JP2006284701A - 顕微鏡用照明装置および蛍光顕微鏡装置 - Google Patents

Abstract

【課題】 簡易な構成で波長選択の効率を向上する。
【解決手段】 超短パルスレーザ光Ｌ１を出射するレーザ光源５と、該レーザ光源５からの超短パルスレーザ光Ｌ１を顕微鏡本体３に導く際に、超短パルスレーザ光Ｌ１のスペクトルを拡散させる光ファイバ８と、該光ファイバ８の出射端に配置され、出射されるスペクトル拡散されたレーザ光Ｌ２を集光させる集光レンズ１０と、該集光レンズ１０による集光位置に配置される空間フィルタ１１とを備え、集光レンズ１０が、入射されるレーザ光Ｌ２の波長毎に異なる焦点距離を有する顕微鏡用照明装置１を提供する。
【選択図】 図１

Description

この発明は、顕微鏡用照明装置および蛍光顕微鏡装置に関するものである。

従来、フェムト秒オーダーの超短パルスレーザ光を、フォトニックバンドギャップ材のような微細構造光学要素に入射させることによってスペクトル拡散させ、広い波長帯域を有するレーザ光を出射させるとともに、音響光学フィルタ（ＡＯＴＦ）やプリズム、あるいはグレーティングを用いて波長範囲を選択する照明装置が知られている（例えば、特許文献１参照。）。
特開２００２−０９８８９６号公報

しかしながら、特許文献１の照明装置においては、ＡＯＴＦ、プリズムあるいはグレーティングによりレーザ光の波長を選択しているため、選択されて出射されるレーザ光の空間的なビーム品質が良好ではないという不都合がある。すなわち、ＡＯＴＦ、プリズムあるいはグレーティングによって分光されるレーザ光には、波長選択素子の面精度等の影響によるビームノイズが多く含まれるため、そのまま顕微鏡装置に入射させたのでは、鮮明な蛍光画像を得ることができないという不都合がある。また、ＡＯＴＦやグレーティングは、分光の際に複数の次数の光を発生させるため、その分、波長選択された出射光の光量が低下するという不都合もある。

本発明は上述した事情に鑑みてなされたものであって、簡易な構成で波長選択の効率を向上することができる顕微鏡用照明装置および空間的なビーム品質の高いレーザ光の照射により鮮明な蛍光画像を得ることができる蛍光顕微鏡装置を提供することを目的としている。

上記目的を達成するために、本発明は、以下の手段を提供する。
本発明は、超短パルスレーザ光を出射するレーザ光源と、該レーザ光源からの超短パルスレーザ光を顕微鏡本体に導く際に、超短パルスレーザ光のスペクトルを拡散させる光ファイバと、該光ファイバの出射端に配置され、出射されるスペクトル拡散されたレーザ光を集光させる集光レンズと、該集光レンズによる集光位置に配置される空間フィルタとを備え、前記集光レンズが、入射されるレーザ光を、波長毎に光軸方向の異なる位置に集光させる顕微鏡用照明装置を提供する。

本発明によれば、光ファイバから出射される広い波長帯域のレーザ光を集光レンズに入射させることで、該レーザ光を波長毎に光軸方向に異なる位置に集光させることができる。そして、集光レンズによる集光位置に配置された空間フィルタを通過させられることにより、レーザ光の空間的なビームノイズが除去されてビーム品質の良好なレーザ光が出射されることになる。この場合に、空間フィルタによれば、レーザ光のエネルギの多くを遮断することなく通過させることができ、波長選択の効率を向上することができる。

上記発明においては、前記空間フィルタの厚さ寸法が、切り出すレーザ光の波長帯域の広さに応じて設定されていることとしてもよい。
このように構成することで、所望の波長帯域を有するレーザ光を選択して顕微鏡本体に入射させることができる。空間フィルタの厚さ寸法を厚くすることにより、顕微鏡本体に入射させるレーザ光の波長帯域幅をより狭くすることができる。これにより、空間的なビーム品質を向上できるのと同時に、スペクトル成分の裾野に配される余分な波長成分を除去して、空間的なビーム品質をさらに向上することができる。

また、上記発明においては、前記空間フィルタを光軸方向に移動させるフィルタ移動機構を備えることとしてもよい。
このように構成することでフィルタ移動機構の作動により空間フィルタの光軸方向位置を変化させ、選択するレーザ光の波長を変化させることができる。その結果、広い波長帯域のレーザ光の中から所望の波長あるいは波長帯域のレーザ光を切り出して顕微鏡本体に入射させることができる。

また、上記発明においては、前記空間フィルタを通過したレーザ光を略平行光にするコリメート光学系を備え、該コリメート光学系を構成するレンズ群内の少なくとも１つのレンズを光軸方向に移動させるレンズ移動機構を備えることとしてもよい。
このように構成することで、空間フィルタを通過して拡散するレーザ光がコリメート光学系によって略平行光に変換される。そして、レンズ移動機構の作動によりコリメート光学系を構成するレンズを光軸方向に移動させることで、略平行光となったレーザ光の光束径を設定することができる。すなわち、空間フィルタの移動によって選択された異なる波長のレーザ光を同一の光束径で顕微鏡本体に入射させることができる。

また、上記発明においては、前記フィルタ移動機構から出射されるレーザ光の波長に基づいて、前記フィルタ移動機構およびレンズ移動機構を制御する制御装置を備えることとしてもよい。
制御装置の作動により、出射するレーザ光の波長を設定するだけで、フィルタ移動機構およびレンズ移動機構が制御され、所望の波長のレーザ光が同一の光束径で出射されるように自動的に調節されることになる。

また、本発明は、上記いずれかの顕微鏡用照明装置と、該顕微鏡用照明装置から入力されたレーザ光を走査させるスキャナ、該スキャナにより走査されたレーザ光を標本に入射させるとともに、標本において発生した蛍光を集光する対物レンズ、および、該対物レンズにより集光された蛍光を検出する光検出器を有する顕微鏡本体とを備える蛍光顕微鏡装置を提供する。

本発明によれば、顕微鏡用照明装置から送られてくるレーザ光が、スキャナによって走査され、対物レンズによって標本に集光される。標本において発生した蛍光は、対物レンズおよびスキャナを介して戻る途中で分岐され、光検出器により検出される。これにより蛍光画像を得ることができる。この場合において、顕微鏡用照明装置からは広い波長帯域から高効率に波長選択されたビーム品質の良好なレーザ光が入射されるので、光検出器によって、明るく、かつ、分解能の高い蛍光画像を取得することができる。

本発明に係る顕微鏡用照明装置によれば、簡易な構成で波長選択の効率を向上することができるという効果を奏する。また、本発明に係る蛍光顕微鏡装置によれば、高効率に波長選択されたビーム品質の高いレーザ光を用いて明るく、かつ、分解能の高い蛍光画像を取得することができるという効果を奏する。

以下、本発明の第１の実施形態に係る顕微鏡用照明装置１および蛍光顕微鏡装置２について、図１を参照して説明する。
本実施形態に係る蛍光顕微鏡装置２は、顕微鏡用照明装置１と、顕微鏡本体３と、画像表示装置４とを備えている。

本実施形態に係る顕微鏡用照明装置１は、図１に示されるように、フェムト秒オーダーの超短パルスレーザ光Ｌ１を出射するレーザ光源５と、該レーザ光源５から発せられた超短パルスレーザ光Ｌ１の光軸の位置および角度を調節するアライメント調整光学系６と、アライメント調整された超短パルスレーザ光Ｌ１を集光させるカップリング光学系７と、該カップリング光学系７による集光位置に一端を配置したフォトニックバンドギャップ材からなる光ファイバ８と、光ファイバ８から出射されるレーザ光Ｌ２を略平行光に変換する第１のコリメート光学系９と、略平行光にされたレーザ光Ｌ２を集光させる集光レンズ１０と、該集光レンズ１０による集光位置に配置された空間フィルタ１１と、該空間フィルタ１１を通過したレーザ光Ｌ３を略平行光に変換する第２のコリメート光学系１２とを備えている。
レーザ光源５は、例えば、波長８００ｎｍの超短パルスレーザ光Ｌ１を出射するようになっている。

前記アライメント調整光学系６は、例えば、光軸に対して垂直な２軸の傾き角を調節できる２枚の反射ミラーおよびビーム位置検出光学系により構成されている、これにより、アライメント調整光学系６は、レーザ光源５から出射された超短パルスレーザ光Ｌ１の光束の中心位置を光軸に一致させるように調節できる。

前記光ファイバ８は、例えば、フォトニッククリスタルファイバあるいはテーパファイバにより構成されている。これにより、光ファイバ８は、一端から入射される波長８００ｎｍの超短パルスレーザ光Ｌ１を伝播させる間にスペクトル拡散させて、略３００〜１６００ｎｍの波長帯域を有する白色レーザ光Ｌ２を他端から出射させるようになっている。

前記集光レンズ１０は、軸上色収差の大きいレンズであって、波長の異なるレーザ光を光軸方向に異なる位置に集光させるようになっている。
前記空間フィルタ１１は、ピンホールである。空間フィルタ１１を集光レンズ１０に対して所定の距離だけ離して配置することにより、特定の波長のレーザ光Ｌ３のみを通過させ、他の波長のレーザ光を遮断することができるようになっている。

前記顕微鏡本体３は、筐体１３内に、顕微鏡用照明装置１から出射されてきた所定波長の略平行光からなるレーザ光Ｌ３を２次元的に走査するスキャナ１４と、走査されたレーザ光Ｌ３を集光して中間像を結像させる瞳投影レンズ１５と、中間像を結像したレーザ光を集光する結像レンズ１６と、結像レンズ１６から発せられたレーザ光を集光して標本Ａに再結像させる対物レンズ１７と、標本Ａにおいて発生し、対物レンズ１７、結像レンズ１６、瞳投影レンズ１５およびスキャナ１４を介して戻る蛍光Ｆを分岐するダイクロイックミラー１８と、集光レンズ１９と、分岐された蛍光を撮像する光検出器２０とを備えている。

スキャナ１４は、例えば、互いに直交する２本の軸線回りに揺動させられる２枚のガルバノミラー（図示略）を近接配置してなる、いわゆる近接ガルバノミラーにより構成されている。
前記光検出器２０は、例えば、光電子増倍管（ＰＭＴ：Photo Multiplier Tube）である。
前記画像表示装置４は、光検出器２０により検出された標本Ａからの蛍光Ｆに基づいて構成された蛍光画像を表示するようになっている。

このように構成された本実施形態に係る顕微鏡用照明装置１および蛍光顕微鏡装置２の作用について、以下に説明する。
レーザ光源５から出射された超短パルスレーザ光Ｌ１は、アライメント調整光学系６によってその光軸位置および角度を調節された後に、カップリング光学系７により集光されて光ファイバ８に入射させられる。

光ファイバ８に入射された超短パルスレーザ光Ｌ１は、フォトニックバンドギャップ材からなる光ファイバ８の非線形効果によってスペクトル拡散させられて、波長３００〜１６００ｎｍの広い波長帯域を有する白色レーザ光Ｌ２として光ファイバ８の他端から出射される。そして、出射された白色レーザ光Ｌ２は第１のコリメート光学系９によって略平行光にされた後に集光レンズ１０によって集光される。

集光レンズ１０は、色収差の大きなレンズにより構成されているので、その集光位置はレーザ光Ｌ２の波長によって異なる。したがって、白色レーザ光Ｌ２は、集光レンズ１０によって集光される際に波長ごとに分光され、波長の異なるレーザ光が光軸方向に異なる位置に集光させられる。

そして、本実施形態によれば、所定の波長のレーザ光Ｌ２の集光位置に空間フィルタ１１が配置されているので、空間フィルタ１１によってその波長のレーザ光Ｌ３のみの通過が許容され、他の波長のレーザ光は遮断される。また、空間フィルタ１１は、レーザ光Ｌ３に含まれるビームノイズを遮断し、かつ、レーザエネルギの多くを通過させるので、高い効率で所定の波長のレーザ光Ｌ３を選択することができる。そして、選択された所定波長のレーザ光Ｌ３は第２のコリメート光学系１２によって略平行光とされた状態で顕微鏡本体３に向けて出射される。

本実施形態に係る顕微鏡用照明装置１によれば、超短パルスレーザ光Ｌ１を伝播させる際にスペクトル拡散させる光ファイバ８により得られた白色レーザ光Ｌ２から、集光レンズ１０と空間フィルタ１１という極めて簡易な構成によって、所望の波長のレーザ光Ｌ３を選択的に切り出すことができる。この際に、複数の次数の光を発生させることなく切り出すので、所望の波長のレーザ光Ｌ３を効率よく最大限に切り出すことができる。また、空間フィルタ１１により、レーザビームノイズを除去するので、出射されるレーザ光Ｌ３のビーム品質を向上することができる。

また、このようにして顕微鏡用照明装置１から出射された所定波長のレーザ光Ｌ３は、スキャナ１４によって２次元的に走査された後に、瞳投影レンズ１５、結像レンズ１６および対物レンズ１７を介して標本Ａに集光される。レーザ光Ｌ３を照射された標本Ａにおいては、蛍光物質が励起されることにより蛍光Ｆが発せられる。標本Ａにおいて発生した蛍光Ｆは、対物レンズ１７によって集められた後、結像レンズ１６、瞳投影レンズ１５およびスキャナ１４を介して同一光路を戻る途中でダイクロイックミラー１８によってレーザ光Ｌ３から分岐され、集光レンズ１９により集光されて光検出器２０により検出される。そして、光検出器２０により検出された蛍光Ｆに基づいて蛍光画像が構成され画像表示装置４により表示される。

本実施形態に係る蛍光顕微鏡装置２によれば、顕微鏡用照明装置１から顕微鏡本体３に入射されるレーザ光Ｌ３が、高効率に波長選択された特定波長のレーザ光Ｌ３であるため、標本Ａに対し十分な光強度のレーザ光Ｌ３を照射させることができ、明るい蛍光画像を取得することができる。また、顕微鏡用照明装置１から顕微鏡本体３に入射されるレーザ光Ｌ３が、ビーム品質の良好なレーザ光Ｌ３であるため、取得される蛍光画像におけるノイズの発生を低減し、鮮明な蛍光画像を取得することができる。

なお、空間フィルタ１１の厚さ寸法を、図２に示されるように広くすることにより、顕微鏡用照明装置１から出射されるレーザ光Ｌ３の波長帯域幅をさらに狭くすることができる。これにより、スペクトル成分の裾野に配置される余分な波長成分を除去することができ、顕微鏡本体３に導入するレーザ光Ｌ３のビーム品質をさらに向上することができる。

次に、本発明の第２の実施形態に係る顕微鏡用照明装置３０および蛍光顕微鏡装置３１について、図３を参照して以下に説明する。
本実施形態の説明において、上述した第１の実施形態に係る顕微鏡用照明装置１および蛍光顕微鏡装置２と構成を共通とする箇所には、同一符号を付して説明を省略する。

本実施形態に係る顕微鏡用照明装置３０は、図３に示されるように、空間フィルタ１１を光軸方向に移動させるフィルタ移動機構３２と、第２のコリメート光学系１２を構成するレンズ１２ａ，１２ｂを光軸方向に移動させるレンズ移動機構３３，３４と、これらの移動機構３２〜３４を制御する制御装置３５とを備えている。
また、顕微鏡本体３には、図示しない波長選択スイッチが設けられており、顕微鏡用照明装置３０に対して、出射すべきレーザ光Ｌ３の波長を指示する波長指令信号Ｓ１を出力するようになっている。

前記制御装置３５は、顕微鏡本体３から入力される波長指令信号Ｓ１に基づいて、フィルタ移動機構３２およびレンズ移動機構３３，３４を駆動するようになっている。制御装置３５には、図示しないメモリ装置が備えられ、顕微鏡本体３に向けて出射すべき波長と、空間フィルタ１１およびレンズ１２ａ，１２ｂの位置とを対応づけて記憶している。

メモリ装置に記憶されている空間フィルタ１１の位置は、指示された波長のレーザ光Ｌ３を通過させる位置に設定されている。また、レンズ１２ａ，１２ｂの位置は、指示された波長に基づいて変化する空間フィルタ１１の位置に応じてその空間フィルタ１１を通過させられるレーザ光Ｌ３の開口数が変化しても、顕微鏡本体３に向けて出射されるレーザ光Ｌ３が、常に同等の光束径を有する略平行光となる位置に設定されている。

制御装置３５は、顕微鏡本体３から入力される波長指令信号Ｓ１に基づいて、当該波長に対応する空間フィルタ１１およびレンズ１２ａ，１２ｂの位置をメモリ装置内から検索して、空間フィルタ１１およびレンズ１２ａ，１２ｂがそれぞれの位置を達成するようにフィルタ移動機構３２およびレンズ移動機構３３，３４を作動させるようになっている。

このように構成された本実施形態に係る顕微鏡用照明装置３０および蛍光顕微鏡装置３１の作用について、以下に説明する。
本実施形態に係る蛍光顕微鏡装置３１を用いて標本Ａを観察するには、顕微鏡本体３に設けられた図示しない波長選択スイッチを操作して、顕微鏡用照明装置３０の制御装置３５に対して波長指令信号Ｓ１を出力する。

波長指令信号Ｓ１が入力されると、制御装置３５は、指示された波長に基づいて、図示しないメモリ装置を検索し、その波長に対応する空間フィルタ１１の位置およびレンズ１２ａ，１２ｂの位置が達成されるように、フィルタ移動機構３２およびレンズ移動機構３３，３４を駆動する。
これにより、光ファイバ８から出射される白色レーザ光Ｌ２の内、指示された波長のレーザ光Ｌ３が通過させられる位置に空間フィルタ１１が移動させられる。また、空間フィルタ１１の位置が変化すると通過するレーザ光Ｌ３の開口数が変化するが、レンズ移動機構３３，３４の作動によってレンズ１２ａ，１２ｂを移動させることにより、第２のコリメート光学系１２から出射されるレーザ光Ｌ３の光束径が一定に維持される。

すなわち、本実施形態に係る顕微鏡用照明装置３０によれば、広い波長帯域を有する白色レーザ光Ｌ２の中から、指定された任意の波長のレーザ光Ｌ３を効率的に選択し、かつ、高いビーム品質のレーザ光Ｌ３を出射させることができる。さらに、本実施形態に係る顕微鏡用照明装置３０によれば、第２のコリメート光学系１２から出射されるレーザ光Ｌ３の光束径およびビームダイバージェンスを常に同等となるように補正することができる。

また、本実施形態に係る蛍光顕微鏡装置３１によれば、常に同等の光束径およびビームダイバージェンスを有するレーザ光Ｌ３を顕微鏡本体３に入射させることができ、その結果、標本Ａにおけるレーザ光Ｌ３の集光位置が光軸方向に変動することを防止できる。
したがって、広い波長帯域の中から選択した任意の波長のレーザ光Ｌ３を用いて、標本Ａの深さ方向の同一位置における蛍光画像を取得することができる。その結果、レーザ光Ｌ３の波長毎に観察位置が変動してしまうことを防止して、分解能を向上することができるという利点がある。

本発明の第１の実施形態に係る顕微鏡用照明装置および蛍光顕微鏡装置を示す全体構成図である。 図１の顕微鏡用照明装置および蛍光顕微鏡装置の変形例を示す全体構成図である。 本発明の第２の実施形態に係る顕微鏡用照明装置および蛍光顕微鏡装置を示す全体構成図である。

符号の説明

Ａ 標本
Ｆ 蛍光
Ｌ１ 超短パルスレーザ光
Ｌ３ レーザ光
１，３０ 顕微鏡用照明装置
３ 顕微鏡本体
５ レーザ光源
８ 光ファイバ
１０ 集光レンズ
１１ 空間フィルタ
１２ コリメート光学系
１２ａ，１２ｂ レンズ
１４ スキャナ
１７ 対物レンズ
２０ 光検出器
３１ 蛍光顕微鏡装置
３２ フィルタ移動機構
３３，３４ レンズ移動機構
３５ 制御装置

Claims (6)

1. 超短パルスレーザ光を出射するレーザ光源と、
   該レーザ光源からの超短パルスレーザ光を顕微鏡本体に導く際に、超短パルスレーザ光のスペクトルを拡散させる光ファイバと、
   該光ファイバの出射端に配置され、出射されるスペクトル拡散されたレーザ光を集光させる集光レンズと、
   該集光レンズによる集光位置に配置される空間フィルタとを備え、
   前記集光レンズが、入射されるレーザ光を、波長毎に光軸方向の異なる位置に集光させる顕微鏡用照明装置。
2. 前記空間フィルタの厚さ寸法が、切り出すレーザ光の波長帯域の広さに応じて設定されている請求項１に記載の顕微鏡用照明装置。
3. 前記空間フィルタを光軸方向に移動させるフィルタ移動機構を備える請求項１または請求項２に記載の顕微鏡用照明装置。
4. 前記空間フィルタを通過したレーザ光を略平行光にするコリメート光学系を備え、
   該コリメート光学系を構成するレンズ群内の少なくとも１つのレンズを光軸方向に移動させるレンズ移動機構を備える請求項３に記載の顕微鏡用照明装置。
5. 前記フィルタ移動機構から出射されるレーザ光の波長に基づいて、前記フィルタ移動機構およびレンズ移動機構を制御する制御装置を備える請求項４に記載の顕微鏡用照明装置。
6. 請求項１から請求項５のいずれかに記載の顕微鏡用照明装置と、
   該顕微鏡用照明装置から入力されたレーザ光を走査させるスキャナ、該スキャナにより走査されたレーザ光を標本に入射させるとともに、標本において発生した蛍光を集光する対物レンズ、および、該対物レンズにより集光された蛍光を検出する光検出器を有する顕微鏡本体とを備える蛍光顕微鏡装置。

Images