CN102827277B - 抗人血清白蛋白单链抗体及其碳端连接多肽药物的方法 - Google Patents

抗人血清白蛋白单链抗体及其碳端连接多肽药物的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种抗人血清白蛋白单链抗体及其碳端连接多肽药物的方法，单链抗体的VH链区域具有如C-SEQ-05、C-SEQ-06、C-SEQ-07所示的互补识别区的CDR氨基酸序列；所述的单链抗体的VL链区域具有如C-SEQ-08、C-SEQ-09、C-SEQ-010所示的互补识别区的CDR氨基酸序列；单链抗体与多肽类药物的氨基酸序列使用如C-SEQ-01所示或C-SEQ-03所示的蛋白连接铰链从单链抗体的氮端连接；本发明中的单链抗体具有分子量小，抗体特异性强，免疫源性弱，水溶性好，易于通过发酵方式大规模生产，并且公开了一种使用本发明中的单链抗体制造的组合物，该药物可有效延长多肽类生物药物的半衰期。

Description

抗人血清白蛋白单链抗体及其碳端连接多肽药物的方法
技术领域
本发明涉及一种单链抗体，特别是涉及一种抗人血清白蛋白单链抗体及其碳端连接多肽药物的方法。 
背景技术
目前，以多肽为主的生物药物在世界范围内呈现出迅速推广的态势。 
多肽类生物药物药效显著，并能够治疗许多化合物类药品无法见效的遗传类疾病。但是，多肽类生物药物在使用中的最大问题之一是此类药物在人体内的衰减周期一般较短，致使用药频率相对较高。给病人带来较大的治疗成本和用药痛苦。因此，延长多肽类生物药物的半衰期就成为生物制药学领域亟待解决的课题。 
目前用于延长多肽类生物药物半衰期的方法主要有包括构建突变体、PEG修饰以及与大分子蛋白融合等。这些方法都能有效地延长多肽类生物药物的半衰期，但是也存在一些问题。通过突变体的构建通常可以降低多肽对水解酶的敏感性，有效地延长多肽类生物药物的半衰期，但是很多半衰期较长的突变体会改变药物的活性，要获得一个即能够满足半衰期要求，同时又不改变药物活性的突变体十分困难。因此，该技术不适宜在蛋白药物领域广泛推广应用，PEG化修饰可以在提高蛋白药物的稳定性的同时降低其免疫原性，但是有影响多肽类生物药物的生物活性的潜在可能，同时，对经过PEG化处理的多肽类生物药物进行纯化较为困难，增加了生产过程中的难度和生产成本。通过与具有较长半衰期的人体蛋白直接融合是一种切实可行的延长药物半衰期的有效方法，但是这种融合方式大大增加了多肽类生物药物的分子量，给生产和纯化带来了很多问题，分子量的增加也会改变药物的某些药代动力学特性，可能使其难以达到靶点所在位置，进而影响药效。 
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供一种可以有效延长半衰期的单链抗体以及使用该单链抗体组合形成的药物组合物。 
本发明的目的之一是提供一种特异性抗人血清白蛋白(HSA)单链抗体。 
本发明的目的之二是提供一种含有所述的特异性抗人血清白蛋白(HSA)单链抗体与多肽类药物形成药物组合物的方法，以及利用这种方法延长药物半衰期的方法。 
在本发明的第一个目的中提供了一种单链抗体的VH链区域，它的互补决定区CDR具有选自下组CDR的氨基酸序列： 
CDR1: C-SEQ-05
CDR2: C-SEQ-06
CDR3: C-SEQ-07
所述的单链抗体VH链区域以C-SEQ-02所示的氨基酸序列为一个较佳的序列。
在本发明的第一个目的中，本发明还提供了一种单链抗体的VL链区域，它的互补决定区CDR具有选自下组CDR的氨基酸序列： 
CDR1: C-SEQ-08
CDR2: C-SEQ-09
CDR3: C-SEQ-010
所述的单链抗体VL链区域以C-SEQ-04所示的氨基酸序列为一个较佳的序列。
在本发明的第一个目的中，本发明还提供了一种单链抗体。其VL链区域具有如权利要求1所指明的互补识别区；其VL链区域具有如权利要求3所指明的互补识别区；其VH链以C-SEQ-02所示的氨基酸序列为一个较佳的序列。其VH链以C-SEQ-04所示的氨基酸序列为一个较佳的序列。其VH链区域和VL链区域使用如C-SEQ-01所示或C-SEQ-03所示的蛋白连接铰链连接。 
在本发明的第二个目的中提供了一种单链抗体与多肽药物连接形成组合物的连接方法。它使用如C-SEQ-01所示或如C-SEQ-03所示的蛋白连接铰链从单链抗体的碳端与多肽类药物连接。 
在本发明的第二个目的中，本发明还提供了一种通过上述单链抗体有效延长生物药物半衰期的方法。它采用本发明所述的单链抗体的碳端和药物形成组合物。它含有上述与单链抗体的氨基酸序列和任意一种多肽类药物的序列。 
与现有技术相比本发明的有益效果为：本发明中的单链抗体它具有分子量小，抗体特异性强，免疫源性弱，水溶性好，易于通过发酵方式大规模生产，产物均一性强等特点，单链抗体非常适合与多肽类生物药物融合，通过菌类发酵整体表达过程大批量生产，人血清白蛋白分子量为150Kda，在人体中的半衰期长达19天，借助其与人源化抗人血清白蛋白单链抗体片段所形成的组合物，可有效延长多肽类生物药物的半衰期，同时，由于单链抗体分子量很小，融合表达后的抗体-多肽类生物药物组合体本身的分子量依然可保持在小于20Kda较低水平。避免了潜在的免疫源性，也降低了生产过程中的难度和生产成本。 
附图说明
图1是电泳检测结果示意图； 
图2是进行体外细胞加药测试结果示意图；
图3是人源化抗人血清白蛋白单链抗体与药物结合物在小鼠体内测试结果示意图。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。 
实施例一，获得本发明中的单链抗体： 
1、构建人源抗体库
从人源化单链抗体库中筛选对人血清白蛋白具有特异性识别能力的抗体可变区序列，人源抗体库是通过采集外周淋巴细胞中合成的免疫球蛋白重链与轻链的诸多基因片段，用聚合酶链反应的方法扩增，并剪接至噬菌体载体中，用引物举例如下，一个用于寻找轻链CDR的引物例子：正向引物【5'-GATATCCAACTTACCCAATCC-3'】 逆向引物【5'-CCTCTTTATTTCTACCTTGG-3'】，一个寻找重链CDR的引物例子：正向引物【5'-GAAGTCCAGCTGCTCG-3'】，逆向引物【5'-CGAAGAGACTGTGACTAGCGT-3'】。
抗体分子片段被噬菌体表达并展示于噬菌体表面，利用人血清白蛋白(HSA)为抗原对显露于噬菌体表面的抗体进行筛选，得到特异性最佳的抗体。 
2、抗体筛选 
将冻存于-86℃细胞株悬液500μL加入19.5mL的LB培养液中，在37℃温度，250rpm频率，0.5L烧瓶条件下温育16小时，用离心机以12000rpm的转速将温育后的细胞悬液离心，弃去离心后的上清液，将离心沉淀物重悬于LB培养液中，达到1011/mL以上的滴度，作为悬液A，将纯化的人血清白蛋白(HSA)包被在50mL聚氧乙烯细胞培养瓶中，将悬液A加入上述细胞培养瓶中，形成109/mL噬菌体颗粒浓度，在37℃温度下温育1小时，弃去细胞培养瓶中的培养液，使用溶有0.5%浓度Tween-20的PBS洗涤细胞培养瓶壁5次，在培养瓶中加入2.0mL的103/mL的EColi细胞，在37℃温度，250rmp频率，条件下温育16小时，将整个过程循环重复5次。
将经过上述筛选获得的细胞以105/mL浓度均匀涂布在含有0.1%卡那霉素的琼脂平板上培养，取平板上的单一细胞株1056株转移至11个96孔板上继续培养，每孔1株，在37℃温度，250rmp频率，条件下温育16小时，温育结束后，在板式离心机中以5000rmp的速度离心30分钟，取上清保藏。 
取上述上清5μL，加入用20μg/mL浓度的人血清白蛋白溶液温育包被的96孔板，在37℃温度下温育1小时，用溶有0.5%浓度Tween-20的PBS洗涤微孔板5次，加入辣根酶标记的兔抗人抗体，在37℃温度下温育1小时，再用溶有0.5%浓度Tween-20的PBS洗涤微孔板5次。加入200μL的DAB显色剂和1μL的过氧化氢，在37℃温度下温育20分钟后读取560nm波长吸光光度，选取吸光光度最强的数个样本孔所对应的抗体可变区克隆为下一步制作重组ScFv单链抗体的样本。 
3、亲和力测试 
在抗体筛选过程中得到294抗原-抗体反应呈阳性的克隆，利用重组人单链抗体纯化***ProteinL亲和色谱分离纯化重组的单链抗体，将纯化后的单链抗体进行亲和力测试，亲和力测试采用常用的Scatchard亲和力分析法，得到亲和力最强的3个克隆： 9.12×10-7M；3.09×10-6M和9.70×10-6M，选择此3个亲和力最强的接种在100mL的LB培养液中，在37℃温度、250rmp频率的条件下温育10小时，再利用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG）诱导培养10小时，选取其中表达量最高的一株，命名为10D7进行编码序列的分析和表达载体的架设。
实施例二，单链抗体的编码序列的分析，重组和表达载体的架设： 
将实施例1中产生的10D7株在LB培养液中增殖，然后利用DNA提取试剂盒将细胞株中的质粒纯化，通过限制性内切酶剪切和2%的琼脂凝胶电泳纯化分离，获得重链可变区编码序列，同法获得轻链可变区编码序列，用人源抗体可变区通用引物进行聚合酶链反应扩增，然后将获得的扩增产物送至Eurofin公司进行测序，测序得到的DNA序列和蛋白序列的结果显示在表2.1和表2.2中，其中表2.1所列出的序列为人源化抗人血清白蛋白单链抗体的轻链区域(C-SEQ-04)，及其可变区序列(C-SEQ-08，C-SEQ-09和C-SEQ-010)，表2.2所列出序列为人源化抗人血清白蛋白单链抗体的重链区域(C-SEQ-03)，及其可变区序列(C-SEQ-05，C-SEQ-06和C-SEQ-07)。
表2.1 ：轻链序列(VL)的一个较佳实例，即C-SEQ-04 。(包括C-SEQ-08，C-SEQ-09和C-SEQ-010) 
GAT ATC CAA CTT ACC CAA TCC CCA AGT AGC
D I Q L T Q S P S S
[FR1       5         10
CTT TCG GCC TCG GTT GGA GAC CGC GTC ACG
L S A S V G D R V T
        15         20
ATT ACA TGT CGT GCC TCA CAG TAT ATC GGG
I T C R A S Q Y I G
    FR1] [No.8] 25         30
CGA TAC CTA AGG TGG TAC CAA CAG AAG CCG
R Y L R W Y Q Q K P
      [No.8] [FR2         40
GGC AAA GCT CCT AGG CTC CTA ATC TAC GAT
G K A P R L L I Y D
        45       FR2] [No.9]
TCG TCA GTG CTG CAA AGT GGT ATA CCC AGT
S S V L Q S G I P S
        55 [No.9] [FR3     60
AGG TTC AGT GGC TCG GGT TCG GGT ACT GAC
R F S G S G S G T D
        65         70
TTC ACC CTA ACC ATT TCA TCC CTC CAA CCC
F T L T I S S L Q P
        75         80
GAA GAC TTC GCA ACG TAC TAC TGC CAG CAA
E D F A T Y Y C Q Q
        85     FR3] [No10] 90
AAG TAT CTA CCC CCG TAC ACC TTT GGC CAG
K Y L P P Y T F G Q
        95   [No10]     100
GGT ACC AAG GTA GAA ATA AAG AGG    
G T K V E I K R    
        105     108    
                   
表2.2 ：重链序列表 (VH)的一个较佳实例，即C-SEQ-02 。(包括C-SEQ-05，C-SEQ-06和C-SEQ-07)
 
GAA GTC CAG CTG CTC GAA TCA GGT GGC GGC
E V Q L L E S G G G
[FR1       5         10
CTG GTG CAA CCT GGA GGG TCG CTC AGA CTT
L V Q P G G S L R L
        15         20
TCG TGT GCC GCC TCA GGT TTC ACC TTT TGG
S C A A S G F T F W
        25         FR1]
GCC TAT CCC ATG TCC TGG GTA AGG CAA GCC
A Y P M S W V R Q A
[No.5]       [No.5] [FR2       40
CCT GGT TGG GGG CTA GAA TGG GTC TCC ACC
P G K G L E W V S T
        45       FR2] [No.6]
ATC TCCCCA TTC GGC TCC ACA ACA TAC TAT GCC
I SP F G S T T Y Y A
        55         60
GAC TCG GTG AAG GGA CGC TTC ACC ATA TCA
D S V K G R F T I S
        [No.6] [FR3       70
CGA GAC AAC TCC AAA AAT ACA CTA TAC CTC
R D N S K N T L Y L
        75         80
CAA ATGAAC TCCCTT CGAGCC GAA GAT ACT GCT GTG TAT
Q MN SL RA E D T A V Y
        85         90
TAT TGT GCC AAA GTC AGA TCAATG CGCCCT TATAAG TTT
Y C A K V R SM RP YK F
      FR3] [No.7]         100
GAT TAC TGG GGT CAA GGC ACG CTA GTC ACA
D Y W G Q G T L V T
  [No.7]     105         110
GTC TCT TCG              
V S S              
    113              
实施例三，单链抗体轻、重链序列的链接以及与治疗二型糖尿病的多肽类生物药物exendin-4连接制成药物组合：
已经确定序列的抗体轻链区域与重链区域DNA通过直接合成或者重组PCR的方法实现链接，其铰链部分为单链抗体的VH链区域具有SEQ ID No.2所对应的DNA序列，所用的重组PCR的操作方法为本领域所通用的常规方法，对委托Invitrogen公司合成的序列进行测序，与我们通过重组PCR的方法完成的抗体轻、重链的链接序列的测序结果完全相同，测序结果如表3.1所示：
3.1：测序获得的人源化抗人血清白蛋白单链抗体的一个较佳序列的DNA序列
GAT ATC CAA CTT ACC CAA TCC CCA AGT AGC
[VL]       5         10
CTT TCG GCC TCG GTT GGA GAC CGC GTC ACG
        15         20
ATT ACA TGT CGT GCC TCA CAG TAT ATC GGG
      [No.8] 25         30
CGA TAC CTA AGG TGG TAC CAA CAG AAG CCG
      [No.8]           40
GGC AAA GCT CCT AGG CTC CTA ATC TAC GAT
        45         [No.9]
TCG TCA GTG CTG CAA AGT GGT ATA CCC AGT
        55 [No.9]       60
AGG TTC AGT GGC TCG GGT TCG GGT ACT GAC
        65         70
TTC ACC CTA ACC ATT TCA TCC CTC CAA CCC
        75         80
GAA GAC TTC GCA ACG TAC TAC TGC CAG CAA
        85       [No10] 90
AAG TAT CTA CCC CCG TAC ACC TTT GGC CAG
        95   [No10]     100
GGT ACC AAG GTA GAA ATA AAG AGG GGT GGA
        105     [VL] [No.2] 110
GGT GGA TCG GGT GGA GGT GGA TCG GGT GGA
        115         120
GGT GGA TCG GAA GTC CAG CTG CTC GAA TCA
    [No.2] [VH] 125         130
GGT GGC GGC CTG GTG CAA CCT GGA GGG TCG
        135         140
CTC AGA CTT TCG TGT GCC GCC TCA GGT TTC
        145         150
ACC TTT TGG GCC TAT CCC ATG TCC TGG GAT
      [No.5] 155     [No.5]   160
AGG CAA GCC CCT GGT TGG GGG CTA GAA TGG
        165         170
GTC TCC ACC ATC TCCCCA TTC GGC TCC ACA ACA
    [No.6]   175         180
TAC TAT GCC GAC TCG GTG AAG GGA CGC TTC
        185     [No.6]   190
ACC ATA TCA CGA GAC AAC TCC AAA AAT ACA
        195         200
CTA TAC CTC CAA ATGAAC TCCCTT CGAGCC GAA GAT ACT
        205         210
GCT GTG TAT TAT TGT GCC AAA GTC AGA TCAATG
        215     [No.7]   220
CGCCCT TATAAG TTT GAT TAC TGG GGT CAA GGC ACG
        225         230
CTA GTC ACA GTC TCT TCG        
        [No.7] [VH]        
通过重复进行重组PCR的方法，可以得到人源化抗人血清白蛋白单链抗体与治疗二型糖尿病的多肽类生物药物exendin-4连接制成药物组合物的序列，该序列也可以通过直接合成的方法获得，对重组PCR方法获得的人源化抗人血清白蛋白单链抗体与治疗二型糖尿病的多肽类生物药物exendin-4连接制成药物组合物的测序，得到对应的DNA序列中较佳的一个，测序结果如表3.2所示：
表3.2 ：测序获得的人源化抗人血清白蛋白单链抗体在碳端链接治疗二型糖尿病的多肽类生物药物exendin-4制成药物组合物的序列
GAT ATC CAA CTT ACC CAA TCC CCA AGT AGC
[VL起]       5         10
CTT TCG GCC TCG GTT GGA GAC CGC GTC ACG
        15         20
ATT ACA TGT CGT GCC TCA CAG TAT ATC GGG
      [No.8起] 25         30
CGA TAC CTA AGG TGG TAC CAA CAG AAG CCG
      [No.8止]           40
GGC AAA GCT CCT AGG CTC CTA ATC TAC GAT
        45         [No.9起]
TCG TCA GTG CTG CAA AGT GGT ATA CCC AGT
        55 [No.9止]       60
AGG TTC AGT GGC TCG GGT TCG GGT ACT GAC
        65         70
TTC ACC CTA ACC ATT TCA TCC CTC CAA CCC
        75         80
GAA GAC TTC GCA ACG TAC TAC TGC CAG CAA
        85       [No10起] 90
AAG TAT CTA CCC CCG TAC ACC TTT GGC CAG
        95   [No10止]     100
GGT ACC AAG GTA GAA ATA AAG AGG GGT GGA
        105     [VL止] [No.2起] 110
GGT GGA TCG GGT GGA GGT GGA TCG GGT GGA
        115         120
GGT GGA TCG GAA GTC CAG CTG CTC GAA TCA
    [No.2止] [VH起] 125         130
GGT GGC GGC CTG GTG CAA CCT GGA GGG TCG
        135         140
CTC AGA CTT TCG TGT GCC GCC TCA GGT TTC
        145         150
ACC TTT TGG GCC TAT CCC ATG TCC TGG GAT
      [No.5起] 155     [No.5止]   160
AGG CAA GCC CCT GGT TGG GGG CTA GAA TGG
        165         170
GTC TCC ACC ATC TCCCCA TTC GGC TCC ACA ACA
    [No.6起]   175         180
TAC TAT GCC GAC TCG GTG AAG GGA CGC TTC
        185     [No.6止]   190
ACC ATA TCA CGA GAC AAC TCC AAA AAT ACA
        195         200
CTA TAC CTC CAA ATGAAC TCCCTT CGAGCC GAA GAT ACT
        205         210
GCT GTG TAT TAT TGT GCC AAA GTC AGA TCAATG
        215     [No.7起]   220
CGCCCT TATAAG TTT GAT TAC TGG GGT CAA GGC ACG
        225         230
CTA GTC ACA GTC TCT TCG CGA GGT CGA GGT
        [No.7止] [VH止] [No.1起]     240
CGA GGT CGA GGT CGA TCC CGA GGT GGA GGT
        245         250
TCC CAT GGT GAG GGA ACT TTC ACT AGC GAC
[No.1止] [exendin4起]     255         260
CTC TCA AAG CAG ATG GAG GAG GAA GCT GTC
        265         270
AGG CTT TTC ATC GAA TGG TTG AAG AAC GGC
        275         280
GGA CCT TCG TCA GGA GCC CCA CCA CCG TCG
        285         [exendin4止]
实施例四，单链抗体与多肽类生物药与表达载体的连接、克隆以及蛋白的表达和测序：
利用限制性内切酶HindIII和BamHI将实例3中建立的DNA序列编码***到表达载体pMG18中。构建成为人源化抗人血清白蛋白单链抗体与治疗二型糖尿病的多肽类生物药物exendin-4连接制成的药物组合物序列的表达载体。
将利用上述方法构建的带有抗体与药物联合基因的表达载体转入大肠杆菌，完成对大肠杆菌宿主细胞的转化，将转化后的接种于500mL的LB培养基中进行发酵。 
将纯化后的产物进行测序，得到序列中较佳的一个，测序结果如表4.1所示： 
表4.1：人源化抗人血清白蛋白单链抗体与治疗二型糖尿病的多肽类生物药物exendin-4连接制成药物组合物的蛋白序列
【DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITC RASQYIGRYLR WYQQKPGKAPRLLIY DSSVLQS GIPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC QQKYLPPYT FGQGTKVEIKR GGGGSGGGGSGGGGS EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS AYPMS WVRQAPGKGLEWVS TISPFGSTTYYADSVKG RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAK VRSMRPYKFDY WGQGTLVTVSS RGRGRGRGRSRGGGS HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS】。
实施例五，利用转化了的宿主细胞生产单链抗体和药物复合物的生产过程： 
1.菌种制备
在新鲜配制的含有四环素的卢波LB平板上均匀涂布大肠杆菌菌液，37℃培养16小时，挑取分散良好的大肠杆菌菌株，在LB含有四环素的培养基中37℃摇床培养，16小时。将上述过夜培养的1：100接种到200ml的LB培养基中,37℃摇床培养8小时左右作为发酵菌种使用。  
2.发酵液配制及灭菌
检测发酵罐罐体运行状况，使用pH值标准液标定发酵罐pH探头，标定补料泵流速。按照表1中配方配制发酵培养基20L，1210C在线灭菌20min，同时在高压灭菌锅中对管线，消泡剂，磷酸进行高压灭菌（氨水不可高压灭菌），待发酵液冷却至37℃，调整发酵罐通气量及搅拌子转速到最大值运行五分钟，标定该时溶氧量为100%，加营养液配方配制流加营养液2.5L，分装在四个补料瓶，并使用高压锅灭菌，灭菌完毕连接管线。
3.发酵流程、流加策略和工艺条件 
按照上述方法准备发酵罐及培养基，待发酵液温度下降到设定温度后，比如300C后，接种200ml 吸光浓度A600=1的大肠杆菌菌种到20L发酵罐中(1:100)，同时加入适量四环素，将接种时间记录为发酵时间的开始，发酵参数设定为：温度T=25-370C，酸碱度pH=6.0-7.5转速S=600-1500rpm，通气量为V=1-5vvm，发酵16-18小时发酵液中溶氧(DOT)出现显著波动时，开始流加加入营养液，流速为50ml/h/L-200mL/h/L，发酵16-20小时后加入1mol/L的适量IPTG，到终浓度为0.1mM-10mM，同时调整发酵温度T=18-25℃，流加速度为25ml/h-50mL/h/L，发酵进行期间测定发酵液A600处吸光值用于判断菌体扩增情况，发酵进行到60-80小时后收集发酵液，清洗罐体，结束发酵.
4.发酵液处理
发酵液采用渗透压冲击法处理释放目的蛋白。发酵液经5000rpm离心处理60分钟后收集上清液，使用蔗糖、乙二胺四乙酸缓冲液重悬沉淀菌体，静置16小时后按照再次离心，收集离心上清液（OSI)，并使用1mM镁离子溶液重新悬沉淀，4℃震荡过夜，再次离心，弃去菌体，收集上清液(OSII)，遗弃处理后菌体，合并收集上清液和OSI、OSII处理上清液。
5.抗体纯化 
蛋白纯化采用阳离子交换预装柱进行纯化，样品准备：发酵液上清与OSI和OSII经1:50稀释后，高速离心30min，取上清对0.02mM的PB柱透析过夜，随后对蛋白溶液进行12000rp 40C离心 30分钟，再经0.22μm的滤膜过滤，每个CMM预装离子交换柱使用0.01mM PB缓冲液平衡，采用10倍体积0.02mM的PB平衡柱子洗脱杂蛋白至A280检测线与基线平行，使用精氨酸盐缓冲液分步洗脱，同时检测洗脱蛋白量(A280)收集各部分蛋白并在浓缩后通过SDS-PAGE电泳检测检测和ELSIA检测，检测显示scFv抗体活性良好。
6.结果 
经过80小时的发酵反应，按照上述参数控制严格发酵工艺流程，发酵过程中将16小时，48小时，64小时，72小时时间点的菌液样本浓度进行检测，获得A600处吸光度分别为：70.0, 82.8, 130, 99.8，发酵液经渗透压冲击处理，分成三个部分OS1, OS2和发酵液上清，利用12% SDS-PAGE电泳检测各个组分中重组蛋白含量，电泳结果显示抗体在OSI和发酵液上清中均有高效表达，如图1所示。
通过SDS-PAGE法检测发酵反应生成的人源化抗血清白蛋白单链抗体和药物复合物的蛋白表达情况。M：蛋白標尺；1：纯化样本1μL；2，纯化样本0.1μL。 
实施例六，数据确认药物在体外细胞测试中的半衰期获得了延长： 
将实施例一中所获得的数个抗体克隆与多肽类生物药Exendin-4按照实施例3所描述的方法进行链接，按照实施例6的方法进行表达生产，将生产获得的人源化抗人血清白蛋白单链抗体与治疗二型糖尿病的多肽类生物药物Exendin-4连接的药物组合物在体外培养的人细胞上进行加药试验，观察药物代谢的半衰期（T），数据显示，与未连接本发明所述的人源化抗人血清白蛋白单链抗体的单纯Exendin-4药物相比，人源化抗人血清白蛋白单链抗体与多肽类生物药物Exendin-4连接的药物组合物的半衰期获得明显的延长，利用统计学软件R Stats进行统计检验得到克隆10D7-Exendin-4复合物半衰期与单纯Exendin-4半衰期的差异非常显著的结论(P<0.001)，如图2所示。
数据确认人源化抗人血清白蛋白单链抗体与药物结合物在体外细胞测试中的半衰期获得了延长。 
实施例七. 数据确认人源化抗人血清白蛋白单链抗体与药物结合物在小鼠体内测试中的半衰期获得了延长。 
根据小鼠药代动力学实验，采用皮下给药sc方法，测定复合物半衰期，计量均为0.1mg/kg，经分析皮下给药平均半衰期为95 h。显著长于单纯exendin-4的2-9 h，如图3所示。 
数据确认人源化抗人血清白蛋白单链抗体与药物结合物在在小鼠体内测试中的半衰期获得了延长 
综合上述，本发明实施例中的单链抗体可以从与上述各氨基酸序列对应的脱氧核糖核酸序列片段利用PCR，重组法或人工合成的方法获得完整的与单链抗体对应的脱氧核糖核酸序列片段，然后通过生物体内或体外表达获得，也可以直接通过氨基酸重组法或人工合成法直接获得，在使用与氨基酸序列对应的脱氧核糖核酸序列表达获得的方法中，一旦获得有关序列，就可以将上述脱氧核糖核酸序列克隆如载体中，再转入细胞，然后通过促进宿主细胞的增值获得更多的有关序列。本发明还涉及包含上述各氨基酸序列对应的脱氧核糖核酸序列的载体。这些载体可以用于转化宿主细胞，使其能够表达本发明所述的氨基酸序列。宿主细胞可以是原核细胞，如大肠杆菌细胞；或真核细胞，如酵母菌细胞和哺乳动物细胞。
从以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。 
附录： 
序列TXT文件与权利要求书即说明书中的序列对照表。
 [VL][FR1]   【DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITC】 
[VL][FR2]    【WYQQKPGKAPRLLIY】
[VL][FR3]    【GIPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC SYMGDRFDY】
[VL][FR4]    【FGQGTKVEIKR】
[VL][CDR1]   【RASQYIGRYLR】 [C-SEQ-08]
[VL][CDR2]   【DSSVLQS】 [C-SEQ-09]
[VL][CDR3]   【QQKYLPPYT】 [C-SEQ-010]
[Linker 1]   【GGGGSGGGGSGGGGS】[C-SEQ-01]
[VH][FR1]    【EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS】
[VH][FR2]    【WVRQAPGKGLEWVS】
[VH][FR3]    【RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAK】
[VH][FR4]    【WGQGTLVTVSS】
[VH][CDR1]   【AYPMS】 [C-SEQ-05]
[VH][CDR2]   【TISPFGSTTYYADSVKG】 [C-SEQ-06]
[VH][CDR3]   【VRSMRPYKFDY】 [C-SEQ-07]
[Linker2]    【RGRGRGRGRSRGGGS】 [C-SEQ-03]
[Exendin-4]     【HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS】
[C-SEQ-02] = 
[VH][FR1]+[VH][CDR1]+[VH][FR2]+[VH][CDR2]+[VH][FR3]+[VH][CDR3]+[VH][FR4]
[C-SEQ-04] = 
[VL][FR1]+[VL][CDR1]+[VL][FR2]+[VL][CDR2]+[VL][FR3]+[VL][CDR3]+[VL][FR4]
[ScFv]的一种表现形式 =
[C-SEQ-04]+[C-SEQ-01]+[C-SEQ-02] 或
[C-SEQ-04]+[C-SEQ-03]+[C-SEQ-02]
抗体药物组合物的一种表现形式：
[C-SEQ-04]+[C-SEQ-01]+[C-SEQ-02]+[C-SEQ-03]+[Exendin-4]
从以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。
                         SEQUENCE LISTING
 
<110>  拜明(苏州)生物技术有限公司
 
<120>  抗人血清白蛋白单链抗体及其碳端连接多肽药物的方法
 
<130>  201210125323.4
 
<160>  15   
 
<170>  PatentIn version 3.5
 
<210>  1
<211>  15
<212>  PRT
<213>  合成序列
 
<400>  1
 
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1               5                   10                  15 
 
 
<210>  2
<211>  120
<212>  PRT
<213>  合成序列
 
<400>  2
 
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15     
 
 
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ala Tyr
            20                  25                  30         
 
 
Pro Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45             
 
 
Ser Thr Ile Ser Pro Phe Gly Ser Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60                 
 
 
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80 
 
 
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95     
 
 
Ala Lys Val Arg Ser Met Arg Pro Tyr Lys Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
            100                 105                 110        
 
 
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
 
 
<210>  3
<211>  15
<212>  PRT
<213>  合成序列
 
<400>  3
 
Arg Gly Arg Gly Arg Gly Arg Gly Arg Ser Arg Gly Gly Gly Ser
1               5                   10                  15 
 
 
<210>  4
<211>  117
<212>  PRT
<213>  合成序列
 
<400>  4
 
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15     
 
 
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Tyr Ile Gly Arg Tyr
            20                  25                  30         
 
 
Leu Arg Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Arg Leu Leu Ile
        35                  40                  45             
 
 
Tyr Asp Ser Ser Val Leu Gln Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60                 
 
 
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80 
 
 
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Ser Tyr Met Gly Asp Arg Phe Asp
                85                  90                  95     
 
 
Tyr Gln Gln Lys Tyr Leu Pro Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys
            100                 105                 110        
 
 
Val Glu Ile Lys Arg
        115        
 
 
<210>  5
<211>  5
<212>  PRT
<213>  合成序列
 
<400>  5
 
Ala Tyr Pro Met Ser
1               5  
 
 
<210>  6
<211>  17
<212>  PRT
<213>  合成序列
 
<400>  6
 
Thr Ile Ser Pro Phe Gly Ser Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1               5                   10                  15     
 
 
Gly
   
 
 
<210>  7
<211>  11
<212>  PRT
<213>  合成序列
 
<400>  7
 
Val Arg Ser Met Arg Pro Tyr Lys Phe Asp Tyr
1               5                   10     
 
 
<210>  8
<211>  11
<212>  PRT
<213>  合成序列
 
<400>  8
 
Arg Ala Ser Gln Tyr Ile Gly Arg Tyr Leu Arg
1               5                   10     
 
 
<210>  9
<211>  7
<212>  PRT
<213>  合成序列
 
<400>  9
 
Asp Ser Ser Val Leu Gln Ser
1               5          
 
 
<210>  10
<211>  9
<212>  PRT
<213>  合成序列
 
<400>  10
 
Gln Gln Lys Tyr Leu Pro Pro Tyr Thr
1               5                   
 
 
<210>  11
<211>  39
<212>  PRT
<213>  合成序列
 
<400>  11
 
His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu
1               5                   10                  15     
 
 
Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser
            20                  25                  30         
 
 
Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser
        35                 
 
 
<210>  12
<211>  30
<212>  PRT
<213>  合成序列
 
<400>  12
 
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15     
 
 
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser
            20                  25                  30 
 
 
<210>  13
<211>  14
<212>  PRT
<213>  合成序列
 
<400>  13
 
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser
1               5                   10                 
 
 
<210>  14
<211>  32
<212>  PRT
<213>  合成序列
 
<400>  14
 
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln
1               5                   10                  15     
 
 
Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys
            20                  25                  30         
 
 
<210>  15
<211>  11
<212>  PRT
<213>  合成序列
 
<400>  15
 
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
1               5                   10     
 
 

Claims (2)

1.一种单链抗体， 其特征在于， 其 VL 链区域具有互补识别区， 所述的互补识别区具有选自下组 CDR 的氨基酸序列；
CDR1: C-SEQ-08
CDR2: C-SEQ-09
CDR3: C-SEQ-010 ；
其 VH 链区域具互补识别区， 所述的互补识别区具有选自下组 CDR 的氨基酸序列 ；
CDR1: C-SEQ-05
CDR2: C-SEQ-06
CDR3: C-SEQ-07 ；
其 VH 区域以 C-SEQ-02所示的氨基酸序列；
其 VL 区域以 C-SEQ-04所示的氨基酸序列；
其 VH 链区域和 VL 链区域使用如C-SEQ-01 所示或如 C-SEQ-03 所示的蛋白铰链连接。
2.一种单链抗体与多肽类药物连接形成药物组合物的方法，其特征在于， 它含有单链抗体和任意多肽类药物的序列，所述的单链抗体其 VH 链区域以 C-SEQ-02 所示的氨基酸序列为一种表现形式 ； 其VL 链区域以 C-SEQ-04 所示的氨基酸序列为一种表现形式， 所述的单链抗体与多肽类药物的氨基酸序列使用如C-SEQ-01所示或C-SEQ-03所示的蛋白连接铰链从单链抗体的氮端连接。
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