JP2010538017A - 膵島形成促進性ペプチドおよびそのアナログを使用する組成物および方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 実施形態は、高い安定性および有効性を示す膵島形成促進性ペプチド、好ましくはHIP、ならびにそれを使用して1型および2型糖尿病ならびにその症状を含む損なわれた膵機能に関連する病状を処置する方法に関する。
【選択図】 なし
【選択図】 なし
Description
本願は、米国仮出願第60/969019号(2007年8月30日付で出願)、米国仮出願第60/979526号(2007年10月12日付で出願)、米国仮出願第60/991964号(2007年12月3日付で出願)、および米国仮出願第61/031479号(2008年2月26日付で出願)の利益を主張するものである。
本明細書中で開示される実施形態は、溶解性、バイオアベイラビリティ、およびプロテアーゼ切断に対する血清中の抵抗性(in−serum−resistance)を高めるように設計されることによって、治療薬としての有効性を改善する、膵島形成促進性ペプチド(proislet peptide)の処方物、誘導体、および改変、ならびにそれらを使用する方法を提供する。
1つの実施形態において、膵島形成促進性ペプチドおよびその誘導体は、N末端のアセチル基およびC末端のアミド基でブロックされている。
1つの実施形態において、HIP(Human proIslet Peptide)およびその誘導体は、N末端のアセチル基およびC末端のアミド基でブロックされている(HIP3ブロック型(配列ID番号5)、HIP1ブロック型(配列ID番号6)、およびHIP2ブロック型(配列ID番号7))。そのような改変は、配列を、通常遊離末端を認識するプロテアーゼによる血清中でのプロテアーゼ切断を受けにくくすることによって、ペプチドのTmaxおよびバイオアベイラビリティを効果的に高めるとみられる。この様式で改変されたペプチドが、高い有効性を示すことによって、例えば、IV、IM、SubQ、または腹腔内経路によって投与されるときに投薬量の減少が必要となる。
別の実施形態において、膵島形成促進性ペプチドおよびその誘導体は、該ペプチドのN末端にシステイン残基を付加することによって改変される。
別の実施形態において、HIPおよびその誘導体は、HIP(HIP3Cys(配列ID番号8)、HIP1Cys(配列ID番号9)、およびHIP2Cys(配列ID番号10))のC末端にシステイン残基を付加することによって改変される。その結果、溶液中で二量体を形成することができる化合物(HIP3Cys二量体(配列ID番号11)、HIP1Cys二量体(配列ID番号12)、およびHIP2Cys二量体(配列ID番号13))がもたらされる。そのような改変は、単量体型でのHIPまたはHIPCysバリアントを認識するプロテアーゼを回避することによってHIPCysバリアントの安定性が高められるとみられる。
別の実施形態において、システイン膵島形成促進性ペプチドバリアントは、N末端のアセチル基およびC末端のアミド基によってブロックされる。
別の実施形態において、HIPCysバリアントは、N末端のアセチル基およびC末端のアミド基によってブロックされる(HIP3Cysブロック型(配列ID番号14)、HIP1Cysブロック型(配列ID番号15)、およびHIP2Cysブロック型(配列ID番号16))。そのような改変は、該配列を、通常遊離末端を認識するプロテアーゼによる血清中でのプロテアーゼ切断を受けにくくし、その結果、溶液中で二量体を形成することができる化合物(HIP3Cysブロック型二量体(配列ID番号17)、HIP1Cysブロック型二量体(配列ID番号18)、およびHIP2Cysブロック型二量体(配列ID番号19))がもたらされることにより、単量体型のHIPまたはHIPCysブロック型バリアントを認識するプロテアーゼを回避することによってHIPCysブロック型バリアントの安定性が高められるとみられる。
別の実施形態において、前記システイン膵島形成促進性ペプチドバリアントは、二量体のマレイミド活性化型40Kd PEG構築物をC末端のシステイン残基に共有結合することによって改変される。
別の実施形態において、HIPCysバリアントは、二量体のマレイミド活性化型40Kd PEG構築物をC末端のシステイン残基に共有結合することによって改変される(HIP3CysPEG(配列ID番号20)、HIP1CysPEG(配列ID番号21)、およびHIP2CysPEG(配列ID番号22))。そのような改変は、血清中のHIPCysの安定性を改善し、その結果、インビボにおいて膵島新生を刺激するためおよび糖尿病を逆転させるための治療ストラテジーにおいてHIPCysバリアントのバイオアベイラビリティおよび投薬有効性が高まるとみられる。
別の実施形態において、Cysブロック型膵島形成促進性ペプチドバリアントは、二量体のマレイミド活性化型40Kd PEG構築物を共有結合することによって改変される。
別の実施形態において、HIPCysブロック型バリアントは、二量体のマレイミド活性化型40Kd PEG構築物(HIP3Cysブロック型PEG(配列ID番号23)、HIP1Cysブロック型PEG(配列ID番号24)、およびHIP2Cysブロック型PEG(配列ID番号25))を共有結合することによって改変される。そのような改変は、血清中でのHIPCysブロック型バリアントの安定性を改善し、その結果、インビボにおいて膵島新生を刺激するためおよび糖尿病を逆転させるための治療ストラテジーにおいてHIPCysブロック型バリアントのバイオアベイラビリティおよび投薬有効性が高まるとみられる。
さらなる実施形態は、単独または膵島細胞の再生を刺激するための他の治療薬との併用での最適化された膵島形成促進性ペプチド化合物(最適化されたHIPs(配列ID番号5〜25)を含む)を投与するための方法を提供する。様々な実施形態において、本明細書中に開示される方法は、単独、インスリンとの併用、インスリンおよび別の薬剤との併用、ならびにインスリン以外の1若しくはそれ以上の薬剤との併用での、治療有効量の最適化された膵島形成促進性ペプチドの投与によって実施され得る。
他の実施形態は、最適化された膵島形成促進性ペプチド化合物(最適化されたHIPを含む)の医薬処方物および単位用量形態を提供する。1つの実施形態において、提供される医薬処方物は、単独でまたは1若しくはそれ以上の他の活性な医薬成分(active pharmaceutical ingredients:APIs)とともに最適化されたHIPを含む。1つの実施形態において、APIは、選択される処方物に応じて、最適化されたHIPを種々の経路(皮下、筋肉内、静脈内、および経口的さえも含む)によって投与できるようにする、可溶性のリポソーム調製物での薬剤である。1つの実施形態において、該処方物は、一般的な全身投与用のものであるが、他の実施形態では、該処方物は、被験体内の特定の位置、受容体、細胞、組織、器官、または器官系への標的化投与のための標的化剤を含む。
他の実施形態において、損なわれた膵機能に関連する病状の処置が必要な被験体においてそのような処置を行う方法が提供される。該方法は、最適化された膵島形成促進性ペプチド化合物(最適化されたHIPを含む)に加えて、膵島細胞の再生を刺激するための1若しくはそれ以上の薬剤を投与する工程を有し得る。この実施形態の1つの態様において、前記薬剤は、HIPまたは最適化されたHIP以外のHIP関連ペプチド、アミリン/プラムリンチド(pramlintide)(SYMLIN(商標))、エキセンディン(exendin)−4(EXENATIDE(商標))、GIP、GLP−1、GLP−1受容体アゴニスト、GLP−1アナログ、ハムスターINGAPペプチド、および関連ペプチド、リラグルチド(Liraglutide)(NN2211)、ならびにGLP−1の分解を阻止するジペプチジルペプチダーゼ阻害剤から選択される。
別の実施形態において、損なわれた膵機能に関連する病状の処置が必要な被験体においてそのような処置を行う方法が提供される。該方法は、(1)血糖コントロールを強化する工程;(2)25−ヒドロキシビタミンレベルを40ng/ml超に維持するために経口ビタミンD3(コレカルシフェロール)またはビタミンD2(エルゴカルシフェロール)を投与する工程;(3)新しい膵島細胞の形成を保護するために1若しくはそれ以上の免疫療法を施す工程(免疫抑制剤の投与を含む);(4)最適化された膵島形成促進性ペプチド化合物(最適化されたHIPを含む)をインスリンと併用して投与するが、投与されるインスリンを時間とともに減少させる工程;および(5)最適化されたHIPを投与する工程に加えて、選択される免疫療法に応じて3〜24ヶ月を基礎として、好ましくは膵島を保護するための治療を繰り返し施す工程のうちの1若しくはそれ以上を有し得る。
別の実施形態において、損なわれた膵機能に関連する病状の処置が必要な被験体においてそのような処置を行う方法が提供される。該方法は、以下の工程:(1)血糖コントロールを強化する工程;(2)25−ヒドロキシビタミンレベルを40ng/ml超に維持するために経口ビタミンD3(コレカルシフェロール)を投与する工程;(3)最適化された膵島形成促進性ペプチド化合物(最適化されたHIPを含む)に加えて、膵島の再生を刺激するための薬剤(これに限定されるものではないが、HIPおよび最適化されたHIP以外のHIPアナログを含む)を投与する工程;(4)アミリン/プラムリンチド(SYMLIN(商標))、エキセンディン−4(EXENATIDE(商標);BYETTA(商標))、ガストリン、上皮成長因子および上皮成長因子アナログGIP、GLP−1、GLP−1受容体アゴニスト、GLP−1アナログ、INGAP、リラグルチド(NN2211)、ならびにGLP−1の分解を阻止するジペプチジルペプチダーゼIV阻害剤から成る群から選択される薬剤を同時投与する工程;および(5)別の糖尿病治療の施与を減少するかまたは漸減させる工程のうちの1若しくはそれ以上を有し得る。
別の実施形態において、損なわれた膵機能に関連する病状の処置が必要な被験体においてそのような処置を行う方法が提供される。該方法は、最適化されたHIPを含む最適化された膵島形成促進性ペプチド化合物を投与する工程に加えて、膵島を標的にする自己免疫細胞を阻害するか、阻止するか、または破壊する1若しくはそれ以上の薬剤を投与する工程を有し得る。そのような治療は、上記で「免疫療法」と呼ばれる。この実施形態の様々な態様において、膵島を標的にする自己免疫細胞を阻害するか、阻止するか、または破壊する薬剤は、個別に投与されるか、または互いに併用されて投与される以下のものから成る群から選択される。hOKT3γ1(Ala−Ala)(テプリズマブ(teplizumab))を含む抗CD−3抗体;免疫応答を標的にし、特に、1型糖尿病におけるベータ細胞の死を引き起こすT−リンパ球を阻止するChAglyCD3;細胞傷害性T−リンパ球抗原4であるCLTA−4Ig(アバタセプト);単独またはタクロリムス(FK506)若しくはIL−2(ラパミューン(rapamune))のいずれかとの併用でのシロリムス(ラパマイシン);単独またはプロロイキン(Proleukin)(アルデスロイキン)との併用でのラパミューン;熱ショックタンパク質60(Diapep277);抗グルタミン酸デカルボキシラーゼ65(GAD65)ワクチン;糖尿病抑制性樹状細胞ワクチン、GSK189075、ジアゾキシド、およびベータ細胞の機能を保存する薬剤として利用されるアトルバスタチンを含むスタチン薬、単独またはダクリズマブとの併用でのミコフェノール酸モフェチル;抗CD20剤であるリツキシマブ;キャンパス(Campath)−1H(抗CD52抗体)、リソフィリン(lysofylline);ポリクローナル抗T−リンパ球グロブリン(ATG/サイモグロブリン(Thymoglobulin))、顆粒球コロニー刺激因子、ニューラスタ(Neulasta)(ペグフィルグラスチム(Pegfilgrastim))、ビタミンD、25ヒドロキシと1,25ヒドロキシビタミンDの両方の補給;膵ベータ細胞の破壊を妨げるように設計された代謝的に不活性型の合成インスリンであるIBC−VSOワクチン;インターフェロン−アルファ;CD4+CD25+抗原特異的制御性T細胞またはランゲルハンス島内のベータ細胞に対する免疫攻撃を抑制するように設計された任意の薬剤を用いるワクチン、プロキマル(Prochymal)(ヒト成体幹細胞)、抗炎症性アナキンラ、および抗炎症剤、デオキシスペルグアリン、炎症促進性サイトカインの産生を阻止し、T細胞およびB細胞を阻害する抗炎症剤。これらの薬剤または類似の薬剤は、直接またはインスリン産生細胞の破壊を停止する免疫療法の使用を介して制御性T細胞を利用する併用療法において使用され得る。
別の実施形態において、損なわれた膵機能に関連する病状の処置が必要な被験体においてそのような処置を行う方法(ここで、最適化されたHIPを含む最適化された膵島形成促進性ペプチド化合物の投与の結果として、損なわれた膵機能に関連する病状の少なくとも1つの症状が、処置されるか、または低減される)が提供される。この実施形態の1つの態様において、該症状は、低レベルのインスリンまたはインスリン活性、インスリン抵抗性、高血糖症、6.0%超のヘモグロビンA1Cレベル、頻尿、過度の口渇、極度の空腹、普通でない体重減少または体重増加、過体重、強い疲労、被刺激性、ぼやけた視野、性器のかゆみ、奇妙な痛みおよび疼痛、口渇、乾燥皮膚または痒い皮膚、不能、腟酵母菌感染、切り傷およびすり傷の治癒不良、過剰な感染または普通でない感染、血糖コントロールの喪失または悪化、血中グルコースの周期的変動、血中グルカゴンの周期的変動、および血中トリグリセリドの周期的変動、そして最終的には微小血管および大血管の合併症をもたらす高血糖症(失明をもたらす視覚的症状、透析および腎臓移植が必要となる腎不全をもたらし得る加速型腎臓機能障害、ならびに足潰瘍および足切断術に至るニューロパシーを含む)から選択される。さらに、最近の研究から、血糖コントロールが改善した1型糖尿病患者において微小血管と大血管/心臓血管の両方のリスクの低下が証明された。
別の実施形態において、損なわれた膵機能に関連する病状の処置が必要な被験体においてそのような処置を行う方法が提供される。損なわれた膵機能に関連する病状は、1型糖尿病、初発1型糖尿病、2型糖尿病、成人潜伏性自己免疫性糖尿病、前糖尿病、空腹時血糖異常、耐糖能障害、インスリン抵抗性症候群、代謝症候群/代謝異常症候群、過体重、肥満症、高脂血症、高トリグリセリド血症、摂食障害、無***性周期、および多嚢胞性卵巣症候群のうちのいずれか1つである。
本開示の実施形態は、最適化されたHIPを含む最適化された膵島形成促進性ペプチド化合物に選択的に結合する抗体も提供する。1つの実施形態において、該抗体は、モノクローナル抗体である。別の実施形態において、該抗体は、ポリクローナル抗体である。そのような抗体は、本明細書中に提供される診断方法において使用され得、該方法は、哺乳動物の血清中または組織内の最適化されたHIPレベルを検出する工程を有する。1つの実施形態において、該診断方法は、そのような治療を受けている患者において治療的に有効なレベルが達成されていることを確実にするために、最適化されたHIPによる処置をモニターするために用いられる。
本開示の実施形態は、1型若しくは2型糖尿病または異常なインスリンレベル、グルコース代謝の乱れ、若しくはインスリン抵抗性が存在する他の状態を有する患者を処置するためのキットも提供し、該キットは、治療的に有効な用量の最適化された膵島形成促進性ペプチド化合物(最適化されたHIPを含む)ならびに任意選択で、GLP−1受容体を刺激するため若しくはGLP−1レベルを上昇させるため、ベータ細胞の再生、強い満腹、食物摂取の減少、および体重減少を促進するための少なくとも1つの薬剤、ならびにそれを使用するための指示書を同じ包装内または別個の包装内に含む。さらなる実施形態は、サンプル中の最適化されたHIPのレベルを含む最適化された膵島形成促進性ペプチド化合物を測定するためのキットを提供し、該キットは、最適化されたHIP特異的抗体を含む最適化された膵島形成促進性ペプチド抗体、および任意選択で、最適化されたHIPを含む最適化された膵島形成促進性ペプチド化合物、および任意選択で、標識手段を含む。
この特許の資料は、カラー仕上げの少なくとも1つの写真または図面を含む。カラーの図面または写真を含むこの特許のコピーは、請求および必要な手数料の支払いに応じて、特許庁(Patent and Trademark Office)によって提供されるだろう。
本発明の性質および利点をさらに理解するために、添付の図面に関連させて、以下の詳細な説明を参照するべきである。
図1は、HIP1、HIP2、およびHIP3とともに、ヒト膵管組織を含む培養物をインキュベーションした後のインスリンレベルを表しているグラフである。
図2は、HIP1、HIP2、およびHIP3で処置されたマウスにおけるインスリン必要量を表しているグラフである。
図3は、HIP1、HIP2、およびHIP3で処置されたマウスにおける、ベースラインからのグルコースの平均の減少を表しているグラフである。
図4Aは、HIP2およびHIP3で処置されたマウスにおける膵島の数を表しているグラフである。
図4Bは、プラセボ処置マウスおよびHIP処置マウスにおけるインスリン免疫染色の代表的な像を提供し、インスリン染色された膵島は、これらの構造を自家蛍光の血液細胞と区別するために黄色で輪郭が描かれている。スケールバー=すべての像において50μm。
図5は、HIPで処置されたマウス膵臓組織におけるインスリンに対する免疫蛍光染色である。
図6は、ラットにおいて筋肉内に送達されたHIPの半減期を表しているグラフである。
図7は、ラットにおいて皮下に送達されたHIPの半減期を表しているグラフである。
図8は、血漿中のHIP2およびHIP2Bのインビトロでの経時的な安定性を表しているグラフである。
図9Aは、様々なHIPおよび最適化されたHIPとのインキュベーションに応答した、非還元条件下および還元条件下でのPANC−1細胞からのヒトインスリン発現を示しているウエスタンブロット解析である。図9Bは、様々なHIPおよび最適化されたHIPとのインキュベーションに応答した、非還元条件下および還元条件下でのポンソー染色である。
図10Aは、4日間にわたってHIP2および最適化されたHIPペプチドで処理されたPANC−1細胞を示しており、200倍の倍率で第7日目に撮影された像である。
図10Bは、7日間にわたるPANC−1細胞の形態の変化の経過を示しており(コントロール、HIP2、およびHIP2B)、200倍の倍率で第1、2、3、5、および7日目に撮影された像である。
図10Cは、コントロールおよび最適化されたHIP(HIP2二量体およびHIP2PEG)で処理されたPANC−1細胞の形態学的な変化の経過を示している。
図11は、HIP2B投与後の、ヒト膵臓細胞における核およびインスリンを示すCK19およびDAP1に対する染色である。
図12は、プラセボおよびリソフィリン(LSF)、HIP2およびLSF、ならびにHIP2BおよびLSFで処置された後の3匹のNODマウスのグルコースレベルを表しているグラフである。
図13は、48時間にわたって150μMのHIPおよび最適化されたHIPペプチドで処理された後のPANC−1細胞のCy3二重抗体免疫組織化学的染色であり、HIPおよび最適化されたHIPによる刺激において、PANC−1細胞の細胞膜から細胞質へのHIP受容体のトランスロケーションを示している。
図14は、HIPおよび最適化されたHIP2Bペプチドを含むSFMおよびTSFM中の露光調整されたPANC−1細胞を示している。
図15は、免疫蛍光解析を用いた、PANC−1細胞に対する最適化されたHIP2ペプチドの影響の反復評価を示しており、HIP2Bが、HIP受容体(EXTL)と相互作用し、HIPによる刺激においてHIP受容体が包み込まれ、細胞膜から細胞質内、そして核にもたらされることが示唆される。
図16は、最適化されたHIP2Bが、PANC−1細胞における細胞膜から核へのHIP受容体(EXTL3)のトランスロケーション時間を増加させるというウエスタンブロットを示している。
図17は、HIP2、HIP2B、およびプラセボを投与した後のSTZ−糖尿病マウスモデルにおける毎日の平均グルコースレベルを表しているグラフである。
図18は、HIP2B処置群(緑色)およびコントロール群(紫色)およびプラセボ群のマウスにおける毎日のグルコースレベルを表しているグラフである。
図19は、介入の開始時および終了時における、HIP2B(黄色)、HIP2(緑色)、およびコントロール(青色)処置群のマウスにおけるグルコースレベルを表しているグラフである。
図20は、空腹時グルコースレベルを非糖尿病性の範囲およびSTZ処置前のベースラインのグルコースレベルの範囲未満のレベルに回復させる最適化されたHIP2Bの影響を示している。
図21は、研究の終了時における処置群の耐糖能試験の結果を示しており、最適化されたHIP2B処置群において低いグルコースレベルが見られる。
図22は、最大の有効性をもたらす最小の可能投薬量を決定するために、マウスの糖尿病モデルにおいて様々な投薬量で送達されたときの、グルコースコントロールに対する最適化されたHIP2Bの作用を比較する、STZ誘導糖尿病マウスにおける最適化されたHIP2Bの用量反応解析研究を示している。
図23は、糖尿病の減弱に対する様々な濃度のHIP2Bの影響を示している。
図24は、4mg/kgでSprague Dawleyラットに皮下投与および静脈内投与した後のHIP2B、HIP2、およびINGAPの薬物動態学的解析を示している。
図25は、皮下に送達された最適化されたHIP2Bの薬物動態学的解析を示している。
本組成物および本方法を説明する前に、説明される特定のプロセス、組成物、または方法が変化し得るので、本発明がこれらに限定されないことが理解されるべきである。その説明において使用される用語は、特定のバージョンまたは実施形態だけを説明する目的であること、および添付の請求項によってのみ限定される本発明の範囲を限定すると意図されないことも理解されるべきである。別段定義されない限り、本明細書中で使用される技術用語および科学用語のすべてが、当業者が通常理解している意味と同じ意味を有する。本明細書中に記載される方法および材料と類似または等価な任意の方法および材料が、本発明の実施形態の実施または試験において使用され得るが、好ましい方法、デバイス、および材料が、ここで説明される。本明細書中で言及されるすべての刊行物は、その全体がこの参照により組み込まれる。本発明が先願発明によってそのような開示に先行する権利がないという承認として解釈されるものは本明細書中に無い。
インスリンは、1922年以来、1型糖尿病およびインスリンの有効性または産生の不足または低下に関係する他の状態の処置のための、唯一の利用可能な治療ではないにしても、主要な治療である。しかしながら、インスリンが、欠損している膵機能および異常な膵機能の一部であるので、インスリンを受けている糖尿病患者は、正常なグルコース代謝を有しない。
現在までに、1型または2型糖尿病のいずれかの基礎をなす疾患メカニズムを処置するために首尾よく使用される単独療法または併用療法は存在しない。膵臓内のインスリン産生細胞の再生を刺激する好結果の処置の開発は、糖尿病を有する患者にとって重大な処置法のブレークスルーとなる。いくつかの文献が、ベータ細胞そのものまたは膵島全体を指すために、用語「膵島細胞」をまぎらわしく使用している。しかしながら、一部の処置選択肢が、ベータ細胞の数を増加させようとしているのに対し、内因的に膵島全体を置き換える利用可能な処置は、膵島移植以外にないので、ベータ細胞と膵島とを区別することは重要である。
数十年に及ぶ研究および1974年の膵島移植の出現および最近の膵島移植のEdmontonプロトコルに起因する成功が主張されているにもかかわらず、これらのアプローチは、米国において大いに成功していない。例えば、移植の4年後において、膵島移植を受けた患者の10%未満だけが、インスリン非依存性のままである。さらに、重篤な副作用の割合が18%である。1型糖尿病の発症時において、患者は、すでに膵島の大部分を失っており、その膵島の数は、着実に減少し続けることが立証されている。しかしながら、最近の研究から、2型糖尿病の診断時には、患者は、少なくとも50%の膵島の質量および数の喪失を示すことが見出された。膵島の数および質量は、自己免疫性攻撃からではないが、ベータ細胞が事実上「燃え尽きる」ようになるので、1型患者と同様に、減少し続ける。この減少は、1型患者ではより迅速に生じるが、2型患者でもなお1年あたり10〜20%減少する。
正常に機能している膵臓では、少数の膵島が、毎日自然に死に、制御下でグルコースレベルを維持するために必要であるので、置き換えられている。膵島新生として知られるこの再生プロセスは、平均して1ヶ月あたり約2%の割合で膵島を置き換える。非糖尿病患者では、既存の膵島内のベータ細胞の質量は、その個体のインスリンの必要性に応じて、拡大または収縮し得る。このプロセスは、「ベータ細胞増殖」と呼ばれ、1型糖尿病を有する患者では生じず、2型患者では限定的である。
膵島新生に関する研究は、新しいものではない。1920年に、閉塞性膵石(obstructive pancreatic stone)では、ほとんどの膵臓の萎縮がもたらされたが、膵島が増加したことが報告された。そして、膵管を結紮すること(縛ること)によって、糖尿病の処置に有用であり得る物質が同定され得るという仮説が立てられた。新しい膵島を形成し得る物質の産生を期待して、外科医は、糖尿病小児の膵管を結紮した。これらの手順の正の作用は、長続きしなかったが、ヒトにおける膵島修復に対する可能性が証明された。
膵炎に対するハムスターモデルの作製を意図した膵管結紮研究によって、多くの新しい膵島が形成された。この研究によって、膵島新生関連(Islet Neogenesis Associated)ペプチド、すなわちINGAPと呼ばれるハムスターペプチドが単離された。INGAPの臨床開発において、新しいヒト膵島が、1型糖尿病を発症した数十年後であっても成人の膵臓全体に存在する幹細胞様の膵島前駆細胞から分化され得ることがさらに証明された。
管の結紮を用いて新しい膵島を産生するという概念とは別に、妊娠中の膵島の潜在的な再生に関する研究が行われた。膵島は、胚形成後期に形成されることが報告され、膵島集団は、周囲の管組織からの変態のプロセスを通じて出生後に成長し続けることが述べられた。
1型または後期2型糖尿病を有する患者が自身の疾患を管理する主要な方法は、皮下注射を介するかまたは皮下ポンプ注入を使用することによるインスリンの投与によるものである。インスリン治療は、明らかな生活様式の不都合の上に、身体の正常な制御機構と調和せず、ゆえにグルコースの周期的変動を完全に管理しない。添付の図表によって示されるように、最も良好に制御されている1型糖尿病患者でさえも、正常なグルコース代謝と同様の遠隔的なものを有しない。これは、インスリン分泌が、失っている膵機能の一部であることが理由である。
研究者らは、インスリンの内因性の産生が薬物処置によって刺激され得るか否かを評価してきた。例えば、過去数十年にわたって、グルコース代謝に関与するペプチドまたはそのようなペプチドのアナログを糖尿病患者に投与するいくつかの治療が研究されてきた。これらの治療は、グルカゴン様ペプチド−1(Glucagon Like Peptie−1:GLP−1)のアミノ酸配列と類似のアミノ酸配列を有するペプチドの投与を含み、そのようなペプチドには:GLP−1受容体アナログ、エキセンディン−4、アメリカドクトカゲ由来のエクセナチド(Exenatide)/BYETTA(商標)、Januvia(商標)、胃抑制性ペプチド/グルコース依存性インスリン分泌性ポリペプチド(Glucose−Dependent Insulinoptropic polypeptide:GIP)、GLP−1に相同な化合物(例えば、リラグルチド(NN2211))、GLP−1の分解を阻害するジペプチジルペプチダーゼ−4阻害剤、ガストリン、上皮成長因子、および上皮成長因子アナログ、ならびにハムスター由来の膵島新生関連ペプチド(Islet Neogenesis Associated Peptide:INGAP)が含まれる。
これらの処置は、糖尿病の基礎をなすメカニズムを逆転させる際に有効であると証明されていない。新しい膵島の生成は、インスリンを産生するベータ細胞を形成するだけでなく、グルコース代謝に関与する他の細胞も形成する。その結果として、新しい膵島が十分に生成される場合、患者は、究極的には、血糖コントロールを回復することができる。ゆえに、膵島新生は、糖尿病を処置するだけでなく、糖尿病を実際に逆転させる可能性を示す。
有効な任意の膵島細胞新生剤について、膵臓は、新しい膵島細胞を生成する能力に関して「柔軟性」がなければならない。膵島の死またはアポトーシスに応答してその生涯を通じて新しい膵島が生成されることに関する膵臓の柔軟性の証明は、インスリンを産生する膵島構造物の数が、出生時に固定され、生涯を通じて維持されるという長きにわたって保持されていた概念に取って代わり、ベータ細胞が既存の膵島内で増殖する柔軟性および能力が十分に立証された。現在は、膵島新生が、膵臓の内分泌と外分泌の両方の部分に見られる前駆細胞の分化によって、前から存在する膵臓細胞から生じることが受け入れられている。データは、1型糖尿病の発症の数十年後であっても、膵島が再生され得ることを証明している。
例えば、1型糖尿病を有する患者は、妊娠中に正常レベルのC−ペプチドを産生することができる。いくつかのチームが、妊娠中のすべての1型患者の3分の1もの患者において、妊娠の第1三半期中にC−ペプチドレベルが奇妙にも正常範囲に上昇したことを見出した。このC−ペプチドの増加は、インスリン必要量の著しい減少を伴い、一部の患者は、妊娠の第1三半期中、一過性にインスリンを中断することができる。妊娠前にはC−ペプチドは測定不可能であったにもかかわらず、患者において10週間の妊娠期間内に起きる妊娠中のC−ペプチドの増加は、機能する膵島構造物の回復を暗示する。妊娠中に起きる膵島新生は、内因性のステロイド産生と、胎児に対する免疫攻撃を防ぐ免疫系のダウンレギュレーションとが同時に生じることに起因するという仮説が立てられ、これもまた、膵島に対するリンパ球攻撃の抑制におそらく関与する。免疫抑制に加えて、妊娠中の母体のグルコース設定値の低下を補う妊娠中の母体の膵島成長促進因子がアップレギュレーションされることも推測される。動物モデルもまた、膵島新生が妊娠中のベータ細胞の拡大の進展に先行することを証明し、ヒト膵臓前駆細胞が膵島に分化することを証明した。同様に、腎臓移植のために長期間にわたって免疫抑制されていた患者において、インスリンを産生する膵島の再生が観察された。
過去10年にわたって、膵臓のベータ細胞の破壊を停止し得るいくつかの免疫調節因子(immune modulators)の影響を評価する臨床試験が行われてきた。この目的のために、免疫応答を標的にし、特に、1型糖尿病においてベータ細胞の死を引き起こすT−リンパ球を阻止する抗CD−3抗体(例えば、hOKT3γ1(Ala−Ala)およびChAglyCD3)が利用され、シロリムス(ラパマイシン)、タクロリムス(FK506)、熱ショックタンパク質60(DIAPEP277(商標))、抗グルタミン酸デカルボキシラーゼ65(Glutamic Acid Decarboxylase 65:GAD65)ワクチン、単独またはダクリズマブとの併用でのミコフェノール酸モフェチル、抗CD20剤、ポリクローナル抗T−リンパ球グロブリン(Anti−T−lymphocyte globulin:ATG)、リソフィリン、リツキシマブ、キャンパス−1H(抗CD52抗体)、ビタミンD、IBC−VSOワクチン(膵臓ベータ細胞の破壊を妨げるように設計された代謝的に不活性型の合成インスリンである)、およびCD4+CD25+抗原特異的制御性T細胞を用いるインターフェロン−αワクチン接種の投与を含む処置も利用された。これらの治療的なアプローチは、直接またはインスリン産生細胞の破壊を停止する免疫療法の使用を介して制御性T細胞を利用することを意図される。これらの治験の目的は、そのような薬剤が、膵臓の膵島のベータ細胞に対するさらなる免疫攻撃を防ぐことによって膵島の機能を保存する能力を判定することである。
さらに、最近の研究から、ビタミンDが、1型糖尿病の予防において重要な免疫調節の役割を果たし得ることが見出された。米国の集団の最大54.7%が、緯度に関係なく、低い25ヒドロキシビタミンDレベルを有する。ビタミンD欠乏は、1型糖尿病のリスクの上昇に関連し、1型診断の開始時に見られると証明されているだけでなく、1型と2型の両方の糖尿病患者に一般に見られる。40ng/ml超にレベルを維持することが、正常な免疫機能を持続するために推奨されている。10,000IU/日までの用量では有害作用は見られていない。
以下の定義は、読み手を助けるために提供される。別段定義されない限り、技術の用語、表記および他の科学用語若しくは医学用語または本明細書中で使用される用語のすべてが、化学分野および医学分野の当業者が通常理解する意味を有すると意図される。いくつかの場合において、通常理解されている意味を有する用語が、明確にするためおよび/または迅速な参照のために本明細書中で定義され、本明細書中のそのような定義の包含は、当該分野で一般に理解されている用語の定義に対してかなりの相違を表すと必ずしも解釈されるべきでない。
本明細書中および添付の請求項において使用されるとき、単数形「a」、「an」、および「the」は、文脈が明らかに別のことを指示しない限り、複数の指示物を含むことにも注意されなければならない。したがって、例えば、「線維芽細胞」(a"fibroblast")という言及は、1若しくはそれ以上の線維芽細胞および当業者に公知のその等価物などの言及である。
本明細書中で使用されるとき、用語「約」は、使用されている数の絶対値のプラスまたはマイナス10%を意味する。ゆえに、約50%とは、45%〜55%の範囲を意味する。本明細書中で使用されるとき、「膵島形成促進性ペプチド」とは、膵島細胞新生を刺激するタンパク質またはそのようなタンパク質から得られるペプチドのことを指し、これに限定されるものではないが、ヒトREG3A(配列ID番号1)、ヒトREG3G(配列ID番号28)、ヒトREG1A、ヒトREG1B、ヒトREG4、ハムスターINGAP(配列ID番号27)、ハムスターREG2、ハムスターREG3G、ラットREG1、ラットPAP/REG3B、ラットPAP3、ラットREG3G、マウスREG1、マウスREG2、マウスREG3A、マウスREG3B、マウスREG3G、マウスREG3S、マウスREG4、ウシPTP、チンパンジー、ウシ、イヌ、ヒツジ、ならびにそのようなタンパク質のアナログおよびホモログ、ならびにそのようなタンパク質またはそのホモログから得られるペプチドフラグメントを含む。そのような膵島形成促進性ペプチドのタンパク質配列は、公的に入手可能である。膵島形成促進性ペプチドは、REG3A、INGAP、またはHIP2の活性な14アミノ酸配列(または各ホモログに対する対応配列)を含むホモログタンパク質のフラグメントであるペプチドをさらに含み(下記の表1を参照のこと)、150アミノ酸未満、125アミノ酸未満、100アミノ酸未満、75アミノ酸未満、50アミノ酸未満、または25アミノ酸未満である。そのようなペプチド(活性な14アミノ酸配列を提供する)の例は、これに限定されるものではないが、以下のものを含む。
そのようなペプチドフラグメントは、これに限定されるものではないが、以下で同定される、HIP1、HIP2、HIP3、INGAPペプチド(配列ID番号26)、およびそれらのホモログを含む。ラット遺伝子と類似のヒト遺伝子がヒトにおいて見られ(それは、Reg遺伝子と呼ばれる)、そしてHIPが見出された遺伝子がヒトに存在し、ヒト膵島形成促進性ペプチドの種間および他の哺乳動物種間には高い相同性が存在する。以下の種相同性の図表は、HIP関連配列が、進化を通じて精巧に保存されていることを示している。これらの配列の各々は、ヒトにおいていくらかの有効性を有する可能性があるが、厳密には、ヒトの活性なHIP配列と一致するものはない。
上の表は、他の種と比較されている14アミノ酸HIP2配列を含む16アミノ酸長のヒトペプチドを比較している。
本明細書中で使用されるとき、「最適化された膵島形成促進性ペプチド」とは、膵島形成促進性ペプチドのバリエーションのことを指し、これに限定されるものではないが、ヒトREG3A、ヒトREG3G、ヒトREG1A、ヒトREG1B、ヒトREG4、ハムスターINGAP、ハムスターREG2、ハムスターREG3G、ラットREG1、ラットPAP/REG3B、ラットPAP3、ラットREG3G、マウスREG1、マウスREG2、マウスREG3A、マウスREG3B、マウスREG3G、マウスREG3S、マウスREG4、ウシPTP、チンパンジー、ウシ、イヌ、ヒツジ、ならびにそのようなタンパク質のアナログおよびホモログ、ならびにそのようなタンパク質またはそのホモログから得られるペプチドフラグメント、HIP1、HIP2、および/若しくはHIP3、またはそのようなペプチドのホモログ(配列ID番号31〜90)を含み、該ペプチドは、様々な実施形態において記載されるように、そのようなペプチドの安定性、溶解性、またはバイオアベイラビリティを高めるように改変されている。本開示の目的の場合、安定性とは、最適化されていない膵島形成促進性ペプチド、REG3A、REG3G、INGAP、REG3Gペプチド、INGAPペプチド、HIP1、HIP2、および/若しくはHIP3、またはそのようなペプチドのホモログを標的にし、分解する血清中のプロテアーゼによる分解に対するペプチドの抵抗性のことを指す。また、本開示の目的の場合、バイオアベイラビリティとは、該ペプチドがプロテアーゼによる分解および最適化されていない膵島形成促進性ペプチド、ヒトREG3A、ヒトREG3G、ヒトREG1A、ヒトREG1B、ヒトREG4、ハムスターINGAP、ハムスターREG2、ハムスターREG3G、ラットREG1、ラットPAP/REG3B、ラットPAP3、ラットREG3G、マウスREG1、マウスREG2、マウスREG3A、マウスREG3B、マウスREG3G、マウスREG3S、マウスREG4、ウシPTP、チンパンジー、ウシ、イヌ、ヒツジ、ならびにそのようなタンパク質のアナログおよびホモログ、HIP1、HIP2、および/若しくはHIP3、またはそのようなペプチドのホモログを分解した他の全身性経路による分解を回避する能力に基づいて標的細胞、経路および/または全身のメカニズムによるインビボでの治療的な使用に利用可能なペプチドの量のことを指す。好ましくは、最適化された膵島形成促進性ペプチドとは、REG3Gペプチド、INGAPペプチド、HIP3、HIP1、および/若しくはHIP2、またはC末端のアミド基およびN末端のアセチル基の付加によってブロックされているホモログ、ペグ化されているホモログ、ならびにそれらの組み合わせのホモログのことを指す。
本明細書中で使用されるとき、「最適化されたHIP」とは、HIPのバリエーションであるHIP1および/またはHIP2のことを指し、該ペプチドは、本明細書中の実施形態に記載されているようにHIP、HIP1またはHIP2の安定性、溶解性、またはバイオアベイラビリティを高めるように改変されている。本開示の目的の場合、安定性とは、最適化されていないHIP3、HIP1、および/またはHIP2を標的にし、分解する血清中のプロテアーゼによる分解に対するペプチドの抵抗性のことを指す。また、本開示の目的の場合、バイオアベイラビリティとは、該ペプチドがプロテアーゼによる分解および最適化されていないHIP3、HIP1、および/またはHIP2を分解した他の全身性経路による分解を回避する能力に基づいて標的細胞、経路および/または全身のメカニズムによるインビボでの治療的な使用に利用可能なペプチドの量のことを指す。好ましくは、最適化されたHIPとは、C末端のアミド基およびN末端のアセチル基の付加によってブロックされ、ペグ化され、そしてそれらの組み合わせの、HIP3、HIP1、および/またはHIP2のことを指す。
本明細書中で使用されるとき、状態または患者を「処置する」とは、臨床結果を含む有益な結果または所望の結果を得るための工程を行うことを指す。本開示の目的の場合、有益な臨床結果または所望の臨床結果は、これに限定されるものではないが、糖尿病の1若しくはそれ以上の症状の軽減または回復、疾患の程度の低下、疾患進行の遅延または低速化、疾患状態の回復、寛解、または安定化、および以下に記載される他の有益な結果を含む。糖尿病の症状は、低レベルまたは不適当なレベルのインスリンまたはインスリン活性、頻尿、過度の口渇、極度の空腹、普通でない体重減少、強い疲労、被刺激性、ぼやけた視野、性器のかゆみ、奇妙な痛みおよび疼痛、口渇、乾燥皮膚または痒い皮膚、不能、腟酵母菌感染、切り傷およびすり傷の治癒不良、過剰な感染または普通でない感染、高血糖症、血糖コントロールの喪失、食後血中グルコースの周期的変動、血中グルカゴンの周期的変動、血中トリグリセリドの周期的変動を含む。糖尿病は、当業者に周知の方法によって診断され得る。例えば、通常、糖尿病患者は、126mg/dLよりも高いグルコースの血漿血糖結果を有する。本明細書中に開示される組成物および方法によっても処置され得る前糖尿病は、通常、100と125mg/dLと間のグルコースの血糖値を有する患者において診断される。他の症状もまた、糖尿病、関連する疾患および状態、ならびに膵機能の低下によって影響を受ける疾患および状態を診断するために使用され得る。
本明細書中で使用されるとき、症状の「減少」(およびこの句の文法上の等価物)は、症状の重症度若しくは頻度の低下、またはその症状の消失を意味する。
用語「阻害する」は、前記症状の発症を予防するため、前記症状を緩和するため、または前記疾患、状態若しくは障害を消失するための本開示の化合物の投与を含む。
本明細書中で使用されるとき、「損なわれた膵機能に関連する病状」は、その病状が、ホルモンおよび/またはサイトカインを産生および/または分泌する被験体の膵臓に対する被験体における能力の低下に関連する病状のことである。好ましくは、このホルモンまたはサイトカインは、インスリンである。損なわれた膵機能に関連する病状は、1型糖尿病、初発1型糖尿病、2型糖尿病、成人潜伏性自己免疫性糖尿病、前糖尿病、空腹時血糖異常、耐糖能障害、インスリン抵抗性症候群、代謝症候群、過体重、肥満症、高脂血症、高トリグリセリド血症、摂食障害および多嚢胞性卵巣症候群を含む。
本明細書中で使用されるとき、被験体に薬物若しくは治療薬を「投与する」または被験体への薬物若しくは治療薬の「投与」(およびこの句の文法上の等価物)は、直接投与(自己投与、標的組織中若しくは標的組織上への直接的なもの、または被験体に治療薬を投与することによって、その治療薬が標的にしている組織を積極的に攻撃することを含む)と間接投与(薬物を処方する行為を含む)の両方を含む。例えば、本明細書中で使用されるとき、薬物を自己投与するように患者に指示する医師および/または薬物についての処方を患者に提供する医師は、その患者に薬物を投与している。
本明細書中で使用されるとき、「被験体」または「患者」は、哺乳動物、典型的にはヒトであるが、任意選択で、獣医学上重要な哺乳動物であり、これに限定されるものではないが、ウマ、ウシ、ヒツジ、イヌ、およびネコを含む。
本明細書中で使用されるとき、疾患の「徴候」とは、その疾患を有する被験体に特徴的な、症状、兆候、解剖学的状態(例えば、膵島細胞の欠如)、生理学的状態(例えば、グルコースレベル)、または報告(例えば、トリグリセリドレベル)のことを指す。
本明細書中で使用されるとき、薬物または薬剤の「治療有効量」は、疾患または状態を有する被験体に投与されるときの薬物または薬剤の量であり、意図される治療効果、例えば、その被験体におけるその疾患または状態の1若しくはそれ以上の徴候の軽減、回復、寛解、または消失を有する。完全な治療効果は、必ずしも1用量の投与によって生じず、一連の用量の投与後にのみ生じ得る。したがって、治療有効量は、1若しくはそれ以上の投与において投与され得る。
本明細書中で使用されるとき、薬物の「予防有効量」は、被験体に投与されるときに、意図される予防効果、例えば、疾患若しくは症状の発症(または再発)の予防若しくは遅延、または疾患若しくは症状の発症(または再発)の可能性の低下を有する薬物の量のことである。完全な予防効果は、必ずしも1用量の投与によって生じず、一連の用量の投与後にのみ生じ得る。したがって、予防有効量は、1若しくはそれ以上の投与において投与され得る。
「薬学的に許容可能な」とは、キャリア、希釈剤、または賦形剤が、その処方物の他の成分と適合性でなければならず、かつそのレシピエントに対して有害でないものでなければならないことを意味する。
本明細書中で使用されるとき、「TID」、「QD」、および「QHS」は、それぞれ「1日3回」、「1日1回」、および「就寝前に1回」という通常の意味を有する。
薬剤の「併用」投与は、平行投与(ある期間にわたって患者に両方の薬剤を投与すること、例えば、1ヶ月間にわたって1日おきのモノクローナル抗体およびペプチドホルモン(例えば、インクレチンホルモンまたはアナログ)の投与)、同時投与(薬剤を、互いにほぼ同時に、例えば、およそ数分から数時間以内に投与すること)、および併用処方物(co−formulation)(薬剤を経口、皮下または非経口投与に適した単回投与形態に混合するか、または調合すること)を含む。
「DPP−4阻害剤」は、ジペプチジルペプチダーゼ−4阻害剤である。
「ハムスターINGAP」は、配列Ile−Gly−Leu−His−Asp−Pro−Ser−His−Gly−Thr−Leu−Pro−Asn−Gly−Ser(配列ID番号26)を有する非ヒト膵島新生関連ペプチドである。このペプチドは、配列Ile−Gly−Leu−His−Asp−Pro−Ser−His−Gly−Thr−Leu−Pro−Asn−Gly−Ser(配列ID番号27)を有するハムスターINGAPタンパク質のフラグメントである。
「GIP」は、グルコース依存性インスリン分泌性ポリペプチドとしても知られる胃抑制性ペプチドである。
「GLP−1」は、グルカゴン様ペプチド1である。
「HIP3」(Ile−Gly−Leu−His−Asp−Pro−Thr−Gln−Gly−Thr−Glu−Pro−Asn−Gly−Glu(配列ID番号2))は、精製型、合成型、または組換え型でのヒト膵島形成促進性ペプチドである。HIP3は、約1564.6の分子量を有する。
「HIP1」(Trp−Ile−Gly−Leu−His−Asp−Pro−Thr−Gln−Gly−Thr−Glu−Pro−Asn−Gly(配列ID番号3))は、精製型、合成型、または組換え型でのヒト膵島形成促進性ペプチドである。
「HIP2」(Ile−Gly−Leu−His−Asp−Pro−Thr−Gln−Gly−Thr−Glu−Pro−Asn−Gly(配列ID番号4))は、精製型、合成型、または組換え型でのヒト膵島形成促進性ペプチドである。HIP2は、約1435.5の分子量を有する。
HIP3ブロック型すなわちHIP3B(Ac−Ile−Gly−Leu−His−Asp−Pro−Thr−Gln−Gly−Thr−Glu−Pro−Asn−Gly−Glu−NH2)(配列ID番号5))は、N末端のアセチル基およびC末端のアミド基でブロックされている、精製型、合成型、または組換え型でのヒト膵島形成促進性ペプチドである。HIPBは、約1605.7の分子量を有する。
HIP1ブロック型(Ac−Trp−Ile−Gly−Leu−His−Asp−Pro−Thr−Gln−Gly−Thr−Glu−Pro−Asn−Gly−NH2(配列ID番号6))は、N末端のアセチル基およびC末端のアミド基でブロックされている、精製型、合成型、または組換え型でのヒト膵島形成促進性ペプチドである。
HIP2ブロック型すなわちHIP2B(Ac−Ile−Gly−Leu−His−Asp−Pro−Thr−Gln−Gly−Thr−Glu−Pro−Asn−Gly−NH2)(配列ID番号7))は、N末端のアセチル基およびC末端のアミド基でブロックされている、精製型、合成型、または組換え型でのヒト膵島形成促進性ペプチドである。HIP2Bは、約1476.6の分子量を有する。
INGAPペプチドブロック型すなわちINGAPBは、N末端のアセチル基およびC末端のアミド基でブロックされている、精製型、合成型、または組換え型でのINGAPペプチドである。
HIP3Cys(Ile−Gly−Leu−His−Asp−Pro−Thr−Gln−Gly−Thr−Glu−Pro−Asn−Gly−Glu−Cys)(配列ID番号8))は、さらなるC末端のシステイン残基を有する、精製型、合成型、または組換え型でのヒト膵島形成促進性ペプチドである。
HIP1Cys(Trp−Ile−Gly−Leu−His−Asp−Pro−Thr−Gln−Gly−Thr−Glu−Pro−Asn−Gly−Cys)(配列ID番号9))は、さらなるC末端のシステイン残基を有する、精製型、合成型、または組換え型でのヒト膵島形成促進性ペプチドである。
HIP2Cys(Ile−Gly−Leu−His−Asp−Pro−Thr−Gln−Gly−Thr−Glu−Pro−Asn−Gly−Cys)(配列ID番号10))は、さらなるC末端のシステイン残基を有する、精製型、合成型、または組換え型でのヒト膵島形成促進性ペプチドである。
INGAPペプチドCysすなわちINGAPCysは、さらなるC末端のシステイン残基を有する、精製型、合成型、または組換え型でのINGAPペプチドである。
HIP3Cys二量体(Ile−Gly−Leu−His−Asp−Pro−Thr−Gln−Gly−Thr−Glu−Pro−Asn−Gly−Cys)2(配列ID番号11))は、精製型、合成型、または組換え型でのヒト膵島形成促進性ペプチド二量体であり、各単量体は、C末端のシステイン残基を含むように改変されている。この二量体は、個別の単量体のシステイン残基間のジスルフィド結合の形成を介して形成される。
HIP1Cys二量体(Trp−Ile−Gly−Leu−His−Asp−Pro−Thr−Gln−Gly−Thr−Glu−Pro−Asn−Gly−Glu−Cys)2(配列ID番号12))は、精製型、合成型、または組換え型でのヒト膵島形成促進性ペプチド二量体であり、各単量体は、C末端のシステイン残基を含むように改変されている。この二量体は、個別の単量体のシステイン残基間のジスルフィド結合の形成を介して形成される。
HIP2Cys二量体(Ile−Gly−Leu−His−Asp−Pro−Thr−Gln−Gly−Thr−Glu−Pro−Asn−Gly−Cys)2(配列ID番号13))は、精製型、合成型、または組換え型でのヒト膵島形成促進性ペプチド二量体であり、各単量体は、C末端のシステイン残基を含むように改変されている。この二量体は、個別の単量体のシステイン残基間のジスルフィド結合の形成を介して形成される。HIP2は、約1435.5の分子量を有する。
INGAPCys二量体は、精製型、合成型、または組換え型でのINGAPペプチド二量体(各単量体は、N末端のシステイン残基を含むように改変されている)である。
HIP3Cysブロック型(Ac−Ile−Gly−Leu−His−Asp−Pro−Thr−Gln−Gly−Thr−Glu−Pro−Asn−Gly−Glu−Cys−NH2)(配列ID番号14))は、精製型、合成型、または組換え型でのヒト膵島形成促進性ペプチドであり、これは、C末端のシステイン残基を含むように改変されており、N末端のアセチル基およびC末端のアミド基でブロックされている。
HIP1Cysブロック型(Ac−Trp−Ile−Gly−Leu−His−Asp−Pro−Thr−Gln−Gly−Thr−Glu−Pro−Asn−Gly−Cys−NH2)(配列ID番号15))は、精製型、合成型、または組換え型でのヒト膵島形成促進性ペプチドであり、これは、C末端のシステイン残基を含むように改変されており、C末端のアセチル基およびC末端のアミド基でブロックされている。
HIP2Cysブロック型(Ac−Ile−Gly−Leu−His−Asp−Pro−Thr−Gln−Gly−Thr−Glu−Pro−Asn−Gly−Cys−NH2)(配列ID番号16))は、精製型、合成型、または組換え型でのヒト膵島形成促進性ペプチドであり、これは、C末端のシステイン残基を含むように改変されており、N末端のアセチル基およびC末端のアミド基でブロックされている。
INGAPCysブロック型は、精製型、合成型、または組換え型でのINGAPペプチドであり、これは、C末端のシステイン残基を含むように改変されており、N末端のアセチル基およびC末端のアミド基でブロックされている。
HIP3Cysブロック型二量体(Ac−Ile−Gly−Leu−His−Asp−Pro−Thr−Gln−Gly−Thr−Glu−Pro−Asn−Gly−Glu−Cys−NH2)2(配列ID番号17)は、精製型、合成型、または組換え型でのヒト膵島形成促進性ペプチド二量体であり、各単量体は、C末端のシステイン残基を含むように改変されており、N末端のアセチル基およびC末端のアミド基でブロックされている。この二量体は、個別の単量体のシステイン残基間のジスルフィド結合の形成を介して形成される。
HIP1Cysブロック型二量体(Ac−Trp−Ile−Gly−Leu−His−Asp−Pro−Thr−Gln−Gly−Thr−Glu−Pro−Asn−Gly−Cys−NH2)2(配列ID番号18)は、精製型、合成型、または組換え型でのヒト膵島形成促進性ペプチド二量体(各単量体は、C末端のシステイン残基を含むように改変されており、C末端のアセチル基およびC末端のアミド基でブロックされている)である。この二量体は、個別の単量体のシステイン残基間のジスルフィド結合の形成を介して形成される。
HIP2Cysブロック型二量体すなわちHIP2BCys二量体(Ac−Ile−Gly−Leu−His−Asp−Pro−Thr−Gln−Gly−Thr−Glu−Pro−Asn−Gly−Cys−NH2)2(配列ID番号19)は、精製型、合成型、または組換え型でのヒト膵島形成促進性ペプチド二量体であり、各単量体は、C末端のシステイン残基を含むように改変されており、N末端のアセチル基およびC末端のアミド基でブロックされている。この二量体は、個別の単量体のシステイン残基間のジスルフィド結合の形成を介して形成される。HIP2BCys二量体は、約3157.5という分子量を有する。
INGAPCysブロック型二量体は、精製型、合成型、または組換え型でのINGAPペプチド二量体であり、各単量体は、C末端のシステイン残基を含むように改変されており、N末端のアセチル基およびC末端のアミド基でブロックされている。この二量体は、個別の単量体のシステイン残基間のジスルフィド結合の形成を介して形成される。
HIP3CysPEG(Ile−Gly−Leu−His−Asp−Pro−Thr−Gln−Gly−Thr−Glu−Pro−Asn−Gly−Glu−Cys(PEG))(配列ID番号20)は、精製型、合成型、または組換え型でのヒト膵島形成促進性ペプチドであり、これは、二量体のマレイミド活性化型40Kd PEG構築物に共有結合されているC末端のシステイン残基を含むように改変されている。
HIP1CysPEG(Trp−Ile−Gly−Leu−His−Asp−Pro−Thr−Gln−Gly−Thr−Glu−Pro−Asn−Gly−Cys(PEG))(配列ID番号21)は、精製型、合成型、または組換え型でのヒト膵島形成促進性ペプチドであり、これは、二量体のマレイミド活性化型40Kd PEG構築物に共有結合されているC末端のシステイン残基を含むように改変されている。
HIP2CysPEG(Ile−Gly−Leu−His−Asp−Pro−Thr−Gln−Gly−Thr−Glu−Pro−Asn−Gly−Cys(PEG))(配列ID番号22)は、精製型、合成型、または組換え型でのヒト膵島形成促進性ペプチドであり、これは、二量体のマレイミド活性化型40Kd PEG構築物に共有結合されているC末端のシステイン残基を含むように改変されている。
INGAPCysPEGは、精製型、合成型、または組換え型でのINGAPペプチドであり、これは、二量体のマレイミド活性化型40Kd PEG構築物に共有結合されているC末端のシステイン残基を含むように改変されている。
HIP3Cysブロック型PEG(Ac−Ile−Gly−Leu−His−Asp−Pro−Thr−Gln−Gly−Thr−Glu−Pro−Asn−Gly−Glu−Cys(PEG)−NH2)(配列ID番号23)は、精製型、合成型、または組換え型でのヒト膵島形成促進性ペプチドであり、これは、N末端のアセチル基およびC末端のアミド基でブロックされており、二量体のマレイミド活性化型40Kd PEG構築物に共有結合されているC末端のシステイン残基を含むように改変されている。
HIP1Cysブロック型PEG(Ac−Trp−Ile−Gly−Leu−His−Asp−Pro−Thr−Gln−Gly−Thr−Glu−Pro−Asn−Gly−Cys(PEG)−NH2)(配列ID番号24)は、精製型、合成型、または組換え型でのヒト膵島形成促進性ペプチドであり、これは、N末端のアセチル基およびC末端のアミド基でブロックされており、二量体のマレイミド活性化型40Kd PEG構築物に共有結合されているC末端のシステイン残基を含むように改変されている。
HIP2Cysブロック型PEGすなわちHIP2BCys−PEG(Ac−Ile−Gly−Leu−His−Asp−Pro−Thr−Gln−Gly−Thr−Glu−Pro−Asn−Gly−Cys(PEG)−NH2)(配列ID番号25)は、精製型、合成型、または組換え型でのヒト膵島形成促進性ペプチドであり、これは、N末端のアセチル基およびC末端のアミド基でブロックされており、二量体のマレイミド活性化型40Kd PEG構築物に共有結合されているC末端のシステイン残基を含むように改変されている。HIP2BCys(PEG)は、約44,782の分子量を有する。
INGAPCysブロック型PEGは、精製型、合成型、または組換え型でのINGAPペプチド(C末端のアセチル基およびN末端のアミド基でブロックされており、二量体のマレイミド活性化型40Kd PEG構築物に共有結合されているC末端のシステイン残基を含むように改変されている)である。
REG3Gは、配列MLPPMALPSVSWMLLSCLILLCQVQGEETQKELPSPRISCPKGSKAYGSPCYALFLSPKSWMDADLACQKRPSGKLVSVLSGAEGSFVSSLVRSISNSYSYIWIGLHDPTQGSEPDGDGWEWSSTDVMNYFAWEKNPSTILNPGHCGSLSRSTGFLKWKDYNCDAKLPYVCKFKD(配列ID番号28)を有するヒト再生膵島由来タンパク質3ガンマ前駆体である。REG3Gペプチドは、配列IGLHDPTQGSEPDG(配列ID番号29)を有する、REG3Gから得られるヒト再生膵島由来タンパク質3ガンマ前駆体ペプチドである。他のREG3Gペプチドは、WIGLHDPTQGSEPDG(配列ID番号58)およびIGLHDPTQGSEPDGD(配列ID番号59)である。
本開示の実施形態は、治療剤としての改善された用途のために、HIPを含む膵島形成促進性ペプチドの安定性および溶解性を最適化するための詳細なストラテジーを提供する。HIPは、2番染色体のロケーション2p12の位置79240075に位置する膵炎関連タンパク質前駆体(NP−002571)としても知られるヒトタンパク質再生膵島由来3アルファタンパク質(REG3A)(NM_138937.1)のペプチドフラグメントである(配列ID番号1)。HIP3、HIP1、およびHIP2は、膵臓内に存在する前駆細胞から膵島新生を誘導または刺激する。本開示の方法に従って使用されるこれらの新生剤は、HIPを含む最適化された形態の膵島形成促進性ペプチドをもたらし、それは、疾患を処置する治療剤として使用されるとき、インビボにおける高い安定性、溶解性、および有効性を証明している。これらの疾患は、これに限定されるものではないが、真性糖尿病(1型糖尿病)、2型糖尿病(非インスリン依存性糖尿病およびインスリン要求性成人発症型糖尿病、小児期および青年期における糖尿病)、および成人潜伏性自己免疫性糖尿病(Latent Autoimmune Diabates in Adults:LADA)を含む。
本開示の実施形態は、医薬組成物を用いて1型および2型糖尿病を含む膵臓機能不全を処置するための組成物および治療も提供する。1つの実施形態において、これらの組成物は、最適化されたHIPを含む最適化された膵島形成促進性ペプチドを含む。別の実施形態において、これらの組成物は、最適化されたHIPを含む最適化された膵島形成促進性ペプチドおよびグルコース代謝に影響を及ぼす他の薬剤を含む。膵島の新生に関与する薬剤および膵島細胞を標的にする自己免疫細胞を阻害するか、阻止するか、または破壊する薬剤が、これらの他の薬剤に含められる。1つの実施形態において、本明細書中に開示される治療は、治療的に有効な用量の最適化された膵島形成促進性ペプチド(最適化されたHIPを含む)を、そのような治療を必要とする哺乳動物に投与することによって実施される。別の実施形態において、本明細書中に開示される治療は、治療的に有効な用量の最適化された膵島形成促進性ペプチド(最適化されたHIPを含む)を、グルコース代謝に影響を及ぼす別の薬剤(例えば、ホルモンまたは化合物)と併用して、そのような治療を必要とする哺乳動物に投与することによって実施され、その別の薬剤は、これに限定されるものではないが、ベータ細胞の再生、満腹、および胃内容物排出に関与するホルモンまたは化合物(例えば、GLP−1、GIP、GLP−1受容体アナログ、GLP−1アナログ、およびGLP−1の破壊を妨げるジペプチジルペプチダーゼ−4阻害剤)および膵臓細胞を標的にする自己免疫細胞を阻害するか、阻止するか、または破壊する薬剤を含む。この後者の実施形態において、最適化されたHIPおよび前記他の薬剤は、別々に投与されてもよいし、まず混合されて併用組成物を提供し、そして同時に投与されてもよい。
NODマウスにおける遺伝子発現のマイクロアレイ解析によって、特に膵島新生における、Reg遺伝子のアップレギュレーションが示された。さらに、Reg遺伝子は、胎児発生後期にアップレギュレーションされることにより、発生中のヒトの膵臓を集合させて(populate)、分娩後のそれ自体のグルコース代謝を維持すると知られている。非内分泌膵臓上皮細胞(non−endocrine pancreatic epithelial cells:NEPECs)を含む胎児組織の同時移植は、NEPEC集団から新しい膵島構造の刺激をもたらすと示されている。同時移植された胎児物質におけるRegのアップレギュレーションは、おそらくこの作用のための刺激だった。
インビボ研究から、HIP1、HIP2、およびHIP3が、糖尿病マウスに導入されるとき、膵臓内の前駆細胞の新しい膵島構造への分化を刺激することが示された。
膵島構造の新生においては有効であるが、治療剤としての投与に向けて、溶解性、安定性、およびバイオアベイラビリティを改善するためにHIPバリアントを含む膵島形成促進性ペプチドを最適化する必要が残っている。プロテアーゼ分解の機会を減少させる、HIPバリアントを含む膵島形成促進性ペプチドに対する改変は、その有効性を高めることにより、正の治療効果に必要な投薬量を減少させる。これらの改変は、「最適化された膵島形成促進性ペプチド」または「最適化されたHIP」と表示されているものをもたらす。
1つの実施形態において、最適化されたHIPを含む最適化された膵島形成促進性ペプチドは、本開示によって精製型、合成型、または組換え型で提供され、膵島の新生を誘導するために本明細書中に開示される方法に従って投与される。
さらに、最適化されたHIPを含む最適化された膵島形成促進性ペプチドは、長時間にわたって安定に保存され得る。最適化されたHIPは、等張性食塩水中、20℃で保存されるとき、数ヶ月にわたって安定である。
特定の実施形態において、最適化されたHIPを含む最適化された膵島形成促進性ペプチドは、機能的に非常に活性である、すなわち、REG3A、他のHIPペプチド、およびハムスターINGAPなどの非ヒトHIPホモログに関連する機能活性のうちの1若しくはそれ以上のより高い活性を示すことができる。
ヌクレオチドコード配列の縮重に起因して、最適化されたHIPを含む最適化された膵島形成促進性ペプチドと同じまたは実質的に類似のアミノ酸配列をコードする種々のDNA配列が、最適化されたHIPバリアントを含む最適化された組換え膵島形成促進性ペプチドを作製するための発現ベクターを調製するために本開示の実施において使用され得る。これらは、これに限定されるものではないが、その配列内の同じアミノ酸残基または機能的に等価なアミノ酸残基をコードする様々なコドンの置換(ゆえにサイレントな変化をもたらす)によって変更される、最適化された膵島形成促進性ペプチド(最適化されたHIPを含む)の全部または一部を含む核酸配列を含む。その最適化された膵島形成促進性ペプチド(最適化されたHIPを含む)およびその誘導体は、これに限定されるものではないが、変更された配列(機能的に等価なアミノ酸残基がサイレントな変更をもたらす配列内の残基に置換されている)を含む最適化された膵島形成促進性ペプチド(最適化されたHIPバリアントを含む)のアミノ酸配列の全部または一部を1次アミノ酸配列として含むものを含む。例えば、その配列内の1若しくはそれ以上のアミノ酸残基は、サイレントな変更をもたらす、機能的等価物として作用する類似の極性の別のアミノ酸によって置換され得る。その配列内のアミノ酸に対する置換は、そのアミノ酸が属するクラスの他のメンバーから選択され得る。例えば、非極性(疎水性)アミノ酸は、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびメチオニンを含む。極性中性アミノ酸は、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、およびグルタミンを含む。正に帯電した(塩基性)アミノ酸は、アルギニン、リシン、およびヒスチジンを含む。負に帯電した(酸性)アミノ酸は、アスパラギン酸およびグルタミン酸を含む。最適化された膵島形成促進性ペプチド(最適化されたHIP誘導体を含む)は、これに限定されるものではないが、変更された配列(アミノ酸残基が類似の化学特性を有する残基に置換されている)を含む膵島形成促進性ペプチド(HIPを含む)のアミノ酸配列の全部または一部を1次アミノ酸配列として含むものも含む。特定の実施形態では、最適化されたHIPの1、2、3、4、または5アミノ酸が置換されて、最適化されたHIPのアナログおよび/または誘導体がもたらされる。
特定の実施形態において、キメラタンパク質または融合タンパク質が、本明細書中に開示される方法において使用され得る。本明細書中で使用されるとき、「キメラタンパク質」または「融合タンパク質」は、非膵島形成促進性ペプチド若しくはHIPポリペプチドまたはそのアナログ若しくは誘導体に作動可能に連結された、最適化された膵島形成促進性ペプチド(最適化されたHIPを含む)またはそのアナログ若しくは誘導体を含む。融合タンパク質の中で、最適化された膵島形成促進性ペプチドまたはHIPと非膵島形成促進性またはHIPポリペプチドとが、「作動可能に連結される」、すなわち、互いにインフレームで融合される。非膵島形成促進性またはHIPポリペプチドは、最適化された膵島形成促進性ペプチドまたはHIPのN末端またはC末端に融合され得る。例えば、融合タンパク質は、そのN末端に異種シグナル配列を含む最適化されたHIPであり得る。ある特定の宿主細胞(例えば、哺乳動物宿主細胞)において、最適化されたHIPまたはそのアナログ若しくは誘導体の発現および/または分泌は、異種シグナル配列を使用することによって増加し得る。さらに別の例では、融合タンパク質は、最適化されたHIP配列が免疫グロブリンタンパク質ファミリーのメンバー由来の配列に融合されている、最適化されたHIP−免疫グロブリン融合タンパク質である。その最適化されたHIP−免疫グロブリン融合タンパク質は、医薬組成物に組み込まれ得、被験体に投与されることにより、本開示に記載の免疫学的応答を阻害し得る。
本明細書中に開示される方法において使用するための、最適化された膵島形成促進性ペプチド(最適化されたHIPを含む)またはそのアナログ若しくは誘導体、あるいは最適化された膵島形成促進性ペプチド(最適化されたHIPを含む)−キメラタンパク質または融合タンパク質は、バイオアベイラビリティを改善する目的ならびに/または有効性、溶解性、および安定性を高める目的で化学的に改変され得る。例えば、そのタンパク質は、アルブミン、トランスフェリン、またはさらなるポリエチレングリコール(polyethylene glycol:PEG)部分に共有結合され得るか、または非共有結合され得る。
本明細書中に開示される方法において使用するための、最適化された膵島形成促進性ペプチド(最適化されたHIPを含む)またはそのアナログ若しくは誘導体、あるいは最適化された膵島形成促進性ペプチドまたはHIP−キメラタンパク質若しくは融合タンパク質は、本明細書中の教示および当該分野で公知の教示に従って、標準的な組換えDNA技術によって作製され得る。例えば、異なるポリペプチド配列をコードするDNAフラグメントが、従来の手法に従って、例えば、ライゲーションのための平滑末端または粘着末端(stagger−ended termini)、適切な末端を提供するための制限酵素消化(必要に応じて付着末端を埋める)、望ましくない結合を回避するアルカリホスファターゼ処理、および酵素的ライゲーションを用いることによって、インフレームで共にライゲーションされ得る。さらに、融合遺伝子は、自動DNA合成装置を含む従来の手法によって合成され得る。あるいは、遺伝子フラグメントのPCR増幅は、2つの連続した遺伝子フラグメント間に相補的なオーバーハングを生じるアンカープライマーを使用して行われ得、そのオーバーハングは、その後アニールし、再増幅されることにより、キメラ遺伝子配列を生成し得る。さらに、すでに融合部分(例えば、GSTポリペプチド)をコードする多くの発現ベクターが、市販されている。最適化されたHIPをコードする核酸は、その融合部分が、最適化されたHIPにインフレームで連結されるようにそのような発現ベクターにクローニングされ得る。その融合タンパク質は、最適化された組換えHIPの精製および検出を助けるか、または被験体における免疫応答を遮断するHisタグまたはエピトープタグ(例えば、V5)に融合された、最適化されたHIPであり得る。最適化されたHIPならびにそのアナログおよび誘導体の短いアミノ酸配列は、同様に、これらの価値あるペプチドの合成的な生成を容易に実施可能とし、ペプチド合成のための種々の自動装置が、市販されており、自動化を必要としないペプチド合成のための合成方法は、長く知られており、本明細書中の教示に従って使用されることにより、最適化されたHIPまたはそのアナログ若しくは誘導体を調製することができる。
いくつかの実施形態において、最適化された膵島形成促進性ペプチド(最適化されたHIPを含む)またはそのアナログ若しくは誘導体、あるいは最適化された膵島形成促進性ペプチドまたはHIP−キメラタンパク質または融合タンパク質は、当該分野で公知の任意の方法を用いてインビボにおいて長い半減期を有するように改変され得る。例えば、ヒトIgGのFcフラグメントまたは高分子量ポリエチレングリコール(polyethyleneglycol:PEG)などの不活性なポリマー分子は、タンパク質のN末端若しくはC末端へのPEGの部位特異的結合体化によってまたはリシン残基上に存在するイプシロン−アミノ基を介して、多機能リンカーを用いてまたは用いずに、最適化されたHIPまたはそのアナログ若しくは誘導体に付着され得る。生物学的活性の最小の損失をもたらす直鎖状または分枝状ポリマーの誘導体化が使用され得る。結合体化の程度は、SDS−PAGEおよび質量分析によって綿密にモニターされることにより、PEG分子と、最適化されたHIPまたはそのアナログ若しくは誘導体との適切な結合体化が確実になり得る。未反応のPEGは、サイズ排除またはイオン交換クロマトグラフィによって、最適化されたHIP−PEG結合体から分離され得る。PEG誘導体化結合体は、当業者に公知の方法を用いてインビボ有効性について試験され得る。
本開示の実施形態は、最適化された膵島形成促進性ペプチド処方物(最適化されたHIP処方物を含む)、ならびに最適化された膵島形成促進性またはHIPに基づく治療、ならびに糖尿病および損なわれた膵機能に関与する他の様々な徴候を処置する際に最適化された膵島形成促進性ペプチドまたはHIPバリアントを送達するための方法を提供する。
1つの実施形態において、膵島形成促進性ペプチドは、C末端のアミド基およびN末端のアセチル基を付加することによって、血清中のペプチドの遊離末端を認識して分解するプロテアーゼによるタンパク分解活性を効果的に阻止し、その結果、最適化された膵島形成促進性ペプチド化合物がもたらされることによって、最適化される。
1つの実施形態において、HIP3、HIP1、および/またはHIP2は、C末端のアミド基およびN末端のアセチル基を付加することによって、血清中のペプチドの遊離末端を認識して分解するプロテアーゼによるタンパク分解活性を効果的に阻止され、それにより最適化され、その結果、最適化されたHIP化合物であるHIP3ブロック型(配列ID番号5)、HIP1ブロック型(配列ID番号6)、およびHIP2ブロック型(配列ID番号7)がそれぞれもたらされる。これらのブロック基は、固相ペプチド合成(Solid Phase Peptide Synthesis:SPPS)によって付加され、調製された。固相合成の基本的な前提は、鎖の一方の末端が不溶性の支持体に固着されながら、アミノ酸が任意の所望の配列のペプチドに組み立てられ得るということである。上で述べたように、実際のSPPSでは、ペプチドのカルボキシル末端が、ポリマーに結合される。アミノ酸の所望の配列が、支持体上に結合された後、試薬を適用することにより、そのペプチド鎖を支持体から切断し、その粗ペプチドを溶液中に遊離し得る。この合成に関与するすべての反応が、可能であれば完了するまで行われることにより、均一な生成物が得られる。
ペプチドのC末端がアミドであるとき、誘導体は、ペプチドアミドである。多くの天然に存在するペプチドホルモンが、アミドとして存在するので、ペプチドアミドは、極めて重要な誘導体である。ペプチドアミドを合成するために、切断時にペプチドアミドを直接もたらす固相樹脂が開発された。N末端がアセチル基であるとき、該ペプチドは、C末端からN末端に組み立てられる。次いで、N末端は、塩基の存在下において無水酢酸を用いてアセチル化される。
別の実施形態において、膵島形成促進性ペプチドは、C末端のシステイン残基の付加によって改変され、その結果、Cys膵島形成促進性ペプチド化合物がもたらされる。これらの最適化された膵島形成促進性ペプチド化合物は、溶液中で二量体を形成することができ、個別の単量体のシステイン間にジスルフィド結合が形成される結果、最適化された膵島形成促進性ペプチド化合物である膵島形成促進性ペプチドCys二量体がもたらされる。
別の実施形態において、HIP3、HIP1、および/またはHIP2は、C末端のシステイン残基の付加によって改変され、その結果、最適化されたHIP化合物であるHIP3Cys(配列ID番号8)、HIP1Cys(配列ID番号9)、およびHIP2Cys(配列ID番号10)がそれぞれもたらされる。これらの最適化されたHIP化合物は、溶液中で二量体を形成することができ、個別の単量体のシステイン間にジスルフィド結合が形成される結果、最適化されたHIP化合物であるHIP3Cys二量体(配列ID番号11)、HIP1Cys二量体(配列ID番号12)、およびHIP2Cys二量体(配列ID番号13)がそれぞれもたらされる。4グラムの粗ペプチドを2mlの酢酸で湿らせ、約500mlのDI水で希釈し、次いで、20%NH4OH溶液を滴下することによってpHを約8.2に調整し、室温で一晩撹拌することによって、システイン残基が付加される。反応が一晩で完了しなかったので、黄緑色が持続するまで、フェリシアン化カリウム溶液を加えた。Ellman試験およびHPLC解析によって測定したところ、この段階において反応が完了していた。次いで、その酸化溶液を1スパーテル分のAG−1 X2(塩化物型)樹脂で30分間処理し、P4漏斗で濾過し、最終的にpHを約5に調整した後、HPLC精製した。
別の実施形態において、C末端のアミド基およびN末端のアセチル基を付加することによって、その化合物を、血清中の遊離末端を認識するプロテアーゼによる分解から保護することによって、Cys膵島形成促進性ペプチドがブロックされ、その結果、最適化されたHIP化合物である膵島形成促進性ペプチドCysブロック型がもたらされる。さらに、これらの化合物は、溶液中で二量体を形成することができ、個別の単量体のシステイン間にジスルフィド結合が形成される結果、最適化された膵島形成促進性化合物である膵島形成促進性ペプチドCysブロック型二量体がもたらされる。これらのブロック基は、上に記述したように付加される。
別の実施形態において、HIP3Cys(配列ID番号8)、HIP1Cys(配列ID番号9)、および/またはHIP2Cys(配列ID番号10)は、C末端のアミド基およびN末端のアセチル基を付加することによってブロックされ、それにより、その化合物が血清中の遊離末端を認識するプロテアーゼによる分解から保護され、その結果、最適化されたHIP化合物であるHIP3Cysブロック型(配列ID番号14)、HIP1Cysブロック型(配列ID番号15)、およびHIP2Cysブロック型(配列ID番号16)がそれぞれもたらされる。さらに、これらの化合物は、溶液中で二量体を形成することができ、個別の単量体のシステイン間にジスルフィド結合が形成され、その結果、最適化されたHIP化合物であるHIP3Cysブロック型二量体(配列ID番号17)、HIP1Cysブロック型二量体(配列ID番号18)、およびHIP2Cysブロック型二量体(配列ID番号19)がそれぞれもたらされる。これらのブロック基は、上に記述したように付加される。
別の実施形態において、Cys膵島形成促進性ペプチドは、二量体のマレイミド活性化型40Kd PEG構築物をC末端のシステイン残基に共有結合することによって最適化され、その結果、最適化されたHIP化合物である膵島形成促進性ペプチドCysPEGがもたらされる。前記PEG構築物は、精製された単量体型のCS504ペプチド(1.1当量)を酢酸緩衝液(pH=6.5)に溶解することによって、C末端のシステイン残基に共有結合され得る。PEGマレイミド(1当量)の溶液は、DI水中に調製され、撹拌しながら該ペプチド溶液に加えられ得る。得られる溶液のpHを、再度、希NH4OH溶液で約6.5に調整し、室温で30分間撹拌し、数滴の酢酸で酸性化し、最後にRP−HPLCで精製することができる。
別の実施形態において、HIP3Cys(配列ID番号8)、HIP1Cys(配列ID番号9)、および/またはHIP2Cys(配列ID番号10)は、二量体のマレイミド活性化型40Kd PEG構築物をC末端のシステイン残基に共有結合することによって最適化され、その結果、最適化されたHIP化合物であるHIP3CysPEG(配列ID番号20)、HIP1CysPEG(配列ID番号21)、およびHIP2CysPEG(配列ID番号22)がそれぞれもたらされる。そのPEG構築物は、精製された単量体型のCS504ペプチド(1.1当量)を酸性緩衝液(pH=6.5)に溶解することによって、C末端のシステイン残基に共有結合される。PEGマレイミドの溶液(1当量)を、DI水中に調製し、撹拌しながらそのペプチド溶液に加えた。得られた溶液のpHを、再度、希NH4OH溶液で約6.5に調整し、室温で30分間撹拌し、数滴の酢酸で酸性化し、最後にRP−HPLCで精製した。
別の実施形態において、膵島形成促進性ペプチドCysPEGは、C末端のアミド基およびN末端のアセチル基を付加することによって最適化され、それにより、血清中の遊離末端を認識するプロテアーゼによる分解からその化合物を保護し、その結果、最適化されたHIP化合物である膵島形成促進性ペプチドCysPEGブロック型がもたらされる。それらのブロック基は、上に記述したように付加される。
別の実施形態において、HIP3CysPEG(配列ID番号20)、HIP1CysPEG(配列ID番号21)、およびHIP2CysPEG(配列ID番号22)は、C末端のアミド基およびN末端のアセチル基を付加することによって最適化され、それにより、血清中の遊離末端を認識するプロテアーゼによる分解からその化合物を保護し、その結果、最適化されたHIP化合物であるHIP3CysPEGブロック型(配列ID番号23)、HIP1CysPEGブロック型(配列ID番号24)、およびHIP2CysPEGブロック型(配列ID番号25)がそれぞれもたらされる。それらのブロック基は、上に記述したように付加される。
本開示の最適化された膵島形成促進性ペプチドまたはHIPまたはアナログまたは誘導体による治療または併用療法は、ベータ細胞の機能の喪失若しくは低下、または最適化されたHIP化合物および処置方法を用いて前駆細胞からの新しい膵島構造の分化を介して被験体に提供され得るより多くのインスリン産生の必要性に起因するインスリンの産生または分泌の低下に関係する疾患、症状、または状態に苦しんでいる任意の哺乳動物(ヒトおよび動物を含む)を処置するために用いられ得る。そのような疾患および状態は、1型真性糖尿病、2型糖尿病、前糖尿病、空腹時血糖異常、空腹時高インスリン血症を含み、これに限定されるものではないが、1a型糖尿病を有する患者または抗体(抗GAD65抗体、抗膵島抗体、または抗インスリン抗体)を表し得る成人潜伏性自己免疫性糖尿病を有する患者、またはベータ細胞に対する自己免疫なしにインスリンが欠乏している1型糖尿病(1b型糖尿病)を有する患者を含む。さらに、本開示の実施形態は、1型糖尿病を有すると新たに診断された患者、1型糖尿病を有する患者の同胞および一等親血縁者、ならびに1型糖尿病に対する偏向を示す陽性抗体および他の自己免疫性の状態を有する人々に対する治療的な利益によって実施され得る。1つの実施形態において、本明細書中に開示される方法は、そのような処置を必要とする患者において1型糖尿病を逆転させるために実施される。
前記併用療法ならびに関連する方法および組成物は、糖尿病を有する患者、ならびに管理不良の糖尿病を有する患者、低血糖に気づいていない患者、および1型糖尿病における反復性の低血糖症を有する患者におけるグルコースの変動を回復させるために、小児および成人における1型糖尿病のインスリン治療に対する補助的療法としても用いられ得る。
最適化された膵島形成促進性ペプチドまたはHIPまたはアナログまたは誘導体による治療ならびに関連する方法および組成物は、新たに診断された2型糖尿病、高血糖症を伴う小児および成人における2型糖尿病(2型糖尿病は、インスリン、経口糖尿病治療または他の皮下糖尿病治療で同時に処置される)、および管理不良の2型糖尿病を有する患者を処置するために用いられ得る。本明細書中に開示される方法および組成物は、小児と成人の両方の一部の患者において、1型および2型糖尿病を逆転させ得る。本明細書中に開示される方法および組成物は、非定型の糖尿病を有する小児と成人の両方および食後の高血糖症の状態を有する患者を処置するためにも用いられ得る。
最適化された膵島形成促進性ペプチドまたはHIPまたはアナログまたは誘導体による治療ならびに関連する方法および組成物は、体重減少、トリグリセリド、LDLコレステロールの減少を必要とする小児ならびに成人の患者である患者を処置するため(これに限定されるものではないが、体重減少を達成するため、または糖尿病を有する患者ならびに1型または2型糖尿病を有しない患者における肥満症、過体重を処置するためを含む)にも用いられ得る。1つの実施形態において、本明細書中に開示される方法および組成物は、病的肥満を有する患者を処置するために用いられる。他の実施形態において、本明細書中に開示される方法および組成物は、病的肥満を有する患者または食欲不振、過食症、若しくは他の摂食障害を有する患者を処置するために用いられる。
単一の薬剤による最適化された治療ならびに関連する方法および組成物は、代謝異常症候群または代謝症候群を有する小児および成人、ならびにグルコース代謝の変化に続発する神経因性疼痛症候群の状態を示す患者および糖尿病を伴う高トリグリセリド血症および糖尿病を伴わない高トリグリセリド血症を有する患者ならびに、食後の高トリグリセリド血症を有する患者を処置するためにも用いられ得る。1つの実施形態において、これらの方法は、多嚢胞性卵巣症候群の処置を必要とする患者においてそのような処置を行うために実施される。
最適化された膵島形成促進性ペプチドまたはHIPまたはアナログまたは誘導体による治療および関連する方法の利益を享受し得る他の患者には、一般に空腹時高血糖症、前糖尿病、空腹時血糖異常、耐糖能障害、および高血糖状態などの状態を有すると診断されている小児患者および成人患者が含まれる。
最適化された膵島形成促進性ペプチドまたはHIPまたはアナログまたは誘導体による治療ならびに関連する方法および組成物は、神経因性疼痛症候群およびニューロパシーを有する患者(その患者が糖尿病と診断されているか否かは関係ない)を処置するためにも用いられ得る。
最適化された膵島形成促進性ペプチドまたはHIPまたはアナログまたは誘導体による治療ならびに関連する方法および組成物もまた、再発性の膵炎または膵癌を有する患者を処置するために使用され得、膵臓内の前駆細胞に由来する新しい膵島構造をもたらすことを目標とされるすべての様式において用いられ得る。
1つの実施形態において、膵臓前駆細胞からインスリンを産生する膵島構造への膵島分化を刺激する薬剤は、最適化された膵島形成促進性ペプチド若しくはHIPまたはそのアナログ若しくは誘導体から選択される。別の実施形態では、HIPを含む最適化された膵島形成促進性ペプチドと、膵島細胞新生を刺激する別の薬剤との組み合わせ。このさらなる薬剤は、例えば、アミリンおよび/またはアナログであり得、これに限定されるものではないが、プラムリンチド(SYMLIN(商標))、GLP−1受容体アナログ、エキセンディン−4(EXENATIDE(商標))、リラグルチド(NN2211)、GLP−1、GLP−1アナログGIP、GLP−1、ハムスターINGAP、他のインクレチン模倣ホルモン、ならびに/または同様に作用する化合物および薬剤、ならびに前述の化合物および薬剤のいずれか(例えば、GLP−1の分解を遅延させるジペプチジルペプチダーゼ−4阻害剤)の半減期を延長するか、またはレベル若しくは活性を上昇させる薬剤を含む。GLP−1受容体に対する直接的なアゴニスト活性を介して作用するかまたはGLP−1の分解を阻害することによって作用する数多くのGLP−1模倣物が存在する。これらの薬剤は、本開示のある特定の実施形態において有用である。GLP−1模倣物は、HIPおよび/または1型糖尿病の処置のために標的化された免疫療法とともに使用され得、それらは、血糖コントロールを改善するため、満腹を高めるため、腸のグルコース吸収を遅延させるため、および1型糖尿病をもたらす基礎をなすメカニズムを逆転させるために用いられ得る。これらの薬剤および方法は、糖尿病における耐糖能障害の進行を妨げ得;前糖尿病、耐糖能障害への空腹時血糖異常の進行、および糖尿病を妨げ得;新たに診断された2型糖尿病を逆転させ得;2型糖尿病を処置し得、そして過体重、肥満症、多嚢胞性卵巣症候群、および神経因性疼痛症候群を処置し得るか、または予防し得る。
成体の膵臓内の前駆細胞からの膵島の分化を達成するための本開示の実施において有用な方法、薬剤、および医薬処方物は、他の目的のために以下の参考文献(その各々が、この参照により本明細書に組み込まれる)に記載されているものを含む:Rosenberg et al.,1992,Adv.Exp.Med.Biol.321:95−104;Mar.1996,Diabetologia 39(3):256−62;Jul.1996,Pancreas 13(1):38−46;およびNov.2004,Ann.Surg.240(5):875−84;Vinik et al.,Jun.1997,Horm.Metab.Res.29(6):278−93。膵島再生または膵臓前駆細胞の分化の刺激の成功は、被験体におけるインスリンの産生および/または分泌の増加によって示され得る。
1つの実施形態において、アミリンまたはアミリンのアナログ(例えば、Symlin(商標)またはプラムリンチド)が、最適化されたHIPの投与前または最適化されたHIPとの併用投与において使用される。アミリンは、参考文献Young et al.,1997,Curr.Opin.Endocrin.Diabetes 4:282−290(この参照により本明細書に組み込まれる)の教示に従って、膵島再生の前に投与され得、膵島再生期間を通じて投与が継続され得る。1つの実施形態において、アミリンおよび/またはアナログ(これに限定されるものではないが、プラムリンチドを含む)は、最適化されたHIPの開始前に血糖コントロールを最適化するために皮下に投与され、次いで、単独または他の膵島刺激ペプチド(例えば、最適化されたHIPまたは最適化されたHIPアナログ若しくは誘導体)との併用で使用され得る。1つの実施形態において、アミリンまたはプラムリンチドは、0.3〜0.8マイクログラム/キログラム患者体重で投薬される。1つの実施形態において、この用量が、食事前、例えば、QHSおよび午前3時に皮下に投与される。1つの実施形態において、治療的に有効な用量は、皮下に、または注入デバイス/ポンプおよび/または経皮的、鼻腔内、頬側、マイクロニードルの送達系、経口カプセル法を介して送達される。別の実施形態において、治療的に有効な用量は、1週間に1回より多くない頻度、2週間に1回、または1ヶ月に1回の注射または他の送達方法による投与の必要な徐放処方物を利用して投与される。上で述べたように、いくつかの実施形態において、アミリンまたはプラムリンチドは、別の膵島刺激剤と同時投与される。
1つの実施形態において、GLP−1受容体アナログ(エキセンディン−4またはエキセンディン4のアナログを含む)が、最適化されたHIPを用いる方法において5〜10mcgの用量で食事と共に使用される。エキセンディン−4は、以下の参考文献(その各々が、この参照により本明細書に組み込まれる)の教示に従って、本開示の目的のために製剤化され得、投与され得る:Alcantara et al.,1998,Cell Biochem.Funct.16(1):51−6;Dupre et al.,2004,J.Clin.Endocrin.Metab.89(7):3469−73;Edwards et al.,1999,Diabetes 48:86−93;およびXu et al.,1999,Diabetes 48:2270−76。1つの実施形態において、エキセンディン−4は、5〜10マイクログラムの範囲で食事前に投薬される。1つの実施形態において、エキセンディン−4は、単独でまたは最適化されたHIPおよび/若しくは他の膵島刺激ペプチドと併用して皮下に投与される。1つの実施形態において、治療的に有効な用量が、皮下に投与される。別の実施形態において、エキセンディン−4の送達は、経皮的、頬側、経口カプセル法、鼻腔内、またはマイクロニードルの送達系を介する。別の実施形態において、治療的に有効な用量は、1週間に1回より多くない頻度、2週間に1回、または1ヶ月に1回の投与が必要な徐放処方物に含められる。1つの実施形態において、エキセンディン−4は、1型若しくは2型糖尿病を有する患者または肥満症、過体重、インスリン抵抗性症候群、空腹時血糖異常、前糖尿病、多嚢胞性卵巣症候群、代謝症候群、または摂食障害を有する患者において、最適化されたHIPまたは別の膵島細胞新生剤または前駆細胞形質転換剤と同時投与される。
GIPおよびGLP−1は、成長ホルモンのインクレチンファミリーに属し(参考文献Creutzfeldt,1979,Diabetologia 16:75−85;Creutzfeldt and Ebert,1985,Diabetologia 28:565−573;Holst et al.,2001,Scand.J.Clin.Lab.Invest.Suppl.234:75−85;およびVilsboll et al.,Jun.2003,J.Clin.Endocrin.Metab.88(6):2706−13(この各々が、この参照により本明細書に組み込まれる)を参照のこと)、1つの実施形態において、最適化されたHIPと同時使用するまたは使用しないインクレチンホルモンまたはアナログが、成体膵臓内の前駆細胞から膵島への分化を刺激する方法において使用される。
様々な実施形態において、GIPまたはGIPアナログは、HIPを含む最適化された膵島形成促進性ペプチドとともに使用される。GIPは、以下の参考文献(その各々が、この参照により本明細書に組み込まれる)の教示に従って、本開示の目的のために製剤化され得、投与され得る:Andersen et al.,1978,J.Clin.Invest.62:152−161;Creutzfeldt et al.,Feb.1980,Diabetes 29(2):140−5;Dupre et al.,1973,J.Clin.Endocrin.Metab.37:826−828;Ebert et al.,1980,Clinical Gastroenterology 9(3):679−98;Elahi et al.,1979,Am.J.Physiol.237:E185−E191および1994,Regulatory Peptide 51(1):63−74;Krarup et al.,Jun.1983,J.Clin.Endocrin.Metab.56(6):1306−12;Krarup et al.,1987,Metabolism 36(7):677−82;Krarup et al.,1988,Acta Med.Scand.223(5):437−41;Lynn et al.,2003,FASEB 17:19−93;Meir et al.,2002,Regulatory Peptides 107:1−3;およびNauk et al.,1993,J.Clin.Endocrin.Metab.76(4):912−7。
1つの実施形態において、GIPは、HIPを含む最適化された膵島形成促進性ペプチドまたはそのアナログ若しくは誘導体と併用して静脈内または皮下に投与され、食事開始の3〜5分前、就寝前、および午前3時に静脈内送達または皮下送達によって30分間の持続注入を提供する2〜10ナノグラム/キログラム患者体重で投薬される。1つの実施形態において、GIPは、食事前、QHS、および午前3時に皮下に投与される。1つの実施形態において、GIPは、経口的に、あるいは注入デバイス、または経皮的、頬側、鼻腔内、またはマイクロニードルの送達系を用いて投与される。別の実施形態において、1週間に1回より多くない頻度での投与、2週間に1回、または1ヶ月に1回の注射が必要な徐放処方物が使用される。本明細書中に開示される方法に従ってGIPを投与するために適した組成物は、他の目的のために、参考文献Jones et al.,6 Nov.1989,Diabetes Res.Clin.Pract.7(4):263−9に記載されているものである。
様々な実施形態において、GLP−1若しくはアナログ、またはGLP−1受容体アゴニスト、またはジペプチジルペプチダーゼ−4阻害剤は、前駆細胞からの膵島分化を刺激する方法において、HIPを含む最適化された膵島形成促進性ペプチドまたはそのアナログ若しくは誘導体と併用して使用され、GLP−1、GLP−1受容体アゴニスト、GLP−1アナログ、およびDPP−4阻害剤は、以下の参考文献(その各々が、この参照により本明細書に組み込まれる)の教示に従って、本開示の目的のために製剤化され得、投与され得る:Elahi et al.,1994,Regulatory Peptides 51(1):63−74;Gutniak et al.,1994,Diabetes Care 17:1039−44;Kreymann et al.,1987,Lancet 2:1300−1304;Larsen et al.,1996,Diabetes 45(Suppl.2):233A(Abstract);Larsen et al.,2001,Diabetes Care 24(8):1416−21;List et al.,2004,Am.J.Physiol.Endocrin.Metab.286(6):E875−81;Lugari et al.,2000,Horm.Metab.Res.32:424−428;Marquez et al.,Mar.1998,Cell.Biochem.Funct.16(1):51−6;Meier et al.,March 2004,Critical Care Medicine 32(3):848−851;Meneilly et al.,2003,Diabetes Care 26:2835−41;Nauk et al.,1996,Diabetologia 39(12):1546−53;Thorens et al.,Dec.1995,Diabetes Metab.21(5):311−8;Vilsboll et al.,2003,J.Clin.Endocrin.Metab.88(6):2706−13;Wang et al.,1997,J.Clin.Invest.99:2883−2889;およびZander et al.,2002,Lancet 359:824−30。
様々な実施形態において、GLP−1、GLP−1受容体アゴニスト、またはGLP−1アナログは、皮下に投与されるか、またはDPP−4阻害剤は、HIPを含む最適化された膵島形成促進性ペプチドまたはそのアナログ若しくは誘導体と併用して経口的に投与され、8〜20mg/キログラム患者体重において400〜800mg/日の範囲で投薬される。1つの実施形態において、GLP−1は、食事前、QHSで経口的または皮下に投与される。1つの実施形態において、GLP−1は、1〜30ng/キログラム体重/分の速度での持続的な皮下注入デバイスを用いて、または食事開始の3〜5分前、就寝前、および午前3時に静脈内送達若しくは皮下送達のいずれかによって30分間の持続注入を提供する経皮的、頬側、またはマイクロニードルの送達系を用いて、投与される。別の実施形態において、1週間に1回より多くない頻度での投与、2週間に1回、または1ヶ月に1回の注射が必要な徐放処方物が使用される。
1つの実施形態において、リラグルチド(NN2211)は、10〜40マイクログラム/キログラム体重の用量で、HIPを含む最適化された膵島形成促進性ペプチドまたはそのアナログ若しくは誘導体と併用して皮下に投与される。別の実施形態において、リラグルチドは、食事前、QHS、および午前3時に皮下に投与される。別の実施形態において、リラグルチドは、食事開始の3〜5分前、就寝前、および午前3時に静脈内送達または皮下送達によって30分間の持続注入を提供する注入デバイスまたは経皮的、頬側、若しくはマイクロニードルの送達系を用いて投与される。別の実施形態において、1週間に1回より多くない頻度での投与、2週間に1回、または1ヶ月に1回の注射が必要な徐放処方物が使用される。
併用療法の1つの実施形態において、リラグルチドまたはNN2211は、約20マイクログラム/kg患者体重の用量で毎日、HIPを含む最適化された膵島形成促進性ペプチドと併用して投与される。この用量は、患者に、周期的変動の減少ならびに食後のグルコース、グルカゴン、およびトリグリセリドの減少とともに、食事前のボーラスインスリンを10〜20%減少させる能力を提供する。本明細書中に開示される方法に従ったリラグルチドの投与は、例えば測定されるときの血糖コントロール、これに限定されないが1型糖尿病におけるヘモグロビンA1Cを改善するため;糖尿病における耐糖能障害の進行を妨げるため;耐糖能障害および糖尿病への空腹時血糖異常の進行を妨げるため;新たに診断された2型糖尿病を逆転させるため;および2型糖尿病を処置するために使用され得る。
併用療法の実施形態において、リラグルチドまたはNN2211は、最適化された膵島形成促進性ペプチドまたはHIPの治療中、連続した3週間にわたって、朝、食物摂取の約4時間前、および就寝時に成人患者に約20マイクログラム/kg患者体重の用量で投与される。約1.0ng/mLより低いC−ペプチドレベルで処置を開始する患者の場合、C−ペプチドレベルをモニターし、それが0.5ng/mL超に上昇したら、連続した12日間にわたって抗体hOKT3g1(ala−ala)を投与する。
前記併用療法では、エキセンディン−4若しくは合成エキセンディン−4または別のGLP−1アナログ、GLP−1受容体アゴニスト、またはジペプチジルペプチダーゼ−4阻害剤が、最適化されたHIP治療の開始前または開始中に血糖コントロールを改善するために、単独でまたは最適化された膵島形成促進性ペプチド若しくはHIPまたは別の膵島分化剤とともに食事前に投与される。そのような薬剤は、食事前に送達されると、インスリンの必要性を少なくとも20%低下させ得、インスリンおよび糖尿病薬剤の適切な漸減を行いながら、最適化されたHIPが投与される。最適化されたHIPおよび/または他の薬剤が、1型患者と2型患者の両方に送達されるとき、新しい膵島細胞が前駆細胞から分化されるので、低血糖症から保護するためにインスリンおよび他の糖尿病薬剤の慎重な漸減が行われる。最終的には、膵臓が新しい機能的な膵島で再配置されるので、インスリンおよび糖尿病薬剤(最適化されたHIPを含む)は、漸減される。約1.0ng/mLより低いC−ペプチドレベルで処置を開始する患者の場合、C−ペプチドレベルをモニターし、それが0.5ng/mL超に上昇したら、慎重なモニタリングおよび外因性インスリンの用量の漸減を行う。
1型糖尿病を有する患者では、HIPを含む最適化された膵島形成促進性ペプチドを開始する前に、および/または他のペプチド化合物(SYMLIN(商標)、ハムスターINGAP、GLP−1、GLP−1受容体アゴニスト、GLP−1アナログ、DPP−4阻害剤が共に(その前、中、または後に)用いられ、免疫療法が、新たに形成される膵島を保護するために施される。例えば、抗体hOKT3g1(ala−ala)が、連続した12日間にわたって投与され、その有効性が、最初の処置終了後24ヶ月まで証明されたのに対し、類似のヒト化モノクローナル抗体であるChAglyCD3は、連続した6日間にわたって投与され得、次いで、年1回繰り返され得る。DiamydのGAD65化合物は、1ヶ月間隔で2回の皮下注射で送達される。熱ショックタンパク質60であるDIAPEP277(商標)は、研究の開始時、1ヶ月後および6ヶ月後に植物油中の40mgのマンニトールとともに1mgの皮下注射を用いることにより、新たに診断された糖尿病患者において成功を証明した。選択される免疫調節因子に基づいて、処置の周期性が決定される。別の実施形態において、DIAPEP277(商標)、熱ショックタンパク質60ワクチン、およびIBC−VSOワクチン(膵臓のベータ細胞の破壊を妨げるように設計された代謝的に不活性型の合成インスリンである)、インターフェロン−アルファ、またはCD4+CD25+抗原特異的制御性T細胞若しくは同様の薬剤を使用するワクチン接種が、前記併用療法において用いられる。別の実施形態において、免疫調節剤(これに限定されるものではないが、抗CD3免疫治療剤およびポリクローナル抗Tリンパ球グロブリンを含む)が、最適化されたHIPと併用して使用される。そのような薬剤は:シロリムス(ラパマイシン)、タクロリムス(FK506)、熱ショックタンパク質60(DIAPEP277(商標))、抗グルタミン酸デカルボキシラーゼ65(GAD65)ワクチン、単独またはダクリズマブとの併用でのミコフェノール酸モフェチル、抗CD20剤のリツキシマブ、キャンパス−1H(抗CD52抗体)、および/またはビタミンDも含む。
いくつかの自己免疫細胞は、膵ベータ細胞を標的にするので、本明細書中に開示される方法に従って処置可能な疾患および状態のいくつかにおいて原因となる役割を果たす。参考文献Bach et al.,2001,Ann.Rev.Immun.19:131−161;Lernmark et al.,Endocrin.Metab.Clin.N.Am.20(3):589−617;およびMathis et al.,Dec.2001,Nature 414(6865):792−798(この各々がこの参照により本明細書に組み込まれる)を参照のこと。
1型糖尿病を有する患者への免疫剤(immune agents)の導入に関する先の処置方法は、免疫攻撃によってなおも破壊される膵島細胞だけを保護し、完全に機能的なベータ細胞を有する新しい膵島構造で膵臓を再配置させる必要性に対処していない。これらの方法は、ベータ細胞の破壊の減少を目的とした全般的な免疫調節および特定の免疫調節と、成体の膵臓内の前駆細胞から新しい膵島細胞を分化する方法とを組み合わせている。
本開示の方法は、インスリン、アミリン、またはグルカゴンを産生する膵ベータ細胞を標的にする自己免疫細胞の活性を特異的に阻害するか、または自己免疫細胞を阻止するか、若しくは破壊する薬剤を使用し得る。そのような薬剤には、膵島細胞の破壊を停止する免疫調節性ペプチドが含まれる。例えば、1つのそのような薬剤は、膵島細胞の喪失の進行を遅延させ得るか、または1型糖尿病の発症を遅くし得るか、若しくは停止し得るモノクローナル抗体である。抗CD3抗体は、本明細書中に開示される方法において有用な薬剤の一般的なクラスを構成する。例えば、本開示の目的に適した抗CD3抗体は、TolerRxによって開発中のTRX4(Ala−AlaおよびChAglyCD3)抗体および参考文献Herold et al.,30 May 2002,NEJM 346(22):1692−1698(この参照により本明細書に組み込まれる)に記載されているヒト化抗CD3抗体を含む。1つの実施形態において、そのヒト化抗CD3抗体は、第1日目に1〜1.42μg/kg、第2日目に5.67μg/kg、第3日目に11.3μg/kg、第4日目に22.6μg/kg、および第5〜14日目に45.4μg/kgの投薬量において14日/年で静脈内に送達される。これらの治療は、新しい膵島細胞の形成が起きるので、インスリンを漸減させながら、最適化されたHIPを使用した3〜6ヶ月後に毎年繰り返され得る。最適化されたHIP処置期間中、ビタミンDおよびプラムリンチド/Symlin(商標)の使用が継続され得る。HIPを含む最適化された膵島形成促進性ペプチドおよびインスリンによる治療の中止後、免疫調節が、抗CD3抗体に対して毎年繰り返され得るが、最近の研究から、その有効性が24ヶ月にもわたって継続することが見出された。
別の実施形態において、前記免疫調節性の化合物は、膵島細胞の破壊を停止することができるか、または遅らせることができる熱ショックタンパク質である。そのようなタンパク質には、Develogen AGによって開発中の熱ショックタンパク質であるDIAPEP277(商標)が含まれる。1つの実施形態において、DIAPEP277(商標)は、ベースラインおよび1ヶ月後、ならびに3ヶ月間隔で2回、皮下に植物油中の40mgのマンニトール中の1mgを与えることによって皮下に送達される。併用療法の1つの実施形態において、HIPを含む最適化された膵島形成促進性ペプチドまたは最適化されたHIPのアナログ若しくは誘導体は、以下のとおりDIAPEP277(商標)と同時投与される。DIAPEP277(商標)が、まず、HIPを含む最適化された膵島形成促進性ペプチドまたはアナログまたは誘導体に基づく治療を開始する約30日前に約1mgの用量で皮下に投与される。次いで、DIAPEP277(商標)の2回目の投与を、最適化されたHIPまたはアナログまたは誘導体に基づく治療の開始時(最初の投与の90日後)に行う。
別の実施形態において、免疫調節性化合物は、ポリクローナル抗T−リンパ球グロブリン(Anti−T−Lymphocyte Globulin:ATG)である。4つの投薬量のATG用量が投与される。ATGの第1の投薬量は、9mg/kg体重であり、次いで、3mg/kgという3つの連続した用量が、4時間にわたって静脈内に投与される。第1のATG投与の1時間前に、皮膚負荷試験(0.2mlの最終溶液)を行う。併用療法の1つの実施形態において、ATGは、最適化されたHIPまたは最適化されたHIPアナログ若しくは誘導体を使用する前に、送達される。ATGの最後の投薬量は、最適化されたHIPまたはアナログまたは誘導体に基づく治療の開始の最低14日前に送達される。ATGによる最初の処置の24ヶ月後の自己免疫性攻撃を示唆する抗GAD65抗体および他の免疫マーカーの年4回の測定に基づいて、ATGの第2の投与が必要とされ得る。膵臓に対して産生された自己免疫性抗体の著しい増加がみられる場合、より早い処置が必要になり得る。
HIPを含む最適化された膵島形成促進性ペプチドまたはそのアナログ若しくは誘導体は、上に記載されたように、治療的に有効な用量での、皮下注射、肝臓を標的にしたベシクル若しくは他のリポソーマル(liposomal)剤を介した経口的、または24時間にわたる連続皮下注入を介して送達され得る。1つの実施形態において、1日量は、約5〜20mg/kg患者体重/24時間である。1つの実施形態において、1日量は、約600〜800mgである。最適化された膵島形成促進性ペプチドまたはアナログまたは誘導体に基づく治療は、3〜6ヶ月間にわたって継続され、C−ペプチドの産生によって厳密にモニターされる。その免疫治療は、選択される免疫剤に基づいて、周期的に送達される。例えば、DIAPEP277(商標)は、合計6ヶ月にわたって3ヶ月間隔で送達され、最適化されたHIPまたはアナログまたは誘導体に基づく治療の3ヶ月前に最初に送達される。
本明細書中に開示される方法において有用な免疫調節性薬剤は、当該分野で公知のとおり、または本明細書中に記載されるように、製剤化され得、投与され得、そして投薬され得る。医薬処方物ならびにさらなる投薬および本明細書中に開示される方法を実施するための投与プロトコルは、以下に説明される。
HIPを含む最適化された膵島形成促進性ペプチドまたはそのアナログ若しくは誘導体の組成物、例えば、およびその薬学的に許容可能な塩およびエステルは、様々な他の化合物と組み合わされるとき、糖尿病または同様の障害を処置する際に前駆細胞を新しい膵島細胞に分化させるのに相乗的または付加的に有効である。これらの化合物は、HIPを含む最適化された膵島形成促進性ペプチドおよびそのアナログまたは誘導体、アミリンおよび/またはアナログ(これに限定されるものではないが、Symlin/プラムリンチド、GLP−1、GLP−1受容体アゴニスト、例えば、エキセンディン−4、リラグルチド(NN2211)、GLP−1アナログ、ジペプチジルペプチダーゼ−4阻害剤、GIP、ハムスターINGAP、および他のインクレチン模倣ホルモンを含む)、および/または同様に作用する化合物および薬剤、ならびに前述の化合物および薬剤のいずれかの半減期を延長するか、またはそのいずれかのレベル若しくは活性を増加させる薬剤、例えば、GLP−1の分解を遅延させるジペプチジルペプチダーゼ阻害剤、およびベータ細胞を標的にする自己免疫細胞を阻害するか、阻止するか、または破壊する薬剤(これに限定されるものではないが:抗CD−3抗体(hOKT31(Ala−Ala)およびChAglyCD3を含む)、ATG、シロリムス(ラパマイシン)、タクロリムス(FK506)、熱ショックタンパク質60(DIAPEP277(商標))、抗グルタミン酸デカルボキシラーゼ65(GAD65)ワクチン、単独またはダクリズマブとの併用でのミコフェノール酸モフェチル、抗CD20薬剤リツキシマブ、キャンパス−1H(抗CD52抗体)、リソフィリン、およびビタミンD、IBC−VSOワクチン(膵ベータ細胞の破壊を妨げるように設計された代謝的に不活性型の合成インスリンである)、ならびにCD4+CD25+抗原特異的制御性T細胞または膵臓のベータ細胞の破壊を妨げるように設計された類似の薬剤を使用するインターフェロン−αワクチン接種)を含む)を含む。この最後の実施形態では、CD4+CD25+抗原特異的制御性T細胞または類似の薬剤を用いるインターフェロン−αワクチン接種が、直接または抗CD3免疫療法の使用を介して制御性T細胞を利用するための併用療法において用いられる。
化合物(例えば、シロリムス(ラパマイシン)、タクロリムス(FK506)、TRX4抗体、ヒト化抗CD3抗体、DYAMID(商標)抗GAD65抗体、およびDIAPEP277(商標))もまた、糖尿病または同様の障害を処置する際に、最適化されたHIPまたは前駆細胞を新しい膵島細胞に分化させる薬剤の用法に加えられるとき、相乗的または相加的に有効である。
2若しくはそれ以上の薬剤の相互作用が、それらの併用作用が併用療法において使用される一方または両方の薬剤の有害事象(adverse event:AE)の発生率を低下させる結果である場合、薬物治療レジメンの改善が、治療効果を有する2つの薬剤の併用投与によってもたらされ得る。この有害作用の発生率の低下は、例えば、その併用療法において使用される一方または両方の薬剤のより低い用量の投与の結果であり得る。例えば、表示される用量で使用されるとき薬物A単独の作用が25%であり、かつ45%という有害事象発生率を有する場合;および表示される用量で使用されるとき、薬物B単独の作用が25%であり、かつ30%という有害事象発生率を有する場合、その2つの薬物が各々の表示される用量よりも少ない用量で組み合わされるとき、全体的な作用が35%であり、かつ有害事象発生率が20%である場合、その薬物治療レジメンは改善される。本開示によって提供される併用療法は、そのような既存の改善を含む。
医薬組成物、投薬、および投与
好ましい実施形態において、最適化された膵島形成促進性ペプチド(HIPを含む)は、約0.5〜約5mg/kg/日の濃度で、より好ましくは、ヒトにおいて分割された皮下注射で送達される。したがって、60kgの個体は、潜在的に、2〜3回に分けられた60mg/日を投与され得る(20mgの投薬量を食後に送達される)。他の好ましい実施形態において、HIPを含む最適化された膵島形成促進性ペプチドは、約0.5〜約5mg/kg/日の範囲の投薬量で経口カプセル法を介しても送達され得、好ましくは、食後に分割された投薬量で経口的に送達され得る。
好ましい実施形態において、最適化された膵島形成促進性ペプチド(HIPを含む)は、約0.5〜約5mg/kg/日の濃度で、より好ましくは、ヒトにおいて分割された皮下注射で送達される。したがって、60kgの個体は、潜在的に、2〜3回に分けられた60mg/日を投与され得る(20mgの投薬量を食後に送達される)。他の好ましい実施形態において、HIPを含む最適化された膵島形成促進性ペプチドは、約0.5〜約5mg/kg/日の範囲の投薬量で経口カプセル法を介しても送達され得、好ましくは、食後に分割された投薬量で経口的に送達され得る。
STZ誘発(rendered)糖尿病マウスにIP送達される、1日2回の1000マイクログラムから0.1マイクログラム/日の用量の範囲でのHIP2および最適化されたHIP2Bを使用する投薬量決定研究(実施例13)に基づくと、HIP2Bは、ハムスター由来INGAPのヒト治験において使用される10mg/kg(600mg/日)という投薬量に対して、その約10%の投薬量の約1mg/kgというHIP2および等価物の投薬量で使用され得る(図23)。
例えば、いくつかの態様において、様々な実施形態は、上で定義されたような化合物および薬学的に許容可能なキャリアまたは希釈剤を含む医薬組成物または上で定義されたような化合物を含む有効量の医薬組成物に関する。
本明細書中に開示される化合物は、それらが活性である任意の経路によって従来の様式で投与され得る。投与は、全身性、局所的、または経口であり得る。例えば、投与は、これに限定されないが、非経口、皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内、経皮的、経口、頬側若しくは眼球の経路、または膣内、吸入、デポー注射、若しくは埋没物によるものであり得る。したがって、本開示の化合物のための投与様式(単独または他の医薬品との併用のいずれか)は、これに限定されないが、舌下、注射(皮下または筋肉内に注射される、短時間作用性、デポー、埋没物、および植込錠の形態を含む)、または膣クリーム、膣坐剤、ペッサリー、膣リング、直腸坐剤、子宮内デバイスの使用によるもの、ならびにパッチおよびクリームなどの経皮的形態であり得る。
特定の投与様式は、適応症に依存する。特定の投与経路および投薬レジメンの選択は、最適な臨床反応を得るために、臨床医に公知の方法に従って臨床医によって調整されるか、または用量設定されるべきである。投与される化合物の量は、治療的に有効な量である。投与される投薬量は、処置される被験体の特徴、例えば、処置される特定の動物、年齢、体重、健康状態、もしあれば併用される処置のタイプ、および処置の頻度に左右され、当業者(例えば、臨床医)によって容易に決定され得る。
本開示の化合物および適当なキャリアを含む医薬処方物は、固体剤形(これに限定されるものではないが、錠剤、カプセル、カシェ剤、植込錠、丸剤、散剤、および顆粒剤を含む);局所的剤形(これに限定されるものではないが、溶液、粉末、流動性エマルジョン、流動性懸濁液、半固体、軟膏、ペースト、クリーム、ゲル、およびゼリーならびに泡沫を含む);および非経口剤形(これに限定されるものではないが、溶液、懸濁液、エマルジョン、および乾燥粉末を含む)であり得;本開示の有効量のポリマーまたはコポリマーを含む。活性成分が、薬学的に許容可能な希釈剤、充填剤、崩壊剤、結合剤、潤滑剤、界面活性物質、疎水性ビヒクル、水溶性ビヒクル、乳化剤、緩衝剤、湿潤剤、湿潤剤、可溶化剤、保存剤などとともにそのような処方物に含められ得ることもまた、当該分野で公知である。投与するための手段および方法は、当該分野で公知であり、当業者は、手引きとして様々な薬理学の参考文献を参照することができる。例えば、Modern Pharmaceutics,Banker & Rhodes,Marcel Dekker,Inc.(1979);およびGoodman & Gilman’s The Pharmaceutical Basis of Therapeutics,6th Edition,MacMillan Publishing Co.,New York(1980)を調べることができる。
本開示の化合物は、注射、例えば、ボーラス注射または持続注入による非経口投与のために製剤化され得る。本化合物は、約15分〜約24時間にわたる持続注入によって皮下に投与され得る。注射用の処方物は、単位剤形で、例えばアンプル中に、または保存剤が加えられた複数回用量の容器内に、入れられ得る。本組成物は、油性または水性のビヒクルにおける懸濁液、溶液またはエマルジョンのような形態をとり得、製剤化剤(formulatory agent)(例えば、懸濁剤、安定化剤、および/または分散剤)を含み得る。
経口投与の場合、本化合物は、これらの化合物を当該分野で周知の薬学的に許容可能なキャリアと組み合わせることによって容易に製剤化され得る。そのようなキャリアは、本明細書中に開示される化合物を、処置される患者による経口摂取のために、錠剤、丸剤、糖衣錠、カプセル、液体、ゲル、シロップ剤、スラリー、懸濁液などとしての製剤化を可能にする。経口用途用の医薬品は、固体賦形剤を加え、任意選択で、得られた混合物を粉砕し、そして所望の場合、錠剤または糖衣錠のコアを得るために適当な補助剤を加えた後、その顆粒剤の混合物を処理することによって得られ得る。適当な賦形剤は、これに限定されるものではないが、糖(これに限定されるものではないが、ラクトース、スクロース、マンニトール、およびソルビトールを含む);セルロース調製物(例えば、これに限定されるものではないが、トウモロコシデンプン、コムギデンプン、コメデンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチル−セルロース、カルボキシルメチルセルロースナトリウム、およびポリビニルピロリドン(PVP)を含む)などの充填剤を含む。所望であれば、崩壊剤(例えば、これに限定されるものではないが、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、またはアルギン酸若しくはアルギン酸ナトリウムなどのその塩を含む)が加えられ得る。
糖衣錠のコアは、適当なコーティングとともに提供され得る。この目的のために、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポール(carbopol)ゲル、ポリエチレングリコール、および/若しくは二酸化チタン、ラッカー溶液、ならびに適当な有機溶媒または溶媒混合物を任意選択で含み得る濃縮された糖溶液が使用され得る。識別のためまたは活性化合物の用量の様々な組み合わせを特徴付けるために、染料または色素が錠剤または糖衣錠のコーティングに加えられ得る。
経口的に使用され得る医薬調製物は、これに限定されるものではないが、ゼラチンから作製された押し込み型カプセルならびにゼラチンおよび可塑剤(例えば、グリセロールまたはソルビトール)から作製されたソフトカプセル、密閉カプセルを含む。押し込み型カプセルは、例えば、ラクトースなどの充填剤、例えば、デンプンなどの結合剤、および/または例えば、タルク若しくはステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤、ならびに任意選択で安定剤の混合物中に活性成分を含み得る。ソフトカプセルでは、活性化合物は、適当な液体(例えば、脂肪油、液体パラフィン、または液体ポリエチレングリコール)に溶解され得るか、または懸濁され得る。さらに、安定剤が加えられ得る。経口投与用のすべての処方物が、そのような投与に適した投薬量で存在するべきである。
頬側投与の場合、本組成物は、従来の様式で製剤化される、例えば錠剤または舐剤の形態をとり得る。
吸入による投与の場合、本開示に従って使用するための化合物は、適当な噴霧剤、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素、または他の適当なガスを使用した、加圧型パックまたは噴霧器からのエアロゾルスプレー形(aerosol spray presentation)の形態で都合よく送達される。加圧エアロゾルの場合、投薬量の単位は、定量を送達するバルブを提供することによって確定され得る。本化合物と適当な粉末基剤(例えば、ラクトースまたはデンプン)との混合粉末を含む、吸入器または注入器において使用するための、例えばゼラチンのカプセルおよびカートリッジが製剤化され得る。
本開示の化合物は、例えば、カカオバターまたは他のグリセリドなどの従来の坐剤の基剤を含む直腸組成物(例えば、坐剤または停留浣腸)としても製剤化され得る。
先に記載された処方物に加えて、本開示の化合物は、デポー調製物としても製剤化され得る。そのような長時間作用性の処方物は、埋め込み(例えば、皮下または筋肉内に)または筋肉内注射によって投与され得る。
デポー注射は、約1〜約6ヶ月若しくはそれ以上の間隔で投与され得る。したがって、例えば、本化合物は、適当なポリマー性材料若しくは疎水性材料(例えば、許容可能な油におけるエマルジョンとして)またはイオン交換樹脂を用いて、あるいは難溶性誘導体として、例えば、難溶性塩として、製剤化され得る。
経皮的投与では、本開示の化合物は、例えば、硬膏に適用され得るか、または結果的に生物に供給される経皮的な治療体系によって適用され得る。
本化合物の医薬組成物は、適当な固相またはゲル相のキャリアまたは賦形剤も含み得る。そのようなキャリアまたは賦形剤の例は、これに限定されるものではないが、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、様々な糖、デンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、および例えばポリエチレングリコールなどのポリマーを含む。
併用が、本明細書中に記載される方法の所望の作用を達成する際に望ましいとわかっているか、または有益であるとわかっている場合、本開示の化合物は、他の活性成分(例えば、佐剤、プロテアーゼ阻害剤、または他の適合性の薬物若しくは化合物)と併用しても投与され得る。
最適化されたHIPおよびそのアナログまたは誘導体を調製する方法
当該分野で公知の任意の手法は、最適化されたHIPまたはそのアナログ若しくは誘導体を合成し、精製する際に用いられ得、その手法は、これに限定されるものではないが、沈殿、吸着(例えば、カラムクロマトグラフィ、膜吸着剤、半径流カラム、バッチ吸着、高速液体クロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィ、無機吸着剤、疎水性吸着剤、固定化金属アフィニティークロマトグラフィ、アフィニティークロマトグラフィ)またはゲル濾過による新規化学合成および精製、電気泳動、液相分画(liquid phase partitioning)、界面活性剤分画(detergent partitioning)、有機溶媒抽出、および限外濾過を含む。精製中、HIPを含む最適化された膵島形成促進性ペプチドまたはそのアナログ若しくは誘導体の生物学的活性は、1若しくはそれ以上のインビトロアッセイまたはインビボアッセイによってモニターされ得る。最適化された膵島形成促進性ペプチドまたはそのアナログ若しくは誘導体の純度は、当該分野で公知の任意の方法(例えば、これに限定されるものではないが、ゲル電気泳動を含む)によってアッセイされ得る。Scopes,前出を参照のこと。いくつかの実施形態において、本明細書中に開示される組成物において使用される最適化された膵島形成促進性ペプチド(HIPを含む)またはそのアナログ若しくは誘導体は、総タンパク質mgの80〜100パーセントの範囲、または総タンパク質mgの少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、若しくは少なくとも98%であり得る。1つの実施形態において、組成物中に使用される最適化された膵島形成促進性ペプチド(HIPを含む)またはそのアナログ若しくは誘導体は、総タンパク質の少なくとも99%である。別の実施形態において、HIPを含む最適化された膵島形成促進性ペプチドまたはそのアナログ若しくは誘導体は、例えば、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動によってアッセイされると、明らかに均一に精製されている。1つの実施形態において、HIPを含む最適化された膵島形成促進性ペプチドが、95%超の純度に合成されHPLCによって試験される。
当該分野で公知の任意の手法は、最適化されたHIPまたはそのアナログ若しくは誘導体を合成し、精製する際に用いられ得、その手法は、これに限定されるものではないが、沈殿、吸着(例えば、カラムクロマトグラフィ、膜吸着剤、半径流カラム、バッチ吸着、高速液体クロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィ、無機吸着剤、疎水性吸着剤、固定化金属アフィニティークロマトグラフィ、アフィニティークロマトグラフィ)またはゲル濾過による新規化学合成および精製、電気泳動、液相分画(liquid phase partitioning)、界面活性剤分画(detergent partitioning)、有機溶媒抽出、および限外濾過を含む。精製中、HIPを含む最適化された膵島形成促進性ペプチドまたはそのアナログ若しくは誘導体の生物学的活性は、1若しくはそれ以上のインビトロアッセイまたはインビボアッセイによってモニターされ得る。最適化された膵島形成促進性ペプチドまたはそのアナログ若しくは誘導体の純度は、当該分野で公知の任意の方法(例えば、これに限定されるものではないが、ゲル電気泳動を含む)によってアッセイされ得る。Scopes,前出を参照のこと。いくつかの実施形態において、本明細書中に開示される組成物において使用される最適化された膵島形成促進性ペプチド(HIPを含む)またはそのアナログ若しくは誘導体は、総タンパク質mgの80〜100パーセントの範囲、または総タンパク質mgの少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、若しくは少なくとも98%であり得る。1つの実施形態において、組成物中に使用される最適化された膵島形成促進性ペプチド(HIPを含む)またはそのアナログ若しくは誘導体は、総タンパク質の少なくとも99%である。別の実施形態において、HIPを含む最適化された膵島形成促進性ペプチドまたはそのアナログ若しくは誘導体は、例えば、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動によってアッセイされると、明らかに均一に精製されている。1つの実施形態において、HIPを含む最適化された膵島形成促進性ペプチドが、95%超の純度に合成されHPLCによって試験される。
当該分野で公知の方法が、HIPを含む最適化された膵島形成促進性ペプチドまたはそのアナログ若しくは誘導体を組換え的に生成するために利用され得る。HIPを含む最適化された膵島形成促進性ペプチドまたはそのアナログ若しくは誘導体をコードする核酸配列が、宿主細胞内での増殖および発現のために発現ベクターに挿入され得る。
本明細書中で使用されるとき、発現構築物とは、適切な宿主細胞において、最適化されたHIPまたはそのアナログ若しくは誘導体の発現を可能にする1若しくはそれ以上の制御領域と作動可能に会合された、HIPを含む最適化された膵島形成促進性ペプチドまたはそのアナログ若しくは誘導体をコードする核酸配列のことを指す。「作動可能に会合された」とは、発現される制御領域および最適化された膵島形成促進性ペプチド(HIPを含む)またはそのアナログ若しくは誘導体が、結合され、転写および最終的には翻訳を可能にするように位置される会合のことを指す。
HIPを含む最適化された膵島形成促進性ペプチドまたはそのアナログ若しくは誘導体の転写に必要な制御領域は、発現ベクターによって提供され得る。その同族の開始コドンを欠いている最適化された膵島形成促進性ペプチド(HIPを含む)またはそのアナログ若しくは誘導体の遺伝子配列が発現される場合、翻訳開始コドン(ATG)もまた提供され得る。適合性の宿主−構築物系において、RNAポリメラーゼなどの細胞性の転写因子は、宿主生物においてHIPを含む最適化された膵島形成促進性ペプチドの配列の転写をもたらす発現構築物上の制御領域に結合する。遺伝子発現に必要とされる制御領域の正確な性質は、宿主細胞ごとに異なり得る。一般に、RNAポリメラーゼと結合することができ、作動可能に会合された核酸配列の転写を促進することができるプロモーターが、必要である。そのような制御領域は、転写および翻訳の開始に関与する5’非コード配列(例えば、TATAボックス、キャッピング配列、CAAT配列など)を含み得る。コード配列に対する非コード領域3’は、転写終結制御配列(例えば、ターミネーターおよびポリアデニル化部位)を含み得る。
制御機能を有するDNA配列(例えば、プロモーター)を、HIPを含む最適化された膵島形成促進性ペプチドまたはそのアナログ若しくは誘導体の遺伝子配列に付着するため、あるいはHIPを含む最適化された膵島形成促進性ペプチドまたはそのアナログ若しくは誘導体の遺伝子配列をベクターのクローニング部位に挿入するために、適切な適合性の制限酵素認識部位を提供するリンカーまたはアダプターが、当該分野で周知の手法によってcDNAの末端にライゲートされ得る。制限酵素による切断の後、ライゲーションの前に、一本鎖DNA末端を消化して戻すか、または埋めることによって、平滑末端を形成する改変が行われ得る。あるいは、所望の制限酵素部位が、所望の制限酵素部位を含むプライマーを使用するPCRを用いるDNAの増幅によって、DNAのフラグメントに導入され得る。
制御領域と作動可能に会合された、HIPを含む最適化された膵島形成促進性ペプチドまたはそのアナログ若しくは誘導体の配列を含む発現構築物は、さらなるクローニングなしに、膵島形成促進性ペプチド(最適化されたHIPを含む)またはそのアナログ若しくは誘導体の発現および産生に適切な宿主細胞に直接導入され得る。その発現構築物は、例えば、相同組換えを介した、宿主細胞のゲノムへの膵島形成促進性ペプチド(最適化されたHIPを含む)またはそのアナログ若しくは誘導体の配列の組み込みを促進するDNA配列も含み得る。この場合、HIPを含む最適化された膵島形成促進性ペプチドまたはそのアナログ若しくは誘導体を適切な宿主細胞において増殖し、発現するために、その宿主細胞に適した複製起点を含む発現ベクターを使用する必要がない。
種々の発現ベクターが使用され得、それは、これに限定されるものではないが、プラスミド、コスミド、ファージ、ファージミド、または改変ウイルスを含む。そのような宿主発現系は、HIPを含む最適化された膵島形成促進性ペプチドまたはそのアナログ若しくは誘導体の遺伝子のコード配列を生成し、続いて精製し得るビヒクルであるだけでなく、適切なヌクレオチドコード配列で形質転換またはトランスフェクトされたときにHIPを含む最適化された膵島形成促進性ペプチドまたはそのアナログ若しくは誘導体をインサイチュで発現し得る細胞でもある。これらは、これに限定されるものではないが、HIPを含む最適化された膵島形成促進性ペプチドまたはそのアナログ若しくは誘導体のコード配列を含む、組換えバクテリオファージDNA、プラスミドDNA、またはコスミドDNAの発現ベクターで形質転換される、細菌(例えば、E.coliおよびB.subtilis)などの微生物;膵島形成促進性ペプチド(最適化されたHIPを含む)またはそのアナログ若しくは誘導体のコード配列を含む組換え発現ベクターで形質転換された酵母(例えば、Saccharomyces,Pichia);HIPを含む最適化された膵島形成促進性ペプチドまたはそのアナログ若しくは誘導体のコード配列を含む組換えウイルス発現ベクター(例えば、バキュロウイルス)で感染された昆虫細胞系;組換えウイルス発現ベクター(例えば、カリフラワーモザイクウイルス(cauliflower mosaic virus:CaMV);タバコモザイクウイルス(tobacco mosaic virus:TMV))で感染されたか、あるいはHIPを含む最適化された膵島形成促進性ペプチドまたはそのアナログ若しくは誘導体のコード配列を含む組換えプラスミド発現ベクター(例えば、Tiプラスミド)で形質転換された、植物細胞系;または哺乳動物細胞のゲノム由来のプロモーター(例えば、メタロチオネインプロモーター)または哺乳動物ウイルス由来のプロモーター(例えば、アデノウイルス後期プロモーター;ワクシニアウイルス7.5Kプロモーター)を含む組換え発現構築物を有する哺乳動物細胞系(例えば、COS、CHO、BHK、293、NS0、および3T3細胞)を含む。好ましくは、Escherichia coliなどの細菌細胞および真核細胞が、組換えの最適化された膵島形成促進性ペプチド(HIPを含む)またはそのアナログ若しくは誘導体の発現に使用される。例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞(Chinese hamster ovary cells:CHO)など哺乳動物細胞が、HIPを含む最適化された膵島形成促進性ペプチドまたはそのアナログ若しくは誘導体の配列を効率的に発現するために、サイトメガロウイルスの主要中間初期(major intermediate early)遺伝子由来のプロモーターエレメントを有するベクターと共に使用され得る。
細菌系では、発現される最適化された膵島形成促進性ペプチド(HIPを含む)またはそのアナログ若しくは誘導体について意図される用途に応じて、いくつかの発現ベクターが有利に選択され得る。例えば、大量の最適化された膵島形成促進性ペプチド(HIPを含む)またはそのアナログ若しくは誘導体が産生されるとき、HIPを含む最適化された膵島形成促進性ペプチドまたはそのアナログ若しくは誘導体の医薬組成物の生成のために、容易に精製される高レベルの融合タンパク質産物の発現を指示するベクターが、望ましい場合がある。ベクターは、これに限定されるものではないが、E.coli発現ベクターpCR2.1TOPO(Invitrogen);pINベクターなどを含む。pFLAG(Sigma)、pMAL(NEB)、およびpET(Novagen)のような一連のベクターを使用することによってもまた、FLAGペプチド、malE−、またはCBD−タンパク質との融合タンパク質として外来タンパク質が発現され得る。これらの組換えタンパク質は、正しいフォールディングおよび成熟のために細胞周辺腔に向けられ得る。融合される部分は、発現されたタンパク質の親和性精製のために使用され得る。エンテロキナーゼのような特定のプロテアーゼに対する切断部位が存在することにより、HIPを含む最適化された膵島形成促進性ペプチドまたはそのアナログ若しくは誘導体の切断が可能になる。pGEXベクターを使用することによってもまた、グルタチオン5−トランスフェラーゼ(GST)との融合タンパク質として外来タンパク質が発現され得る。一般に、そのような融合タンパク質は、可溶性であり、マトリックスグルタチオンアガロースビーズへの吸着および結合に続いて遊離グルタチオンの存在下での溶出によって、溶解された細胞から容易に精製され得る。pGEXベクターは、トロンビン切断部位またはXa因子プロテアーゼ切断部位を含むように設計されており、クローニングされた標的遺伝子産物は、GST部分から遊離され得る。
昆虫系では、外来遺伝子を発現する多くのベクターが、使用され得、例えば、Autographa californica核多角体病ウイルス(Autographa californica nuclear polyherosis virus:AcNPV)が、外来遺伝子を発現するベクターとして使用され得る。このウイルスは、Spodoptera frugiperda細胞のような細胞内で成長する。HIPを含む最適化された膵島形成促進性ペプチドまたはそのアナログ若しくは誘導体のコード配列は、そのウイルスの非必須領域(例えば、ポリヘドリン遺伝子)に個別にクローニングされ得、AcNPVプロモーター(例えば、ポリヘドリンプロモーター)の制御下に配置され得る。
哺乳動物宿主細胞では、いくつかのウイルスベースの発現系が利用され得る。発現ベクターとしてアデノウイルスが使用される場合、HIPを含む最適化された膵島形成促進性ペプチドまたはそのアナログ若しくは誘導体の目的のコード配列は、アデノウイルス転写/翻訳調節複合体、例えば、後期プロモーターおよび三部(tripartite)リーダー配列にライゲートされ得る。次いで、このキメラ遺伝子を、インビトロまたはインビボにおける組換えによってアデノウイルスゲノムに挿入し得る。そのウイルスゲノムの非必須領域(例えば、領域E1またはE3)における挿入は、生存可能であり、かつHIPを含む最適化された膵島形成促進性ペプチドまたはそのアナログ若しくは誘導体を、感染した宿主において発現することができる、組換えウイルスにおいて生じる。挿入された、HIPを含む最適化された膵島形成促進性ペプチドまたはそのアナログ若しくは誘導体のコード配列の効率的な翻訳には、特定の開始シグナルも必要とされることがある。これらのシグナルは、ATG開始コドンおよび隣接配列を含む。さらに、開始コドンは、挿入断片全体の翻訳を確実にするために、所望のコード配列の読み枠と一致していなければならない。これらの外因性の翻訳調節シグナルおよび開始コドンは、天然と合成の両方の種々の起源からのものであり得る。発現の効率は、適切な転写エンハンサーエレメント、転写ターミネーターなどを含めることによって増強され得る。
さらに、挿入される配列の発現を調節するか、または所望の特定の様式で遺伝子産物を修飾し、プロセシングする宿主細胞株が、選択され得る。タンパク質生成物のそのような修飾(例えば、グリコシル化)およびプロセシング(例えば、切断)は、そのタンパク質の機能のために重要であり得る。様々な宿主細胞が、タンパク質および遺伝子産物の翻訳後のプロセシングおよび修飾にために特徴的かつ特異的なメカニズムを有する。発現される外来タンパク質の正しい修飾およびプロセシングを確実にするために、適切な細胞株または宿主系が選択され得る。この目的を達成するために、一次転写産物の適切なプロセシングおよび遺伝子産物の翻訳後修飾、例えば、遺伝子産物のグリコシル化およびリン酸化のための細胞機構を有する真核生物の宿主細胞が、用いられ得る。そのような哺乳動物宿主細胞は、これに限定されるものではないが、PC12、CHO、VERY、BHK、HeLa、COS、MDCK、293、3T3、W138、BT483、Hs578T、HTB2、BT2OおよびT47D、NS0(いかなる免疫グロブリン鎖も内因性に産生しないマウスミエローマ細胞株)、CRL7O3O、ならびにHsS78Bst細胞を含む。最適化されたHIPまたはそのアナログ若しくは誘導体の所望の活性に非必須である翻訳後修飾が見られる場合、細菌系または酵母系における発現が用いられ得る。
適切にプロセシングされた、HIPを含む最適化された膵島形成促進性ペプチドまたはそのアナログ若しくは誘導体を長期間にわたって高収率で産生するためには、細胞内での安定な発現が好ましい。HIPを含む最適化された膵島形成促進性ペプチドまたはそのアナログ若しくは誘導体を安定に発現する細胞株は、選択マーカーを含むベクターを用いることによって操作され得る。例としては、これに限定されないが、発現構築物の導入後、操作された細胞を1〜2日間強化培地中で生育し、次いで、選択培地に切り替え得る。その発現構築物内の選択マーカーは、その選択に対する抵抗性を付与し、使用されるベクター構築物および宿主細胞に応じて、細胞が発現構築物をその染色体に安定に組み込ませること、および培養物中で成長すること、および細胞株に発展することを可能にし得る。そのような細胞は、HIPを含む最適化された膵島形成促進性ペプチドまたはそのアナログ若しくは誘導体を持続的に発現しながら、長期間にわたって培養され得る。
いくつかの選択系が用いられ得、それは、これに限定されるものではないが、抗生物質耐性(ジェネティシン(geneticine)すなわちG−418に対する抵抗性を付与するNeo;Zeocinに対する抵抗性のためのZeo;およびブラストサイジンに対する抵抗性のためのBsdのようなマーカー);代謝拮抗物質耐性(メトトレキサートに対する抵抗性を付与するDhfrのようなマーカー;ミコフェノール酸に対する抵抗性を付与するgpt;およびハイグロマイシンに対する抵抗性を付与するhygroを含む。さらに、変異細胞株(これに限定されるものではないが、tk−、hgprt−、またはaprt−細胞を含む)が、チミジンキナーゼ、ヒポキサンチン、グアニン、またはアデニンホスホリボシル−トランスフェラーゼに対応する遺伝子を有するベクターと組み合わせて使用され得る。組換えDNA技術の当該分野で通常公知の方法を日常的に適用することにより、所望の組換えクローンが150:1で選択され得る。
その組換え細胞を、温度、インキュベーション時間、光学濃度、および培地組成に関して標準的な条件下で培養し得る。しかしながら、組換え細胞が成長するための条件は、HIPを含む最適化された膵島形成促進性ペプチドまたはそのアナログ若しくは誘導体の発現のための条件と異なり得る。改変された培養条件および培地を使用することによっても、HIPを含む最適化された膵島形成促進性ペプチドまたはそのアナログ若しくは誘導体の産生が増強され得る。当該分野で公知の任意の手法を適用することにより、HIPを含む最適化された膵島形成促進性ペプチドまたはそのアナログ若しくは誘導体を産生するための最適な条件が確立され得る。
HIPを含む最適化された膵島形成促進性ペプチドまたはそのフラグメントを組換え手法または天然源からの精製によって生成するのに対する代替方法は、ペプチド合成である。例えば、最適化されたHIP全体またはそのアナログ若しくは誘導体、あるいは最適化されたHIPまたはそのアナログ若しくは誘導体の一部に対応するタンパク質は、ペプチド合成装置を使用することによって合成され得る。従来のペプチド合成プロトコルまたは当該分野で周知の他の合成プロトコルが使用され得る。
HIPを含む最適化された膵島形成促進性ペプチドまたはそのアナログ若しくは誘導体あるいはそれらの一部のアミノ酸配列を有するタンパク質は、固相ペプチド合成によって合成され得る。合成中、保護された側鎖を有するN−α−保護アミノ酸が、そのC末端によって連結された成長中のポリペプチド鎖および不溶性のポリマー支持体、すなわち、ポリスチレンビーズに滴下される。そのタンパク質は、N−α−脱保護アミノ酸のアミノ基を、ジシクロヘキシルカルボジイミドなどの試薬と反応させることによって活性化されたN−α−保護アミノ酸のα−カルボキシル基に連結することによって合成される。その活性化されたカルボキシルに遊離アミノ基が付着することによって、ペプチド結合が形成される。最もよく使用されるN−α−保護基には、酸不安定であるBocおよび塩基不安定Fmocが含まれる。適切な化学、樹脂、保護基、保護されたアミノ酸および試薬の詳細は、当該分野で周知であるので、本明細書中では詳細に説明されない。
得られる最適化された膵島形成促進性ペプチド(HIPを含む)またはそのアナログ若しくは誘導体の精製は、従来の手順(例えば、ゲル浸透、分配および/またはイオン交換クロマトグラフィを用いる分取HPLC)を用いて達成される。適切なマトリックスおよび緩衝液の選択は、当該分野で周知であるので、本明細書中では詳細に説明されない。
本発明の試薬および方法の前述の詳細な説明とともに、以下の実施例が提供されることにより、本発明の様々な態様が例証される。
インビトロHIP活性。このインビトロ研究は、University of Pennsylvania Human Islet Laboratoryにおいて行われた。ヒト膵島画分およびヒト膵管画分を10日間培養し、次いで、盲検試験において処理した。ネガティブコントロールとしての機能を果たすスクランブルペプチド、HIP3、HIP1、HIP2、およびポジティブコントロールとしての機能を果たすハムスター由来INGAPで処理したヒト膵臓培養物におけるインスリンレベルを、ラジオイムノアッセイ法を用いて測定した。ペプチドは、Bachem BioScienceによって合成されたものである(95%純粋、リサーチグレード)。
2つ組の培養物を第10日目および第12日目に処理し、次いで、HIPペプチド、コントロールおよびINGAPでの処置の1週間後にインスリン含有量の検出のために溶解した。10日間の培養中、インスリン産生は低下し、次いで、HIPペプチドで処置した後、再度インスリンが産生される。
図1に示されるような管画分のグラフは、ヒト膵管組織を含む培養物のインキュベーション後の、ラジオイムノアッセイによって測定されたインスリンレベルをy軸に表している。膵島画分のグラフは、ヒト膵島組織におけるインキュベーション後のインスリンレベルを示している。ベースラインのインスリンレベルは、ベースライン時の管画分におけるレベルよりもベースライン時の膵島画分におけるレベルの方が著しく高い。
Ricordi法を用いて、管組織および膵島組織を分離した。管細胞も膵島培養物も完全に均一では全くなかった。本研究は、HIPに対する標的である前駆細胞が、膵島培養物と管培養物の両方において見られることも示唆している。本研究を繰り返したところ、HIP2とともに培養されたヒト管組織におけるラジオイムノアッセイによってインスリンレベルが4倍も増加したという以下の図表に示される同様の知見が得られた。
繰り返された研究から、主にヒト管細胞培養物と膵島培養物の両方においてインスリンが増加し、ベースラインのインスリンレベルは、膵島培養物と比べてベースライン時の管培養物におけるレベルのほうが一貫して約1/3低く、同様にネガティブコントロールと比べてHIPペプチドとのインキュベーション後のインスリン含有量が増加したことが確かめられた。
インビボ研究。HIP3、HIP1、およびHIP2が、マウスにおけるインビボ研究の対象である。研究から、これらのHIPバリアントは、糖尿病マウスに導入されたときに、膵臓内の前駆細胞が新しい膵島構造に分化するのを刺激することが示された。糖尿病のモデルが、マウスにおいて開発されている(Rosenberg et.al.,2004)。被験体数は、この研究にとって十分な数の糖尿病の動物がもたらされるように選択し、動物を研究群にランダムに割り当てた。すべての動物に、連続した28日間にわたって腹腔内注射を介して1日2回(午前および午後)投薬した。用量投与のタイミングは、投薬期間中、一定(±2時間)のままであった。そのマウスが糖尿病になったこと(少なくとも1週間にわたって16.7mmol/L(300mg/dL)を超える血糖を確認した後、マウスに投薬した。
マウスを糖尿病にするために、連続した5日間にわたってクエン酸緩衝液,pH4.5中のストレプトゾシンを40mg/kgでマウスに腹腔内注射した。マウスは、糖尿病であるとみなされるために、少なくとも1週間にわたって16.7mmol/L(300mg/dL)を超える血糖を有していなければならなかった。任意の動物における血糖値が、400mg/dL超に上昇したら、その動物をインスリンで処置した。3日おきに、各日同じ時間に、尾に切り目を入れて、1滴の血液を採取した。グルコースメーターを用いて、グルコース測定値を決定した。群の割り当ておよび用量レベルは、表1のとおりであった。
研究のエンドポイントには、以下:グルコースの変化;インスリン必要量の変化;および死後の膵臓の組織学が含まれた。
インスリン必要量の変化。インスリン必要量とインスリン必要量の減少速度の両方の著しい減少が、図2に示されるようにHIP処置マウスにおいてみられた。HIP2処置マウスは、第21日目までに完全にインスリンから離脱した。
グルコースレベルの変化。HIP処置群のすべてにおいて、グルコースがコントロールと比べてベースラインから平均して減少し、この減少は、図3に示されるようにすべてのHIP処置群において有意であった。HIP1とコントロール間では平均グルコースが14.7%低下し、HIP2とコントロール間では平均グルコースが29.4%低下し、HIP3とコントロール群間では平均グルコースが57.3%低下した。このデータは、コントロール糖尿病マウスと比べて、すべてのHIP処置マウス群間でのインスリン必要量の減少速度が著しく速いことを示唆している。マウス膵臓において観察された膵島の数は、HIP処置後に著しく増加し、このことを、研究された各マウスについて区分し、再調査した。この膵臓は、検体について知らされていない組織学者によって評価され、そのデータを以下の表3に示す。
HIPとプラセボ間の膵島の数の差は、統計学的に有意だった(p=0.022)。HIP処置マウスとプラセボ処置群間で、膵島面積のなおもより著明な増加があった。図4Aに示されるように、HIP2処置群における膵島面積は、プラセボ処置群における142,394μm(2)、HIP3処置群における283,918μm(2)と比べて、360,297μm(2)だった(p=0.05)。図4Bは、HIP2Bが糖尿病マウスにおいて膵島の数を増加させることを示している。(a)プラセボ処置マウスおよびHIP処置マウスにおけるインスリン免疫染色の代表的な像。(b)インスリン染色された膵島は、これらの構造を自家蛍光の血液細胞と区別するために黄色で輪郭が描かれている。
マウスの膵臓においてもインスリンに対する蛍光免疫染色が行われ、図5に示されるように、HIP処置マウスにおけるインスリン染色のほうが染色の程度が高いことが示されている。このマウス膵臓組織を回収し、4%PFA中で固定し、ブロッキングし、切片にした。10倍対物レンズ、1.6オプティバール(optivar)。
以下の実施例では、HIPおよび最適化されたHIPを合成し、精製する例示的な方法を説明する。
HIPペプチドの合成は、標準的なFmoc保護化学(Fields,G.B.and Noble,R.L.1990,Int.J.Peptide Protein Res.35,161−214)を用いるMerrifieldの一般的な固相手順(Merrifield,R.B.1963,J.Am.Chem.Soc.85:2149−2154)によるものであった。
樹脂に結合した保護されたペプチドを切断し、スカベンジャーの存在下でのトリフルオロ酢酸(trifluoroacetic acid:TFA)による処理によって脱保護することにより、粗生成物を得た。逆相高速液体クロマトグラフィ(high performance liquid chromatography:HPLC)によって、精製されたペプチド生成物を得た。
ポリエチレングリコール(polyethylene glycol:PEG)を有するペプチドの誘導体化は、300〜43,000という分子量範囲の別個のPEG単位の導入からなり得る。
実施例A:Ac−IGLHDPTQGTEPNG−NH2(HIP2B)(配列ID番号7)。4−[2’,4’−ジメトキシフェニル−Fmoc−アミノメチル)−フェノキシ樹脂であるRinkアミド樹脂から出発し、Fmoc保護されたアミノ酸を連続的に導入し、HOBtおよびDCC(N−ヒドロキシベンゾトリアゾールおよびジシクロヘキシルカルボジイミド)を用いて結合させた。出発樹脂および各アミノ酸のFmoc保護基のFmoc脱保護は、ジメチルホルムアミド中の20%ピペリジンを用いて達成された。N末端アミノ酸のIleのFmoc保護基を除去した後、樹脂に結合した保護されたペプチドを塩化メチレン中の20%無水酢酸でアセチル化した。側鎖基の脱保護および樹脂からのペプチドの切断は、2.5%水および2.5%トリイソプロピルシランを含む95%トリフルオロ酢酸を用いて達成された。1時間処理した後、そのペプチドを、ジエチルエーテルを含む切断溶液から沈殿させ、濾過し、乾燥させた。
精製。水中の0.1%TFAおよびアセトニトリル中の0.1%TFAをそれぞれ緩衝液AおよびBとして使用するC−18支持体における逆相高速液体クロマトグラフィ(high performance liquid chromatography:HPLC)によって、粗生成物を精製した。緩衝液Bを徐々に増加させる勾配を用いることによって生成物を溶出した。残留TFAのアセテートとの交換は、生成物画分をC−18HPLCカラムに再度適用し、0.1M NH4OAc水溶液で洗浄し、移動相として水およびアセトニトリル中の1%酢酸の勾配を用いて生成物を溶出することによって、達成された。純粋な生成物画分をプールし、凍結乾燥させた。ペプチドの同一性および均一性は、アミノ酸組成解析、分析用HPLC、および質量スペクトル解析によって確かめられた。
実施例B:IGLHDPTQGTEPNG(HIP2)(配列ID番号4)。Fmoc−Gly−Wang樹脂から出発し、実施例Aにおけるようにペプチド配列を組み立てた。ブロックされていない遊離アミノ末端および遊離カルボキシル末端を有するペプチドを提供するために、アミノ末端をアセチル化しなかった。精製された生成物を実施例Aにおけるように単離した。
実施例C:(Ac−IGLHDPTQGTEPNGC−NH2)2(HIP2BCys二量体)(配列ID番号19)。遊離チオール型でのペプチドの合成は、実施例Aに記載したとおりであった。約2gのペプチドを2mlの酢酸で溶解し、約500mlの蒸留水で希釈し、20%NH4OH溶液を滴下することによってpHを約8.2に調整することによって、粗生成物を酸化することにより二量体を形成した。その溶液を室温において一晩撹拌した。反応は、一晩で完了に達しなかった。その反応を完了させるために、黄緑色が持続するまで、フェリシアン化カリウムの1%溶液を加えた。Ellman試験およびHPLC解析によって判定したところ、その反応は完了したと判断された。次いで、酸化されたペプチドの溶液を3〜5gのAG−1 X2イオン交換(塩化物型)樹脂とともに30分間撹拌し、濾過し、酢酸を用いてpHを約5に調整した後、HPLC精製した。
実施例D:(IGLHDPTQGTEPNGC)2(HIP2Cys二量体)(配列ID番号13)。Fmoc−Cys(Trt)−Wang樹脂から出発し、実施例2におけるようにペプチド配列を調製した。粗生成物のエーテル沈殿、二量体への酸化、およびHPLC精製を、実施例Cに記載したように達成した。
実施例E:Ac−IGLHDPTQGTEPNGC−NH2(HIP2BCys)(配列ID番号16)。単量体の1次配列の合成および精製を実施例Aにおけるように達成する。
以下の実施例では、ブロックされたHIPを調製する例示的な方法を説明する。HIPブロックされたペプチドを固相ペプチド合成(Solid Phase Peptide Synthesis:SPPS)によって調製した。固相合成の基本的な前提は、鎖の一方の末端が不溶性の支持体に固着されながら、アミノ酸が任意の所望の配列のペプチドに組み立てられ得るということである。上で述べたように、実際のSPPSでは、ペプチドのカルボキシル末端が、ポリマーに結合される。アミノ酸の所望の配列が、支持体上に結合された後、試薬を適用することにより、そのペプチド鎖を支持体から切断し、その粗ペプチドを溶液中に遊離し得る。この合成に関与するすべての反応が、可能であれば完了するまで行われることにより、均一な生成物が得られ得る。
ペプチドのC末端がアミドであるとき、誘導体は、ペプチドアミドである。多くの天然に存在するペプチドホルモンが、アミドとして存在するので、ペプチドアミドは、極めて重要な誘導体である。ペプチドアミドを合成するために、切断時にペプチドアミドを直接もたらす固相樹脂が開発された。N末端がアセチル基であるとき、そのペプチドは、C末端からN末端に組み立てられる。次いで、そのN末端は、塩基の存在下において無水酢酸を用いてアセチル化される。
Fmoc−アミノ酸誘導体を用いることにより、前記配列を構築する。アミノ酸の所望の配列を支持体上に結合した後、そのペプチドをアセチル化し、濾過し、そして乾燥させる。次いで、スカベンジャーを含むトリフルオロ酢酸(Trifluoroacetic acid:TFA)を用いて、アセチル化されたペプチド樹脂を切断することにより、そのペプチドを支持体ならびにすべての保護基から遊離する。次いで、高速液体クロマトグラフィ(high performance liquid chromatography:HPLC)を用いてその粗材料に対して精製を行う。
実施例F:Ac−IGLHDPTQGTEPNGC(PEG)−NH2(HIP2BCys−PEG)(配列ID番号25)。実施例5の精製された単量体型のペプチド(1.1当量)を酢酸塩緩衝液(0.1M,pH=6.5)に溶解した。マレイミド誘導体化ポリエチレングリコール(PEGマレイミド)の溶液(1当量)を蒸留水中に調製し、撹拌しながら前記ペプチド溶液に加えた。得られた溶液のpHを、希NH4OH溶液を用いて約6.5に調整し、室温で30分間撹拌し、数滴の酢酸によって酸性化し、HPLCによって精製した。
実施例G:IGLHDPTQGTEPNGC(PEG)(HIP2Cys−PEG)(配列ID番号22)。Fmoc−Cys(Trt)−Wang樹脂から出発し、1次配列の合成および精製は、実施例Bに記載したとおりである。PEGマレイミドを用いた誘導体化後のHPLC精製は、実施例Fにおけるとおりである。
実施例H:(PEG)−IGLHDPTQGTEPNG(PEG−HIP2)(配列ID番号91)。樹脂に結合したペプチド1次配列を、実施例2におけるように調製した。N末端のIleのFmoc脱保護の後、カップリング剤としてHOBTおよびDCCを用い、保護されたペプチド樹脂を、PEG−カルボン酸を用いて誘導体化した。その樹脂からの(PEG)−ペプチドの切断および精製は、実施例Aに記載したとおりだった。
以下の実施例では、HIP2に切断されるHIP1の筋肉内投与および皮下投与の薬物動態を説明する。
20匹のラット(5匹のラット/投与経路)を用いたHIP送達の薬物動態を評価した。ハムスター由来INGAPでの治験と同様に、筋肉内(IM)経路は、図6に示されるように、その材料のより良好な血中濃度を提供したが、半減期の測定値は、ELISA測定によって30分短かった。
図7に示されるように、投与の皮下(SQ)経路は、わずかに長い半減期を示したが、ELISAによって検出されたレベルは、IM経路よりも低かった。IM経路は、SQよりもわずかに長い血中半減期を提供する。
以下の実施例は、凍結融解研究におけるHIP2Bペプチドの安定性を示している。
実験の手順。この研究は、各群8つのサンプルの2群で開始された。2ヶ月間の安定性研究の一部として、一方の群は、4〜8℃で維持され、他方の群は、25℃で維持される。各サンプルは、5マイクロリットルの蒸留水中に4.57ミリグラムのHIP2Bを含む。LC/MS解析を行うまで、7日間おきに各温度群から1つのサンプルを取り出し、保存のためにマイナス20℃の冷凍庫内に置いた。安定性研究において1、2、および3週間後に一連のサンプルを、その研究の開始時に調製され−20℃で保存されたHIP2Bのコントロールサンプルに対して評価した。上に記載した各温度における安定性試験の3週間後、LC/MSによって測定したところ、すべてのサンプルが変化していなかったことから、1、2、および3週間後は安定であると考えられる。この凍結融解安定性研究から、ジメチルスルホキシド(DMSO)中で保存されるとき、HIP配列内のPro−Asnの接合点において炭素シフト(carbon shift)が生じ、配列は、−20℃の等張性食塩水中で保存されるとき、数ヶ月間安定のままであることが示唆される。
最適化されたHIPは、インビトロにおいて血清プロテアーゼに対する経時的な(T)ペプチド安定性の増加を示す。
前記ペプチドをヒト血漿中、37℃においてインキュベートした。1時間にわたってサンプルのインキュベーションを行った。1、5、10、30、および60分という個別の時点を用いて反応を追跡した。各時点における血漿プロテアーゼの非活性化は、サンプルを100℃で1分間加熱することによって達成された。ワークアップ後、血漿処理サンプルを、逆相クロマトグラフィによって、質量分析計、HPLC/LC−MSで順次、コントロールサンプルに対して評価した。
HIPおよび最適化されたHIPペプチドで処理された血漿を1、5、10、30、および60分にわたって評価した。各時点について、0.70mlの血漿を10ml試験管にピペットで移した。各々に、リン酸緩衝食塩水中に調製されたHIPまたは最適化されたHIPペプチドの原液(1.66mg/ml)0.30mlを加えた。その血漿/ペプチドサンプルを各時点にわたって37℃でインキュベートした後、100℃で加熱することにより、血漿プロテアーゼのタンパク分解活性を不活性化した。不活性化後、そのサンプルを1mlのH2Oで希釈し、遠心し、解析のために上清の液体を取り出した。
緩衝液AとしてH2O中の0.07%TFAおよび緩衝液Bとしてアセトニトリル中の0.07%TFAを用いるC−18逆相カラム(50mm×2.0mm)においてサンプルを解析した。10分間にわたる98%A/2%Bから30%A/70%Bに達する線形勾配を0.4ml/分という流速で用いた。220nmの波長のUVおよび質量分析によって溶出液をモニターした。ペプチド参照サンプルおよび血漿コントロールに対する、血漿処理ペプチド(37℃)のクロマトグラフィのプロファイルの比較を用いることによって、血漿処理に対するペプチドの相対的な安定性を判定した。
コントロール
T=0:血漿(0.7ml)+ペプチド原液(0.3ml)、100℃で1分間加熱。1mlのH2Oを加え、遠心。
血漿バックグラウンドコントロール:0.7mlの血漿+PBS(0.3ml)、100℃で1分間加熱、1mlのH2Oを加え、遠心。
熱処理ありの参照ペプチド:ペプチド原液(0.3ml)+0.7mlのPBS、100℃で1分間加熱、1mlのH2Oを加える。
熱処理なしの参照ペプチド:ペプチド原液(0.3ml)+0.7mlのPBS+1mlのH2O。
結果。
HIP2(IGLHDPTQGTEPNG)(配列ID番号4)
新しい成分の出現(約5%)によるタンパク質分解の証拠が、HIP2インキュベーションのたった1分後に明らかである。その新しい成分は、経時的に増加し続ける。30分後、それは、約50%となり、60分後、その濃度は、約70%である。主要な代謝産物は、GLHDPTQGTEPNG(配列ID番号92)と同定され、このことから、N末端のイソロイシンが主に喪失されたことが示唆される。さらに、IGLの喪失に起因する少量のHDPTQGTEPNG(配列ID番号93)の存在についても証拠がある。
コントロール
T=0:血漿(0.7ml)+ペプチド原液(0.3ml)、100℃で1分間加熱。1mlのH2Oを加え、遠心。
血漿バックグラウンドコントロール:0.7mlの血漿+PBS(0.3ml)、100℃で1分間加熱、1mlのH2Oを加え、遠心。
熱処理ありの参照ペプチド:ペプチド原液(0.3ml)+0.7mlのPBS、100℃で1分間加熱、1mlのH2Oを加える。
熱処理なしの参照ペプチド:ペプチド原液(0.3ml)+0.7mlのPBS+1mlのH2O。
結果。
HIP2(IGLHDPTQGTEPNG)(配列ID番号4)
新しい成分の出現(約5%)によるタンパク質分解の証拠が、HIP2インキュベーションのたった1分後に明らかである。その新しい成分は、経時的に増加し続ける。30分後、それは、約50%となり、60分後、その濃度は、約70%である。主要な代謝産物は、GLHDPTQGTEPNG(配列ID番号92)と同定され、このことから、N末端のイソロイシンが主に喪失されたことが示唆される。さらに、IGLの喪失に起因する少量のHDPTQGTEPNG(配列ID番号93)の存在についても証拠がある。
HIP2B(Ac−IGLHDPTQGTEPNG−NH2)(配列ID番号7)HIP2のN−アセチル化C−アミド型は、37℃でのインキュベーションの1時間後に、血漿プロテアーゼに対して完全に安定であるとみられる。
HIP3(IGLHDPTQGTEPNGE)(配列ID番号3)HIP3のタンパク質分解は、HIP2のタンパク質分解よりも遅い。60分後、HIP3の開始濃度は、約50%である。同定された主要な代謝産物は、HDPTQGTEPNG(配列ID番号93)であり、このことから、IGの喪失が示唆される。
HIP3B(Ac−IGLHDPTQGTEPNGE−NH2)(配列ID番号5)HIP3のブロック型は、血漿インキュベーションの1時間まで完全に安定である。
HIP2BCys−二量体(Ac−IGLHDPTQGTEPNGC−NH2)2(配列ID番号19)
この化合物は、少なくとも1時間にわたって、血漿プロテアーゼに対して安定であるとみられる。しかしながら、インキュベートされたサンプルの100℃の熱処理ならびにT=0コントロールから、出発物質が、Ac−IGHDPTQGTEPNGC(C)−NH2(配列ID番号94)という構造を有するシスチン付加物に変換したことが示唆された。
この化合物は、少なくとも1時間にわたって、血漿プロテアーゼに対して安定であるとみられる。しかしながら、インキュベートされたサンプルの100℃の熱処理ならびにT=0コントロールから、出発物質が、Ac−IGHDPTQGTEPNGC(C)−NH2(配列ID番号94)という構造を有するシスチン付加物に変換したことが示唆された。
変換は、サンプルが100℃に加熱されるときの、血漿からのシステインによる置換に起因するとみられる。
HIP2BCys−PEG(Ac−IGLHDPTQGTEPNGC(PEG)−NH2)(配列ID番号22)。この高分子構築物は、1時間まで血漿プロテアーゼに対して安定である。
結果。血漿中のHIP2およびHIP2Bペプチドのタンパク質分解を図8に示す。HIP2の結果は、血漿中でのインキュベーションのたった1分後に新しい成分の出現(約5%)を示した。この新しい成分は、経時的に増加し続け、再提示し、そして主要な代謝産物は、第1にN末端のイソロイシンが喪失しており、第2に最初の3つのアミノ酸が喪失しているHIP2配列と同定される。HIP2Bは、37℃でのインキュベーションの1時間後に、血漿プロテアーゼに対して完全に安定であるとみられた。HIP2BおよびHIP3Bと呼ばれるHIP2およびHIP3のブロック型は、1時間まで、ブロックされていない構造よりも血漿プロテアーゼに対して明らかに安定である。HIP2Bの二量体およびPEG誘導体もまた非常に安定である。
PANC−1として知られるヒト膵臓類上皮細胞由来の確立された不死化ヒト細胞株を生育する手法を利用して、インスリン産生に対するHIPおよび最適化されたHIPの影響のインビトロでの影響を評価した。この細胞株は、適切なシグナル伝達において他の膵臓細胞タイプに分化する能力を証明している。ゆえに、膵臓の天然に存在する前駆細胞に対する代理としてPANC−1細胞を用いた。
10%ウシ胎児血清を含むDMEM培地が入ったT75フラスコにPanc−1細胞を播種した。この細胞を37℃、5%CO2で24時間インキュベートし、次いで、167nMという最終濃度のHIPで処理した。この処理を1日に1回、4日間にわたって行った。第5日目に、細胞を破壊することにより、細胞溶解物を得た。これらの細胞抽出物において、総タンパク質レベルを測定し、50マイクログラムの総タンパク質を使用して、ウエスタンブロット解析を行った。50マイクログラムのタンパク質を含むサンプルを、5%の還元剤ベータ−メルカプトエタノールを含むか、または含まないローディング緩衝液に希釈し、ゲルの各ウェルに充填した。電気泳動およびニトロセルロース膜へのタンパク質の転写の後、1次抗体としてポリクローナルニワトリ抗インスリン抗体(ab14042,1/2000希釈)および2次抗体としてウサギポリクローナル−HRP結合体化抗ニワトリ(NITゲルの場合1/1000希釈およびPANC−1ゲルの場合1/2000)を使用することによって、インスリンの存在を検出した。
図9は、HIP及び最適化されたHIPとのインキュベーションに応答したPANC−1細胞からのヒトインスリンの発現を示しているウエスタンブロット解析である。Aと表示されている下のパネルは、サンプルを非還元条件において充填したときのPanc−1細胞におけるインスリンに対するバンドを示している。この結果は、HIP2、HIP2B、およびHIP2二量体型が、HIP2PEG化型またはコントロールよりも多くのインスリン産生を刺激することを示唆している。還元条件では、インスリン内の2本のポリペプチド鎖を接続しているジスルフィド結合が還元されるので、該鎖は分離し、この条件では、インスリン抗体は、インスリンと反応しない。非還元条件と対照的に、該インスリン分子は、完全であり、前記抗体によって認識される。
図9Bは、図9Aにおけるものと同じ膜に含まれている総タンパク質を示している。ポンソー染色を介する総タンパク質のレベルの測定は、様々なレーンが、同様の量のタンパク質を含んでいることを証明している。NIT−1およびPANC−1細胞における総タンパク質レベルを測定し、50マイクログラムの総タンパク質を使用して、ウエスタンブロット解析を行った。50マイクログラムのタンパク質を含むサンプルを、5%の還元剤ベータ−メルカプトエタノールを含むか、または含まないローディング緩衝液に希釈し、ゲルの各ウェルに充填した。
ポンソー染色は、インスリン発現の差が、様々なHIPおよび最適化されたHIPに対応し、ウェルに充填されたタンパク質の量に関係しないことを証明している。インスリンに対するシグナルを欠いていること(例えば、還元条件における膜)もまた、タンパク質を欠いていることに起因しない。
PANC−1細胞株の細胞形態に対するHIPおよび最適化されたHIPペプチドの作用。前記細胞を、HIPおよび最適化されたHIPペプチドで4日間処理した。第7日目に200倍の倍率で撮影された図10Aでは、コントロール条件と、組織学的に分化した細胞とともにHIPおよび最適化されたHIPSで処理された細胞との間に形態学的差異が、特に、HIP2B処理細胞において見られる。図10Bは、7日間にわたる細胞の形態の変化の経過を示しており、上段がコントロール、中段がHIP2、下段がHIP2Bである。写真は、第1、2、3、5、および7日目に200倍の倍率で撮影された。コントロール処理細胞は、いかなる変化も起こさないとみられたが、HIP2およびHIP2Bで処理された細胞は、最初の様相から著しく逸脱している。図10Cは、PANC−1細胞培養中にHIP2二量体およびHIP2PEGを処理したときの、形態学的変化の経過を示している。全体的に見て、コントロール処理細胞は、いかなる著しい視覚的変化も起こさなかったが、HIP2およびHIP2Bで処理された細胞は、それらの最初の様相から著しく逸脱している。
ヒト膵臓組織培養物におけるHIP2B活性。University of Pennsylvania Human Islet Labは、ヒト膵管細胞培養物におけるHIPおよび最適化されたHIPペプチドの影響を証明した。ヒト膵臓細胞の管画分を、コラーゲンマトリックスにおいて10日間培養し、次いで、HIP2Bで1日おきに処理した。管組織に対するマーカーであるCK19ならびに核およびインスリンを示すDAPI染色のために、細胞を二重抗体染色によって標識した。図11に示されるように、細胞は、他のインスリン陰性細胞においてインスリン発現を誘導する形態学的変化を起こした。
非肥満糖尿病モデルにおけるHIPおよび最適化されたHipペプチドの影響のパイロットデータ。
膵島の質量、面積および数の増加に関するSTZ処置マウスにおけるデータ(上記)と一致して、パイロットNODマウスモデルは、39日間のHIP処理の後のマウスにおいてC−ペプチドレベルによって判断される、膵島新生に関してより良好な有効性を提供する最適化されたHIPに対する潜在能力の予備的な証拠を証明した。
非肥満糖尿病(NOD)モデルを、1型自己免疫性糖尿病に対するモデルとして使用する。この形態の糖尿病は、膵臓およびインスリン産生に対する根源的な損傷が、自己免疫性の攻撃に起因するという点で、最も困難である。ゆえに、この形態の糖尿病において決定的な膵島新生を示すために、HIPと併用して免疫寛容剤を使用しなければならない。NODマウスの多くが、一過性に糖尿病になるだけで、緩解に入り得るのに対し、他は、重篤な糖尿病を発症するので、NODマウスモデルは、極めて難しいモデルである。このトランスジェニックマウスモデルにおける介入のタイミングは、決定するのが困難である。
免疫寛容剤である開発中のリソフィリン(LSF)を利用する予備的研究において、糖尿病になった3匹のNODマウスをプラセボ+LSF、HIP2+LSF、およびHIP2B+LSFにランダム化した。図12に示されるように、適切な時点にLSFを投与された群のうち、この研究全体を通してグルコースが徐々に増加していたLSF単独で処置されたNODマウスに対して、HIPで処置された2匹は、この研究中、着実に改善されたグルコースレベルで反応した。統計学的に有意な研究ではないが、これらのデータは、1型糖尿病に対して免疫寛容剤とHIPとの併用の研究に対して非常に有力な証拠を提供する。
HIP受容体に対するHIP2BおよびHIP2の影響。以下の研究セットは、HIP2Bが、HIPに対する細胞膜受容体との相互作用および受容体から核への輸送においてHIP2と同程度に有効であることを証明している。ヒト膵島形成促進性ペプチドに対する受容体を、安定なヒト膵臓細胞株において二重抗体法を用いて標識した。1次抗体は、ウサギポリクローナルであり、2次抗体は、Cy3蛍光色素で標識されたヤギ抗ウサギであった。
これらの細胞は、通常、無血清培地中で生育され、トリプシンで処理されると、不安定化し、発生的な変化を起こすのに適格性となる。HIPを含むおよび含まない無血清培地(serum free media:SFM)中、ならびにトリプシンを含む無血清培地(TSFM)中で細胞を培養した。これは、単に不安定化することが、発生的な変化を活性化しないことを示すためである。
安定な条件下においてHIPで処理するとき、変化は生じない。発生的に適格性の条件下においてHIPで処理すると、標識された受容体は、細胞膜によって被包され、分化に対するシグナルが受け取られる核膜に移動することによって、HIPの存在に反応する。
安定な条件下においてHIPで処理するとき、変化は生じない。発生的に適格性の条件下においてHIPで処理すると、標識された受容体は、細胞膜によって被包され、分化に対するシグナルが受け取られる核膜に移動することによって、HIPの存在に反応する。
図13は、トリプシンで処理され、無血清培地中でインキュベートされたPANC−1細胞が膵島細胞凝集物に分化することを証明している。HIP受容体は、ヒト膵臓細胞の分化中、アップレギュレートされ、HIP2およびHIP2Bと相互作用するとみられ、HIP受容体と相互作用する。HIP2および最適化されたHIP2Bは、細胞膜上のHIP受容体から、インスリンを産生する新しい膵島への膵臓前駆細胞の分化を刺激する細胞の核への輸送を刺激した。
図14は、48時間にわたる(A)TSFM単独および(B)150μM(最適化されたHIP2B)を含むTSFMにおける、Cy3で標識されたウサギ抗ヒトHIP受容体抗体を示している。HIPは、膜結合型の受容体タンパク質が細胞膜によって包み込まれて核膜に輸送されるように刺激する。
図15は、HIP受容体(EXTL3)に対する最適化されたHIP2Bの影響に関する反復された免疫蛍光解析を示している。上のパネルは、EXTL3のCy3蛍光免疫染色によって示されている(赤色)。下のパネルの像では、EXTL3のCy3免疫染色が、核を染色しているDAPI(青色)と重ね合わされている。細胞を、コントロールとして標準的な成長培地中で生育し、HIPの存在下または非存在下の無血清培地(serum free media:SFM)中で生育された細胞と比較した。黄色の矢印は、標準的な成長培地中で成長したEXTL3の表面での発現の例を示している。細胞の境界が、詳細に明らかにされ、原形質膜上でのEXTL3の表面での発現が示唆される。黄色の矢印は、細胞の境界を表しており、核は、青色で示されている。真ん中の像は、SFM中で成長した細胞である。EXTL3は、細胞質のCy3染色によって示されるように細胞質に局在化している。緑色の矢印は、核の位置の染色を欠いていることを示している。SFM中で成長した細胞の下段の像における緑色の矢印は、核にEXTL3が存在しないことを示唆する核の強い青色のDAPI染色を示している。SFMおよびHIP中で成長した細胞の上段の像において、青色矢印によって示されている核におけるEXTL3免疫染色の存在は、核へのEXTL3のトランスロケーションを示唆する。SFMおよびHIP中で成長した細胞の下段の像において、青色矢印は、核の位置を示している。下段の像では、EXTL3−Cy3染色と核のDAPI染色が重ね合わされており、これは、EXTL3の核の局在化の確証となる(青色矢印)。スケールバー=すべての像において20μm。
図16は、最適化されたHIP2Bが、PANC−1細胞において細胞膜から核へのHIP受容体(EXTL3)のトランスロケーションを増強することを示している。記載の時点において単離されたサイトゾルおよび核の画分中のHIP(EXTL3)レベルのウエスタンブロット解析。ウエスタンブロット解析は、HIPを含まないSFM中で培養した6時間後に、HIP受容体(EXTL3)のより高い核レベルが観察されたことを証明している。培養液にHIP2およびHIP2Bを加えることによって、EXTL3の核へのトランスロケーションが増強され、これは、30分後におけるこのタンパク質のより高い核レベルによって証明される。これらの比較は、HIPの存在下において細胞質の区画から核へのEXTL3のトランスロケーション時間が増加すること、およびEXTL3の核へのトランスロケーションが、HIPの両方の存在によって調節され得ることを証明する。ウエスタンブロットは、これらの細胞および時点を用いて、繰り返された結果である。
プラセボに対するHIP2、HIP2Bのランダム化プラセボ対照試験において、80(80)匹のマウスをSTZで処置することにより、糖尿病を誘導した。糖尿病の発症と一致する高血糖症のレベルに達するまで、マウスをモニターした。介入マウスに対するベースラインのグルコースレベルは、平均300+/−6mg/dLであり、HIP介入群とプラセボ群間にグルコースレベルの統計学的有意差はなかった(p=0.301)。
36日後、すべてのHIP処置マウスが、インスリンから離脱し、グルコースは、プラセボ群と比べて有意に低下の傾向を示す。ランダムに選択されたマウスを、膵臓に対する免疫組織化学のために研究の経過中に屠殺した。血清に対するC−ペプチド解析は、進行中である。介入の39日後、残りのマウスを、次の60日間にわたって毎日グルコースレベルおよび全般的な健康状態について試験することにする。
予備的な評価は、HIP処置が、プラセボと比べて38.7%の低下をもたらすこと(p<0.05)を証明している。さらに、HIP2BをもたらすHIP2の安定化は、インビボにおいて活性を低下させなかった。
図17に示されるように、HIP処置は、プラセボよりも116mg/dL低いグルコースレベルをもたらした(↓38.7%p<0.05)。すべてのHIP処置マウスが、インスリンから離脱した。HIP処置マウスの56%(9/16)が、<230mg/dLのグルコースレベルを有した。プラセボ処置マウスの9%(1/11)が、<230mg/dLのグルコースレベルを有した。HIP2Bは、37度の血清中のインビトロにおいて有意に安定である。HIP2Bは、食塩水中でも長い半減期を有する。HIP2Bを形成するHIP2に対する改変は、インビボにおいて活性を低下させなかった。
HIP2Bの治療上の潜在能力を評価するために、STZ誘導糖尿病マウスモデルを利用した。糖尿病にするために、連続した5日間にわたって60匹のC57BL/6Jマウスに、クエン酸緩衝液,pH4.5中のSTZを50mg/kgで腹腔内注射した。血糖値が連続した2日間にわたって≧200mg/dlとなったとき、マウスを研究にランダム化した。尾の先端に入れた切り目から採取された1滴の血液を用いて、血糖を毎日モニターした。グルコースメーターを用いて、グルコース測定値を決定した。任意の動物における血糖値が≧324mg/dLに上昇した場合、血糖が324mg/dL未満に低下するまで、該動物をインスリンで処置した(1単位/日、グラルギンインスリン、筋肉内)。インスリン投薬の記録をつけたので、インスリン必要量の比較を行うことができた。さらに3匹の動物は、STZで処置せず、非糖尿病のベースライン値を立証するために用いた。
表4に示されるように動物を3つの群に割り当てた。糖尿病動物に、連続した39日間にわたって1日2回(午前および午後)、ビヒクルコントロール、HIP2(300μg)、またはHIP2B(300μg)を腹腔内注射した。各治療群(群1〜3)のマウスを第39日目に屠殺した。屠殺する前の晩に、すべてのマウスを絶食させ、朝のグルコースレベルを屠殺の前に測定し、それを空腹時グルコースレベルとみなした。第40〜60日目は、医学的介入なしに残りの動物群を維持した。毎朝、それらの動物のグルコースを測定し、適切なときにインスリン投与した。研究のエンドポイントは、以下:1)血糖の変化および2)インスリン必要量の変化を含んだ。
この研究の間、HIP2群とHIP2B群の両方の血糖値が、コントロール群から有意に低下した。しかしながら、2つのHIP群間に血糖値の差はなかった。図17は、第36日目まで、HIP2Bを形成するHIP2に対する改変がインビボにおいて活性を低下させなかったことを証明している。HIP処置は、プラセボより116mg/dL低いグルコースレベルをもたらした(↓38.7%p<0.05)。すべてのHIP処置マウスが、インスリンから離脱した。HIP処置マウスの56(56)%(9/16)が、<230mg/dLのグルコースレベルを有した。プラセボ処置マウスの9(9)%(1/11)が、<230mg/dLのグルコースレベルを有した。
図17は、HIP2、HIP2B、およびプラセボを投与した後のSTZ−糖尿病マウスモデルにおける毎日の平均グルコースレベルを表しているグラフである。平均ベースライングルコースレベルは、300mg/dL±2mg/dLであり、プラセボ群とHIP処置群間に有意差はなかった(p=0.301)。
図18は、HIP2B処置群(緑色)およびコントロール群(紫色)およびプラセボ群のマウスの毎日のグルコースレベルを表しているグラフである。各群の直線の傾き(図18)は、グルコースレベルの変化の速度を表しており、これを本発明者らは「再生速度」と呼ぶ。HIP2B処置は、第1〜39日目の研究の間、+0.381というグルコースの増加速度を有したプラセボ処置群内のレベルにおけるグルコースの増加速度と比べて、−0.602というグルコースレベルの低下速度(再生速度)をもたらした。
図19は、HIP2B、HIP2、およびプラセボを比較する研究の第1日目と第38日目間のグルコースの差を示している。図19は、介入の開始時および終了時における、最適化されたHIP2Bレシピエント(黄色)、HIP2(緑色)、およびコントロール(青色)処置群のマウスにおける改善されたグルコースコントロールを証明している。コントロール群は、ベースラインから334.6mg/dLに28.9mg/dLだけ平均増加を有した。HIP2B群およびHIP2群は、HIP2B群において235.3mg/dLという平均非空腹時グルコース(コントロールに対してp=0.024)、HIP2群において231.6mg/dL(コントロールに対してp=0.029)というベースラインからの有意な低下を有した。
図20は、処置群間の研究終了時における空腹時グルコースレベルを示している。最適化されたHIP2B処置群は、研究の終了時に、258.00±84.5mg/dLという平均空腹時グルコースを有したプラセボ処置コントロールと比べて、106.7mg/dL±0.58mg/dL(p=0.046)という空腹時グルコースを有した。ブロックされていないHIP2処置マウスは、プラセボ処置群と比べて、115.3mg/dL±16.5mg/dL(p=0.050)という平均空腹時グルコースを有した。
図21は、処置の過程の後かつ屠殺の前の動物において行われた耐糖能試験の結果を示している。最適化されたHIP2Bは、37度の血清中のインビトロにおいて有意に安定である。最適化されたHIP2Bは、食塩水中でも長い半減期を有する。HIP2Bを形成するHIP2に対する改変は、インビボにおいて活性を低下させなかった。
HIP2Bの治療上の潜在能力および血糖コントロールを有意に改善するのに必要なHIP2Bの最低有効用量を評価するために、STZ誘導糖尿病マウスモデルを利用した用量反応研究を行った。
図22は、最大の有効性をもたらす最小の可能投薬量を決定するために、マウスの糖尿病モデルにおいて様々な投薬量で送達されたときの、グルコースコントロールに対する最適化されたHIP2Bの作用を評価および比較するために行われたHIP2Bの用量反応解析の結果を示している。本研究は、STZ処置マウスモデルにおける、血糖コントロールおよび糖尿病の減弱に対する5つの濃度のHIP2Bの影響を決定するためのランダム化された試験だった。処置群は、100μlの等張性食塩水中、最大1000マイクログラムのBIDから、0.1マイクログラムのBIDの範囲の最適化されたHIP2Bだった。6つの研究群を下記に列挙する。
マウスにおける摂食パターンとは無関係に、マウスのグルコースレベルをおよそ0900〜1100に毎日確認した。毎日のグルコース測定時間における潜在的なグルコースの変動が理由で、5日間の移動平均グルコース値を各処置群において毎日計算した。HIP2B濃度の影響を1)平均グルコースレベルおよび2)コントロール群と比べて介入群間の、血糖可動域によって判定される様々な濃度のHIP2Bがグルコース毒性の発生を減弱する程度によって評価した。
図22は、STZ処置マウスにおいて行われた用量反応研究を示しており、10、100、および1000マイクログラムのBIDで処置された糖尿病マウス間の有効性が、等しいことを確認している。1mg/kg未満の投薬(0.1および0.01mg/kg用量レベルに対応する)では、マウスにおける有効性シグナルが低下した。
最適化されたHIP2Bは、糖尿病を処置するためのインスリンなどの従来の治療と多くの方法において異なるものである。HIP2Bは、膵島新生をもたらすシグナル伝達カスケードを開始する。反応の有効性がその即時のグルコース低下能力によって主に測定されるインスリンとは対照的に、任意の膵島新生剤の薬力学的反応は、数日および数週間にわたって測定される。したがって、HIP2BおよびINGAPなどの膵島新生剤の有効性は、繰り返される毎日の投薬後の長期間にわたる血糖コントロールの回復によって評価され得るだけではなく、高血糖症の減弱および/または正常血糖が達成される速度によっても評価され得る。すべてのHIP処置群が、正常血糖に近づいた。
用量減弱反応(dose attenuation response)は、糖尿病が減弱される最大の程度と等しい最大の達成可能な反応に伴う平均グルコース変化として計算された。この評価において、本発明者らは、コントロール群の血糖可動域の差と比べて、研究全体を通じての各処置群における最大の血糖可動域の差によって計算される単位用量あたりの反応の変化を報告する。コントロール群は、疾患の減弱が見られず、100%の疾患誘導に達した。HIP2B用量がこの作用を減弱させた程度は、プラセボ群に対する各処置群における疾患の%減弱として記載される。
図23は、様々な濃度のHIP2Bの、糖尿病の減弱に対する影響を示している。3つの最も高い処置レベルの各々は、同程度に糖尿病の重症度を減じた。HIPの最も低い2つの処置投薬量(0.1および1マイクログラム/日BID送達)は、それらより多い3つの投薬量と同じ最適な反応を示さなかった。
0.1および1マイクログラムBIDの投薬量レベルにおいて、HIP2B反応は、プラセボに対して疾患の減弱を示した。HIP2B濃度を10マイクログラムBIDに上昇させると、最も高い有効性および糖尿病の減弱がもたらされた。1000、100、および10マイクログラムBIDという用量レベルでは、糖尿病は、プラセボ群に見られる最大疾患状態の60〜70%に減弱した。これらの結果から、本発明者らは、最適な有効性をもたらすHIP2Bの最低用量レベルが、マウスでは1〜10マイクログラムBIDの範囲であるか、またはヒトでは0.5〜1.0mg/kgというヒトでの等価な用量(30〜60mgBID)であると結論づける。この用量は、第2B相INGAP治験において使用された投薬量(600mg/日)の約1/10である。
最適化されたHIP2B構造によって達成されたバイオアベイラビリティの改善を確かめるために薬物動態学的研究に着手した。HIP2(図24)、最適化されたHIP2B、およびINGAPの静脈内および皮下への用量の投与後のSprague Dawleyラットにおいて、絶対的バイオアベイラビリティおよび薬力学的研究を行った。目的は、2つの異なる投与経路の後の雄ラットにおいて、HIP2、最適化されたHIP2B、およびINGAPの吸収、絶対的バイオアベイラビリティ、および血漿レベルを測定することだった。
5匹の雄Sprague Dawleyラットの6群に、下記の表におけるように、HIP2、HIP2B、またはINGAPを静脈内経路および皮下経路によって投与した。
10個の連続した血漿サンプル(各0.03ml)を、投薬の5、10、15、30分、45分、続いて、1、2、3、8、および24時間後に、1群あたり5匹の動物から頚静脈カテーテルから回収した。血漿を、EDTAを含むチューブに回収した。回収後、サンプルを冷パック上で冷却して維持した後、遠心分離し、−70℃以下で保存するために、予めラベルを付けておいたマイクロチューブに移した。
各200μlのラット血漿サンプルを、1mlのアセトニトリル(0.07%トリフルオロ酢酸,TFA)が入った微小遠心管に加え、ボルテックスミキサーを用いて1分間撹拌した後、遠心分離することにより、沈殿した血漿タンパク質を除去した。上清溶液を取り出し、Speed Vacを用いて乾燥するまで蒸発させた。その乾燥したペレットが入っている微小遠心管に、200μlの20:80アセトニトリル:水(0.07%TFAを含む)を加えた。そのサンプルを遠心することにより、任意の不溶性物質を除去し、上清溶液をLC/MSMS解析のための分析用バイアルに移した。質量分析計を較正して、HIP2B(M=286.0)、HIP2(M=287.1)、およびINGAP(M=212.2、356.1、373.9)のそれぞれの参照サンプルの各々に対して観察される最も豊富な娘イオンを検出した。最適化されたHIP2B、HIP2、およびINGAP血漿サンプルを、緩衝液AとしてH2O中の0.07%TFAおよび緩衝液Bとしてアセトニトリル中の0.07%TFAを用いるC−18逆相カラム(50mm×2.0mm,Varian Pursuit XRS3)において解析した。9分間にわたる98%A/2%Bから100%Bに達する線形勾配を0.4ml/分という流速で用いた。
以下の血漿コントロールを、上に記載したように処理し、標準的な濃度曲線を確立するために用いた:
1.バックグラウンドコントロールとしてブランク血漿
2.6.7×104、6.7×103、6.7×102、67および6.7ng/mlのHIP2B、HIP2、およびINGAPを含む5つの標準的な血漿サンプル。
1.バックグラウンドコントロールとしてブランク血漿
2.6.7×104、6.7×103、6.7×102、67および6.7ng/mlのHIP2B、HIP2、およびINGAPを含む5つの標準的な血漿サンプル。
最適化されたHIP2B、HIP2、およびINGAPの保持されていた投薬サンプルもまた、注射時点の各々の濃度を決定するためにLC/MSMSによって解析した。解析によって、2mg/mlであるという実験誤差内の濃度が確認された。すべての動物が、投薬後のすべての時点において、および各経路の投与後において正常であると見られた。HIP2およびINGAP:HIP2の静脈内投与または皮下投与の後、投薬の5分後のみ非常に低レベルのHIP2が観察され、その後のすべてのサンプルは、定量限界未満だった。INGAPの静脈内投与または皮下投与の後、測定されたすべての血漿サンプルが、定量下限未満だった。結果として、静脈内投与および皮下投与の後のHIP2およびINGAPに対する血漿の薬物動態学的パラメータを計算することができなかった。
HIP2Bの静脈内投与後、HIP2B血漿濃度は、一相性の様式で低下し、平均消失相(mean terminal phase)血漿半減期は、0.19時間(11分)だった。平均Cmaxは、最初のサンプリング時間である5分において生じた8237ng/mlだった。平均C0は、18805ng/mlであると推定された。平均AUC0−∞は、2231ng*hr/mlだった。見かけの平均血漿クリアランスは、1.9l/時/kgであり、見かけの平均分布容積は、0.48l/kgだった。
最適化されたHIP2Bの皮下投与の後、吸収されたHIP2Bは、一相性の様式で低下し、平均消失相血漿半減期は、0.34時間(20分)だった。平均AUC0−∞は、1932ng*時/mlだった。見かけの平均Cl/Fは、2.1l/時/kgであり、見かけの平均V2/Fは、1l/kgだった。HIP2Bの絶対的皮下バイオアベイラビリティは、87%だった。図25は、最適化されたHIP2Bの皮下投与の薬物動態である最適化されたHIP2B血漿レベルが、2時間まで検出可能であり、t1/2,eが、約20分であったことを示している。
INGAPの血漿濃度は、いずれの時点においても検出不可能だったことから、INGAPが、迅速にクリアランスおよび/または代謝されることが示唆される。最適化されたHIP2Bの血漿レベルは、皮下投与後、HIP2またはINGAPよりも有意に高い。観察されたマルチピークのLC/MSクロマトグラフィ血漿プロファイルに基づくと、最適化されたHIP2Bは、インビボにおいてHIP2およびINGAPよりも迅速に代謝される可能性は非常に低い。HIP2Bのバイオアベイラビリティは、87%である。
図24は、PK解析の一部としての、ラット血漿から得られた最適化されたHIP2B、HIP2、およびINGAPサンプルのLC/MSMS解析を示しており、ここで、HIP2B、HIP2、およびINGAPは、皮下にまたは静脈内注射を介して4mg/kgで投与された。
皮下投与の後、HIP2Bレベルは、1.5時間まで検出可能だった。T1/2は、約0.5時間である。非常に低レベルのHIP2が、5分後に検出され、5分後の後は、検出されなかった。観察されたマルチピークのLC/MSクロマトグラフィプロファイルに基づくと、最適化されたHIP2Bは、インビボにおいてHIP2よりも迅速に代謝されない。
本発明者らは、最適化されたHIP2Bの血漿レベルが、皮下投与後にHIP2またはINGAPよりも有意に高いと結論づける。HIP2B血漿レベルは、IV投与後に、HIPまたはINGAPよりも有意に高い。静脈内注射の後、最適化されたHIP2Bは、45分まで、検出不可能な濃度での時間依存的枯渇を示す。T1/2は、約9分である。HIP2は、5分後の時点でのみ観察され、INGAPは、いずれの時点においても検出不可能だったことから、両方が、迅速にクリアランスおよびまたは代謝されると示唆される。
本発明のある特定の好ましい実施形態を参照して、かなり詳細に本発明を説明してきたが、他の変形例もありうる。ゆえに、添付の請求項の精神および範囲は、本明細書内に含まれる説明および好ましい変形例に限定されるべきでない。
Claims (12)
- 最適化された膵島形成促進性ペプチド(proislet peptide)。
- 医薬賦形剤および最適化された膵島形成促進性ペプチドを含む医薬組成物。
- 請求項2記載の医薬組成物において、前記ヒト膵島ペプチドアナログは治療有効量で存在するものである、医薬組成物。
- 請求項3記載の医薬組成物において、前記治療有効量は約60〜約180mg/日である。医薬組成物。
- 損なわれた膵機能に関連する病状を治療する方法であって、
最適化された膵島形成促進性ペプチドを投与する工程
を有する方法。 - 請求項5記載の方法において、前記最適化された膵島形成促進性ペプチドは治療有効量で投与されるものである、方法。
- 請求項5記載の方法において、前記治療有効量は約1〜約3mg/日である、方法。
- 請求項5記載の方法において、損なわれた膵機能に関連する前記病状は、1型糖尿病、初発1型糖尿病、2型糖尿病、成人潜伏性自己免疫性糖尿病、前糖尿病、空腹時血糖異常、耐糖能障害、インスリン抵抗性症候群、代謝症候群/代謝異常症候群、過体重、肥満症、高脂血症、高トリグリセリド血症、摂食障害、無***性周期、および多嚢胞性卵巣症候群から選択されるものである、方法。
- 請求項5記載の方法において、この方法は、さらに、
膵島細胞再生剤を投与する工程を有するものである、方法。 - 請求項9記載の方法において、前記膵島細胞再生剤は、ヒト膵島形成促進性ペプチド、ヒト膵島形成促進性ペプチドアナログ、アミリン、プラムリンチド、エキセンディン−4、GIP、GLP−1、GLP−1受容体アゴニスト、GLP−1アナログ、ハムスターINGAPペプチド、リラグルチド、およびジペプチジルペプチダーゼ阻害剤から選択されるものである、方法。
- 請求項5記載の方法において、この方法は、さらに、
膵内分泌細胞を標的とする自己免疫細胞を阻害するか、阻止するか、または破壊する薬剤を投与する工程を有するものである、方法。 - 請求項11記載の方法において、膵島細胞を標的とする自己免疫細胞を阻害するか、阻止するか、または破壊する前記薬剤は、以下の薬剤:hOKT3γ1(Ala−Ala)(テプリズマブ)を含む抗CD−3抗体;免疫応答を標的にし、特に、1型糖尿病におけるベータ細胞の死を引き起こすT−リンパ球を阻止するChAglyCD3;細胞傷害性T−リンパ球抗原4であるCLTA−4Ig(アバタセプト);単独またはタクロリムス(FK506)若しくはIL−2(ラパミューン)のいずれかとの併用でのシロリムス(ラパマイシン);単独またはプロロイキン(アルデスロイキン)との併用でのラパミューン;熱ショックタンパク質60(Diapep277);抗グルタミン酸デカルボキシラーゼ65(GAD65)ワクチン;リソフィリン、IBC−VSO、ワクチン、インターフェロン−アルファ、CD4+CD25+抗原特異的制御性T細胞ワクチン;糖尿病抑制性樹状細胞ワクチン、GSK189075、ジアゾキシド、およびベータ細胞の機能を保存する薬剤として利用されるアトルバスタチンを含むスタチン薬、単独またはダクリズマブとの併用でのミコフェノール酸モフェチル;抗CD20薬剤であるリツキシマブ;キャンパス−1H(抗CD52抗体)、リソフィリン;ポリクローナル抗T−リンパ球グロブリン(ATG/サイモグロブリン)、顆粒球コロニー刺激因子、ニューラスタ(ペグフィルグラスチム)、ビタミンD、25ヒドロキシと1,25ヒドロキシビタミンDの両方の補給;膵ベータ細胞の破壊を妨げるように設計された代謝的に不活性型の合成インスリンであるIBC−VSOワクチン;インターフェロン−アルファ;CD4+CD25+抗原特異的制御性T細胞、またはランゲルハンス島内のベータ細胞に対する免疫攻撃を抑制するように設計された任意の薬剤を用いるワクチン、プロキマル(ヒト成体幹細胞)、抗炎症性アナキンラ、および抗炎症剤、デオキシスペルグアリン、炎症促進性サイトカインの産生を阻止し、且つT細胞およびB細胞を阻害する抗炎症剤、のうちの1若しくはそれ以上から選択されるものである、方法。
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