JP5385442B2 - 顕微鏡対物レンズ及びそれを用いた蛍光観察装置 - Google Patents
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Description
また、例えばKaedeやPA−GFPなどのフォトアクチベーション蛍光タンパク質では440nmや405nmの波長が用いられる。この様な短波長光は従来ではあまり利用されてこなかった光である。その結果、従来よりも広い波長域で収差補正がされた対物レンズに対する要求が高まっている。
また、対物レンズの軸上色収差に起因して、対物レンズに入射する照明光の大きさによって集光位置が異なる場合があった。例えば、対物レンズの瞳を完全に満たす照明光束の場合と、対物レンズの瞳を完全には満たさない照明光束の場合では、照明光束の集光する位置が異なる。この現象は従来の対物レンズでは、NAに対する球面収差量の特性が波長ごとに異なることによって起きていた。
(1) 0.59 ≦ H2/H1 ≦ 0.75
(2) 7.8 ≦ | f(Gb)/f | ≦ 20
条件式(1)は軸上色収差を良好に補正するための条件である。条件式(1)により、レンズ群Gbからレンズ群Gdへの光線高を規定し軸上色収差を補正しやすくしている。条件式(1)の下限を下回ると、レンズ群Gbからレンズ群Gdへの光線高が低くなりすぎて、像面湾曲やコマ収差を補正することが困難となる。条件式(1)の上限を超えると、レンズ群Gbからレンズ群Gdへの光線高が高くなりすぎて、軸上色収差を良好に補正することが困難となる。ここではマージナル光線は、対物レンズのNAにより決まる軸上従属光線の最も光線高の高いものとする。
(2)’ 8 ≦ | f(Gb)/f | ≦ 20
を満たすことがより好ましい。
(3)’ 45 ≧ νd(Len)−νd(Lep) ≧ 30
条件式(3)’は、レンズ群Geの負レンズと正レンズのアッベ数の差を大きくし、倍率の色収差を補正するための条件である。条件式の下限値を下回ると、倍率の色収差が補正不足となる。対物レンズ単独で軸上色収差および倍率色収差を補正するコンペンゼーションフリー対物レンズは、組み合わせるユニット(結像光学系や照明光学系)を選択する自由度が増える。
さらに、H3を前記レンズ群Geから射出するマージナル光線の光線高としたときに、次の条件式
(6) 0.5 ≦ H3/H1 ≦ 0.65
を満足することが望ましい。
条件式(6)は諸収差を良好に補正するための条件である。条件式(6)の下限値を下回ると、レンズ群Gaおよびレンズ群Gbのパワーが弱くなりすぎ、レンズ群Gc以降の後群に強いパワーが必要となり、後群での諸収差の発生量が大きくなる。条件式の上限値を上回ると、レンズ群Gaおよびレンズ群Gbのパワーが強くなりすぎ、レンズ群Gaおよびレンズ群Gbでの諸収差の発生量が大きくなる。
(4) 1.65 ≦ nd(Lep) ≦ 1.8
(5) 25 ≦ νd(Lep) ≦ 41
を満足することが望ましい。
(7) 1 ≦ f(G1+G2)/f ≦ 2
(8) D/f ≦ 0.6
物体からの発散光束を収斂させるために、物体側のレンズ群は強いパワーを持つのが一般的である。特にNAが大きな液浸系対物レンズは、最も物体側のレンズ群は半球に近い形状を持つのが一般的である。しかし、最も物体側のレンズ群に大きな収斂パワーを持たせると、そこで発生する球面収差や軸上色収差が大きくなりすぎて補正が困難となる。本発明では、これまでは最も物体側のレンズ群のみに持たせていた強い収斂作用を、接合レンズG1とメニスカスレンズG2の2つのレンズ群に持たせることにより、収差の発生量を低減し、かつ、収差を補正するレンズ面を増やしている。
(9) | f(Gc)/f | ≦ 50
ただし、fは対物レンズ全系の焦点距離、f(Gc)はレンズ群Gcの焦点距離である。
(10) 10 ≦ |f(Gc)/f| ≦ 20
を満たすことが望ましい。この条件式の下限値を下回ると、レンズ群Gcのパワーが強くなりすぎて、レンズ群Gcでの収差の発生量が大きくなる。更に、レンズ群Gcの移動量が小さくなり、球面収差を補正する補正環の使用時に操作性が劣化する。
(11) λ1−λ2≧180nm
(12) |Δ1−Δ2|<0.2μm
(11)と(12)式を満たすことができれば、試料内を複数の蛍光タグで染色しても色収差は無視できるレベルとなる。
(13) λ2≦442nm
近年蛍光タグには短波長側の刺激光を与えると特性が変化するフォトアクチベーション蛍光タグが用いられるようになっている。たとえばカエデやPA−GFPなどのフォトコンバージョン蛍光たんぱく質では405nmの波長を用いることが一般的である。また、442nmはCFP−YFPの蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)の観察などで用いられるため、(13)式を満たすとフォトアクチベーションや蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)の観察に対応することが可能となる。
(14) |δ1−δ2|≦0.3μm
ここでδ1とδ2はそれぞれλ1とλ2の視野数9での倍率の色収差を示す。
(1) 0.59 ≦ H2/H1 ≦ 0.75
(2) 7.8 ≦ f(Gb)/f ≦ 20
さらに、前記対物レンズが単独で色収差を行っていることが望ましい。単独で色収差を補正した場合、組み合わせるユニット(結像光学系や照明光学系)を選択する自由度が増える。
該試料と該対物レンズの間隔を複数変えて該試料の照明を行ったときの該検出器での検出結果より形成される画像を取得し、該取得された画像のうち該励起波長λ1、λ2で該試料の照明を行ったときの画像を各断面位置での画像保存位置に保存し、該試料と対物レンズの間隔が同じ位置で取得されたλ1、λ2の画像の演算を行うことが好適である。
本発明は軸上色収差を補正しているため、前述の通り、試料の3次元像を観察することに適している。このため、3次元的な検出が可能となる共焦点式の検出手段をもっていることが望ましい。
ただし、実施例中において、sは各レンズ面の面番号、rは各レンズ面の曲率半径(単位mm)、dは各レンズ面間の間隔(単位mm)、ndは各レンズのd線の屈折率、νdは各レンズのd線におけるアッベ数である。また、βは倍率、NAは開口数、WDは作動距離(単位mm)、fは対物レンズ全系の焦点距離(単位mm)、f(G1+G2)は第1レンズ群と第2レンズ群との合成焦点距離(単位mm)、f(Ga)〜f(Ge)はレンズ群Ga〜レンズ群Geの各レンズ群の焦点距離(単位mm)、H1はレンズ群Gbから射出するマージナル光線の光線高(単位mm)、H2はレンズ群Gdに入射するマージナル光線の光線高(単位mm)、H3は対物レンズ射出側のマージナル光線の光線高(単位mm)である。
(結像レンズA)
f(Ga) = 4.809
f(Gb) = 27.656
f(Gc) = 156.491
f(Gd) = −97.432
f(Ge) = −32.359
f(Ga)/f = 1.60
f(Gb)/f = 9.22
f(Gc)/f = 52.16
f(Gd)/f = −32.48
f(Ge)/f = −10.79
H1 = 7.27
H2 = 5.2
H3 = 4.2
νd(Len) = 63.3
νd(Lep) = 29.8
nd(Len) = 1.61800
nd(Lep) = 1.80000
(1) H2/H1 = 0.72
(2) f(Gb)/f = 9.22
(3) νd(Len)−νd(Lep) = 33.5
(6) H3/H1 = 0.58
上記のような構成によって、本実施例では色収差及び諸収差を405nmから656nmまでの波長域で収差補正を補正している。その補正の様子は、図2によって示される。
f(Ga) = 4.587
f(Gb) = 28.014
f(Gc) = 158.735
f(Gd) = −68.519
f(Ge) = −36.452
f(Ga)/f = 1.53
f(Gb)/f = 9.34
f(Gc)/f = 52.91
f(Gd)/f = −22.84
f(Ge)/f = −12.15
H1 = 6.91
H2 = 4.72
H3 = 4.2
νd(Len) = 70.3
νd(Lep) = 29.8
nd(Len) = 1.48745
nd(Lep) = 1.80000
(1) H2/H1 = 0.68
(2) f(Gb)/f = 9.34
(3) νd(Len)−νd(Lep) = 40.5
(6) H3/H1 = 0.61
(9) |f(Gc)/f| = 52.9
上記のような構成によって、本実施例では色収差及び諸収差を405nmから656nmまでの波長域で収差補正を補正している。その補正の様子は、図4によって示される。
f(Ga) = 4.057
f(Gb) = 55.132
f(Gc) = 424.929
f(Gd) = −14.706
f(Ge) = 425.459
f(Ga)/f = 1.35
f(Gb)/f = 18.38
f(Gc)/f = 141.64
f(Gd)/f = −4.90
f(Ge)/f = 141.82
H1 = 6.7
H2 = 4.19
H3 = 4.2
νd(Len) = 70.3
νd(Lep) = 32.2
nd(Len) = 1.48745
nd(Lep) = 1.73800
(1) H2/H1 = 0.63
(2) f(Gb)/f = 18.38
(3) νd(Len)−νd(Lep) = 38.1
(6) H3/H1 = 0.63
(9) |f(Gc)/f|= 141.6
上記のような構成によって、本実施例では色収差及び諸収差を405nmから656nmまでの波長域で収差補正を補正している。その補正の様子は、図6によって示される。
f(Ga) = 4.178
f(Gb) = 39.814
f(Gc) = 133.751
f(Gd) = −13.142
f(Ge) = 350.726
f(Ga)/f = 1.39
f(Gb)/f = 13.27
f(Gc)/f = 44.58
f(Gd)/f = −4.38
f(Ge)/f = 116.91
H1 = 6.96
H2 = 4.1
H3 = 4.2
νd(Len) = 70.3
νd(Lep) = 32.2
nd(Len) = 1.48745
nd(Lep) = 1.73800
(1) H2/H1 = 0.59
(2) f(Gb)/f = 13.27
(3) νd(Len)−νd(Lep) = 38.1
(6) H3/H1 = 0.60
上記のような構成によって、本実施例では色収差及び諸収差を405nmから656nmまでの波長域で収差補正を補正している。その補正の様子は、図8によって示される。
f(Ga) = 5.006
f(Gb) = 28.159
f(Gc) = −43.184
f(Gd) = 34.104
f(Ge) = −68.746
f(Ga)/f = 1.67
f(Gb)/f = 9.39
f(Gc)/f = −14.39
f(Gd)/f = 11.37
f(Ge)/f = −22.92
H1 = 7.32
H2 = 4.49
H3 = 3.9
νd(Len) = 64.2
νd(Lep) = 32.2
nd(Len) = 1.51630
nd(Lep) = 1.73800
(1) H2/H1 = 0.61
(2) f(Gb)/f = 9.39
(3) νd(Len)−νd(Lep) = 32.0
(6) H3/H1 = 0.53
(9) |f(Gc)/f| = 14.4
上記のような構成によって、本実施例では色収差及び諸収差を405nmから656nmまでの波長域で収差補正を補正している。その補正の様子は、図10によって示される。
f(Ga) = 4.835
f(Gb) = 24.100
f(Gc) = −66.770
f(Gd) = −30.153
f(Ge) = −436.809
f(Ga)/f = 1.61
f(Gb)/f = 8.03
f(Gc)/f = −22.26
f(Gd)/f = −10.05
f(Ge)/f = −145.60
f(G1+G2) = 5.740
H1 = 7.12
H2 = 4.47
H3 = 4.2
D = 1.33
νd(Len) = 64.2
νd(Lep) = 29.8
nd(Len) = 1.51630
nd(Lep) = 1.80000
(1) H2/H1 = 0.63
(2) f(Gb)/f = 8.03
(3) νd(Len)−νd(Lep) = 34.4
(6) H3/H1 = 0.59
(7) f(G1+G2)/f = 1.91
(8) D/f = 0.44
上記のような構成によって、本実施例では色収差及び諸収差を405nmから656nmまでの波長域で収差補正を補正している。その補正の様子は、図12によって示される。
f(Ga) = 3.973
f(Gb) = 28.967
f(Gc) = 3756.617
f(Gd) = −19.235
f(Ge) = 671.695
f(Ga)/f = 1.32
f(Gb)/f = 9.66
f(Gc)/f = 1252.21
f(Gd)/f = −6.41
f(Ge)/f = 223.90
f(G1+G2) = 4.5
H1 = 7.01
H2 = 4.16
H3 = 4.2
D = 1.3
νd(Len) = 70.3
νd(Lep) = 32.2
nd(Len) = 1.48745
nd(Lep) = 1.73800
(1) H2/H1 = 0.59
(2) f(Gb)/f = 9.66
(3) νd(Len)−νd(Lep) = 38.1
(6) H3/H1 = 0.60
(7) f(G1+G2)/f = 1.50
(8) D/f = 0.43
上記のような構成によって、本実施例では色収差及び諸収差を405nmから656nmまでの波長域で収差補正を補正している。その補正の様子は、図14によって示される。
以下では本願発明の実施の形態をレーザ走査型顕微鏡の装置の視点から説明する。
2 可視光レーザ
3 ミラー
4 ダイクロイックミラー
5 ミラー
6 集光レンズ
7 ファイバカップリング機構
8 ファイバ
9 ファイバ傾き位置合わせ機構
10 コリメータレンズ
11 ミラー
12 ダイクロイックミラー
13 ダイクロイックミラー
14 ガルバノミラー
15 瞳投影レンズ
16 結像レンズ
17 ミラー
18 対物レンズ
19 ピンホール
20 結像レンズ
21 ダイクロイックミラー
22 ミラー
23 バリアフィルタ
24 検出器
25 標本
26 ステージ
27 対物レンズ上下機構
28 顕微鏡本体
29 共焦点スキャナー
30 画像表示装置
31 画像処理装置
32 ダイクロイックミラー
33 刺激用レーザ
34 可動式ミラー
Claims (10)
- 物体側より順に正のレンズ群Gaと正のレンズ群Gbとレンズ群Gcとレンズ群Gdとレンズ群Geとから構成され、
前記正のレンズ群Gaは、物体側に平面を向けた平凸レンズと物体側に凹面を向けたメニスカスレンズを接合した接合レンズと2つの正の単レンズとからなり、
前記正のレンズ群Gbは、1つの3枚接合の接合レンズからなり、
前記レンズ群Gcは、少なくとも1つ以上の負レンズと正レンズとからなる接合レンズを含み、
前記レンズ群Gdは、像側に強い凹面を向けたメニスカス形状のものであり、
前記レンズ群Geは、物体側に強い凹面を向けた負レンズを含み、
H1をレンズ群Gbから射出するマージナル光線の光線高、H2をレンズ群Gdに入射するマージナル光線の光線高、fを対物レンズ全系の焦点距離、f(Gb)をレンズ群Gbの焦点距離としたときに、次の条件式
0.59 ≦ H2/H1 ≦ 0.75
7.8 ≦ f(Gb)/f ≦ 20
を満足する液浸系顕微鏡対物レンズ。 - 前記レンズ群Gbは、正レンズと負レンズと正レンズとの3枚接合であることを特徴とする請求項1に記載の液浸系顕微鏡対物レンズ。
- 前記正レンズLepの光学ガラスは、d線の屈折率をnd(Lep)としたとき、次の条件式
1.65 ≦ nd(Lep) ≦ 1.8
25 ≦ νd(Lep) ≦ 41
を満足する請求項2に記載の液浸系顕微鏡対物レンズ。 - 前記正のレンズ群Gaは、物体側に平面を向けた平凸レンズと物体側に凹面を向けたメニスカスレンズを接合した接合レンズG1と、物体側に凹面を向けた正のメニスカスレンズG2と、正の単レンズG3とからなり、
f(G1+G2)を接合レンズG1とメニスカスレンズG2との合成焦点距離、fを対物レンズ全系の焦点距離、Dを接合レンズG1とメニスカスレンズG2との間のマージナル光線の長さとしたときに、次の条件式
1 ≦ f(G1+G2)/f ≦ 2
D/f ≦ 0.6
を満足する請求項1から請求項3の何れかに記載の液浸系顕微鏡対物レンズ - λ1、λ2を前記液浸系顕微鏡対物レンズを透過するある2つの光の波長とし、
Δ1、Δ2をそれぞれλ1、λ2の軸上の集光位置としたときに、以下の条件式
λ1−λ2≧180nm
|Δ1−Δ2|<0.2μm
を満足することを特徴とする請求項1から請求項4の何れかに記載の液浸系顕微鏡対物レンズ。 - 以下の条件式
λ2≦442nm
を満たすことを特徴とする請求項5に記載の液浸系顕微鏡対物レンズ。 - δ1とδ2をそれぞれλ1とλ2の視野数9での倍率の色収差としたときに、以下の条件式
|δ1−δ2|≦0.3μm
を満足することを特徴とする請求項5または請求項6に記載の液浸系顕微鏡対物レンズ。 - 前記レンズ群Gcが光軸方向に移動可能であり、
fを対物レンズ全系の焦点距離、f(Gc)を前記レンズ群Gcの焦点距離としたときに、次の条件式
|f(Gc)/f| ≦ 50
を満足する請求項1から請求項7の何れかに記載の液浸系顕微鏡対物レンズ。 - 次の条件式
10 ≦ |f(Gc)/f| ≦ 20
を満足する請求項8に記載の液浸系顕微鏡対物レンズ。 - 請求項1から9のいずれか1項に記載の前記液浸系顕微鏡対物レンズを備えたことを特徴とする蛍光観察装置。
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