JP7488253B2

JP7488253B2 - 共焦点顕微鏡ユニット及び共焦点顕微鏡

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Publication number: JP7488253B2
Application number: JP2021509611A
Authority: JP
Inventors: 慈郎山下; 康行田邊; 俊輔松田; 浩敏寺田
Original assignee: Hamamatsu Photonics KK
Current assignee: Hamamatsu Photonics KK
Priority date: 2019-03-28
Filing date: 2020-03-26
Publication date: 2024-05-21
Anticipated expiration: 2040-03-26
Also published as: EP3951466A1; CN113631980A; WO2020196784A1; JPWO2020196784A1; US20220155577A1; JPWO2020196783A1; EP3951468A1; JP7344281B2; WO2020196783A1; US20220179185A1; CN113631980B; CN113646686A; EP3951468A4; CN113646686B; EP3951466A4

Description

本開示は、共焦点顕微鏡を構成する共焦点顕微鏡ユニット及び共焦点顕微鏡に関する。

従来から、観察対象の標本の光学断層像を高解像度で得ることが可能な共焦点顕微鏡が知られている。例えば、下記特許文献１には、顕微鏡に接続される顕微鏡接続ポートと、標本に光を照射する刺激ユニットと、標本から発せられる光を検出する観察ユニットと、顕微鏡と刺激ユニット及び観察ユニットとを光学的に接続する光路を合成する光路合成部とを備える顕微鏡接続ユニットが開示されている。この顕微鏡接続ユニットは、複数の光源から発せられた光を導く光学系、それに応じて発生した蛍光を複数波長ごとに検出するためのダイクロイックミラー、共焦点ピンホール、及び光電子増倍管を、同一の観察ユニット内に有している。このような構成では、複数の波長の励起光を用いてそれに応じて生じる蛍光を検出することにより、同一の装置で複数波長領域でのイメージングが実現される。

特開２０１１－９０２４８号公報

上述したような従来のユニットでは、共焦点光学系を構成するにあたり、励起光と蛍光を分離するダイクロイックミラーに対して、励起光を出力する光源や蛍光の光束を制限する絞り部材の位置を共役位置に設置する必要があり、この共役位置の光学調整に手間がかかっていた。

実施形態は、かかる課題に鑑みてなされたものであり、ダイクロイックミラーに対して、励起光を出力する光源及び蛍光の光束を制限する絞り部材の位置を共役位置に設置したユニットを設けることで、複数波長での共焦点イメージングを容易に行うことができる共焦点顕微鏡ユニットを提供することを課題とする。

本開示の一形態に係る共焦点顕微鏡ユニットは、顕微鏡光学系を有する顕微鏡の接続ポートに取り付けられることにより、共焦点顕微鏡を構成する共焦点顕微鏡ユニットであって、第１の励起光を出力する光源、第１の励起光に応じて観察対象の試料から生じる第１の蛍光の光束を制限する第１の絞り部材、及び、第１の絞り部材を通過した第１の蛍光を検出する第１の光検出器を有する第１のサブユニットと、第２の励起光を出力する光源、第２の励起光に応じて試料から生じる第２の蛍光の光束を制限する第２の絞り部材、及び、第２の絞り部材を通過した第２の蛍光を検出する第２の光検出器を有する第２のサブユニットと、第１及び第２のサブユニットから出力された励起光を、試料上で走査させ、励起光に応じて試料から生じる蛍光を第１及び第２のサブユニットに向けて導くスキャンミラーと、スキャンミラーによって走査された励起光を顕微鏡光学系に導光し、顕微鏡光学系によって結像された蛍光をスキャンミラーに導光するスキャンレンズと、接続ポートに取り付け可能に構成され、スキャンミラー、スキャンレンズ、第１のサブユニット、及び第２のサブユニットが固定されたメイン筐体と、を備え、第１のサブユニットは、第１の励起光及び第１の蛍光を反射し、第２の励起光及び第２の蛍光を透過する第１のビームスプリッタを有する。

上記一形態によれば、第１のサブユニットから出力された第１の励起光が、第１のビームスプリッタを反射してからスキャンミラー及びスキャンレンズを経由して試料上に走査され、それに応じて試料上から生じた第１の蛍光がスキャンレンズ及びスキャンミラーを経由してから第１のビームスプリッタを反射することにより第１のサブユニット内に入射し、第１のサブユニット内の第１の絞り部材にその像が結ばれて第１の光検出器で検出される。加えて、第２のサブユニットから出力された第２の励起光が、第１のサブユニット内の第１のビームスプリッタを透過してからスキャンミラー及びスキャンレンズを経由して試料上に走査され、それに応じて試料上から生じた第２の蛍光が、スキャンレンズ及びスキャンミラーを経由して第１のビームスプリッタを透過してから第２のサブユニット内に入射し、第２のサブユニット内の第２の絞り部材にその像が結ばれて第２の光検出器で検出される。ここで、これらのスキャンミラー、スキャンレンズ、第１及び第２のサブユニットはメイン筐体に固定されているので、第１及び第２のサブユニットの単位での光源の光学系と絞り部材との位置関係の設定が可能となる。その結果、設定作業を容易にしつつ複数波長領域でのイメージングの精度を高めることが可能となる。

あるいは、本開示の他の形態は、上述の共焦点顕微鏡ユニットと、顕微鏡光学系及び共焦点顕微鏡ユニットが取り付けられる接続ポートを有する顕微鏡を備える共焦点顕微鏡である。このような共焦点顕微鏡によれば、所望の励起波長及び蛍光波長における共焦点イメージングを容易に行うことができる。

本開示の一側面によれば、光源の光学系及び絞り部材の設定を容易にして複数波長領域でのイメージングの精度を高めることができる。

実施形態にかかる共焦点顕微鏡Ａの概略構成図である。ダイクロイックミラー９ａ～９ｃにおける蛍光の屈折状態を示す平面図である。図１の共焦点顕微鏡ユニット１の第１～第４のサブユニット６ａ～６ｄの位置決め構造を示す平面図である。図１の第１～第４のサブユニット６ａ～６ｄで扱われる励起光及び蛍光の波長分布特性を示すグラフである。

以下、添付図面を参照して、本開示の実施形態について詳細に説明する。なお、説明において、同一要素又は同一機能を有する要素には、同一符号を用いることとし、重複する説明は省略する。

図１は、実施形態にかかる共焦点顕微鏡Ａの概略構成図である。図１に示す共焦点顕微鏡Ａは、観察対象の試料Ｍの光学断層像の構築を可能とする画像を取得する共焦点顕微鏡を構成し、共焦点顕微鏡ユニット１が顕微鏡５０の外部ユニット接続用の接続ポートＰ１に接続されて構成される。この共焦点顕微鏡ユニット１は、顕微鏡５０内の結像レンズ５１、対物レンズ５２等の顕微鏡光学系を経由して、顕微鏡５０のステージ上等に配置された試料Ｍに励起光を照射し、その励起光に応じて試料Ｍから生じた蛍光を、顕微鏡５０の顕微鏡光学系を経由して受光（検出）して光学的断層像を生成して出力する装置である。

詳細には、共焦点顕微鏡ユニット１は、メイン筐体２と、メイン筐体２の一部を構成し、顕微鏡５０の接続ポートＰ１に着脱可能に接続される鏡筒３と、メイン筐体２内に固定されたスキャンミラー４、固定ミラー５、第１～第４のサブユニット６ａ～６ｄと、鏡筒３内に固定されたスキャンレンズ７とを含んで構成される。以下、共焦点顕微鏡ユニット１の各構成要素について詳細に説明する。

鏡筒３内のスキャンレンズ７は、スキャンミラー４の反射面を対物レンズ５２の瞳位置にリレーすると同時に、顕微鏡５０の顕微鏡光学系の１次結像面にスポットを結ぶ機能を有する光学素子である。スキャンレンズ７は、スキャンミラー４によって走査された励起光を顕微鏡光学系に導光することにより試料Ｍに照射させ、それに応じて試料Ｍから生じた蛍光をスキャンミラー４に導光する。

メイン筐体２内のスキャンミラー４は、例えば、反射板を２軸で傾動可能に構成されたＭＥＭＳ（Micro Electro Mechanical System）ミラー等の光走査素子である。スキャンミラー４は、反射角度を連続的に変更することにより、第１～第４のサブユニット６ａ～６ｄから出力された励起光を試料Ｍ上に走査させ、その励起光に応じて生じる蛍光を、第１～第４のサブユニット６ａ～６ｄに向けて導く役割を有する。

固定ミラー５は、メイン筐体２内に固定された光反射素子であり、第１～第４のサブユニット６ａ～６ｄから出力された励起光をスキャンミラー４に向けて反射させ、スキャンミラー４で反射された蛍光を励起光と同軸で第１～第４のサブユニット６ａ～６ｄに向けて反射する。

第１のサブユニット６ａは、ベース板８ａと、ベース板８ａ上に配置されたダイクロイックミラー（第１のビームスプリッタ）９ａ、光源１０ａ、ダイクロイックミラー１１ａ、ピンホール板（第１の絞り部材）１２ａ、光検出器（第１の光検出器）１３ａとを有する。ダイクロイックミラー９ａは、固定ミラー５の蛍光の反射方向に固定され、第１のサブユニット６ａが照射する波長λ_１の第１の励起光及びそれに応じて試料Ｍから生じる波長範囲Δλ_１の第１の蛍光を反射し、第１の励起光及び第１の蛍光よりも長波長の光を透過させる性質を有するビームスプリッタである。ダイクロイックミラー１１ａは、ダイクロイックミラー９ａの第１の蛍光の反射方向に設けられ、波長範囲Δλ_１の第１の蛍光を透過し、波長範囲Δλ_１より短い波長λ_１の第１の励起光を反射させる性質を有するビームスプリッタである。光源１０ａは、波長λ_１の第１の励起光（例えば、レーザ光）を出力する発光素子（例えば、レーザダイオード）であり、第１の励起光がダイクロイックミラー１１ａによって第１の蛍光と同軸でダイクロイックミラー９ａに向けて反射されるように配置される。ピンホール板１２ａは、そのピンホール位置が試料Ｍの第１の励起光のスポットの共役位置に一致するように配置され、第１の蛍光の光束を制限する絞り部材であり、光源１０ａ等とともに共焦点光学系を構成する。このピンホール板１２ａは、ピンホールの径を外部から調整可能にされ、光検出器１３ａによって検出される画像の解像度と画像の信号強度を変更可能とする。光検出器１３ａは、その検出面がピンホール板１２ａに対向して配置され、ピンホール板１２ａを通過した第１の蛍光を受光および検出する。なお、光検出器１３ａは、光電子増倍管、フォトダイオード、アバランシェフォトダイオード、ＭＰＰＣ（Multi-Pixel Photon Counter）、ＨＰＤ（Hybrid Photo Detector）、或いはエリアイメージセンサ等である。

第２～第４のサブユニット６ｂ～６ｄも、第１のサブユニット６ａと同様な構成を有する。

すなわち、第２のサブユニット６ｂは、ベース板８ｂと、ダイクロイックミラー（第２のビームスプリッタ）９ｂ、光源１０ｂ、ダイクロイックミラー１１ｂ、ピンホール板（第２の絞り部材）１２ｂ、光検出器（第２の光検出器）１３ｂとを有する。ダイクロイックミラー９ｂは、第２のサブユニット６ｂが照射する波長λ_２（＞λ_１）の第２の励起光及びそれに応じて試料Ｍから生じる波長範囲Δλ_２の第２の蛍光を反射し、第２の励起光及び第２の蛍光よりも長波長の光を透過させる性質を有する。ダイクロイックミラー１１ｂは、波長範囲Δλ_２の第２の蛍光を透過し、波長範囲Δλ_２より短い波長λ_２の第２の励起光を反射させる性質を有する。光源１０ｂは、波長λ_２の第２の励起光を出力する発光素子である。ピンホール板１２ｂは、そのピンホール位置が試料Ｍの第２の励起光のスポットの共役位置に一致するように配置され、第２の蛍光の光束を制限する絞り部材である。光検出器１３ｂは、その検出面がピンホール板１２ｂに対向して配置され、ピンホール板１２ｂを通過した第２の蛍光を受光および検出する。なお、光検出器１３ｂは、光電子増倍管、フォトダイオード、アバランシェフォトダイオード、ＭＰＰＣ（Multi-Pixel Photon Counter）、ＨＰＤ（Hybrid Photo Detector）、或いはエリアイメージセンサ等である。

第３のサブユニット６ｃは、ベース板８ｃと、ダイクロイックミラー（第３のビームスプリッタ）９ｃ、光源１０ｃ、ダイクロイックミラー１１ｃ、ピンホール板（第３の絞り部材）１２ｃ、光検出器（第３の光検出器）１３ｃとを有する。ダイクロイックミラー９ｃは、第３のサブユニット６ｃが照射する波長λ_３（＞λ_２）の第３の励起光及びそれに応じて試料Ｍから生じる波長範囲Δλ_３の第３の蛍光を反射し、第３の励起光及び第３の蛍光よりも長波長の光を透過させる性質を有する。ダイクロイックミラー１１ｃは、波長範囲Δλ_３の第３の蛍光を透過し、波長範囲Δλ_３より短い波長λ_３の第３の励起光を反射させる性質を有する。光源１０ｃは、波長λ_３の第３の励起光を出力する発光素子である。ピンホール板１２ｃは、そのピンホール位置が試料Ｍの第３の励起光のスポットの共役位置に一致するように配置され、第３の蛍光の光束を制限する絞り部材である。光検出器１３ｃは、その検出面がピンホール板１２ｃに対向して配置され、ピンホール板１２ｃを通過した第３の蛍光を受光および検出する。なお、光検出器１３ｃは、光電子増倍管、フォトダイオード、アバランシェフォトダイオード、ＭＰＰＣ（Multi-Pixel Photon Counter）、ＨＰＤ（Hybrid Photo Detector）、或いはエリアイメージセンサ等である。

第４のサブユニット６ｄは、ベース板８ｄと、全反射ミラー９ｄ、光源１０ｄ、ダイクロイックミラー１１ｄ、ピンホール板（第４の絞り部材）１２ｄ、光検出器（第４の光検出器）１３ｄとを有する。全反射ミラー９ｃは、第４のサブユニット６ｄが照射する波長λ_４（＞λ_３）の第４の励起光及びそれに応じて試料Ｍから生じる波長範囲Δλ_４の第４の蛍光を反射する。ダイクロイックミラー１１ｄは、波長範囲Δλ_４の第４の蛍光を透過し、波長範囲Δλ_４より短い波長λ_４の第４の励起光を反射させる性質を有する。光源１０ｄは、波長λ_４の第４の励起光を出力する発光素子である。ピンホール板１２ｄは、そのピンホール位置が試料Ｍの第４の励起光のスポットの共役位置に一致するように配置され、第４の蛍光の光束を制限する絞り部材である。光検出器１３ｄは、その検出面がピンホール板１２ｄに対向して配置され、ピンホール板１２ｄを通過した第４の蛍光を受光および検出する。なお、光検出器１３ｄは、光電子増倍管、フォトダイオード、アバランシェフォトダイオード、ＭＰＰＣ（Multi-Pixel Photon Counter）、ＨＰＤ（Hybrid Photo Detector）、或いはエリアイメージセンサ等である。

上記構成の第１～第４のサブユニット６ａ～６ｄの位置関係について説明する。

第１～第４のサブユニット６ａ～６ｄは、スキャンミラー４及び固定ミラー５による第１～第４の蛍光の導光方向に沿って、この順番で固定ミラー５から離れる方向に並ぶように、かつ、第１～第４の蛍光の光路上にダイクロイックミラー９ａ～９ｃ及び全反射ミラー９ｄが位置するように、メイン筐体２内に固定されている。詳細には、第２～第４のサブユニット６ｂ～６ｄは、それぞれ、第１～第３のサブユニット６ａ～６ｃに対して、ダイクロイックミラー９ａ～９ｃ及び全反射ミラー９ｄの中心位置を基準にして、第２～第４の蛍光の導光方向に垂直な方向に所定距離ｄだけシフトするように、配置されている。

この所定距離ｄは、ダイクロイックミラー９ａ～９ｃによって透過される蛍光の光路において、それぞれのダイクロイックミラー９ａ～９ｃにおいて蛍光の屈折によって生じる、その光路に垂直な方向のシフト量δに略等しく設定される。本実施形態では、ダイクロイックミラー９ａ～９ｃを構成するミラー部材の厚さは同一に設定されているため、ダイクロイックミラー９ａ～９ｃで生じるシフト量はほぼ同じとなり、それに応じて、第１～第４のサブユニット６ａ～６ｄのうちの隣り合う２つのサブユニット間のシフト距離ｄも同じに設定される。このシフト距離ｄは、ダイクロイックミラー９ａ～９ｃを構成するミラー部材の厚さ及び屈折率に応じて適切に設定される。詳しくは、ミラー部材が厚さｔ、屈折率ｎであり、ミラー部材に入射する蛍光の入射角をθ、ミラー部材内部への屈折角をφとした場合、ミラー部材による蛍光のシフト量δは、図２のようになる。この時、シフト量δは、下記式（１）のように求めることができるため、このシフト量δに合わせてシフト距離（所定距離）ｄを設定すればよい。なお、入射角θと屈折角φの間には、下記式（２）の関係がある。
δ＝ｔ・sin（θ‐φ）／cosφ …（１）
φ＝arcsin(sinθ／ｎ) …（２）
なお、入射角θを４５度とした場合、ミラー部材の屈折率ｎが１．５であれば、ｄ＝δ＝０．３３ｔとなり、ミラー部材の屈折率ｎが１．４であれば、ｄ＝δ＝０．２９ｔとなる。

図３には、第１～第４のサブユニット６ａ～６ｄの位置決め構造の例を示している。図３においては、第１～第３のサブユニット６ａ～６ｄの構成部品の図示は省略されている。このように、メイン筐体２を構成するベース板１４上には、第１～第４のサブユニット６ａ～６ｄのそれぞれに対応して２つの突起部（第１～第４の位置決め部）１５ａ～１５ｄが設けられており、それぞれの２つの突起部１５ａ～１５ｄに対して第１～第４のサブユニット６ａ～６ｄのベース板８ａ～８ｄに形成された穴部１６が嵌め込まれることにより、第１～第４のサブユニット６ａ～６ｄが互いに所定距離ｄだけシフトするように位置決めされる。ここで、ベース板１４上の２つの突起部１５ａ～１５ｄのそれぞれの間隔と、ベース板８ａ～８ｄの２つの穴部１６のそれぞれの間隔とは、全て同一になるように形成されている。このようにすることで、第１～第４のサブユニット６ａ～６ｄのうちから任意のサブユニットを選択してメイン筐体２内のベース板１４上に配置することができる。ただし、第１～第４のサブユニット６ａ～６ｄのうちから一部のサブユニットを選択する場合には、選択されたサブユニットは固定ミラー５側に詰めて配置され、照射する励起光の波長が短いものから順に固定ミラー５側から並ぶように配置される。

以上説明した共焦点顕微鏡ユニット１によれば、第１のサブユニット６ａから出力された第１の励起光が、ダイクロイックミラー９ａを反射してからスキャンミラー４及びスキャンレンズ７を経由して試料Ｍ上に走査され、それに応じて試料Ｍ上から生じた第１の蛍光がスキャンレンズ７及びスキャンミラー４を経由してからダイクロイックミラー９ａを反射することにより第１のサブユニット６ａ内に入射し、第１のサブユニット６ａ内のピンホール板１２ａにその像が結ばれて光検出器１３ａで検出される。加えて、第２のサブユニット６ｂから出力された第２の励起光が、第２のサブユニット６ｂ内のダイクロイックミラー９ｂを反射した後に第１のサブユニット６ａ内のダイクロイックミラー９ａを透過してからスキャンミラー４及びスキャンレンズ７を経由して試料Ｍ上に走査され、それに応じて試料Ｍ上から生じた第２の蛍光が、スキャンレンズ７及びスキャンミラー４を経由してダイクロイックミラー９ａを透過した後にダイクロイックミラー９ｂを反射して第２のサブユニット６ｂ内に入射し、第２のサブユニット６ｂ内のピンホール板１２ｂにその像が結ばれて光検出器１３ｂで検出される。同様に、他の第２及び第３のサブユニット６ｃ，６ｄに関しても、自ユニットから照射された励起光及びそれに応じて生じた蛍光が自ユニットのダイクロイックミラーを反射し他ユニットのダイクロイックミラーを透過するように構成されることで、２つの波長の励起光に応じて生じた蛍光の検出が独立に可能となる。また、第１～第４のサブユニット６ａ～６ｄはそれぞれ、共焦点顕微鏡ユニット１の外部で、光源やピンホールの位置を共役な関係になるように調整することができ、共焦点顕微鏡ユニット１に搭載後、面倒な光学調整が不要となり、サブユニットの追加や交換が容易に行える。

図４は、第１～第４のサブユニット６ａ～６ｄで扱われる励起光及び蛍光の波長分布特性を示すグラフである。第１のサブユニット６ａから照射される波長λ_１の励起光に応じて生じる蛍光の波長範囲Δλ_１は、一般的には、波長λ_１の近傍であって波長λ_１より長波長の範囲となる。これに対して、第２のサブユニット６ｂから照射される励起光の波長λ_２、及びそれによって生じる蛍光の波長範囲Δλ_２は、波長λ_１及び波長範囲Δλ_１よりも長波長の範囲となる。ここで、第１のサブユニット６ａのダイクロイックミラー９ａの光分割の境界波長λ_ｄ１は、波長λ_１及び波長範囲Δλ_１よりも長波長であり、かつ、波長λ_２及び波長範囲Δλ_２よりも短波長となる値に設定されている。これにより、第１のサブユニット６ａを用いた波長λ_１及び波長範囲Δλ_１の範囲の共焦点計測が可能となり、同一装置の第２のサブユニット６ｂを用いて、波長λ_２及び波長範囲Δλ_２の範囲の共焦点計測が可能となる。同様に、第２のサブユニット６ｂのダイクロイックミラー９ｂの光分割の境界波長λ_ｄ２は、波長λ_２及び波長範囲Δλ_２よりも長波長であり、かつ、波長λ_３及び波長範囲Δλ_３よりも短波長となる値に設定されており、第３のサブユニット６ｃのダイクロイックミラー９ｃの光分割の境界波長λ_ｄ３は、波長λ_３及び波長範囲Δλ_３よりも長波長であり、かつ、波長λ_４及び波長範囲Δλ_４よりも短波長となる値に設定されている。これにより、同一の装置の第３のサブユニット６ｃを用いた波長λ_３及び波長範囲Δλ_３の範囲の共焦点計測が可能となり、同一装置の第４のサブユニット６ｄを用いて、波長λ_４及び波長範囲Δλ_４の範囲の共焦点計測が可能となる。

ここで、これらのスキャンミラー４、スキャンレンズ７、第１～第４のサブユニット６ａ～６ｄはメイン筐体２に固定され、第１～第４のサブユニット６ａ～６ｄは、任意のサブユニットを選択的にメイン筐体２のベース板１４上に配置可能とされている。このような構成により、第１～第４のサブユニット６ａ～６ｄの単位での光源１０ａ～１０ｄの光学系とピンホール板１２ａ～１２ｄ及び光検出器１３ａ～１３ｄとの位置関係の設定が可能となる。その結果、設定作業を容易にしつつ複数波長領域でのイメージングの精度を高めることが可能となる。すなわち、共焦点顕微鏡Ａによる観察においては検出器側のピンホールと光源とを共役位置に設定することが測定精度維持のために重要となる。本実施形態によれば、そのような設定がサブユニット単位で実施可能となり、第１～第４のサブユニット６ａ～６ｄをメイン筐体２に収容した後はスキャンミラー４及びスキャンレンズ７を調整するだけで精度の高い画像検出が可能となる。

また、各第１～第４のサブユニット６ａ～６ｄのピンホール板１２ａ～１２ｄは、それらのピンホール径を観察する蛍光の波長に応じて調整可能とされているので、観察する蛍光の波長に応じて画像の解像度と画像の信号強度を調整することができる。

また、本実施形態では、第１～第３のダイクロイックミラー９ａ～９ｃを構成するミラー部材の厚さが略同一とされている。このような構成によれば、第１～第３のダイクロイックミラー９ａ～９ｃのそれぞれを透過することにより生じる励起光あるいは蛍光の光軸のずれを同等とすることができ、第１～第４のサブユニット６ａ～６ｄ間の配置のずれを同一の距離ｄに設定すればよく、位置決め構造を単純化することができる。その結果、第１～第４のサブユニット６ａ～６ｂの設定作業を容易にしつつ複数波長領域でのイメージングを実現できる。

詳細には、メイン筐体２に、第１～第４のサブユニット６ａ～６ｄを位置決めする突起部１５ａ～１５ｄが設けられ、これらの突起部１５ａ～１５ｄにより、第２～第４のサブユニット６ｂ～６ｄのそれぞれを第１～第３のサブユニット６ａ～６ｃのそれぞれに対して、蛍光の導光方向に垂直な方向に所定距離ｄだけシフトして位置決めするように構成されている。かかる構成を採れば、前段の他サブユニット内のダイクロイックミラーを透過することにより生じる励起光あるいは蛍光の光軸のずれに合わせて、サブユニットを前段の他のサブユニットに対して位置決めできる。その結果、４つの波長領域でのイメージングの精度を向上できる。

なお、それぞれの第２～第４のサブユニット６ｂ～６ｄの前段の第１～第３のサブユニット６ａ～６ｃに対するシフト距離ｄは、ダイクロイックミラー９ａ～９ｃによる蛍光の光路のシフト量δに応じて設定してもよい。また、このシフト量は蛍光の波長によって異なるため、前段のサブユニットに対するシフト距離ｄは、サブユニット毎に異なる値に設定されもよい。ただし、ダイクロイックミラー９ａ～９ｃによる蛍光の光路のシフト量δがほとんど変わらない場合、前段のサブユニットに対する各サブユニットのシフト距離ｄを同じ値にしてもよい。

上記実施形態においては、スキャンミラー４はＭＥＭＳミラーで構成されている。このような構成の場合、装置の小型化を容易に実現することができる。

以上、本開示の種々の実施形態について説明したが、本開示は上記実施形態に限定されるものではなく、各請求項に記載した要旨を変更しない範囲で変形し、又は他のものに適用したものであってもよい。

上記実施形態は、共焦点光学系を構成するために絞り部材としてピンホール板を用いているが、絞り部材は光束を制限する光学素子であればよく、例えば、虹彩絞りやファイバコアなどであってもよい。ファイバ出力タイプの光源を用いる場合、ファイバコア端面の位置を絞り位置（光束が制限される位置）とすればよい。

また、上記実施形態は、固体レーザやダイオードレーザなどのレーザ光源を用いることもできる。この場合、これらのレーザ光源のビームウェストの位置を絞り位置（光束が制限される位置）とすればよく、光源自体が絞り部材の役割を果たすことになる。

上記実施形態においては、扱う励起光及び蛍光の波長範囲が短い順番でスキャンミラー４側から離れる方向に第１～第４のサブユニット６ａ～６ｄが配置されていたが、波長範囲が長い順番で配置されてもよい。ただし、この場合、ダイクロイックミラー９ａ～９ｃの特性は、各サブユニット６ａ～６ｃのそれぞれで扱う比較的長波長の励起光及び蛍光を反射し、他のサブユニットで扱う比較的短波長の励起光及び蛍光を透過するような特性に設定される。

上記実施形態においては、メイン筐体は、第１のサブユニットを位置決めする第１の位置決め部と、第２のサブユニットを位置決めする第２の位置決め部とを有し、第１の位置決め部及び第２の位置決め部は、第２のサブユニットを第１のサブユニットに対して、蛍光の導光方向に交わる方向に所定距離だけシフトして位置決めしてもよい。これにより、各サブユニットからのビームの水平位置を揃えることができる。

また、この所定の距離は、蛍光の導光方向に交わる方向における、蛍光の光路のシフト量に合わせて設定されてもよい。この場合、第１のビームスプリッタを透過することにより生じる励起光あるいは蛍光の光軸のずれに合わせて第２のサブユニットを第１のサブユニットに対して位置決めできる。その結果、複数波長領域でのイメージングの精度を向上できる。

上記実施形態においては、スキャンミラーはＭＥＭＳミラーであってもよい。この場合、装置の小型化を容易に実現することができる。

また、第１のサブユニットと第２のサブユニットとは、スキャンミラーによる蛍光の導光方向に沿って、第１のサブユニットおよび第２のサブユニットの順で並んだ状態でメイン筐体に固定されてもよい。かかる構成によれば、第１及び第２のサブユニットのそれぞれから照射された第１及び第２の励起光を、第１のサブユニット内の第１のビームスプリッタを経由して顕微鏡側の試料に向けて照射することができるとともに、それに応じて試料から生じる第１及び第２の蛍光のそれぞれを、第１のサブユニット内の第１のビームスプリッタを経由して第１及び第２のサブユニット内に導入することできる。その結果、同一の装置で複数波長領域でのイメージングを実現可能となる。

またさらに、第３の励起光を出力する光源、第３の励起光に応じて試料から生じる第３の蛍光の光束を制限する第３の絞り部材、及び、第３の絞り部材を通過した第３の蛍光を検出する第３の光検出器を有する第３のサブユニットをさらに備え、第２のサブユニットは、第２の励起光及び第２の蛍光を反射し、第３の励起光及び第３の蛍光を透過する第２のビームスプリッタを有してもよい。かかる構成によれば、第２のサブユニットから出力された第２の励起光が、第２のサブユニット内の第２のビームスプリッタを反射後に第１のサブユニット内の第１のビームスプリッタを透過してからスキャンミラー及びスキャンレンズを経由して試料上に走査され、それに応じて試料上から生じた第２の蛍光が、スキャンレンズ及びスキャンミラーを経由して第１のビームスプリッタを透過した後に第２のビームスプリッタを反射してから第２のサブユニット内に入射し、第２のサブユニット内の第２の絞り部材にその像が結ばれて第２の光検出器で検出される。加えて、第３のサブユニットから出力された第３の励起光が、第２のサブユニット内の第２のビームスプリッタ及び第１のサブユニット内の第１のビームスプリッタを透過してからスキャンミラー及びスキャンレンズを経由して試料上に走査され、それに応じて試料上から生じた第３の蛍光が、スキャンレンズ及びスキャンミラーを経由して第１のビームスプリッタ及び第２のビームスプリッタを透過してから第３のサブユニット内に入射し、第３のサブユニット内の第３の絞り部材にその像が結ばれて第３の光検出器で検出される。これにより、同一の装置で３つの波長領域でのイメージングを実現可能となる。

さらに、メイン筐体は、第２のサブユニットを位置決めする第２の位置決め部と、第３のサブユニットを位置決めする第３の位置決め部とを有し、第２の位置決め部及び第３の位置決め部は、第３のサブユニットを第２のサブユニットに対して、蛍光の導光方向に交わる方向に所定距離だけシフトして位置決めしてもよい。かかる構成を採れば、第２のビームスプリッタを透過することにより生じる励起光あるいは蛍光の光軸のずれに合わせて第３のサブユニットを第２のサブユニットに対して位置決めできる。その結果、複数の波長領域でのイメージングの精度を向上できる。

また、第１のビームスプリッタの厚さと、第２のビームスプリッタの厚さは同一であってもよい。かかる構成を採れば、第１及び第２のビームスプリッタのそれぞれを透過することにより生じる励起光あるいは蛍光の光軸のずれを同等とすることができ、第１～第３のサブユニット間の配置の設定を容易にすることができる。その結果、設定作業を容易にしつつ複数波長領域でのイメージングを実現できる。

さらにまた、第１のサブユニットと第２のサブユニットと第３のサブユニットとは、スキャンミラーによる蛍光の導光方向に沿って、第１のサブユニット、第２のサブユニット、および第３のサブユニットの順で並んだ状態でメイン筐体に固定されてもよい。この場合、第１～第３のサブユニットのそれぞれから照射された第１～第３の励起光を、第１及び第２のサブユニット内の第１及び第２のビームスプリッタを経由して顕微鏡側の試料に向けて照射することができるとともに、それに応じて試料から生じる第１～第３の蛍光のそれぞれを、第１及び第２のサブユニット内の第１及び第２のビームスプリッタを経由して第１～第３のサブユニット内に導入することできる。その結果、同一の装置で３つの波長領域でのイメージングを実現可能となる。

実施形態は、共焦点顕微鏡を構成する共焦点顕微鏡ユニット及び共焦点顕微鏡を使用用途とし、ダイクロイックミラーに対して、励起光を出力する光源及び蛍光の光束を制限する絞り部材の位置を共役位置に設置したユニットを設けることで、複数波長での共焦点イメージングを容易に行うことができるものである。

Ｍ…試料、Ｐ１…接続ポート、ｄ…所定距離、１０ａ～１０ｄ…光源、１２ａ～１２ｄ…ピンホール板（絞り部材）、１３ａ～１３ｄ…光検出器、１５ａ～１５ｄ…突起部（位置決め部）、６ａ～６ｂ…第１～第４のサブユニット、９ａ～９ｃ…ダイクロイックミラー（第１～第３のビームスプリッタ）、１…共焦点顕微鏡ユニット、２…メイン筐体、３…鏡筒、４…スキャンミラー、７…スキャンレンズ、５０…顕微鏡、Ａ…共焦点顕微鏡。

Claims

顕微鏡光学系を有する顕微鏡の接続ポートに取り付けられることにより、共焦点顕微鏡を構成する共焦点顕微鏡ユニットであって、
第１の励起光を出力する光源、前記第１の励起光に応じて観察対象の試料から生じる第１の蛍光の光束を制限する第１の絞り部材、及び、前記第１の絞り部材を通過した第１の蛍光を検出する第１の光検出器を有する第１のサブユニットと、
第２の励起光を出力する光源、前記第２の励起光に応じて前記試料から生じる第２の蛍光の光束を制限する第２の絞り部材、及び、前記第２の絞り部材を通過した第２の蛍光を検出する第２の光検出器を有する第２のサブユニットと、
前記第１及び第２のサブユニットから出力された励起光を、前記試料上で走査させ、前記励起光に応じて前記試料から生じる蛍光を前記第１及び第２のサブユニットに向けて導くスキャンミラーと、
前記スキャンミラーによって走査された前記励起光を前記顕微鏡光学系に導光し、前記顕微鏡光学系によって結像された前記蛍光を前記スキャンミラーに導光するスキャンレンズと、
前記接続ポートに取り付け可能に構成され、前記スキャンミラー、前記スキャンレンズ、前記第１のサブユニット、及び前記第２のサブユニットが固定されたメイン筐体と、
を備え、
前記第１のサブユニットは、前記第１の励起光及び前記第１の蛍光を反射し、前記第２の励起光及び前記第２の蛍光を透過する第１のビームスプリッタを有し、
前記第１のサブユニットを構成する、前記第１の励起光を出力する前記光源、前記第１の絞り部材、前記第１の光検出器、及び、前記第１のビームスプリッタは、前記メイン筐体内の第１のベース板上に配置されており、
前記第２のサブユニットを構成する、前記第２の励起光を出力する前記光源、前記第２の絞り部材、及び、前記第２の光検出器は、前記メイン筐体内の第２のベース板上に配置されており、
前記メイン筐体は、前記第１のベース板を位置決めする第１の位置決め部と、前記第２のベース板を位置決めする第２の位置決め部とを有し、
前記第１の位置決め部及び前記第２の位置決め部は、前記第２のベース板を前記第１のベース板に対して、前記蛍光の導光方向に交わる方向に所定距離だけシフトして位置決めし、
前記所定距離は、前記蛍光の導光方向に交わる方向における前記蛍光の光路のシフト量を決める、前記第１のビームスプリッタの厚さ及び屈折率に応じて、設定される、
共焦点顕微鏡ユニット。
前記スキャンミラーはＭＥＭＳミラーである、
請求項１に記載の共焦点顕微鏡ユニット。
前記第１のサブユニットと前記第２のサブユニットとは、前記スキャンミラーによる前記蛍光の導光方向に沿って、前記第１のサブユニットおよび前記第２のサブユニットの順で並んだ状態で前記メイン筐体に固定されている、
請求項１又は２に記載の共焦点顕微鏡ユニット。
第３の励起光を出力する光源、前記第３の励起光に応じて前記試料から生じる第３の蛍光の光束を制限する第３の絞り部材、及び、前記第３の絞り部材を通過した第３の蛍光を検出する第３の光検出器を有する第３のサブユニットをさらに備え、
前記第２のサブユニットは、前記第２の励起光及び前記第２の蛍光を反射し、前記第３の励起光及び前記第３の蛍光を透過する第２のビームスプリッタを有する、
請求項１～３のいずれか１項に記載の共焦点顕微鏡ユニット。
前記メイン筐体は、前記第２のサブユニットを位置決めする第２の位置決め部と、前記第３のサブユニットを位置決めする第３の位置決め部とを有し、
前記第２の位置決め部及び前記第３の位置決め部は、前記第３のサブユニットを前記第２のサブユニットに対して、前記蛍光の導光方向に交わる方向に所定距離だけシフトして位置決めする、
請求項４に記載の共焦点顕微鏡ユニット。
前記第１のビームスプリッタの厚さと、前記第２のビームスプリッタの厚さは同一である、
請求項４又は５に記載の共焦点顕微鏡ユニット。
前記第１のサブユニットと前記第２のサブユニットと前記第３のサブユニットとは、前記スキャンミラーによる前記蛍光の導光方向に沿って、前記第１のサブユニット、前記第２のサブユニット、および前記第３のサブユニットの順で並んだ状態で前記メイン筐体に固定されている、
請求項４～６のいずれか１項に記載の共焦点顕微鏡ユニット。
請求項１～７のいずれか１項に記載の共焦点顕微鏡ユニットと、
前記顕微鏡光学系及び前記共焦点顕微鏡ユニットが取り付けられる接続ポートを有する顕微鏡を備える、共焦点顕微鏡。