JP4818634B2 - 走査型蛍光観察装置 - Google Patents

Description

本発明は、走査型蛍光観察装置に関するものである。

従来、白色光観察を行うための顕微鏡の対物レンズにおいて発生する種々の収差を補正するために、反射面形状を可変としたアダプティブミラーが用いられている（例えば、特許文献１参照。）。アダプティブミラーによれば、対物レンズに入射させる光の波面を調節して対物レンズの焦点位置が収差によって変動することを防止できる。
特開平１１−１０１９４２号公報

しかしながら、特許文献１の顕微鏡は、白色光観察を行うためのものであり、その波長範囲は比較的狭い範囲に限定されている。
これに対して、レーザ走査型共焦点蛍光顕微鏡のように、対物レンズに入射させるレーザ光の波長帯域が広い範囲にわたる場合には、特許文献１のように、対物レンズに入射する光の波面を調節するだけでは、色収差による分解能の低下を十分に抑制することが困難であり、鮮明な蛍光画像を取得することができないという問題がある。

本発明は上述した事情に鑑みてなされたものであって、紫外線領域から赤外線領域までの広い波長帯域の励起光を試料に照射しても、鮮明な蛍光画像を取得することを可能とする走査型蛍光観察装置を提供することを目的としている。

上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明は、複数の異なる波長の励起光を出射可能な光源装置と、該光源装置から出射された励起光を走査する走査装置と、該走査装置により走査された励起光を試料に集光する対物光学系と、励起光を照射された試料において発生し、対物光学系、走査装置を介して戻る蛍光を集光する集光光学系と、該集光光学系により集光された蛍光を検出する光検出装置と、前記励起光の光路上に配置され、励起光の波面を調節する第１の波面調節装置と、前記蛍光の光路上に配置され、蛍光の波面を調節する第２の波面調節装置と、前記光源装置から出射される励起光の波長に基づいて、前記第１および第２の波面調節装置を連動させる制御装置とを備え、前記第１の波面調節装置および前記第２の波面調節装置が、形状可変ミラーまたは液晶光学素子のいずれかからなる走査型蛍光観察装置を提供する。

本発明によれば、光源装置から出射された励起光は、走査装置により走査された後に対物光学系を経て試料に集光される。励起光を照射された試料からは、試料内に含有される蛍光物質および励起光の波長に応じた蛍光が発生する。試料において発生した蛍光は、対物光学系および走査装置を経て戻り、集光光学系により集光されて光検出装置により検出される。これにより、試料の蛍光画像を取得することができる。

この場合において、励起光の光路上には第１の波面調節装置が配置されているので、第１の波面調節装置の作動により、励起光の波面が調節される。光源装置から出射される励起光の波長が異なる場合、光源装置から対物光学系までの種々の光学要素の色収差に基づいて、試料に照射される励起光の試料における集光位置が変動するため、励起光の波長に応じて第１の波面調節装置を作動させることにより、励起光の波長が変化しても同一位置に集光させることが可能となる。

また、蛍光の光路上には第２の波面調節装置が配置されているので、第２の波面調節装置の作動により、蛍光の波面が調節される。試料から発せられる蛍光が励起光の波長の相違に基づいて変化する場合、試料から光検出装置までの種々の光学要素の色収差に基づいて、光検出装置に検出される蛍光の強度が変動するため、蛍光の波長に応じて第２の波面調節装置を作動させることにより、蛍光の波長が変化しても、蛍光を同一位置に集光させることができる。

例えば、集光光学系の集光位置に共焦点ピンホールを有する共焦点観察装置の場合、蛍光の波長に関わらず、共焦点ピンホールの位置に蛍光を集光させることができる。したがって、試料の同一位置から発生した蛍光が、その蛍光の波長に依存して検出されたりされなかったりする不都合を防止でき、試料の同一位置における複数色の蛍光画像を精度よく取得することができる。

また、本発明によれば、制御装置の作動により第１の波面調節装置および第２の波面調節装置が連動させられる。第１の波面調節装置により励起光の波面が調節され、第２の波面調節装置により蛍光の波面が調節されるが、励起光の波長によって発生する蛍光の波長が異なるため、制御装置が励起光の波長に基づいて第１および第２の波面調節装置を連動させることにより、試料における励起光の集光位置および光検出装置における蛍光の集光位置の両方が自動的に調節されることになる。
また、第１の波面調節装置および第２の波面調節装置を、形状可変ミラーまたは液晶光学素子のいずれかから構成することで、簡易に、励起光の波長に基づいて励起光および蛍光の波面を調節することができる。

上記発明においては、前記励起光の光路から、前記光検出装置に向かう蛍光を分岐する蛍光分岐手段を備え、前記第１の波面調節装置が、前記光源装置と前記蛍光分岐手段との間に配置され、前記第２の波面調節装置が、前記蛍光分岐手段と前記光検出装置との間に配置されていることが好ましい。

このように構成することで、光源装置と蛍光分岐手段との間および蛍光分岐手段と光検出装置との間に、それぞれ励起光のみおよび蛍光のみの光路が設けられる。これにより、第１の波面調節装置が励起光のみの光路において励起光の波面を調節し、第２の波面調節装置が蛍光のみの光路において蛍光の波面を調節することができる。したがって、励起光の波面調節と蛍光の波面調節とを独立して行うことが可能となり、両者の調節を容易にすることができる。蛍光分岐手段としては、例えば、ダイクロイックミラーが用いられる。

また、上記発明においては、前記蛍光を波長毎に分岐する蛍光波長分岐手段を備え、前記第２の波面調節装置が、前記蛍光波長分岐手段と前記光検出装置との間に配置されていることとしてもよい。
このように構成することで、試料から複数波長の蛍光が発生する場合に、蛍光波長分岐手段の作動により、蛍光を波長毎に分岐することができる。したがって、複数の波長の蛍光を波長毎に波面調節して、同一位置に集光させることが可能となる。この場合に、全ての蛍光に対して第２の波面調節装置を配置してもよいが、基準となる波長以外の波長の蛍光に対して第２の波面調節装置を配置してもよい。また、色収差が同等の波長の蛍光に対しては、第２の波面調節装置を共通化することにしてもよい。なお、蛍光波長分岐手段としては、例えば、ダイクロイックミラーが用いられる。

また、上記発明においては、前記励起光を波長毎に分岐する励起光波長分岐手段を備え、前記第１の波面調節装置が、前記励起光波長分岐手段と前記蛍光分岐手段との間に配置されていることとしてもよい。
このように構成することで、光源装置から複数波長の励起光が出射される場合に、励起光波長分岐手段の作動により、励起光を波長毎に分岐し、第１の波面調節装置により波長毎に波面調節することができる。この場合に、全ての波長の励起光に対して第１の波面調節装置を配置してもよいが、基準となる波長以外の波長の励起光に対して第１の波面調節装置を配置してもよい。また、色収差が同等の波長の励起光に対しては、第１の波面調節装置を共通化することにしてもよい。なお、励起光波長分岐手段としては、例えば、ダイクロイックミラーが用いられる。

また、上記発明においては、前記第１の波面調節装置および／または前記第２の波面調節装置が、前記対物レンズの入射瞳位置またはこれと共役な位置に配置されていることが好ましい。
このように構成することで、波面を調節する第１の波面調節装置および／または第２の波面調節装置に入射させる励起光および／または蛍光の光束径の変動を最小限に抑えることができる。したがって、励起光および／または蛍光の波面調節を容易にすることができる。

本発明によれば、異なる波長の励起光を光源装置から出射しても、励起光の波長にかかわらず、試料の同一位置に励起光を集光させることができ、また、光検出装置の同一位置に蛍光を集光させることができる。その結果、波長の異なる励起光を光源装置から出射しても、光学要素の色収差に基づく集光位置の変動が防止され、試料の同一位置における鮮明な蛍光画像を精度よく取得することができるという効果を奏する。

以下、本発明に係る走査型蛍光観察装置１について、図１を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る走査型蛍光観察装置１は、図１に示されるように、光学ユニット２と、観察装置本体３と、これらを制御する制御装置４とを備えている。

光学ユニット２は、光源装置５と、光検出装置６と、光源装置５からの光路と光検出装置６への光路とを分岐するダイクロイックミラー７とを備えている。
光源装置５は、例えば、波長の異なる３つのレーザ光源８と、各レーザ光源８から発せられたレーザ光（励起光）Ｌを略平行光にするコリメートレンズ９と、これら３つのレーザ光源８から出射された３種類の波長のレーザ光Ｌを同一光路に合流させるミラー１０およびダイクロイックミラー１１とを備えている。

前記光検出装置６は、ダイクロイックミラー７によって分岐された蛍光Ｆを集光する集光レンズ１２と、該集光レンズ１２による蛍光Ｆの集光位置に配置されるピンホール１３と、ピンホール１３を通過した蛍光Ｆを検出する光検出器１４とを備えている。前記集光レンズ１２は、該集光レンズ１２を光軸方向に沿って移動させる移動装置１２ａを備えている。光検出器１４は、例えば、光電子増倍管（ＰＭＴ：Photo Multiplier Tube）である。

前記観察装置本体３は、光源装置５から発せられたレーザ光Ｌを集光して、第１の中間像を結像させる第１のリレーレンズ１５と、第１の中間像を結像したレーザ光Ｌを集光して略平行光にする第２のリレーレンズ１６と、略平行光にされたレーザ光Ｌを２次元的に走査する走査装置１７と、２次元的に走査されたレーザ光Ｌを集光して第２の中間像を結像させる瞳投影レンズ１８と、第２の中間像を結像したレーザ光Ｌを略平行光にする結像レンズ１９と、略平行光にされたレーザ光Ｌを集光して試料Ａに照射する対物レンズ２０とを備えている。図中、符号２１はミラー、符号２２は、シャーレ２３内に収容した生体試料等の試料Ａを載置するステージである。

また、観察装置本体３は、ダイクロイックミラー７と第１のリレーレンズ１５との間に配置された形状可変ミラー２４を備えている。形状可変ミラー２４は、図示しない複数のアクチュエータを備え、与えられる電気信号に応じて各アクチュエータを駆動させることにより、所望の反射面形状を達成することができるようになっている。これにより、反射するレーザ光Ｌの波面を調節することができるようなっている。また、形状可変ミラー２４は、前記対物レンズ２０の入射瞳位置と略共役な位置関係に配置されている。

前記走査装置１７は、例えば、一対のガルバノミラーにより構成されている。一対のガルバノミラーの角度をそれぞれ変化させることにより、レーザ光Ｌを２次元的に走査させることができるようになっている。

前記制御装置４は、光源装置５から出射されるレーザ光Ｌの波長と、形状可変ミラー２４の反射面形状とを対応づけて記憶しており、波長が与えられたときに、その反射面形状を達成するための電気信号を形状可変ミラー２４に入力するように構成されている。また、制御装置４は、光源装置５から出射されるレーザ光Ｌの波長と、集光レンズ１２の位置とを対応づけて記憶しており、レーザ光Ｌの波長が与えられたときに、その位置に集光レンズ１２を移動させるべく移動装置１２ａを駆動するようになっている。

このように構成された本実施形態に係る走査型蛍光観察装置１の作用について以下に説明する。
本実施形態に係る走査型蛍光観察装置１を用いて試料Ａを蛍光観察する場合に、光源装置５から出射させるレーザ光Ｌの波長を選択すると、制御装置４の作動により、形状可変ミラー２４の反射面形状および集光レンズ１２の位置が設定される。この状態で、選択された波長のレーザ光Ｌがレーザ光源８から出射されると、レーザ光Ｌは、ダイクロイックミラー７によって反射された後に、形状可変ミラー２４によって反射される。

その後、第１のリレーレンズ１５および第２のリレーレンズ１６を介してリレーされたレーザ光Ｌは、走査装置１７によって２次元的に走査される。走査されたレーザ光Ｌは、瞳投影レンズ１８、結像レンズ１９および対物レンズ２０を介して試料Ａに集光される。試料Ａにおいては、レーザ光Ｌを照射されることにより、内部に含有されている蛍光物質が励起されて、レーザ光Ｌの波長に対応した波長の蛍光Ｆが発せられる。

発生した蛍光Ｆは、対物レンズ２０、結像レンズ１９、瞳投影レンズ１８、走査装置１７、第２のリレーレンズ１６および第１のリレーレンズ１５を介して戻り、形状可変ミラー２４によって反射された後にダイクロイックミラー７を透過させられることによって、レーザ光Ｌから分岐させられる。そして、集光レンズ１２によって、ピンホール１３の位置に集光させられた後に、光検出器１４によって検出されることになる。

次に、他の波長のレーザ光Ｌを発生するレーザ光源８が選択されたときには、同様にして制御装置４の作動により、該レーザ光Ｌの波長に対応する反射面形状に形状可変ミラー２４が設定されるとともに、これと連動して、集光レンズ１２の位置が設定される。

これにより、レーザ光Ｌの波長が変化しても、形状可変ミラー２４の作動によって、レーザ光Ｌの波面が調節されるので、レーザ光Ｌは、その波長にかかわらず、試料Ａの同一位置に集光させられる。
また、レーザ光Ｌの波長が変化することによって、試料Ａにおいて発生する蛍光Ｆの波長が変化しても、移動装置１２ａの作動によって集光レンズ１２の位置が調節されるので、蛍光Ｆは、その波長にかかわらず、同一位置に配置されているピンホール１３を通過させられて光検出器１４により検出されることになる。

本実施形態に係る走査型蛍光観察装置１においては、試料Ａにおける焦点位置と、ピンホール１３の位置とは互いに共役な位置関係に配置されるので、試料Ａの焦点位置において発生した蛍光Ｆのみがピンホール１３を通過して光検出器１４により検出されることになる。したがって、高い空間的分解能を有する蛍光画像を取得することができる。

この場合において、本実施形態に係る走査型蛍光観察装置１によれば、レーザ光源８が切り替えられることにより、試料Ａに照射されるレーザ光Ｌの波長が変化しても、形状可変ミラー２４の作動によって、色収差が補正されるので、試料Ａの深さ方向の同一位置にレーザ光Ｌを集光させることができる。また、レーザ光Ｌの波長が変化させられることにより、試料Ａにおいて発生する蛍光Ｆの波長も変化するが、光検出器１４に至るまでの光学系において色収差が発生しても形状可変ミラー２４および集光レンズ１２によって補正される。
したがって、複数の波長のレーザ光Ｌを用いて試料Ａの深さ方向の同一の観察位置の蛍光画像を取得することができる。

特に、本実施形態に係る走査型蛍光観察装置１においては、形状可変ミラー２４が対物レンズ２０の入射瞳位置と共役な位置に配置されているので、形状可変ミラー２４の位置におけるレーザ光Ｌの光束径の変化が抑制される。したがって、形状可変ミラー２４によるレーザ光Ｌの波面の調節を、簡易かつ精度よく行うことができる。

なお、本実施形態においては、３つのレーザ光源８を備える光源装置５を例示したが、これに限定されるものではなく、２以上の異なる波長のレーザ光Ｌを出射可能な２以上のレーザ光源８を備えていてもよい。また、出射するレーザ光Ｌの波長を連続的に、あるいは断続的に変更可能な波長可変のレーザ光源８を採用してもよい。この場合に、レーザ光源８から出射するレーザ光Ｌの波長をレーザ光源８に指示するとともに、制御装置４に入力することとしてもよく、また、レーザ光源８から出射されるレーザ光Ｌの波長を実際に測定し、測定された波長を制御装置４に入力することにしてもよい。
また、波面調節装置として形状可変ミラー２４および光軸方向に移動可能な集光レンズ１２を例示したが、これに代えて、液晶光学素子を採用してもよい。

次に、本発明の第２の実施形態に係る走査型蛍光観察装置３０について、図２を参照して以下に説明する。
本実施形態の説明において、上述した第１の実施形態に係る走査型蛍光観察装置１と構成を共通とする箇所には、同一符号を付して説明を省略する。

本実施形態に係る走査型蛍光観察装置３０は、図２に示されるように、ダイクロイックミラー１１によって同一光路に合流されたレーザ光Ｌを集光するカップリングレンズ３１と、該カップリングレンズ３１による集光位置に一端を配置された光ファイバ３２と、該光ファイバ３２により伝播され、他端から出射されるレーザ光Ｌを略平行光にするコリメートレンズ３３とを備えている。

また、本実施形態においては、レーザ光Ｌの波面を調節する形状可変ミラー３４が、コリメートレンズ３３とダイクロイックミラー７との間に配置されている。また、蛍光Ｆの波面を調節する形状可変ミラー３５がダイクロイックミラー７と集光レンズ１２との間に配置されている。

このように構成された本実施形態に係る走査型蛍光観察装置３０によれば、形状可変ミラー３４，３５が、それぞれレーザ光Ｌのみおよび蛍光Ｆのみの光路上に配置されているので、レーザ光Ｌおよび蛍光Ｆの波面を独立に調節することができる。したがって、試料Ａにおける集光位置と、ピンホール１３への集光位置とを個別に調節でき、調節を簡易に、かつ精度よく行うことができる。

なお、本実施形態に係る走査型蛍光観察装置３０においては、レーザ光Ｌを伝播する光ファイバ３２を用いているが、レーザ光Ｌの波長の変化による色収差の発生により、光ファイバ３２への集光位置も変動する場合がある。このため、図３に示されるように、光ファイバ３２の端面への集光位置の変動を防止するために、光ファイバ３２の端面とレーザ光源８との間に形状可変ミラー３６を配置して、レーザ光Ｌの波長に基づいて光ファイバ３２に入射させるレーザ光Ｌの波面を調節することとしてもよい。
特に、ＣＡＲＳ顕微鏡（Coherent Anti-stokes Raman Spectroscopy）のように、異なる波長の２つのレーザ光を試料Ａに照射して、試料Ａ内において可干渉的に相互作用したストークス・ラマン散乱により、単一の非ストークス波長で強い蛍光を得る用途には適している。

また、図４に示されるように、複数の波長のレーザ光Ｌの内、特定の波長のレーザ光Ｌ１については色収差の補正を必要とせず、他の波長のレーザ光Ｌ２についてのみ波面を調節するために、レーザ光Ｌ２をダイクロイックミラー３７によって波長毎に分岐し、色収差の補正が必要な波長のレーザ光Ｌ２についてのみ、形状可変ミラー３８によって波面を調節することとしてもよい。

また、図５に示されるように、複数の波長のレーザ光Ｌを同時に試料Ａに照射して、試料Ａにおいて発生する複数の波長の蛍光Ｆ１，Ｆ２を同時に取得する用途においては、レーザ光Ｌから分岐された蛍光Ｆを、ダイクロイックミラー３９によって、さらに波長毎に蛍光Ｆ１，Ｆ２に分岐し、分岐された蛍光Ｆ１，Ｆ２を波長毎に別個の形状可変ミラー３５によって波面調節することにしてもよい。

［第１実施例］
次に、本発明に係る走査型蛍光観察装置の第１実施例について、図６〜図１２および表１〜表１０を参照して以下に説明する。
本実施例に係る走査型蛍光観察装置は、ほぼ第１の実施形態に対応するもので、図６に示されるように、集光レンズ１２に代えて形状可変ミラーＤＭＦ２を用いている点において第１の実施形態と相違している。図６においては、光源装置５を省略している。

各光学要素間の距離は表１に示される通りである。

対物レンズのレンズデータを図７および表２に示す。

また、結像レンズのレンズデータを図８および表３に示す。

また、瞳投影レンズのレンズデータを図９および表４に示す。

また、リレーレンズＲ１，Ｒ２のレンズデータを図１０および表５に示す。リレーレンズＲ１，Ｒ２は同一のレンズデータを有する。

さらに、集光レンズのレンズデータを図１１および表６に示す。

また、形状可変データの形状例を図１２〜図１４に示す。本実施例においては、光の入射および出射がＹＺ平面内において行われるように設定されている。図中実線Ｂは、光の当たる領域を示している。
本実施例においては、形状可変ミラーの反射面の形状Ｚ（ｘ，ｙ）を以下の数１の通りに定義する。また、２つの形状可変ミラーＤＦＭ１，ＤＦＭ２の数１における変形パラメータＣｊ（ｊ＝４，６，１１，１３，１５）は表７および表８の通りに定義する。

このように構成された本実施例に係る走査型蛍光観察装置によれば、表９に示されるように、形状可変ミラーＤＦＭ１の作用により、レーザ光Ｌの波長を変化させても、試料Ａにおける焦点位置のずれ量ΔＺを極めて小さく抑えることができることがわかる。表９には、形状可変ミラーＤＦＭ１による補正をしない場合を比較例として併せて示している。

また、本実施例に係る走査型蛍光観察装置によれば、表１０に示されるように、主として形状可変ミラーＤＦＭ２の作用により、レーザ光Ｌの波長を変化させても、光検出器における検出位置での蛍光のずれ量ΔＺを極めて小さく抑えることができることがわかる。表１０には、形状可変ミラーＤＦＭ２による補正を行わない場合を比較例として併せて示している。比較例においては、波長５４２ｎｍを基準とした数値を記載している。

［第２実施例］
次に、本発明に係る走査型蛍光観察装置の第２実施例について、図１５および表１１〜表１３を参照して以下に説明する。
本実施例は上述した第２の実施形態に対応するものである。各レンズのレンズデータは第１実施例と同じである。また、形状可変ミラーＤＦＭ１の変形パラメータも第１実施例と同じである。図１５において、各光学要素間の距離を表１１に示す。図示しない距離は、第１実施例と同じである。

表１２に形状可変ミラーＤＦＭ２の変形パラメータを示す。

本実施例に係る走査型蛍光観察装置によれば、表１３に示されるように、形状可変ミラーＤＦＭ２の作用により、レーザ光Ｌの波長を変化させても、光検出器における検出位置での蛍光のずれ量ΔＺを極めて小さく抑えることができることがわかる。表１３には、形状可変ミラーＤＦＭ２による補正を行わない場合を比較例として併せて示している。比較例においては、波長５４２ｎｍを基準とした数値を記載している。

本発明の第１の実施形態に係る走査型蛍光観察装置を示す全体構成図である。 本発明の第２の実施形態に係る走査型蛍光観察装置を示す全体構成図である。 図２の走査型蛍光観察装置の第１の変形例を示す全体構成図である。 図２の走査型蛍光観察装置の第２の変形例を示す全体構成図である。 図２の走査型蛍光観察装置の第３の変形例を示す全体構成図である。 本発明に係る走査型蛍光観察装置の第１実施例を示す全体構成図である。 図６の走査型蛍光観察装置の対物レンズのレンズ構成を示す図である。 図６の走査型蛍光観察装置の結像レンズのレンズ構成を示す図である。 図６の走査型蛍光観察装置の瞳投影レンズのレンズ構成を示す図である。 図６の走査型蛍光観察装置のリレーレンズのレンズ構成を示す図である。 図６の走査型蛍光観察装置の集光レンズのレンズ構成を示す図である。 図６の走査型蛍光観察装置の形状可変ミラーの反射面の形状例を示す斜視図である。 図１２の形状可変ミラーの反射面のＸＹ断面形状を示すグラフである。 図１２の形状可変ミラーの反射面のＹＺ断面形状を示すグラフである。 本発明に係る走査型蛍光観察装置の第２実施例を示す全体構成図である。

符号の説明

Ａ 試料
Ｆ 蛍光
Ｌ，Ｌ１，Ｌ２ レーザ光（励起光）
１，３０ 走査型蛍光観察装置
４ 制御装置
５ 光源装置
６ 光検出装置
７ ダイクロイックミラー（蛍光分岐手段）
１２ 集光光学系
１２ａ 移動装置（第２の波面調節装置）
１７ 走査装置
２０ 対物レンズ（対物光学系）
２４，３４ 形状可変ミラー（第１の波面調節装置）
３５ 形状可変ミラー（第２の波面調節装置）
３７ ダイクロイックミラー（励起光波長分岐手段）
３９ ダイクロイックミラー（蛍光波長分岐手段）

Claims (5)

1. 複数の異なる波長の励起光を出射可能な光源装置と、
   該光源装置から出射された励起光を走査する走査装置と、
   該走査装置により走査された励起光を試料に集光する対物光学系と、
   励起光を照射された試料において発生し、対物光学系、走査装置を介して戻る蛍光を集光する集光光学系と、
   該集光光学系により集光された蛍光を検出する光検出装置と、
   前記励起光の光路上に配置され、励起光の波面を調節する第１の波面調節装置と、
   前記蛍光の光路上に配置され、蛍光の波面を調節する第２の波面調節装置と、
   前記光源装置から出射される励起光の波長に基づいて、前記第１および第２の波面調節装置を連動させる制御装置とを備え、
   前記第１の波面調節装置および前記第２の波面調節装置が、形状可変ミラーまたは液晶光学素子のいずれかからなる走査型蛍光観察装置。
2. 前記励起光の光路から、前記光検出装置に向かう蛍光を分岐する蛍光分岐手段を備え、
   前記第１の波面調節装置が、前記光源装置と前記蛍光分岐手段との間に配置され、
   前記第２の波面調節装置が、前記蛍光分岐手段と前記光検出装置との間に配置されている請求項１に記載の走査型蛍光観察装置。
3. 前記蛍光を波長毎に分岐する蛍光波長分岐手段を備え、
   前記第２の波面調節装置が、前記蛍光波長分岐手段と前記光検出装置との間に配置されている請求項２に記載の走査型蛍光観察装置。
4. 前記励起光を波長毎に分岐する励起光波長分岐手段を備え、
   前記第１の波面調節装置が、前記励起光波長分岐手段と前記蛍光分岐手段との間に配置されている請求項１から請求項３のいずれかに記載の走査型蛍光観察装置。
5. 前記第１の波面調節装置および／または前記第２の波面調節装置が、前記対物レンズの入射瞳位置またはこれと共役な位置に配置されている請求項１から請求項４のいずれかに記載の走査型蛍光観察装置。

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