JP4509933B2 - アディポネクチン分析用ラテックス試薬及びアディポネクチン分析方法 - Google Patents
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Description
より具体的には、特許文献1には、遺伝子組み換え技術により大腸菌で発現させたアディポネクチンを免疫原として得られたモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体を使用するアディポネクチン分析用ELISA法が開示されている。また、特許文献1には、このELISA法を用いて、正常人血漿中のアディポネクチン濃度を、前記血漿を前処理することなく、そのまま測定したところ、ウエスタンブロッティングの結果から予め予測されたアディポネクチン濃度が得られなかったこと、そして、その原因として、血中のアディポネクチンが他の血漿成分と会合して290kDa以上の大きな分子を形成しているため、抗体の認識部位がマスクされていることが考えられることが開示されている。特許文献1に記載のELISA法では、血漿をSDS含有バッファーで10倍に希釈して5分間煮沸処理し、更に、最終的に約5000倍に希釈して測定することにより、血漿中のアディポネクチンの測定を可能にしている。すなわち、特許文献1に記載のELISA法では、前処理(すなわち、SDS存在下での加熱処理)及び被検試料の前希釈が必須である。
また、本発明は、(1)アディポネクチンを含む可能性のある生物学的液体を取得する工程、及び
(2)前記工程で取得した生物学的液体を、前記工程で取得した状態のままで、アディポネクチンに対する特異的結合体を担持したラテックス粒子懸濁液と接触させ、ラテックス粒子の凝集度合いを光学的に分析する工程
を含む、アディポネクチン分析方法に関する。
また、一般的な臨床検査用として調製した生体材料由来液中には、数μg/mL〜数十μg/mLの濃度でアディポネクチンが存在する。あるいは、予備実験等により処理液(例えば、抽出用溶液又は培養用溶液)の量を適宜選択することにより、得られる生体材料由来液中のアディポネクチン濃度を数μg/mL〜数十μg/mLとすることができる。
このように、本発明により分析可能な生物学的液体(特に血液)は、アディポネクチンを数μg/mL〜数十μg/mLの濃度で含むが、本発明のアディポネクチン分析用ラテックス試薬により、あるいは、本発明のアディポネクチン分析方法により、前希釈することなく、分析することができる。
前記免疫原としては、遺伝子組み換え技術を用いて調製したアディポネクチン又はその誘導体、あるいは、天然のアディポネクチンを使用することができる。
得られた免疫原を、常法に従って、動物(例えば、ウサギ)に免疫することにより、ポリクローナル抗体を得ることができ、また、前記免疫原を用いてハイブリドーマを作製することにより、モノクローナル抗体を得ることができる。
ラテックス担体の感作は、任意の公知の方法で実施することができ、例えば、抗体を用いる場合には、ラテックス担体に抗体を物理的又は化学的に結合させることにより感作することができる。
例えば、自動分析測定装置を用いて本発明のアディポネクチン分析方法を実施する場合には、生物学的液体を取得した後、前記生物学的液体を自動分析測定装置に装入する前には、前希釈及び/又は前処理を実施しない。より具体的には、生物学的液体を取得した後、取得した前記生物学的液体に対して前希釈及び/又は前処理することなく、取得した状態のままで、自動分析測定装置内において、アディポネクチンに対する特異的結合体を担持したラテックス粒子懸濁液(好ましくは、本発明のアディポネクチン分析用ラテックス試薬)と接触させる。
すなわち、本発明方法の好適態様の1つである、自動分析測定装置を用いるアディポネクチン分析方法は、
(1)アディポネクチンを含む可能性のある生物学的液体を取得する工程、及び(2)前記工程で取得した生物学的液体を、前記工程で取得した状態のままで、自動分析測定装置内において、アディポネクチンに対する特異的結合体を担持したラテックス粒子懸濁液と接触させ、ラテックス粒子の凝集度合いを光学的に分析する工程
を含む。
それに対して、本発明のアディポネクチン分析方法では、例えば、ラテックス粒子の粒径を適宜選択する(例えば、血中アディポネクチンの場合には、0.1〜0.5μmの粒径が好ましい)ことにより、検体の前希釈や前処理を必要とせず、原液を試料としてラテックス凝集反応を実施することが可能である。
(1)抗アディポネクチン抗体感作ラテックス液の調製
ウサギ由来の抗ヒトアディポネクチンポリクローナル抗体を0.5mg/mLの濃度で0.01mol/Lトリス緩衝液(pH8.0)に溶解した液9mLに、平均粒径0.2μmのポリスチレンラテックス(固形分10重量%)1mLを添加し、室温にて60分間攪拌した。次いで、この液に、ウシ血清アルブミンを0.5重量%含有するトリス緩衝液(pH8.0)を添加し、室温にて60分間攪拌した後、この混合液を20000rpmで遠心分離した。得られた沈殿物にトリス緩衝液(pH8.0)10mLを添加し、ラテックスを懸濁させ、抗アディポネクチン抗体感作ラテックス液を調製した。
なお、本実施例で使用した前記ポリクローナル抗体は、国際公開第WO99/21577号パンフレットの実施例1に記載の方法により調製したポリクローナル抗体であり、より詳細には、遺伝子組み換え技術を用いて調製したアディポネクチンを免疫原として得られたポリクローナル抗体である。
本実施例では、同一の調製操作に基づく3種類の抗アディポネクチン抗体感作ラテックス液(ロット01〜ロット03)を調製し、以下の実施例2で評価した。
0.5%(重量%)濃度でウシ血清アルブミンを含有する0.1mol/Lトリス緩衝液(PH8.0)に、0.9%(重量%)濃度の塩化ナトリウムを添加して緩衝液とした。
本実施例で使用するヒトアディポネクチン抗原測定試薬は、前記実施例1(2)で調製した緩衝液からなる第1試薬と、前記実施例1(1)で調製した抗アディポネクチン抗体感作ラテックスからなる第2試薬とからなる2液系の試薬として構成した。
痩身者検体より選択したアディポネクチン高濃度血清を生理食塩水で希釈し、既知濃度のアディポネクチンを含む標準アディポネクチン抗原液を作製した。
(1)血中アディポネクチンの測定
測定検体(痩身者検体から採取した血液)2μLに、実施例1(2)で調製した緩衝液90μLを混合し、37℃で適時保持した後、実施例1(1)で調製した抗アディポネクチン抗体感作ラテックス液90μLを添加攪拌し、この後、5分後の波長570nmでの吸光度を測定した。この間の吸光度の変化量を吸光度変化量(ΔAbs)とした。標準アディポネクチン抗原液から得られるΔAbsとその抗原濃度とから検量線を作成した。その検量線を用いて、被検サンプルのΔAbsからアディポネクチン値を計算した。測定は、日立自動分析装置7170型を用いて行った。
結果を表1及び図1に示す。表1及び図1に示すように、抗アディポネクチン抗体感作ラテックス液ロット01〜03は、アディポネクチン希釈理論値の低濃度域から高濃度域まで測定可能であることが確認された。
測定検体として、健常者検体を用いたこと以外は、実施例2(1)の操作を繰り返した。
結果を表2に示す。表において、各記号「N」、「MAX」、「MIN」、「RANGE」、「MEAN」、「SD」、及び「CV」は、それぞれ、「測定対象数」、「最大値」、「最小値」、「最大値と最小値との差」、「平均値」、「標準偏差」、及び「変動係数」を意味する。
表2から、0μg/mLのΔAbsのMEAN+2SDと、MEAN−2SDが重ならない濃度は、0.1μg/mLであることが確認された。
本発明のラテックス法は、測定検体として、健常者検体を用いたこと以外は、実施例2(1)の操作を繰り返した。
また、EIA法は、市販研究用試薬(ヒトアディポネクチンELISAキット;大塚製薬株式会社)を用いて実施した。このELISA試薬は、国際公開第WO99/21577号パンフレットに記載のELISA法に基づいた市販試薬であり、抗アディポネクチン抗体として、遺伝子組み換え技術を用いて調製したアディポネクチンを免疫原として得られるモノクローナル抗体とポリクローナル抗体との組み合わせを使用するものであり、被検試料の前処理(SDS存在下での加熱処理)及び希釈操作を必要とする。
結果を図2に示す。図2から、市販研究用試薬であるEIA法との相関性は、Y=0.9938x−0.0015(R=0.9889)と良好な相関性が確認された。
測定検体として、健常者検体に各種夾雑物(ビリルビンF、ビリルビンC、ヘモグロビン、乳ビ、イントラファット、又はリウマチ因子)を所定濃度添加した検体を用いたこと以外は、実施例2(1)の操作を繰り返した。
結果を、表3〜表14に示す。表3〜表14から、ビリルビンF、ビリルビンC、ヘモグロビン、乳ビ、イントラファット、及びリウマチ因子(RF)の各共存物質の各濃度においての影響は、全て±10%以内であることが確認された。
近年、多数の被検試料を短時間に処理するための自動分析装置が普及し、更に高感度化が要求されることと相まって、特に、抗体(又は抗原)を結合したラテックス粒子との凝集反応を利用するラテックス凝集法が汎用されている。本発明によれば、前処理及び/又は前希釈を必要としないので、短時間(例えば、約10分〜15分)で測定が可能である。本発明のアディポネクチン分析用ラテックス試薬(好ましくは、血液中のアディポネクチン分析用ラテックス試薬)は、自動分析測定装置用の分析試薬として適している。
以上、本発明を特定の態様に沿って説明したが、当業者に自明の変形や改良は本発明の範囲に含まれる。
Claims (6)
- 抗アディポネクチンポリクローナル抗体を担持したラテックス粒子懸濁液を含む、アディポネクチン分析用ラテックス試薬。
- 前処理を行わない生物学的液体中に含有されるアディポネクチンの分析用であり、前記前処理がドデシル硫酸ナトリウムによる変性である、請求項1に記載のアディポネクチン分析用ラテックス試薬。
- アディポネクチンを含む可能性のある生物学的液体を前処理することなく、抗アディポネクチンポリクローナル抗体を担持したラテックス粒子懸濁液と接触させ、ラテックス粒子の凝集度合いを光学的に分析する工程
を含み、前記前処理が、ドデシル硫酸ナトリウムによる変性である、アディポネクチン分析方法。 - 前記前処理が、ドデシル硫酸ナトリウム存在下における加熱処理である、請求項3に記載のアディポネクチン分析方法。
- 前記前処理が、ドデシル硫酸ナトリウム存在下における加熱処理である、請求項2に記載のアディポネクチン分析用ラテックス試薬。
- 請求項3又は4に記載のアディポネクチン分析方法に使用する、請求項1、2、又は5のいずれか一項に記載のアディポネクチン分析用ラテックス試薬。
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