JP5394887B2

JP5394887B2 - 顕微鏡装置および顕微鏡観察方法

Info

Publication number: JP5394887B2
Application number: JP2009249348A
Authority: JP
Inventors: 貴米山
Original assignee: Olympus Corp
Current assignee: Olympus Corp
Priority date: 2009-10-29
Filing date: 2009-10-29
Publication date: 2014-01-22
Anticipated expiration: 2029-10-29
Also published as: US8730315B2; EP2317364A1; JP2011095500A; CN102053359B; US20110102571A1; EP2317364B1; CN102053359A

Description

本発明は、顕微鏡装置および顕微鏡観察方法に関するものである。

従来、スライド上の標本を複数の小領域に分割して、各小領域ごとに撮影し、得られた高解像度の複数枚の拡大画像を貼り合わせて仮想的な標本全体の画像を構築するバーチャルスライド作成装置が知られている（特許文献１参照。）。

特開２００８−１９１４２７号公報

しかしながら、従来のバーチャルスライド作成装置においては、各小領域毎にオートフォーカスによってピントずれを補正して鮮明な拡大画像を取得することが行われるが、隣接する小領域に対して取得された隣接する拡大画像間においてオートフォーカスによる焦点位置が異なる場合に、最終的に構築されたバーチャルスライドにおいて、拡大画像間に継ぎ目が形成されてしまうことがある。

隣接する小領域について取得された隣接する拡大画像間において継ぎ目が形成されてしまうほど焦点位置が変動するのは、標本自体の起伏の変化よりもむしろ、標本の表面に付着した塵埃等による場合が多く、その場合には、標本自体の画像は不鮮明となるという不都合がある。

本発明は、上述した事情に鑑みてなされたものであって、構築されるバーチャルスライドにおいて拡大画像間の継ぎ目を低減し、見易く鮮明なバーチャルスライドを得ることを可能とする顕微鏡装置および顕微鏡観察方法を提供することを目的としている。

上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明は、スライド上の標本からの光を集光する対物レンズと、前記標本に対する前記対物レンズの合焦位置を検出する合焦位置検出部と、該合焦位置検出部による検出結果に基づいて、標本に対する前記対物レンズの合焦状態を調節する合焦状態調節部と、標本の部分的な小領域の拡大画像を取得する拡大画像取得部とを備え、前記合焦状態調節部は、前記合焦位置検出部により検出された小領域の合焦位置が、該小領域に隣接する拡大画像の取得時における合焦状態に対して、所定の閾値を超えて変動している場合に、該所定の閾値以下に合焦状態の調節を制限する顕微鏡装置を提供する。
前記所定の閾値は、例えば、対物レンズの焦点深度である。

本発明によれば、スライド上の標本の撮影に先立って、合焦位置検出部の作動により、標本に対する対物レンズの合焦位置が検出され、検出された合焦位置に基づいて合焦状態調節部により標本に対する対物レンズの合焦状態が調節され、対物レンズを介して集光された光を撮影することにより拡大画像取得部によって標本の各部の拡大画像が取得される。

この場合において、合焦位置が検出されると、隣接する拡大画像の取得時における合焦状態に対する変動量が判定される。変動量が所定の閾値（例えば、対物レンズの焦点深度）以下の場合には、検出された合焦位置に一致させるように合焦状態が調節されて拡大画像の取得が行われる。一方、変動量が所定の閾値（例えば、対物レンズの焦点深度）を超えている場合には合焦状態の調節が所定の閾値（例えば、対物レンズの焦点深度）以下に制限される。

これにより、取得された複数枚の拡大画像をつなぎ合わせてバーチャルスライドを作成する場合に、作成されたバーチャルスライドにおいて隣接する拡大画像間の継ぎ目を目立たなくすることができ見易いバーチャルスライドを提供することが可能となる。特に、標本上の塵埃等によって合焦位置が大きく変動した場合に、塵埃にピントを合わせることなく、標本の鮮明な拡大画像を得ることができる。

上記発明においては、前記拡大画像取得部により取得された複数枚の拡大画像を貼り合わせて、前記標本のバーチャルスライドを作成する画像貼り合わせ部を備えていてもよい。
このようにすることで、画像貼り合わせ部によって各拡大画像間における継ぎ目の目立たないバーチャルスライドを得ることができる。

また、上記発明においては、前記合焦状態調節部が、隣接する拡大画像が複数存在する場合には、合焦位置の変動量が最も大きな隣接拡大画像の取得時における合焦位置に対して、前記所定の閾値（例えば、対物レンズの焦点深度）以下に合焦状態の調節を制限してもよい。
このようにすることで、複数の拡大画像に隣接する拡大画像において各隣接拡大画像との各継ぎ目を目立たなくしたバーチャルスライドを作成することが可能となる。

また、上記発明においては、前記拡大画像取得部が、前記スライド上の前記標本における隣接領域の拡大画像を順次取得するよう駆動されてもよい。
このようにすることで、合焦位置の変動が直前に取得された拡大画像との間で判定される。標本は通常の場合、その高さが徐々に変化するものであるため、隣接領域の拡大画像を順次取得することにより、急激な合焦位置の変動を塵埃等の異物によるものと認定し易い。また、常に隣接領域の拡大画像が存在する状態で拡大画像を取得でき、標本にピントを合わせた鮮明な拡大画像を取得することができる。

また、上記発明においては、前記合焦状態調節部は、連続して隣接する３以上の拡大画像の取得において、合焦位置の変動量が連続して複数回前記所定の閾値（例えば、対物レンズの焦点深度）を超えた場合に、合焦状態の調節の制限を解除してもよい。
このようにすることで、合焦位置の変動が、塵埃等の異物によるものではなく、標本の高さの変動によるものある、あるいはスライドが傾いている可能性が高いと判定することができ、合焦状態の調節の制限による標本へのピントのずれの発生を防止することができる。すなわち、継ぎ目を目立たなくすることに優先して、鮮明な拡大画像を取得することができる。

また、本発明は、スライド上の標本からの光を集光する対物レンズの標本に対する合焦位置を検出するステップと、前記標本の部分的な小領域に対して検出された合焦位置が、該小領域に隣接する拡大画像の取得時における前記標本に対する前記対物レンズの合焦状態に対して、所定の閾値（例えば、対物レンズの焦点深度）を超えて変動しているか否かを判定するステップと、合焦位置の変動量が前記所定の閾値（例えば、対物レンズの焦点深度）以下の場合には、検出された合焦位置に一致するように合焦状態を調節し、前記所定の閾値（例えば、対物レンズの焦点深度）を超えている場合には、該所定の閾値以下に合焦状態の調節を制限するステップと、合焦状態が調節された標本の拡大画像を取得するステップとを含む顕微鏡観察方法を提供する。
前記所定の閾値は、例えば、対物レンズの焦点深度である。

本発明によれば、構築されるバーチャルスライドにおいて拡大画像間の継ぎ目を低減し、見易く鮮明なバーチャルスライドを得ることができるという効果を奏する。

本発明の一実施形態に係る顕微鏡装置を示す全体構成図である。図１の顕微鏡装置により拡大画像を取得する順序の一例を示す図である。図１の顕微鏡装置による合焦状態の調節動作を説明する図であり、（ａ）隣接する２つの小領域における合焦位置が対物レンズの焦点深度を超えている場合、（ｂ）隣接する２つの小領域における合焦状態の調節が制限された場合をそれぞれ示している。図１の顕微鏡装置を用いた顕微鏡観察方法を説明するフローチャートである。

本発明の一実施形態に係る顕微鏡装置１および顕微鏡観察方法について、図面を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る顕微鏡装置１は、図１に示されるように、標本を搭載したスライドＡを載置するステージ２と、ステージ２上のスライドＡに対向して配置される対物レンズ３と、該対物レンズ３により集光された標本からの光を検出して拡大画像を取得するカメラ（拡大画像取得部）４と、標本に対する対物レンズ３の合焦位置を検出する合焦センサ（合焦位置検出部）５と、合焦センサ５による検出結果に基づいて合焦状態を調節する制御部（合焦状態調節部）６と、制御部６により合焦状態が調節された状態でカメラ４により取得された拡大画像を記憶する記憶部７とを備えている。

ステージ２は、対物レンズ３の光軸方向（鉛直方向）およびこれに直交する方向（水平方向）に、それぞれスライドＡを移動させる機構を有している。
対物レンズ３は、ステージ２の上方に間隔をあけて、その光軸を鉛直方向に向けて配置されている。対物レンズ３は、倍率の異なるものが複数用意され、レボルバ８によって択一的にステージ２に対向配置されるようになっている。

カメラ４は、例えばＣＣＤを備え、対物レンズ３によって集光された標本の部分的な小領域Ｂの像を撮影するようになっている。
合焦センサ５は、例えば、カメラ４により取得された標本の部分的な小領域Ｂの拡大画像のコントラストを検出し、コントラストが最も大きくなる位置を合焦位置として検出するようになっている。図２において、符号Ｃは、合焦センサ５が小領域Ｂの合焦位置を検出する際のコントラスト検出範囲を示している。

制御部６は、予め設定された標本上の複数の小領域Ｂの中央に対物レンズ３の光軸を順次一致させるように、予め設定されたスケジュールに従って、ステージ２を水平２方向に移動させるようになっている。図２に示す例では、ａ１、ｂ１、ｃ１、ｄ１、ｄ２、ｃ２、ｂ２、ａ２、ａ３、ｂ３、ｃ３、ｄ３の順に小領域Ｂの像を撮影するために、ステージ２を移動させるようになっている。

また、制御部６は、各小領域Ｂの中央に対物レンズ３の光軸が一致した時点で、合焦センサ５から出力される合焦位置の情報を受けて、隣接する小領域Ｂについて拡大画像が既に取得されている場合には、当該隣接拡大画像が取得された際の合焦状態に対して合焦位置が所定の閾値を越えて変動しているか否かを判定するようになっている。

そして、制御部６は、合焦位置が所定の閾値以下で変動している場合、および隣接する小領域Ｂについて拡大画像が取得されていない場合には、検出された合焦位置に一致するようにステージ２を上下方向（鉛直方向）に移動させて合焦状態を調節するようになっている。一方、制御部６は、合焦位置が所定の閾値を越えて変動している場合には、対物レンズ３の焦点深度の範囲内に配されるように合焦状態を調節するようになっている。ここで、所定の閾値としては、例えば、対物レンズ３の焦点深度を設定しておけばよい。

さらに、制御部６は、隣接拡大画像が複数存在する場合には、いずれかの隣接拡大画像が取得された際の合焦状態に対する合焦位置の最大の変動量が所定の閾値以内となるように合焦状態を調節するようになっている。
また、制御部６は、隣接拡大画像を撮影した際の合焦状態に対する合焦位置の変動量が連続して所定回数、例えば、２回、所定の閾値を越えた場合には、検出された合焦位置に一致するように合焦状態を調節するようになっている。

記憶部７は、各小領域Ｂの位置において取得された拡大画像を記憶するとともに、各拡大画像が取得された際における合焦状態を対応づけて記憶するようになっている。合焦状態としては、拡大画像が取得された際におけるステージ２の上下方向位置を記憶するようになっている。

例えば、所定の閾値である対物レンズ３の焦点深度が±１０μｍである場合に、隣接する拡大画像が取得された際における合焦状態がステージ２の原点位置であるとすると、その合焦状態に対して、図３（ａ）に示されるように、焦点位置の変動量が＋３０μｍである場合には、合焦状態の調節は、図３（ｂ）に示されるように、＋１０μｍに制限される。そして、ステージ２が１０μｍ下降させられて、拡大画像の取得が行われるとともに、このときの合焦状態＋１０μｍが記憶される。焦点位置の変動量が＋８μｍである場合には、合焦状態は合焦位置＋８μｍに一致させられて、ステージ２が８μｍ下降させられるとともに、この合焦状態＋８μｍが記憶される。図中、符号Ｄは、対物レンズの焦点位置Ｐを示すための光束の一例を示し、符号Ｅは標本を示している。

一方、一の小領域Ｂに対する焦点位置の変動量が＋３０μｍであって、制御部６によって合焦状態の調節が＋１０μｍに制限された場合において、その次の隣接する小領域Ｂに対する焦点位置の変動量が、記憶されている先の合焦状態すなわちステージ２の位置を基準として焦点位置の変動量が＋２０μｍであった場合には、合焦状態の調節を＋１０μｍに制限することなく、合焦位置に一致させるように合焦状態が調節されるようになっている。

また、顕微鏡装置１には、透過観察用光学系９と、落射観察用光学系１０と、検鏡法を切り替えるためのキューブユニット１１と、接眼レンズ１２と、観察光路を接眼レンズ１２側およびカメラ４側に分岐するビームスプリッタ１３とが備えられている。
透過観察用光学系９は、透過照明用光源１４と、透過照明用光源１４からの照明光を集光するコレクタレンズ１５と、透過用フィルタユニット１６と、透過視野絞り１７と、透過開口絞り１８と、コンデンサ光学素子ユニット１９と、トップレンズユニット２０とを備えている。図中、符号２１はミラーである。
落射観察用光学系１０は、落射照明用光源２２と、コレクタレンズ２３と、落射用フィルタユニット２４と、落射シャッタ２５と、落射視野絞りと２６、落射開口絞り２７とを備えている。また、符号２８は、記憶部に記憶された拡大画像を貼り合わせてバーチャルスライドを生成するバーチャルスライド生成部である。

このように構成された本実施形態に係る顕微鏡装置１を用いた顕微鏡観察方法について、説明する。
本実施形態に係る顕微鏡装置１を用いて複数枚の拡大画像を取得するには、図４に示されるように、制御部６が、数値を初期化し（ステップＳ１）、カウンタＮをインクリメントして（ステップＳ２）、予め定められた順序に従って標本上のいずれかの小領域Ｂの中心に対物レンズ３の光軸を一致させるようにステージ２を水平移動させ（ステップＳ３）、透過観察用光学系９あるいは落射観察用光学系１０のいずれかによって標本に照明光を照射する。

照明光の標本における透過光あるいは反射光、照明光が励起光である場合には、標本において発生する蛍光が対物レンズ３によって集光されてカメラ４によって撮影される。
そして、合焦センサ５が、ステージ２を鉛直方向に移動させながら取得された拡大画像について、それぞれコントラストを算出して、コントラストが最も大きくなる位置を合焦位置として検出する（ステップＳ４）。

この位置で取得される拡大画像が最初の拡大画像か否かが判定され（ステップＳ５）、最初の拡大画像である場合、すなわち、既に取得された隣接する拡大画像が存在しない場合には、合焦センサ５により検出された合焦位置に一致する位置までの移動量が設定され（ステップＳ６）、その設定移動量分だけ制御部６がステージ２を鉛直方向に移動させ（ステップＳ７）、その位置でカメラ４により標本の拡大画像を取得し（ステップＳ８）、取得された拡大画像を合焦状態、すなわちステージ２の位置とともに記憶部７に記憶する（ステップＳ９）。

制御部６は、予定されていた全ての小領域Ｂの画像取得が終了したか否かを判定し（ステップＳ１０）、終了していない場合には、カウンタＮをインクリメントして（ステップＳ２）、予め定められた順序に従って、次の小領域Ｂの中心に対物レンズ３の光軸が一致するまでステージ２を水平方向に移動させ（ステップＳ３）、合焦センサ５による合焦位置の検出を行う（ステップＳ４）。そして、記憶部７に記憶されている隣接する拡大画像が取得された際における合焦状態が記憶部７から読み出され（ステップＳ１１）、読み出された合焦状態に対する検出された合焦位置の変動量が算出され（ステップＳ１２）、該変動量が閾値以下であるか否かが判定される（ステップＳ１３）。

変動量が閾値以下である場合には、定数Ｍが初期化された後（ステップＳ１４）、検出された合焦位置に対物レンズ３の焦点位置が一致するようにステージ２が鉛直方向に移動させられる。

一方、変動量が閾値を越える場合には、定数Ｍ＝１であるか否かが判定され（ステップＳ１５）、定数Ｍ＝１でない場合には、ステージ２の移動量が、予め設定された対物レンズ３の焦点深度範囲内の制限された移動量に設定され（ステップＳ１６）、定数Ｍがインクリメントされる（ステップＳ１７）。そして、設定移動量分だけ、制御部６がステージ２を鉛直方向に移動させ（ステップＳ７）、その位置でカメラ４により標本の拡大画像を取得し（ステップＳ８）、取得された拡大画像を合焦状態、すなわちステージ２の位置とともに記憶部７に記憶する（ステップＳ９）。

また、ステップＳ１５において、定数Ｍ＝１であると判定された場合には、定数Ｍが初期化された後（ステップＳ１８）、合焦センサ５により検出された合焦位置に一致する位置までの移動量が設定され（ステップＳ６）、その設定移動量分だけ、制御部６がステージ２を鉛直方向に移動させ（ステップＳ７）、移動後の位置でカメラ４により標本の拡大画像が取得され（ステップＳ８）、取得された拡大画像が、合焦状態すなわちステージ２の位置とともに記憶部７に記憶される（ステップＳ９）。

このように、本実施形態に係る顕微鏡装置１および顕微鏡観察方法によれば、隣接して取得された拡大画像間において、対物レンズの焦点深度を超えて大きく合焦状態が変動することが防止され、拡大画像間の継ぎ目が目立ってしまうことを防止することができる。その結果、取得されるバーチャルスライドは、継ぎ目が目立たずに連続した１連の画像として観察することができる。特に、標本の表面に付着した塵埃によって合焦状態が変動したとしても、それによってピントがずれた拡大画像が取得されずに済み、鮮明なバーチャルスライドを提供することができる。

また、隣接する３つの拡大画像間において２回連続して、対物レンズの焦点深度を超えて大きく合焦位置が変動した場合に、合焦状態の調節の制限が解除されるので、標本自体の傾斜に追従させて合焦状態を調節することができる。

なお、本実施形態に係る顕微鏡装置および顕微鏡観察方法によれば、２回連続して大きく合焦位置が変動した場合に合焦状態の調節の制限を解除することとしたが、これに代えて３回以上の任意の回数に設定してもよい。この場合、ステップＳ１５の判定条件を任意の数に設定するだけでよい。

また、直前に取得された隣接拡大画像の撮影時における合焦状態との関係で、合焦状態の調節を行うこととしたが、これに代えて、隣接する複数枚の拡大画像との関係によって合焦状態の調節を行うこととしてもよい。例えば、図２に示す例において、符号ｃ２の小領域Ｂの拡大画像を取得する際には、それに隣接する符号ｃ１，ｄ２の小領域Ｂの拡大画像が既に取得されているので、これらの取得時における合焦状態からの変動量がいずれも対物レンズ３の焦点深度の範囲の閾値以内に制限されるように、合焦状態が調節されるようにしてもよい。

また、本実施形態においては、カメラ４により取得された画像のコントラストによって合焦位置を検出する合焦センサを例示したが、これに代えて、赤外線距離センサ等の他の任意の距離センサを用いて合焦位置を検出することにしてもよい。
また、合焦位置の変動量が大きい場合における合焦状態の調節量は、対物レンズの焦点深度以内の任意の値でよい。

１顕微鏡装置
２ステージ（拡大画像取得部）
３対物レンズ
４カメラ（拡大画像取得部）
５合焦センサ（合焦位置検出部）
６制御部（合焦状態調節部）
２８バーチャルスライド生成部（画像貼り合わせ部）
Ａスライド
Ｅ標本
Ｓ４合焦位置検出ステップ
Ｓ７合焦状態調節ステップ
Ｓ８撮影ステップ
Ｓ１３変動量判定ステップ

Claims

スライド上の標本からの光を集光する対物レンズと、
前記標本に対する前記対物レンズの合焦位置を検出する合焦位置検出部と、
該合焦位置検出部による検出結果に基づいて、標本に対する前記対物レンズの合焦状態を調節する合焦状態調節部と、
標本の部分的な小領域の拡大画像を取得する拡大画像取得部とを備え、
前記合焦状態調節部は、前記合焦位置検出部により検出された小領域の合焦位置が、該小領域に隣接する拡大画像の取得時における合焦状態に対して、所定の閾値を超えて変動している場合に、該所定の閾値以下に合焦状態の調節を制限することを特徴とする顕微鏡装置。
前記所定の閾値が、前記対物レンズの焦点深度であることを特徴とする請求項１に記載の顕微鏡装置。
前記拡大画像取得部により取得された複数枚の拡大画像を貼り合わせて、前記標本のバーチャルスライドを作成する画像貼り合わせ部を備えることを特徴とする請求項１または請求項２に記載の顕微鏡装置。
前記合焦状態調節部が、隣接する拡大画像が複数存在する場合には、合焦位置の変動量が最も大きな隣接拡大画像の取得時における合焦位置に対して、前記所定の閾値以下に合焦状態の調節を制限することを特徴とする請求項１から請求項３のいずれかに記載の顕微鏡装置。
前記拡大画像取得部が、前記スライド上の前記標本における隣接領域の拡大画像を順次取得するよう駆動されることを特徴とする請求項１または請求項２に記載の顕微鏡装置。
前記合焦状態調節部は、連続して隣接する３以上の拡大画像の取得において、合焦位置の変動量が連続して複数回前記所定の閾値を超えた場合に、合焦状態の調節の制限を解除することを特徴とする請求項５に記載の顕微鏡装置。
スライド上の標本からの光を集光する対物レンズの標本に対する合焦位置を検出するステップと、
前記標本の部分的な小領域に対して検出された合焦位置が、該小領域に隣接する拡大画像の取得時における前記標本に対する前記対物レンズの合焦状態に対して、所定の閾値を超えて変動しているか否かを判定するステップと、
合焦位置の変動量が前記所定の閾値以下の場合には、検出された合焦位置に一致するように合焦状態を調節し、前記所定の閾値を超えている場合には、該所定の閾値以下に合焦状態の調節を制限するステップと、
合焦状態が調節された標本の拡大画像を取得するステップとを含むことを特徴とする顕微鏡観察方法。
前記所定の閾値が、前記対物レンズの焦点深度であることを特徴とする請求項７に記載の顕微鏡観察方法。