JP5434597B2 - 植物用病害耐性増強剤およびそれを用いた植物病害防除法 - Google Patents
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Description
(1)微生物菌体を酸性溶液中で加熱処理することにより得られる抽出液を含む、植物用病害耐性増強剤。
(2)酸性溶液中での加熱処理が、pH6以下の溶液中で70℃以上に加熱する処理である、(1)記載の病害耐性増強剤。
(3)微生物がEscherichia属細菌、コリネ型細菌、Pantoea属細菌、Bacillus属細菌、酵母、乳酸菌、酢酸菌であることを特徴とする(1)または(2)記載の病害耐性増強剤。(4)葉面散布剤であることを特徴とする(1)〜(3)のいずれかに記載の病害耐性増強剤。
(5)さらに金属を含むことを特徴とする(1)〜(4)のいずれかに記載の病害耐性増強剤。
(6)金属が亜鉛及び/又は銅である(5)記載の病害耐性増強剤。
(7)(1)〜(6)のいずれかに記載の病害耐性増強剤で植物を処理することを特徴とする、植物の病害を防除する方法。
好ましくは、コリネ型細菌、バチルス属細菌、エシェリヒア属細菌、パントエア属細菌、乳酸菌、酢酸菌、酵母等が使用できる。
パントエア属細菌としてはパントエア・アナナティス等が挙げられる。
バチルス属細菌としては、バチルス・ズブチリス、バチルス・アミロリケファシエンス、バチルス・プミルス等が挙げられる。
酵母としては、サッカロミセス・セレビジエ等のサッカロミセス属酵母、ピキア・パストリス等のピキア属酵母、ハンセヌラ・ポリモルファ等のハンセヌラ属酵母、キャンディダ・ユティリス等のキャンディダ属酵母、シゾサッカロミセス・ポンベ等のシゾサッカロミセス属酵母などが挙げられる。
乳酸菌としては、ラクトバチルス・カゼイなどのラクトバチルス属細菌、ラクトコッカス・ラクチスなどのラクトコッカス属細菌、ビフィドバクテリウム・ビフィドゥムなどのビフィドバクテリウム属細菌が挙げられる。
酢酸菌としては、アセトバクター・アセチなどのアセトバクター属細菌が挙げられる。
本発明の病害耐性増強剤の施用濃度は植物の種類、生育ステージ、施用方法により適切な濃度に希釈又は濃縮して調製することができる。また、分子量で分画した画分を用いることもできる。
本発明の病害耐性増強剤は、その他の成分を含んでもよい。その他の成分としては、亜鉛や銅などの金属が挙げられる。微生物の酸性加熱処理液の散布でも効果は発揮されるが、亜鉛や銅などの金属を添加することでその効果を増加、持続させることができる。金属の濃度は、金属の重量として施用時に0.0001%〜10%(w/v)になるような濃度範囲が好ましい。亜鉛や銅などの金属は、溶液中でイオンを形成するように、塩の形で本発明の病害耐性増強剤に加えることが好ましい。
微生物菌体はEscherichia coli、Corynebacterium glutamicum、Pantoea ananatis、Bacillus subtilis、またはSaccharomyces cerevisiaeを用いた。各種菌体は培養液100mLあたりおよそ1.5-2.0g(乾燥重量)まで培養を行なった。培養には特開2005-278643、特開2003-259861、再表01/090310などに記載の培地を用いた。
各菌体は6,000rpmで遠心分離して回収し、純水で3回洗浄を行なった後、1.5-2.0g(乾燥重量)につき純水100mLに懸濁した。H2SO4を添加してpH3.2に調整した後、121℃で30分間オートクレーブを用いて加熱処理を行なった。得られた溶液を10,000rpmで遠心分離し、不溶成分を除去した。ここで得られた上清を酸性加熱処理液として以降の実験に用いた。植物体への処理には特に記載のない場合は100倍に希釈した溶液を用いた。
(1)植物体の栽培と散布方法
シロイヌナズナ寒天栽培はOptMS無機塩類培養液(表1)に1 % sucrose、0.8 % agarを加えた培地で2週間栽培した植物を用いた。日周は16時間明期で光強度はおよそ70μmol m-2s-1で栽培した。シロイヌナズナのロックウール栽培は5cm角のロックウール(日東紡社製・サイズV)を用いた。肥料としてOptMS無機塩類培養液(表1)を用いた。日周は14時間明期で光強度はおよそ100μmol m-2 s-1で21日間栽培し、地上部のうち葉柄以外すべてをサンプルとした。各溶液による散布効果は寒天培地またはロックウールで栽培した植物に対して評価し、特に記載のない場合は、実施例1記載の方法で調製した溶液を100倍希釈したもので植物を処理し、処理後24時間の葉内の酵素活性を測定した。散布溶液には展着剤としてアプローチBI (花王)を1/1000濃度で添加した。
酵素活性測定用に植物をサンプリングした後、直ちに液体窒素で凍結し、-80℃で保存した。凍結状態のまま植物破砕機MM300(QIAGEN)により破砕し500μLの抽出バッファー[100 mM Na3PO4 (pH6.0)、1 mM DTT、protease inhibitor / complete mini EDTA free (Roche)]に溶かした。10,000 rpm 5分間の遠心分離後の上清を0.22 μmフィルターに通し不溶化物を除去した。濃縮および脱塩を目的として限外ろ過フィルターUFV5BG00 (Millipore)に通した。1.5 mlの抽出バッファーを3回に分けて通すことで脱塩を行なった。ここで得られた画分を粗抽出画分とし、Bradford法によるタンパク質濃度測定後、酵素活性測定に用いた。
キチナーゼ活性はMcCreathらによる方法(J. Microbiol. Methods 14:229- 1992)により求めた。基質である4MU-(GlcNAc)3 (SIGMA M5639)は最終濃度0.4mMになるように50% エタノール中に溶解し-20℃で保存した。使用時に10倍に希釈し基質溶液とした。抽出した粗抽出液を6-8μg/μLに調製し50μLを反応に用いた。96穴プレート上で37℃で10分間のプレインキュベーション後に基質溶液50μLを添加し37℃で反応を開始した。反応開始後30分、150分後に反応液に100μLの1M Gly / NaOH buffer (pH 10.2)を添加し反応を停止した。反応、停止は96ウェルプレート上で行い、最終量200μLとした。液面の泡を完全に除去した後に蛍光検出用プレートリーダー(WALLAC 1420 ARVO-SX)を用いて蛍光強度を測定した。蛍光測定では360nmエキサイテイーション、450nmエミッションにより測定した。反応量は4-MU(メチルウンベリフェロン)を基質をして求めた標準値にもとづき1分間に1μmol反応する酵素量を1ユニットと定義した。
シロイヌナズナにおけるグルカナーゼ活性測定はAonoらの方法(Appl Environ Microbiol. 58:520- 1992)に従って行なった。可溶性多糖であるラミナリン分解法を用いた。基質であるlaminarin (SIGMA L9634)は最終濃度5mg/mlとなるように滅菌水に溶解し-20℃で保存した。抽出した粗抽出液を6-8μg/μLに調製し50μLに基質溶液50μLを添加し、37℃で反応を開始した。反応開始後180分、360分後に反応液100μLを500μLのDNS溶液(5g/L dinitrosalicylic acid、16g/L NaOH、300g/L 酒石酸ナトリウムカリウム4水和物)に添加し、98℃で10分間加熱後氷上で急冷し発色させた。DNS法はMillerによる方法(Anal Chem 31: 426- 1959)により行い、発色後540nmの吸収量にもとづき活性を求めた。反応量はglucoseを基質として求めた標準値にもとづき1分間に1μmol反応する酵素量を1ユニットと定義した。
また、pH6の溶液中で加熱処理を行って得られたCorynebacterium菌体の酸性加熱処理液を散布した植物の評価の結果を図4に示した。その結果、pH6,75℃で加熱することによって得られた処理液でもキチナーゼ活性の上昇が認められ、病害耐性誘導効果があることが示された。
また、アミノ酸発酵廃液を主成分とする工場排水の活性汚泥処理装置より発生した余剰汚泥を脱水し、H2SO4水溶液を添加してpH3.2に調整した後、121℃で20分間加熱処理を行った後、得られた溶液を10,000rpmで遠心分離し、不溶成分を除去して得られた上清を酸性加熱処理液として用いた場合の結果を図5に示す。その結果、余剰汚泥に含まれる微生物の酸性加熱処理液にも、病害耐性誘導効果があることが示された。
これらの結果から、様々な菌体を酸性条件下で加熱処理することで微生物から病害耐性誘導物質が抽出されることが判った。
ZnSO4を亜鉛Znの重量比率0.01%として散布液に混合した場合の効果を検証した結果を図6と図7で示した。菌体酸性加熱処理液やZn単独の場合と比較して、菌体酸性加熱処理液+Znでは、酵素活性上昇が強くなる傾向が認められた。この効果はCorynebacterium(図6)およびE.coli(図7)菌体で共通に認められ、特にグルカナーゼの活性において顕著であった。さらに処理後24時間よりも72時間目においてその効果は顕著であり、持続的に効果を発揮させる上でZnの添加が有効であることが示された。
また、CuSO4を銅Cuの重量比率0.01%として散布液に混合した場合の効果を検証した結果を図8で示した。その結果、各種菌体酸性加熱処理液にCuを加えた場合には酵素活性上昇が強くなる傾向が認められた。
過去に菌体の細胞壁を構成するペプチドグリカンやリポポリサッカライド(LPS)を植物が認識し、病害耐性誘導が引き起こされることが報告されており、それらの物質との効果の比較を行なった。ペプチドグリカンはinvivogen社製の標品(PGN-ECndss ultrapure)をリポポリサッカライドはシグマ製の標品(L8643)を用い、それぞれ効果があることが示されている100mg/L濃度でシロイヌナズナへの葉面散布を行い24時間後の酵素活性を測定した。図9に示すとおり、これらの物質ではキチナーゼの活性上昇は認められず、菌体酸性加熱処理液の葉面散布時の病害耐性誘導効果がこれらの物質よりも顕著に強いことが示された。
また、プロリン(Pro)発酵液の上清の散布により、病原菌の感染が防除できるとの先行知見(特開平6-80530号公報)にもとづき、これと本願の菌体酸性加熱処理液との効果の比較検討を実施した。Pro発酵菌体(コリネバクテリウム グルタミカムATCC21159)は文献に記載の方法で培養を行い、アミノ酸分析計(日立 L-8800)を用いてアミノ酸分析を行った。植物体への処理にはアミノ酸の総量が50ppmとなるように希釈した溶液を用いた。図10で示すとおり、Pro発酵液上清の葉面散布では有意な酵素活性上昇は認められなかった。
病原菌であるPseudomonas syrinagae pv. maculicolaはYEP培地で24時間培養した。培養後の菌体を3,000rpmで回収し、5x106cfu/mLとなるように10mM MgSO4水溶液に懸濁した。菌体懸濁液を針をつけていない1mLシリンジにて葉内に注入し感染させた。感染後3日目に観察を行い、被病性を確認した。
試験では、前処理を展着剤のみまたは展着剤+酸性加熱処理液を散布して行い、その24時間後に病原菌を感染させた。図11に示すとおり、展着剤のみに比べ、展着剤+酸性加熱処理液では顕著に感染が抑制されていることが示された。
(1)イネの栽培と散布方法
イネ(品種:日本晴)種子を3日間水に浸して催芽し、園芸用培土(パワーソイル(関東肥料工業株式会社(呉羽化学工業株式会社))とバーミキュライト(エス・ケー・アグリ株式会社)を4:1で混合したもの)に播種して、温室内で栽培した。温室では自然光で14日間栽培し、本葉4.5葉齢期の植物をサンプルとして用いた。
イネにおけるグルカナーゼ活性測定はInuiらの方法(Biosci Biotechnol Biochem. 61: 975- 1997)に従って行なった。試料(酸性加熱処理液)は本葉4.5葉齢期の第4本葉の表面10ヶ所に2μLずつのせ、24時間後にこの葉を液体窒素で凍結後、ホモジナイズ抽出した。抽出した粗抽出液100μLに900μLの基質溶液(1% Curdlan (SIGMA C7821), 50mM Na2HPO4-citric buffer, (pH5.0))を添加し、37℃で反応を開始した。反応開始60分後に反応液50μLを200μLのDNS溶液(5g/L dinitrosalicylic acid, 16g/L NaOH, 300g/L 酒石酸ナトリウムカリウム4水和物)に添加し、98℃で10分間加熱後、氷上で急冷し発色させた。DNS法はMillerによる方法(Anal Chem 31: 426- 1959)により行い、発色後540nmの吸収量にもとづき活性を求めた。反応量はglucoseを基質として求めた標準値にもとづき1分間に1μmol反応する酵素量を1ユニットと定義した。
実施例1記載の方法で調製した、Corynebacterium菌体の酸性条件下で加熱処理した溶液を希釈せずに用いてイネを処理し、その24時間後のグルカナーゼ活性を測定した。図12で示すとおり、対照と比較し、菌体酸性加熱処理液の散布により有意にグルカナーゼ活性が上昇することが示された。
本葉4.5葉齢期のイネの葉全体に実施例1記載の方法で調製したCorynebacterium菌体の酸性加熱処理液を10倍希釈した試料をスプレーし、24時間栽培した後、イネいもち病菌(学名:Magnaporthe oryzae)の分生胞子懸濁液(1×105 分生胞子/mL)を噴霧接種した。噴霧接種後、暗所、湿室下に24時間放置することにより、いもち病菌を感染させた。接種6日後に各処理区の第4本葉に発生した罹病性病斑数を測定することにより防除価を算出した。防除価の算出は、防除価=(対照区平均病斑数−各区の試料処理区平均病斑数/対照区平均病斑数)×100とした。図13に示すとおり、対照と比較し、菌体酸性加熱処理液の散布により有意に病原菌の感染を防除できることが示された。
各植物は土-メトロミックス(ハイポネックスジャパン)に播種し、光強度はおよそ100μmol m-2 s-1、14時間明期、10時間暗期のサイクルで、21日間栽培した植物の新鮮な本葉を評価に用いた。
活性酸素(H2O2)の測定には、Kunzeらの方法(Plant Cell, 16, 3496- 2004)を変更して行なった。植物の葉を約3mm四方に裁断し、一晩滅菌水に漬けた後に、各菌体(1.Corynebacterium、2.E.coli、3.Bacillus、4.Pantoea、5.Saccharomyces cerevisiae)の酸性加熱処理液を含む水溶液に移しH2O2を発生させて、その水溶液を反応液(50mMリン酸バッファー(pH5.8)、 5μM Amplex Red (Invitrogen)、1μg/mL Horseradish Peroxidase (Sigma Aldrich P8515) に添加し、Excitation 544nm、Emission 590nmで測定した。各実験は4反復以上繰り返し以下の基準に従って判定を行なった。
(判定方法)
1) 各実験回において,平均値が対照よりも5倍以上増加(+2)、2倍以上増加(+1)
2) 各実験回において,有意差検定を行ないp値が<0.01の場合は(+2)、<0.05の場合(+1)
3) 総和を実験回で割り、1以上を(++)、0.5以上を(+)と表記した。
表2に示すとおり、様々な植物で活性酸素の発生が確認できたことから、菌体酸性加熱処理液の処理による病害耐性誘導が種特異的ではないことが示された。
表2中の1はCorynebacterium glutamicum,2はE.coli,3はBacillus subtilis,4はPantoea ananatis,5はSaccharomyces cerevisiaeの酸加熱処理液による葉片からの活性酸素発生測定の結果を示す.またn.d.は測定せずを意味する.
活性酸素の測定は基本的に実施例5記載の方法で行なった。アスパラガスは実施例5記載の方法で1ヶ月間栽培した植物体から葉を回収し、活性酸素発生を測定した。イチゴとブドウはそれぞれ苗を購入し、温室内、25℃で2-3週間栽培し順化した後に健全な葉を選んで回収し、活性酸素発生を測定した。処理液はCorynebacterium酸性加熱処理液を限外ろ過により5kDa以上から30kDa以下に分画した液を用いた。限外ろ過には分子量分画は限外ろ過フィルター(Amicon Ultra-15 centrifugal filter; 30K NMWL, 5K NMWL; Millipore)を用いた。測定は相対的な蛍光強度を活性酸素発生量としてコントロールと比較した。図14に示す通り、上記分画液はアスパラガス、イチゴ、ブドウへの処理においても顕著な活性酸素産生を誘導することが示された。
Corynebacterium処理液によるキャベツのキチナーゼ活性に対する効果
キャベツを土に播種し、3週間栽培後、第一番目の本葉にCorynebacterium酸性加熱処理液を10倍希釈で注入処理し48時間後のキチナーゼ活性を測定した。対照は水処理を行なった。図15に示す通り、対照と比較し菌体酸性加熱処理液の散布により有意にキチナーゼ活性が上昇していることが示された。
Saccharomyces cerevisiae酸性加熱処理液によるイネに対する効果
実施例4記載の方法に従い、Saccharomyces cerevisiae酸性加熱処理液によるイネに対する効果をグルカナーゼ活性の上昇および感染防除効果を測定することで調べた。図16に示す通り、Saccharomyces cerevisiae酸性加熱処理液(等倍希釈)の散布により有意にグルカナーゼ活性が上昇していることが示され、また図17に示す通り、Saccharomyces cerevisiae酸性加熱処理液(5倍希釈)の散布により有意に病原菌の感染を防除できることが示された。
OptMS無機塩類培養培地(表1)に0.8% Agarを加えた寒天培地を充填した1mLチップをチップラックにセットし、培地上に滅菌済みのイネ(品種:コシヒカリ)の種子を播種した。チップは根が伸展できるよう下端から約20mm以下の部分を切り落とし、乾燥を防ぐため切り口を純水に漬けた状態で1週間栽培した。チップ上で成長したイネ幼苗に厚さ20mmの発泡スチロールの浮きを装着し、OptMS 1Lを入れたフードパック(C-APフルーツ200、 中央化学(株))に浮かべた。この状態でさらに1週間栽培し、トータルで2週間栽培した4.5葉期のイネを実験材料とした。テクノポット(住友ベークライト(株))の底部に処理液を100mL入れ、水耕栽培で2週間生育させたイネを根が処理液に十分浸る状態で発泡スチロールごと浮かべた。処理液は20%濃度のCorynebacterium酸性加熱処理液を用いた。発泡スチロールはあらかじめテクノポットに収まるサイズに調整した。栽培は恒温植物インキュベーター(コイトトロン、小糸工業(株))内で、日周16時間明期8時間暗期、温度28℃、光強度約150μmol m-2 s-1で行った。根への処理後15時間後にサンプリングを行ない,サンプルは根全体を1サンプルとした。各サンプルからRNeasy Plant Mini Kit (QIAGEN) を用いてtotal RNAを抽出した。Total RNAをRNase free DNase Set (QIAGEN)を用いてDNase処理した後、逆転写酵素High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit ( Applied Biosystems)を用いてoligo dT primerから逆転写を行ない、合成した1本鎖cDNAを鋳型として定量PCRを行なった。定量PCRはABI PRISM 7500を用い、反応条件は95℃ 15秒 60℃ 60秒を40サイクルで行った。試薬はPower SYBR Green PCR Master Mix(Applied Biosystems)を用いた。定量する遺伝子にはハウスキーピング遺伝子としてRAc1 (RAP code、 Os11g0163100)、病害抵抗性関連遺伝子としてPBZ1 (RAP code、 Os12g0555200)を用いた。各遺伝子発現用プライマーは以下を用いた:5’-CCCCTTGTGTGTGACAATGG -3’(配列番号1)と5’-CCCTGGGCGCATCGT-3’ (配列番号2)(RAc1)、 5’-GGAGCAGGAGAAGATGATCG-3’ (配列番号3)と5’-TTCTTCTCACATGCGACCAC-3’ (配列番号4)(PBZ1)。PBZ1の発現量はRAc1の発現量で標準化した。結果を図18に示す。根に処理した場合、根においてはPBZ1遺伝子発現量が増加することが示された。
殺菌剤など植物病原菌に対して直接作用するタイプの農薬は、病原菌に対して殺菌効果を示すものが多いが、継続的な使用により薬剤に対して耐性変異株が出現するのに対して、耐性誘導型農薬は、薬剤の耐性変異株が出現しにくく、長期間にわたる使用が可能であることが知られている。このようなことから、微生物菌体の酸性加熱処理液が抗菌活性よりはむしろ、病害耐性を誘導することによって病原菌の感染を防ぐということは、耐性変異株が出現しにくく、長期間にわたる使用が可能であるために、産業上極めて有用である。
Claims (5)
- Escherichia属細菌、コリネ型細菌、Pantoea属細菌、Bacillus属細菌およびSaccharomyces属酵母から選択される微生物の菌体をpH6以下の酸性溶液中で70℃以上の温度で10分以上加熱処理することにより得られる抽出液を含む、植物用病害耐性増強剤。
- 葉面散布剤である、請求項1に記載の病害耐性増強剤。
- さらに金属を含む、請求項1または2に記載の病害耐性増強剤。
- 金属が亜鉛及び/又は銅である、請求項3に載の病害耐性増強剤。
- 請求項1〜4のいずれか一項に記載の病害耐性増強剤で植物を処理することを特徴とする、植物の病害を防除する方法。
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