DE69034245T2

DE69034245T2 - Verfahren und Zusammensetzung für chromosomenspezifische Färbung

Info

Publication number: DE69034245T2
Application number: DE69034245T
Authority: DE
Inventors: Joe W. Livermore Gray; Douglas Dept. Of Pathology Tkachuk (113), Seattle; Daniel Walnut Creek Pinkel
Original assignee: University of California
Current assignee: University of California
Priority date: 1989-12-01
Filing date: 1990-08-08
Publication date: 2008-03-13
Anticipated expiration: 2010-08-09
Also published as: IE20070380A1; JP2008283989A; EP0885971A3; DE69032920D1; JPH03224499A; EP0430402B2; ATE366323T1; DE69034245D1; AU5898790A; IE902727A1; EP0430402B1; KR910012263A; EP0885971A2; DK0885971T3; DE69032920T2; ATE176281T1; EP0430402A3; JP3771934B2; JP2005304508A; DE69032920T3

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die Erfindung bezieht sich allgemein auf das Gebiet der Zytogenetik und im besonderen auf das Gebiet der molekularen Zytogenetik. Die Erfindung betrifft Verfahren zum Färben von chromosomaler Ziel-DNA, um eine chromosomale Amplifikation oder Deletion nachzuweisen, und Kits dafür.
Obwohl hier die meisten Beispiele menschliche Chromosomen betreffen und ein Großteil der Terminologie auf humane Bezüge gerichtet ist, ist das Konzept der Verwendung von Nukleinsäuresonden zum Färben oder Anfärben von Chromosomen auf Chromosomen jeder Herkunft, was sowohl Pflanzen als auch Tiere einschließt, anwendbar.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Chromosomenanomalien sind mit genetischen Störungen, degenerativen Erkrankungen und der Einwirkung von Mitteln, von denen bekannt ist, dass sie degenerative Erkrankungen, insbesondere Krebs, bewirken, assoziiert; German, "Studying Human Chromosomes Today", American Scientist, Bd. 58, S. 182-201 (1970); Yunis, "The Chromosomal Basis of Human Neoplasia", Science, Bd. 221, S.227-236 (1983); und German, "Clinical Implication of Chromosome Breakage", in Genetic Damage in Man Caused by Environmental Agents, Berg, Hrsg., S. 65-86 (Academic Press, New York, 1979). Chromosomenanomalien können unterschiedlichen Typs sein und beinhalten unter anderem: zusätzliche oder fehlende einzelne Chromosomen, zusätzliche oder fehlende Teile eines Chromosoms (segmentale Duplikationen oder Deletionen), Brüche, Ringe und Chromosomenumordnungen. Chromosomale oder genetische Umordnungen beinhalten Translokationen (Übertragung eines Stücks von einem Chromosom auf ein anderes Chromosom), dizentrische Chromosomen (Chromosome mit zwei Zentromeren), Inversionen (Umkehrung der Polarität eines Chromosomensegments), Insertionen, Amplifikationen und Deletionen.
Nachweisbare Chromosomenanomalien treten mit einer Häufigkeit von eins zu 250 menschlichen Geburten auf. Anomalien, welche Deletionen oder Additionen von Chromosomenmaterial beinhalten, verändern das Gengleichgewicht eines Organismus und führen allgemein zum Tod des Fetus oder zu schweren geistigen und körperlichen Defekten. Das Down-Syndrom kann durch das Vorliegen von drei Kopien des Chromosoms 21 anstelle der normalen zwei hervorgerufen werden. Dieses Syndrom ist ein Beispiel für einen Zustand, der durch eine anomale Chromosomenzahl oder Aneuploidie hervorgerufen wird. Das Down-Syndrom kann auch durch eine segmentale Duplikation einer Subregion auf Chromosom 21 (wie z.B. 21q22), welche auf Chromosom 21 oder auf einem anderen Chromosom vorliegen kann, hervorgerufen werden. Das Edward-Syndrom (18+), das Patau-Syndrom (13+), das Turner-Syndrom (XO) und das Kleinfelter-Syndrom (XXY) zählen zu den häufigsten zahlenmäßigen Aberrationen. [Epstein, The Consequences of Chromosome Imbalance: Principles, Mechanisms and Models (Cambridge Univ. Press 1986); Jacobs, Am. J. Epidemiol, 105:180 (1977); und Lubs et al., Science, 169:495 (1970).]
Retinoblastom (del 13q14), Prader-Willi-Syndrom (del 15qII-q13), Wilms-Tumor (del 11p13) und Cri-du-chat-Syndrom (del 5p) sind Beispiele für wichtige, mit Erkrankungen verbundene strukturelle Aberrationen. [Nora and Fraser, Medical Genetics: Principles and Practice, (Lea and Febiger 1989).]
Messungen der Häufigkeit von Chromosomen mit strukturellen Aberrationen, beispielsweise von dizentrischen Chromosomen, welche durch erbsubstanzverändernde Mittel, wie z.B. ionisierende Strahlung oder chemische Mutagene, hervorgerufen sind, werden breit als quantitative Indikatoren der durch solche Mittel verursachten genetischen Schädigung eingesetzt; Biochemical Indicators of Radiation Injury in Man (International Atomic Energy Agency, Vienna, 1971); und Berg, Hrsg. Genetic Damage in Man Caused by Environmental Agents (Academic Press, New York, 1979). Eine große Zahl potentiell karzinogener und teratogener Chemikalien ist aufgrund industrieller und landwirtschaftlicher Tätigkeit in der Umwelt weit verbreitet. Diese Chemikalien schließen Pestizide und eine Palette industrieller Abfälle und Nebenprodukte ein, wie z.B. halogenierte Kohlenwasserstoffe, Vinylchlorid, Benzol, Ar sen und dergleichen; Kraybill et al., Hrsg., Environmental Cancer (Hemisphere Publishing Corporation, New York, 1977). Empfindliche Messungen von Chromosomenbrüchen und anderen Anomalien könnten die Grundlage für verbesserte Methodologien der Dosimetrie und Risikoabschätzung zur Evaluierung der Folgen der Einwirkung solcher berufs- und umweltbedingter Mittel bilden.
Die gegenwärtigen Verfahren für genetisches Screening und biologische Dosimetrie beinhalten die Analyse von Karyotypen. Ein Karyotyp ist der spezielle Chromosomenbestand eines Individuums oder einer verwandten Gruppe von Individuen, definiert durch die Zahl und Morphologie der Chromosomen, üblicherweise in der mitotischen Metaphase. Er beinhaltet Dinge wie z.B. die Gesamtzahl der Chromosomen, die Kopienzahl der einzelnen Chromosomentypen (z.B. die Zahl von Kopien des Chromosoms X) und die chromosomale Morphologie, z.B. gemessen als Länge, Zentromerindex, Verbundensein oder dergleichen. Chromosomenanomalien können durch Untersuchung der Karyotypen nachgewiesen werden. Karyotypen werden in konventioneller Weise durch Anfärben von Metaphasechromosomen oder in anderer Weise (beispielsweise durch vorzeitige Chromosomenkondensation) kondensierter Chromosomen eines Organismus bestimmt. Kondensierte Chromosomen werden verwendet, da es bis vor kurzem nicht möglich war, Interphasechromosomen sichtbar zu machen, was auf ihren dispersen Zustand und das Fehlen sichtbarer Grenzen zwischen ihnen im Zellkern zurückzuführen ist.
Mehrere, auf chemischen Färbungen beruhende zytologische Techniken sind entwickelt worden, welche ein Längsmuster auf kondensierten Chromosomen erzeugen, das allgemein als Banden bezeichnet wird. Das Bandenmuster jedes Chromosoms in einem Organismus erlaubt üblicherweise die eindeutige Identifizierung jedes Chromosomentyps; Latt, "Optical Studies of Metaphase Chromosome Organization", Annual Review of Biophysics and Bioengineering, Bd. 5, S. 1-37 (1976). Der genaue Nachweis einiger wichtiger Chromosomenanomalien, wie z.B. Translokationen und Inversionen, hat solche Bandenanalysen erfordert.
Unglücklicherweise erfordert eine solche Bandenanalyse das Kultivieren von Zellen und die Präparation von Metaphasespreitungen hoher Qualität, was zeit- und arbeitsaufwendig und häufig schwierig oder undurchführbar ist. Beispielsweise sind Zellen vieler Tumorarten schwierig zu kultivieren, und es ist nicht klar, dass die kultivierten Zellen die ursprüngliche Tumorzellpopulation repräsentieren. Fetale Zellen, die kultiviert werden können, müssen mit invasiven Mitteln gewonnen und über mehrere Wochen kultiviert werden, um genügend Metaphasezellen für die Analyse zu erhalten. In vielen Fällen erlauben die Bandenmuster auf den anomalen Chromosomen keine eindeutige Identifizierung der Teile der normalen Chromosomen, aus welchen sie gebildet sind. Eine solche Identifizierung kann wichtig sein, um die Lage wichtiger, von der Anomalie betroffener Gene anzuzeigen. Außerdem sind die Empfindlichkeit und Auflösungskraft der gegenwärtigen Verfahren zur Karyotyp-Bestimmung dadurch begrenzt, dass multiple Chromosomen oder Chromosomenregionen sehr ähnliche Färbungscharakteristiken aufweisen und dass Anomalien (wie z.B. Deletionen), welche nur den Bruchteil einer Bande betreffen, nicht nachweisbar sind. Daher sind solche Verfahren im wesentlichen auf die Diagnose und detaillierte Analyse von benachbarte Gene betreffenden Syndromen (engl.: "contiguous gene syndromes"), wie z.B. partielle Trisomie, Prader-Willi-Syndrom [Emanuel, Am. J. Hum. Genet., 43:575 (1988); Schmickel, J. Pediatr., 109:231 (1986)] und Retinoblastom [Sparkes, Biochem. Biophys. Acta., 780:95 (1985)] beschränkt.
Die konventionelle Bandenanalyse weist somit mehrere wichtige Limitationen auf, welche die folgenden beinhalten. 1) Sie ist arbeitsaufwendig, zeitaufwendig und erfordert einen hochgeübten Analytiker. 2) Sie kann nur auf kondensierte Chromosomen angewendet werden. 3) Sie erlaubt nicht den Nachweis struktureller Aberrationen, welche weniger als 3-15 Megabasen (MB), abhängig von der Art der Aberration und der Auflösung der Bandendarstellungstechnik, betreffen [Landegren et al., Science, 242:229 (1988)]. Diese Erfindung liefert Sondenzusammensetzungen und Verfahren, um solche Limitationen konventioneller Bandenanalysen zu überwinden.
Die chemischen Färbemethoden des Stands der Technik liefern aus Gründen, welche nicht gut verstanden sind, Genommuster, die nicht nach Bedarf für den Einsatz bei verschiedenen Anwendungen modifiziert werden können. Solche chemischen Färbungsmuster wurden zum Kartieren der Bindungsstelle von Sonden eingesetzt. Eine In situ-Hybridisierung wurde jedoch nur gelegentlich und unter großem Aufwand eingesetzt, um eine gewisse Information über die Position einer Läsion, beispielsweise einer Bruchstelle bezogen auf eine spezielle DNA-Sequenz, zu gewinnen. Die vorliegende Erfindung überwindet die Inflexibilität der chemischen Färbung, indem sie ein Genom mit einem Muster färbt, das auf der Nukleinsäuresequenz basiert; das Muster kann daher durch Ändern der Nukleinsäuresequenz der Sonde je nach Bedarf verändert werden. Die mittels Sonde erzeugten erfindungsgemäßen Färbungsmuster liefern verlässliche Markierungen, welche für die zytogenetische Analyse nützlich sind.
Der automatisierte Nachweis struktureller Anomalien von Chromosomen mit einer Bildanalyse chemisch gefärbter Banden würde die Entwicklung eines Systems erfordern, das die auf Metaphasechromosomen durch konventionelle Techniken erzeugten Bandenmuster nachweisen und auswerten kann. Es hat sich als sehr schwierig erwiesen, normale Chromosomen, die chemisch gefärbt worden waren, mit automatisierten Mitteln verlässlich zu identifizieren; es ist noch viel schwieriger, anomale Chromosomen mit Strukturanomalien, wie z.B. Translokationen, zu differenzieren. Ein wirkungsvoller automatisierter Nachweis von Translokationen bei konventionell mit Banden versehenen Chromosomen ist nach über einer Dekade intensiver Arbeit nicht zustande gebracht worden. Die mittels Sonden erzeugten erfindungsgemäßen Bandenmuster sind für einen solchen automatisierten Nachweis und eine solche automatisierte Analyse geeignet.
In den letzten Jahren haben sich rasche Fortschritte bei der Untersuchung der Chromosomenstruktur und ihrer Beziehung zum genetischen Gehalt und zur DNA-Zusammensetzung ergeben. Zum Teil kam der Fortschritt in Form verbesserter Verfahren der Genkartierung, basierend auf der Verfügbarkeit großer Mengen reiner, durch gentechnologische Verfahren produzierter DNA- und RNA-Fragmente als Sonden, z.B. Kao, "Somatic Cell Genetics and Gene Mapping", International Review of Cytology, Bd. 85, S. 109-146 (1983) und D'Eustachio et al., "Somatic Cell Genetics in Gene Families", Science, Bd. 220, S. 9, 19-924 (1983). Die Sonden zur Genkartierung umfassen markierte Fragmente einzelsträngiger oder doppelsträngiger DNA oder RNA, welche an komplementäre Stellen der chromosomalen DNA hybridisiert werden. Im Zusammenhang mit solchen Sonden ist es höchst wichtig, reine oder homogene Sonden zu erzeugen, um die Hybridisierungen an andere Orte als die interessierende Stelle möglichst gering zu halten; Henderson, "Cytological Hybridization to Mammalian Chromosomes", International Review of Cytology, Bd. 76, S. 1-46 (1982).
Das Hybridisierungsverfahren beinhaltet das Auftrennen oder Aufschmelzen der doppelsträngigen Sonden-Nukleinsäuren und Ziel-Nukleinsäuren durch Erhitzen oder andere Mittel (außer die Sonden-Nukleinsäure und Ziel-Nukleinsäure sind einzelsträngige Nukleinsäuren). Dieser Schritt wird manchmal als Denaturieren der Nukleinsäure bezeichnet. Wenn das Gemisch aus Sonde und Ziel-Nukleinsäuren abkühlt, rekombinieren oder reassoziieren ("Annealing") die Stränge, welche komplementäre Basen aufweisen. Wenn eine Sonde mit einer Ziel-Nukleinsäure reassoziiert, kann die Lage der Sonde auf der Ziel-Nukleinsäure durch eine von der Sonde getragene Markierung oder durch gewisse intrinsische Eigenschaften der Sonde oder des Sonde-Ziel-Doppelstranges nachgewiesen werden. Wenn die Ziel-Nukleinsäure in ihrer natürlichen biologischen Umgebung verbleibt, z.B. DNA in Chromosomen, mRNA in Cytoplasma, Teilen von Chromosomen oder Zellkernen (wenn diese auch durch Präparationstechniken fixiert oder verändert sind), wird das Hybridisierungsverfahren als In situ-Hybridisierung bezeichnet.
Sonden für In situ-Hybridisierung waren anfänglich darauf beschränkt, die Lage von Genen oder anderen gut definierten Nukleinsäuresequenzen auf Chromosomen oder in Zellen zu identifizieren. Vergleiche der Kartierung von Einzelkopie-Sonden an normalen und anomalen Chromosomen wurden verwendet, um Chromosomenanomalien zu untersuchen. Cannizzaro et al., Cytogenetics and Cell Genetics, 39:173-178 (1985). Die Verteilung der multiplen Bindungsstellen repetitiver Sonden konnten ebenfalls bestimmt werden.
Die Hybridisierung mit Sonden, welche eine Zielstelle in einem haploiden Genom aufweisen, Einzelkopie- oder Einmalsequenz-Sonden, sind verwendet worden, um die Lage spezieller Gene im Genom zu kartieren [Harper und Saunders, "Localization of the Human Insulin Gene to the Distal End of the Short Arm of Chromosome 11", Proc. Natl. Acad. Sci., Bd. 78, S. 4458-4460 (1981); Kao et al., "Assignment of the Structural Gene Coding for Albumin to Chromosome 4", Human Genetics, Bd. 62, S. 337-341 (1982)]; solche Hybridisierungen sind jedoch nicht verlässlich, wenn die Größe der Zielstelle klein ist. Da die Menge an Zielsequenz für Einzelkopie-Sonden niedriger Komplexität gering ist bildet nur ein Teil der potentiellen Zielstellen in einer Zellpopulation Hybride mit der Sonde. Die Kartierung der Lage der spezifischen Bindungsstelle der Sonde ist daher durch Hintergrundsignale kompliziert worden, welche durch nicht-spezifisches Binden der Sonde und auch durch Rauschen im Nachweissystem (beispielsweise Autoradiographie oder Immunchemie) erzeugt werden. Die Unverlässlichkeit der Signale für solche Einzelkopie-Sonden des Stands der Technik hat eine statistische Analyse der Positionen der scheinbaren Hybridisierungssignale in multiplen Zellen erforderlich gemacht, um die spezifische Bindungsstelle der Sonde zu kartieren.
Unterschiedliche repetitive Sequenzen können unterschiedliche Verteilungen auf Chromosomen aufweisen. Sie können, wie in der eben zitierten Referenz, über alle Chromosome verteilt sein, oder sie können in kompakten Regionen des Genoms, wie z.B. auf den Zentromeren der Chromosomen, konzentriert sein, oder sie können andere Verteilungen aufweisen. In manchen Fällen ist eine solche repetitive Sequenz vorwiegend auf einem einzigen Chromosom lokalisiert, und ist daher eine chromosomenspezifische repetitive Sequenz. [Willard et al., "Isolation and Characterization of a Major Tandem Repeat Family from the Human X Chromosome", Nucleic Acids Research, Bd. 11, S. 2017-2033 (1983).]
Eine Sonde für repetitive Sequenzen, welche allen Chromosomen gemeinsam ist, kann verwendet werden, um zwischen Chromosomen verschiedener Species zu unterscheiden, wenn die Sequenz spezifisch für eine der Species ist. Die gesamte genomische DNA aus einer Species, welche reich an solchen repetitiven Sequenzen ist, kann in dieser Weise verwendet werden. [Pinkel et al. (III), PNAS USA, 83:2934 (1986); Manuelidis, Hum. Genet., 71:288 (1985) und Durnam et al., Somatic Cell Molec. Genet., 11:571 (1985)].
In jüngster Zeit gibt es eine größere Verfügbarkeit von Sonden für wiederholte Sequenzen (repetitive Sonden), welche stark und spezifisch an ausgewählte Chromosomen hybridisieren. [Trask et al., Hum. Genet., 78:251 (1988) und dort zitierte Referenzdokumente]. Solche Sonden sind nun für mehr als die Hälfte der menschlichen Chromosomen verfügbar. Im allgemeinen binden sie an wiederholte Sequenzen auf kompakten Regionen des Ziel-Chromosoms nahe dem Zentromer. Von einer Sonde wurde jedoch berichtet, dass sie an das menschliche Chromosom 1p36 hybridisiert, und es gibt mehrere Sonden, die an das menschliche Chromosom Yq hybridisieren. Die Hybridisierung mit solchen Sonden erlaubt die rasche Identifizierung von Chromosomen in Metaphasespreitungen, die Bestimmung der Kopienzahl ausgewählter Chromosomen in Interphasezellkernen [Pinkel et al. (I), PNAS USA, 83:2934 (1986); Pinkel et al. (II), Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 51:151 (1986) und Cremer et al., Hum. Genet., 74:346 (1986)] und die Bestimmung der relativen Positionen von Chromosomen in Interphasezellkernen [Trask et al., siehe oben; Pinkel et al. (I), siehe oben; Pinkel et al. (II), siehe oben; Manuelidis, PNAS USA, 81:3123 (1984); Rappold et al., Hum. Genet., 67:317 (1984); Schardin et al., Hum. Genet., 71:282 (1985); und Manuelidis, Hum. Genet., 71:288 (1985)].
Viele Anwendungen sind jedoch immer noch durch das Fehlen geeigneter Sonden beschränkt. Beispielsweise waren, bis die hier beschriebenen Verfahren erfunden wurden, Sonden mit einer für die pränatale Diagnostik ausreichenden Spezifität für Chromosom 13 oder 21 nicht verfügbar. Außerdem sind repetitive Sonden für den Nachweis struktureller Aberrationen nicht sehr brauchbar, da die Wahrscheinlichkeit, dass die Aberrationen die Region betreffen, an welche die Sonde hybridisiert, gering ist.
Diese Erfindung überwindet die Limitationen des Stands der Technik hinsichtlich des Einsatzes der Sonden und erhöht die Anwendung der In situ-Hybridisierung für die zytogenetische Analyse dramatisch. Wie oben dargestellt, sind Sonden des Stands der Technik für eine tief greifende zytogenetische Analyse nicht brauchbar. Einzelkopie-Sonden niedriger Komplexität erzeugen beim derzeitigen Stand der Hybridisierungstechnologie keine verlässlichen Signale. Obwohl repetitive Sonden verlässliche Signale liefern, können solche Signale wegen der fixierten Verteilung der repetitiven Sequenzen in einem Genom nicht auf unterschiedliche Anwendungen zugeschnitten werden. Die hierin beschriebenen Sonden kombinieren die Hybridisierungsverläßlichkeit repetitiver Sonden mit der Flexibilität, dass das Bindungsmuster der Sonde auf jede gewünschte Anwendung zugeschnitten werden kann.
Die verbesserten Fähigkeiten dieser Sonden beruhen auf ihrer höheren Komplexität. Das Erhöhen der Komplexität einer Sonde erhöht die Wahrscheinlichkeit und daher die Intensität der Hybridisierung an die Zielregion, erhöht jedoch auch die Wahrscheinlichkeit unspezifischer Hybridisierungen, welche zu Hintergrundsignalen führen. Im erfindungsgemäßen Konzept wurde jedoch berücksichtigt, dass solche Hintergrundsignale ungefähr zufällig über das Genom verteilt sein würden. Als Nettoergebnis ergibt sich daher, dass die Zielregion mit erhöhtem Kontrast gegen solche Hintergrundsignale visualisiert werden könnte.
Hierin sind beispielhaft Sonden mit einem ungefähren Komplexitätsbereich von etwa 50.000 Basen (50 kB) bis zu hunderten Millionen Basen dargestellt. Solche repräsentativen Sonden eignen sich für kompakte Loci und ganze menschliche Chromosome. Vor dieser Erfindung wiesen die für In situ-Hybridisierungstechniken eingesetzten Sonden Komplexitäten unter 40 kB und noch typischer in der Größenordnung von wenigen kB auf.
Das Färben von Chromosomenmaterial mit diesen Sonden unterscheidet sich signifikant vom chemischen Färben nach dem Stand der Technik. Die Spezifität der von den Sonden erzeugten erfindungsgemäßen Färbung resultiert aus einer völlig neuen Quelle – der Nukleinsäuresequenz in einem Genom. Die erfindungsgemäßen Färbungsmuster können daher so konzipiert werden, dass sie grundlegende genetische Informationen, die wichtig für spezielle Anwendungen sind, hervorheben.
Die hierin beschriebenen Methoden zur Konstruktion von Sonden jeder gewünschten Spezifität liefern signifikante Fortschritte für ein breites Spektrum zytogenetischer Studien. Die Analyse kann an Interphasezellkernen durchgeführt werden. Die hierin beschriebenen Techniken können besonders vorteilhaft für Applikationen sein, wo eine Bandendarstellung hoher Qualität mittels konventioneller Methoden schwierig ist oder wo vermutet wird, dass diese eine fehlerhafte Information liefert, z.B. in der Tumorzytogenetik. Reagenzien, welche auf Stellen von Läsionen zielen, die als diagnostisch oder prognostisch wichtig bekannt sind, wie z.B. für Tumorarten spezifische Translokationen, erlauben eine rasche Erkennung solcher Anomalien. Wo die Analysengeschwindigkeit im Vordergrund der Überlegungen steht, beispielsweise beim Nachweis von durch toxische Umwelteinflüsse hervorgerufenen Chromosomenaberrationen geringer Häufigkeit, erlauben die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen eine dramatische Erhöhung der Nachweiseffizienz im Vergleich zu früheren, auf konventioneller Chromosomen-Bandendarstellung basierenden Techniken.
Des Weiteren wird das pränatale Screening auf mit Krankheiten verbundene Chromosomenaberrationen (Beispielsweise Trisomie 21) durch den raschen Nachweis solcher Aberrationen mit den hierin beschriebenen Verfahren und Zusammensetzungen verbessert. Die hierin beschriebene Interphasen-Aneuploidie-Analyse ist für die pränatale Diagnostik dadurch besonders bedeutsam, dass sie raschere Ergebnisse liefert als sie durch Zellkulturverfahren zur Verfügung stehen. Ferner können fetale, vom mütterlichen Blut abgetrennte Zellen, welche nicht mittels Routinemethoden kultiviert und daher nicht mit konventionellen Techniken zur Bestimmung des Karyotyps analysiert werden können, durch die erfindungsgemäßen Verfahren und Zusammensetzungen untersucht werden. Außerdem verbessern Intensität, Kontrast und Farbkombinationen der Färbungsmuster in Verbindung mit der Fähigkeit des Zuschneidens der Muster auf spezielle Anwendungen die Möglichkeiten für eine automatisierte zytogenetische Analyse, beispielsweise mittels Durchflußzytometrie oder computergestützter Mikroskopie und Bildanalyse.
Diese Anmeldung beschreibt spezifisch Verfahren für den Nachweis chromosomaler Amplifikationen und Deletionen. Eine repräsentative derart nachgewiesene Amplifika tion, ist die eines Fusionsgens-BCR-ABL-, das diagnostisch für chronischmyeloische Leukämie (CML) ist.
Chronisch-myeloische Leukämie (CML) ist eine neoplastische Proliferation von Knochenmarkzellen, die auf genetischer Ebene durch die Fusion des BCR-Gens und des ABL-Gens auf den Chromosomen 9 und 22 charakterisiert ist. Diese Fusion beinhaltet üblicherweise eine reziproke Translokation t(9;22)(q34;q11), welche das zytogenetisch charakteristische Philadelphia-Chromosom (Ph¹) erzeugt. Jedoch können auch komplexere Umordnungen eine BCR-ABL-Fusion bewirken. Auf der molekularen Ebene kann die Fusion durch Southern-Analyse oder durch In vitro-Amplifikation der mRNA des Fusionsgens unter Verwendung der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) nachgewiesen werden. Diese Techniken sind empfindlich, können aber nicht auf Einzelzellen angewendet werden.
Ein empfindliches Verfahren zum Nachweis von Chromosomenanomalien und – noch spezifischer – genetischer Umordnungen, wie beispielsweise der mit CML assoziierten, tumorspezifischen Umordnungen, wäre ein höchst nützliches Werkzeug für genetisches Screening. Diese Erfindung stellt ein solches Werkzeug zur Verfügung.
Die folgenden Zitate werden im nachfolgenden Text mit den angegebenen Nummern angeführt:

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Die Fusion des Proto-Onkogens c-ABL aus dem langen Arm des Chromosoms 9 mit dem BCR-Gen von Chromosom 22 ist ein konsistenter Befund bei CML (1-3). Diese genetische Veränderung führt zur Bildung eines BCR-ABL-Transkripts, das translatiert wird, wobei ein Protein mit 210 kd gebildet wird, das bei praktisch allen Fällen von CML vorhanden ist (4-6). In 90% der Fälle resultiert das Fusionsgen aus einer reziproken Translokation unter Beteiligung der Chromosomen 9 und 22, welche ein zytogenetisch unterscheidbares kleines akrozentrisches Chromosom erzeugt, das als Philadelphia-Chromosom (Ph¹) bezeichnet wird (7-12); 8. Die Standard-Zytogenetik weist jedoch nicht die Auflösung auf, um nahe zusammenliegende Bruchstellen, wie z.B. die für CML und akute lymphatische Leukämie (ALL) charakteristischen, zu unterscheiden und versagt bei Fusionen, die durch komplexere Umordnungen erzeugt werden. Die Kartierung und das Klonieren von Bruchstellenregionen in beiden Genen hat zu molekularen Techniken geführt, welche eine BCR-ABL-Fusion bei CML-Fällen zeigen, bei denen das Ph¹-Chromosom zytogenetisch nicht nachgewiesen werden konnte (13-16). Die Southern-Analyse hinsichtlich BCR-Umordnungen ist zum Standard für die Diagnose von CML geworden. Kürzlich wurde die Fusion durch In vitro-Amplifikation eines cDNA-Transkripts, das unter Verwendung von reverser Transkriptase von CML-mRNA kopiert worden war, nachgewiesen (17-23). Diese Technik erlaubt den Nachweis eines BCR-ABL-Transkripts aus CML-Zellen, die in geringer Häufigkeit vorliegen. Beide dieser Techniken verwenden Nukleinsäure, die aus Zellpopulationen erhalten wird, so dass eine Korrelation zwischen Genotyp und Phänotyp für einzelne Zellen nicht möglich ist.
Hierin werden chromosomenspezifische Reagenzien und Verfahren zum Nachweis genetischer Umordnungen, wie z.B. die hier beispielhaft für die BCR-ABL-Fusion dargestellten, beschrieben, welche Informationen liefern, die mit existierenden Techniken nicht verfügbar sind.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Diese Erfindung betrifft Verfahren zum Färben von chromosomalem Material wie in Anspruch 1 definiert. Die Verfahren erzeugen Färbungsmuster, die auf spezifische zytogenetische Analysen zugeschnitten werden können.
Eine weitere Aufgabe dieser Erfindung ist es Kits herzustellen, welche für eine cytogenetische Analyse nützliche Nukleinsäuresonden umfassen, die das chromosomale Material mit zuverlässigen Signalen färben. Solche Sonden sind für eine In situ- Hybridisierung geeignet. Bevorzugte Nukleinsäuresonden für bestimmte erfindungsgemäße Anwendungen sind jene, welche eine ausreichende Komplexität aufweisen, um jede von zwei oder mehr Zielstellen zuverlässig zu färben.
Die erfindungsgemäßen Kits dieser Erfindung umfassen Sondenzusammensetzungen, welche beim gegenwärtigen Stand der Hybridisierungstechniken typischerweise eine hohe Komplexität aufweisen, üblicherweise eine Komplexität von größer als etwa 50 kB, wobei die Komplexität von der Anwendung abhängt, für welche die Sonde vorgesehen ist. Insbesondere werden chromosomenspezifische Färbereagenzien bereitgestellt, welche heterogene Gemische von Nukleinsäurefragmenten umfassen, wobei bei jedem Fragment ein wesentlicher Teil seiner Sequenzen zu einem Teil der Nukleinsäure, die spezifisch angefärbt werden soll, – die Ziel-Nukleinsäure, vorzugsweise das chromosomale Ziel-Material – im wesentlichen komplementär ist. Im allgemeinen werden die Nukleinsäurefragmente mit Mitteln, wie sie hier beispielhaft dargestellt und nachstehend angeführt sind, markiert. Die Nukleinsäurefragmente müssen jedoch direkt markiert werden, damit die Bindung der Sondenfragmente an das Ziel nachgewiesen werden kann; eine solche Nukleinsäurebindung kann beispielsweise durch anti-RNA/DNA-Duplex-Antikörper und Antikörper gegen Thymidin-Dimere nachgewiesen werden. Die Nukleinsäurefragmente der heterogenen Gemische beinhalten doppelsträngige oder einzelsträngige RNA oder DNA.
Diese Erfindung ist einzig durch die anhängenden Ansprüche definiert und betrifft chromosomenspezifische Reagenzien und Verfahren zum Färben von chromosomalem Material, das sich in der Nähe einer vermuteten genetischen Umordnung befindet, nämlich einer chromosomalen Amplifikation oder Deletion. Wenn eine solche genetische Umordnung mit einer Krankheit assoziiert ist, werden solche chromosomenspezifischen Reagenzien als krankheitsspezifische Reagenzien oder Sonden bezeichnet. Wenn eine solche genetische Umordnung mit Krebs assoziiert ist, werden solche Reagenzien als tumorspezifische Reagenzien oder Sonden bezeichnet.
Im Zusammenhang der vorliegenden Erfindung bezieht sich der Ausdruck "genetische Umordnung" auf chromosomale Amplifikation oder Deletion.
Für den Nachweis genetischer Umordnungen brauchbare Nukleinsäuresonden weisen typischerweise eine hohe Komplexität auf.
Diese Erfindung stellt ferner Verfahren und Reagenzien zur Unterscheidung zwischen zytogenetisch ähnlichen, aber genetisch unterschiedlichen chromosomalen Umordnungen, wie vorstehend erwähnt, zur Verfügung.
Hierin sind spezifisch chromosomenspezifische Reagenzien und Verfahren zum Nachweis genetischer Umordnungen offenbart, z.B. Translokationen, Deletionen, Amplifikationen und Insertionen, welche die BCR-ABL-Fusion erzeugen, die diagnostisch für chronisch-myeloische Leukämie (CML) ist. Es ist jedoch ersichtlich, dass die Erfindung den Nachweis von chromosomalen Amplifikationen und Deletionen betrifft. Chromosomenspezifische Reagenzien für die Diagnose von CML enthalten Nukleinsäuresequenzen, die im wesentlichen homolog sind zu chromosomalen Sequenzen in der Nähe der Translokationsbruchstellenregionen der chromosomalen Regionen 9q34 und 22q11, die mit CML assoziiert sind.
Diese Reagenzien erzeugen ein Färbungsmuster, welches sich eindeutig ändert, wenn die für CML charakteristische BCR-ABL-Fusion auftritt. 11 zeigt graphisch eine Vielzahl von Färbungsmustern, welche – gemeinsam mit anderen potentiellen Färbungsmustern – bei Vorliegen einer genetischen Umordnung, wie z.B. der BCR-ABL Fusion, einer Änderung unterliegen.
Das Vorliegen einer genetischen Umordnung kann bestimmt werden, indem die erfindungsgemäßen Reagenzien gemäß den hier beschriebenen Verfahren angewendet und die Nachbarschaft und/oder andere Charakteristiken der Signale des erzeugten Färbungsmusters beobachtet werden.
Vorzugsweise umfassen die zum Nachweis von CML verwendeten erfindungsgemäßen Reagenzien Nukleinsäuresequenzen, die eine Komplexität von etwa 50 Kilobasen (kB) bis etwa 1 Megabase (MB), mehr bevorzugt von etwa 50 kB bis etwa 750 kB und am meisten bevorzugt von etwa 200 kB bis etwa 400 kB aufweisen.
Diese Erfindung liefert ferner Verfahren zur Unterscheidung zwischen vermuteten genetischen Umordnungen, welche in relativ naher Nachbarschaft in einem Genom auftreten, wobei die chromosomenspezifischen Reagenzien Nukleinsäuresequenzen umfassen, die im wesentlichen homolog zu Nukleinsäuresequenzen in der Nähe der vermuteten genetischen Umordnungen sind. Ein Beispiel für eine solche Differenzierung zwischen zwei potentiellen genetischen Umordnungen ist die Differentialdiagnose von CML gegenüber akuter lymphatischer Leukämie (ALL).
Diese Erfindung liefert darüber hinaus Verfahren und Reagenzien zum Erzeugen von Färbungsmustern bei einem Patienten, der von einer krankheitsassoziierten genetischen Umordnung betroffen ist, wie z.B. der mit der BCR-ABL-Fusion bei CML assoziierten, wobei die Färbungsmuster die Reaktion eines Patienten gegenüber verschiedenen Therapiemaßnahmen, wie z.B. Chemotherapie, Bestrahlung, Chirurgie und Transplantation, beispielsweise Knochenmarktransplantation, voraussagen und/oder anzeigen. Solche Färbungsmuster können für die Überwachung des Status eines solchen Patienten, vorzugsweise auf einer Zelle-für-Zelle-Basis, nützlich sein und können einen Krankheitsrückfall bei einem Patienten, der sich in Remission befindet, voraussagen. Eine computergestützte mikroskopische Analyse kann die Interpretation der erfindungsgemäßen Färbungsmuster unterstützen, und die Erfindung liefert Verfahren, bei denen eine computergestützte mikroskopische Analyse zum Testen von Patientenzellen auf einer Zelle-für-Zelle-Basis eingesetzt wird, um beispielsweise nach einer Restkrankheit bei einem Patienten zu suchen.
Außerdem liefert diese Erfindung Verfahren zur Bestimmung der molekularen Grundlage einer genetischen Erkrankung und zum Nachweis spezifischer genetisch bedingter Erkrankungen.
Des Weiteren werden hierin Verfahren und Reagenzien zum Nachweis von benachbarte Gene betreffenden Syndromen beschrieben, umfassend die In situ-Hybridisierung von Nukleinsäuresonden, welche Sequenzen umfassen, die im wesentlich homolog zu den für eine oder mehrere Komponenten eines benachbarte Gene betreffenden Syndroms charakteristischen Nukleinsäuresequenzen sind. Ein typisches Beispiel für ein solches benachbarte Gene betreffendes Syndrom ist das Down-Syndrom.
Es werden auch Verfahren zum gleichzeitigen Nachweis genetischer Umordnungen multipler Loci in einem Genom bereitgestellt, umfassend die In situ-Hybridisierung von Nukleinsäuresonden hoher Komplexität, welche Nukleinsäuresequenzen umfassen, die im wesentlichen homolog zu Nukleinsäuresequenzen an multiplen Loci in einem Genom sind.
Des Weiteren werden Verfahren zum Suchen nach genetischen Umordnungen in einem Genom bereitgestellt. Beispielsweise kann eine konventionelle Bandenanalyse eine Anomalie in einer Chromosomenregion eines zu untersuchenden Genoms anzeigen. Die erfindungsgemäßen Verfahren können die Anwendung von Nukleinsäuresonden, die aus dem benachbarten Bereich jener Chromosomenregion eines normalen Genoms hergestellt sind, durch In situ-Hybridisierung an Zellen, welche die Anomalie enthalten, beinhalten, um durch Beobachten des auf diese Weise erzeugten Färbungsmusters die exakte Lage und Art der genetischen Umordnung der Anomalie im Detail festzustellen.
Die Erfindung liefert darüber hinaus Nukleinsäuresonden hoher Komplexität, welche für einen raschen, wirkungsvollen und automatisierten Nachweis genetischer Umordnungen optimiert sind.
Ein Weg zum Erzeugen einer Sonde hoher Komplexität besteht darin, mehrere oder viele Klone zu poolen, beispielsweise unter anderem Phagen-, Plasmid-, Cosmid- und/oder YAC-Klone, wobei jeder Klon eine Einfügungssequenz enthält, die an einen gewissen Teil des Ziels in einem Genom hybridisieren kann. Ein anderer Weg zur Erzeugung einer solchen Sonde besteht in der Verwendung der Polymerase-Kettenreaktion (PCR).
Bezogen auf das Gemisch markierter Nukleinsäurefragmente bedeutet heterogen, dass die Färbereagenzien jeweils viele Kopien von Fragmenten mit unterschiedlichen Sequenzen und/oder Größen (z.B. von den unterschiedlichen DNA-Klonen, die zur Herstellung der Sonde gepoolt wurden) umfassen. Als Vorbereitung für die Verwendung können diese Fragmente zufallsmäßig oder spezifisch geschnitten werden, um die Größenverteilung der an der Hybridisierungsreaktion teilnehmenden Nukleinsäurestücke einzustellen.
Wie nachstehend ausführlicher diskutiert, sind die heterogenen Sondengemische vorzugsweise im wesentlichen frei von Nukleinsäuresequenzen mit der Fähigkeit zur Hybridisierung an Nichtziel-Nukleinsäuren. Die meisten solcher Sequenzen binden an repetitive Sequenzen, die den Ziel- und Nichtziel-Nukleinsäuren gemeinsam sind, das heißt gemeinsame repetitive Sequenzen.
Verfahren zum Entfernen unerwünschter Nukleinsäuresequenzen und/oder zur Ausschaltung des Hybridisierungsvermögens solcher Sequenzen werden nachstehend ausführlicher diskutiert. [Siehe Abschnitt II]. Solche Verfahren schließen, ohne darauf beschränkt zu sein, ein: die selektive Entfernung oder das Screening gemeinsamer repetitiver Sequenzen aus der Sonde; die sorgfältige Auswahl von Nukleinsäuresequenzen für die Aufnahme in die Sonde; das Blockieren gemeinsamer repetitiver Sequenzen durch die Zugabe unmarkierter genomischer DNA oder das sorgfältigere Auswählen von Nukleinsäuresequenzen für die Aufnahme in das Blockierungsgemisch; das Inkubieren des Sondengemisches über eine ausreichende Zeit zur Reassoziation von repetitiven Sequenzen hoher Kopienzahl oder dergleichen.
Die erfindungsgemäßen Färbereagenzien werden vorzugsweise auf chromosomale DNA aus der Interphase mittels In situ-Hybridisierung appliziert, und die Chromosomen werden identifiziert oder klassifiziert, d.h. der Karyotyp bestimmt, indem das Vorhandensein der Markierung, beispielsweise Biotin oder ³H, auf den Nukleinsäurefragmenten, welche das Färbereagenz umfassen, nachgewiesen wird.
Die Erfindung beinhaltet Chromosomen-Färbereagenzien für den gesamten Genomsatz von Chromosomen, Färbereagenzien spezifisch für einzelne Chromosomen, Färbereagenzien spezifisch für Chromosomen-Untergruppen und Färbereagenzien spezifische für Subregionen innerhalb einzelner oder multipler Chromosomen. Der Begriff "chromosomenspezifisch" ist so zu verstehen, dass er alle diese Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Färbereagenzien umfasst. Der Begriff ist auch so zu verstehen, dass er Färbereagenzien, die sowohl aus normalen und anomalen Chromosomentypen hergestellt und gegen diese gerichtet sind, umfasst.
Ein bevorzugtes Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen chromosomenspezifischen Färbereagenzien schließt ein: 1) Isolieren der chromosomalen DNA aus einem speziellen Chromosomentyp oder Zielregion oder -regionen im Genom, 2) Amplifizieren der isolierten DNA, um ein heterogenes Gemisch von Nukleinsäurefragmenten zu bilden, 3) Ausschaltung des Hybridisierungsvermögens der Nukleinsäurefragmente oder Entfernen darin befindlicher, gemeinsamer wiederholter Sequenzen und 4) Markieren der Nukleinsäurefragmente zur Bildung eines heterogenen Gemisches markierter Nukleinsäurefragmente. Wie nachstehend ausführlicher beschrieben wird, kann die Reihenfolge der Schritte für spezielle Ausführungsformen entsprechend den speziellen Mitteln variieren, welche zur Ausführung der Schritte verwendet werden.
Die vorliegende Erfindung beschäftigt sich mit Problemen, die mit der Bestimmung von Chromosomen-Karyotypen zusammenhängen, besonders für diagnostische und dosimetrische Anwendungen. Insbesondere überwindet die Erfindung Probleme, welche durch das Fehlen von Färbemitteln, die ausreichend chromosomenspezifisch sind, auftreten, indem sie Reagenzien liefert, die heterogene Gemische von Nukleinsäurefragmenten umfassen, welche an die Ziel-DNA und/oder -RNA hybridisiert werden können, beispielsweise an die Ziel-Chromosomen, an Ziel-Untergruppen von Chromosomen oder an Zielregionen der spezifischen Chromosomen. Die erfindungsgemäße Färbetechnik eröffnet die Möglichkeit des raschen und empfindlichen Nachweises genetischer Umordnungen in Interphasezellen unter Verwendung von Klinik- und Labor-Standardausrüstung und einer verbesserten Analyse mit Einsatz automatisierter Techniken. Sie besitzt direkte Anwendbarkeit für das genetische Screening, in der Krebsdiagnostik und bei der biologischen Dosimetrie.
Diese Erfindung liefert außerdem spezifisch Verfahren und Nukleinsäuresonden zum Färben von fetalem chromosomalem Material in der Interphase. Darüber hinaus liefert die Erfindung ein für den Embryo nicht-invasives Verfahren zur Bestimmung des Karyotyps des chromosomalen Materials von fetalen Zellen, bei dem die fetalen Zellen vom mütterlichen Blut abgetrennt worden sind. Solche fetalen Zellen sind vorzugsweise Leukozyten und/oder Zytotrophoblasten. Exemplarische Nukleinsäuresonden sind Sonden mit hoher Komplexität, die für die Chromosomentypen 13, 18 und/oder 21 chromosomenspezifisch sind. Repräsentative Sonden umfassen chromosomenspezifische Bluescribe Plasmidbibliotheken, aus denen vor und/oder während der Hybridisierung mit den fetalen Ziel-Chromosomen eine ausreichende Zahl gemeinsamer repetitiver Sequenzen entfernt oder deren Hybridisierungsvermögen ausgeschaltet worden ist.
Diese Erfindung offenbart Testkits, wie in Anspruch 18 definiert, welche geeignete Nukleinsäuresonden für die Verwendung in der Tumor-Zytogenetik, zum Nachweis von krankheitsbezogenen Loci, zur Analyse von strukturellen Anomalien, z.B. Translokationen, unter anderen genetischen Umordnungen, und zur biologischen Dosimetrie umfassen.
Diese Anmeldung offenbart außerdem Kits für das pränatale Screening, die geeignete Nukleinsäuresonden umfassen, einschließlich Testkits, die Sonden hoher Komplexität für den Nachweis genetischer Umordnungen und spezifisch jener, welche die für CML charakteristische BCR-ABL-Fusion erzeugen, umfassen.
Die erfindungsgemäßen Verfahren und Zusammensetzungen erlauben das Färben von chromosomalem Material mit für eine gewünschte Anwendung zweckmäßigen Mustern. Das Muster kann sich über einige Regionen eines oder mehrerer Chromosomen oder über einige oder alle Chromosomen eines Genoms und multiple Abschnitte, die durch multiple Farben unterscheidbar sind, erstrecken. Alternativ dazu kann das Muster auf einen speziellen Teil oder Teile eines Genoms fokussiert sein, wie z.B. einen Teil oder Teile, welche potentiell eine Bruchstelle enthalten, die dia gnostisch oder prognostisch für einen oder mehrere Tumoren wichtig ist, oder auf jene Teile von Chromosomen, die für die pränatale Diagnostik von Bedeutung sind.
Das Färbungsmuster kann je nach eingesetztem Analysenverfahren, sei es beispielsweise ein menschlicher Beobachter oder eine automatisierte Ausrüstung, wie z.B. ein Durchfluss-Zytometer oder computergestützte Mikroskopie, angepasst werden. Die Muster können so gewählt werden, dass sie für die Analyse kondensierter Chromosomen oder von dispersem chromosomalem Material geeignet sind.
Die Erfindung sieht ferner automatisierte Mittel für den Nachweis und die Analyse chromosomaler Anomalien, insbesondere genetischer Umordnungen, wie sie durch die erfindungsgemäß erzeugten Färbungsmuster angezeigt werden, vor.
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein alternatives Verfahren zu den gegenwärtig verfügbaren Techniken für die Herstellung und Anwendung nicht-selbstkomplementärer einzelsträngiger DNA-Hybridisierungssonden zur Verfügung zu stellen.
Ein weiteres Ziel der Erfindung besteht darin, das bei einer In situ-Hybridisierung erzielbare Signal-Rauschverhältnis durch Reduzieren des unspezifischen und fehlgepaarten Bindens der Sonde zu verbessern.
Ein weiteres Ziel der Erfindung besteht darin, ein Verfahren zur Denaturierung doppelsträngiger Ziel-DNA für die Anwendung der Hybridisierungssonde bereitzustellen, welches die für eine Hybridisierung verfügbaren einzelsträngigen Regionen, die zu den Sondensequenzen nicht komplementär sind, auf ein Minimum beschränkt.
DNA-Fragmente, aus denen Sonden durch Behandlung mit einer Restriktionsendonuklease, die eine Sammlung von Restriktionsfragmenten mit "klebrigen" Enden oder abgestuften Schnitten, charakteristisch für die verwendete Endonuklease, erzeugt, konstruiert werden können. Das heißt, die zwei durch einen Schnitt eingeführten Fragmentenden bestehen jeweils aus einem überhängenden und einem zurückge setzten Strang. Die Restriktionsfragmente werden in Vektoren eingefügt, welche so konstruiert sind, dass sie diesen Restriktionsfragment-Typ akzeptieren; und die Vektoren werden durch Transfektion in Wirtsorganismen eingeschleust, welche angezüchtet werden, um die Zahl der Restriktionsfragmente zu erhöhen. Danach werden die Vektoren von den Wirtsorganismen abgetrennt, und die Restriktionsfragmente werden herausgeschnitten und von den Vektoren abgetrennt. An jedem Ende der Restriktionsfragmente werden die zurückgesetzten Stränge durch eine geeignete Exonuklease verdaut. Es wird nicht zugelassen, dass die Verdauung vollständig abläuft. Die mit Exonuklease behandelten Restriktionsfragmente werden dann als Vorlage/Primer für DNA-Polymerase verwendet, welche den verdauten Strang in Gegenwart einer markierten Vorläufersubstanz ersetzt. Beispiele für Enzyme, die für dieses Verfahren geeignet sind, sind Exonuklease III, gefolgt von Behandlung mit dem großen Fragment der DNA-Polymerase I; oder T4-DNA-Polymerase, welche durch Änderungen in den Reaktionsbedingungen beide Funktionen ausführen kann. Nach Abschluss der Synthese werden die Restriktionsfragmente zu kleineren Fragmenten zerbrochen, so dass die markierten Teile des ursprünglichen Restriktionsfragments im wesentlichen intakt bleiben. Die kleineren Fragmente werden denaturiert, und die markierten Stränge werden von den unmarkierten Strängen abgetrennt, um die Hybridisierungssonden zu bilden.
Bei diesem Verfahren der Verwendung einzelsträngiger Sonden wird die Ziel-DNA vor Applikation der Hybridisierungssonde auf die Ziel-DNA zuerst mit der gleichen Restriktionsendonuklease behandelt, die zum Ausschneiden der Sonden-DNA aus dem Klonierungsvektor verwendet wurde. Diese Behandlung zerbricht die Ziel-DNA in eine Sammlung von Restriktionsfragmenten, welche an jedem Ende für die Restriktionsendonuklease charakteristische Schwänze aufweisen. Dann wird die Ziel-DNA mit einer Exonuklease behandelt, welche den zurückgesetzten Strang entfernt, so dass einzelsträngige DNA in der Nähe des durch die Restriktionsendonuklease eingeführten Schnitts freigelegt wird. Schließlich wird die Hybridisierungssonde auf die Ziel-DNA appliziert, beispielsweise unter Verwendung von Standardprotokollen für die In situ-Hybridisierung, wie sie nachstehend ausführlicher beschrieben sind.
Ein wichtiges Merkmal des Verfahrens mit einzelsträngigen Sonden besteht darin, dass die klonierte Sonden-DNA und die Ziel-DNA mit der gleichen Restriktionsendonuklease behandelt werden. Dies stellt sicher, dass die einzelsträngige DNA des Ziels komplementär zum markierten Strang der Sonde ist. Natürlich werden zusätzlich zu den korrekten Bindungsstellen viele Segmente des Ziels in Einzelstränge überführt werden, da viele Restriktionsschnitte vorhanden sind, aber es wird insgesamt viel weniger einzelsträngiges Ziel vorliegen, als durch wahllose Denaturierung erzeugt würde. Außerdem kann die auf diese Weise in einen Einzelstrang überführte Ziel-DNA nicht mit sich selbst reassoziieren und so den Zugang für die Sonde blockieren.
Ein weiteres wichtiges (aber nicht kritisches) Merkmal eines solchen Verfahrens besteht in der Wahl einer Markierung, welche die Abtrennung markierter Stränge von unmarkierten Strängen erlaubt. Die Vorläufersubstanzen werden vorzugsweise durch Biotinylierung markiert, und die markierten Stränge werden von den unmarkierten Strängen durch Affinitätschromatographie abgetrennt.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
Die 1A, B und C und die 2A und 2B veranschaulichen die Hybridisierung einer für Chromosom 21 spezifischen Bibliothek an eine menschliche Metaphasespreitung, wobei die Einfügungssequenzen im Lambda-Phagen Charon 21A kloniert waren. Das Hybridisierungsvermögen der repetitiven Sequenzen mit hoher Kopienzahl in der Bibliothek wurde durch die Zugabe unmarkierter genomischer DNA zum Hybridisierungsgemisch reduziert. Die Sonde wurde mit Biotin markiert, das mit grünem FITC-Avidin (Fluoresceinisothiocyanat-Avidin) nachgewiesen wurde. Die gesamte DNA in den Chromosomen wurde mit dem blauen Fluoreszenzfarbstoff DAPI (4,6-Diamidino-2-phenylindol) gefärbt.
1A ist ein Binärbild der DAPI-Färbung in der menschlichen Metaphasespreitung, die durch Verwendung einer an einem Fluoreszenzmikroskop befestigten TV-Kamera erhalten wurde. Es wurden für eine DAPI-Visualisierung geeignete Filter verwendet. Die Computerverarbeitung des Bildes zeigt alle Teile oberhalb einer gewählten Intensitätsschwelle als weiß und den Rest als schwarz.
1B ist ein Binärbild der FITC-Färbung derselben menschlichen Metaphasespreitung wie in 1A. Das Bild wurde wie in 1A hergestellt, der Filter im Mikroskop wurde jedoch gewechselt, so dass das an die Sonde gebundene FITC statt des DAPI sichtbar ist.
1C ist ein Binärbild der Chromosomen des Typs 21 allein, wobei am Binärbild der 1B unspezifisch gefärbte Objekte (die kleiner sind) durch Standard-Bildbearbeitungstechniken entfernt wurden.
2A ist eine Farbphotographie der DAPI-Färbung in einer menschlichen Metaphasespreitung, der gleichzeitig mit dem in den computergenerierten Binärbildern der 1A, B und C gezeigten Spreitung hergestellt und hybridisiert wurde.
2B ist eine Farbphotographie des an die DNA-Sonde gebundenen Fluorescein in derselben menschlichen Metaphasespreitung wie der in 2A. Sie wurde durch Wechseln der Filter im Fluoreszenzmikroskop zur Anregung von Fluorescein anstelle von DAPI erhalten. Die Photographie ist mit dem Binärbild von 1B vergleichbar.
3 ist eine Photographie einer menschlichen Metaphasespreitung, die gleichzeitig mit den in den 1A, B und C und 2A und B gezeigten Spreitungen hergestellt und hybridisiert wurde. Die verwendeten Methoden waren dieselben, außer dass PI (Propidiumiodid) anstelle von DAPI zum Färben der gesamten Chromosomen verwendet wurde. Sowohl PI- als auch Fluorescein-Färbungen können mit den gleichen Mikroskopfiltern betrachtet werden. Es wurde Farbfilm verwendet, so dass auf dem Farbfilm die Propidiumiodid-Gegenfärbung rot und das Fluorescein der Sonde gelb erscheint.
4A zeigt die Hybridisierung der Chromosom 4-spezifischen Bibliothek in Bluescribe-Plasmiden (die Bibliothek pBS-4) an eine menschliche Metaphasesprei tung, wobei keine unmarkierte menschliche genomische DNA verwendet und das Hybridisierungsgemisch unmittelbar nach Denaturierung appliziert wurde. Beide Kopien von Chromosom 4 sind als ein wenig heller als die anderen Chromosomen zu erkennen. Die kleinen Pfeile bezeichnen Regionen, die nicht mit der Sonde gefärbt sind. Wie bei 3 und wie beim Rest der unten angeführten Figuren ist PI die Gegenfärbung, und Fluorescein wird verwendet, um die Sonde zu markieren.
4B zeigt die Hybridisierung von pBS-4 an eine menschliche Metaphasespreitung, wobei unmarkierte menschliche genomische DNA während der Hybridisierung eingesetzt wurde (Q = 2 von genomischer DNA; die Bedeutung von Q ist unten erklärt). Eine qualitative Bildanalyse zeigt, dass die Intensität pro Längeneinheit der Chromosomen des Typs 4 etwa das 20-fache der anderen Chromosomen beträgt. Die Chromosomen des Typs 4 sind gelb; die anderen Chromosomen sind aufgrund der Propidiumiodid-Gegenfärbung rot. Zwei Schichten von Avidin-Fluoresceinisothiocyanat wurden verwendet, um die Ziel-Chromosomen für eine genaue Messung ausreichend aufzuhellen. Die Chromosomen des Typs 4 können jedoch nach Aufbringen einer einzigen Schicht leicht erkannt werden.
4C zeigt dieselbe Spreitung wie in 4B, aber durch ein Filter, das nur die Fluoreszenz des Fluoresceinisothiocyanats passieren lässt.
4D zeigt den Nachweis einer die Chromosomen des Typs 4 betreffenden strahlungsinduzierten Translokation (Pfeile) in einer menschlichen Metaphasespreitung, wobei pBS-4-spezifische Bibliotheken verwendet werden. Das Kontrastverhältnis ist etwa 5X.
4E zeigt, dass normale und zwei Derivat-Chromosomen, die aus einer Translokation zwischen Chromosom 4 und 11 (in Ziellinie RS4;11) resultieren, durch die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen und Verfahren in Interphasezellkernen nachgewiesen werden können. Sie zeigen sich als drei getrennte Domänen.
4F zeigt die Hybridisierung der Chromosom 21-spezifischen Bibliothek in Bluescribe-Plasmiden (die Bibliothek pBS-21) an eine Metaphasespreitung einer Trisomie-21-Zellinie. Ein geringes Ausmaß an Hybridisierung ist nahe den Zentromeren der anderen akrozentrischen Chromosomen sichtbar.
4G zeigt die gleiche Hybridisierung wie in 4F, jedoch mit Interphasezellkernen. Die drei Chromosom 21-Domänen sind deutlich gezeigt.
4H zeigt die Hybridisierung mit einem Pool von 120 Einzelkopie-Sonden aus Chromosom 4 an eine menschliche Metaphasespreitung. Die Chromosomen des Typs 4 sind mit Pfeilen bezeichnet.
5 zeigt die Hybridisierung eines Klons eines künstlichen Hefe-Chromosoms (YAC), der eine 580-kB-Einfügungssequenz menschlicher DNA enthält, an eine menschliche Metaphasespreitung. Eine gelbe Fluoresceinbande auf jedem der Chromosomen des Typs 12 (bei 12g21.1) ist gegen die Propidiumiodid-Gegenfärbung sichtbar.
6 zeigt die Hybridisierung von DNA aus einer Mensch/Hamster-Hybridzelle, die eine Kopie des menschlichen Chromosoms 19 enthält, an eine menschliche Metaphasespreitung. Ein wenig rechts von der Mitte der Photographie befinden sich die zwei Chromosomen des Typs 19, die heller als die anderen Chromosomen in der Spreitung sind.
7 veranschaulicht ein repräsentatives Verfahren zur Verwendung der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) für die Herstellung erfindungsgemäßer Sonden, die eine verminderte Zahl repetitiver Sequenzen aufweisen.
8 veranschaulicht die Lage von Sonden zur CML-Bruchstelle und die korrespondierenden Färbungsmuster in normalen und CML-Metaphase- und Interphasezellkernen.
Die linke Seite zeigt schematische Darstellungen des BCR-Gens auf Chromosom 22, des ABL-Gens auf Chromosom 9 und des BCR-ABL-Fusionsgens auf dem Philadelphia-Chromosom. Auch die Lage der CML-Bruchstellen und ihre Relation zu den Sonden sind gezeigt (32). Die rechte Seite zeigt Hybridisierungsmuster, wie sie für die c-hu-ABL- und PEM12-Sonden bei Hybridisierung an normale und CML-Metaphasespreitungen und -Interphasezellkerne zu erwarten sind.
9 zeigt eine Fluoreszenz-In situ-Hybridisierung (FISH) an Metaphasespreitungen und Interphasezellkerne. Die Tafeln A und B zeigen die Hybridisierung von ABL und BCR an normale Metaphasespreitungen. Das ABL-Signal (A) ist auf dem telomeren Teil von 9q lokalisiert, und das BCR-Signal (B) ist nahe dem Zentromer von 22q lokalisiert. Tafel C zeigt, dass die abl-Färbung bei einem CML-Fall mit 46XY, t(9:22) (q34;q11) auf der telomeren Region des Philadelphia-Chromosoms lokalisiert ist. Tafel D zeigt, dass die abl-Färbung bei einem CML-Fall mit 46XY ins (22:9)(q11;q34) interstitiell auf dem Derivat-Chromosom 22, das aus einem Insertionsereignis entsteht, liegt. Tafel E veranschaulicht, dass die K562-Zellinie multiple Signale aufweist, die auf einer Region des Interphasezellkerns lokalisiert sind. Ein identisches Färbungsmuster wurde mit einer BCR-Sonde beobachtet, was eine Amplifizierung des BCR-ABL-Fusionsgens anzeigt. Tafel F stellt eine Metaphasespreitung aus der K562-Zellinie dar, der eine auf einem einzigen Chromosom lokalisierte Fusionsgen-Amplifizierung zeigt.
10 veranschaulicht eine Fluoreszenz-In situ-Hybridisierung bei CML-Interphasezellkernen mit ABL(rot)- und BCR(grün)-Sonden, die gleichzeitig durch ein Doppelbandfilter visualisiert werden. Die Zellen aus einem CML-Patienten zeigen die rot-grünen (gelben) Signale, die aus der Hybridisierung an das BCR-ABL-Fusionsgen resultieren, und einzelne rote und grüne Hybridisierungssignale für die Hybridisierung an die normalen BCR- und ABL-Gene auf den Chromosomen 22 und 9.
11 veranschaulicht einige typische Sondenstrategien für den Nachweis struktureller Aberrationen. Das Design der Bindungsmuster, Farben etc. der Sonden kann für den Nachweis genetischer Anomalien in Metaphase- und/oder Interphasezellen optimiert werden. Unterschiedliche Muster können für spezielle Anwendungen von Vorteil sein. Die Zeichnungen in 11 veranschaulichen einige der für den Nachweis einiger Anomalien brauchbaren Muster. Die Beispiele sind repräsentativ und nicht als erschöpfend anzusehen; verschiedene Muster können kombiniert werden, um den Nachweis multipler Anomalien in derselben Zelle zu ermöglichen.
In den Zeichnungen der 11, sind die Metaphasechromosomen mit an beide Chromatiden gebundenen Sonden dargestellt. Die Interphasezellkerne sind in einem Stadium des Zellzyklus vor Replikation des Teils des Chromosoms, an den die Sonde bindet; abgebildet; es liegt daher nur ein Chromatid von jedem Interphasechromosom vor. Wenn die Sondenbindung nur auf einen Teil eines Chromosoms beschränkt ist, ist das Signal entweder als schwarzer oder weißer Kreis angezeigt. Eine solche Darstellung wird verwendet, um verschiedene Farben oder auf andere Weise unterscheidbare Charakteristiken der Färbung anzuzeigen. Muster, die mehr als zwei unterscheidbare Charakteristiken (drei Farben, verschiedene Farbverhältnisse etc.) enthalten, erlauben komplexere Färbungsmuster als die in der Figur dargestellten. Die chromosomale Lage der Bruchstellen in der DNA wird durch waagrechte Linien neben den anomalen Chromosomen angezeigt.

a. Abschnitt a) stellt die Verwendung einer Sonde dar, die ein ganzes Chromosom färbt. Eine solche Sonde kann verwendet werden, um eine Translokation, die irgendwo entlang eines Chromosoms auftritt, nachzuweisen. Die Farbphotographie der 12 zeigt die Verwendung eines solchen Färbemittels für Chromosom 22 zum Nachweis einer Translokation, in diesem Fall jener, die bei CML auftritt. Eine solche Vorgangsweise hinsichtlich der Färbung ist bei Interphasezellkernen nicht sehr nützlich, da die Region des Zellkerns, welche gefärbt wird, relativ groß ist; Überlappungen der gefärbten Regionen können bei vielen Zellkernen die Interpretation schwierig gestalten.
b. Abschnitt b) stellt die Reduktion der gefärbten Region des in a) gezeigten Chromosoms auf die Region in der Nähe einer Bruchstelle dar, so dass eine auf Ereignisse in dieser Region fokussierte Information geliefert wird. Das Färbungsmuster kann kontinuierlich oder diskontinuierlich über die Bruchstelle verlaufen, gerade so, dass eine gewisse Bindung auf beiden Seiten der Bruchstelle gegeben ist. Ein solches Färbungsmuster erfordert lediglich eine "Farbe", gibt aber keine Information darüber, welche andere Genomregion in den Austausch involviert sein kann.
c. Abschnitt c) stellt die Verwendung einer Sonde dar, die an Sequenzen bindet, welche als Ergebnis der Umordnung zusammenkommen, und den Nachweis in Metaphase- und Interphasezellen erlaubt. In diesem Fall werden die verschiedenen Sequenzen mit verschiedenen "Farben" gefärbt. Ein solches Färbungsmuster ist jenes, das in den Beispielen des Abschnitts VIII dieser Anmeldung verwendet wird.
d. Abschnitt d) stellt eine Ausweitung von c) dar, indem er das Färben beider Seiten der beiden Bruchstellen, die an der Umordnung beteiligt sind, beinhaltet. Verschiedene "Farben" werden wie angezeigt verwendet. Die durch das komplexere Färbungsmuster gelieferte zusätzliche Information kann die Interpretation der Zellkerne unterstützen. Sie könnte auch, wie hierin diskutiert, die Erkennung eines scheinbaren Insertionsereignisses erlauben.
e. Abschnitt e) stellt den Nachweis einer Inversion in einem Homolog eines Chromosoms dar.
f. Abschnitt f) stellt ein Färbungsmuster dar, das für den Nachweis einer Deletion nützlich ist. Eine Deletion könnte auch mit einer Sonde nachgewiesen werden, die nur die deletierte Region färbt; das Fehlen einer Sondenbindung kann jedoch auf andere Gründe als die Deletion der Zielsequenz zurückzuführen sein. Die mit einer unterschiedlichen "Farbe" gefärbten flankierenden Regionen dienen als Kontrolle für die Hybridisierung.

12 veranschaulicht ein Färbungsmuster zum Nachweis einer Umordnung mittels Anfärbung eines ganzen Chromosoms, in diesem Fall eine mit CML assoziierte Umordnung von Chromosom 22. Die Metaphasespreitung dieser Figur stammt aus einer CML-Zelle, die mit einer Sonde gefärbt wurde, welche entlang des gesamten Chromosoms 22 bindet. Die von der Sonde gefärbten Regionen erscheinen gelb. Die restliche DNA wurde mit dem rot-fluoreszierenden chemischen Färbemittel Propidiumiodid gefärbt. Das völlig gelbe Chromosom ist eine normale Kopie von Chromosom 22. Genau unter dem normalen Chromosom 22 befindet sich das Philadelphia-Chromosom, ein zum kleinen Teil gelbes und zum Teil rotes Chromosom. Unterhalb und rechts vom Philadelphia-Chromosom befindet sich das anomale Chromosom 9 (rot) mit dem angefügten distalen Teil von Chromosom 22 (gelb). Die Photographie dieser Figur veranschaulicht das in Teil a) der vorhergehenden Figur dargestellte Färbungsmuster.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Diese Erfindung betrifft die Verwendung von Nukleinsäuresonden zum Färben von chromosomalem Ziel-Material in Mustern, die sich über eines oder mehrere Chromosomen und/oder entlang einer oder mehrerer Regionen auf einem oder mehreren Chromosomen erstrecken können, einschließlich Mustern, die sich über ein gesamtes Genom erstrecken. Die erfindungsgemäßen Färbereagenzien erleichtern die mikroskopische und/oder durchflußzytometrische Identifizierung normaler und aberranter Chromosomen und ermöglichen die Charakterisierung der genetischen Natur spezieller Anomalien, wie z.B. genetischer Umordnungen. Der Begriff "chromosomenspezifisch" ist hierin so definiert, dass er die Begriffe "zielspezifisch" und "regionsspezifisch" umfasst, das heißt, wenn die Färbezusammensetzung auf ein Chromosom gerichtet ist, dann ist sie chromosomenspezifisch, aber sie ist auch chromosomenspezifisch, wenn sie beispielsweise auf multiple Regionen auf multiplen Chromosomen oder auf eine Region nur eines Chromosoms oder auf Regionen im Bereich des gesamtem Genoms gerichtet ist. Der Begriff "chromosomenspezifisch" hat seinen Ursprung in der Verwendung rekombinanter DNA-Bibliotheken, die durch Klonieren von DNA aus einem einzelnen normalen Chromosomentyp hergestellt wurden, als das Ausgangsmaterial für die anfänglichen erfindungsgemäßen Sonden. Bibliotheken, die aus DNA von Regionen eines oder mehrerer Chromosomen hergestellt sind, sind DNA-Ausgangsmaterial für Sonden für diese Region oder diese Regionen des Genoms. Die aus einem solchen Ausgangsmaterial hergestellten Sonden sind regionsspezifische Sonden, jedoch auch von dem weitergefassten Ausdruck "chromosomenspezifische" Sonden umfasst. Der Begriff "zielspezifisch" wird hierin austauschbar mit dem Begriff "chromosomenspezifisch" verwendet.
Das Wort "spezifisch", wie es im Fachgebiet üblicherweise gebraucht wird, besitzt zwei etwas unterschiedliche Bedeutungen. Dieser Praxis wird auch hierin gefolgt. "Spezifisch" kann sich auf die Herkunft einer Nukleinsäuresequenz oder auf das Muster, mit dem sie als Teil eines Färbereagenz an ein Genom hybridisieren wird, beziehen. Beispielsweise führt das Isolieren und Klonieren von DNA aus einem spezifizierten Chromosom zu einer "chromosomenspezifischen Bibliothek". [Z.B., Van Dills et al., "Human Chromosome-Specific DNA Libraries: Construction and Availability", Biotechnologe, 4:537 (1986).] Eine solche Bibliothek enthält jedoch Sequenzen, die sie mit anderen Chromosomen gemeinsam hat. Solche gemeinsamen Sequenzen sind hinsichtlich ihrer Hybridisierungseigenschaften nicht chromosomenspezifisch für das Chromosom, von dem sie abgeleitet sind, da sie an mehr Chromosomen als das Ursprungschromosom binden werden. Eine Sequenz ist "chromosomenspezifisch", wenn sie nur an den gewünschten Teil eines Genoms bindet. Solche Sequenzen umfassen im Ziel enthaltene Einzelkopie-Sequenzen oder repetitive Sequenzen, bei denen die Kopien vorwiegend im Ziel enthalten sind.
"Chromosomenspezifisch" als nähere Bestimmung von "Färbereagenz" bezieht sich auf das gesamte Hybridisierungsmuster der Nukleinsäuresequenzen, die das Reagenz umfasst. Ein Färbereagenz ist chromosomenspezifisch, wenn ein brauchbarer Kontrast zwischen dem chromosomalen Ziel- und Nichtziel-Material erzielt wird (das heißt, dass das Ziel ausreichend visualisiert werden kann).
Eine Sonde ist hierin definiert als eine Sammlung von Nukleinsäurefragmenten, deren Hybridisierung an das Ziel nachgewiesen werden kann. Die Sonde wird wie unten beschrieben markiert, so dass ihre Bindung an das Ziel visualisiert werden kann. Die Sonde wird aus einer Nukleinsäurequelle, beispielsweise einer Sammlung von Klonen oder einer Sammlung von Produkten einer Polymerase-Kettenreaktion (PCR), hergestellt. Die Ausgangsnukleinsäure kann dann in mancher Weise weiter verarbeitet werden, beispielsweise durch Entfernen repetitiver Sequenzen oder deren Blockierung mit einer unmarkierten Nukleinsäure mit komplementärer Sequenz, so dass die Hybridisierung mit der resultierenden Sonde eine Färbung mit ausreichendem Kontrast auf dem Ziel erzeugt. Das Wort Sonde kann hierin somit nicht nur in Bezug auf die nachweisbare Nukleinsäure, sondern auch in Bezug auf die nachweisbare Nukleinsäure in der Form, in welcher sie auf das Ziel appliziert wird, beispielsweise mit der blockierenden Nukleinsäure etc., verwendet sein. Die blockierende Nukleinsäure kann auch getrennt genannt werden. Worauf sich "Sonde" spezifisch bezieht, sollte aus dem Zusammenhang, in dem das Wort gebraucht wird, klar sein.
Wenn zwei oder mehrere erfindungsgemäße Nukleinsäuresonden zusammengemischt werden, ergeben sie eine neue Sonde, die bei Hybridisierung an ein Ziel nach dem erfindungsgemäßen Verfahren ein Färbungsmuster erzeugen, das eine Kombination der von deren Komponenten-Sonden einzeln produzierten Färbungsmuster darstellt. Daher können die Begriffe "Sonde" und "Sonden" (das heißt, die Einzahl- und Mehrzahlform) im Zusammenhang mit einem erzeugten Färbungsmuster austauschbar verwendet werden. Wenn beispielsweise eine erfindungsgemäße Sonde einen Punkt auf Chromosom 9 erzeugt, und eine andere Sonde erzeugt eine Bande auf Chromosom 11, dann bilden die zwei Sonden zusammen eine Sonde, die ein Punkt/Bande-Färbungsmuster erzeugt.
Der Begriff "markiert" wird hierin verwendet, um darauf hinzuweisen, dass ein Verfahren zur Visualisierung der gebundenen Sonde existiert, unabhängig davon ob die Sonde direkt einen modifizierten Bestandteil trägt oder nicht. Der nachstehende Abschnitt III beschreibt verschiedene Mittel zum direkten Markieren der Sonde und andere Markierungsmittel, mit welchen die gebundene Sonde nachgewiesen werden kann.
Die Begriffe "Färben" bzw. "Färbung" oder "Anfärben" bedeuten hierin definitionsgemäß das Hybridisieren einer erfindungsgemäßen Sonde an ein Genom oder ein Segment davon, so dass die Sonde zuverlässig an das darin befindliche chromoso male Ziel-Material bindet und die gebundene Sonde visualisiert werden kann. Die Begriffe "Färben" oder "Anfärben" werden austauschbar verwendet. Die durch das "Färben" oder "Anfärben" erhaltenen Muster sind nützlich für zytogenetische Analysen, insbesondere für molekulare zytogenetische Analysen. Die Färbungsmuster erleichtern die mikroskopische und/oder durchflusszytometrische Identifizierung normaler und anomaler Chromosomen und die Charakterisierung der genetischen Natur spezieller Anomalien. Der nachstehende Abschnitt III beschreibt Verfahren zum Sichtbarmachen der Sonde. Da vielfältige kompatible Verfahren der Sondenvisualisierung verfügbar sind, können die Bindungsmuster verschiedener Komponenten der Sonde unterschieden werden, beispielsweise durch Farbe. Diese Erfindung kann daher jedes gewünschte Färbungsmuster, das mittels einer oder mehrerer Farben (ein Vielfarben-Färbungsmuster) und/oder anderer Indikatorverfahren visualisiert wird, auf den Chromosomen erzeugen. Der Begriff "Färben", wie er hierin definiert ist, beinhaltet nicht das Konzept des Färbens von Chromosomen mit Chemikalien wie bei konventionellen Verfahren zur Karyotyp-Bestimmung, obwohl solche konventionellen Färbemittel in Verbindung mit den erfindungsgemäßen Sonden verwendet werden können, um die Visualisierung jener Teile des Genoms zu ermöglichen, an welche die Sonde nicht bindet. Die Verwendung von DAPI und Propidiumiodid für einen solchen Zweck ist in den Figuren dargestellt.
Der Ausdruck "hohe Komplexität" bedeutet hierin definitionsgemäß, dass die dadurch näher bestimmte Sonde in der Größenordnung von 50.000 (50 kB) oder mehr, bis zu vielen Millionen oder mehreren Milliarden Basen von Nukleinsäuresequenzen, die in der Sonde nicht wiederholt sind, enthält. Beispielsweise können typische erfindungsgemäße Nukleinsäuresonden hoher Komplexität eine Komplexität von größer als 50 kB, größer als 100.000 Basen (100 kB), größer als 200.000 (200 kB), größer als 500.000 Basen (500 kB), größer als eine Million Basen (1 MB), größer als 2 MB, größer als 10 MB, größer als 100 MB, größer als 500 MB, größer als 1 Milliarde Basen und weiters größer als mehrere Milliarden Basen aufweisen.
Der Begriff "Komplexität" ist hierin gemäß dem Standard für die Nukleinsäure-Komplexität definiert, wie er von Britten et al., Methods of Enzymol., 29:363 (1974) aufgestellt wurde. Siehe auch Cantor und Schimmel, Biophysical Chemistry: Part III: The Behavior of Biological Macromolecules, S. 1228-1230 (Freeman and Co. 1980) zur weiteren Erklärung und beispielhaften Darstellung der Nukleinsäure-Komplexität.
Die für eine erfindungsgemäße Sondenzusammensetzung bevorzugte Komplexität hängt von der Anwendung ab, für die sie bestimmt ist. Im allgemeinen ist die Sonde umso komplexer, je größer der Zielbereich ist. Es ist vorauszusehen, dass die zum Erzeugen eines gewünschten Musters von Markierungspunkten auf einem Chromosom notwendige Komplexität einer Sonde mit zunehmender Hybridisierungsempfindlichkeit entsprechend den Fortschritten in der Hybridisierungstechnologie abnehmen wird. Mit zunehmender Empfindlichkeit wird die Zuverlässigkeit des Signals von kleineren Zielstellen zunehmen. Während daher gegenwärtig eine Zielsequenz mit etwa 40 kB bis etwa 100 kB zur Lieferung eines zuverlässigen, leicht nachweisbaren Signals notwendig sein kann, sollten zukünftig kleinere Zielsequenzen zuverlässige Signale liefern. Daher sollte mit zunehmender Hybridisierungsempfindlichkeit eine Sonde mit einer bestimmten Komplexität, beispielsweise 100 kB, den Anwender in die Lage versetzen, beträchtlich mehr Loci in einem Genom nachzuweisen als derzeit zuverlässig nachgewiesen werden; somit wird mit einer Sonde derselben Komplexität mehr Information erhalten werden. Der Begriff "Komplexität" bezieht sich daher auf die Komplexität der gesamten Sonde, unabhängig davon, wie viele visuell unterscheidbare Loci nachgewiesen werden sollen, das heißt, unabhängig von der Verteilung der Zielstellen über das Genom.
Wie oben angedeutet, ist es mit den gegenwärtigen Hybridisierungstechniken möglich, ein zuverlässiges, leicht nachweisbares Signal mit einer Sonde mit etwa 40 kB bis etwa 100 kB (z.B. die Sonden-Insertionskapazität eines oder einiger weniger Cosmide), die auf einen kompakten Punkt im Genom zielt, zu erhalten. Somit erlaubt derzeit beispielsweise eine Komplexität im Bereich von ungefähr 100 kB eine Hybridisierung an beide Seiten einer tumorspezifischen Translokation. Der auf die eine Seite der Bruchstelle zielende Teil der Sonde kann verschieden von jenem Teil der Sonde markiert werden, der auf die andere Seite der Bruchstelle zielt, so dass die zwei Seiten beispielsweise durch verschiedene Farben differenziert werden können.
Das proportionale Erhöhen der Komplexität der Sonde erlaubt die gleichzeitige Analyse multipler kompakter Regionen des Genoms. Die konventionellen, mit chemischen Färbemitteln erzeugten Bandenmuster können erfindungsgemäß durch eine Serie auf Sonden basierender, (beispielsweise) farbcodierter Referenzpunkte entlang jedes Chromosoms oder signifikanter Regionen davon ersetzt werden.
Das gleichmäßige Färben einer ausgedehnten, zusammenhängenden Region eines Genoms, beispielsweise eines ganzen Chromosoms, erfordert eine Sondenkomplexität, die der Komplexität der Zielregion proportional, jedoch wesentlich nedriger als diese ist. Die benötigte Komplexität ist lediglich jene, die für die Bereitstellung eines zuverlässigen, im wesentlichen gleichmäßigen Signals auf dem Ziel notwendig ist. Abschnitt V.B, weiter unten zeigt, dass für die Fluoreszenzfärbung des menschlichen Chromosoms 21, das etwa 50 Megabasen (MB) DNA enthält, eine Sondenkomplexität von etwa 1 MB ausreichend ist. 4H veranschaulicht die Hybridisierung von etwa 400 kB einer Sonde an das menschliche Chromosom 4, das etwa 200 MB DNA enthält. In diesem Fall sind Lücken zwischen der Hybridisierung der einzelnen Elemente der Sonde sichtbar. Die 4B und 4F zeigen die Ergebnisse, welche mit Sonden erzielt wurden, die aus vollständigen Bibliotheken für die Chromosomen 4 bzw. 21 bestanden. Wie in den 4B und 4F gezeigt ist, sind die Chromosomen viel dichter gefärbt als mit der Einzelkopie-Sequenzen umfassenden Sonde niedrigerer Komplexität, die zur Erzeugung des Musters von 4H verwendet wurde.
Eine Erhöhung der Komplexität über das für eine ausreichende Färbung benötigte Minimum hinaus ist nicht nachteilig, solange die Nukleinsäure-Gesamtkonzentration in der Sonde unter dem Punkt bleibt, wo die Hybridisierung beeinträchtigt wird. Eine geringere Konzentration eines Teils einer Sequenz in der Sonde wird durch die Erhöhung der Zahl der Zielstellen kompensiert. Wenn doppelsträngige Sonden verwendet werden, ist es tatsächlich bevorzugt, eine relativ niedrige Konzentration jedes Teils der Sequenz aufrechtzuerhalten, um die Reassoziation zu inhibieren, bevor der Teil der Sequenz auf dem Ziel eine Bindungsstelle finden kann.
Die erfindungsgemäßen Färbungsmuster umfassen eine oder mehrere "Banden". Der Begriff "Bande" ist hier definiert als ein Referenzpunkt in einem Genom, der eine Ziel-Nukleinsäuresequenz, die an eine Sondenkomponente gebunden ist, umfasst, welcher Doppelstrang durch bestimmte Indikatormittel nachweisbar ist und in seiner kleinsten Abmessung unter den angewendeten Bedingungen und Protokollen für die Hybridisierung und der Instrumentierung, neben anderen Variablen, ein zuverlässiges Signal liefert. Eine Bande kann sich von der kleinsten Abmessung einer Sequenz, die ein zuverlässiges Signal liefert, über ein ganzes Chromosom bis zu multiplen Regionen auf einer Zahl von Chromosomen erstrecken.
Die erfindungsgemäßen, durch Sonden erzeugten Banden müssen von den Banden unterschieden werden, die durch chemische Färbung erzeugt werden, wie oben im Kapitel Hintergrund dargestellt. Die erfindungsgemäßen, durch Sonden erzeugten Banden basieren auf Nukleinsäuresequenzen, während die durch chemische Färbung erzeugten Banden von natürlichen Eigenschaften der Chromosomen, jedoch nicht von der tatsächlichen Nukleinsäuresequenz abhängen. Die durch chemische Färbung erzeugten Bandenmuster sind außerdem nur für Metaphasechromosomen interpretierbar, während die erfindungsgemäßen, durch Sonden erzeugten Banden sowohl für Metaphase- als auch Interphasechromosomen brauchbar sind.
Für Vergleichszwecke wird die Färbung von Metaphasechromosomen nachstehend diskutiert und dargestellt. Es ist jedoch ersichtlich, dass die Erfindung das Färben von Interphase-DNA betrifft.
Ein Verfahren zur Bildung der erfindungsgemäßen Sonden besteht darin, viele verschiedene Sonden niedriger Komplexität zu poolen. Eine solche Sonde würde dann ein "heterogenes Gemisch" einzelner klonierter Sequenzen umfassen. Die Zahl der erforderlichen Klone hängt von der Ausdehnung des Zielbereichs und der Kapazität des Klonierungsvektors ab. Wenn das Ziel aus mehreren diskreten, kompakten Loci besteht, das heißt, einzelnen Spots an der Grenze der mikroskopischen Auflösung, dann liefern mit den gegenwärtigen Techniken etwa 40 kB, mehr bevorzugt 100 kB, für jeden Spot ein zuverlässiges Signal. Der Sondenteil für jeden Spot kann bei spielsweise aus einer einzelnen Einfügungssequenz aus einem künstlichen Hefe-Chromosom (YAC), aus mehreren Cosmiden, von denen jedes 35-40 kB Sondensequenz enthält, oder aus etwa 25 Plasmiden mit jeweils 4kB Sequenz bestehen.
Typische heterogene Gemische von Klonen, die hierin beispielhaft dargestellt sind, schließen Phagen (1, 2 und 3) und Plasmide (4) ein. Künstliche Hefe-Chromosomen (YACS) (5) und ein einzelnes menschliches Chromosom in einer Interspecies-Hybridzelle (6) sind Beispiele für Sonden hoher Komplexität für einzelne Loci und ein ganzes Chromosom, welche als Einzelklon vermehrt werden können.
Eine Basensequenz an irgendeinem Punkt des Genoms kann entweder als "Einzelkopie" oder als "repetitiv" klassifiziert werden. Zu Praxiszwecken muss die Sequenz lang genug sein, so dass unter den angewendeten Hybridisierungsbedingungen eine komplementäre Sondensequenz mit der Zielsequenz ein stabiles Hybrid bilden kann. Eine solche Länge liegt typischerweise im Bereich von mehreren zehn bis hunderten Nukleotiden.
Eine "Einzelkopie-Sequenz" liegt vor, wenn nur eine Kopie der Ziel-Nukleinsäuresequenz im haploiden Genom vorhanden ist. "Einzelkopie-Sequenzen" sind in der Literatur auch als "einmalige Sequenzen" bekannt. Eine "repetitive Sequenz" liegt vor, wenn mehr als eine Kopie der gleichen Ziel-Nukleinsäuresequenz im Genom vorhanden ist. Jede Kopie einer repetitiven Sequenz muss nicht identisch mit allen anderen sein. Das wesentliche Merkmal besteht darin, dass die Sequenz den anderen Mitgliedern der Familie repetitiver Sequenzen ausreichend ähnlich ist, so dass unter den angewendeten Hybridisierungsbedingungen dasselbe Fragment der Sondennukleinsäure stabile Hybride mit jeder Kopie bilden kann. Eine "gemeinsame repetitive Sequenz" ist eine Sequenz mit einigen Kopien in der Zielregion des Genoms und einigen an anderer Stelle.
Wenn die Adjektive "Einzelkopie-", "repetitiv", "gemeinsam repetitiv" – unter anderen solchen näher bestimmenden Begriffen – verwendet werden, um Sequenzen in der Sonde zu beschreiben, beziehen sie sich auf die Art der Sequenz im Zielbereich, an welche die Sondensequenz binden wird. "Eine repetitive Sonde" ist daher eine, die an eine repetitive Sequenz im Zielbereich bindet; und "eine Einzelkopie-Sonde" bindet an eine Einzelkopie-Zielsequenz.
Repetitive Sequenzen treten im haploiden Genom in multiplen Kopien auf. Die Kopienzahl kann von zwei bis hunderttausenden reichen, wobei die Alu-Familie repetitiver DNA für die letztgenannte vielzahlige Art beispielhaft ist. Die Kopien der Wiederholungssequenzen können gehäuft oder über das Genom gestreut sein. Die Wiederholungssequenzen können an einer oder mehreren Stellen des Genoms gehäuft sein, beispielsweise repetitive Sequenzen, die nahe den Zentromeren jedes Chromosoms auftreten, und Tandem-Wiederholungssequenzen variabler Zahl (VNTRs) [Nakamura et al., Science, 235:1616 (1987)]; oder die Wiederholungssequenzen können über ein einzelnes Chromosom verteilt sein [beispielsweise nur auf dem X-Chromosom vorhandene Wiederholungssequenzen, wie von Bardoni et al., Cytogenet. Cell Genet., 46:575 (1987) beschrieben]; oder die Wiederholungssequenzen sind über alle Chromosomen verteilt, beispielsweise die Alu-Familie repetitiver Sequenzen.
Die Begriffe repetitive Sequenzen, wiederholte Sequenzen und Wiederholungssequenzen werden hierin austauschbar verwendet.
Gemeinsame repetitive Sequenzen können gehäuft oder gestreut sein. Gehäufte repetitive Sequenzen schließen Tandem-Wiederholungssequenzen ein, die so genannt werden, weil sie am DNA-Molekül, welches das Rückgrat eines Chromosoms bildet, benachbart sind. Gehäufte Wiederholungssequenzen sind mit wohldefinierten Regionen eines oder mehrerer Chromosomen assoziiert, z.B. der Zentromerregion. Wenn eine oder mehrere gehäufte Wiederholungssequenzen einen beträchtlichen Anteil eines Chromosoms ausmachen und auch in einer oder mehreren Nichtziel-Region(en) des Genoms vorhanden sind und daher aus dem erfindungsgemäß angewendeten heterogenen Gemisch von Fragmenten entfernt wurden oder deren Hybridisierungsvermögen ausgeschaltet wurde, kann es sein, dass eine vollkomme ne Gleichmäßigkeit der Färbung der Zielregion nicht möglich ist. Diese Situation wird durch die Verwendung des Begriffes "im wesentlichen gleichmäßig", bezogen auf die Bindung des heterogenen Gemisches markierter Nukleinsäurefragmente an das Ziel, ausgedrückt.
Die chromosomenspezifische Färbung der vorliegenden Erfindung wird durch Verwendung von Nukleinsäurefragmenten erzielt, welche an Sequenzen binden, die spezifisch für das Ziel sind. Diese Sequenzen können entweder Einzelkopie- oder repetitive Sequenzen sein, wobei die Kopien der Wiederholungssequenz überwiegend im Zielbereich auftreten. 4H und die Ergebnisse der unten in Abschnitt V näher beschriebenen Arbeit zeigen, dass Sonden aus Einzelkopie-Sequenzen bestehen können. Bei solchen Sonden wie jener von 4B können jedoch chromosomenspezifische Wiederholungssequenzen niedriger Kopienzahl [Nakamura et al. und Bardoni et al., siehe oben] ebenfalls zur Hybridisierung beitragen.
Wenn Nukleinsäurefragmente, die zu Nichtziel-Regionen des Genoms komplementär sind, in der Sonde vorhanden sind, beispielsweise gemeinsame repetitive Sequenzen oder unspezifische Sequenzen, muss deren Hybridisierungsvermögen ausreichend ausgeschaltet oder ihre Häufigkeit ausreichend reduziert werden, damit ein adäquater Färbungskontrast erzielt werden kann. Abschnitt V und 4H zeigen Hybridisierungsbeispiele mit Sonden, die Klon-Pools enthalten, bei denen jeder Klon individuell ausgewählt wurde, so dass er an Einzelkopie-Sequenzen oder repetitive Sequenzen sehr niedriger Kopienzahl hybridisiert. Die restlichen Figuren veranschaulichen die Verwendung von Sonden, die Fragmente enthalten, welche an repetitive Sequenzen hoher Kopienzahl hybridisieren hätten können, bei denen jedoch das Hybridisierungsvermögen solcher Sequenzen ausgeschaltet worden war.
Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuresonden müssen nicht absolut spezifisch für den Zielbereich des Genoms sein. Sie sollen einen "Färbungskontrast" erzeugen. Der "Kontrast" wird durch das Verhältnis der Färbungsintensität der Zielregion des Genoms zu jener der anderen Teile des Genoms quantifiziert. Beispielsweise kann eine durch Klonieren eines speziellen Chromosoms hergestellte DNA-Bibliothek, wie z.B. die in Tabelle I angeführten Bibliotheken, als Sonde zum Färben des ganzen Chromosoms verwendet werden. Die Bibliothek enthält Sequenzen, die nur auf diesem Chromosom vorhanden sind, und mit anderen Chromosomen gemeinsame Sequenzen. In einem vereinfachten (ungefähr lebensechten) Modell des menschlichen Genoms fällt etwa die Hälfte der chromosomalen DNA in jede dieser Klassen. Wenn die Hybridisierung mit der gesamten Bibliothek alle Bindungsstellen absättigen könnte, würde das Ziel-Chromosom zweimal so hell (Kontrastverhältnis 2) wie die anderen sein, da es Signale von den spezifischen und den gemeinsamen Sequenzen der Sonde enthalten würde, während das andere Chromosom nur das Signal von den gemeinsamen Sequenzen aufweisen würde. Eine mäßige Verringerung der Hybridisierung der gemeinsamen Sequenzen in der Sonde würde daher den Kontrast wesentlich erhöhen. Kontaminierende Sequenzen, die nur an Nichtziel-Sequenzen hybridisieren, beispielsweise Verunreinigungen in einer Bibliothek, können in der Sonde bis zu dem Grad toleriert werden, dass diese Sequenzen nicht den Färbungskontrast unter ein brauchbares Niveau reduzieren.
In Wirklichkeit kann es sein, dass nicht alle Zielstellen während der Hybridisierung abgesättigt werden, und viele andere Mechanismen tragen zur Erzeugung von Färbungskontrast bei, aber dieses Modell veranschaulicht eine allgemeine Überlegung bei der Verwendung von Sonden, die auf einen großen Teil eines Genoms zielen.
Der benötigte Kontrast hängt von der Anwendung ab, für welche die Sonde bestimmt ist. Bei mikroskopischer Visualisierung von Chromosomen und Zellkernen etc. ist ein Kontrastverhältnis von zwei oder größer zur Identifizierung ganzer Chromosomen oft ausreichend. In den 4D-F beträgt das Kontrastverhältnis 3-5. Je kleiner die einzelnen Segmente der Zielregion sind, desto größer muss der Kontrast sein, um eine zuverlässige Erkennung des Ziels in Relation zu den Schwankungen der Färbung der Nichtziel-Regionen zu erlauben. Wenn die in einem Zellkern vorhandene Größe der Zielregion durch Messungen der Fluoreszenzintensität unter Anwendung von Durchflußzytometrie oder quantitativer Mikroskopie quantifiziert werden soll, liegt das benötigte Kontrastverhältnis in der Größenordnung von durchschnittlich 1/T oder größer für das Genom, wobei T der in der Zielregion enthaltene Anteil des Genoms ist. Wenn das Kontrastverhältnis gleich 1/T ist, kommt eine Hälfte der gesamten Fluoreszenzintensität von der Zielregion und eine Hälfte vom restlichen Genom. Wenn beispielsweise eine Sonde hoher Komplexität für Chromosom 1, das etwa 10% des Genoms umfasst, verwendet wird, liegt das benötigte Kontrastverhältnis in der Größenordnung von 10, damit die Chromosom 1-Fluoreszenzintensität jener des restlichen Genoms gleich ist.
Es kann sein, dass die Hintergrundfärbung durch die Sonde, das heißt auf den Nichtziel-Regionen des Genoms, nicht gleichmäßig ist. 4F zeigt, dass eine für Chromosom 21 spezifische Sonde Sondenfragmente enthält, die an kompakte Regionen nahe den Zentromeren anderer akrozentrischer menschlicher Chromosomen schwach hybridisieren. Dieser Grad an Unspezifität verhindert nicht ihre Verwendung für die dargestellten Anwendungen. Für andere Anwendungen kann die Entfernung oder ein weitergehendes Ausschalten des Hybridisierungsvermögens der Sondenfragmente, die an diese Sequenzen binden, notwendig sein.
Für andere Anwendungen können repetitive Sequenzen, die an Zentromere binden, beispielsweise α-Satellitensequenzen, und/oder Telomere Teil der chromosomenspezifischen Färbereagenzien sein, wobei das Ziel einige oder alle Zentromere und/oder Telomere in einem Genom gemeinsam mit vielleicht anderen chromosomalen Regionen einschließt. Dafür typisch würde eine solche Anwendung sein, bei der das Färbereagenz so ausgelegt ist, dass es durch erbsubstanzverändernde Mittel bewirkte, zufällige strukturelle Aberrationen, die zu dizentrischen Chromosomen und anderen strukturellen Anomalien, wie z.B. Translokationen, führen, nachweist. Die Zugabe von Sequenzen, die an alle Zentromere eines Genoms binden, beispielsweise zur Sonde, die zur Erzeugung des Färbungsmusters von 4D verwendet wurde, würde eine zuverlässigere Unterscheidung zwischen dizentrischen Chromosomen und Translokationen erlauben.
Die Anwendung der erfindungsgemäßen Färbereagenzien auf ein Genom führt zu einer im wesentlichen gleichförmigen Verteilung der an die Zielregionen eines Genoms hybridisierten Sonde. Die Verteilung der gebundenen Sonde wird als "im we sentlichen gleichmäßig" angesehen, wenn die Zielregionen des Genoms mit einem brauchbaren Kontrast visualisiert werden können. Beispielsweise ist ein Ziel in dem Fall, wo es eine Serie visuell getrennter Loci darstellt, im wesentlichen gleichmäßig gefärbt, wenn der Großteil der Loci im Großteil der Zellen sichtbar ist.
"Wesentliche Anteile" bedeutet bezogen auf die Basensequenzen der Nukleinsäurefragmente, die zur chromosomalen DNA komplementär sind, dass die Komplementarität extensiv genug ist, dass die Fragmente unter den angewendeten Hybridisierungsbedingungen stabile Hybride mit der chromosomalen DNA bilden. Insbesondere umfasst der Begriff die Situation, wo die Nukleinsäurefragmente des heterogenen Gemisches einige Sequenzregionen besitzen, die zum chromosomalen Ziel-Material nicht vollkommen komplementär sind. Die Stringenz kann eingestellt werden, um die für die Hybridisierung benötigte Komplementaritätsgenauigkeit zu steuern.
Der Ausdruck "Metaphasechromosomen" bedeutet hier definitionsgemäß nicht nur im Metaphase-Stadium der Mitose kondensierte Chromosomen, sondern schließt alle kondensierten Chromosomen ein, beispielsweise jene, die durch vorzeitige Chromosomenkondensation kondensiert sind.
Das Ausschalten des Hybridisierungsvermögens einer Nukleinsäurensequenz wird hier manchmal als "Ausschalten der Nukleinsäuresequenz" abgekürzt.
Die erfindungsgemäßen Verfahren und Reagenzien finden eine besonders zweckmäßige Anwendung auf dem Gebiet der diagnostischen Zytogenetik, insbesondere auf dem Gebiet der diagnostischen Interphase-Zytogenetik. Der Nachweis genetischer Umordnungen, die mit einer Krankheit wie z.B. Krebs assoziiert sind, stellt eine spezifische Anwendung der erfindungsgemäßen chromosomenspezifischen Reagenzien und Färbeverfahren dar.
Benachbarte Gene betreffende Syndrome sind ein Beispiel für die genetischen Umordnungen, welche die erfindungsgemäßen Sonden und Verfahren identifizieren können. Benachbarte Gene betreffende Syndrome sind durch das Vorhandensein mehrerer eng beisammenliegender Gene charakterisiert, die in multipler und/oder reduzierter Kopienzahl vorliegen können. Das Down-Syndrom ist ein Beispiel für ein benachbarte Gene betreffendes Syndrom, bei dem eine zusätzliche Kopie einer mehrere Gene enthaltenden Chromosomenregion vorhanden ist.
Insbesondere ist hierin die Anwendung von chromosomenspezifischen Reagenzien und Verfahren zum Nachweis genetischer Umordnungen, welche die mit CML assoziierte BCR-ABL-Fusion erzeugen, beschrieben. Solche Reagenzien sind beispielhaft für krankheitsspezifische, in diesem Fall tumorspezifische Sonden, die direkt und/oder indirekt markiert werden können, so dass sie sichtbar gemacht werden können, wenn sie an das chromosomale Ziel-Material, das im Falle von CML der Nachbarbereich der Translokationsbruchstellen-Regionen der bekanntermaßen mit CML assoziierten Chromosomenregionen 9q34 und 22q11 ist, gebunden sind. Bei den in Abschnitt VIII dieser Anmeldung zur Verfügung gestellten Beispielen werden die Sonden so markiert, dass im Färbungsmuster dieser Sonden nach In situ-Hybridisierung [Fluoreszenz-In situ-Hybridisierung (FISH)] eine Zweifarben-Fluoreszenz erzeugt wird; die Färbungsmuster können jedoch in vielen Farben erzeugt werden und andere Arten von Signalen und alle Visualisierungsmittel, welche die an ihr Ziel gebundene Sonde anzeigen, können bei den erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden.
Abschnitt VIII beschreibt hierin repräsentative erfindungsgemäße Verfahren und Reagenzien zum Nachweis genetischer Umordnungen. Die Beispiele von Abschnitt VIII betreffen genetische Umordnungen, welche die für CML charakteristische BCR-ABL-Fusion erzeugen. Die Vorgangsweise bei solchen Beispielen basiert auf FISH mit Sonden aus den Chromosomen 9 und 22, welche die fusionierten BCR- und ABL-Sequenzen praktisch bei allen CML-Fällen flankieren (8). Wenn die Sonden an das chromosomale Material sowohl normaler als auch anomaler Zellen hybridisiert werden, erzeugen sie unterschiedliche Färbungsmuster, wie dies in den 8-12 dargestellt ist. Die durch solche typischen Sonden erzeugten Färbungsmuster unterscheiden sich in normalen und anomalen Zellen; das Färbungsmuster, das vorliegt, wenn die genetische Umordnung auftritt, ist gegenüber dem Färbungsmuster, das sich durch Hybridisieren der Sonden an chromosomales Material, welches die genetische Umordnung nicht enthält, zeigt, eindeutig verändert. Außerdem sind Färbungsmuster für eine Art von genetischer Umordnung gegenüber einer anderen Art eindeutig verschieden. Beispielsweise sind die Färbungsmuster, welche nach Hybridisieren von erfindungsgemäßen Nukleinsäuresonden an chromosomales Material, das eine mit ALL assoziierte genetische Umordnung enthält, erzeugt werden, eindeutig verschieden von jenen, die nach Hybridisierung solcher Sonden an chromosomales Material erzeugt werden, das die für CML charakteristische BCR-ABL-Fusion enthält. Die erfindungsgemäßen Verfahren und Reagenzien ermöglichen daher die Differentialdiagnose verwandter Erkrankungen.
Die Beispiele von Abschnitt VIII ermöglichen die Diagnose von CML, basierend auf der Nähe der Fluoreszenzsignale in den Färbungsmustern, und stützen sich auf einen Grenzwert von 1 Mikron zur Bestimmung des Vorliegens einer Fusion. Der Nahabstand der Signale ist nur ein Kennzeichen der Signale unter vielen anderen, das zum Nachweis des Vorliegens einer genetischen Umordnung verwendet werden kann. Der Nahabstand ist außerdem von den angewendeten speziellen Zellpräparationstechniken und der Größe der darin befindlichen Zellkerne abhängig und ist für eine spezielle Zellpräparation relativ, abhängig vom Abstand zwischen den Signalen in normalen und anomalen Zellen.
Die in den Beispielen von Abschnitt VIII beispielhaft dargestellten Färbungsmuster sind für eine Art der Sondenstrategie repräsentativ. Viele andere Sondenstrategien können angewendet werden. 11 veranschaulicht einige andere beispielhaften Sondenstrategien zum Nachweis genetischer Umordnungen, deren Muster modifiziert und optimiert und in anderer Weise variiert werden können, um spezielle genetische Umordnungen nachzuweisen.
Die Verwendung anderer erfindungsgemäßer krankheitsspezifischer Reagenzien würde den in Abschnitt VIII für CML näher beschriebenen Verfahren analog sein. Beispielsweise kann die Diagnose und Untersuchung von akuter lymphatischer Leukämie (ALL) durch Ersetzen der BCR-Sonde (PEM12) von Abschnitt VIII durch eine Sonde vom 5'-Ende des BCR-Gens erreicht werden. ALL ist von besonderem Interesse, da das Ph¹-Chromosom die häufigste Anomalie bei dieser Erkrankung ist, und das Vorhandensein eines solchen Chromosoms auf ein sehr aggressives Neoplasma hinweist.
Die hier insbesondere in Abschnitt VIII beispielhaft dargestellten Verfahren und Reagenzien stellen die Mittel zu Verfügung, zwischen zytogenetisch ähnlichen, aber genetisch verschiedenen Erkrankungen zu unterscheiden. "Zytogenetisch" bezieht sich in diesem speziellen Zusammenhang auf eine Ähnlichkeit, die durch eine konventionelle Bandenanalyse bestimmt wird. CML und ALL sind in diesem Zusammenhang dadurch zytogenetisch ähnlich, dass eine konventionelle Banden-Analyse nicht zwischen ihnen unterscheiden kann, weil die zugehörigen Bruchstellen im menschlichen Genom so nahe beisammenliegen.
Diese Erfindung stellt des Weiteren Verfahren und Reagenzien zur Verfügung, die in der zytogenetischen Forschung als Arbeitsweise zur Untersuchung der molekularen Grundlagen genetischer Erkrankung verwendet werden können. Wenn beispielsweise im Karyotyp einer Person mittels konventioneller Banden-Analyse eine Anomalie beobachtet wird, können die erfindungsgemäßen Sonden und Reagenzien verwendet werden, um irgendwelche genetischen Umordnungen in der Nähe der Anomalie nachzuweisen. Die der Anomalie zugrunde liegende molekulare Basis kann durch die erfindungsgemäßen Verfahren und Reagenzien bestimmt werden, und die resultierenden Unterschiede auf der genetischen Ebene können Hinweise auf verschiedene Behandlungspläne geben und prognostisch wichtig sein. Es kann sich zeigen, dass die zugrunde liegenden genetischen Umordnungen regelmäßig mit einem Satz phänotypischer Charakteristiken in einer Population assoziiert sind.
Die folgenden Abschnitte geben Beispiele für die Herstellung und Verwendung der erfindungsgemäßen Färbezusammensetzungen und dienen lediglich Veranschaulichungszwecken und sollen die Erfindung in keiner Weise beschränken. In der folgenden Beschreibung sind auch Beispiele für das Screening von Metaphasespreitungen eingeschlossen. Obwohl solche Beispiele nicht im Bereich der vorliegenden Ansprüche eingeschlossen sind, werden sie als nützlich für das Verständnis und die Anwendung der vorliegenden Erfindung, welche den Nachweis von Translokationen in Interphasezellen betrifft, angesehen. Wie vorstehend aufgezeigt, veranschaulichen die Beispiele Färbeverfahren für Metaphasechromosomen und Nachweisverfahren für genetische Umordnungen, welche von chromosomalen Amplifikationen und Deletionen verschieden sind. Solche Verfahren werden hierin jedoch nicht beansprucht.
Die folgenden Abkürzungen werden verwendet.
Abkürzungen

BN: – Bicarbonat-Puffer mit NP-40
DAPI: – 4,6-Diamidino-2-phenylindol
DCS: – wie in Fluorescein-Avidin DCS (eine kommerziell erhältliche sortierte Qualität von Fluorescein-Avidin D)
AAF: – N-Acetoxy-N-2-acetylaminofluoren
EDTA: – Ethylendiamintetraacetat
FACS: – Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung
FITC: – Fluoresceinisothiocyanat
IB: – Isolierungspuffer
NP-40: – nichtionisches Detergens, kommerziell erhältlich von Sigma als Nonidet P-40 (St. Louis, MO)
PBS: – Phosphatgepufferte Kochsalzlösung
PI: – Propidiumiodid
PMSF: – Phenylmethylsulfonylfluorid
PN-Puffer: – Gemisch von 0,1 M NaH₂PO₄ und 0,1 M Na₂HPO₄, pH 8; 0,1% NP-40
PNM-Puffer: – Pn-Puffer plus 5% fettfreie Trockenmilch (zentrifugiert); 0,02% Na-Azid
SDS: – Natriumdodecylsulfat
SSC: – 0,15 M NaCl/0,015 M Na-Citrat, pH 7
VNTR: – Tandem-Wiederholungssequenz variabler Zahl

I. Verfahren zur Herstellung chromosomenspezifischer Färbereagenzien
I.A. Isolierung chromosomenspezifischer DNA und Bildung von DNA-Fragment-Bibliotheken
Der erste Schritt bei einem bevorzugten Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen besteht in der Isolierung chromosomenspezifischer DNA (welcher Begriff wie oben erwähnt zielspezifische und/oder regionsspezifische DNA beinhaltet, wobei spezifisch sich auf die Herkunft der DNA bezieht). Dieser Schritt beinhaltet als erstes das Isolieren einer ausreichenden Menge des speziellen Chromosomentyps oder der chromosomalen Subregion, auf welche die Färbezusammensetzung gerichtet ist, dann das Extrahieren der DNA aus dem (den) isolierten Chromosom(en) oder der (den) chromosomalen Subregion(en). "Ausreichende Menge" bedeutet hier ausreichend, um die nachfolgenden Schritte des Verfahrens durchzuführen. Die extrahierte DNA wird vorzugsweise verwendet, um unter Verwendung gentechnologischer Standardtechniken durch Klonieren eine Bibliothek von DNA-Einfügungssequenzen zu erstellen.
Bevorzugte Klonierungsvektoren schließen künstliche Hefe-Chromosomen (YACS), Plasmide, Bakteriophagen und Cosmide ein, sind aber nicht darauf beschränkt. Bevorzugte Plasmide sind Bluescribe-Plasmide; bevorzugte Bakteriophagen sind Lambda-Insertionsvektoren, insbesondere Charon 4A, Charon 21A, Charon 35, Charon 40 und GEM11; und bevorzugte Cosmide schließen Lawrist 4, Lawrist 5 und sCos1 ein.
Wie vorstehend erwähnt, kann die DNA aus jedem Ausgangsmaterial isoliert sein. Chromosomenspezifische Färbereagenzien können gemäß den erfindungsgemäßen Verfahren sowohl aus pflanzlicher als auch tierischer DNA hergestellt sein. Wichtige Quellen für tierische DNA sind Säuger, insbesondere Primaten oder Nagetiere, wobei Primatenquellen insbesondere Mensch und Affe sind und Nagetierquellen insbesondere Ratten oder Mäuse und besonders bevorzugt Mäuse sind.
1. Isolieren der DNA von einem ganzen Chromosom.
Ein bevorzugtes Mittel zur Isolierung bestimmter ganzer Chromosomen (spezifischer Chromosomentypen) besteht in der direkten Durchflusssortierung [Fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS)] von Metaphasechromosomen mit oder ohne Verwendung interspezifischer Hybridzellsysteme. Bei einigen Species kann jedes Chromosom durch die gegenwärtig verfügbaren Sortiertechniken isoliert werden. Die meisten, wenn auch nicht alle menschlichen Chromosomen sind derzeit mittels Durchflußsortierung aus menschlichen Zellen isolierbar, Carrano et al., "Measurement and Purification of Human Chromosomes by Flow Cytometry and Sorting", Proc.Natl. Acad. Sci., Bd. 76, S. 1382-1384 (1979). Für die Isolierung einiger menschlicher Chromosomen kann daher die Verwendung des Mensch/Nagetier-Hybridzellsystems notwendig sein, siehe Kao, "Somatic Cell Genetics and Gene Mapping," International Review of Cytology., Bd. 85, S. 109-146 (1983) für eine Übersicht, und Gusella et al., "Isolation and Localization of DNA Segments from Specific Human Chromosomes," Proc. Natl. Acad. Sci., Bd. 77, S. 2829-2833 (1980). Die Chromosomensortierung kann mit kommerziell erhältlichen Fluoreszenz-aktivierten Sortiermaschinen, z.B. Becton Dickinson FACS-II, Coulter Epics V Sortierer oder für Chromosomensortierung optimierte Sortierer für Spezialzwecke oder dergleichen Geräte durchgeführt werden.
DNA wird aus den isolierten Chromosomen mittels Standardtechniken isoliert, z.B. Marmur, "A Procedure for the Isolation of Deoxyribonucleic Acid from Micro-Organisms," J. Mol. Biol., Bd. 3, S. 208-218 (1961); oder Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laborstory, 1982) S. 280-281. Diese Referenzdokumente werden bezüglich ihrer Beschreibungen von DNA-Isolierungstechniken durch Zitat aufgenommen.
Die Herstellung von Einfügungssequenz-Bibliotheken aus der isolierten chromosomenspezifischen DNA wird unter Verwendung gentechnologischer Standardtechniken durchgeführt, z.B. Davies et al., "Cloning of a Representative Genomic Library of the Human X Chromosome After Sorting by Flow Cytometry", Nature, Bd. 293, S. 374-376 (1981); Krumlauf et al., "Construction and Characterization of Genomic Libraries from Specific Human Chromosomes", Proc. Natl. Acad. Sci., Bd. 79, S. 2971-2975 (1982); Lawn et al., "The Isolation and Characterization of Linked Delta-and-Beta-Globin Genes from a Cloned Library of Human DNA." Cell, Bd. 15, S. 1157-1174 (1978); und Maniatis et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", (Cold Springs Harbor Laborstory, 1982), S. 256-308; Van Dills et al., id.; Fuscoe, Gene, 52:291 (1987); und Fuscoe et al., Cytogenet. Cell Genet., 43:79 (1986). Diese Referenzdokumente werden hierin durch Zitat aufgenommen.

Bibliotheken von rekombinanter DNA für jedes der menschlichen Chromosome sind durch das National Laborstory Gene Library Project konstruiert worden und sind von der American Type Culture Collection verfügbar. [van Dills et al., Biotechnology, 4:537 (1986).] Kleine, Einfügungssequenzen enthaltende Bibliotheken wurden durch vollständige Verdauung durchflußsortierter menschlicher genomischer Chromosomen-DNA mit HindIII oder EcoRI und Klonieren in den Lambda-Insertionsvektor Charon 21A konstruiert. Der Vektor kann menschliche Einfügungssequenzen von bis zu 9,1 'kB Größe aufnehmen. HindIII-(oder EcoRI-)Restriktionsfragmente größer als 9,1 'kB werden somit aus diesen Bibliotheken nicht gewonnen werden. Die in diesen Bibliotheken beobachtete durchschnittliche Größe der Einfügungssequenzen beträgt ungefähr 4 kB. Eine repräsentative Aufstellung der chromosomenspezifischen HindIII-Bibliotheken mit ihren ATCC-Eingangsnummern ist in Tabelle 1 gezeigt. TABELLE 1 MENSCHLICHE CHROMOSOMENSPEZIFISCHE GENOMISCHE BIBLIOTHEKEN IN CHARON 21A VEKTOR

CHROMOSOM	ATCC NR.	BIBLIOTHEK
1	57753	LL01NS01
1	57754	LL01NS02
2	57744	LL02NS01
3	57751	LL03NS01
4	57700	LL04NS01
4	57745	LL04NS02
5	57746	LL05NS01
6	57701	LL06NS01
7	57755	LL07NS01
8	57702	LL08NS02
9	57703	LL09NS01
10	57736	LL10NS01
11	57704	LL11NS01
12	57756	LL12NS01
13	57705	LL13NS01
13	57757	LL13NS02
14	57706	LL14NS01
14/15	57707	LL99NS01
15	57737	LL15NS01
16	57758	LL16NS03
17	57759	LL17NS02
18	57710	LL18NS01
19	57711	LL19NS01
20	57712	LL20NS01
21	57713	LL21NS02
22	57714	LL22NS01
X	57747	LL0XNS01
Y	57715	LL0YNS01

Alternativ dazu kann anstatt des Klonierens der extrahierten DNA in einem Vektor oder Anzüchten in einer Ziellinie die aus einem sortierten Chromosomentyp extrahierte DNA mit der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) amplifiziert werden. Bei der Vorbereitung für die PCR werden an die extrahierte DNA geeignete Schwänze angefügt. Literaturzitate für solche PCR-Methoden sind nachstehend in Abschnitt I.B angeführt.
Andere mögliche Verfahren zur Isolierung der gewünschten Sequenzen aus Hybridzellen schließen jene von Schmeckpeper et al., "Partial Purification and Characterization of DNA from Human X Chromosome", Proc. Natl. Acad. Sci., Bd. 76, S. 6525-6528 (1979) oder Olsen et al., siehe oben (im Kapitel Hintergrund) ein. Entsprechend sind diese Referenzdokumente hierin durch Zitat aufgenommen.
2. Isolierung von DNA aus einem Teil eines Chromosoms.
Zu den Verfahren, die zur Isolierung regionsspezifischer chromosomaler DNA verwendet werden können, zählen: die Selektion einer geeigneten chromosomalen Region aus DNA, die vorher kartiert worden ist, beispielsweise aus einer Bibliothek kartierter Cosmide; das Sortieren von Derivat-Chromosomen, beispielsweise durch FACS; die Mikrodissektion von selektiertem chromosomalem Material; subtraktive Hybridisierung; Identifizierung einer geeigneten Hybridzelle, die ein gewünschtes Chromosomenfragment enthält, Extrahieren und Amplifizieren der DNA und Selektieren der gewünschten amplifizierten DNA; und die Selektion geeigneten chromosomalen Materials aus Strahlungshybriden. Die vorstehend im Unterabschnitt I.A.1 skizzierten gentechnologischen Standardtechniken werden bei solchen, dem Fachmann wohlbekannten Methoden verwendet. Die Amplifizierung der regionsspezifischen DNA kann durch Klonieren in einem geeigneten Vektor, Vermehrung in einer geeigneten Ziellinie und/oder durch die Verwendung von PCR (siehe I.B unten) durchgeführt werden.
Ein bevorzugtes Verfahren zur Isolierung chromosomaler regionsspezifischer DNA besteht in der Verwendung kartierter kurzer DNA-Sequenzen, um eine Bibliothek längerer DNA-Sequenzen zu sondieren, wobei die letztgenannte Bibliothek üblicherweise in einem unterschiedlichen Vektor kloniert worden ist. Beispielsweise kann eine in einem Plasmid klonierte Sonde dazu verwendet werden, eine Cosmid- oder Künstliche-Hefechromosom-(YAC)-Bibliothek zu sondieren. Durch Verwendung einer initialen Startsonde können überlappende Klone in der Bibliothek mit den größeren Einfügungssequenzen gefunden werden (ein "Walking" genanntes Verfahren), und eine Sonde mit höherer Komplexität für die zuverlässige Färbung der die Startsonde umgebenden chromosomalen Region kann hergestellt werden. Wenn letztendlich ein gesamtes Genom für eine Species kartiert worden ist (beispielsweise das Human Genom Project für die menschliche Species), werden geordnete Klone für das gesamte Genom der Species verfügbar sein. Man kann dann leicht die geeigneten Klone auswählen, um eine Sonde mit der gewünschten Spezifität zu bilden.
Ein anderes Verfahren zur Isolierung von DNA aus einer chromosomalen Region oder chromosomalen Regionen (oder auch einem ganzen Chromosom) besteht darin, eine solche chromosomale Region oder solche chromosomalen Regionen in einer geeigneten Ziellinie (beispielsweise einer Hybridzelllinie, wie z.B. einer Mensch/Hamster-Hybridzellinie) zu vermehren, die DNA aus der Ziellinie zu extrahieren und sie in einem geeigneten Vektor zu klonieren und menschliche DNA enthaltende Klone zu selektieren, um eine Bibliothek zu bilden. Wenn eine Hybridzelle verwendet wird, können die Chromosomen in der Hybridzelle, welche das menschliche chromosomale Material enthalten, mittels Durchflusssortierung (FACS) vor dem Klonieren abgetrennt werden, um die Häufigkeit menschlicher Klone in der Bibliothek zu erhöhen. Ferner kann die gesamte DNA ohne weiteres Klonieren aus der Hybridzelle isoliert und markiert und als Sonde verwendet werden, wie dies in 6 beispielhaft dargestellt ist.
3. Einzelsträngige Sonden.
In manchen Fällen ist es bevorzugt, dass die Nukleinsäurefragmente des heterogenen Gemisches aus einzelsträngiger RNA oder DNA bestehen. Es ist festgestellt worden, dass unter manchen Bedingungen die Bindungseffizienz von einzelsträngigen Nukleinsäuresonden während In situ-Hybridisierung höher ist, z.B. Cox et al., "Detection of mRNAs in Sea Urchin Embryos by In Situ Hybridization Using Asymmetric RNA Probes", Developmental Biologe, Bd. 101, S. 485-502 (1984).
Zur Herstellung von RNA-Fragmenten von isolierten DNA-Fragmenten werden Standardverfahren verwendet. Beispielsweise ist ein von Green et al. entwickeltes, in Cell, Bd. 32, S. 681-694 (1983) beschriebenes Verfahren unter dem Warenzeichen "Riboprobe" von Promega Biotec (Madison, WI) kommerziell erhältlich. Andere zur Verwendung für die vorliegende Erfindung geeignete Transkriptionskits sind von der United States Biochemical Corporation (Cleveland, OH) unter dem Warenzeichen "Genescribe" erhältlich. Einzelsträngige DNA-Sonden können mit dem einzelsträngigen Bakteriophagen M13, der auch in Form eines Kits, z.B. von Bethesda Research Laboratories (Gathersburg, MD) erhältlich ist, hergestellt werden. Die in 4 dargestellten Hybridisierungen wurden mit den in den Bluescribe-Plasmidvektor (Stratagene, La Jolla, CA) subklonierten Bibliotheken von Tabelle 1 durchgeführt. Das Bluescribe-Plasmid enthält RNA-Promotoren, welche die Herstellung einzelsträngiger Sonden erlauben.
Der nachstehende Abschnitt IX stellt Verfahren zur Herstellung und Anwendung von nicht-selbstkomplementären einzelsträngigen Nukleinsäuresonden zur Verfügung, welche das bei In situ-Hybridisierung erreichbare Signal-Rauschverhältnis durch Reduzieren der unspezifischen und fehlgepaarten Bindung der Sonde verbessern. Dieser Abschnitt stellt weiters Verfahren zur Denaturierung doppelsträngiger Ziel-Nukleinsäure zur Verfügung, welche einzelsträngige, für die Hybridisierung verfügbare Regionen, die nichtkomplementär zu Sondensequenzen sind, auf ein Minimum reduzieren. Kurz gesagt, wird die Sonde konstruiert, indem die DNA mit einem Restriktionsenzym und einer Exonuklease behandelt wird, um Vorlagen/Primer für eine DNA-Polymerase zu bilden. Der verdaute Strang wird in Gegenwart von markiertem Nukleosidtriphosphat-Vorläufer neu synthetisiert, und die markierten einzelsträngigen Fragmente werden von den neu synthetisierten Fragmenten abgetrennt, um die Sonde zu bilden. Die Ziel-Nukleinsäure wird mit demselben Restriktionsenzym, das zur Konstruktion der Sonde benutzt wird, behandelt und wird vor Applikation der Sonde mit einer Exonuklease behandelt.
I.B. PCR
Ein weiteres Verfahren zur Herstellung erfindungsgemäßer Sonden beinhaltet die Verwendung der Polymerase-Kettenreaktion [PCR]. [Für eine Erklärung des Mechanismus der PCR, siehe Saiki et al., Science, 230:1350 (1985) und US-Patente Nr. 4,683,195 , 4,683,202 (beide erteilt am 28. Juli 1987) und 4,800,159 (erteilt am 24. Jänner 1989)]. Zielspezifische Nukleinsäuresequenzen, die wie oben dargestellt iso liert wurden, können mit PCR amplifiziert werden, um zielspezifische Sequenzen herzustellen, die vermindert an oder frei von repetitiven Sequenzen sind. Die für eine solche Methode verwendeten PCR-Primer sind auf die Enden der repetitiven Sequenzen gerichtet, wodurch eine Amplifikation von Sequenzen erfolgt, welche von den Wiederholungssequenzen flankiert sind.
7 veranschaulicht ein solches Verfahren unter Verwendung der PCR, wobei die repräsentative repetitive Sequenz Alu ist. Wenn nur kurze Segmente amplifiziert werden, ist es wahrscheinlich, dass solche Sequenzen frei von anderen Wiederholungssequenzen sind, so dass eine an repetitiven Sequenzen verminderte DNA zur Verfügung gestellt wird.
Man kann die Erzeugung repetitiver Sequenzen bei einer solchen PCR-Methode weiter unterdrücken, indem zuerst komplementäre Sequenzen an die repetitive Sequenz anhybridisiert werden, wobei die komplementären Sequenzen erweiterte nichtkomplementäre flankierende Enden aufweisen oder terminale Nukleotide besitzen, die keine Verlängerung durch die Polymerase zulassen. Die nichtkomplementären Enden der Blockierungssequenzen hindern die Blockierungssequenzen daran, während des PCR-Verfahrens als PCR-Primer zu fungieren.
II. Entfernung repetitiver Sequenzen und/oder Ausschalten des Hybridisierungsvermögens repetitiver Sequenzen
Eine erfindungsgemäße Sonde wird typischerweise in einer Reihe von Schritten hergestellt, welche einschließen: Gewinnen der Ausgangsnukleinsäuresequenzen, die zur Zielregion des Genoms komplementär sind, Markieren und anderweitiges Bearbeiten dieser, so dass sie effizient an das Ziel hybridisieren werden und nach deren Binden nachgewiesen werden können und Behandlung dieser, um entweder die Hybridisierungskapazität auszuschalten oder einen ausreichenden Teil der gemeinsamen repetitiven Sequenzen zu entfernen oder solche Sequenzen sowohl auszu schalten als auch zu entfernen. Die Reihenfolge dieser Schritte ist von den spezifischen angewendeten Methoden abhängig.
Die folgenden Verfahren können verwendet werden, um gemeinsame repetitive Sequenzen zu entfernen und/oder das Hybridisierungsvermögen solcher gemeinsamer repetitiver Sequenzen auszuschalten. Solche Verfahren sind repräsentativ und werden schematisch in Form von dem Fachmann wohlbekannten Methoden dargestellt und können gemäß dem Fachmann wohlbekannten Parametern und Methoden modifiziert und erweitert werden.
1. Einzelkopie-Sonden.
Eine Einzelkopie-Sonde besteht aus Nukleinsäurefragmenten, die komplementär zu Einzelkopie-Sequenzen sind, welche in der Zielregion des Genoms enthalten sind. Ein Verfahren zur Konstruktion einer solchen Sonde besteht darin, mit einer DNA-Bibliothek, die durch Klonieren der Zielregion hergestellt wurde, zu beginnen. Einige der Klone der Bibliothek werden DNA enthalten, deren gesamte Sequenz eine Einzelkopie darstellt; andere werden repetitive Sequenzen enthalten; und wieder andere werden Teile mit Einzelkopie-Sequenzen und repetitiven Sequenzen aufweisen. Eine Selektion auf Klon-für-Klon-Basis und das Poolen jener Klone, die nur Einzelkopie-Sequenzen enthalten, wird zu einer Sonde führen, die spezifisch an die Zielregion hybridisiert. Die Einzelkopie-Natur eines Klons kann schließlich durch Southern-Hybridisierung unter Verwendung von Standardtechniken bewiesen werden. 4H zeigt eine Hybridisierung mit 120 Klonen, die auf diese Weise aus einer Chromosom 4-Bibliothek selektiert wurden.
Eine Southern-Analyse ist sehr zeitaufwendig und arbeitsintensiv. Daher sind weniger vollkommene, aber effizientere Screening-Verfahren zur Gewinnung von Kandidaten von Einzelkopie-Klonen nützlich. In Abschnitt V.B werden Beispiele für verbesserte Verfahren zum Screening individueller Phagen- und Plasmid-Klone auf das Vorhandensein repetitiver DNA unter Verwendung von Hybridisierung mit genomischer DNA gegeben. Das Screening der Plasmid-Klone ist effizienter, und ungefähr 80% der selektierten Klone enthalten lediglich Einzelkopie-Sequenzen; der Rest ent hält Wiederholungssequenzen niedriger Kopienzahl. Die so produzierten Sonden können jedoch einen adäquaten Färbungskontrast erzeugen, was darauf hinweist, dass die repetitiven Sequenzen niedriger Kopienzahl in der Sonde toleriert werden können (siehe Unterabschnitt 3 diese Abschnitts).
Ein Nachteil der Klon-für-Klon-Methoden besteht darin, dass ein Klon auch verworfen wird, wenn nur ein Teil der darin enthaltenen Sequenz repetitiv ist. Je größer die Länge der klonierten Nukleinsäure ist, desto größer ist die Chance, dass sie eine repetitive Sequenz enthalten wird. Wenn daher Nukleinsäure in einem Vektor, der große Einfügungssequenzen aufweist, wie z.B. ein Cosmid, YAC oder in einer Ziellinie, wie z.B. Hybridzellen, vermehrt wird, kann es vorteilhaft sein, sie in kleineren Stücken subzuklonieren, bevor die Einzelkopie-Selektion durchgeführt wird. Die oben gerade skizzierten Selektionsmethoden unterscheiden nicht zwischen gemeinsamen und spezifischen repetitiven Sequenzen; Klone mit nachweisbaren repetitiven Sequenzen jedes Typs werden in der Sonde nicht verwendet.
2. Individuelles Testen der Hybridisierungseigenschaften.
Die Hybridisierungsspezifität eines Stücks Nukleinsäure, beispielsweise eines Klons, kann durch In situ-Hybridisierung getestet werden. Wenn es unter geeigneten Hybridisierungsbedingungen an Einzelkopie- oder repetitive Sequenzen bindet, die spezifisch für die gewünschte Zielregion sind, kann es in die Sonde aufgenommen werden. Viele Sequenzen mit spezifischen Hybridisierungseigenschaften sind bereits bekannt, wie z.B. chromosomenspezifische repetitive Sequenzen [Trask et al., siehe oben, (1988) und die dort zitierten Literaturstellen], VNTRs, zahlreiche kartierte Einzelkopie-Sequenzen. Weitere werden kontinuierlich kartiert. Solche Sequenzen können in einer erfindungsgemäßen Sonde enthalten sein.
3. Bulk-Methoden.
In vielen Genomen, wie z.B. dem menschlichen Genom, ist ein Großteil der gemeinsamen repetitiven DNA in wenigen Familien von hochwiederholten Sequenzen, wie z.B. Alu, enthalten. Eine Sonde, die im wesentlichen frei von solchen repetitiven Sequenzen hoher Kopienzahl ist, erzeugt bei vielen Anwendungen einen brauchbaren Färbungskontrast. Eine solche Sonde kann aus einer Nukleinsäuresequenz-Quelle, beispielsweise den Bibliotheken von Tabelle I, mit relativ einfachen Bulk-Methoden hergestellt werden. Solche Bulk-Methoden sind daher die bevorzugten Verfahren für solche Anwendungen.
Diese Verfahren nützen hauptsächlich die Tatsache, dass die Hybridisierungsgeschwindigkeit von komplementären Nukleinsäuresträngen bei Zunahme ihrer Konzentration zunimmt. Wenn somit ein heterogenes Gemisch der Nukleinsäurefragmente denaturiert und unter Bedingungen, die eine Hybridisierung zulassen, inkubiert wird, werden die in hoher Konzentration vorhanden Sequenzen rascher Doppelstränge bilden als die anderen. Die doppelsträngige Nukleinsäure kann dann entfernt werden, und der Rest kann als Sonde verwendet werden. Alternativ dazu kann das partiell hybridisierte Gemisch als Sonde verwendet werden, wobei die doppelsträngigen Sequenzen nicht an das Ziel binden können. Die folgenden Verfahren sind repräsentativ für Bulk-Methoden, die zur Erzeugung der erfindungsgemäßen zielspezifischen Färbung brauchbar sind.
3a. Selbst-Reassoziation der Sonde.
Die doppelsträngige Sonden-Nukleinsäure im Hybridisierungsgemisch wird denaturiert und dann unter Hybridisierungsbedingungen für eine Zeit inkubiert, die ausreicht, dass die Sequenzen hoher Kopienzahl in der Sonde im wesentlichen Doppelstränge ausbilden. Dann wird das Hybridisierungsgemisch auf die Probe appliziert. Die restlichen markierten einzelsträngigen Kopien der hochwiederholten Sequenzen binden über die gesamte Probe verteilt, wobei ein schwaches, breit gestreutes Signal erzeugt wird. Die Bindung der vielfach vorhandenen, für die Zielregion des Genoms spezifischen Sequenzen niedriger Kopienzahl erzeugt ein leicht unterscheidbares spezifisches Signal.
Ein solches Verfahren ist in Abschnitt VI.B (unten) mit chromosomenspezifischen Bibliotheken für die Chromosomen 4 und 21 (pBS4 und pBS21) als Sonden für diese Chromosomen beispielhaft dargestellt. [Pinkel et al., PNAS (USA), 85:9138-9142 (Dezember 1988)]. Das Hybridisierungsgemisch, welches eine Sonden- Konzentration im Bereich von 1-10 ng/ul enthielt, wurde vor Applikation auf die Probe zur Denaturierung der Sonde erhitzt und 24 Stunden bei 37°C inkubiert.
3b. Verwendung von blockierender Nukleinsäure.
Unmarkierte Nukleinsäuresequenzen, die zu jenen Sequenzen in der Sonde komplementär sind, deren Hybridisierungsvermögen inhibiert werden soll, werden dem Hybridisierungsgemisch hinzugefügt. Die Sonde und die blockierende Nukleinsäure werden -falls notwendig – denaturiert und unter geeigneten Hybridisierungsbedingungen inkubiert. Die zu blockierenden Sequenzen bilden rascher Doppelstränge aus als die anderen und können daher nicht an das Ziel binden, wenn das Hybridisierungsgemisch auf das Ziel appliziert wird. In manchen Fällen tritt die Blockierreaktion so rasch ein, dass der Inkubationszeitraum sehr kurz sein kann, und adäquate Ergebnisse können erhalten werden, wenn das Hybridisierungsgemisch unmittelbar nach der Denaturierung auf das Ziel appliziert wird. Ein Blockierverfahren wird von Sealy et al., "Removal of Repeat Sequences from Hybridization Probes", Nucleic Acid Research, 13:1905 (1985) allgemein beschrieben. Beispiele für blockierende Nukleinsäuren sind genomische DNA, eine Fraktion genomischer DNA mit hoher Kopienzahl und spezielle Sequenzen, wie sie nachstehend angeführt sind (i-iii).
3b.i. Genomische DNA.
Genomische DNA enthält alle Nukleinsäuresequenzen des Organismus im Verhältnis ihrer Kopienzahl im Genom. Das Hinzufügen genomischer DNA zum Hybridisierungsgemisch erhöht daher die Konzentration der Wiederholungssequenzen hoher Kopienzahl stärker als jene von Sequenzen niedriger Kopienzahl und ist daher für das Blockieren der erstgenannten wirksamer. Die genomische DNA enthält jedoch Kopien der Sequenzen, die für das Ziel spezifisch sind, und wird daher auch die gewünschte chromosomenspezifische Bindung verringern, falls zu viel davon hinzugefügt wird. Richtlinien zur Bestimmung, wie viel genomische DNA zugesetzt werden soll (siehe nachstehend 3.e. Das Q-Konzept) und Beispiele für die Verwendung genomischer blockierender DNA werden nachstehend gegeben. Die blockierende Wirksamkeit genomischer DNA kann unter manchen Bedingungen durch Einstellung des Zeitpunkts ihrer Zugabe zum Hybridisierungsgemisch erhöht werden; Beispiele für solche Zeitpunkt-Einstellungen werden mit den Protokoll I- und Protokoll II-Hybridisierungen gegeben, die nachstehend in den 4B bis E (Protokoll I) und in 4F (Protokoll II) dargestellt und in Abschnitt VI detailliert beschrieben sind.
3b.ii. Fraktion genomischer DNA mit hoher Kopienzahl.
Die Schwierigkeit bei der Verwendung genomischer DNA besteht darin, dass sie auch die Hybridisierung der Sequenzen niedriger Kopienzahl blockiert, welche überwiegend jene Sequenzen sind, die die gewünschte Ziel-Färbung liefern. Eine Fraktionierung der genomischen DNA, um nur die Sequenzen hoher Kopienzahl zu erhalten, und deren Verwendung für die Blockierung überwindet daher diese Schwierigkeit. Eine solche Fraktionierung kann beispielsweise, wie nachstehend beschrieben (3c.i) mit Hydroxyapatit durchgeführt werden.
3b.iii. Spezifizierte Sequenzen.
Das Blockieren einer speziellen Sequenz in der Sonde kann durch Zugabe vieler unmarkierter Kopien dieser Sequenz erreicht werden. Beispielsweise können Alu-Sequenzen in der Sonde durch Zugabe kionierter Alu-DNA blockiert werden. Blockierende DNA, die aus einem Gemisch weniger Klone besteht, welche die Sequenzen mit der höchsten Kopienzahl im menschlichen Genom enthalten, kann wirkungsvoll mit chromosomenspezifischen Bibliotheken, beispielsweise jenen von Tabelle I verwendet werden. Alternativ dazu könnten unmarkierte Nukleinsäuresequenzen aus einer oder mehreren chromosomenspezifischen Bibliotheken verwendet werden, um eine Sonde zu blockieren, welche markierte Sequenzen aus einer oder mehreren anderen chromosomenspezifischen Bibliotheken enthält. Die gemeinsamen Sequenzen würden blockiert werden, während die nur auf dem Ziel-Chromosom vorhandenen Sequenzen unbeeinflusst bleiben würden. 4F zeigt, dass genomische DNA die Hybridisierung einer Sequenz oder von Sequenzen, die dem menschlichen Chromosom 21 und den Zentromer-Regionen der anderen menschlichen akrozentrischen Chromosomen gemeinsam sind, nicht vollständig blockierte. Wenn ein Klon oder Klone, welche(r) eine solche Sequenz oder Sequenzen enthält (enthalten), schließlich isoliert wird (werden), könnte daraus hergestellte unmarkierte DNA der genomischen blockierenden DNA zugegeben werden, um die Spezifität der Färbung zu erhöhen.
3c. Entfernung von Sequenzen.
3c.i. Hydroxyapatit.
Einzel- und doppelsträngige Nukleinsäuren weisen gegenüber Hydroxyapatit unterschiedliche Bindungseigenschaften auf. Solche Eigenschaften liefern eine Grundlage, die üblicherweise für die Fraktionierung von Nukleinsäuren genutzt wird. Hydroxyapatit ist kommerziell erhältlich (z.B. Bio-Rad Laborstories, Richmond, CA). Die Fraktion genomischer DNA, welche Sequenzen mit einem speziellen Repetitionsgrad – von der höchsten Kopienzahl bis zur Einzelkopie – enthält, kann durch Denaturieren genomischer DNA, Reassoziieren lassen unter geeigneten Bedingungen bis zu einem bestimmten Wert von C₀t, gefolgt von der Abtrennung unter Verwendung von Hydroxyapatit gewonnen werden. Die einzel- und doppelsträngige Nukleinsäure kann auch durch Verwendung von S1-Nuklease getrennt werden. Solche Techniken und das C₀t-Konzept sind in Britten et al., "Analysis of Repeating DNA Sequences by Reassociation", in Methods in Enzymology, Bd. 29, S. 363-418 (1974) beschrieben.
Die oben gemäß 3a. oder 3b. hergestellte einzelsträngige Nukleinsäurefraktion kann mit Hydroxyapatit getrennt und als Sonde verwendet werden. Die Sequenzen, welche blockiert worden sind (welche einen Doppelstrang bilden), werden so physisch entfernt. Die Sonde kann dann bis zu ihrer Verwendung gelagert werden. Die Sonde kann dann ohne weitere blockierende Nukleinsäure verwendet werden, oder es kann deren Färbungskontrast eventuell durch zusätzliches Blockieren verbessert werden.
3c.ii. Reaktion mit immobilisierter Nukleinsäure.
Die Entfernung bestimmter Sequenzen kann auch durch Anheften von einzelsträngigen "absorbierenden" Nukleinsäuresequenzen auf einem festen Träger erreicht werden. Einzelsträngige Ausgangsnukleinsäure wird an die immobilisierte Nukleinsäure hybridisiert. Nach der Hybridisierung werden die nicht gebundenen Sequenzen gesammelt und als Sonde verwendet. Beispielsweise kann menschliche genomische DNA verwendet werden, um repetitive Sequenzen aus menschlichen Sonden zu ab sorbieren. Ein solches Verfahren ist von Brison et al., "General Method for Cloning Amplified DNA by Differential Screening with Genomic Probes", Molecular and Cellular Biologe, Bd. 2, S. 578-587 (1982) beschrieben. Kurz gesagt, wird die einer minimalen Scherwirkung ausgesetzt gewesene menschliche genomische DNA an Diazonium-Cellulose oder einen gleichartigen Träger gebunden. Die zweckmäßig zu Fragmenten zerschnittene Ausgangs-DNA wird an die immobilisierte DNA bei C₀t-Werten im Bereich von etwa 1 bis 100 hybridisiert. Die bevorzugte Stringenz der Hybridisierungsbedingungen kann in Abhängigkeit von der Basenzusammensetzung der DNA variieren. Eine solche Methode könnte repetitive Sequenzen aus chromosomenspezifischen Bibliotheken, beispielsweise jenen von Tabelle I entfernen, um eine Sonde herzustellen, die ein ganzes menschliches Chromosom färben kann.
3d. Blockieren von Nichtziel-Sequenzen im Ziel-Genom.
Das Blockieren von Nichtziel-Bindungsstellen im Ziel-Genom durch Hybridisierung mit unmarkierten komplementären Sequenzen wird das Binden von markierten Sequenzen in der Sonde, welche das Potential zur Bindung an diese Stellen besitzen, verhindern. Beispielsweise wird eine Hybridisierung mit unmarkierter genomischer DNA die repetitiven Sequenzen hoher Kopienzahl im Ziel-Genom in Doppelstränge überführen. Wenn die Sonde anschließend appliziert wird, werden markierte Kopien solcher Sequenzen in der Sonde nicht binden können.
In der Praxis ist für die Erzeugung des Färbungskontrastes eine Kombination mehrerer Mechanismen verantwortlich. Wenn beispielsweise – wie vorstehend in 3b – der Sonde blockierende DNA zugesetzt wird, kann jene, die noch einzelsträngig ist, wenn die Sonde auf das Ziel appliziert wird, an die Zielsequenzen binden und diese blockieren. Wenn die Inkubation der Sonde mit der blockierenden DNA minimal ist, dann blockiert die genomische DNA die Sonde und konkurriert gleichzeitig mit der Sonde um Bindungsstellen auf dem Ziel.
3e. Das Q-Konzept.
Wie vorstehend in Abschnitt 3b.i erwähnt, ist es notwendig, die richtige Menge an genomischer DNA zuzusetzen, um den besten Kompromiss zwischen der Inhibierung des Hybridisierungsvermögens von Wiederholungssequenzen hoher Kopienzahl in der Sonde und der Verminderung der Intensität des gewünschten Signals durch die Inhibierung der Bindung der zielspezifischen Sequenzen zu erzielen. Die folgende Diskussion betrifft die Verwendung genomischer blockierender DNA mit Sonden, welche durch Klonierung oder andere Replikation von DNA-Bereichen aus der Zielregion des Genoms hergestellt sind. Die Sonde enthält daher eine repräsentative Auswahl der im Ziel vorhandenen Einzelkopie-Sequenzen, chromosomenspezifischen repetitiven Sequenzen und gemeinsamen repetitiven Sequenzen. Die Komplexität einer solchen Sonde könnte im Bereich von 100 kB Sequenz, abgeleitet von einer kleinen Region des Genoms, beispielsweise mehreren eng benachbarten Cosmid-Klonen, bis zu vielen Millionen Basen, beispielsweise einer Kombination multipler Bibliotheken von Tabelle 1 reichen. Die nachstehend geführte Diskussion dient der Erläuterung und kann auf andere Situationen ausgedehnt werden, wo unterschiedliche blockierende Nukleinsäuren verwendet werden. Die folgende Diskussion über Q ist lediglich darauf hin ausgelegt, allgemeine Richtlinien zur Vorgangsweise zu geben.
Die Zugabe einer unmarkierten genomischen DNA zu einem Hybridisierungsgemisch, das markierte Sondensequenzen enthält, erhöht die Konzentration der gesamten Sequenzen, erhöht jedoch die Konzentration der gemeinsamen Sequenzen um einen größeren Faktor als die Konzentration der zielspezifischen Sequenzen, da die gemeinsamen Sequenzen im Gegensatz zu den zielspezifischen Sequenzen auch an anderen Stellen im Genom vorhanden sind. Die Reassoziation der gemeinsamen Sequenzen wird somit in bevorzugter Weise erhöht, so dass die Hybridisierung der markierten Kopien der gemeinsamen Sequenzen an das Ziel in bevorzugter Weise inhibiert wird.
Um dieses Konzept zu quantifizieren, betrachten wir als als erstes eine der Sequenzen, sei es eine Einzelkopie-Sequenz oder eine Wiederholungssequenz, die spezifisch an das i-te Chromosom bindet, in einem Hybridisierungsgemisch, das eine Masse m_p von Sonden-DNA aus der i-ten-Chromosomen-Bibliothek von Tabelle 1 (als Beispiel) und eine Masse m_b von unmarkierter genomischer DNA enthält. Die Zahl markierter Kopien der Sequenz ist proportional zu m_p. Die Zahl unmarkierter Kopien ist jedoch proportional zu f_im_b, worin f_i die auf dem i-ten Chromosom enthaltene Fraktion genomischer DNA bedeutet. Das Verhältnis von unmarkierten zu markierten Kopien jeder der für das Ziel-Chromosom spezifischen Sequenzen ist daher f_im_b/m_p, welches hier als Q definiert ist. Für normale menschliche Chromosomen gilt: 0,016 ≤ f_i ≤ 0,08 [Mendelsohn et al., Science, 179:1126 (1973)]. Für repräsentative, in Abschnitt VI.B (unten) beschriebene Beispiele: f₄ = 0,066 und f₂₁ = 0,016. Für eine Sonde, die auf eine Region mit L Basenpaaren zielt: f_i = L/G, worin G die Zahl der Basenpaare in einem Genom (ungefähr 3 × 10⁹ Basen bei Menschen und anderen Säugern) bedeutet. Somit gilt: Q = (L/G) (m_b/m_p).
Nun betrachten wir eine gemeinsame Sequenz, die mehr oder weniger gleichmäßig über das Genom verteilt ist, beispielsweise Alu. Die Zahl markierter Kopien ist proportional zu m_p, während die Zahl unmarkierter Kopien proportional zu m_b ist. Das Verhältnis von unmarkierten zu markierten Kopien ist daher m_b/m_p = Q/f_i. Dies gilt für alle gleichmäßig verteilten Sequenzen unabhängig von der Kopienzahl. Die Zugabe genomischer DNA erhöht daher die Konzentration jeder spezifischen Sequenz um den Faktor 1 + Q, während jede gleichförmig verteilte Sequenz um den größeren Faktor 1 + Q/f_i erhöht wird. Die Reassoziationsgeschwindigkeiten der gemeinsamen Sequenzen werden daher durch die Zugabe der genomischen DNA um einen größeren Faktor erhöht als jene der spezifischen Sequenzen.
Es kann gezeigt werden, dass etwa die Hälfte des günstigen Effekts der genomischen DNA auf die relativen Reassoziationsgeschwindigkeiten erzielt wird, wenn Q = 1, und dass bei Q = 5 im wesentlichen kein weiterer Nutzen durch weitere Erhöhungen gewonnen werden kann. Die Protokoll 1-Hybridisierungen von Abschnitt VI.B unten halten Q ≤ 5.
Um die Verwendung genomischer blockierender DNA zu veranschaulichen, ist es zweckmäßig, ein Modell eines Genoms zu betrachten, bei dem 50% der DNA aus spezifischen Sequenzen (sowohl repetitive als auch Einzelkopien) und die anderen 50% der DNA aus gemeinsamen repetitiven Sequenzen, die gleichmäßig über das Genom verteilt sind, bestehen. Wenn das Ziel L Basen sind (das heißt, die Sonde enthält Fragmente, die L Basen des Zielbereichs oder der Zielbereiche des Genoms repräsentieren), werden daher gemäß dem Modell Sequenzen, die L/2 Basen enthalten, spezifisch für das Ziel sein, und L/2 werden mit dem gesamten Genom gemeinsam sein.
III. Markieren der Nukleinsäurefragmente des heterogenen Gemisches.
Für das Markieren einzel- und doppelsträngiger Nukleinsäurefragmente des heterogenen Gemisches stehen mehrere Techniken zur Verfügung. Dazu zählen: der Einbau radioaktiver Markierungen, z.B. Harper et al., Chromosoma, Bd. 83, S. 431-439 (1984); direktes Anheften von Fluorochromen oder Enzymen, z.B. Smith et al., Nucleic Acids Research, Bd. 13, S. 2399-2412 (1985) und Connolly et al., Nucleic Acids Research, Bd. 13, S. 4485-4502 (1985); und verschiedene chemische Modifikationen der Nukleinsäurefragmente, welche sie immunchemisch oder durch andere Affinitätsreaktionen nachweisbar machen, z.B. Tchen et al., "Chemically Modified Nucleic Acids as Immunodetectable Probes in Hybridization Experiments", Proc. Natl. Acad. Sci., Bd. 81, S. 3466-3470 (1984); Richardson et al., "Biotin and Fluorescent Labeling of RNA Using T4 RNA Ligase", Nucleic Acids Research, Bd. 11, S. 6167-6184 (1983); Langer et al., "Enzymatic Synthesis of Biotin-Labeled Polynucleotides: Novel Nucleic Acid Affinity Probes," Proc. Natl. Acad. Sci., Bd. 78, S. 6633-6637 (1981); Brigati et al., "Detection of Viral Genomes in Cultured Cells and Paraffin-Embedded Tissue Sections Using Biotin-Labeled Hybridization Probes", Virology, Bd. 126, S. 32-50 (1983); Broker et al., "Electron Microscopic Visualization of tRNA Genes with Ferritin-Avidin: Biotin Labels", Nucleic Acids Research, Bd. 5, S. 363-384 (1978); Bayer et al., "The Use of the Avidin Biotin Complex as a Tool in Molecular Biology", Methods of Biochemical Analysis, Bd. 26, S1-45 (1980) Kuhlmann, Immunoenzyme Techniques in Cytochemistry (Weinheim, Basel, 1984). Langer-Safer et al., PNAS USA, 79,:4381 (1982): Landegent et al., Exp. Cell Res., 153:61 (1984); und Hopman et al., Exp. Cell Res., 169:357 (1987).
Zu den typischen Markierungsmitteln zählen solche, bei denen die Sondenfragmente biotinyliert, mit N-Acetoxy-N-2-acetylaminofluoren modifiziert, mit Fluoresceinisothiocyanat modifiziert, mit Quecksilber/TNP-Liganden modifiziert, sulfoniert oder mit Digoxigenin markiert werden oder T-T-Dimere enthalten.
Das Hauptmerkmal der "Sondenmarkierung" besteht darin, dass die an das Ziel gebundene Sonde nachweisbar wird. In manchen Fällen kann statt eines hinzugefügten Merkmals ein intrinsisches Merkmal der Sonden-Nukleinsäure für diesen Zweck genützt werden. Beispielsweise ist gezeigt worden, dass Antikörper, die spezifisch RNA/DNA-Doppelstränge erkennen, die Fähigkeit besitzen, aus RNA bestehende und an DNA-Ziele gebundene Sonden zu erkennen [Rudkin and Stollar, Nature, 265:472-473 (1977)]. Die für solche Sonden verwendete RNA ist nicht modifiziert. Sonden-Nukleinsäurefragmente können durch Anhängen von "Schwänzen" aus modifizierten Nukleotiden oder bestimmten normalen Nukleotiden verlängert werden. Wenn ein Schwanz aus normalen Nukleotiden verwendet wird, erlaubt eine zweite Hybridisierung mit zum Schwanz komplementärer Nukleinsäure, die als Markierungsmittel beispielsweise Fluorochrome, Enzyme, Radioaktivität und/oder modifizierte Basen enthält, den Nachweis der gebundenen Sonde. Ein solches System ist von Enzo Biochem (Biobridge Labeling System; Enzo Biochem Inc., New York, N.Y.) kommerziell erhältlich.
Ein weiteres Beispiel für ein Mittel zur Visualisierung der gebundenen Sonde, bei dem die Nukleinsäuresequenzen in der Sonde keinen direkten modifizierten Bestandteil tragen, ist die Verwendung von Antikörpern gegen Thymidin-Dimere. Nakane et al., 20(2):229 (1987) veranschaulichen ein solches Verfahren, bei dem mit Thymin-Thymin-Dimeren versehene DNA (T-T-DNA) als Marker für eine In situ-Hybridisierung verwendet wurde. Die hybridisierte T-T-DNA wurde unter Verwendung von Kaninchen-anti-T-T-DNA-Antikörper immunhistochemisch nachgewiesen.
Alle in den oben angeführten Referenzdokumenten offenbarten Markierungstechniken können unter bestimmten Umständen bevorzugt sein. Demgemäß werden die oben zitierten Referenzdokumente durch Zitat aufgenommen. Des Weiteren würden alle dem Fachmann bekannten Markierungstechniken brauchbar sein, um die erfindungsgemäßen Färbezusammensetzungen zu markieren. Mehrere Faktoren beeinflussen die Wahl des Markierungsmittels, wozu die Wirkung der Markierung auf die Geschwindigkeit der Hybridisierung und Bindung der Nukleinsäurefragmente an die chromosomale DNA, die Zugänglichkeit der gebundenen Sonde für Markierungskomponenten, die nach der initialen Hybridisierung appliziert werden, die gegenseitige Kompatibilität der Markierungskomponenten, die Art und Intensität des durch die Markierung erzeugten Signals, der Aufwand und die Leichtigkeit, mit der die Markierung appliziert wird und dergleichen zählen.
Mehrere unterschiedliche Sonden hoher Komplexität, von denen jede mit einem unterschiedlichen Verfahren markiert ist, können gleichzeitig verwendet werden. Die Bindung von unterschiedlichen Sonden kann damit beispielsweise durch verschiedene Farben unterschieden werden.
IV. In situ-Hybridisierung.
Die Applikation des erfindungsgemäßen heterogenen Gemisches auf Chromosomen wird durch Standardtechniken der In situ-Hybridisierung vorgenommen. Mehrere hervorragende Anleitungen für die Technik sind verfügbar, z.B. Gall und Pardue, "Nucleic Acid Hybridization in Cytological Preparations", Methods in Enzymology, Bd. 21, S. 470-480 (1981); Henderson, "Cytological Hybridization to Mammalian Chromosomes", International Review of Cytology, Bd. 76, S. 1-46 (1982) und Angerer et al., "In Situ Hybridization to Cellular RNAs", in Genetic Engineering: Principles and Methods, Setlow und Hollaender, Hrsg., Bd. 7, S. 43-65 (Plenum Press, New York, 1985).
Drei Faktoren beeinflussen die Färbungsintensität der Hybridisierungssonden: (1) die Effizienz der Hybridisierung (Anteil der Ziel-DNA, die durch die Sonde hybridisiert werden kann), (2) die Nachweiseffizienz (d.h. das Ausmaß an sichtbarem Signal, das von einer gegebenen Menge der Hybridisierungssonde erzielt werden kann) und (3) der Rauschpegel, der durch das unspezifische Binden der Sonde oder von Komponenten des Nachweissystems erzeugt wird.
Allgemein umfasst die In situ-Hybridisierung die folgenden Hauptschritte: (1) Fixierung des Gewebes oder der biologischen Struktur, die untersucht werden sollen, (2) Vorhybridisierungsbehandlung der biologischen Struktur, um die Zugänglichkeit der Ziel-DNA zu erhöhen und unspezifisches Binden zu reduzieren, (3) Hybridisierung des heterogenen Gemisches der Sonde an die DNA in der biologischen Struktur oder im Gewebe; (4) Wäschen nach der Hybridisierung zur Entfernung von Sonde, die nicht in spezifischen Hybriden gebunden ist und (5) Nachweis der hybridisierten Sonden des heterogenen Gemisches. Die bei jedem dieser Schritte verwendeten Reagenzien und ihre Anwendungsbedingungen unterscheiden sich in Abhängigkeit von der speziellen Situation.
Die folgenden Kommentare sollen als eine Richtlinie für die Anwendung der oben angeführten allgemeinen Schritte dienen. Ein gewisses Maß an Versuchen kann notwendig sein, um optimale Färbebedingungen für spezielle Anwendungen festzulegen.
Zur Vorbereitung der Hybridisierung kann die Sonde – unabhängig von ihrem Herstellungsverfahren – zu Fragmenten mit einer Größe, die geeignet ist, die beste Intensität und Spezifität der Hybridisierung zu liefern, zerbrochen werden. Als eine allgemeine Richtlinie hinsichtlich der Größe der Fragmente muss man anerkennen, dass wenn die Fragmente zu lang sind, sie nicht zum Binden in das Ziel eindringen können und statt dessen Aggregate bilden, die ein Hintergrundrauschen für die Hybridisierung beitragen; wenn jedoch die Fragmente zu kurz sind, ist die Signal-Intensität vermindert.
Unter den in Abschnitt VI.B beispielhaft dargestellten Hybridisierungsbedingungen, worin eine menschliche genomische DNA als Mittel zur Blockierung des Hybridisierungsvermögens der gemeinsamen repetitiven Sequenzen hoher Kopienzahl verwendet wird, ist der bevorzugte Größenbereich der Sondenfragmente etwa 200 Ba sen bis etwa 2000 Basen, mehr bevorzugt nahe 1 kB. Wenn die Größe des Sondenfragments im Bereich von etwa 800 bis etwa 1000 Basen liegt, ist die bevorzugte Hybridisierungstemperatur etwa 30°C bis etwa 45°C, mehr bevorzugt etwa 35°C bis 40°C und noch mehr bevorzugt etwa 37°C; der bevorzugte Waschtemperaturbereich ist etwa 40°C bis etwa 50°C, mehr bevorzugt etwa 45°C.
Die Größe der Sondenfragmente wird vor Hybridisierung an das Ziel überprüft; vorzugsweise wird die Größe der Fragmente durch Elektrophorese, mehr bevorzugt durch denaturierende Agarose-Gelelektrophorese überwacht.
Fixierungsmittel schließen Säure-Alkohol-Lösungen, Säure-Aceton-Lösungen, Petrunkewitsch-Reagenz und verschiedene Aldehyde, wie z.B. Formaldehyd, Paraformaldehyd, Glutaraldehyd oder dergleichen ein. Vorzugsweise werden Ethanol-Essigsäure- oder Methanol-Essigsäure-Lösungen in Verhältnissen von etwa 3:1 verwendet, um die Chromosomen in Metaphasespreitungen zu fixieren. Für Zellen oder Chromosomen in Suspension ist eine von Trask et al. in Science, Bd. 230, S. 1401-1402 (1985) geoffenbarte Fixierungsmethode brauchbar. Demgemäß wird Trask et al. durch Zitat aufgenommen. Kurz gesagt, werden K₂CO₃ und Dimethylsuberimidat (DMS) (aus einer 5-fach konzentrierten Stammlösung, die unmittelbar vor Verwendung gemischt wird) einer Suspension zugesetzt, die etwa 5 × 10⁶ Zellkerne/ml enthält. Die Endkonzentrationen an K₂CO₃ und DMS betragen 20 mM bzw. 3 mM. Nach 15 Minuten bei 25°C wird der pH durch die Zugabe von 50 Mikroliter 100 mM Zitronensäure pro Milliliter Suspension von 10,0 auf 8,0 eingestellt. Die Zellkerne werden einmal durch Zentrifugation gewaschen (300g, 10 Minuten, 4°C in 50 mM KCl, 5 mM Hepes-Puffer mit pH 9,0 und 10mM MgSO₄).
Eine bevorzugte Fixierungsmethode für in Suspension befindliche Zellen oder Zellkerne wird von Trask et al., Hum. Genet., 78:251-259 (1988) offenbart. Kurz gesagt, werden die Zellkerne für etwa 10 Minuten bei Raumtemperatur in 1% Paraformaldehyd in PBS, 50 mM MgSO₄, pH 7,6 fixiert und zweimal gewaschen. Die Zellkerne werden in Isolierungspuffer (IB) (50 mM KCl, 5 mM HEPES, 10 mM MgSO₄, 3 mM Dithioerythritol, 0,15 mg/ml RNase, pH 8.0)/0,05% Triton X-100 mit 10⁸/ml resuspendiert.
Vor der In situ-Hybridisierung werden Chromosomen oft mit Mitteln zur Proteinentfernung behandelt. Solche Mittel schließen Enzyme oder milde Säuren ein. Pronase, Pepsin oder Proteinase K sind häufig verwendete Enzyme. Eine typische Säurebehandlung ist 0,02-0,2 N HCl, gefolgt von Waschen bei hoher Temperatur (z.B. 70°C). Die Optimierung der Deproteinisierung erfordert eine Kombination von Protease-Konzentration und Verdauungszeit, welche die Hybridisierung maximiert, aber keinen unannehmbaren Verlust an morphologischem Detail bewirkt. Die optimalen Bedingungen variieren je nach Gewebearten und Fixierungsverfahren. Eine zusätzliche Fixierung nach der Protease-Behandlung kann nützlich sein. Für spezielle Anwendungen kann daher ein gewisse Maß an Versuchen notwendig sein, um die Protease-Behandlung zu optimieren.
In manchen Fällen kann eine Vorbehandlung mit RNase wünschenswert sein, um restliche RNA vom Ziel zu entfernen. Eine solche Entfernung kann durch Inkubation der fixierten Chromosomen in 50-100 Mikrogramm/Milliliter RNase in 2X SSC (wobei SSC eine Lösung von 0,15 M NaCl und 0,015 M Natriumcitrat ist) für einen Zeitraum von 1-2 Stunden bei Raumtemperatur erreicht werden.
Der Schritt der Hybridisierung der Sonden des heterogenen Sondengemisches an die chromosomale DNA beinhaltet (1) Denaturieren der Ziel-DNA, so dass die Sonde Zugang zu komplementären einzelsträngigen Regionen erhalten kann und (2) das Aufbringen des heterogenen Gemisches unter Bedingungen, die es den Sonden erlauben, an komplementäre Stellen im Zielbereich zu reassoziieren. Verfahren zur Denaturierung schließen die Inkubation in Gegenwart von hohem pH, niedrigem pH, hoher Temperatur oder organischen Lösungsmitteln, wie z.B. Formamid, Tetraalkylammoniumhalogenide oder dergleichen, bei verschiedenen Kombinationen von Konzentration und Temperatur ein. Einzelsträngige DNA im Zielbereich kann auch mit Enzymen, wie z.B. Exonuklease III [van Dekken et al., Chromosoma (Berl) 97:1-5 (1988)] erzeugt werden. Das bevorzugte Denaturierungsverfahren besteht in einer Inkubation für etwa 1-10 Minuten in Formamid bei einer Konzentration zwischen etwa 35-95 Prozent in 2X SSC und bei einer Temperatur zwischen etwa 25-70°C. Die Bestimmung der optimalen Inkubationszeit, Konzentration und Temperatur innerhalb dieser Bereiche hängt von mehreren Variablen ab, einschließlich des Fixierungsverfahrens und der Art der Sonden-Nukleinsäure (beispielsweise DNA oder RNA).
Nach Denaturierung der chromosomalen DNA werden die Denaturierungsmittel typischerweise vor Applikation des heterogenen Probengemisches entfernt. Wenn Formamid und Wärme die primären Denaturierungsmittel sind, wird die Entfernung zweckmäßig durch mehrere Wäschen mit einem Lösungsmittel, das häufig gekühlt ist, wie z.B. Serien von 70%igem, 85%igem und 100%igem kaltem Ethanol, bewerkstelligt. Alternativ dazu kann die Zusammensetzung des Denaturierungsmittels durch Zusatz anderer Bestandteile oder Wäschen mit geeigneten Lösungen je nach Zweckmäßigkeit für die In situ-Hybridisierung eingestellt werden. Die Sonde und die Ziel-Nukleinsäure können gleichzeitig denaturiert werden, indem das Hybridisierungsgemisch appliziert und dann auf die geeignete Temperatur erwärmt wird.
Die physiochemischen Umgebungsbedingungen von chromosomaler DNA und Sonde während der Zeit, in der das heterogene Gemisch appliziert wird, werden hierin als Hybridisierungsbedingungen oder Reassoziationsbedingungen bezeichnet. Optimale Hybridisierungsbedingungen für bestimmte Anwendungen können durch Steuern mehrerer Faktoren eingestellt werden, welche die Konzentration der Bestandteile, die Inkubationszeit der Chromosomen im heterogenen Gemisch und die Konzentrationen, Komplexitäten und Längen der Nukleinsäurefragmente, aus denen das heterogene Gemisch besteht, einschließen. Die Hybridisierungsbedingungen müssen etwa ausreichend nahe an der Schmelztemperatur liegen, um unspezifisches Binden zu minimieren. Andererseits können die Bedingungen nicht so stringent sein, dass sie korrekte Hybridisierungen von komplementären Sequenzen unter nachweisbare Niveaus vermindern oder übertrieben lange Inkubationszeiten erfordern.
Die Nukleinsäure-Konzentration im Hybridisierungsgemisch ist eine wichtige Variable. Die Konzentrationen müssen hoch genug sein, so dass eine ausreichende Hybri disierung der entsprechenden chromosomalen Bindungsstellen in einer vernünftigen Zeit erfolgt (z.B. innerhalb von Stunden oder mehrerer Tage). Höhere Konzentrationen als die zur Erzielung adäquater Signale notwendigen sollten vermieden werden, damit unspezifisches Binden minimiert wird. Eine wichtige praktische Beschränkung für die Sondennukleinsäure-Konzentration im heterogenen Gemisch stellt die Löslichkeit dar. Es existieren Obergrenzen hinsichtlich der Fragmentkonzentration, d.h. Längeneinheiten an Nukleinsäure pro Einheiten Volumen, die in Lösung gehalten werden kann und wirkungsvoll hybridisieren kann.
Bei den in Abschnitt VI.B (unten) beschriebenen, repräsentativen Beispielen wies die gesamte DNA-Konzentration im Hybridisierungsgemisch eine obere Grenze in der Größenordnung von 1 ug/ul auf. Sondenkonzentrationen im Bereich von 1-20 ng/ul wurden für solche Färbungen ganzer Chromosomen verwendet. Die Menge an genomischer blockierender DNA wurde so eingestellt, dass Q kleiner als 5 war. Am unteren Ende der Sondenkonzentration wurden adäquate Signale mit einer einstündigen Inkubation, das heißt, einem Zeitraum, in dem die Sonde und die blockierende DNA vor Applikation auf das Ziel-Material gemeinsam gehalten werden, um die Sequenzen hoher Kopienzahl zu blockieren, und einer 16-ständigen Hybridisierung erzielt. Signale waren nach zweistündiger Hybridisierung sichtbar. Die besten Ergebnisse (helle Signale mit höchstem Kontrast) ergaben sich nach 100-ständiger Hybridisierung, die den zielspezifischen Sequenzen niedriger Kopienzahl mehr Gelegenheit zum Auffinden von Bindungsstellen gab. Am oberen Ende der Sondenkonzentration werden helle Signale nach Hybridisierungen für 16 Stunden oder weniger erhalten; der Kontrast war vermindert, da mehr markierte repetitive Sequenzen in der Sonde enthalten waren.
Das fixierte Zielobjekt kann auf mehrere Arten entweder während oder nach dem Hybridisierungsschritt behandelt werden, um das unspezifische Binden von Sonden-DNA zu vermindern. Solche Behandlungen beinhalten das Zugeben von Nichtsonden- oder "Träger"-DNA zum heterogenen Gemisch, das Verwenden von Beschichtungslösungen, wie z.B. Denhardt-Lösung (Biochem. Biophys. Res. Commun., Bd. 23, S. 641-645 (1966)) mit dem heterogenen Gemisch, das Inkubieren in denaturie renden Lösungsmitteln bei einer Temperatur von 5-10°C über der Hybridisierungstemperatur für mehrere Minuten, z.B. 5-20, und im Falle von RNA-Sonden die schonende Behandlung mit Einzelstrang-RNase (z.B 5-10 Mikrogramm pro Milliliter RNase) in 2X SSC bei Raumtemperatur für 1 Stunde.
V. Chromosomenspezifische Färbereagenzien, die ausgewählte Einzelkopie-Sequenzen umfassen
V.A. Herstellung und Verwendung eines für das menschliche Chromosom 21 spezifischen Färbereagenz
V.A.1. Isolierung von Chromosom 21 und Konstruktion einer für Chromosom 21 spezifischen Bibliothek
DNA-Fragmente aus menschlichen chromosomenspezifischen Bibliotheken sind vom National Laborstory Gene Library Project durch die American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, MD erhältlich. DNA-Fragmente aus Chromosom 21 wurden durch die von Fuscoe et al. in "Construction of Fifteen Human Chromosome-Specific DNA Libraries from Flow-Purified Chromosomes", Cytogenet. Cell Genet., Bd. 43, S. 79-86 (1986) beschriebene Methode gewonnen. Kurz gesagt, wurde eine menschliche diploide Fibroblastenkultur aus Vorhautgewebe von Neugeborenen hergestellt. Die Chromosomen der Zellen wurden durch das MgSO₄-Verfahren von van den Engh et al., Cytometry; Bd. 5, S. 108-123 (1984) isoliert und mit den Fluoreszenz-Farbstoffen Hoechst 33258 und Chromomycin A3 gefärbt. Chromosom 21 wurde auf dem von Peters et al., Cytometry; Bd. 6, S. 290-301 (1985) beschriebenen Hochgeschwindigkeitssortierer des Lawrence Livermore National Laborstory gereinigt.
Nach dem Sortieren betrugen die Chromosomenkonzentrationen ungefähr 4 × 10⁵/ml. Daher wurden die Chromosomen (0,2-1,0 × 10⁶) vor der DNA-Extraktion durch Zentrifugation bei 40.000 × g für 30 Minuten bei 4°C konzentriert. Das Pellet wurde dann in 100 Mikrolitern DNA-Isolierungspuffer (15 mM NaCl, 10 mM EDTA, 10 mM Tris-HCl pH 8,0), der 0,5% SDS und 100 Mikrogramm/ml Proteinase K enthielt, resuspendiert. Nach Inkubation über Nacht bei 37°C wurden die Proteine zweimal mit Phenol:Chloroform:Isoamylalkohol (25:24:1) und einmal mit Chloroform:Isoamylalkohol (24:1) extrahiert. Wegen der kleinen DNA-Mengen wurde jede organische Phase neuerlich mit einer kleinen Menge 10 mM Tris pH 8,0, 1 mM EDTA (TE) extrahiert. Die wässrigen Phasen wurden vereinigt und auf eine Mini-Kollodiummembran von Schleicher und Schuell (Nr. UHO20/25) übertragen und bei Raumtemperatur für 6-8 Stunden gegen TE dialysiert. Die gereinigte DNA-Lösung wurde dann mit 50 Einheiten von HindIII (Bethesda Research Laborstories, Inc.) in 50 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 10 mM MgCl₂, 1 mM Dithiotreitol verdaut. Nach 4 Stunden bei 37°C wurde die Reaktion durch Extraktionen mit Phenol und Chloroform wie vorstehend beschrieben gestoppt. Die wässrige Phase wurde über Nacht bei 4°C in einem Mini-Kollodiumsack gegen Wasser dialysiert und dann wurden 2 Mikrogramm Charon-21A-Arme, die mit HindIII gespalten und mit alkalischer Phosphatase vom Kalb (Boehringer Mannheim) behandelt worden waren, hinzugefügt. Diese Lösung wurde unter Vakuum auf ein Volumen von 50-100 Mikroliter konzentriert und in ein 0,5 ml Mikrofugen-Röhrchen überführt, wo die DNA mit einem Zehntel Volumen 3M Natriumacetat, pH 5,0 und 2 Volumina Ethanol ausgefällt wurde. Der Niederschlag wurde mittels Zentrifugation gesammelt, mit kaltem 70%igem Ethanol gewaschen und in 10 Mikroliter TE gelöst.
Nach mehrstündigem Auflösenlassen der DNA wurden 1 Mikroliter 10X Ligase-Puffer (0,5M Tris-HCl pH 7,4, 0,1 M MgCl₂, 0,1 M Dithiotreitol, 10 mM ATP, 1 mg/ml Rinderserumalbumin) und 1 Einheit T4-Ligase (Bethesda Research Laborstories, Inc.) hinzugegeben. Das Ligations-Reaktionsgemisch wurde 16-20 Stunden bei 10°C inkubiert und Teilmengen zu je 3 Mikroliter wurden in Phagenpartikel verpackt, wobei aus den E. coli-Stämmen BHB 2688 und BHB 2690 hergestellte In vitro-Extrakte, beschrieben von Hohn in Methods of Enzymology, Bd. 68, S. 299-309 (1979) Molecular Cloning: A Laborstory Manual, (Cold Spring Harbor Laborstory, New York, 1982), verwendet wurden. Kurz gesagt, wurden beide Extrakte durch Beschallung hergestellt und zum Zeitpunkt der In vivo-Verpackung vereinigt. Diese Extrakte verpackten Wildtyp-Lambda-DNA mit einer Effizienz von 1-5 × 10⁸ Plaquebildenden Einheiten (pfu) pro Mikrogramm. Die resultierenden Phagen wurden auf E. coli LE392 in einer Dichte von ungefähr 10⁴ pfu/150 mm Platte 8 Stunden amplifiziert, um die Plaques am Zusammenwachsen zu hindern und Unterschiede in den Wachstumsgeschwindigkeiten unterschiedlicher Rekombinanten zu minimieren. Die Phagen wurden aus dem Agar in 10 ml SM-Puffer (50 mM Tris-HCl pH 7,5, 10 mM MgSO₄, 100 mM NaCl, 0,01% Gelatine) pro Platte durch sanftes Schütteln bei 4°C über 12 Stunden eluiert. Die Platten wurden dann mit weiteren 4 ml SM gespült. Nach dem Abscheiden der Zelldebris wurde die Phagensuspension über Chloroform bei 4°C aufbewahrt.
V.A.2. Konstruktion und Verwendung des für Chromosom 21 spezifischen Färbemittels zum Färben von Chromosom 21 von menschlichen Lymphozyten
Klone mit einmaligen Einfügungssequenzen werden durch das Verfahren von Benton and Davis, Science, Bd. 196, S. 180-182 (1977) isoliert. Kurz gesagt, werden etwa 1000 rekombinante Phagen zufallsmäßig aus der für Chromosom 21 spezifischen Bibliothek isoliert. Diese werden auf Nitrocellulose überführt und mit Nicktranslatierter gesamter genomischer menschlicher DNA sondiert.
Von den Klonen, welche keine starke Hybridisierung zeigen, werden ungefähr 300 ausgewählt, die DNA mit offenbar einmaliger Sequenz enthalten. Nach Amplifikation der selektierten Klone, wird die Chromosom 21-Einfügungssequenz in jedem Klon mit ³²p markiert und an Southern-Blots von menschlicher genomischer DNA hybridisiert, welche mit demselben Enzym verdaut ist, das zur Konstruktion der für Chromosom 21 spezifischen Bibliothek verwendet wurde, d.h. HindIII. Einmalige Sequenzen enthaltende Klone werden als jene erkannt, die bei der Southern-Analyse eine einzige Bande erzeugen. Etwa 100 solcher Klone werden für das heterogene Gemisch selektiert. Die Klone mit einmaliger Sequenz werden amplifiziert, die Einfügungssequenzen werden durch HindIII-Verdauung herausgeschnitten, und die Einfügungssequenzen werden von den Phagenarmen durch Gelelektrophorese abgetrennt. Die Sonden-DNA-Fragmente (d.h. die einmaligen Einfügungssequenzen) werden aus dem Gel entfernt und mittels Nick-Translation biotinyliert (z.B. mittels eines von Bethesda Research Laborstories erhältlichen Kits). Markierte DNA-Fragmente werden aus dem Reaktionsgemisch der Nick-Translation unter Verwendung kleiner Spin- Säulen, die in mit Sephadex^® G-50 (Medium), das in 50 mM Tris, 1 mM EDTA, 0,1% SDS bei pH 7,5 gequollen ist, befüllten 0,5 ml Eppendorph-Röhrchen hergestellt sind, abgetrennt. Menschliche Lymphozyten-Chromosomen werden gemäß Harper et al., Proc. Natl. Acad. Sci., Bd. 78, S. 4458-4460 (1981) präpariert. Metaphase- und Interphasezellen wurden dreimal in phosphat-gepufferter Kochsalzlösung gewaschen, in Methanol-Essigsäure (3:1) fixiert und auf gereinigte Objektträger aufgetragen. Die Objektträger werden in einer Stickstoffatmosphäre bei –20°C aufbewahrt.
Objektträger, die Interphasezellen und/oder Metaphasespreitungen tragen, werden aus dem Stickstoff entnommen, in Luft 4 Stunden auf 65°C erhitzt, mit RNase (100 Mikrogramm/ml für 1 Stunde bei 37°C) behandelt und mit einer Ethanolserie dehydratisiert. Dann werden sie mit Proteinase K (60 ng/ml bei 37°C für 7,5 Minuten) behandelt und dehydratisiert. Die Proteinase K-Konzentration wird abhängig von der Zellart und der Enzym-Charge eingestellt, so dass fast kein phasenmikroskopisches Bild der Chromosomen auf dem trockenen Objektträger zurückbleibt. Das Hybridisierungsgemisch besteht aus (Endkonzentrationen) 50 Prozent Formamid, 2X SSC, 10 Prozent Dextransulfat, 500 Mikrogramm/ml Träger-DNA (beschallte Heringsperma-DNA) und 2,0 Mikrogramm/ml Biotin-markierter, für Chromosom 21 spezifischer DNA. Das Gemisch wird auf die Objektträger in einer Dichte von 3 Mikroliter/cm² unter ein Deckglas aufgetragen und mit Kautschukkitt verschlossen. Nach Inkubation bei 37°C über Nacht werden die Objektträger bei 45°C gewaschen (50% Formamid-2XSSC pH 7,3, 3 mal 3 Minuten; gefolgt von 2XSSC pH 7, 5 mal 2 Minuten) und in BN-Puffer (0,1 M Na-Bicarbonat, 0,05 Prozent NP-40, pH 8) eingetaucht. Die Objektträger werden nach diesem Zeitpunkt nie mehr austrocknen gelassen.
Die Objektträger werden aus dem BN-Puffer entnommen und 5 Minuten bei Raumtemperatur mit BN-Puffer (5 Mikroliter/cm² unter Kunststoffdeckstreifen), der 5% fettfreie Trockenmilch (Carnation) und 0,02% Na-Azid enthält, blockiert. Die Deckstreifen werden entfernt und überschüssige Flüssigkeit kurz abgesaugt, und Fluorescein-Avidin DCS (3 Mikrogramm/ml in BN-Puffer mit 5% Milch und 0,02% Na-Azid) wird aufgetragen (5 Mikroliter/cm²). Dieselben Deckstreifen werden wieder aufgebracht, und die Objektträger werden 20 Minuten bei 37°C inkubiert. Die Objektträger werden dann 3 mal jeweils 2 Minuten mit BN-Puffer bei 45°C gewaschen. Die Intensität der Biotin-gekoppelten Fluoreszenz wird durch Auftragen einer Schicht von biotinyliertem Ziegen-Antiavidin-Antikörper (5 Mikrogramm/ml in BN-Puffer mit 5% Ziegenserum und 0,02% Na-Azid) verstärkt, gefolgt – nach Waschen wie oben – von einer weiteren Schicht Fluorescein-Avidin DCS. Fluorescein-Avidin DCS, Ziegen-Antiavidin und Ziegenserum sind alle kommerziell erhältlich, z.B. Vector Laborstories (Burlingame, CA). Nach Waschen mit BN, wird vor Betrachtung eine das Verblassen der Fluoreszenz hemmende Lösung, p-Phenylendiamin (1,5 Mikroliter/cm² Deckstreifen) zugegeben. Für eine optimale mikroskopische Abbildung ist es wichtig, diese Schicht dünn zu halten. Diese verblassungshemmende Lösung verminderte das Verblassen des Fluoresceins signifikant und erlaubt eine kontinuierliche mikroskopische Beobachtung für bis zu 5 Minuten. Die DNA-Gegenfärbemittel (DAPI oder Propidiumiodid) sind in der verblassungshemmenden Lösung zu 0,25-0,5 Mikrogramm/ml enthalten.
Der rot-fluoreszierende DNA-spezifische Farbstoff Propidiumiodid (PI) wird verwendet, um die gleichzeitige Beobachtung von hybridisierter Sonde und gesamter DNA zu erlauben. Das Fluorescein und PI werden bei 450-490 nm (Zeiss-Filterkombination 487709) angeregt. Die Erhöhung der Anregungswellenlänge auf 546 nm (Zeiss-Filterkombination 487715) erlaubt die Beobachtung des PI allein. DAPI, ein blau-fluoreszierendes DNA-spezifisches Färbemittel, das im Ultravioletten (Zeiss-Filterkombination 487701) angeregt wird, wird als Gegenfärbemittel verwendet, wenn Biotin-markierte und gesamte DNA getrennt beobachtet werden. Metaphasechromosomen des Typs 21 werden durch zufällig angeordnete gelbe Tupfen, die über den Chromosomenkörper verteilt sind, nachgewiesen.
V.B. Verbessertes Verfahren zum effizienten Selektieren von Einzelkopie-Sequenzen von Chromosom 21
Fuscoe et al., Genomics, 5:100-109 (1989) stellen effizientere Verfahren als das soeben beschriebene (V.A.2) zum Selektieren großer Zahlen von Klonen mit Einzelkopie-Sequenzen oder Klonen mit Wiederholungssequenzen sehr niedriger Kopienzahl aus Bibliotheken rekombinanter Phagen zur Verfügung und zeigen deren Verwen dung zum Färben von Chromosom 21. Die genannte Veröffentlichung wird hiermit durch Zitat aufgenommen. Kurz gesagt, wurden Klone aus der Charon-21A-Bibliothek LL21NS02 (hergestellt aus DNA vom menschlichen Chromosom 21) unter Verwendung zweier grundlegender Methoden selektiert. Bei der ersten wurde die Phagenbibliothek in zwei Schritten durchmustert, wobei Verfahren verwendet wurden, die auf eine höhere Empfindlichkeit gegenüber dem Vorhandensein repetitiver Sequenzen in den Klonen ausgerichtet waren als das Verfahren von Abschnitt V.A.2. Die selektierten Klone wurden dann in Plasmide subkloniert. Die so selektierten 450 Einfügungssequenzen bilden die Bibliothek pBS-U21. Die zweite Methode bestand in einem Mehrstufen-Verfahren, bei dem 1) Einfügungssequenzen aus LL21NS02 in Bluescribe-Plasmide subkloniert wurden, 2) Plasmide in hoher Dichte in Bakterienkulturen auf Nitrocellulose-Filtern vermehrt wurden und 3) radioaktive menschliche genomische DNA an die Plasmid-DNA auf den Nitrocellulose-Filtern bei niedriger Stringenz in zwei Schritten anhybridisiert wurde und 4) Plasmide mit Einfügungssequenzen, die nicht hybridisierten, als potentielle Träger von Einzelkopie-Sequenzen selektiert wurden. Fünfzehnhundertdreißig Kolonien wurden auf diese Weise ausgewählt, um die Bibliothek pBS-U21/1530 zu bilden.
Die Southern-Analyse zeigte, dass die zweite Methode wirksamer im Erkennen repetitiver Sequenzen war als die erste. Fluoreszenz-In-situ-Hybridisierung mit DNA aus pBS-U21/1530 erlaubte die spezifische, intensive Färbung von Chromosomen des Typs 21 in aus menschlichen Lymphozyten gewonnenen Metaphasespreitungen. Die Hybridisierung mit pBS-U21 ergibt eine weniger spezifische Färbung von Chromosom 21. Details bezüglich des Verfahrens von Fuscoe et al. zum Selektieren von Sonden mit Einzelkopie-Sequenzen oder von Sonden mit Wiederholungssequenzen sehr niedriger Kopienzahl aus rekombinanten Bibliotheken sind in Fuscoe et al., id., zu finden.
V.C. Hybridisierung mit einer Sammlung von Chromosom 4-Einzelkopie-Sequenzen
Pinkel et al., PNAS (USA), 85:9138-9142 (Dezember 1988) beschreiben die Methoden zur Herstellung von Chromosom 4-Einzelkopie-Sequenzen und dann ein Protokoll [Modifizierung der in Pinkel et al., PNAS (USA), 83:2934-2938 (1986) beschriebenen Methode] zum Hybridisieren der Einzelkopie-Sonden an eine menschliche Metaphasespreitung. 4H zeigt die Hybridisierung mit einem Pool von 120 Einzelkopie-Sonden aus Chromosom 4 an eine menschliche Metaphasespreitung.
VI. Ausschalten gemeinsamer repetitiver Sequenzen
VI.A. Chromosom 21-spezifische Färbung unter Verwendung blockierender DNA
Hohe Konzentrationen von unmarkierter menschlicher genomischer DNA und Lambda-Phagen-DNA wurden verwendet, um die Bindung von repetitiven und Vektor-DNA-Sequenzen an die Ziel-Chromosomen zu inhibieren. Ausgedehnte Verdauung durch Proteinase und anschließende Fixierung des Ziels verbesserten den Zugang der Sonden zur Ziel-DNA.
Menschliche Metaphasespreitungen wurden auf Objektträgern mit Standardtechniken hergestellt und sofort in einer Stickstoff-Atmosphäre bei –20°C aufbewahrt.
Die Objektträger wurden aus dem Tiefkühler entnommen und in einer Stickstoffatmosphäre auf Raumtemperatur anwärmen gelassen, bevor mit dem Färbevorgang begonnen wurde. Die aufgewärmten Objektträger wurden zuerst 7,5 Minuten mit 0,6 Mikrogramm/ml Proteinase K in P-Puffer (20 mM Tris, 2 mM CaCl₂ mit pH 7,5) behandelt und einmal mit P-Puffer gewaschen. Die verwendete Menge Proteinase K muß für die verschiedenen Chargen von Objektträgern eingestellt werden. Nach dem Denaturieren wurden die Objektträger in 2XSSC aufbewahrt. Ein Hybridisierungsgemisch wurde hergestellt, das aus 50% Formamid, 10% Dextransulfat, 1% Tween 20, 2XSSC, 0,5 mg/ml menschliche genomische DNA, 0,03 mg/ml Lambda-DNA und 3 Mikrogramm/ml Biotin-markierte Sonden-DNA bestand. Die Sonden-DNA bestand aus der Phagen-Fraktion mit der höchsten Dichte (bestimmt mit einem Cäsiumchlorid-Gradienten) aus der Chromosom 21-HindIII-Fragment-Bibliothek (ATCC-Eingangsnummer 57713). (Sowohl Einfügungssequenz- als auch Phagen-DNA der Sonde wurden mittels Nick-Translation markiert.) Die durchschnittliche, mittels Gelelektrophorese bestimmte Größe der Einfügungssequenz (Menge an Chromosom 21-DNA) betrug etwa 5 Kilobasen. Es wurde kein Versuch unternommen, repetitive Sequenzen aus den Einfügungssequenzen zu entfernen oder die Einfügungssequenzen aus dem Lambda-Phagenvektor zu isolieren. Das Hybridisierungsgemisch wurde durch Erhitzen auf 70°C für 5 Minuten denaturiert, gefolgt von einer Inkubation bei 37°C für 1 Stunde. Die Inkubation ermöglicht es der menschlichen genomischen DNA und der unmarkierten Lambda-DNA im Hybridisierungsgemisch, die menschlichen repetitiven Sequenzen und Vektorsequenzen in der Sonde zu blockieren.
Der die menschliche Metaphasespreitung enthaltende Objektträger wurde aus dem 2XSSC entnommen und mit einem Linsenpapier trockengetupft. Das Hybridisierungsgemisch wurde sofort auf den Objektträger aufgebracht, ein Deckglas wurde auf dem Objektträger mit Kautschukkitt befestigt, und der Objektträger wurde über Nacht bei 37°C inkubiert. Danach erfolgte die Präparierung der Objektträger wie im Abschnitt V.B. beschrieben (wo Chromosom 21-DNA mit Fluorescein gefärbt und die gesamte chromosomale DNA mit DAPI gegengefärbt wurde). Die 1A-C veranschaulichen die Ergebnisse. 1A ist ein DAPI-Bild der menschlichen Metaphasespreitung, das mit einem computerisierten Bildanalysesystem erhalten wurde. Es ist ein Binärbild, das alles oberhalb der Nachweisschwelle in Weiß und den Rest in Schwarz zeigt. Die Primärdaten wurden als ein Graustufenbild mit 256 Intensitätsstufen aufgezeichnet. (Kleine Pfeile weisen auf die Lage der Chromosomen des Typs 21 hin.) 1B ist eine Fluorescein-Abbildung derselben Spreitung wie in 1A, wieder in Binärform. (Wiederum weisen kleine Pfeile auf die Lage der Chromosomen des Typs 21 hin.) 10 veranschaulicht die Positionen der Chromosomen des Typs 21, nachdem andere, weniger dicht gefärbte Objekte mittels Standardtechniken der Bildverarbeitung entfernt worden waren.
VI.B. Nachweis von Trisomie 21 und Translokationen von Chromosom 4 unter Verwendung von Bluescribe-Plasmidbibliotheken
Wie in Abschnitt VI.A. veranschaulicht, kann eine menschliche chromosomenspezifische Bibliothek, einschließlich ihrer gemeinsamen repetitiven Sequenzen, verwendet werden, um dieses Chromosom zu färben, wenn das Hybridisierungsvermögen der gemeinsamen repetitiven Sequenzen durch Inkubation mit unmarkierter menschlicher genomischer DNA vermindert wird. In Abschnitt VI.A. wurden die Nukleinsäuresequenzen des heterogenen Gemisches im Phagenvektor Charon 21A kloniert, bei welchem das Verhältnis von Einfügungssequenz- zu Vektor-DNA etwa 0,1 (4 kB durchschnittliche Einfügungssequenz zu 40 kB des Vektors) beträgt. In diesem Abschnitt zeigen wir, dass das Übertragen derselben Einfügungssequenzen in einen kleineren Kloniervektor, das etwa 3 kB große Bluescribe-Plasmid, was das Verhältnis von Einfügungssequenz- zu Vektor-DNA auf 0,5 erhöht, die Spezifität und Intensität der Färbung verbesserte.
Wie vorstehend diskutiert, kann die Inkubation der Sonde mit der Sonde allein, mit der mit unmarkierter genomischer DNA vermischten Sonde und mit einer Sonde, die mit unmarkierter DNA, die hinsichtlich aller oder bestimmter gemeinsamer repetitiver Sequenzen angereichert ist, vermischt ist, durchgeführt werden. Wenn unmarkierte genomische DNA zugesetzt wird, dann ist es wichtig, genug zuzusetzen, um die gemeinsamen repetitiven Sequenzen in der Sonde ausreichend auszuschalten. Die genomische DNA enthält jedoch auch unmarkierte Kopien der Sequenzen, deren Hybridisierung erwünscht ist. Wie oben erklärt, ist Q hier als das Verhältnis von unmarkierten zu markierten Kopien der chromosomenspezifischen Sequenzen im Hybridisierungsgemisch definiert.
Pinkel et al., PNAS (USA), 85:9138-9142 (Dezember 1988) beschreiben die Verwendung unmarkierter genomischer DNA zur kompetitiven Hemmung der Hybridisierung jener Sequenzen in einer chromosomenspezifischen Bibliothek, die auch auf anderen Chromosomen vorhanden sind. Diese Veröffentlichung beschreibt Materialien und Verfahren zur Fluoreszenz-In situ-Hybridisierung mit menschlichen chromoso menspezifischen Bibliotheken [Chromosom-4-Bibliothek LL04NS02, subkloniert in Bluescribe-Plasmide (pBS-4); Chromosom-21-Bibliothek LL21NS02, subkloniert in Bluescribe-Plasmide (pBS-21)]. Die Ergebnisse dieser Hybridisierungen sind in 4A-C und 4F und G gezeigt.
VI.C. Hybridisierung von künstlichen Hefechromosomen (YACS) an eine menschliche Metaphasespreitung
YACS. Sieben Hefeklone HY1, HY19, HY29, HYA1.A2, HYA3.A2, HYA3.A9 und HYA9.E6 wurden von D. Burke (Washington University, St. Louis, MO) erhalten. Die Längen der menschlichen DNA in den Klonen reichten von etwa 100 kB bis etwa 600 kB. Eine Gelelektrophorese wurde durchgeführt, um die Größe dieser Einfügungssequenzen zu verifizieren. Jeder dieser Klone wurde angezüchtet, und die gesamte DNA wurde isoliert. Die isolierte DNA wurde mittels Nick-Translation biotinyliert, so dass 10-30% des Thymidins durch Biotin-11-dUTP ersetzt wurden. Die Konzentration an gesamter markierter DNA nach Nick-Translation liegt im Bereich von 10-20 ng/ul.
Blockierende DNA. Menschliche plazentäre DNA (Sigma) wurde mit Proteinase K behandelt und mit Phenol extrahiert und bis zum Vorliegen eines Größenbereichs von 200-600 bp beschallt. Aus Hefe isolierte gesamte DNA, die kein künstliches Chromosom enthielt, wurde bis zum Vorliegen eines ähnlichen Größenbereichs beschallt. Beide DNAs wurden bei einer Konzentration von 1-10 ug/ul gehalten.
Fluoreszenz-In situ-Hybridisierung (FISH). Die Hybridisierung folgte mit leichten Modifikationen den Methoden von Pinkel et al. (1988), siehe oben. Metaphasespreitungen wurden aus Methotrexat-synchronisierten Kulturen gemäß den Methoden von Harper et al. PNAS (USA) 78:4458-4460, (1981) hergestellt. Die Zellen wurden mit Methanol/Essigsäure fixiert, fixiert (3:1), auf Objektträger aufgebracht, luftgetrocknet und unter Stickstoffgas bei –20°C bis zur Verwendung gelagert. Die Objektträger wurden dann zwei Minuten in 70% Formamid/2xSSC eingetaucht, um die Sequenzen der Ziel-DNA zu denaturieren, mit einer 70-85-100% Ethanol-Serie dehydratisiert und luftgetrocknet. (SSC ist 0,15 M NaCl/0,015 M Na-Citrat, pH 7). Zehn – 100 ng biotiny lierte Hefe-DNA und jeweils ungefähr 1 ug unmarkierte Hefe-DNA und menschliche genomische DNA wurden dann dem Hybridisierungsgemisch hinzugefügt (Endvolumen 10 ul, Endzusammensetzung 50% Formamid/2xSSC/10% Dextransulfat), 5 Minuten auf 70°C erhitzt und dann 1 Stunde bei 37°C inkubiert, um die komplementären Stränge der wiederholten Sequenzen mit höherer Kopienzahl reassoziieren zu lassen.
Das Hybridisierungsgemisch wurde dann auf den Objektträger (eine Fläche von ungefähr 4 cm²) aufgebracht und mit Kautschukkitt unter einem Deckglas verschlossen. Nach Inkubation über Nacht bei 37°C wurde das Deckglas entfernt und der Objektträger 3 mal jeweils 3 Minuten mit 50% Formamid/2xSSC bei 42-45°C und einmal mit PN-Puffer [Gemisch von 0,1 M NaH₂PO₄ und 0,1 M Na₂HPO₄, so dass pH 8 erhalten wird; 0,1% Nonidet P-40 (Sigma)] gewaschen. Die gebundene Sonde wurde dann mit alternierenden 20-minütigen Inkubationen (Raumtemperatur) mit Avidin-FITC und Ziegen-Antiavidin-Antikörper, beide zu 5 ug/ml in PNM-Puffer (PN-Puffer plus 5% fettfreie Trockenmilch, zur Entfernung von Feststoffen zentrifugiert; 0,02% Na-Azid) nachgewiesen. Avidin- und Antiavidin-Inkubation wurden durch 3 Waschungen von jeweils 3 Minuten mit PN-Puffer getrennt. Zwei oder drei Schichten Avidin wurden aufgetragen (Avidin von DCS-Qualität und biotinyliertes Ziegen-Antiavidin wurden von Vector Laborstories Inc., Burlingame. CA) erhalten.
5 zeigt die Hybridisierung von HYA3.A2 (580 kB menschlicher DNA) an 12q21.1. Der Ort der Hybridisierung wurde durch Verwendung einer konventionellen Fluoreszenz-Bandendarstellungstechnik unter Einsatz der DAPI/Actinomycin D-Methode festgestellt: Schweizer, "Reverse fluorescent chromosome banding with chromomycin and DAPI", Chromosoms, 58:307-324 (1976). Das Hybridisierungssignal bildet eine Bande über die Breite jedes Chromosoms des Typs 12, was auf die Morphologie der Packung der DNA in dieser Chromosomenregion hinweist.

Die Positionen der YAC-Klone sind wie unten in Tabelle 2 gezeigt zugeordnet. TABELLE 2 YAC-Kompetitionshybridisierung

YAC-Klon	Größe der Einfügungssequenz	Lokalisation
HY1	120	Xq23
HY19	450	8q23.3
		21q21.1
HY29	500	14q12
HYA1.A2	250	6q16
HYA3.A2	580	12q21.1
HYA3.A9	600	14q21
HYA9.E6	280	1p36.2
		3q22

VI.D. Hybridisierung mit Mensch/Hamster-Hybridzellen
In diesem Beispiel wurden im wesentlichen dieselben Hybridisierungs- und Färbebedingungen verwendet, wie sie bei der Methode von Pinkel et al. (1988), siehe oben, detailliert beschrieben und in den Abschnitten V.C. und VI.B., siehe oben, beispielhaft dargestellt wurden. Bei diesem Beispiel wurden 400 ng Biotin-markierter DNA aus einer Hamster-Mensch-Hybridzelle, die eine Kopie des menschlichen Chromosoms 19 enthält, mit 1,9 ug unmarkierter menschlicher genomischer DNA in 10 ul Hybridisierungsgemisch gemischt. Die Hybridisierung wurde über ungefähr 60 Stunden bei 37°C durchgeführt. Das Fluoreszenzfärben der gebundenen Sonde und das Gegenfärben der Chromosomen erfolgte wie bei den anderen oben dargestellten Beispielen. 6 zeigt die Ergebnisse der Hybridisierung.
VII. Spezifische Anwendungen
Die vorliegende Erfindung erlaubt den mikroskopischen und in manchen Fällen durchflusszytometrischen Nachweis genetischer Anomalien auf einer Zelle-für-Zelle-Basis. Die Mikrosokopie kann vollständig durch menschliche Beobachter vorgenommen werden oder verschiedene Grade zusätzlicher Instrumentierung und Computerunterstützung bis zur vollständigen Automatisierung einschließen. Der Einsatz von Instrumentierung und Automatisierung für solche Analysen bietet viele Vorteile. Dazu zählen die Verwendung von Fluoreszenz-Farbstoffen, die für menschliche Beobachter unsichtbar sind (beispielsweise Infrarotfarbstoffe) und die Möglichkeit zur Interpretation von Ergebnissen, die mit Mehrfachmarkierungsverfahren gewonnen wurden, welche nicht gleichzeitig sichtbar sein könnten (beispielsweise Kombinationen von fluoreszierenden und absorbierenden Färbemitteln, Autoradiographie etc.). Quantitative Messungen können verwendet werden, um Färbungsunterschiede nachzuweisen, die durch menschliche Beobachter nicht nachweisbar sind. Wie weiter unten beschrieben ist, kann eine automatisierte Analyse auch die Geschwindigkeit erhöhen, mit der Zellen und Chromosomen analysiert werden können.
Die mit den Sonden dieser Erfindung nachweisbaren cytogenen Anomalien schließen ein: Duplikation des gesamten oder eines Teils eines Chromosomentyps kann nachgewiesen werden als ein Anstieg in der Zahl oder der Größe verschiedener Hybridisierungsdomänen in Interphase-Kernen nach Hybridisierung mit einer Sonde für den Chromosomentyp oder den Bereich, oder durch Anstieg in der Menge gebundener Sonde. Wenn die Sonde durch Fluoreszenz nachgewiesen wird, kann die Menge gebundener Sonde entweder durchflusscytometrisch oder mittels quantitativer Fluoreszenzmikroskopie bestimmt werden. Deletion eines gesamten Chromosoms oder eines Chromosomenbereichs kann nachgewiesen werden als eine Abnahme in der Zahl oder der Größe verschiedener Hybridisierungsdomänen in Interphase-Kernen nach Hybridisierung mit einer Sonde für den Chromosomentyp oder den Bereich, oder durch Abnahme Menge gebundener Sonde. Wenn die Sonde durch Fluoreszenz nachgewiesen wird, kann die Menge gebundener Sonde entwe der durchflusscytometrisch oder mittels quantitativer Fluoreszenzmikroskopie bestimmt werden.
VII.A Bandenanalyse
Wesentliche Anstrengungen wurden während der vergangenen dreißig Jahre der Entwicklung automatisierter Systeme (besonders computergesteuerter Mikroskope) für die automatische Klassifikation und den Nachweis von Aberrationen von Chromosomen durch Analyse von Metaphasespreitungen gewidmet. In den letzten Jahren waren die Anstrengungen vor allem auf die automatische Klassifizierung von Chromosomen gerichtet, die zur Erzeugung eindeutiger Bandenmuster auf den verschiedenen Chromosomentypen chemisch gefärbt wurden. Diese Anstrengungen waren wegen der feinen Unterschiede im Bandenmuster zwischen Chromosomentypen mit ungefähr gleicher Größe, und weil die unterschiedliche Kontraktion der Chromosomen in verschiedenen Metaphasespreitungen eine Änderung der Zahl und Breite der auf den Chromosomen jedes Typs sichtbaren Banden bewirkt, nur teilweise erfolgreich. Die vorliegende Erfindung überwindet dieses Problem, indem sie die Konstruktion von Reagenzien erlaubt, welche ein Färbungsmuster erzeugen, dessen Abstand, Breiten und Markierungsunterschiede (beispielsweise unterschiedliche Farben) dahingehend optimiert sind, dass sie die automatisierte Klassifizierung und den automatisierten Nachweis von Aberrationen von Chromosomen erleichtern. Dies ist möglich, weil die Hybridisierungssonden ganz nach Wunsch entlang den Längen der Chromosomen gewählt werden können. Die Größe einer von einem solchen Reagenz erzeugten Bande kann von einem einzelnen kleinen Punkt bis zu einer im wesentlichen gleichmäßigen Deckfärbung eines oder mehrerer ganzer Chromosomen reichen. Die vorliegende Erfindung erlaubt somit die Konstruktion einer Hybridisierungssonde und die Verwendung von Markierungsmitteln, vorzugsweise Fluoreszenz, in einer Weise, dass benachbarte Hybridisierungsdomänen unterschieden werden können, beispielsweise durch Farbe, so dass Banden, die für eine räumliche Auflösung zu nahe aneinanderliegen, spektral nachgewiesen werden können (d.h., wenn rote und grüne fluoreszierende Banden verschmelzen, kann das Vorhanden sein der zwei Banden durch die resultierende gelbe Fluoreszenz nachgewiesen werden).
Die vorliegende Erfindung erlaubt auch die Konstruktion von Bandenmustern, die auf spezielle Anwendungen zugeschnitten sind. Sie können daher signifikant unterschiedlich hinsichtlich Abstand und Farbmischung sein, beispielsweise auf Chromosomen, die bezüglich allgemeiner Gestalt und Größe ähnlich sind und die bei Anwendung konventioneller Techniken ähnliche Bandenmuster aufweisen. Die Größe, Gestalt und Markierung (z.B. Farbe) der durch die erfindungsgemäßen Sonden erzeugten Hybridisierungsbanden kann optimiert werden, um Irrtümer beim maschinellen Erfassen zu eliminieren, so dass ein genauer automatisierter Nachweis von Aberrationen möglich wird. Dieses optimierte Bandenmuster verbessert auch in hohem Maß die visuelle Klassifizierung und den visuellen Nachweis von Aberrationen von Chromosomen.
Die Leichtigkeit der Erkennung spezifischer Translokationsbruchstellen kann durch Verwendung eines Reagenz, das auf die Nähe der Bruchregion zielt, verbessert werden. Beispielsweise kann eine erfindungsgemäße Sonde hoher Komplexität verwendet werden, die Sequenzen umfasst, welche an beide Seiten des Bruchs auf einem Chromosom hybridisieren. Der Anteil der Sonde, welcher an eine Seite des Bruchs bindet, kann auf unterschiedliche Weise nachgewiesen werden als der Anteil, welcher an die andere Seite bindet, beispielsweise mit unterschiedlichen Farben. Bei einem solchen Muster würde ein normales Chromosom die verschiedenen gefärbten Hybridisierungsregionen nebeneinander vorliegend aufweisen, und solche Banden würden nahe beieinander erscheinen. Ein Bruch würde die Sonden auf unterschiedliche Chromosomen separieren oder zu chromosomalen Fragmenten führen, und diese könnten als im Durchschnitt viel weiter entfernt visualisiert werden.
VII.B Biologische Dosimetrie
Ein Weg der biologischen Dosimetrie besteht darin, die Häufigkeiten von strukturell aberranten Chromosomen als Hinweis für die genetische Schädigung von Personen, die potentiell toxischen Mitteln ausgesetzt waren, zu messen. Zahlreiche Studien haben die Zunahme der Häufigkeit struktureller Aberrationen mit zunehmender Exposition gegenüber ionisierender Strahlung und anderen Mitteln, die als Clastogene bezeichnet werden, gezeigt. Dizentrische Chromosomen werden am häufigsten erfaßt, da ihre charakteristische Art es ermöglicht, sie rasch ohne Bandenanalyse zu erfassen. Eine rasche Analyse ist wichtig wegen der geringen Häufigkeit solcher Aberrationen bei Personen, die gegenüber an Arbeitsplätzen gefundenen Konzentrationen exponiert waren (~2 × 10^–3/Zelle). Unglücklicherweise bleiben dizentrische Chromosomen nicht stabil erhalten, so dass die gemessene Häufigkeit dizentrischer Chromosomen mit der Zeit nach Exposition abnimmt. Eine längerdauernde Exposition auf niedrigem Niveau führt daher wegen der ständigen Beseitigung dieser Aberrationen nicht zu einer erhöhten Häufigkeit dizentrischer Chromosomen. Translokationen sind geeignetere Aberrationen zur Erfassung bei solchen dosimetrischen Studien, da sie mehr oder weniger unbegrenzt erhalten bleiben. Die Feststellung eines genetischen Schadens kann so lange Zeit nach Exposition erfolgen. Translokationen werden für Zwecke der biologischen Dosimetrie nicht routinemäßig erfasst, da die Schwierigkeit ihrer Erkennung das Erfassen ausreichender Zellen für die Dosimetrie logistisch unmöglich macht.
Die vorliegende Erfindung beseitigt diese Schwierigkeit. Im einzelnen erlaubt die Hybridisierung mit einer Sonde, die mehrere Chromosomen (z.B. Chromosomen 1, 2, 3 und 4) im wesentlichen gleichförmig färbt, die sofortige mikroskopische Identifizierung von diese Chromosomen betreffenden strukturellen Aberrationen in Metaphasespreitungen. Normale Chromosomen erscheinen als durch die Sonde vollständig gefärbt oder ungefärbt. Derivat-Chromosomen, die durch Translokationen zwischen Ziel- und Nichtziel-Chromosomen entstanden sind, werden als nur teilweise gefärbt erkannt (4D). Solche partiell hybridisierten Chromosomen können unmittelbar entweder visuell im Mikroskop oder auf automatisierte Weise unter Verwendung computergestützter Mikroskopie erkannt werden. Die Unterscheidung zwischen Translokationen und dizentrischen Chromosomen wird erleichtert, indem der Sonde in allen Chromosomen-Zentromeren vorhandene Sequenzen zugesetzt werden. Der Nachweis der zentromeren Komponenten der Sonde mit einem Markierungsmittel, beispielsweise Farbe, die sich von der zum Nachweis der übrigen Sondenelemente verwendeten unterscheidet, erlaubt die leichte Identifizierung der Chromosomenzentromere, was wiederum die Unterscheidung zwischen dizentrischen Chromosomen und Translokationen erleichtert. Diese Technologie vermindert den bei früheren Techniken erforderlichen Erfassungsaufwand dramatisch, so dass es möglich wird, zehntausende Metaphasespreitungen zu untersuchen, wie dies für biologische Dosimetrie im niedrigen Konzentrationsbereich erforderlich ist.
VII.C. Pränatale Diagnostik
Die häufigsten pränatal vorhandenen Aberrationen sind Trisomien, welche die Chromosomen 21 (Down-Syndrom), 18 (Edward-Syndrom) und 13 (Patau-Syndrom) betreffen und XO (Turner Syndrom)-, XXY(Kleinfelter-Syndrom)- und XYY-Krankheit. Strukturelle Aberrationen treten auch auf. Sie sind aber selten, und ihre klinische Bedeutung ist oft unsicher. Die Bedeutung des Nachweises dieser Aberrationen ist daher fraglich. Die gegenwärtigen Techniken zur Gewinnung fetaler Zellen für eine konventionelle Karyotyp-Bestimmung, wie z.B. Amniozentese und Chorionbiopsie, liefern hunderte bis tausende Zellen für die Analyse. Diese werden üblicherweise in einer Kultur über 2 bis 5 Wochen angezüchtet, um eine ausreichende Zahl mitotischer Zellen für die zytogenetische Analyse zu produzieren. Nach Präparation der Metaphasespreitungen werden diese mittels konventioneller Bandenanalyse analysiert. Ein solches Verfahren kann nur von hochgeübten Analytikern durchgeführt werden und ist zeitaufwendig, so dass die Zahl an Analysen, welche selbst von den größten zytogenetischen Laboratorien verlässlich durchgeführt werden kann, nur wenige tausend pro Jahr beträgt. Als Folge davon sind pränatale zytogenetische Analysen üblicherweise auf Frauen beschränkt, deren Kinder ein hohes Risiko für eine genetische Erkrankung aufweisen (z.B. über 35 Jahre alte Frauen).
Die vorliegende Erfindung überwindet diese Schwierigkeiten, indem sie die einfache, rasche Identifizierung häufiger numerischer Chromosomenaberrationen in Interphasezellen ohne oder mit minimaler Zellkuitivierung erlaubt. Im einzelnen kann eine anomale Anzahl der Chromosomen 21, 18, 13, X und Y in Interphasezellkernen durch Zählen der Zahl der Hybridisierungsdomänen nach Hybridisierung mit für diese Chromosomen (oder für wichtige Regionen darauf, wie z.B. 21q22 bei Down-Syndrom) spezifischen Sonden nachgewiesen werden. Eine Hybridisierungsdomäne ist eine kompakte, deutlich erkennbare Region, auf der eine hohe Hybridisierungsintensität besteht. Eine erhöhte Häufigkeit von Zellen (mehr als 10%), die drei Domänen für die Chromosomen 21, 18 und 13 zeigen, weist auf das Vorliegen von Down-, Edward- bzw. Patau-Syndrom hin. Eine Erhöhung der Zahl von Zellen, welche nach Hybridisierung mit X-spezifischen und Y-spezifischen Sonden eine einzige X-spezifische Domäne und keine Y-spezifische Domäne zeigen, weist auf das Vorliegen von Turner-Syndrom hin. Eine Erhöhung der Häufigkeit von Zellen, welche zwei X-spezifische Domänen und eine Y-spezifische Domäne zeigen, weist auf Kleinfelter-Syndrom hin, und eine Erhöhung der Häufigkeit von Zellen, welche eine X-spezifische Domäne und zwei Y-spezifische Domänen zeigen, weist auf einen XYY-Fetus hin. Das Zählen von Domänen in Interphasezellkernen kann durch Messung der Hybridisierungsintensität, beispielsweise unter Verwendung von quantitativer Fluoreszenz-Mikroskopie oder Durchflußzytometrie ergänzt (oder in manchen Fällen ersetzt) werden, da die Hybridisierungsintensität der Zahl der Ziel-Chromosomen, für welche die Sonde spezifisch ist, ungefähr proportional ist. Numerische Aberrationen, die mehrere Chromosomen betreffen, können durch den Nachweis der Hybridisierung der verschiedenen Chromosomen mit verschiedenen Markierungsmitteln, beispielsweise verschiedenen Farben, gleichzeitig gezählt werden. Diese Nachweismethoden für Aberrationen überwinden die Notwendigkeit ausgedehnter Zellkultivierung bei konventionellen Methoden, da alle Zellen in der Population ausgewertet werden können. Sie beseitigen wegen der einfachen, eindeutigen Art der Hybridisierungssignale für numerische Aberrationen den Bedarf an hochgeübten Analytikern. Sie sind außerdem für eine automatisierte Aberrationsanalyse gut geeignet.
Die Tatsache, dass numerische Aberrationen in Interphasezellkernen nachgewiesen werden können, erlaubt auch die zytogenetische Analyse von Zellen, die normalerweise nicht zur Mitose stimuliert werden können. Im einzelnen erlauben sie die Analyse von im mütterlichen Blut vorhandenen fetalen Zellen. Ein solches Merkmal ist vorteilhaft, da es die Notwendigkeit invasiver Probenahmen fetaler Zellen, wie z.B. Amniozentese oder Chorionbiopsie, eliminiert.
Wie bereits im Kapitel Hintergrund angedeutet, besteht der Grund, dass solche Embryo-invasiven Verfahren notwendig sind, darin, dass die konventionelle Karyotyp-Bestimmung und Bandenanalyse Metaphasechromosomen benötigt. Gegenwärtig gibt es keine anerkannten Methoden zur Kultivierung von aus mütterlichem Blut abgetrennten fetalen Zellen, um eine Zellpopulation mit Metaphasechromosomen zu erhalten. Dadurch dass die erfindungsgemäßen Färbereagenzien mit Interphasezellkernen verwendet werden können, wird durch diese Erfindung ein für den Embryo nicht-invasives Verfahren zur Karyotyp-Bestimmung fetaler Chromosomen zur Verfügung gestellt.
Der erste Schritt bei einem solchen Verfahren besteht in der Abtrennung fetaler Zellen, welche die Plazenta passiert haben oder von der Plazenta in das mütterliche Blut ausgeschieden worden sind. Die Inzidenz fetaler Zellen im mütterlichen Blutstrom ist sehr niedrig, in der Größenordnung von 10^–4 bis 10^–6 Zellen/ml und variiert ziemlich in Abhängigkeit von der Schwangerschaftsphase; in geeigneter Weise markierte fetale Zellen können jedoch von den mütterlichen Zellen unterschieden und konzentriert werden, beispielsweise durch Hochgeschwindigkeits-Zellsortierung.
Das Vorhandensein von Zellen eines männlichen Fetus kann durch eine Markierung, beispielsweise einen Fluoreszenzmarker, auf einem chromosomenspezifischen Färbereagenz für das Y-Chromosom identifiziert werden. Es wurde gezeigt, dass Zellen, die offenbar entweder Lymphozyten- oder Erythrozyten-Vorläufer waren, welche aus mütterlichen Blut abgetrennt worden waren, Y-Chromatin-positiv sind. [Zillacus et al., Scan. J. Haematol, 15:333 (1975); Parks und Herzenberg, Methods in Cell Biology, Bd. 10, S. 277-295 (Academic Press, N.Y., 1982) und Siebers et al., Humangenetik, 28:273 (1975)].
Ein bevorzugtes Verfahren zur Abtrennung fetaler Zellen aus mütterlichem Blut besteht in der Verwendung monoklonaler Antikörper, welche in bevorzugter Weise eine Affinität für einen nicht auf den mütterlichen Blutzellen vorhandenen Bestandteil aufweisen. Die fetalen Zellen können durch väterliche HLA(Humanes Leukozyten-Antigen)-Marker oder durch ein Antigen auf der Oberfläche der fetalen Zellen nachgewiesen werden. Bevorzugte immunchemische Methoden zur Unterscheidung fetaler und mütterlicher Leukozyten auf Grundlage des unterschiedlichen HLA-Typs nutzen Unterschiede bei den HLA-A2-, -A3- und -B7-Loci und besonders bevorzugt beim-A2-Locus. Ferner können fetale Trophoblasten des ersten und zweiten Trimesters mit Antikörper gegen den inneren Zellbestandteil Cytokeratin, der in mütterlichen Leukozyten nicht vorhanden ist, markiert werden. Beispielhafte monoklonale Antikörper sind in den folgenden zitierten Dokumenten beschrieben.
Herzenberg et al., PNAS, 76:1453 (1979) berichtet über die Isolierung fetaler Zellen, offenbar lymphatischer Herkunft, aus mütterlichem Blut durch Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS), wobei die Abtrennung auf dem Nachweis markierter Antikörpersonden, die an HLA-A2-negative Zellen in mütterlichem Blut binden, basierte. Die auf diese Weise abgetrennten männlichen fetalen Zellen wurden darüber hinaus durch Chinacrin-Färbung des Y-Chromatins identifiziert.
Covone et al., Lancet, Okt. 13, 1984:841 berichteten über die Gewinnung fetaler Trophoblasten aus mütterlichem Blut mittels Durchflußzytometrie unter Verwendung eines Antikörpers mit der Bezeichnung H315. Dieser monoklonale Antikörper identifiziert gemäß dem Bericht ein Glykoprotein, das auf der Oberfläche des menschlichen Syncytiotrophoblasten sowie anderer Trophoblasten-Zellpopulationen exprimiert wird und in anderen peripheren Blutzellen nicht vorhanden ist.
Kawata et al., J. Exp. Med., 160:653 (1984) offenbaren ein Verfahren zur Isolierung plazentärer Zellpopulationen aus Suspensionen menschlicher Plazenta. Das Verfahren verwendet koordinierte Zwei-Farben- und Lichtstreuungs-FACS-Analyse und – Sortierung. Fünf verschiedene Zellpopulationen wurden auf Basis von Größen- und quantitativen Unterschieden hinsichtlich der koordinierten Expression von Oberflächenantigenen, die durch monoklonale Antikörper gegen eine HLA-A-, B-, C- monomorphe Determinante (MB40.5) und gegen menschliche Trophoblasten (anti-Trop-1 und anti-Trop-2) nachgewiesen worden waren, isoliert.
Loke und Butterworth, J. Cell Sci., 76:189 (1985) beschreiben zwei monoklonale Antikörper, 18B/A5 und 18A/C4, die mit Zytotrophoblasten des ersten Trimesters und anderen fetalen Epithelgeweben, einschließlich Syncytiotrophoblasten reagieren.
Ein bevorzugter monoklonaler Antikörper zur Abtrennung fetaler Zellen aus mütterlichem Blut für die erfindungsgemäße Färbung ist der Anti-Cytokeratin-Antikörper Cam 5.2, der von Becton-Dickinson (Franklin Lakes, N.J., USA) kommerziell erhältlich ist.
Andere bevorzugte monoklonale Antikörper zum Abtrennen fetaler Zellen aus mütterlichem Blut sind in der ebenfalls anhängigen, gemeinsam gehörenden US-Patentanmeldung USSN 389,224 , eingereicht am 3. August 1989 unter dem Titel "Method for Isolating Fetal Cytotrophoblast Cells" geoffenbart. [Siehe auch in Fisher et al., J. Cell. Biol., 109 (2):891-902 (1989)]. Die dort offenbarten monoklonalen Antikörper reagieren spezifisch mit Antigen auf Zytotrophoblasten-Zellen des ersten Trimesters, welche fetalen Zellen die höchste Wahrscheinlichkeit für das Erreichen des mütterlichen Blutkreislaufs besitzen. Die genannte Anmeldung und der genannte Artikel werden hierin spezifisch durch Zitat aufgenommen. Kurz gesagt, wurden die monoklonalen Antikörper durch Injizieren von Zytotrophoblasten-Zellen, die aus Schnitten des durch Uterusaspiration isolierten Plazentabetts gewonnen wurden, in Versuchstiere produziert. Die produzierten Antikörper wurden mehreren zytologischen Siebvorgängen unterworfen, um jene Antikörper zu selektieren, die mit der Zytotrophoblasten-Stammzellschicht der Chorionzotten des ersten Trimesters reagieren.
Bevorzugte, von Fisher et al. offenbarte monoklonale Antikörper gegen solche Zytotrophoblasten-Zellen des ersten Trimesters sind beispielsweise monoklonale Antikörper, die von den folgenden, gemäß dem Budapester Vertrag bei der American Type Culture Collection (ATCC; Rockville, MD, USA) hinterlegten Hybridomen produziert werden:

Hybridom ATCC-Eingangsnr.

J1D8 HB10096

P1B5 HB10097
Beide Hybridom-Kulturen wurden von der ATCC am 4. April 1989 in Empfang genommen, und deren Lebensfähigkeit wurde von dieser am 14. April 1989 berichtet.
Fisher et al. geben an, dass die unter Verwendung dieser monoklonalen Antiköper aus mütterlichem Blut isolierten fetalen Zellen zur In vitro-Replikation befähigt sind. Daher können die gemäß dem Verfahren von Fisher et al. isolierten fetalen Zellen, das heißt, fetale Zytotrophoblasten des ersten Trimesters, fetales chromosomales Material liefern, das sich sowohl in der Metaphase als auch in der Interphase befindet.
Nachdem die fetalen Zellen, vorzugsweise Leukozyten und Zytotrophoblasten, besonders bevorzugt Zytotrophoblasten, mit einem geeigneten Antikörper markiert worden sind, werden sie dann von den mütterlichen Zellen entweder direkt oder vorzugsweise durch Abtrennen und Konzentrieren der fetalen Zellen durch Zell-Sortierung oder Panning abgetrennt. Beispielsweise kann FACS verwendet werden, um fluoreszenzmarkierte fetale Zellen abzutrennen, oder es kann die Durchflusszytometrie verwendet werden.
Nachdem die fetalen Zellen vom mütterlichen Blut abgetrennt worden sind, können sie gemäß den Verfahren dieser Erfindung mit geeigneten erfindungsgemäßen chromosomenspezifischen Färbereagenzien, vorzugsweise jenen mit spezieller Bedeutung für die pränatale Diagnostik, gefärbt werden. Bevorzugte Färbereagenzien sind jene, welche so beschaffen sind, dass sie eine Aneuploidie, beispielsweise die Trisomie eines jeden von mehreren Chromosomen, einschließlich der Chromosomentypen 21, 18, 13, X und Y und von Subregionen auf solchen Chromosomen, wie z.B. Subregion 21q22 auf Chromosom 21, nachweisen können.
Vorzugsweise umfasst eine fetale Probe für eine erfindungsgemäße Färbeanalyse mindestens 10 Zellen oder Zellkerne und mehr bevorzugt etwa 100 Zellen oder Zellkerne.
VII.D Tumor-Zytogenetik
In den letzten Jahren haben zahlreiche Studien das Vorliegen struktureller und numerischer Chromosomen-Aberrationen aufgezeigt, die für spezielle Krankheitsphänotypen diagnostisch sind und Hinweise auf die genetische Natur der Krankheit selbst liefern. Zu den prominenten Beispielen zählen die enge Assoziation zwischen chronisch-myeloischer Leukämie und einer die Chromosomen 9 und 22 betreffenden Translokation, die Assoziation einer Deletion eines Teils von 13q14 mit Retinoblastom und die Assoziation einer die Chromosomen 8 und 14 betreffenden Translokation mit Burkitt-Lymphom. Der derzeitige Fortschritt bei der Aufklärung neuer tumorspezifischer Anomalien wird durch die Schwierigkeit beschränkt, repräsentative Metaphasespreitungen mit Banden hoher Qualität für die zytogenetische Analyse zu produzieren. Diese Probleme ergeben sich aus der Tatsache, dass viele menschliche Tumoren schwer oder gar nicht in Kultur gezüchtet werden können. Die Gewinnung mitotischer Zellen ist daher üblicherweise schwierig. Auch wenn die Zellen in Kultur gezüchtet werden können, besteht ein signifikantes Risiko, dass die Zellen, die tatsächlich wachsen, nicht repräsentativ für die tumorauslösende Population sein könnten. Diese Schwierigkeit verhindert auch die Anwendung des vorhandenen genetischen Wissens für die klinische Diagnostik und Prognose.
Die vorliegende Erfindung überwindet die Beschränkungen, indem sie den Nachweis spezifischer struktureller und numerischer Aberrationen in Interphasezellkernen ermöglicht. Diese Aberrationen werden wie oben beschrieben nachgewiesen. Die Hybridisierung mit Ganzchromosomen-Sonden wird die Identifizierung von bisher unbekannten Aberrationen erleichtern und dadurch die rasche Entwicklung neuer Zusammenhänge zwischen Aberrationen und Krankheitsphänotypen erlauben. Mit der Zunahme des Wissens über die genetische Natur spezifischer maligner Erkrankungen können die Interphase-Untersuchungen zunehmend spezifisch durchgeführt werden, indem Hybridisierungssonden selektiert werden, die auf die genetische Läsion zielen. Translokationen an spezifischen Stellen auf ausgewählten Chromosomen können durch Verwendung von Hybridisierungssonden, welche die Bruchstellen in deren Nähe flankieren, nachgewiesen werden. Die Verwendung dieser Sonden erlaubt die Diagnose dieser spezifischen Krankheitsphänotypen. Translokationen können in der Interphase nachgewiesen werden, weil sie Hybridisierungsdomänen zusammenbringen, die normalerweise voneinander getrennt sind, oder weil sie eine Hybridisierungsdomäne in zwei, deutlich getrennte Domänen auftrennen. Außerdem können sie verwendet werden, um die Verringerung und das Wiederauftreten von malignen Zellen während des Therapieverlaufs zu verfolgen. Die Interphasen-Analyse ist bei einer solchen Anwendung besonders wichtig, da es sein kann, dass nur eine kleine Zahl von Zellen vorhanden ist und diese schwer oder gar nicht zur Mitose stimuliert werden können.
Duplikationen und Deletionen, an der Gen-Amplifikation beteiligte Prozesse und der Verlust der Heterozygotie können ebenfalls unter Verwendung der erfindungsgemäßen Techniken in Metaphasespreitungen und Interphasezellkernen nachgewiesen werden. Solche Prozesse werden mit einer zunehmenden Anzahl verschiedener Tumoren in Verbindung gebracht.
VIII. Nachweis der BCR-ABL-Fusion bei chronisch-myeloischer Leukämie (CML)
Sonden. Dieser Abschnitt beschreibt im Detail einen CML-Test, der auf FISH mit Sonden aus den Chromosomen 9 und 22 basiert, welche die fusionierten BCR- und ABL-Sequenzen bei im wesentlichen allen Fällen von CML flankieren (8). Die für die Beispiele dieses Abschnitts verwendeten BCR- und ABL-Sonden wurden freundlicherweise von Carol A. Westbrook vom Department of Medicine, Section of Hematology/Oncology am University of Chicago Medical Center in Chicago, Illinois (USA) zur Verfügung gestellt.
Die ABL-Sonde für Chromosom 9, c-hu-ABL, ist ein 35-kB-Cosmid(pCV105)-Klon, der daraufhin selektiert ist, dass er zur 200-kB-Region von ABL zwischen den Exons IB und II, worin die Brüche auftreten, telomer ist (24). Die BCR-Sonde für Chromosom 22, PEM12, ist ein 18-kB-Phagenklon (in EMBL3), der einen Teil der 5,8-kB-Bruchstellencluster-Region des BCR-Gens, worin beinahe alle CML-Bruchstellen auftreten, enthält und sich zentromer zu dieser erstreckt. Die FISH wurde unter Verwendung einer Biotin-markierten ABL-Sonde, nachgewiesen mit dem Fluorochrom Texasrot, und einer Digoxigenin-markierten BCR-Sonde, nachgewiesen mit dem grünen Fluorochrom FITC, durchgeführt. Die Hybridisierung beider Sonden konnte unter Verwendung eines mit einem Doppelbandfiltersatz (Omega Optical) ausgestatteten Mikroskops gleichzeitig beobachtet werden.
8 ist eine schematische Darstellung des BCR-Gens auf Chromosom 22, des ABL-Gens von Chromosom 9 und des BCR-ABL-Fusionsgens auf dem Philadelphia-Chromosom und zeigt die Lage der CML-Bruchstellen und deren Beziehung zu den Sonden. Exons des BCR-Gens sind als schraffierte Rechtecke dargestellt. Die römische Ziffer I bezieht sich auf das erste Exon des BCR-Gens; die arabischen Ziffern 1-5 beziehen sich auf Exons innerhalb der Bruchstellencluster-Region, hier durch eine strichlierte Linie angedeutet. Die ungefähre Lage der 18-kB-Phage-PEM12-Sonde (die BCR-Sonde) ist durch den leeren, horizontalen Balken angedeutet. Da die Mehrzahl der Bruchstellen bei CML zwischen den Exons 2 und 4 auftritt, werden 15 kB oder mehr des Ziels für PEM12 auf dem Philadelphia-Chromosom verbleiben. Bei der klassischen reziproken Translokation werden wenige kB des Ziels für PEM12 (nicht nachweisbares Fluoreszenzsignal) auf dem Derivat-Chromosom zu finden sein. Die Karte und die Nummerierung der Exons (nicht maßstabsgetreu) wurden nach Heisterkamp et al. (Zitat 34, siehe oben) adaptiert.
Exons des ABL-Gens sind als leere vertikale Balken dargestellt (nicht maßstabsgetreu). Die römischen Ziffern Ia und Ib beziehen sich auf die alternativen ersten Exons und II auf das zweite Exon. Exon II ist ungefähr 25 kB stromaufwärts vom Ende des 28-kB-Cosmids c-hu-abl (der ABL-Sonde). Alle CML-Bruchstellen treten stromaufwärts von Exon II auf, üblicherweise zwischen den Exons Ib und Ia innerhalb einer Region, deren Länge ungefähr 200 kB beträgt. C-hu-abl wird daher immer 25 bis 200 kB von der Verbindungsstelle der Fusion entfernt sein. Die Karte (nicht maßstabsge treu) wurde nach Heisterkamp et al. (Zitat 35, siehe oben) adaptiert. Das BCR-ABL-Fusionsgen ist dargestellt. Bei CML wird PEM12 immer an der Verbindungsstelle liegen, und c-hu-abl wird von PEM12 durch 25 bis 225 kB getrennt sein.
Probenvorbereitung: CML-4: Peripheres Blut wurde 5 Minuten zentrifugiert. Zehn Tropfen der Phasengrenzfläche wurden mit PBS verdünnt, zentrifugiert, mit Methanol/Essigsäure (3:1) fixiert und auf Objektträger aufgetropft. CML-2, 3, 7: Fünf bis 10 Tropfen Mark, das zur Verhinderung der Koagulation mit PBS verdünnt worden war, wurden mit Methanol/Essigsäure fixiert und auf Objektträger aufgetropft. CML-1, 4, 5, 6: Peripheres Blut und/oder Knochenmark wurden in RPMI 1640, das mit 10% fetalem Kalbsserum, einer antibiotischen Mischung (Gentamycin 500 mg/ml) und 1% L-Glutamin supplementiert war, 24 h kultiviert. Die Kulturen wurden gemäß J.J. Yunis und M.E. Chandler Prog. in Clin. Path., 7:267 (1977) synchronisiert, und die Präparation der Chromosomen folgte Gibis und Jackson, Karyogram, 11:91 (1985).
Hybridisierungs- und Nachweisprotokoll. Die Hybridisierung folgte mit Modifikationen den von D. Pinkel et al. (27), Trask et al. (25) und J.B. Lawrence et al. (30) beschriebenen Methoden. Die BCR-Sonde wurde mittels Nick-Translation (Bethesda Research Laborstories Nick-Translation System) mit Digoxigenin-11-dUTP (Boehringer Mannheim Biochemicals) mit einem durchschnittlichen Einbau von 25% markiert. Die ABL-Sonde wurde in ähnlicher Weise mittels Nick-Translation mit Biotin-11-dUTP (Enzo Diagnostics) markiert.

1. Hybridisierung. Denaturieren der Ziel-Interphasezellen und/oder -Metaphasespreitungen auf Glas-Objektträgern bei 72°C in 70% Formamid/2xSSC mit pH 7 für 2 Minuten. Dehydratisieren mit einer Ethanolserie (70%, 85% und 100% jeweils für 2 Minuten). Lufttrocknen und bei 37°C halten (2xSSC ist 0,3 M NaCl/30 mM Natriumcitrat). Erhitzen von 10 ml des Hybridisierungsgemisches, enthaltend 2 ng/ml jeder Sonde, 50% Formamid/2xSSC, 10% Dextransulfat und 1 mg/ml menschliche genomische DNA (beschallt auf 200-600 bp), auf 70°C für 5 Minuten zur Denaturierung der DNA. Inkubieren bei 37°30 Minuten. Auf die erwärmten C für Objektträger auftragen, mit einem 20 mm × 20 mm großen Deckglas bedecken, mit Kautschukkitt ver siegeln und über Nacht in einer Feuchtkammer bei 37°C inkubieren. Die Deckgläser entfernen und dreimal jeweils 20 Minuten mit 50% Formamid/2xSSC, pH 7 bei 42°C, zweimal jeweils 20 Minuten mit 2xSSC bei 42°C waschen und schließlich bei Raumtemperatur mit 4xSSC spülen.
2. Nachweis der gebundenen Sonden: Alle Inkubationsschritte werden mit ungefähr 100 ml Lösung bei Raumtemperatur unter Deckgläsern durchgeführt. Die biotinylierte ABL-Sonde wurde zuerst nachgewiesen, dann die Digoxigenin-markierte BCR-Sonde. a. Biotinylierte ABL-Sonde: Vorblockieren mit 4xSSC/1% Rinderserumalbumin (BSA) für 5 Minuten. Aufbringen von Texasrot-Avidin (Vector Laborstories Inc., 2 mg/ml in 4xSSC/1% BSA) für 45 Minuten. Einmal waschen mit 4xSSC, mit 4xSSC/1% Triton-X 100 (Sigma) und dann wieder mit 4xSSC, jeweils 5 Minuten. Vorblockieren mit PNM (PN enthaltend 5% fettfreie Trockenmilch und 0,02% Natriumazid und zur Entfernung von Feststoffen zentrifugiert. PN ist 0,1 M NaH₂PO₄/0,1 M Na₂HPO₄, 0,05% NP40, pH 8) für 5 Minuten. Aufbringen von biotinyliertem Ziegen-Antiavidin (Vector Laborstories Inc., 5 mg/ml in PNM) für 45 Minuten. Zweimal waschen mit PN für 5 Minuten. Aufbringen einer zweiten Schicht von Texasrot-Avidin (2mg/ml in PNM) für 45 Minuten. Zweimal waschen mit PN für jeweils 5 Minuten. b. Digoxigenin-markierte BCR-Sonde: Vorblockieren mit PNM für 5 Minuten. Aufbringen von Schaf-Antidigoxigenin-Antikörper (erhalten von D. Pepper, Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianapolis, IN; 15,4 mg/ml in PNM) für 45 Minuten. Zweimal waschen mit PN für jeweils 5 Minuten. Vorblockieren mit PNM für 5 Minuten. Aufbringen von mit FITC konjugiertem Kaninchen-Antischaf-Antikörper (Organon Teknika-Cappel, 1:50 in PNM) für 45 Minuten. Zweimal waschen mit PN für jeweils 5 Minuten. Falls erforderlich wird das Signal durch Vorblockieren für 5 Minuten mit PNM und Aufbringen von mit FITC konjugiertem Schaf-Antikaninchen-IgG-Antikörper (Organon Teknika-Cappel, 1:50 in PNM) für 45 Minuten verstärkt. Spülen mit PN.
3. Visualierung: Auf die Objektträger wird eine das Verblassen der Fluoreszenz hemmende Lösung [G. D. Johnson und J. G. Nogueria, J. Immunol. Methods, 43:349 (1981) (Zitat 31, siehe oben)], enthaltend 1 mg/ml 4',6-Amidino-2-Phenylindol (DAPI) als Gegenfärbemittel, aufgebracht und diese werden unter Verwendung eines FITC/Texasrot-Doppelbandfiltersatzes (Omega Optical) auf einem Zeiss Axioskop untersucht.

Das hier für den PCR-Test auf BCR-ABL verwendete Verfahren war für CML-3, 4 und 7 das von Hegewisch-Becker et al. beschriebene (Zitat 32, siehe oben) und für CML-5 und 6 das von Kohler et al. beschriebene (Zitat 33, siehe oben).
Ergebnisse. ABL- und BCR-Hybridisierungsstellen waren auf beiden Chromatiden der Chromosomen in den meisten Metaphasespreitungen sichtbar. Die ABL-Sonde band an Metaphasespreitungen von normalen Personen (9A) nahe des Telomers auf 9q, während die BCR-Sonde bei 22q11 band (9B). Hybridisierung mit der ABL- oder BCR-Sonde an normale Interphasezellkerne führte typischerweise zu zwei winzigen Fluoreszenzpunkten entsprechend der Zielsequenz auf beiden Chromosomen-Homomologen. Die Punkte waren auf den zweidimensionalen Kernbildern offenbar zufällig verteilt und üblicherweise gut getrennt. Einige wenige Zellen zeigten zwei Dublett-Hybridisierungssignale, wahrscheinlich ein Ergebnis der Hybridisierung an beide Schwesterchromatiden beider Homologe in Zellen, welche diese DNA-Region repliziert hatten (d.h. die in der S- oder G2-Phase des Zellzyklus). Zweifarben-FISH der ABL(rot)- und BCR(grün)-Sonden an normale G1-Zellkerne lieferte zwei rote (ABL) und zwei grüne (BCR) Hybridisierungssignale, die zufällig über den Zellkern verteilt waren.
Die genetische Umordnung bei CML bringt die zu den Sonden homologen DNA-Sequenzen auf einem anomalen Chromosom, üblicherweise dem Ph¹, zusammen und im Interphasezellkern zusammen, wie in 8 dargestellt. Der genomische Abstand zwischen den Sonden-Bindungsstellen im Fusionsgen variiert zwischen den CML-Fällen im Bereich von 25 kB bis 225 kB, bleibt aber in allen Zellen eines einzelnen Leukämie-Klons gleich. Zweifarben-Hybridisierung mit ABL- und BCR-Sonden an Interphase-CML-Zellen führte zu einem roten und einem grünen Hybridisierungssignal, deren Lokalisation im Zellkern zufällig war, und einem rot-grünen Dublett-Signal, bei dem der Abstand zwischen den beiden Farben weniger als 1 Mikron betrug (oder ein gelbes Hybridisierungssignal für eine Hybridisierung in sehr enger Nachbarschaft, siehe 10). Die zufallsmäßig lokalisierten roten und grünen Signale werden der Hybridisierung an die ABL- und BCR-Gene auf den normalen Chromosomen zugeschrieben, und das rot-grüne Dublett-Signal der Hybridisierung an das BCR-ABL-Fusionsgen. Interphase-Kartierungsstudien lassen vermuten, dass DNA-Sequenzen, die durch weniger als 250 kB getrennt sind, in Interphasezellkernen durch weniger als 1 Mikron getrennt sein sollten (25). Daraus folgt, dass Zellen, die rote und grüne Hybridisierungssignale zeigten, welche durch mehr als 1 Mikron getrennt waren, als normal gewertet wurden, da dies mit dem Vorliegen der Hybridisierungsstellen auf verschiedenen Chromosomen übereinstimmt. Aufgrund statistischer Betrachtungen werden einige normale Zellen jedoch rote und grüne Farbpunkte aufweisen, die einander nahe genug sind, um als anomal gewertet zu werden. Bei diesen zweidimensionalen Kernanalysen wiesen 9 von 750 normalen Zellkernen rote und grüne Hybridisierungssignale weniger als 1 Mikron vom jeweils anderen auf. Somit wurden ungefähr 1% der normalen Zellen als anomal klassifiziert.
Tabelle 3 zeigt die Hybridisierungsergebnisse für 7 Proben von 6 CML-Fällen zusammen mit konventionellen Karyotypen und anderen diagnostischen Ergebnissen (PCR- und Southern-Blot-Daten). Alle sechs Fälle, einschließlich 3, die mit Bandenanalyse (CML –5, –6 und –7) als Ph¹-negativ bestimmt wurden, zeigten bei mehr als 50% der untersuchten Zellkerne rot-grüne Hybridisierungssignale, die durch weniger als 1 Mikron getrennt waren. Bei den meisten war das Fusionsereignis in fast jeder Zelle sichtbar. Ein Fall (CML-7) zeigte Fusionssignale in fast jeder Zelle, obwohl die PCR-Analyse das Vorhandensein eines Fusionsgens nicht nachweisen konnte und die Bandenanalyse kein Philadelphia-Chromosom offenbarte.
Eine Hybridisierung an Metaphasespreitungen wurde in drei Fällen durchgeführt (CML –1, –5 und –6). Alle zeigten rote und grüne Hybridisierungssignale eng benachbart auf einem einzigen akrozentrischen Chromosom. Bei zwei Fällen, die mittels Bandenanalyse als t(9:22)(q34;q11) erfasst wurden, befand sich das rot-grüne Paar in enger Nachbarschaft zum Telomer des langen Arms eines kleinen akrozentrischen Chromosoms, wie es für das Ph¹ zu erwarten war (9C). Bei einem Fall (CML-6) wurde aufgrund klassischer zytogenetischer Untersuchungen vermutet, dass eine Insertion von chromosomalem Material bei 22q11 vorliegt. Zweifarben-Hybridisierungen an Metaphasespreitungen von diesem Fall zeigten, dass das rotgrüne Paar zentral auf einem kleinen Chromosom lokalisiert war (9D). Dieses Ergebnis stimmt mit der Bildung des BCR-ABL-Fusionsgens durch eine Insertion überein. Bei einem Fall (CML-1) wurden bei 3 von 150 (2%) Interphasezellkernen zwei Paare rot-grüner Dublett-Signale gesehen. Dies kann auf ein doppeltes Ph¹ (oder ein doppeltes Fusionsgen) in diesen Zellen hinweisen. Ein solches Ereignis war mittels der Standard-Zytogenetik, die auf die Analyse von 25 Metaphasespreitungen beschränkt war, nicht nachgewiesen worden. Der Erwerb eines zusätzlichen Ph¹ ist das häufigste Begleitereignis einer Blastentransformation, und sein zytogenetischer Nachweis kann eine Krankheitsprogression ankündigen.
Die gleichzeitige Hybridisierung mit ABL- und BCR-Sonden an Metaphasespreitungen der von CML abgeleiteten Ziellinie K-562 zeigte multiple rot-grüne Hybridisierungsstellen entlang beider Arme eines einzigen akrozentrischen Chromosoms. Die Hybridisierung an Interphasezellkerne zeigte, dass die roten und grünen Signale auf dieselbe Region des Zellkerns beschränkt waren. Dies stimmt mit ihrer Lokalisation auf einem einzigen Chromosom überein. Zwölf bis fünfzehn Hybridisierungspaare wurden in jedem Zellkern gesehen, was auf eine entsprechende Amplifikation des BCR-ABL-Fusionsgens hinweist (siehe 9E und 9F). Diese Ergebnisse stimmen mit früheren Southern-Blot-Daten überein, die eine Amplifikation des Fusionsgens in dieser Ziellinie zeigen (26).
Zusammenfassend legt die Analyse von Interphasezellen bei sieben CML- und vier normalen Zell-Proben unter Verwendung von Zweifarben-FISH mit ABL- und BCR- Sonden die Brauchbarkeit dieser Vorgangsweise für die Routinediagnose von CML und das klinische Monitoring der Krankheit nahe. Zu ihren sehr wichtigen Vorteilen zählen die Möglichkeit, genetische Informationen aus einzelnen Interphase- oder Metaphasezellen in weniger als 24 Stunden zu gewinnen. Sie kann somit auf alle Zellen einer Population und nicht nur auf jene, die sich zufällig oder durch Kultivierung gerade in der Metaphase befinden, angewendet werden. Außerdem kann die Analyse des Genotyps mit dem auf Basis der Morphologie oder anderer Merkmale beurteilten Zell-Phänotyp in Zusammenhang gebracht werden, wodurch die Untersuchung der Abstammungsspezifität von Zellen mit dem CML-Genotyp sowie die Feststellung der Häufigkeit von Zellen mit dieser Anomalie ermöglicht wird.
Das zufällige Nebeneinanderliegen roter und grüner Signale in zweidimensionalen Abbildungen normaler Zellen, das bei etwa 0,01 von normalen Zellen auftritt, setzt die Grenze für den Nachweis geringer Häufigkeiten. Diese Nachweisgrenze kann durch eine vollständigere quantitative Messung der Trennung und Intensität der Hybridisierungssignale in jedem Zellkern unter Verwendung computerisierter Bildanalyse gesenkt werden. Eine solche Analyse wird besonders bei der Untersuchung von Patientenpopulationen wichtig sein, bei denen die Zellen, welche die BCR-ABL-Fusion tragen, in geringer Häufigkeit vorliegen (z.B. während einer Remission, nach Knochenmarktransplantation, während eines Relapse oder bei Modellsystemen).
Dieser Test sollte auch für den Nachweis von CML-Zellen während einer Therapie vorteilhaft sein, wenn die Zahl der für eine Analyse verfügbaren Zellen niedrig ist, da nur wenige Zellen benötigt werden. Schließlich ermöglicht das einfache Zählen von Hybridisierungsspots den Nachweis und die quantitative Analyse der Amplifikation des BCR-ABL-Fusionsgens, wie dies für die K562-Zellinie dargestellt ist (9E). Die quantitative Messung der Fluoreszenzintensität kann eine solche Analyse unterstützen.
IX. Verfahren zur Herstellung und Anwendung einzelsträngiger Nukleinsäure-Sonden auf doppelsträngige Ziel-DNAs
Allgemein beinhaltet das Verfahren zur Herstellung und Anwendung einzelsträngiger DNA-Hybridisierungssonden auf doppelsträngige Ziel-DNA das Behandeln sowohl der Ziel-DNA als auch der Sonden-DNA mit derselben Restriktionsendonuklease, gefolgt von der Verdauung der den Restriktionsschnittstellen benachbarten Einzelstränge. Die Sonden werden durch Neusynthese der verdauten Einzelstränge mit markierten Nukleotiden konstruiert. Die markierten Stränge sind im wesentlichen komplementär zu den unverdauten Einzelsträngen der Ziel-DNAs. Die die markierten Einzelstränge enthaltenden doppelsträngigen DNA-Fragmente werden zu kleineren Stücken zerbrochen und denaturiert. Die Hybridisierungssonden werden durch Abtrennen der markierten einzelsträngigen Fragmente von den unmarkierten Fragmenten gewonnen.
DNA, die für die Sonden verwendet werden soll, wird mit einer Restriktionsendonuklease so geschnitten, dass Restriktionsfragmente mit "klebrigen" Enden gebildet werden. Das heißt, es ist wichtig, dass die Restriktionsendonuklease einen abgestuften Schnitt durch die doppelsträngige DNA ausführt. Geeignete Restriktionsendonukleasen schließen, ohne darauf beschränkt zu sein, ein: HindIII, Bam H1, Eco R1 oder dergleichen, welche alle kommerziell erhältlich sind, z.B. Promega Biotec (Madison, WI) oder Boehringer Mannheim (Indianapolis, IN). Bei der Auswahl einer Restriktionsendonuklease ist es bevorzugt, dass die resultierenden Restriktionsfragmente innerhalb eines Größenbereichs liegen, der ihre direkte Insertion in verfügbare Klonierungsvektoren erlaubt. Zu den geeigneten Klonierungsvektoren zählen Plasmide, wie z.B. pBR322, und Phagen, wie z.B. Lambda-Phage, wobei verschiedene Abkömmlinge dieser beiden kommerziell erhältlich sind, z.B. Promega Biotec (Madison, WI) und Boehringer Mannheim (Indianapolis, IN). Amplifizierte Kopien der Restriktionsfragmente werden unter Verwendung von Standardtechniken isoliert, z.B. Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laborstory, 1982). Alternativ dazu können für manche Anwendungen Restriktionsfragmente aus existierenden Bibliotheken erhalten werden. Beispielsweise hält die American Type Culture Collection, Rockville, MD, Sammlungen menschlicher chromosomenspezifischer Bibliotheken von Restriktionsfragmenten, welche der Öffentlichkeit zur Verfügung stehen.
Bei der Behandlung der Restriktionsfragmente mit Exonuklease werden Standardmethoden verwendet, ebenso bei der enzymatischen Neusynthese der verdauten Stränge in Gegenwart von markierten Vorläufersubstanzen. Insbesondere wird der von James und Leffak, Anal. Biochem., Bd. 141, S. 33-37 (1984) offenbarten Technik gefolgt. Kurz gesagt, werden zu den Restriktionsfragmenten etwa 3 Einheiten Exonuklease III pro Mikrogramm DNA in einer Lösung, bestehend aus 100 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 10 mM MgCl₂ und 1 mM Dithiothreitol, bei 37°C hinzugefügt. Die Verdauung wird durch Erhitzen der Probe auf 60°C für 5-10 Minuten beendet. James und Laffak berichten, dass diese Bedingungen zu einer Verdauung von etwa 80-200 Nukleotiden pro Minute führen. Die tatsächliche Verdauungsgeschwindigkeit wird abhängig vom Ausgangsmaterial und der Charge der Exonuklease III sowie dem Ausgangsmaterial des DNA-Substrates variieren, z.B. Guo et al., Nucl. Acids Res., Bd. 10, S. 2065. Ein gewisses Maß an Versuchen kann notwendig sein, um markierte Stränge der gewünschten Länge zu erhalten. Exonuklease III ist kommerziell erhältlich, z.B. Boehringer Mannheim (Indianapolis, IN) oder Promega Biotec (Madison, WI). T4-Polymerase (BRL, Bethesda, MD) kann ebenfalls sowohl für den Exonuklease- als auch den Neusynthese-Schritt verwendet werden.
Die mit Exonuklease behandelten Restriktionsfragmente dienen als Primer/Vorlage für eine DNA-Polymerase, welche die verdauten Stränge in Gegenwart markierter Vorläufersubstanzen neu synthetisiert. Die bevorzugte markierte Vorläufersubstanz ist biotinyliertes Uracil als ein Ersatz für Thymidin. Die Neusynthese wird unter Verwendung von DNA-Polymerase I oder T4-DNA-Polymerase ausgeführt, wobei nach der Methode von Langer et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci., Bd. 78, S. 6633-6637 (1981) vorgegangen wird, die wiederum eine Adaptierung der von Rigby et al., J. Mol. Biol., Bd. 113, S. 237 (1977) geoffenbarten grundlegenden Technik der Nick-Translation ist, z.B. 1 Einheit E. Coli-Polymerase I pro Mikrogramm DNA wird bei 37°C in einer Lösung, bestehend aus 100 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 10 mM MgCl₂, 1 mM Dithiothreitol und 50 mM KCl, inkubiert. In der Lösung sind auch geeignete Mengen an Triphosphat-Vorläufern (wovon einer oder mehrere markiert sind), z.B. 50-100 mikromolar von jedem für 20-50 Mikrogramm pro Milliliter Restriktionsfragmente. Unter diesen Bedingungen ist die Neusynthese in etwa 40-60 Minuten beendet.
Die markierten Restriktionsfragmente werden zu kleineren Fragmenten zerbrochen, um sicherzustellen, dass die markierten Regionen auf jeder Seite der markierten Restriktionsfragmente getrennt werden. (Ansonsten würde das markierte Fragment auf einer Seite Teil eines größeren Stücks einzelsträngiger DNA sein, das zum markierten Fragment am anderen Ende komplementäre Regionen enthielte). Ein solches Zerbrechen zu kleineren Fragmenten wird durch eine beliebige Zahl von Standardtechniken erreicht, z.B. Beschallung, enzymatische Behandlung oder dergleichen, Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laborstory Manual (Cold Spring Harbor Laborstory, 1982).
Nachdem die markierten Restriktionsfragmente in geeigneter Weise zu kleineren Stücken zerbrochen worden sind, werden sie denaturiert und einzelsträngige markierte Fragmente werden von den unmarkierten Fragmenten getrennt. Die Trennung kann auf mehreren Wegen erreicht werden. Wenn die bevorzugte Markierung, Biotin, verwendet wird, ist das bevorzugte Trennmittel eine Standard-Avidin-Affinitätssäule, z.B. Bayer und Wilchek, "The Use of the Avidin-Biotin Complex as a Tool in Molecular Biology", Methods of Biochemical Analysis, Bd. 26, S. 1-45 (1980) und Manning et al., Biochemistry, Bd. 16, S. 1364-1370 (1977). Avidin kann an eine Anzahl verschiedener Substrate, wie z.B. Glas, Sepharose, Agarose und dergleichen, mit Standardtechniken, wie sie in den obigen Referenzdokumenten beschrieben sind, kovalent gekoppelt werden. Demgemäß werden Manning et al. und Bayer und Wilchek, S. 9-16 durch Zitat aufgenommen. Avidin-Affinitätssäulen sind auch kommerziell erhältlich, z.B. Zymed Laborstories, Inc. (South San Francisco, CA). Die biotinylierten Sonden werden von den Avidinsäulen nach der Methode von Chollet und Kawashima, Nucleic Acids Resources, Bd. 5, S. 1529-1541 (1985) entfernt.
Alternativen zur oben geschilderten Markierungsmethode sind verfügbar. Beispielsweise werden nach Behandlung der DNA, die für die Sonden verwendet werden soll, mit einer Restriktionsendonuklease die erhaltenen Restriktionsfragmente in zwei Teile getrennt. Der erste Teil wird wie oben beschrieben behandelt. Das heißt, er wird mit Exonuklease behandelt, um eine Vorlage bzw. Primer für die Neusynthese eines markierten DNA-Stranges zu bilden. Die erhaltenen neusynthetisierten Restriktionsfragmente werden dann wie oben beschrieben zu kleineren Stücken zerbrochen. Die Markierung muss in diesem Fall nicht Biotin sein. Beispielsweise kann eine radioaktive Markierung verwendet werden. Der zweite Teil wird auch mit einer Exonuklease, vorzugsweise Exonuklease III, behandelt. Die Reaktion wird jedoch vollständig ablaufen gelassen, so dass jedes Restriktionsfragment in zwei nichtkomplementäre, einzelsträngige Stücke mit ungefähr der halben Länge des Ausgangsstrangs umgewandelt wird. Diese resultierenden Einzelstränge werden dann unter Verwendung von Standardtechniken kovalent an DBM-Papier gebunden, z.B. Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, 1982) S. 335-339 und Alwine et al. Methods in Enzymology, Bd. 68, S. 220-242 (Academic Press, New York, 1979). Demgemäß werden die zitierten Seiten dieser Referenzdokumente durch Zitat aufgenommen. Die Fragmente des ersten Teils werden denaturiert und mit dem DBM-Papier, das die kovalent gebundenen Fragmente des zweiten Teils enthält, zusammengebracht. Die Bedingungen werden so eingestellt, dass sie eine Hybridisierung der markierten Stränge an die komplementären, kovalent an das DBM-Papier gebundenen Stränge erlauben. Die unmarkierten Stränge des ersten Teils werden vom Papier abgewaschen (es gibt keine komplementären Stränge, an die sie hybridisieren könnten). Nach dem Waschen werden die markierten Stränge beispielsweise durch Erhitzen abgelöst und sind verwendungsbereit.
Vor Applikation der Sonde auf die Ziel-DNA wird die Ziel-DNA mit der gleichen Restriktionsendonuklease behandelt, die zur Konstruktion der Sonde verwendet wurde. Nach Behandlung mit der Restriktionsendonuklease wird die Ziel-DNA mit einer Exonuklease, vorzugsweise Exonuklease III oder T4-Polymerase, behandelt. Vorzugsweise werden die Bedingungen für die Behandlung mit Exonuklease so einge stellt, dass die Längen der erzeugten einzelsträngigen Regionen im wesentlichen gleich den Längen der Sonden-DNA sind.
Die Hybridisierung der Sonde an die Ziel-DNA wird unter Verwendung von Standardmethoden durchgeführt, z.B. Gall und Pardue, Methods in Enzymology, Bd. 21, S. 270-480 (1981); Henderson, International Review of Cytology, Bd. 76, S. 1-46 (1982) und Angerer et al., in Genetic Engineering: Principles and Methods, Setlow und Hollaender, Hrsg., Bd. 7, S. 43-65 (Plenum Press, New York, 1985). Demgemäß werden diese Referenzdokumente als Anleitung für die Verwendung der Erfindung bei der In situ-Hybridisierung aufgenommen. Kurz gesagt, wird die erfindungsgemäß hergestellte Sonde mit mehreren anderen Mitteln zur Verringerung der unspezifischen Bindung, zur Erhaltung der Integrität der zu sondierenden biologischen Struktur und dergleichen kombiniert. Das resultierende Gemisch wird hierin als Hybridisierungsgemisch bezeichnet. Das Verfahren wird unten für die chromosomenspezifische Färbung von menschlichem Chromosom 21 angewendet.
HindIII-Restriktionsfragmente vom menschlichen Chromosom 21 sind vom National Laborstory Gene Library Project durch die American Type Culture Collection, Rockville, MD, Van Dills et al., "Human Chromosome-Specific DNA Libraries: Construction and Availability", Biotechnologe, Bd. 4, S. 537-552 (1986) erhältlich. Alternativ dazu können solche Fragmente gemäß den Offenbarungen im oben zitierten Van Dills et al. oder in Fuscoe et al., "Construction of Fifteen Human Chromosome-Specific DNA Libraries from Flow-Purified Chromosomes", Cytogenet Cell Genet., 43:79-86 (1986) hergestellt werden.
Klone aus der Bibliothek mit einmaligen Einfügungssequenzen werden mit dem Verfahren von Benton und Davis, Science, Bd. 196, S. 180-182 (1977) isoliert. Kurz gesagt, werden etwa 1000 rekombinante Phagen zufallsmäßig aus der Chromosom 21-spezifischen Bibliothek isoliert. Diese werden auf Nitrocellulose übertragen und mit gesamter genomischer DNA, die einer Nick-Translation unterworfen wurde, sondiert.
Von den Klonen, die keine starke Hybridisierung zeigen, werden ungefähr 300 ausgewählt, die offenbar DNA mit einmaliger Sequenz enthalten. Nach Amplifikation der selektierten Klone wird die Chromosom 21-Einfügungssequenz in jedem Klon mit ³²P markiert und an Southern-Blots von menschlicher genomischer DNA hybridisiert, die mit demselben Enzym, d.h. HindIII, verdaut ist, das zur Konstruktion der Chromosom 21-Bibliothek verwendet wurde. Einmalige Sequenzen enthaltende Klone werden als jene identifiziert, die bei der Southern-Analyse eine einzige Bande erzeugen. Etwa 100 solcher Klone werden für das heterogene Gemisch der Sonden-DNA selektiert. Die Klone mit einmaliger Sequenz werden amplifiziert, die Einfügungssequenzen werden durch HindIII-Verdauung herausgeschnitten, und die Einfügungssequenzen werden von den Phagenarmen durch Gelelektrophorese abgetrennt. Die Sonden-DNA-Fragmente (d.h. die einmaligen Einfügungssequenzen) werden aus dem Gel entfernt und wie oben beschrieben mit Exonuklease III behandelt, gefolgt von Neusynthese in Gegenwart von biotinyliertem UTP-Vorläufer. Die erhaltenen doppelsträngigen Fragmente werden beschallt, so dass im Durchschnitt jedes Fragment etwa 1,5-2,0 Brüche erhält. Die erhaltenen Stücke werden denaturiert, und die biotinylierten Fragmente werden wie oben beschrieben mit Avidin-Affinitätschromatographie isoliert.
Menschliche Lymphozyten-Chromosomen werden gemäß Harper et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci., Bd. 78, S. 4458-4460 (1981) präpariert. Metaphase- und Interphasezellen werden dreimal mit phosphatgepuffertem Kochsalz gewaschen, mit Methanol-Essigsäure (3:1) fixiert und auf gereinigte Objektträger aufgetragen. Die Objektträger werden in einer Stickstoffatmosphäre bei –20°C aufbewahrt.
Objektträger, die Interphasezellen und/oder Metaphasespreitungen tragen, werden aus dem Stickstoff entnommen, mit RNase (100 Mikrogramm/ml für 1 Stunde bei 37°C) behandelt, für etwa 1-16 Stunden mit HindIII bei 37°C (10 Einheiten M 10 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, 10 mM MgCl₂ und 14 mM Dithioenythritol mit pH 7,6) behandelt, mit Exonuklease III wie oben beschrieben behandelt und mit einer Ethanolserie dehydratisiert. Dann werden sie mit Proteinase K (60 ng/ml bei 37°C für 7,5 Minuten) behandelt und dehydratisiert. Die Proteinase-K-Konzentration wird abhängig von der Zellart und der Enzym-Charge eingestellt, so dass fast kein phasenmikroskopisches Bild der Chromosomen auf dem trockenen Objektträger zurückbleibt. Das Hybridisierungsgemisch besteht aus (Endkonzentrationen) 2X SSC (0,15 M NaCl und 0,015 M Natriumnitrat), 10 Prozent Dextransulfat, 500 Mikrogramm/ml Träger-DNA (beschallte Heringsperma-DNA) und 2,0 Mikrogramm/ml Biotin-markierter Sonden-DNA. Dieses Gemisch wird auf die Objektträger in einer Dichte von 3 Mikroliter/cm² unter ein Deckglas aufgetragen und mit Kautschukkitt verschlossen. Nach Inkubation bei 37°C über Nacht, werden die Objektträger bei 45°C gewaschen (50% Formamid-2XSS, pH 7, 3 mal 3 Minuten; gefolgt von 2XSSC, pH 7, 5 mal 2 Minuten) und in BN-Puffer (0,1 M Na-Bicarbonat, 0,05 Prozent NP-40, pH 8) eingetaucht. Die Objektträger werden nach diesem Zeitpunkt nie mehr austrocknen gelassen.
Die Objektträger werden aus dem BN-Puffer entnommen und 5 Minuten bei Raumtemperatur mit BN-Puffer (5 Mikroliter/cm² unter Kunststoffdeckstreifen), der 5% fettfreie Trockenmilch (Carnation) und 0,92% Na-Azid enthält, blockiert. Die Deckstreifen werden entfernt und überschüssige Flüssigkeit kurz abgesaugt, und Fluorescein-Avidin DCS (3 Mikrogramm/ml in BN-Puffer mit 5% Milch und 0,02% Na-Azid) wird aufgetragen (5 Mikroliter/cm²). Dieselben Deckstreifen werden wieder aufgebracht, und die Objektträger werden 20 Minuten bei 37°C inkubiert. Die Objektträger werden dann 3 mal jeweils 2 Minuten mit BN-Puffer bei 45°C gewaschen. Die Intensität der Biotin-gekoppelten Fluoreszenz wird durch Auftragen einer Schicht von biotinyliertem Ziegen-Antiavidin-Antikörper (5 Mikrogramm/ml in BN-Puffer mit 5% Ziegenserum und 0,02% Na-Azid) verstärkt, gefolgt – nach Waschen wie oben – von einer weiteren Schicht Fluorescein-Avidin DCS. Fluorescein-Avidin DCS, Ziegen-Antiavidin und Ziegenserum sind alle kommerziell erhältlich, z.B. Vector Laborstories (Burlingame, CA). Nach Waschen mit BN, wird vor Betrachtung eine das Verblassen der Fluoreszenz hemmende Lösung, p-Phenylendiamin (1,5 Mikroliter/cm² Deckstreifen) zugegeben. Für eine optimale mikroskopische Abbildung ist es wichtig, diese Schicht dünn zu halten. Diese verblassungshemmende Lösung verminderte das Verblassen des Fluoresceins signifikant und erlaubt eine kontinuierliche mikroskopische Beobachtung für bis zu 5 Minuten. Die DNA-Gegenfärbemittel (DAPI oder Propidiumiodid) sind in der verblassungshemmenden Lösung zu 0,25-0,5 Mikrogramm/ml enthalten.
Der rot-fluoreszierende DNA-spezifische Farbstoff Propidiumiodid (PI) wird verwendet, um die gleichzeitige Beobachtung von hybridisierter Sonde und gesamter DNA zu erlauben. Das Fluorescein und PI werden bei 450-490 nm (Zeiss-Filterkombination 487709) angeregt. Die Erhöhung der Anregungswellenlänge auf 546 nm (Zeiss-Filterkombination 487715) erlaubt die Beobachtung des PI allein. DAPI, ein blau-fluoreszierendes DNA-spezifisches Färbemittel, das im Ultravioletten (Zeiss-Filterkombination 487701) angeregt wird, wird als Gegenfärbemittel verwendet, wenn Biotin-markierte und gesamte DNA getrennt beobachtet werden. Metaphasechromosomen des Typs 21 werden durch zufallsmäßig angeordnete gelbe Tupfen, die über die Chromosomenkörper verteilt sind, nachgewiesen.
Die Beschreibungen der vorhergehenden Ausführungsformen der Erfindung werden zum Zwecke der Veranschaulichung und Beschreibung präsentiert. Sie sind nicht als vollständig anzusehen und sollen die Erfindung nicht auf die präzise offenbarte Form beschränken, und offensichtlich sind im Lichte der obigen Lehren viele Modifikationen und Variationen möglich. Die Ausführungsformen wurden gewählt und beschrieben, um die Prinzipien der Erfindung und ihrer praktischen Anwendung bestmöglich zu erklären, um so andere Fachleute in die Lage zu versetzen, die Erfindung bestmöglich für verschiedene Ausführungsformen und mit verschiedenen Modifikationen, wie sie für den speziellen beabsichtigten Gebrauch passend sind, zu nutzen.

Claims

Verfahren zum Färben chromosomaler Ziel-DNA, um eine chromosomale Amplifikation oder Deletion nachzuweisen, umfassend: (a) das Bereitstellen einer ersten Sonde, umfassend ein heterogenes Gemisch von markierten Nukleinsäurefragmenten, das einzigartige Sequenzen einschließt, welche im Wesentlichen komplementär zu einem ersten Teil eines Chromosoms sind, für das ein Nachweis gewünscht ist, wobei die markierten Nukleinsäurefragmente mit einer ersten Markierung markiert sind und eine Komplexität von etwa 40 Kilobasen bis 10 Mb aufweisen, (b) das Verwenden der Sonde und chromosomalen Ziel-DNA in in situ-Hybridisierung, um den Nachweis einer Sonde zu ermöglichen, die mit der chromosomalen Ziel-DNA hybridisiert ist, wobei die chromosomale Ziel-DNA Interphase-DNA ist, und (c) das Nachweisen eines Signals von der ersten Markierung und eines Signals einer zweiten Markierung, welche mit einem zweiten Teil eines Chromosoms hybridisiert ist, um zu bestimmen, ob eine Amplifikation oder eine Deletion in der chromosomalen Ziel-DNA vorliegt, wobei die zweite Markierung unterschiedlich von der ersten Markierung ist und der zweite Teil unterschiedlich vom ersten Teil ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Nachweisen durchgeführt wird, um zu bestimmen, ob eine Amplifikation in der chromosomalen Ziel-DNA vorliegt.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Nachweisen durchgeführt wird, um zu bestimmen, ob eine Deletion in der chromosomalen Ziel-DNA vorliegt.
Verfahren nach jedem vorhergehenden Anspruch, wobei die chromosomale Ziel-DNA während der in situ-Hybridisierung in einem morphologisch identifizierbaren Zellkern vorliegt.
Verfahren nach jedem vorhergehenden Anspruch, wobei die ersten und zweiten Teile Teile verschiedener Chromosomen sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die ersten und zweiten Teile Teile des gleichen Chromosoms sind.
Verfahren nach jedem vorhergehenden Anspruch, wobei der erste Teil einen Teil eines humanen Chromosoms, ausgewählt aus Chromosomen 1 bis 22, X und Y, umfasst.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei der erste Teil einen Teil des humanen Chromosoms 3 umfasst.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei der erste Teil einen Teil des humanen Chromosoms 17 umfasst.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei der erste Teil einen Teil von Chromosom 21 umfasst.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei der erste Teil das Retinoblastom-Gen umfasst.
Verfahren nach jedem vorhergehenden Anspruch, wobei die markierten Nukleinsäurefragmente der ersten Sonde eine Komplexität von mindestens etwa 50 Kilobasen aufweisen.
Verfahren nach jedem vorhergehenden Anspruch, wobei die markierten Nukleinsäurefragmente der ersten Sonde Nukleinsäure von einem YAC, einem Cosmid oder einer Vielzahl von Plasmiden umfassen.
Verfahren nach jedem vorhergehenden Anspruch, wobei die zweite Markierung ein heterogenes Gemisch von markierten Nukleinsäurefragmenten umfasst, das einzigartige Sequenzen einschließt, welche im Wesentlichen komplementär zum zweiten Teil sind.
Verfahren nach jedem vorhergehenden Anspruch, wobei eine oder beide der Markierungen Fluoreszenz-Markierungen umfasst/umfassen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, wobei eine oder beide der Markierungen immunochemische Markierungen umfasst/umfassen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, wobei eine der Markierungen Biotin umfasst.
Testkit zum Färben chromosomaler DNA zum Nachweisen einer chromosomalen Amplifikation oder Deletion, umfassend: (a) eine erste Sonde, umfassend ein heterogenes Gemisch von markierten Nukleinsäurefragmenten, das einzigartige Sequenzen einschließt, welche im Wesentlichen komplementär zu einem ersten Teil eines Chromosoms sind, für das ein Nachweis erwünscht ist, wobei die markierten Nukleinsäurefragmente mit einer ersten Markierung markiert sind und eine Komplexität von mindestens etwa 40 Kilobasen aufweisen, und (b) eine zweite Sonde, umfassend markierte Nukleinsäurefragmente, die im Wesentlichen komplementär zu einem zweiten Teil eines Chromosoms sind, wobei der zweite Teil vom ersten Teil unterschiedlich ist, wobei die markierten Nukleinsäurefragmente mit einer zweiten Markierung markiert sind, wobei die zweite Markierung von der ersten Markierung unterschiedlich ist.
Testkit nach Anspruch 18, wobei die markierten Nukleinsäurefragmente der ersten Sonde eine Komplexität von bis zu 10 Mb aufweisen.
Testkit nach Anspruch 18, wobei die ersten und zweiten Teile Teile von verschiedenen Chromosomen sind.
Testkit nach Anspruch 18, wobei die ersten und zweiten Teile Teile des gleichen Chromosoms sind.
Testkit nach Anspruch 18, wobei der erste Teil wie in einem der Ansprüche 7 bis 11 angeführt ist.
Testkit nach Anspruch 18, wobei die markierten Nukleinsäurefragmente der ersten Sonde wie in Anspruch 12 oder Anspruch 13 angeführt ist.
Testkit nach Anspruch 18, wobei die markierten Nukleinsäurefragmente der zweiten Sonde ein heterogenes Gemisch von markierten Nukleinsäurefragmenten umfassen.
Testkit nach Anspruch 18, wobei die Markierungen wie in einem der Ansprüche 15 bis 17 angeführt sind.