JP4517152B2 - 染色体−特異的染色の方法および組成物 - Google Patents
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Description
剤およびある範囲の産業廃棄物、同副産物、例えばハロゲン化炭化水素、塩化ビニル、ベンゼン、ヒ素などがふくまれる(非特許文献10参照)染色体切断およびその他の異常の鋭敏な測定は、このような職業的、環境的薬剤への暴露の影響を評価するための改良された線量測定による危険評価方法論の基礎を形成することができるであろう。
増幅によって検出されるようになった(非特許文献31〜37参照)。この技術は、低い頻度で現れるCML細胞からのBCR−ABL転写の検出を可能にする。これら両技術は、細胞集団から得られた核酸を利用するので、各個の細胞に対する遺伝子型と表現型との相関はあり得ない。
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によって中期染色体上に作出されたバンディングパターンを検出しこれを解釈できるシステムの開発を必要とするであろう。化学的に染色された正常染色体を、自動化手段によって信頼性をもって同定することが非常に難しいことは分かったし、構造的異常、例えば転座を有する異常染色体を区別することはもっと難しい。慣用的にバンド化した染色体の転座の効果的な自動化検出は、10年以上にわたる精深な研究によっても完成しなかった。本発明のプローブ−作出バンディングパターンは、このような自動化検出、分析に対して適している。
International Review of Cytology, Vol.85, pp.109-146 (1983)、および D' Eustachio et al., 「Somatic Cell Genetics in Gene Families」, Science, Vol.220, pp.9, 19-924 (1983)参照のこと。遺伝子マッピングのためのプローブは、一重鎖もしくは二重鎖DNAまたはRNAの標識された断片からなり、これらは染色体DNA上の相補的座位にハイブリダイズされる。このようなプローブにおいては、関心のある座位以外の位置におけるハイブリダイゼーシヨンを最小にするような純粋な、または均一なプローブを作ることが決定的に重要であった。Henderson, 「Cytological Hybridization to Mammalian Chromosomes」, International Review of Cytology, Vol.76, pp.1-46 (1982)参照のこと。
例えばオートラジオグラフィーまたは免疫化学)のノイズによって複雑化された。このような従来技術によるシングル−コピー プローブに対するシグナルの不信頼性の故に、プローブの特異的結合座位をマップ化するためには、多数の細胞中の見かけのハイブリダイゼーションシグナルの位置の統計的分析を必要とした。
(I), PNAS USA, 83: 2934 (1986); Pinkel et al. (II), Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 51: 151 (1986)及びCremer et al., Hum. Genet., 74: 346 (1986)]および間期核中の染色体の相対的位置の決定を可能にする[Trask et al., 前記; Pinkel et al.
(I), 前記; Pinkel et al. (II), 前記; Manuelidis, PNAS USA, 81: 3123 (1984); Rappold et al., Hum. Genet., 67: 317 (1984); Schardin et al., Hum. Genet., 71: 282 (1985);及びManuelidis, Hum. Genet., 71: 288 (1985)]。
伝学的分析に対して有用な核酸プローブを作ることも本発明の目的であって、これは信頼性のあるシグナルによって染色体物質を染色する。このプローブはインシトゥ ハイブリダイゼーションに適している。本発明のある適用に対して好ましい核酸プローブは、2またはそれ以上の各標的座位を確実に染色するのに十分なコンプレキシティを有するものである。
らの各図面において、中期染色体は両染色分体に結合したプローブを伴って示されている。間期核が描かれているのは、プローブが結合する染色体の部分の複製前における細胞サイクルの段階であるので、各間期染色体に対してただ1つの染色分体があるにすぎない。プローブの結合が染色体のただ一部分のみに制限されると、シグナルは、黒または白の円として示される。このような表示は、異なった色または別の識別可能な染色特性を示すために用いられる。2つ以上の識別可能な特性(3色、色の異なった比など)を含むパターンは、ここに図示されたものよりより複雑な染色パターンを可能にする。DNA中の切断点の染色体上の位置は、異常染色体に隣接する水平線によって示される。
の近傍における核酸配列と実質的に相同な核酸配列からなる。2つの潜在的遺伝子再配列の間のこのような鑑別の例としては、急性リンパ性白血病(ALL)からのCMLの識別診断である。
ーブは、染色体−特異的ブルースクライブ(Bluescribe)プラスミドライブラリーを含み、これは標的胎児染色体とのハイフリダイゼーションの前および/または期間中に十分な数の共有反復配列が除去され、またはそのハイブリダイゼーション能力が役立たなくされたものである。
イジェストされたストランドに代わる。このプロセスに適した酵素の例は、DNAポリメラーゼIの大きな断片によって処理されたエキソヌクレアーゼIII、またはT4 DNAポリメラーゼであって、これは反応条件の変化によって両方の機能を果たすことができる。合成が完了した後、制限断片は、最初の制限断片の標識した部分が実質的に元のままに残るように、より細かな断片に分割される。この細かな断片は変性され、標識されたストランドは標識されないストランドから分離されて、ハイブリダイゼーションプローブを形成する。一重鎖プローブを用いるこの方法においては、標的DNAにハイブリダイゼーションプローブを施す前に、先ず標的DNAを、クローニングベクターからプローブDNAを切り出すために用いたのと同じ制限エンドヌクレアーゼで処理する。この処理は、標的DNAを、各末端に制限エンドヌクレアーゼの特徴である尾部を有する制限断片のコレクションに分割する。次に、標的DNAは、引っ込んだストランドを除去するエキソヌクレアーゼで処理されるが、これによって制限エンドヌクレアーゼによって導入されたカットの近傍に一重鎖DNAを露出させる。最後に、より十分に後に記載するように、例えば標準インシトゥハイブリダイゼーションプロトコル(protocol)を用いて、ハイブリダイゼーションプローブを標的DNAに適用する。
座とヒト染色体全体に対するものである。本発明の前には、インシトゥ ハイブリダイゼーションに使用されるプローブは、40kb以下、さらに代表的には数kbのオーダのコンプレキシティを有していた。
ンを包含する。本発明の染色試薬は正常な染色体と異常な染色体の顕微鏡的同定、および/またはフローサイトメトリック同定を容易にし、かつ遺伝子配列のごとき特有の異常の遺伝子的性質の特性を提供する。本明細書において、「染色体−特異的」なる文言は「標的特異的」および「領域特異的」なる文言を包含するものと定義される。すなわち、染色組成物が1個の染色体に導びかれる場合、それは染色体−特異的であるが、染色体組成物が例えば、多数の染色体における多数の領域に導かれる場合、単に1個の染色体の1領域に導かれる場合、または全ゲノムにわたる領域に導かれる場合にも、これらは染色体−特異的である。染色体−特異的なる文言は組換えDNAライブラリーを使用することに由来する。当該DNAライブラリーは本発明の最初のプローブのための源物質のごとき、単一の正常染色体から得られるDNAをクローニングすることにより作られる。1または複数の染色体の領域からのDNAから作られたライブラリーは、ゲノムのこれらの領域のプローブのためのDNAの源である。かかる源物質から形成されたプローブは領域−特異的プローブであり、これもまた“染色体−特異的”なる幅広い文言に包含される。「標的−特異的」なる文言は本明細書においては「染色体−特異的」なる文言と互換的に使用される。
数形および複数形)なる文言は、形成される染色パターンの状況において互換的に使用される。例えば、本発明に係るあるプローブが第9染色体にドットを形成し、かつ本発明に係る他のプローブが第11染色体にバンドを形成する場合、これら2つのプローブズはドット/バンド染色パターンを形成する1つのプローブを構成する。
う。それ故、ハイブリダイゼーション感受性が増加するほど、あるコンプレキシティ例えば100kbのプローブは、現在確実に検出されるよりも多くのゲノムの遺伝子座を相当に検出することをユーザに可能とする。従って、より多くの情報が同じコンプレキシティのプローブから得られるであろう。“コンプレキシティ”なる文言はそれ故、如何に多くの可視化的に個別の遺伝子座が検出されようとも、すなわちゲノムを越えた標的座位の分散にかかわらず、全プローブのコンプレキシティに関係する。
来の特性によるもので、実質の核酸配列によるものではない。さらに、化学的染色により形成されたバンディングパターンは中期染色体に関して解明できるにすぎず、これに対して本発明のプローブ−形成バンドは中期および間期染色体の両者の解明に有効である。
数10万まで配列でき、その中で反復DNAのAluファミリー(Alu family)は後者の非常に多い変種の典型的なものである。反復のコピーはクラスターされ(clustered)、またはゲノムからインタスパーズされる(interspersed)。反復物はゲノム、例えば各染色体の動原体の近くに生じる反復配列、および多数のタンデム反復(VNTRs)における1または複数の場所でクラスターされる。[Nakamura et al, Science, 235: 1616 (1987)];反復物はシングル染色体から分散されてもよい。[例えば、反復物はBardoni等, Cytogenet. Cell Genet., 46: 575 (1987)により記述されたごとくX染色体上でのみ発見された]。反復物は全染色体、例えば反復配列のAluファミリーから分散されてもよい。
和することができるならば、標的染色体は他の染色体の明度の2倍である(コントラスト比2)。何故ならば、標的染色体はプローブにおける特異的配列および共有配列からのシグナルを含み、これに対して他の染色体は共有配列からのシグナルを有するにすぎないためである。従って、プローブにおける共有配列のハイブリダイゼーションを適度に減少させることのみが、実質的にコントラストを高める。非標的配列にのみハイブリダイズする汚染した配列例えばライブラリー中の不純物は、同配列が染色コントラストを有効レベル以下には低下させない限度において、プローブ中に許容できる。
propotions)とは、使用されるハイブリダイゼーション条件のもとで核酸断片が染色体DNAと安定なハイブリッドを形成するほど相補性が十分に広い範囲であることを意味する。特に、かかる文言は、不均一混合物の核酸断片が標的染色体物質に完全には相補的ではない配列のある領域を有している状況を含んでいる。厳格性(stringency)は、ハイブリダイゼーションのために要求された相補性の精度を制御することにより調整することができる。
明確に異なる。従って、本発明に係る方法および試薬は類似の疾患の差別診断を提供する。
略語
BN −NP−40を伴うビカーボネート緩衝液
DAPI −4,6−ジアミジノ−2−フェニルインドール
DCS −フルオロセイン−アビジンDCS(フルオロセインAvidan
Dの商業的に入手できるセルソータグレイド)
AAF −N−アセトキシ−N−2−アセチル−アミノフルオレン
EDTA −エチレンジアミンテトラアセテート
FACS −フルオロセイン−アクティベイティド セル ソーティング
FITC −フルオロセイン イソチオシアネート
IB −分離緩衝液
NP−40 −Sigma as Nonidet P−40(St.Louis, MO)から
商業的に入手できる非イオン界面活性剤
PBS −フォスフェード−ブァファード サリン
PI −プロピジウム アイオダイド
PMSF −フエニルメチルスルフォニル フルオライド
PN緩衝液 −0.1M NaH2PO4と0.1M Na2HPO4の混合物
pH8;0.1%NP−40
PNM緩衝液 −非脂肪ドライミルク(遠心分離)を伴うPn緩衝液;0.02%
Naアジド
SDS −ソジウム ドデシル サルフェート
SSC −0.15M NaCl/0.015M Naサイトレート,pH7
VNTR −可変数タンデム反復(variable number tandem repeat)。
I.A 染色体−特異的DNAの分離とDNA断片ライブラリーの形成
本発明に係る組成物を調製する好ましい第1ステップは、染色体−特異的DNAを分離することである。(この文言は上記したごとく標的−特異的および/または領域−特異的DNAを包含するもので、その特異性はDNAの起源に起因する)。同ステップは第1に、染色組成物が導かれる十分な量の特定の染色体タイプまたは染色体サブリージョンを分離すること、その後分離された染色体または染色体サブリージョンからDNAを抽出すること含む。ここで“十分な量”とは本方法のその後のステップを遂行するに十分な量のことを意味する。好ましくは、抽出されたDNAは標準的な遺伝子工学技術を用いてクローニングすることによりDNAインサートを形成するために使用される。
ベクターであり、より好ましくはカロン4A(Charon 4A)、カロン21A(Charon 21A)、カロン35(Charon 35)、カロン40(Charon 40)およびGEM11である。好ましいコスミドはロウリスト4(Lawrist4)、ロウリスト5(Lawrist5)およびsCos1を含む。
特定の全染色体(whole chromosome)(特異的染色体タイプ)を分離するための好ましい手段は、インタースペシフィック ハイブリッドセル システムを使用するか否かにかかわらず、中期染色体のダイレクト フロー ソーティング(フルオロセンス−アクティベイティド セル ソーティング)による手段である。ある種にとって、全ての染色体は慣用の有効なソーティング技術により分離できる。全てではないが、多くのヒト染色体は一般にフロー ソーティングによりヒト細胞から分離できる。[Carrano et al., 「Measurement and Purification of Human Chromosomes by Flow Cytometry and Sorting」, Proc. Natl Acad Sci., Vol. 76, pp.1382-1384 (1979)]。従って、ヒト染色体の分離にはヒト/ゲッシ動物 ハイブリッド セル システムが必要である。[Kao, 「Somatic Cell Genetics and Gene Mapping」, International Review of Cytology., Vol.85, pp.109-146 (1983)、 Gusella et al.,「Isolation and Localization of DNA Segments from Specific Human Chromosomes」, Proc. Natl.Acad. Sci., Vol.77, pp.2829-2833 (1980)]を参照。染色体ソーティングは商業的に入手できるフルオルセン−アクティベイティド ソーティングマシン、例えばベクトン ディキンソン FACS−II(Becton Dickinson FACS-II)、カウルター エピシス V ソーター(Coulter Epics V sorter)、または染色体ソーティングに活用できる特殊目的のソーターまたはこれに類似する機器により行われる。
領域−特異的染色体DNAを分離するのに使用できる方法には、下記の方法が含まれる。前もってマップ化されたDNA、例えばマップ化されたコスミドのライブラリーからの適宜の染色体領域の選択:例えばFACSによる誘導染色体のソーティング:選択された染色体の微視的解体:減ハイブリダイゼーション:所望の染色体断片を含み、DNAを抽出するとともに増幅し、かつ所望の増幅されたDNAを選択する適宜のハイブリッドセルの同定:放射線ハイブリッドからの適宜の染色体物質の選択。サブセクションI.A.1で概略的に記載した標準的遺伝子工学技術は、本技術分野の周知の手法で使用される。領域−特異的DNAの増幅は、適宜のベクターでクローニングすることにより、適宜の細胞系で増殖することより、および/またはPCRの使用により遂行できる(後述のI.B.を参照)。
あるケースにおいては、不均一混合物の核酸断片はー重鎖RNAまたはDNAからなることが好ましい。ある条件のもとでは、一重鎖核酸プローブの結合効率(binding efficiency)は例えばコックス等の下記の文献にしめされているように、インシトゥ ハイブリダイゼーションの間により高くなることが発見された。[Cox et al., 「Detection of mRNAs in Sea Urchin Embryos by In Situ Hybridization Using Asymmetric RNA Probes」, Developmental Biolgy, Vol.101, pp.485-502 (1984)]。
発展された方法は、プロメガ バイオテック(Promega Biotec) [Madison,WI]から商品名「リボプローブ」(Riboprobe)として商業的に入手できる。本発明とともに使用する好ましい他の転写キットは、商品名“ジェネスクライブ”(Genescribe)としてユナイティッド
ステイト バイオケミカル コーポレイション(クレベランド,OH)(United States
Biochemical Corporation)から入手できる。ー重鎖DNAプローブは一重鎖バクテリオファージM13にて形成することができ、例えばベセスダ リサーチ ラボラトリー(ガイサーバーグ,MD)(Bethesda Research Laboratories) (Gaitherburg,MD)等のキットホームの状態で入手できる。図4に示すハイブリダイゼーションは、ブルースクライブ プラスミド ベクター(ストラタジェン,ラ ジョラ,シーエー)(Stratagene, La Jolla,CA )中でサブクローンされた[表1]のライブラリーで遂行された。ブルースクライブプラスミドはRNAプロモータを含み、同RNAは一重鎖プローブの形成を可能とする。
本発明に係るプローブを形成する他の方法は、ポリメラーゼ鎖反応[PCR]の使用を含む。[PCRのメカニックの説明として、Saiki et al., Sciense, 230: 1350 (1985)、USP Nos.4,683,195、 4,683,202 (1987,7,24)、 4,800,159 (1989,1,24)]。上記したごとく、分離された標的−特異的核酸配列はPCRによって増幅でき、反復配列の少ないまたは皆無である標的−特異的配列を形成する。かかる手法に使用されたPCRプライマーは、反復配列の末端のためのものであり、反復物によりフランクされた配列の増幅をもたらす。
本発明に係るプローブは典型的には、以下の幾多のステップにより形成される。ゲノムの標的領域に相補的である核酸配列源を得るステップ。同配列が標的物質に能率的にハイブリダイズしかつそれらが結合した後検出し得るように、同配列を標識しまたはその他の処理を行うステップ。ハイブリダイゼーション能力を無能力化しまたは共有反復配列の十
分な量を除去し、またはかかる配列を無能力化しかつ除去すべく同配列を処理するステップ。これらのステップの順序は、採用される特定の方法に依存する。
シングル−コピー プローブは、ゲノムの標的領域に含まれるシングルコピー配列に相補的である核酸断片からなりたっている。かかるプローブを構成するー方法は、標的領域をクローニングにより形成されたDNAライブラリーで始めることである。ライブラリーにおけるクローンの中には、全配列がシングル−コピーであるDNAを含むであろうし、他のものは反復配列を含むであろうし、またさらに他のものはシングル−コピー配列および反復配列の部分を持つであろう。個々のクローンによる選択、およびシングル−コピー配列のみを含んでいるこれらのクローンのプーリングは、標的領域に特異的にハイブリダイズするプローブをもたらす。クローンのシングル−コピーの性質は最終的には、標準技術を使用するサザン ハイブリダイゼーションにより確認される。図4Hは、第4染色体ライブラリーからこの方法で選択された120クローンによるハイブリダイゼーションを示す。
核酸のピース、例えばクローンのハイブリダイゼーション特異性は、インシトゥ ハイブリダイゼーションにより試験できる。適宜のハイブリダイゼーション条件のもとで、上記ピースが所望の標的領域としての特異的なシングル−コピーまたは反復配列に結合するならば、同ピースはプローブに包含できる。染色体−特異的反復配列[Trask et al., supra, (1988) and references therein],VNTRs,多数のマップ化されたシングルコピー配列等のごとく、特異的ハイブリダイゼーション特性を持っている多くの配列がすでに知られている。もっと多くのものが連続的にマップ化されている。かかる配列は本発明のプローブに包含できる。
ヒトゲノムのごとく多くのゲノムにおいて、共有反復DNAの主要部分はAluのごとき高度に反復された配列の若干のファミリーに含まれている。このような高度コピー反復配列を実質的に含んでいないプローブは、多くの適用において有効な染色コントラストを形成するであろう。かかるプローブは核酸配列のある源、例えば第1表のライブラリーから比較的簡単な集団固定法で形成できる。それ故、かかる集団固定法はかかる適用にとって好ましい方法である。
ハイブリダイゼーション混合物における二重鎖プローブ核酸は変性され、その後ハイブリダイゼーション条件のもとで高度コピー配列のための十分な時間プローブ中でインキュベートされて、実質的に二重鎖配列となる。ハイブリダイゼーション混合物はその後サンプルに適用される。高度に反復された配列の残留している標識されたー重鎖コピーは、サンプルのいたるところに結合し、弱くかつ幅広く分散されたシグナルを形成する。ゲノムの標的領域のための特異的な低度コピー配列の多様な結合は、容易に識別し得る特異的シグナルを形成する。
ハイブリダイゼーション混合物には、ハイブリダイゼーション能力を抑制することが望まれる配列と相補的である標識されない核酸配列が添加される。必要によりプローブおよびブロッキング核酸は変性され、また適宜のハイブリダイゼーション条件もとでインキュベートされる。ブロックされるべき配列は他のものより早く二重鎖配列になるため、ハイブリダイゼーション混合物が標的物質に適用される場合には同標的物質に結合することはできない。あるケースにおいては、ブロッキング反応はインキュベート期間が極めて短縮できるほど早く生じ、ハイブリダイゼーション混合物が変性後直ちに標的物質に適用される場合には十分な結果が得られる。ブロッキング方法は一般にシーリイ等により下記の文献に記述され、かかる文献は参考文献として取り入れられる。[Sealy et al, 「Removal of Repeat Sequence form Hybridization probes」, Nucleic Acid Research, 13: 1905(1985)]。ブロッキング核酸の実施例はゲノムDNA、ゲノムDNAの高度コピーフラクションおよび下記(i−iii)に概略的に示したごとく特定の配列を含んでいる。
ゲノムDNAは生物の核酸配列の全てを、それらのゲノムにおけるコピー数に比例して
含む。従って、ゲノムDNAをハイブリダイゼーション混合物に添加することは、高度コピー反復配列の濃度を低度配列より増加し、それ故前者をブロッキングするのにより効果的である。しかしながら、ゲノムDNAは標的物質に対して特異的である配列のコピーを含み、同ゲノムDNAがあまりにも多く添加される場合には所望の染色体−特異的結合を減少するであろう。添加すべきゲノムDNA量を決定するガイドライン(後述の3.e.項のQの概念を参照)、およびゲノムブロッキングDNAを使用する実施例は下記に提供される。ゲノムDNAのブロッキング効果性はある条件のもとでは、そのハイブリダイゼーション混合物への添加タイミングの調整により高めることができる。かかるタイミング調整の実施例は、後述の図4B〜図4E(プロトコルI)および図4F(プロトコルII)に示されたプロトコルIおよびプロトコルII ハイブリダイゼーションで提供され、またセクションVIに詳述されている。
ゲノムDNAの使用での難しさは、同ゲノムDNAもまた低度コピー配列のハイブリダイゼーションをブロックすることであり、かかるブロックは所望の標的染色を与える配列に対して支配的である。従って、単に高度コピー配列のみを得るためにゲノムDNAを分別すること、およびこれらをブロッキングに使用することはこの困難性を克服する。かかる分別は例えば、後述(3c.i.)するごとくハイドロオキシアパタイトで行うことができる。
プローブにおける特定の配列のブロッキングは、同配列の標識されないコピーを多く添加することにより成し遂げられる。例えば、プローブにおけるAlu配列は、クローン化されたAluを添加することによりブロックできる。ヒトゲノムにおける最高度コピー配列を含んでいるわずかなクローンの混合物から調製されたブロッキングDNAは、染色体−特異的ライブラリー例えば[表1]のライブラリーとともに効果的に使用できる。1または複数の染色体−特異的ライブラリーからの標識されない核酸配列は、1または複数の他の染色体−特異的ライブラリーからの標識された配列を含んでいるプローブをブロックするのに使用できる。共有配列はブロックされ、標的染色体上にのみ存在する配列は影響されない。図4Fは、ゲノムDNAがヒト第21染色体および他の末端動原体型染色体の動原体型領域により共有された配列、または配列類のハイブリダイゼーションを完全にブロッキングするには効果的ではないことを示している。これらの配列または配列類を含んでいるクローンまたはクローンズが最終的に分離されると、これから形成された標識されないDNAは染色の特異性を改良するためにゲノムブロッキングDNAに添加される。
3c.i.ハイドロオキシアパタイト
一重鎖核酸および二重鎖核酸は、ハイドロオキシアパタイトに対して異なる結合特性を持っている。かかる特性は核酸を分別するのに一般的に使用される基礎を提供する。ハイドロオキシアパタイトは商業的に入手できる(例えば、Bio-Rad Labratories, Richmond, CA)。最高度コピー数からシングルコピー数までの反復の特定の度合の配列を含んでいるゲノムDNAのフラクションは、ゲノムDNAを変性し、それを適宜の条件のもとでCotの特定の値に再結合することを許容することにより得られ、それに続いてハイドロオキシアパタイトを使用する分離に付される。一重鎖核酸および二重鎖核酸もまた、S1ヌクレアーゼの使用により識別できる。かかる技術およびCotの概念はブリテン等により以下の文献に説明されており、かかる文献は参考文献として本明細書に取り入れられている(Britten et al., 「Analysis of repeating DNA Sequences by Reassociation」, in Method in Enzymololgy, Vol.29, pp. 363-418 (1974))。
シアパタイトにより分離でき、かつプローブとして使用できる。従って、ブロックされた配列(二重鎖となる)は物理的に除去される。その後、プローブは必要とするまで保存される。その後、プローブは添加ブロッキング核酸なしに使用でき、またはその染色コントラストは多分添加ブロッキング核酸により改良できる。
特定の配列の除去は、一重鎖「吸収」(absorbing)核酸配列をソリッドサポート(solid support)に付着することによっても遂行できる。一重鎖源核酸は固定された核酸にハイブリダイズされる。ハイブリダイゼーション後、未結合配列は収集されプローブとして使用される。例えば、ヒトゲノムDNAはヒトプローブから反復配列を吸収するために使用できる。かかる方法の一つの方法がブリソン等により以下の文献に記述されており、かかる文献は参考文献として取り入れられている[Brison et al.,「General Method for Cloning Amplified DNA by Differential Screening with Genomic Probes」, Molecular and Cellular Biology, Vol.2, pp.578-587 (1982)]。簡単に言えば、わずかに奪い取られたヒトゲノムDNAは、ジアゾニウムセルロースまたはその類似のサポートに結合される。断片に適宜にカットされた源DNAは固定されたDNAに対してハイブリダイズされ、約1〜100のCot値になる。ハイブリダイゼーション条件の好ましいストリンジェンシイは、DNAのベース組成により変化する。かかる手法は染色体−特異的ライブラリー、例えば[表1]のライブラリーから反復配列を除去し、全ヒト染色体を染色し得るプローブを形成する。
標的ゲノムにおける非標的結合座位を、標識されない相補的反復配列によるハイブリダイゼーションを行うことによりブロックすることは、結合する潜在力を持つプローブにおける標識された配列の結合を阻止する。例えば、標識されないゲノムDNAによるハイブリダイゼーションは、標的ゲノム二重鎖に高度コピー反復配列を与える。プローブにおけるかかる配列の標識されたコピーは、プローブがその後に適用される場合結合することができない。
上記3b.i.セクションで示したごとく、プローブにおける高度コピー反復のハイブリダイゼーション能力を抑制することと、標的−特異的配列の結合を抑制することによる所望のシグナル強度を減すこととの間の最適な妥協を図るためには、正確な量のゲノムDNAを添加することが必要である。次のディスカッションは、ゲノムの標的領域からのDNAをクローニングすることにより形成された、または同DNAの広がり(streches)をクローニングとは異なる他の複製により形成されたプローブをともなうゲノムブロッキングDNAの使用に関するものである。従って、プローブはシングルコピー、染色体−特異的反復配列、および標的において発見される共有反復配列の典型的なサンプリングを含んでいる。かかるプローブは、コンプレキシティがゲノムの小さな領域、例えばいくつかの接近されたコスミドクローンから誘導された100kbから、例えば[表1]からの多数のライブラリーのコンビネーションである数億ベースまでの範囲のものである。下記のディスカッションは例示的であり、異なる核酸が使用される他の状況にまで拡大できる。下記のQのディスカッションは、本発明を如何に進行すべきかに関する一般的なガイドライン
を与えることのみを意図したものである。
不均一混合物のー重鎖および二重鎖核酸断片を標識するにはいくつもの技術がある。これらの方法は放射線的標識の結合を含んでいる。例えば、ハーパー等[Harper et al., Chromosoma, Vol. 83, pp.431-439 (1984)];フルオロクロムまたは酵素の直接付着(direct attachment)、例えばスミス等[Smith et al., Nucleic Acids Reserch, Vol.13, pp.2399-2412 (1986),およびコノリイ等[Connolly et al., Nucleic Acids Research, Vol.13, pp.4485-4502 (1985)];免疫化学的または他のアフィニティリアクションにより核酸断片を検出し得るようにする同断片の種種の化学的変更、例えばテーン等[Tchen et al., 「Chemically Modified Nucleic Acids as Immunodetectable Probes in Hybridization Experiments」, Proc. Natl. Acad. Sci., Vol.81, pp.3466-3470 (1984)];リチャードソン等[Richardson et al., 「Biotin and Fluorescent Labeling of RNA Using T4 RNA Ligase」, Nucleic Acids Reserch, Vol.11, pp.6167-6184 (1983)];ランガー等[Langer et al., 「Enzymatic Synthesis of Biotin-Labeled Polynucleotides: Nucleic Acid Affinity Probes」, Proc. Natl. Acad. Sci., Vol.78, pp.6633-6637 (1981)];ブリガティ等[Brigati et al., 「Detection of Viral Genomesin Cultured Cells and Paraffin-Embedded Tissue Sections Using Biotin-Labeled Hybridization Probes」, Virology, Vol.126, pp.32-50 (1983)];ブロカー等[Broker et al., 「Electron Microscopic Visualization of tRNA Genes Ferrin-Avidin: Biotin Labels」, Nucleic Acids Research Vol.5, pp.363-384 (1978)];ベヤー等[Bayer et al.,「The Use of the Avidin Biotin Complex as a Tool in Molecular Biology」, Methods of Biochemical Analysis, Vol.26, pp.1-45 (1980);クールマン[Kuhlmann, Immunoenzyme Techniques in Cytochemistry (Weinheim, Basel, 1984)]、ランガー−サファー等[PNAS USA,79: 4381 (1982)];ランデゲント等[Exp. Cell Res., 153: 61 (1984)];ホップマン等[Hopman et al., Exp. Cell Res., 169: 357(1987)]。典型的な標識化手段はこれらを含み、これらの手段においてプローブ断片はビオチニル化され、N−アセトキシ−N−2−アセチルアミノフルオレンで変更され、フルオロセインで変更され、水銀/TNPリガントで変更され、スルホン化され、ジゴキシゲニン化され、またはT−Tダイマを含む。
染色体に対する本発明に係る不均一混合物の適用は、標準的なインシトゥ ハイブリダイゼーション技術により遂行される。技術上の幾多の優れたガイドが役に立つ。例えばガルおよびパードゥ[Gall and Pardue, 「Nucleic Acid Hybridization in Cytological Preparations」, Methods in enzymology, Vol. 21, pp.470-480 (1981)]、例えばヘンダーソン[Henderson, 「Cytological Hybridization to Mammalian Chromosomes」, International Review of Cytology, Vol.76, pp.1-46 (1982)];例えばアンゲラー等[Angerer, et al., 「In Situ Hybridization to Cellular RNAs」, in Genetic Engineerng: Principles and Methods, Setlow and Hollaender, Eds., Vol.7, pp.43-65 (Plenum Press,New
York, 1985)]。したがって、これらの文献は参考文献として取り入れられる。
の効率的なインキュベーション時間、濃度、および温度の決定は、固定方法およびプローブ核酸(例えばDNAまたはRNA)の型を含む種種の変動要因に依存する。
V.A.ヒト第21染色体に特異的な染色試薬の製造および使用
V.A.1.第21染色体の分離および第21染色体−特異的ライブラリーの構造
ヒト染色体−特異的ライブラリーからのDNA断片は、ナショナル ラボラトリー ジーン ライブラリー プロジェクト(National Laboratory Gene Library Project)から、アメリカン タイプ カルチャー コレクション[American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, MD.]を通して入手可能である。第21染色体からのDNA断片は、フスコー等により記載された手法[Fuscoe et al., in 「Construction of Fifteen Human Chromosome-Specific DNA Libraries from Flow-Purified Chromosome」, Cytogenet. Cell Genet., Vol.43, pp.76-86 (1986)]で造られ、この文献は参考文献として取り入れられる。簡単に言えば、ヒト二倍体繊維芽細胞培養は新生児***組織から確立された。細胞の染色体はファン デン エンフ等のMgSO4法[van den Enph et al., Cytometry, Vol.5, pp.108-123 (1984)]により分離され、蛍光染料−ヘキスト33258およびクロモマイシンA3−で染色された。第21染色体はピータース等[Peters et al., Cytometry, Vol.6, pp290-301 (1985)]により述べられたローレンス リバーモア ナショナル ラボラトリーの高速ソーターにより分離された。
びBHB2690から調製されたインビトロ抽出物を用いてファージパーチクルに組み込まれた。簡単に言えば、両抽出物は音波処理により調製されてインビボパッケージング(in vivo packaging)のときに組み合わされた。これらの抽出物は野生型ラムダDNAを、マイクログラムあたり1−5×108プラークフォーミングユニット(pfu)の効率でパッケージした。結果として生じたファージは、プラークが一緒に成長するのを阻止しまた異なる組換え物の成長率の差を最小にするために、約104pfu/150mmディッシュの密度で8時間、E.コリLE392上で増幅された。ファージはプレートごとに10mlのSM緩衝液(50mMトリスHCl pH7.5,10mM MgSO4,100mM NaCl,0.01%ゼラチン)中で、4℃で12時間穏やかに揺り動かすことにより溶離された。それからプレートは余分の4mlのSMでリンスされた。細胞の破片をペレット化した後、ファージ浮遊液はクロロホルムによって4℃で貯えられた。
非反復配列インサートを有するクローンはベントンおよびデービスの方法[Benton and Davis, Science, Vol.196, pp.180-182 (1977)]により分離される。簡単に言えば、約1000の組換えファージが第21染色体−特異的ライブラリーからランダムに分離される。これらはニトロセルロースに移されてニックトランスレートされた全ゲノムヒトDNAでプローブされる。
でシールされる。37℃で一晩のインキュベーションの後、スライドは45℃で洗浄(50%ホルムアミド−2×SSC pH7,3回3分、続いて2×SSC pH7,5回2分)されて、BN緩衝液(0.1Mソジウムビカーボネート,0.05%NP−40,pH8)に浸される。この時点以後、スライドは決して乾燥させてはならない。
フスコー等[Fuscoe et al., Genomics, 5: 100-109 (1989)]は、多数のシングルコピー配列または非常に低いコピー数の反復配列クローンを組換えファージライブラリーから選択するための、すぐ上(V.A.2)で述べた方法よりもっと効率的な手法を提供して、第21染色体を染色するためのその使用につき実証している。前記記事はこれにより参考として取り入れられる。簡単に言えば、クローンは2つの基本的手法を用いて(ヒト第21染色体のDNAから造られた)カロン21Aから選択された。第1に、ファージライブラリーは、クローン内の反復配列の存在に対しセクションV.A.2.の方法よりもっと敏感になるように案出された方法を用いて2つのステージに区別された。それから選択されたクローンはプラスミドにサブクローンされた。このようにして選択された450のインサートがライブラリーpBS−U21を形成する。第2は複数ステップの処理からなり、そこでは、1)LL21NS02からのインサートはブルースクライブプラスミドにサブクローンされ、2)プラスミドはニトロセルロースのフィルター上のバクテリアコロニー中で高密度で増殖され、3)放射性ヒトゲノムDNAがニトロセルロースのフィルター上のプラスミドDNAに2ステップの低い厳格性でハイブリダイズされ、4)ハイブリダイズされなかったインサートを有するプラスミドがシングルコピー配列を備えている可能性があるものとして選択された。このようにして5030のコロニーが選び出されて、ライブラリーpBS−U21/1530を形成した。
ピンケル等[Pinkel et al., PNAS(USA), 85: 9138-9142 (December 1988)]は、第4染色体シングルコピー配列を調製する手法および、次いで前記シングルコピー プローブをヒト中期スプレッドにハイブリダイズするためのプロトコル{ピンケル等[Pinkel et al;
PNAS(USA), 83: 2934-2938 (1986)]}に記載された手法の変形を記載している。図4Hは第4染色体からの120のシングルコピー プローブのプールでのヒト中期スプレッドに対するハイブリダイゼーションを示す。
VI.A.ブロッキングDNAを使用した第21染色体−特異的染色
高濃度の標識されていないヒトゲノムDNAとラムダファージDNAが標的染色体に対し反復およびベクターDNA配列結合を抑制するのに使用された。重質プロテイナーゼのダイジェスションとこれに続く標的の固定は標的DNAに対するプローブのアクセスを改良する。
カバースリップがラバーセメント共にスライド上に置かれて、スライドは37℃で一晩インキュベートされた。その後スライドの調製はセクションV.B.で述べた手法で進められた(ここでは第21染色体DNAはフルオレセインで染色されて全染色体DNAはDAPIで対比染色された)。図1A−Cはその結果を示す。図1Aはコンピュータ画像分析装置で得られたヒト中期スプレッドのDAPI像である。これは全てのものをしきい値以上は白でそれ以外は黒で示すバイナリーイメージである。基本的データは256の強度レベルの灰色レベル像で記録された。(小さい矢印は第21染色体の位置を示す。)図1Bは図1Aと同じスプレッドの、これもバイナリー形式での、フルオレセイン像である。(ここでも小さい矢印は第21染色体の位置を示す。)図1Cは、他のより淡く染色されたものが標準的イメージ処理技法で除かれた後の第21染色体の位置を示す。
セクションVI.A.で説明したごとく、共有反復配列を含むヒト染色体−特異的ライブラリーは、標識しないヒトゲノムDNAでのインキュベーションにより共有反復配列のハイブリダイゼーションキャパシイティが減少されていれば、その染色体を染色するのに使用することが出来る。セクションVI.A.では、不均一な混合物の核酸配列がファージベクターカロン21A中でクローンされ、そこではベクターDNAのインサートの比は約0.1(40kbのベクターに対し平均4kbのインサート)である。このセクションでは、より小さいクローニングベクター、約3キロベースのブルースクライブプラスミド、に対して同じインサートの転移することが、ベクターDNAに対するインサートの比を0.5に増大させて、染色の特異性と強さを改良したことを実証する。
YACS.7つの酵母クローンHY1,HY19,HY29,HYA1.A2,HYA3.A2,HYA3.A9およびHYA9.E6がD.バーク(Washington University, St.Louis, MO)から得られた。クローン中のヒトDNAの長さは約100kbから600kbの範囲であった。ゲル電気泳動がこれらのインサートのサイズを確かめるために行われた。これらの各クローンは増殖されて全てのDNAが分離された。分離されたDNAはチミジンの10−30%がビオチン−11−dUTPで置換されるようにニックトランスレーションによりビオチン化された。ニックトランスレーション後の全ての標識されたD
NAの濃度は10−20ng/μlの範囲内だった。
上記ピンケル等(1988)の手法で詳述され上記セクションV.C.およびVI.B.で例示されたと本質的に同じハイブリダイゼーションおよび染色条件が、この例では使用された。この例では、ヒト第19染色体の一つのコピーを含むハムスター−ヒト雑種細胞からの400ngのビオチン標識されたDNAが、10μlのハイブリダイゼーション混合物中で、1.9μgの標識されていないヒトゲノムDNAと混合された。ハイブリダイゼーションは37℃でおよそ60時間であった。結合プローブの蛍光染色と染色体の対比染色は上述の他の例と同様であった。図6は、ハイブリダイゼーションの結果を示す。
この発明は、細胞上において細胞ベースで、顕微鏡的なまたある場合にはフローサイトメトリー的な遺伝的異常の検出を可能にする。検鏡は全て人間の観察者によりなされてもよいし、完全なオートメーションにいたるまでの種々の程度の付加的器具の使用および算出方法の助成手段を含んでもよい。このような分析のための器具の使用やオートメーションは多くの利点を与える。その中には、人間の観察者には不可視な蛍光染料(例えばインフェアードダイ(infared dyes))の使用や、同時的には可視でない多重標識法(例えば蛍光および吸収染色、オートラジオグラフィー等の組合せ)で得られた結果を判断する機会
がある。量的測定は人間の観察者では検出できない染色の差を検出するのに使用できる。以下に述べるごとく、オートメーション化された分析は、細胞および染色体が分析される速度を増大させることもできる。
中期スプレッドによる自動的な染色体の分類および異常検出のためのオートメーション化されたシステム(特にコンピューター制御顕微鏡)の開発に向けて、過去30年間相当な努力がなされてきた。近年は、種々の染色体タイプ上にはっきり認識できるバンディングパターンを生ずるように化学的に染色された染色体の自動分類に努力が向けられてきた。これらの努力は、おおよそ同じサイズの染色体タイプの間のバンディングパターンの微妙な差のために、また異なる中期中の染色体の特質的な収縮は各タイプの染色体上に見られるバンドの数および幅の変化の原因となるので、ごく部分的にしか成功していない。本発明は、間隔、幅および標識の差異(例えば異なる色)がオートメーション化された染色体の分類および異常検出を容易にするように最適化される染色パターンを生じる試薬の構成を可能にすることにより、これらの問題を克服する。このことは、ハイブリダイゼーションプローブが染色体の長さに沿って所望のように選択できるので可能である。このような試薬により生じるバンドのサイズは、単一の小さいドットから一つまたはそれ以上の染色体を本質的に一様に覆うものまでの範囲に及ぶであろう。従って本発明は、隣接したハイブリダイゼーションドメインが例えば色により見分けられるような、ハイブリダイゼーションプローブの構成、および好ましくは蛍光のような標識手段の使用を可能にし、これにより分解するには空間的に余りにも接近しているバンドもスペクトル的に検出される(すなわち、もし赤と緑の蛍光を発するバンドが合体していれば、この2つのバンドの存在は結果として生じる黄色の蛍光により検出される)。
良する。
生物学的線量法への一つの接近手段は、潜在的に有毒な薬剤に暴露された個体により被った遺伝学的損傷の兆候として、構造的に異常な染色体の頻度を測定することである。多数の研究が、染色体異常誘発物と呼ばれる電離性放射線およびその他の薬剤に対する暴露の増大と共に構造的異常の頻度が増大することを示している。二動原体染色体は、その特徴のある性質がバンド分析なしに速やかに記録することを可能とするので、最も普通に記録される。作業場で見いだされるレベルに暴露された個体におけるこのような異常は低い頻度(〜2×10−3/細胞)であるので、速やかな分析が重要である。遺憾ながら、二動原体は安定して維持されないので測定された二動原体の頻度は暴露後の時間と共に減少する。従って、長時間にわたる低レベルの暴露は、異常が連続的に除去されるので結果的に高い二動原体頻度とはならない。転座は多かれ少なかれいつまでも維持されるのでこのような線量法的研究のための記録にはより適した異常である。従って、遺伝子損傷の評価を暴露後長時間たったときに行うことが出来る。転座は、それを見分けることの困難さが線量法のために充分な数の細胞を記録することを論理的に不可能にするので、生物学的線量法のためには日常的に記録されない。
出生前に発見される最も普通の異常は、第21染色体(ダウン症候群)、第18染色体(エドワード症候群)および第13染色体(パトー症候群)ならびにX0染色体(ターナー症候群)、XXY染色体(クラインフェルター症候群)およびXYY染色体の異常を伴う三染色体性である。構造的異常も生じる。しかしながら、これらはまれであってその臨床的重要性もしばしば不確実である。従って、これらの異常を検出することの重要性は疑問である。羊水穿刺や絨毛生検の様な伝統的な核型のために胎児細胞を得る今の技法は、分析のための百から千の細胞をもたらす。これらは通常細胞遺伝学的分析に充分な***細
胞を作り出すために、2から5週間培養基中で増殖される。中期スプレッドが調製されれば、伝統的バンド分析で分析される。このような処理は高度に熟練した分析家によってのみ実行できまた時間を浪費するので、最大の細胞遺伝学研究所によるものでも信頼性を持ってなされる分析の数は年に数千だけである。結果的に、出生前の細胞遺伝学的分析は通常、子供に遺伝病の高いリスクがある婦人(例えば35才以上の婦人)に限られている。
p.277-295 (Academic Press,N.Y.,1982) および Siebers et al., Humangenetik, 28:273
(1975)]。
J1D8 HB10096
P1B5 HB10097
両ハイブリドーマの培養は1989年4月4日にATTCにより受け入れられて1989年4月14日に生育可能と報告された。
近年の多数の研究は、特定の病気の表現型の診断に役立ちまた病気それ自身の遺伝学的性質への手がかりを提供する、構造的および数的染色体の異常の存在を明らかにした。著名な例には、慢性骨髄性白血病と第9および第22染色体に伴う転座との密接な関連、13q14の部位の欠失と網膜芽細胞腫との関連および第8および第14染色体に伴う転座とバーキットリンパ腫との関連が含まれる。新種の腫瘍の特異的異常を明らかにする今日の進歩は、細胞遺伝学的分析のための代表的な高品質のバンデッド中期スプレッドを造ることの困難性により制限されている。これらの問題は、多くのヒト腫瘍は培養基中で増殖させることが困難または不可能であるという事実に由来する。従って、***細胞を得ることは普通は困難である。たとえ細胞が培養基中で増殖できたとしても、増殖する細胞が腫瘍集団を代表するものでないという少なからぬ危険がある。この困難性はまた存在する遺伝学的知識を臨床的診断および予後に応用することを妨げる。
リダイゼーションプローブを選択することにより、間期評価分析はますます具体的に行うことが出来る。選択された染色体上の特定の転座は、ぴったりと切断点を側面から攻撃するハイブリダイゼーションプローブの使用により検出できる。これらのプローブの使用は特定の病気の表現型の診断を可能にする。これらは正常では分離されているハイブリダイゼーションドメインを一緒にし、またはハイブリダイゼーションドメインを2つのはっきり分離されたドメインに分離するので、転座は間期において検出できる。これに加えて、これらは治療の途中で悪性細胞の減少および再出現をフォローするために使用できる。このような応用では、存在するかも知れない細胞が少数であり、またそれらは刺激して有糸***させることが困難または不可能であるかも知れないので、間期分析が特に重要である。
重複および欠失、遺伝子増幅およびヘテロ接合度がなくなることに伴うプロセスも、本発明の技法を用いて中期および間期において検出できる。そのようなプロセスは異なる腫瘍の数の増大に関連している。
このセクションは、本質的に全てのCML患者において融合BCR、ABL配列のわきに位置する第9及び第22染色体からのプローブを用いるFISHに基づくCML試験について詳述する(図8)。このセクションの例において用いられたBCR、ABLプローブは、米国イリノイ州シカゴのユニバーシティオブシカゴメディカルセンターの血液学/腫瘍学セクション、デパートメントオブメディシンのカロル エイ.ウエストブルックによって好意的に提供された。
200kb離れているであろう。マップは(尺度は別として)ハイスターカンプ等(非特許文献49)から改作したBCR−ABL融合遺伝子が示されている。CMLにおいて、PEM12は常に結合に位置するであろうが、c−hu−ablはPEM12から25ないし225kb離れているであろう。
Research Laboratories Nick-Translation System)。ABLプローブは、同様にビオチン−11−dUTP(Enzo Diagnostics)を用いてニック−トランスレートされた。
G. Nogueria, J. Immunol. Methods, 43:349(1981)(非特許文献45)にマウントされ、FITC/テキサス赤色二重バンド通過フィルターセット(Omega Optical)を用い、ツァイスアキシオスコープにより検査される。
結果.ABLおよびBCRハイブリダイゼーション座位は、たいていの中期スプレッド中の染色体の両染色分体上に見られた。正常な個体からの中期スプレッドと結合したABLプローブは、9qのテロメア近くにあるが(図9A)、BCRプローブは22q11において結合している(図9B)。正常な間期核へのABLまたはBCRによるハイブリダイゼーションは、典型的には両相同染色体上の標的配列に対応した2つの小さな蛍光点を生じた。これらの点は、二次元的核イメージ内に外見上ランダムに分布しており、通常はよく分離していた。少数の細胞は、2つのダブレットハイブリダイゼーションシグナルを示したが、これはたぶんDNAのこの領域を複製した細胞内の両相同の両姉妹染色分体(すなわち細胞サイクルのS−またはG2−フェイズにおけるそれら)へのハイブリダイゼーションの結果であろう。正常なG1核へのABL(赤色)、BCR(緑色)プローブの二重カラーFISHは、核の周囲にランダムに分布した2つの赤色(ABL)および緑色(BCR)ハイブリダイゼーションシグナルを生じた。
核分析においては、750個の正常核中の9個が互いに1ミクロン以下の分離の赤色と緑色のハイブリダイゼーションシグナルを示した。かくして、正常細胞の約1%が異常として分類された。
うに、その赤色−緑色の対は小さな末端動原体型染色体の長い腕のテロメアにごく近接していた(図9C)。1人の患者(CML−6)は、古典的細胞遺伝学によって、22q11に染色体物質の挿入を有すると考えられた。この患者からの中期スプレッドへの二重カラーハイブリダイゼーションは、小さな染色体内に中心的に位置する赤色−緑色の対を示した(図9D)。この結果は、挿入によるBCR−ABL融合遺伝子の形成と合致する。1人の患者(CML−1)では、2対の赤色−緑色ダブレットシグナルが150個中3個(2%)の間期核において見られた。これは、これらの細胞中のダブルPh1(またはダブル融合遺伝子)を示す。このような事象は、25の中期スプレッドの分析に限定されていた標準的細胞遺伝学によっては検出されなかった。付加的Ph1の取得は、芽球化に伴う最も頻度の高い細胞遺伝学的事象であつて、その細胞遺伝学的検出によつて、疾患の加速を予告することができるであろう。
一般に一重鎖DNAハイブリダイゼーションプローブを調製してこれを二重鎖標的DNAに適用する方法は、標的DNAとプローブDNAの両方を同一の制限エンドヌクレアーゼで処理することとこれに続く制限切断端付近での一重鎖のダイジェスションを含んでいる。プローブはダイジェストされた一重鎖を標識されたヌクレオチドで再合成することにより構成される。標識された鎖は標的DNAのダイジェストされていない一重鎖と本質的に相補的である。標識された一重鎖を含む二重鎖DNA断片はより小さいピースに切断されて変性される。ハイブリダイゼーションプローブは標識された一重鎖断片を標識されて
いない断片から分離することにより得られる。
(1981)]に従ってなされ、この手法はリグビー等[Rigby et al., J. Mol. Biol., Vol.113, pg.237 (1977)]により開示された基本的ニックトランスレーション技法の改作物である[例えばDNA 1マイクログラム当たり1ユニットのE.コリポリメラーゼIが、100mMのNaCl,50mMのトリス−HCl(pH8.0),10mMのMgCl2,1mMのジチオトレイトールおよび50mMのKClからなる溶液中で37℃でインキュベートされる]。また溶液の中には適切な量のトリフォスフェート前駆体(そのひとつまたはそれ以上は標識されている)も含まれている(例えば各50−100マイクロモル濃度のものを、制限断片1ミリリットル当たり20−50マイクログラム)。これらの条件のもとで、再合成は約40−60分で終わる。
ngineering: Principles and Methods, Setlow and Hollaender, Eds., Vol.7, pp.43-65
(Plenum Press, New York, 1985)]を使用してなされる。よって、これらの文献は、インシトゥ ハイブリダイゼーションにおける本発明の実施の指針として参考に取り入れられる。簡単に言えば、本発明に従って調製されたプローブは、非特異的結合の減少、プローブされる生物学的構造の無欠性の維持、その他のために、いくつかの他の薬剤と組み合わされる。結果として生じる混合物は、ここではハイブリダイゼーション混合物と呼ぶ。以下に、この方法はヒト第21染色体の染色体−特異的染色に適用される。
ライブラリー プロジェクトから入手可能[Van Dilla et al., 「Human Chromosome-Specific DNA Libraries: Construction and Availability」, Biotechnology, Vol.4, pp.537-552 (1986)]である。代わりに、そのような断片は上に引用したファンディラ等、またはフスコー等[Fuscoe et al., 「Construction of Fifteen Human Chromosome-Specific DNA Libraries from Flow-Purified Chromosomes」, Cytogenet Cell Genet., 43:79-86(1986)]の開示に従って造ることもできる。
顕微鏡による像が乾燥したスライド上に殆ど残らないように調整される。ハイブリダイゼーション混合物は(最終濃度で)、2×SSC(0.15M NaClおよび0.015Mソジウムナイトレート)、10%のデキストランサルフェート、500μg/mlのキャリヤDNA(音波処理されたニシン***DNA)および2.0μg/mlのビオチン−標識されたプローブDNAからなっている。この混合物はガラスのカバースリップの下に3μl/cm2の密度でスライドに適用されてラバーセメントでシールされる。37℃で一晩のインキュベーションの後、スライドは45℃で洗浄(50%ホルムアミド−2×SSC pH7,3回3分、続いて2×SSC pH7,5回2分)されて、BN緩衝液(0.1Mソジウムビカーボネート,0.05%NP−40,pH8)に浸される。この時点以後、スライドは決して乾燥させてはならない。
本発明の以上の実施例の記述は例証および説明の目的で提示された。それらは網羅的であるとか、または本発明を開示されたまさにその形態に限定することを意図するものではなく、上記教示に照らして明らかに多くの変更や変形が可能である。実施例は本発明の原理と実際の適用を最もよく説明し、これによりこの技術に熟練した他の者が本発明を種々の実施例でまた期待される特定の用途適合した種々の変更と共に最もよく利用することが可能となるようにするために、選ばれ記述された。ここに添付する特許請求の範囲により本発明の技術的範を定義することが意図されている。
の間の、ローレンスリバーモアナショナルラボラトリーの運営のための契約書第W−7405−ENG−48号に従って、本発明における権利を有する。
Claims (1)
- 染色体異常である遺伝子転座を検出する為に間期細胞中の標的となる染色体DNAを染色する方法であって、以下の工程を含む方法:
(a)2又はそれ以上の核酸プローブの混合物を調製する工程、ここで各プローブは、遺伝子転座と関連する切断点領域に隣接する、及び/又は該切断点領域を部分的に又は完全に含んで延びる核酸配列と相補的な核酸配列を有し、異なる配列及び/又はサイズを有する核酸断片であり、異なる標識で標識されている、
(b)該核酸プローブの混合物と標的となる染色体DNAとをインシトゥ ハイブリダイゼーションによって反応させる工程、及び
(c)各プローブによって染色された領域の近接を観察し、該間期細胞中に該転座が存在するか否かを決定する工程。
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