JP2008048668A

JP2008048668A - Ｄｎａコピー数多型を用いた癌発症体質の判定方法

Info

Publication number: JP2008048668A
Application number: JP2006228404A
Authority: JP
Inventors: Isanori Sasaki; 功典佐々木; Yuji Hinota; 裕治日野田; Hiroshi Suehiro; 寛末広
Original assignee: Yamaguchi University NUC
Current assignee: Yamaguchi University NUC
Priority date: 2006-08-24
Filing date: 2006-08-24
Publication date: 2008-03-06

Abstract

【課題】
従来、癌と疑われる組織を採取して行っていた検査法に対し、血液など採取が容易な材料を用いた新規な検査法を開発することを目的として、材料中に存在するＤＮＡコピー数多型を検出する方法を提供すること、さらに該ＤＮＡコピー数多型を指標として子宮体癌や大腸癌になりやすい体質（癌発症体質）を判定する方法を提供することをその主な課題とする。
【解決手段】
ヒト染色体１ｐ３６．３３、１ｑ３２．１、１０ｑ２２．３、１１ｐ１５．５、１１ｑ１３．３、１４ｑ１１．２、１ｑ２１．１、７ｑ１１．１−１１．２１、９ｑ１３、１４ｑ３２．３３、１６ｐ１１．２、２ｐ２１、７ｑ３６．３、１５ｑ２６．３、及び１６ｐ１３．３領域の中から選択される１以上の領域の少なくとも一部におけるＤＮＡコピー数多型を検出することを特徴とする、癌発症体質の判定方法を提供する。
【選択図】なし

Description

本発明は、血液やその他正常組織中に存在するＤＮＡコピー数多型を指標として癌発症体質を判定する方法、該判定の指標となるＤＮＡコピー数多型の検出方法、検出方法に利用するプライマー、および判定用キットに関する。

癌の撲滅のために「癌の早期発見・早期治療」が従来謳われてきた。しかし癌の「早期発見・早期治療」は癌の罹患率そのものを下げるわけではないため、今日では「癌の発症予防」に注目が移っている。癌発症の原因については、いわゆる「癌家系」のように遺伝学的要因が重要な役割を果たしていることが知られている。しかしこれまでの研究の中で「癌になりやすさ（癌発症体質）」に関わる決定的な遺伝学的変化というのは未だに明らかになってはいない。

癌の早期発見への取り組み、およびその問題点について、子宮体癌と大腸癌を見ると、大腸癌の罹患率および死亡率は、本邦においては、肺癌に次いで第二位であり、しかも近年増加傾向にある。大腸癌の多くは良性の腫瘍（ポリープ）を経て癌化することが知られている。このため、定期的な大腸カメラ検査を行い、前癌病変であるポリープの段階で切除することが大腸癌発症予防に有用である。しかし大腸カメラ検査が時に苦痛を伴うことや、検査を受ける際の羞恥心の問題などから、十分な数の受診者が集まらないのが現状である。また一方、子宮体癌の発生率も年々増えており、発症予防や早期発見のために何らかの対策が必要とされている。子宮体癌の早期発見には、定期的な検診を行うことが勧められているが、産婦人科的な診察をためらう女性も多く、やはり十分な数の受診者が集まらないのが現状である。

近年、医学・生物学的研究の進歩により、癌発生のメカニズムが分子レベルまで解明されてきており、癌と遺伝子の関連研究が多く見られるようになった。特許においても、すでに遺伝子レベルの比較を用いた診断法はいくつか知られている。子宮体癌と大腸癌に関連する例をあげれば、正常組織での発現レベルが極めて低く、癌組織で特異的に発現レベルが高い遺伝子を見出し、これを用いた胃癌、大腸癌の診断方法（特許文献１）、ヒト由来の新規なマンノース転移酵素遺伝子を大腸癌マーカー遺伝子として利用する方法（特許文献２）、患者由来の試料中のインターロイキン１受容体アンタゴニストとインターロイキン６（ＩＬ−６）濃度比に基づいて、大腸癌・胃癌・乳癌の診断、癌の悪性度の判定および患者の予後を客観的に判定する方法（特許文献３）や、前立腺癌、非小細胞癌、卵巣癌、胃癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸部癌、結腸癌、直腸癌または大腸癌の検出法として、複数の遺伝子個々の発現量をまとめて定量解析することにより、ある細胞または組織においてその発現が特徴的に亢進または減少している遺伝子を同定することを特徴とする遺伝子発現解析方法（特許文献４）などがある。

染色体異常が原因として起る遺伝的疾患、癌などの診断方法として、染色体ＤＮＡのコピー数異常を指標とする方法も提案されている（特許文献５）。癌細胞由来の染色体ＤＮＡのコピー数の増減を、直接蛍光標識したＤＮＡプローブを用いて、ＣＧＨ（Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅｇｅｎｏｍｉｃｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）法により、標識正常ＤＮＡと競合的に正常な***中期染色体上にｉｎｓｉｔｕｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎを行い、腫瘍／正常の蛍光強度比を測定するものである。腫瘍細胞、正常細胞はそれぞれ別の色素による標識がなされており、もし、腫瘍細胞と正常細胞が等量であれば、その比は１となり、その比が高い染色体領域では、腫瘍細胞でコピー数の増加、すなわち染色体領域の増幅があり、比が低い領域ではコピー数の減少、すなわち染色体領域の欠失があると判断される。

染色体の構造変化による子宮内膜癌を検出する方法については、子宮内膜癌患者の癌細胞のＤＮＡと、正常人の細胞のＤＮＡとを、ＣＧＨ法により比較する方法が開示されている（特許文献６）。

染色体ＤＮＡのコピー数異常を指標とする癌の診断方法として、ＢＡＣ（ＢＡＣｔｅｒｉａｌａｒｔｉｆｉｃｉａｌｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）クローンとのハイブリダイゼーション法を用いて、癌細胞中の染色体ＤＮＡのコピー数異常を検出することによる胃癌、口腔扁平上皮癌の検出方法（特許文献７）、肝細胞癌の悪性度を評価する方法（特許文献８）も開示されている。
特開２００６−１６６７８９号公報特開２００６−１３６３１９号公報特開２００４−８５３０５号公報特開２００４−２１５５０３号公報特表平０７−５０５０５３号公報特開２０００−１６６５５７号公報特開２００６−９４７３３号公報特開２００６−９４７２６号公報

しかしながら、前述の方法は、癌と疑われる組織を採取して行っている検査法であり、定期健診等で利用するには受診者の負担が大きい。本発明は、血液など採取が容易な材料を用いた新規な検査法を開発することを目的として、材料中に存在するＤＮＡコピー数多型を検出する方法を提供すること、さらに該ＤＮＡコピー数多型を指標として子宮体癌や大腸癌になりやすい体質（癌発症体質）を判定する方法を提供することをその主な課題とする。

本発明者等は、血液やその他正常組織に存在するＤＮＡコピー数多型が、子宮体癌患者や大腸癌患者に特徴的に存在することを見出すことにより、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は以下の（１）〜（７）を提供する。

（１）ヒト染色体１ｐ３６．３３、１ｑ３２．１、１０ｑ２２．３、１１ｐ１５．５、１１ｑ１３．３、１４ｑ１１．２、１ｑ２１．１、７ｑ１１．１−１１．２１、９ｑ１３、１４ｑ３２．３３、１６ｐ１１．２、２ｐ２１、７ｑ３６．３、１５ｑ２６．３、及び１６ｐ１３．３領域の中から選択される１以上の領域の少なくとも一部におけるＤＮＡコピー数多型を検出することを特徴とする、癌発症体質の判定方法。

（２）ヒト染色体１ｐ３６．３３、１ｑ３２．１、１０ｑ２２．３、１１ｐ１５．５、１１ｑ１３．３、１４ｑ１１．２、１ｑ２１．１、７ｑ１１．１−１１．２１、９ｑ１３、１４ｑ３２．３３、及び１６ｐ１１．２領域の中から選択される１以上の領域の少なくとも一部におけるＤＮＡコピー数多型を検出することを特徴とする、子宮体癌発症体質の判定方法。

（３）ヒト染色体１ｐ３６．３３、１ｑ３２．１、１０ｑ２２．３、１１ｐ１５．５、１１ｑ１３．３、及び１４ｑ１１．２領域の中から選択される１以上の領域の少なくとも一部におけるＤＮＡコピー数の増加、及び／またはヒト染色体１ｑ２１．１、７ｑ１１．１−１１．２１、９ｑ１３、１４ｑ３２．３３、及び１６ｐ１１．２領域の中から選択される１以上の領域の少なくとも一部におけるＤＮＡコピー数の減少を検出する、上記（２）に記載の判定方法。

（４）ヒト染色体２ｐ２１、７ｑ３６．３、１５ｑ２６．３、及び１６ｐ１３．３領域の中から選択される１以上の領域の少なくとも一部におけるＤＮＡコピー数多型を検出することを特徴とする、大腸癌発症体質の判定方法。

（５）女性において染色体１６ｐ１３．３領域の少なくとも一部におけるＤＮＡコピー数の増加、あるいは男性において染色体２ｐ２１、７ｑ３６．３、１５ｑ２６．３、及び１６ｐ１３．３領域の中から選択される１以上の領域の少なくとも一部におけるＤＮＡコピー数の減少を検出することを特徴とする上記（４）に記載の判定方法。

（６）ＤＮＡコピー数多型の検出を、ヒト血液または組織を材料として、ＢＡＣアレイＣＧＨ法、定量ＰＣＲ法、またはＦＩＳＨ法によって検出する、上記（１）〜（５）のいずれか一項に記載の判定方法。

（７）ヒト染色体１ｐ３６．３３、１ｑ３２．１、１０ｑ２２．３、１１ｐ１５．５、１１ｑ１３．３、１４ｑ１１．２、１ｑ２１．１、７ｑ１１．１−１１．２１、９ｑ１３、１４ｑ３２．３３、１６ｐ１１．２、２ｐ２１、７ｑ３６．３、１５ｑ２６．３、及び１６ｐ１３．３領域の中から選択される１以上の領域の少なくとも一部におけるＤＮＡコピー数多型を検出するための癌発症体質の判定用キット。

本発明により、採取が容易な血液など正常な組織を材料にして、子宮体癌や大腸癌になりやすい体質（癌発症体質）を判定することが可能になるため、発症予防や早期発見に必要な定期検診等による癌の検診者の増加が期待される。早期ガンの段階で診断・治療をうける検診者が増えることにより、癌による死亡率を下げることが可能になり、社会的に大きな貢献をすることができる。

本発明は、被験者のＤＮＡにおいて、染色体１ｐ３６．３３、１ｑ３２．１、１０ｑ２２．３、１１ｐ１５．５、１１ｑ１３．３、１４ｑ１１．２、１６ｐ１３．３、１ｑ２１．１、７ｑ１１．１−１１．２１、９ｑ１３、１４ｑ３２．３３、１４ｑ３２．３３、１６ｐ１１．２、２ｐ２１、７ｑ３６．３、及び１５ｑ２６．３領域の中から選択される１以上の領域の少なくとも一部におけるＤＮＡコピー数多型を検出することにより、子宮体癌や大腸癌などの癌発症体質の判定を行う方法を提供する。

本発明の方法は、上記領域の１つの多型を検出すれば良いが、精度を高めるためには、２つ以上、好ましくは３つ以上、より好ましくは５つ以上の領域の多型を検出することが望ましい。

本発明において、「癌発症体質の判定」とは、癌になりやすい体質を有する、と決定することを意味し、「少なくとも一部」とは、ＤＮＡの２０ｂｐ以上の連続した配列をいい、多型を検出するには、好ましくは８０ｂｐ以上、より好ましくは１ｋｂ以上の連続した配列が望ましい。この「少なくとも一部」の中には遺伝子も含まれる。

本明細書において、「コピー数多型」とは、健常人のゲノムＤＮＡにおいて、特定の領域が増加あるいは減少している状態のことをいい、本発明の「ＤＮＡコピー数多型を検出する」とは、ＤＮＡコピー数の増減の程度およびＤＮＡコピー数多型の頻度を見つけることであり、本発明は、ＤＮＡの「コピー数多型」を検出することにより、子宮体癌や大腸癌などの癌発症体質の判定を行う方法を提供するものである。また、ＤＮＡの「コピー数多型」の中には「遺伝子コピー数多型」も含まれる。

ＤＮＡコピー数多型の検出法としては、ヒト血液または組織を材料として、ＢＡＣアレイＣＧＨ法、定量ＰＣＲ法、あるいはＦＩＳＨ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｉｎｓｉｔｕｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）法を使用することができる。

ＢＡＣアレイＣＧＨ法とは、Ｍａｃｒｏｇｅｎ’ｓＫＯＧＥＮＯＭＥＰｒｏｊｅｃｔで作成されたＤＮＡ断片からなるＢＡＣ（ＢＡＣｔｅｒｉａｌＡｒｔｉｆｉｃａｌＣｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）クローンを、スライドガラス上にスポットしたアレイを用いた比較ゲノムハイブリダイゼージョン（Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅｇｅｎｏｍｉｃｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：ＣＧＨ）法であり、テストＤＮＡと正常細胞由来のＤＮＡをそれぞれ異なった蛍光色素で標識し、その蛍光強度の比較を行うことによりＤＮＡコピー数多型を検出する方法である。ＢＡＣアレイには、約１Ｍｂ間隔でＢＡＣクローンがスポットされているため、約１Ｍｂの解像度で染色体異常を検出することができる。

ＢＡＣクローンをスポットしたアレイは、市販のものを入手して利用することも可能である。例えば、Ｍａｃｒｏｇｅｎ社のＭＡＣＡｒｒａｙ（登録商標）、ＳＰＥＣＴＲＡＬＧＥＮＯＭＩＣＳ社のＳｐｅｃｔｒａｌＣｈｉｐ（登録商標）等がある。ＭＡＣＡｒｒａｙ（登録商標）の場合、アレイスライド上には全染色体を網羅する４０３０個のＢＡＣクローンがスポットされている。ＢＡＣ開始位置、終了位置などの情報クローン情報は、Ｍａｃｒｏｇｅｎ社のＨＰ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍａｃｒｏｇｅｎ．ｃｏｍ／ｅｎｇ／ｆｉｌｅ／４Ｋ＿ｌｉｓｔ＿０４１２２１．ｘｌｓ）に掲載され更新されている。

Ｍａｃｒｏｇｅｎ社のＭＡＣＡｒｒａｙ（登録商標）では、本発明の染色体領域は、表１に示すＢＡＣクローンＩＤを含む領域であり、ＢＡＣクローンの開始位置と終了位置は、ＮＣＢＩＨｕｍａｎＧｅｎｏｍｅＡｓｓｅｍｂｌｙＢｕｉｌｄ３４に基づいて表している。

ＢＡＣクローンと反応させるＤＮＡは、ランダムプライム法などで標識するが、このような方法で蛍光標識する場合、テストＤＮＡは、Ｃｙａｎｉｎｅ５−ｄＣＴＰ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）で、コントロールＤＮＡはＣｙａｎｉｎｅ３−ｄＣＴＰ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）で標識することができる。

標識したＤＮＡ溶液は、３Ｍ酢酸ナトリウムやエタノールを用いて、ＤＮＡに取り込まれなかった標識物質等除去するため洗浄する。精製された標識ＤＮＡは、ハイブリダイゼーション溶液に溶解する。ハイブリダイゼーション溶液としては、５０％ホルムアミド、１０％硫酸デキストラン、２ＸＳＳＣ（２ＸＳＳＣ：２倍濃度の標準クエン酸緩衝液）、４％ドデシル硫酸ナトリウム、１００ｍｇ／ｍｌ酵母ｔＲＮＡの混液を用いることができるが、ＭＡＣＡｒｒａｙ（登録商標）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌｋｉｔ（Ｍａｃｒｏｇｅｎ社）等の市販のハイブリダイゼーション溶液を利用することができる。７０℃の水浴中で１５分間加熱することによりＤＮＡを熱変性させ、３７℃のインキュベータ内で１時間静置することにより、繰り返し配列をブロックする。

ハイブリダイズさせるアレイスライドは、標識ＤＮＡの担体への吸着によるロスを防ぐために、前処理を行うことが望ましい。前処理液は、ハイブリダイゼーション溶液を使用することもできるが、ＭＡＣＡｒｒａｙ（登録商標）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌｋｉｔ（Ｍａｃｒｏｇｅｎ社）等の市販の前処理液を利用することもできる。前処理液をアレイスライド上に滴下し、液がアレイ全体に行き渡るようカバーグラスを載せ、密閉箱中にスライドを置き、室温で３０分間程度静置する。スライドグラスは蒸留水中で洗浄した後、アルコール類で乾燥させる。

ハイブリダイゼーションは、作製した標識ＤＮＡを含むハイブリダイゼーション溶液をアレイスライド上に滴下して、カバーグラスをかけ、湿潤条件下、３７℃で４８時間程度行う。密閉湿潤箱中にアレイスライドを静置する方法が好ましい。

反応後、非結合物質を除去するためアレイスライドの洗浄を行う。アレイスライドの洗浄法は以下のように行うことができるが、この方法には限定されない。アレイスライドを、４６℃に保った５０％ホルムアミド／２ＸＳＳＣ（ｐＨ７．０）中に１５分間、４６℃に保った０．１％ＳＤＳ／２ＸＳＳＣ（ｐＨ７．０）中に３０分間浸漬し、さらに、室温に保った０．１％ＮＰ−４０／０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中に１５分間、室温に保った２ＸＳＳＣ（ｐＨ７．０）中に５分間静置する。その後エタノールに浸漬して乾燥させると良い。

ハイブリダイゼーションおよび洗浄後のアレイスライドは、レーザースキャナーや、ＣＣＤカメラなどの定量的検出装置により、テストＤＮＡおよびコントロールＤＮＡ由来蛍光による画像を取得することができる。レーザースキャナーとしては、マイクロアレイ用スキャナＧｅｎｅＰｉｘ４０００Ｂ（ＡｘｏｎＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社）が市販されている。得られた画像データはアレイＣＧＨ解析用ソフトウェアＭａｃＶｉｅｗｅｒｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｍａｃｒｏｇｅｎ社）により解析を行うことができる。

テストＤＮＡおよびコントロールＤＮＡ由来の蛍光による画像においては、テストＤＮＡのコピー数が多い場合には、テストＤＮＡの蛍光強度が増加し、コントロールＤＮＡのコピー数が多い場合には、コントロールＤＮＡの蛍光強度が増加することから、子宮体癌患者、大腸癌患者および非癌患者のＤＮＡから得られたサンプルのアレイスポットの特定の蛍光波長における蛍光強度を測定することによって、ＢＡＣクローンごとの多型を検出することができる。さらに、ＡｒｒａｙＣＧＨの結果を基に作成した受信者操作特性曲線（ｒｅｃｅｉｖｅｒｏｐｅｒａｔｉｎｇｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｃｕｒｖｅ：ＲＯＣ）から、ＢＡＣクローンごとのＤＮＡコピー数のカットオフ値、感度、特異度を求めることにより、各クローンにおけるＤＮＡコピー数変化の程度と疾患感受性の関係を明確に知ることができる。

カットオフ値、感度、特異度は、相関する。カットオフ値を決めると感度と特異度も一組決まるので、カットオフ値を低いほうから高いほうへ順に変えていくと、そのカットオフ値の数だけ感度と特異度が求められるが、ＲＯＣとは、その点をプロットした曲線をいう。

カットオフ値、感度、特異度の相関については、以下のように説明することができる。何らかの疾病がある人および疾病がない人に対して、ある検査を行ったとする。実際病気のある人に検査で陽性が出るとその人は真の陽性（真陽性）という。また、実際病気があるにもかかわらず検査結果が陰性であると偽陰性という。病気がないのに検査結果が陽性であると偽陽性という。また、実際に病気がなく検査も陰性であると真の陰性（真陰性）という。ある検査をして、その検査値に対して陽性、陰性を分けるひとつの分割点をカットオフ値と言う。カットオフ値を決めると、対象者は表２のように、真陽性、偽陰性、偽陽性、真陰性のどこかに必ず分類され、その数も決まる。そして、その数により感度（感度＝真陽性者数／病気ありの人数（真陽性者数＋偽陰性者数）：その検査が病気を発見する能力）、および、特異度（特異度＝真陰性者数／病気なしの人数（偽陽性者数＋真陰性者数）：非患者を陽性としない能力）が、ひとつのカットオフポイントに対して一組計算される。

ＤＮＡコピー数多型の検出法は、定量ＰＣＲ法を用いても行うことができる。定量ＰＣＲによる方法は、増幅すべきＤＮＡ配列に特異的なプライマーを設計し、定法のＰＣＲ条件下で増幅させたＤＮＡを経時的（リアルタイム）に測定し、増幅率に基づいて鋳型となるＤＮＡの定量を行なう方法である。遺伝子のコピー数多型の検出は、検出すべき遺伝子に特異なプライマーを設計し、定量ＰＣＲを行うことにより可能であり、それに基づき癌発症体質の判定をすることができる。

ＤＮＡコピー数多型の検出法は、ＦＩＳＨ法を用いても行うことができる。ＦＩＳＨ法は、染色体標本の調べたいゲノム領域に、ハイブリダイズ可能なＤＮＡ配列を有するプローブをＦＩＴＣ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）、ＴＲＩＴＣ（Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｒｈｏｄａｍｉｎｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）、ＣｙＤｙｅ（登録商標）などの蛍光物質で標識し、染色体のゲノム領域にハイブリダイズさせ、それにより得られる蛍光シグナルの数量を蛍光顕微鏡下で計数する手法である。また、調べたい対象領域と同一染色体上に存在するＤＮＡに対しては、プローブを異なる蛍光で標識し、同時にハイブリダイゼーションを行うと、コピー数異常をより正確に評価することが可能となる。

染色体標本の前処理は、２ＸＳＳＣ中に染色体スライドを３７℃３０分浸漬して行う。その後、順次７０％、８５％、１００％エタノールに２分間浸漬し、乾燥させる。次いで、７５℃に加温した７０％ホルムアミド／２ＸＳＳＣ溶液中に染色体スライドを５分間浸漬し、順次７０％、８５％、１００％エタノールに２分間浸漬し、乾燥させスライドの熱変性を行う。

プローブの標識は、市販のＭＡＣＰｒｏｂｅＫｉｔ（Ｍａｃｒｏｇｅｎ社）の溶液（ＭＡＣｐｒｏｂｅ２μｌ、ＨｕｍａｎＣｏｔ−１ＤＮＡ２μｌ、ＳａｌｍｏｎＳｐｅｒｍ１μｌ、Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎｓｏｌｕｔｉｏｎ１０μｌ）を混合して、プローブ溶液として調整すると容易である。プローブ混合溶液は、７５℃５分間加温した後、３７℃で１時間加温し、プローブを熱変性させる。

染色体標本のＤＮＡとプローブのハイブリダイズは、以下のように行うことができる。染色体スライドを３７℃のホットプレート上に静置し、染色体スライド上にプローブ混合溶液を滴下し、カバーグラスをかけた状態で、密閉湿潤箱中に静置し、３７℃で一晩加温する。反応後、非結合物質を除去するため染色体スライドの洗浄を行う。染色体スライドの洗浄法は以下のように行うことができるが、この方法には限定されない。染色体スライドを、４５℃に保った５０％ホルムアミド／２ＸＳＳＣ中に１０分間浸す。この操作を計３回行う。さらに、４５℃に加温した２ＸＳＳＣ中に５分間静置、次いで４５℃に加温した４ＸＳＳＣ／０．１％Ｔｗｅｅｎ２０中に１５分間浸す。その後、染色体スライドをエタノールに浸漬して乾燥させる。次いで、ＤＡＰＩ（ＭＡＣＰｒｏｂｅＫｉｔ，Ｍａｃｒｏｇｅｎ社）を染色体スライド上に滴下し、カバーグラスをかける。螢光顕微鏡下、染色体スライド上の蛍光シグナルをカウントして解析を行う。

本発明は、ヒト染色体１ｐ３６．３３、１ｑ３２．１、１０ｑ２２．３、１１ｐ１５．５、１１ｑ１３．３、１４ｑ１１．２、１ｑ２１．１、７ｑ１１．１−１１．２１、９ｑ１３、１４ｑ３２．３３、１６ｐ１１．２、２ｐ２１、７ｑ３６．３、１５ｑ２６．３、及び１６ｐ１３．３領域の中から選択される１以上の領域の少なくとも一部におけるＤＮＡコピー数多型を検出して癌発症体質を判定するためのキットを提供する。

本発明のキットには、対照とするコントロールＤＮＡの他、ＣＧＨ法で使用する標識用蛍光色素、緩衝液や洗浄液、定量ＰＣＲ法で使用するテストＤＮＡに特異的なプライマー、コントロールのプライマーをセットとして含ませること
もできる。

以下、本発明を更に詳しく説明するため、実施例を挙げるが本発明はこれに限定されない。

アレイＣＧＨ法による子宮体癌および大腸癌に特徴的なＤＮＡコピー数多型領域の同定

非癌男性１２人、非癌女性１２人、子宮体癌患者１４人、大腸癌女性患者１２人、大腸癌男性患者１２人の各々から得られた正常細胞由来のＤＮＡを、テストＤＮＡとして、非癌男性３０名、または非癌女性３０名の血液を混合して得られた血液由来のＤＮＡを、それぞれの性別ごとのコントロールＤＮＡとした。テストＤＮＡおよびコントロールＤＮＡのコピー数多型を調べるため、ＢＡＣＡｒｒａｙＣＧＨ（ＢＡＣｔｅｒｉａｌａｒｔｉｆｉｃｉａｌｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｍｉｃｒｏａｒｒａｙｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅｇｅｎｏｍｉｃｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）法を行った。なお、ＢＡＣアレイスライドはＭａｃｒｏｇｅｎ社より発売されているＭＡＣＡｒｒａｙ（登録商標）Ｋａｒｙｏ４Ｋキットを使用した。アレイスライド上には全染色体を網羅する４０３０個のＢＡＣクローンがスポットされている。

＜ＤＮＡ標識プローブの作製＞
テストＤＮＡおよびコントロールＤＮＡ５００ｎｇをそれぞれ別々のチューブに分注し、精製水を加えて全量を２１μｌとした。これらＤＮＡ溶液に２０μｌの２．５ｘＲａｎｄｏｍｐｒｉｍｅｒ溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社ＢｉｏＰｒｉｍｅ（登録商標）ＤＮＡＬａｂｅｌｉｎｇＫｉｔ）を加えて混合し、１００℃にて５分間加熱後、直ちに氷上に移し、５分間冷却した。遠心（４０００ｒｐｍ１０秒）の後、５μｌのＡ溶液（Ｍａｃｒｏｇｅｎ社ＭＡＣＡｒｒａｙ（登録商標）ＵｎｉｖｅｒｓａｌＫｉｔ）を加え、テストＤＮＡのチューブには３μｌの１ｍＭＣｙａｎｉｎｅ５−ｄＣＴＰ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）を、コントロールＤＮＡのチューブには３μｌの１ｍＭＣｙａｎｉｎｅ３−ｄＣＴＰ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）を加え、氷上で１μｌ（４０ｕｎｉｔ）のＫｌｅｎｏｗＦｒａｇｍｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社ＢｉｏＰｒｉｍｅ（登録商標）ＤＮＡＬａｂｅｌｉｎｇＫｉｔ）を添加混合した後、３７℃で一晩反応させた。６５℃で２０分加熱し酵素を失活させた後、氷上で１分間冷やした。

＜標識プローブの洗浄＞
上記で得られたＤＮＡの各標識プローブ中の未反応Ｃｙａｎｉｎｅ標識ｄＣＴＰ等を除去するため、ＱＩＡｑｕｉｃｋＰＣＲｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）を使用して洗浄を行った。まず、５０μｌの標識プローブを２５０μｌのＢｉｎｄｉｎｇＢｕｆｆｅｒと混合し、スピンカラムに滴下し、１３０００回転／分で１分間遠心した。流れ落ちた液体を捨て、７００μｌのＷａｓｈＢｕｆｆｅｒをスピンカラムに加え、１３０００回転／分で１分間遠心した。流れ落ちた液体を捨て、再度１３０００回転／分で１分間遠心した。スピンカラムを清潔な１．５ｍｌのチューブ内に設置し、５０μlのＥｌｕｔｉｏｎＢｕｆｆｅｒを滴下して加え、３分間室温で静置した。さらに、１３０００回転／分で１分間遠心を行い、再度３０μｌのＥｌｕｔｉｏｎＢｕｆｆｅｒをスピンカラムに滴下し、３分間室温で静置した。１３０００回転／分で１分間遠心して、以下のテストに使用する標識プローブを得た。

＜エタノール沈殿およびアレイハイブリダイゼーション混合液の作製＞
蛍光標識したテストＤＮＡおよびコントロールＤＮＡ各８０μｌおよび１００μｌのＳｏｌｕｔｉｏｎＢ（Ｍａｃｒｏｇｅｎ社）を混合し、さらに３０μｌの３Ｍ酢酸ナトリウムおよび６００μｌの氷冷１００％エタノールを加えて混合撹拌した。冷凍庫（−２０℃）にて１時間静置した後、４℃の温度下に１３０００回転／分で２０分間遠心した。ＤＮＡ残渣を残して上清を除去し、氷冷７０％エタノールを５００μｌ加え、再度１３０００回転／分で５分間遠心した。上清を除去した後、１０分間自然乾燥させた。得られたＤＮＡ残渣に４μｌのＳｏｌｕｔｉｏｎＤ（Ｍａｃｒｏｇｅｎ社）および４０μｌのＳｏｌｕｔｉｏｎＣ（Ｍａｃｒｏｇｅｎ社）を添加して３０分間遮光下に静置してＤＮＡを緩やかに溶解させた。ＤＮＡを十分に撹拌溶解させた後、７０℃の水浴中で１５分間加熱することでＤＮＡを熱変性させ、３７℃のインキュベータ内で１時間静置することで繰り返し配列のブロッキング反応を行った。

＜Ａｒｒａｙスライドの前処理＞
３０μｌのＳｏｌｕｔｉｏｎＣに、１０μｌのＳｏｕｌｔｉｏｎＥを加えて混合し、７０℃水浴中で１０分間加熱して前処理液を熱変性させた後、氷上で５分間冷却した。４０μｌの前処理液をアレイスライド（Ｍａｃｒｏｇｅｎ社ＭＡＣＡｒｒａｙ（登録商標）Ｋａｒｙｏ４０００）上に滴下し、液がアレイ全体に行き渡るよう２２×４０ｍｍのカバーグラスを載せ、密閉箱中にスライドを置き、室温で３０分間静置した。その後カバーグラスを外し、スライドグラスを１０秒間蒸留水中に浸漬し、再度１０秒間新しい蒸留水中に浸漬した後、１００％イソプロパノールに浸漬した後、スライドグラスを乾燥させた。

＜ハイブリダイゼーション＞
上記で作製した４４μｌのアレイハイブリダイゼーション混合液をアレイスライド上に滴下した。２２×４０ｍｍのカバーグラスをかけ、密閉湿潤箱中にスライドを静置し、３７℃で４８時間静置した。

＜アレイスライドの洗浄＞
４６℃に保った洗浄液１（５０％ホルムアミド／２ＸＳＳＣ，ｐＨ７．０）中に、アレイスライドを１５分間静置し、時々振盪した。次いで、４６℃に保った洗浄液２（０．１％ＳＤＳ／２ＸＳＳＣ，ｐＨ７．０）中に、アレイスライドを３０分間静置し、時々振盪した。さらに、室温に保った洗浄液３（０．１％ＮＰ−４０／０．１Ｍリン酸緩衝液，ｐＨ７．０）中に１５分間、室温に保った洗浄液４（２ＸＳＳＣ，ｐＨ７．０）中に、アレイスライドを５分間静置した。その後、７０％エタノール、８５％エタノール、１００％エタノールの順に室温下でアレイスライドを各１分間ずつ浸漬後、アレイスライドを乾燥させた。

＜アレイスライドの読み取りおよび解析＞
ハイブリダイゼーションおよび洗浄後のアレイはマイクロアレイ用スキャナ（ＡｘｏｎＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社ＧｅｎｅＰｉｘ４０００Ｂ）にてスキャンし、テストＤＮＡおよびコントロールＤＮＡ由来蛍光による画像を取得した。得られた画像データはアレイＣＧＨ解析用ソフトウェア（Ｍａｃｒｏｇｅｎ社ＭａｃＶｉｅｗｅｒｓｏｆｔｗａｒｅ）により解析を行った。

＜結果＞
子宮体癌患者、大腸癌患者および非癌患者のＤＮＡから得られたサンプルのアレイスポットのＣｙａｎｉｎｅ３およびＣｙａｎｉｎｅ５の蛍光強度を測定し、全被験者のＣｙａｎｉｎｅ５／Ｃｙｉａｎｉｎｅ３の比を求めて、クローンごとにプロットした図、およびＡｒｒａｙＣＧＨの結果を基に作成した受信者操作特性曲線（ｒｅｃｅｉｖｅｒｏｐｅｒａｔｉｎｇｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｃｕｒｖｅ：ＲＯＣ）を図１〜図４に示した。
子宮体癌患者、大腸癌患者および非癌患者において、ＤＮＡコピー数に特徴的な変化を認めた染色体領域のＢＡＣクローン情報（ＢＡＣ情報はＭａｃｒｏｇｅｎ社ＭＡＣＡｒｒａｙＫａｒｙｏホームページ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍａｃｒｏｇｅｎ．ｃｏｍ／ｅｎｇ／ｆｉｌｅ／４Ｋ＿ｌｉｓｔ＿０４１２２１．ｘｌｓ）を参照した。）、およびＢＡＣクローンごとのＤＮＡコピー数カットオフ値、感度、特異度を表に示した。表３には子宮体癌患者のデータを、表４には大腸癌女性患者のデータを、表５には大腸癌男性患者のデータを示した。（表中、＞はＤＮＡコピー数の増加を示し、＜はＤＮＡコピー数の減少を示す。）この結果から、癌患者では、ＤＮＡコピー数の増減の程度およびＤＮＡコピー数多型の頻度が非癌患者に比べ、有意に差があることが明らかになった。

ＤＮＡコピー数多型を調べることで、癌になりやすさの体質診断（癌発症体質の判定）が可能であることが明らかになった。アレイＣＧＨ法用いてコピー数多型を調べる事により、容易に診断が可能となる。この方法を応用することにより、子宮体癌や大腸癌以外の種々の癌についても癌発症体質の判定の可能性がある。このように、血液や正常組織の検査だけで癌の発症を高い精度で予測できる検査方法はこれまでに存在せず、本発明は非常に画期的な検査法で広く利用される可能性がある。

アレイＣＧＨ法による子宮体癌患者と非癌女性におけるＤＮＡコピー数多型を比較したデータを示す図である。アレイＣＧＨ法による子宮体癌患者と非癌女性におけるＲＯＣを示す図である。アレイＣＧＨ法による大腸癌女性患者と非癌女性におけるＢＡＣ１９８＿Ｊ０５（染色体１６ｐ１３．３）の遺伝子コピー数多型を比較したデータ、およびＲＯＣを示す図である。アレイＣＧＨ法による大腸癌男性患者と非癌男性におけるＤＮＡコピー数多型を比較したデータ、およびＲＯＣを示す図である。

Claims

ヒト染色体１ｐ３６．３３、１ｑ３２．１、１０ｑ２２．３、１１ｐ１５．５、１１ｑ１３．３、１４ｑ１１．２、１ｑ２１．１、７ｑ１１．１−１１．２１、９ｑ１３、１４ｑ３２．３３、１６ｐ１１．２、２ｐ２１、７ｑ３６．３、１５ｑ２６．３、及び１６ｐ１３．３領域の中から選択される１以上の領域の少なくとも一部におけるＤＮＡコピー数多型を検出することを特徴とする、癌発症体質の判定方法。
ヒト染色体１ｐ３６．３３、１ｑ３２．１、１０ｑ２２．３、１１ｐ１５．５、１１ｑ１３．３、１４ｑ１１．２、１ｑ２１．１、７ｑ１１．１−１１．２１、９ｑ１３、１４ｑ３２．３３、及び１６ｐ１１．２領域の中から選択される１以上の領域の少なくとも一部におけるＤＮＡコピー数多型を検出することを特徴とする、子宮体癌発症体質の判定方法。
ヒト染色体１ｐ３６．３３、１ｑ３２．１、１０ｑ２２．３、１１ｐ１５．５、１１ｑ１３．３、及び１４ｑ１１．２領域の中から選択される１以上の領域の少なくとも一部におけるＤＮＡコピー数の増加、及び／またはヒト染色体１ｑ２１．１、７ｑ１１．１−１１．２１、９ｑ１３、１４ｑ３２．３３、及び１６ｐ１１．２領域の中から選択される１以上の領域の少なくとも一部におけるＤＮＡコピー数の減少を検出する請求項２に記載の判定方法。
ヒト染色体２ｐ２１、７ｑ３６．３、１５ｑ２６．３、及び１６ｐ１３．３領域の中から選択される１以上の領域の少なくとも一部におけるＤＮＡコピー数多型を検出することを特徴とする、大腸癌発症体質の判定方法。
女性において染色体１６ｐ１３．３領域の少なくとも一部におけるにおけるＤＮＡコピー数の増加、あるいは男性において染色体２ｐ２１、７ｑ３６．３、１５ｑ２６．３、及び１６ｐ１３．３領域の中から選択される１以上の領域の少なくとも一部におけるＤＮＡコピー数の減少を検出することを特徴とする請求項４に記載の判定方法。
ヒト染色体１ｐ３６．３３領域に存在する遺伝子ＬＯＣ４４０５５２のコピー数多型を検出することを特徴とする請求項２または３のいずれかに記載の判定方法。
ＤＮＡコピー数多型の検出を、ヒト血液または組織を材料として、ＢＡＣアレイＣＧＨ法、定量ＰＣＲ法、またはＦＩＳＨ法によって検出する請求項１〜６のいずれか一項に記載の判定方法。
遺伝子のコピー数多型の検出を、配列番号１および配列番号２で示される塩基からなるプライマーを用いた定量ＰＣＲ法によって検出することを特徴とする請求項７に記載の判定方法。
ヒト染色体領域１ｐ３６．３３領域に存在する遺伝子ＬＯＣ４４０５５２のコピー数増加を検出するためのプライマーであって、配列番号１および配列番号２で示される塩基からなる子宮体癌発症体質判定用のプライマー。
ヒト染色体１ｐ３６．３３、１ｑ３２．１、１０ｑ２２．３、１１ｐ１５．５、１１ｑ１３．３、１４ｑ１１．２、１ｑ２１．１、７ｑ１１．１−１１．２１、９ｑ１３、１４ｑ３２．３３、１６ｐ１１．２、２ｐ２１、７ｑ３６．３、１５ｑ２６．３、及び１６ｐ１３．３領域の中から選択される１以上の領域の少なくとも一部におけるＤＮＡコピー数多型を検出するための癌発症体質の判定用キット。