CN111239421A - 一种定量检测脂联素adpn的胶乳增强免疫比浊试剂盒及其制备与应用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种定量检测脂联素ADPN的胶乳增强免疫比浊试剂盒，包括脂联素R1试剂和脂联素R2试剂；脂联素R1试剂包括缓冲液A、保护剂A、反应增强剂、防腐剂；脂联素R2试剂包括缓冲液B、保护剂B、防腐剂、包被抗人脂联素抗体的致敏聚苯乙烯胶乳颗粒；其中，包被抗人脂联素抗体的致敏聚苯乙烯胶乳颗粒中的抗人脂联素抗体与致敏聚苯乙烯胶乳颗粒之间通过链亲和素‑生物素***连接。本发明还提供了一种定量检测脂联素ADPN的胶乳增强免疫比浊试剂盒的制备与应用方法。本发明的优点在于：方便快速、灵敏度高、特异性，可定量准确的检测ADPN；它仪器兼容性强，检测成本低，弥补了临床上对ADPN比浊产品的需求。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，尤其涉及一种定量检测脂联素ADPN的胶乳增强免疫比浊试剂盒及其制备与应用方法。
背景技术
脂联素(Adiponectin/ADPN)是脂肪细胞分泌的一种内源性生物活性多肽或蛋白质。脂联素是一种胰岛素增敏激素(An Insulin-sensitizing Hormone)，能改善小鼠的胰岛素抗性(Insulin resistance)和动脉硬化症；对人体的研究发现，脂联素水平能预示II型糖尿病和冠心病的发展，并在临床试验表现出抗糖尿病、抗动脉粥样和炎症的潜力。
研究人员发现了一种调节脂联素的新化合物，从而为研究脂联素功能和胰岛素敏感性机制提出了一种新途径。胰岛素是由胰脏β细胞分泌出来的激素，主要功能是促进血液中的葡萄糖进入肌肉或脂肪组织，提供人体所需的能量。当胰岛素不能发挥作用时，血液中的葡萄糖便无法转化为人体所需的能量，导致血糖升高，糖尿病由此发生。而胰岛素抗阻是指细胞不能有效利用胰岛素甚至对胰岛素的反应不再敏锐，这是造成糖尿病的最主要原因。科学家们相信游离脂肪酸和某些脂肪所释放的分子是引发胰岛素抗阻现象的罪魁祸首。Lily Dong和合作者一直在寻找与脂联素受体相关的蜂窝状蛋白质，以期发现调节脂联素激素功能的新靶标。他们鉴别出一种多域蛋白质，它能调节脂联素在脂肪酸氧化和葡萄糖吸收中的功能，并将这种新蛋白质命名为APPL1。他们的研究并进一步表明，在肌肉细胞中，APPL1通过激酶通道来调节脂联素的胰岛素敏感效应。
脂肪因子是由脂肪组织分泌的具有生物活性的细胞因子及激素，与胰岛素抵抗冠状动脉粥样硬化等代谢过程密切相关。其中，脂联素是外周血中含量最高的脂肪因子，在健康人中血浆脂联素水平为5～30μg/mL。脂联素与其受体结合后，通过激活腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)、p38丝裂原活化蛋白激酶和过氧物酶体增殖物激活受体(PPAR)等信号分子发挥抗炎、抗糖尿病、抗动脉粥样硬化等多种生物学作用。在动物实验中，脂联素基因敲除小鼠较正常小鼠容易发生严重的免疫排斥反应，注射脂联素后排斥反应明显改善，表明脂联素可以降低小鼠的免疫排斥反应。而Wilk等研究发现，脂联素对抗原激活的效应T细胞有抑制作用，推测脂联素与免疫调节有关。风湿性疾病泛指影响骨、关节及周围软组织的一组疾病，主要的病理改变有炎症和非炎症性病变。炎症性反应除痛风性关节炎是因尿酸结晶导致外，其余大部分因免疫反应引起。进一步研究显示，脂联素在类风湿关节炎患者血浆及关节液中表达水平升高，且关节液中脂联素水平与白细胞数呈负相关。在***性红斑狼疮患者血清中的表达水平高于正常对照者，且与患者的疾病活动度明显相关。
在脂肪细胞分泌的具有生物活性的一类蛋白质因子中脂联素是脂肪组织基因表达最丰富的蛋白质产物之一，大量存在于血液循环中。在人体内以3-30ug/ml的浓度出现在循环血浆中。脂联素又被称作Acrp30、apM1、AdipoQ、GBP28，最初，脂联素是在人体皮下脂肪组织、血浆和鼠科动物的脂肪细胞中被发现。人体内的脂联素由244个氨基酸组成，分子量为30KD。由氨基末端的分泌信号序列(aa 1-18)、一段特异序列(aa19-41)、一组由22个氨基酸组成的胶原重复序列(aa42-107)、一段球状序列(aa108-244)组成。其中，球状区是脂联素生物活性的关键部位，和TNF-α的结构相似，脂联素与胶原Ⅷ、X和补体C1q高度同源。脂联素的单聚体和三聚体是其生物活性形式或受体亲和配基可以特异性结合骨骼肌或肝脏细胞膜上的G蛋白偶联受体一型或二型脂联素受体，进而调节脂肪酸氧化和糖代谢。脂联素不仅由脂肪细胞分泌，骨骼肌、内皮细胞、心肌细胞也可分泌；其由染色体3q27的apM1基因编码，该基因由3个外显子和2个内含子组成。脂联素的相对分子质量为30000，与补体C1q结构相似，又称为Arcp30、AdipoQ、apM1、GBP28；同时，它还属于可溶性胶原超家族，与胶原VIII和X、补体C1q和肿瘤坏死因子(tumornecrosisfactor,TNF)家族具有结构同源性。
脂联素由脂联素单体组成，脂联素单体连接形成三聚体，4～6个三聚体结合形成高分子结构，其中脂联素单体只存在于脂肪细胞中，形成多聚体后才会被分泌到血浆中。
迄今为止，发现的脂联素受体有3个，分别为脂联素受体1、脂联素受体2、T-钙黏素。其中，Yamau-chi等发现了脂联素的2个受体，分别命名为脂联素受体1和脂联素受体2。脂联素受体具有7次跨膜结构域，但与G蛋白偶联受体家族结构不同，其N端位于膜内，C端位于膜外，可与脂联素受体结合。脂联素受体1主要在骨骼肌细胞表达，是球形脂联素的高亲和受体及全长脂联素的低亲和受体，与腺苷激酶(AMPK)有关；而脂联素受体2主要在肝细胞表达,是全长脂联素和球形脂联素的中等亲和受体，能激活PPAR。T-钙黏素主要在内皮细胞及平滑肌中表达，主要作用是与心脏、肌肉和血管等组织的脂联素结合。Parker-Duffen等发现，T-钙黏素敲除小鼠血液中的脂联素水平较正常小鼠升高4倍，而心脏、血管中的T钙黏素表达减少,经过重组脂联素治疗后，T-钙黏素在细胞表面的表达可以恢复正常水平。由于脂联素与其受体结合后发挥了多种生物学作用，所以任何影响脂联素受体表达的因素均将影响脂联素生物学效应的发挥及其相关性疾病的发生和发展。
目前，脂联素的检测方法主要有化学发光法和胶乳免疫比浊法。其中，化学发光法是一种灵敏简便的方法，但选择性差，会对一个系列的化合物做出反应，而不是针对单个的某一化合物。而胶乳增强免疫比浊法的优点则是快速简便，能定量测定，并且，其精密度高、易于自动化、适于大批量标本的同时检测。随之，大量的脂联素ADPN胶乳增强免疫比浊法检测试剂盒便应运而生。然而，现有的胶乳增强免疫比浊法检测试剂盒的检测灵敏度有限，仍不能满足临床应用的需求。因此，目前急需一种灵敏度更好的脂联素ADPN胶乳增强免疫比浊法检测试剂盒。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种灵敏度更好的定量检测脂联素ADPN的胶乳增强免疫比浊试剂盒及其制备与应用方法。
本发明采用以下技术方案解决上述技术问题：
一种定量检测脂联素ADPN的胶乳增强免疫比浊试剂盒，包括脂联素R1试剂和脂联素R2试剂；
所述脂联素R1试剂包括的成分及相应含量为：缓冲液A20～200mM，保护剂A1～10mg/mL，反应增强剂1～5％，防腐剂0.03～0.2％，溶剂为纯化水；
所述脂联素R2试剂包括的成分及相应含量为：缓冲液B 20～200mM，保护剂B1～10mg/mL，防腐剂0.03～0.2％，包被抗人脂联素抗体的致敏聚苯乙烯胶乳颗粒0.04～0.16％，溶剂为纯化水；所述包被抗人脂联素抗体的致敏聚苯乙烯胶乳颗粒中的“抗人脂联素抗体”与“致敏聚苯乙烯胶乳颗粒”之间通过链亲和素-生物素***连接。其中，链亲和素-生物素***可极大地提高检测方法的灵敏度，同时不增加非特异干扰。此外，链亲和素-生物素结合很稳定，不会因反应试剂的高度稀释而受影响,保证了检测结果的准确性。
作为本发明的优选方式之一，所述脂联素R1试剂中，缓冲液A具体为硼酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液、Tris-HCl缓冲液、磷酸盐缓冲液和甘氨酸缓冲液中的一种或多种，且pH为6～10；保护剂A具体为牛血清白蛋白、卵清蛋白和明胶中的一种或多种；反应增强剂具体为聚乙二醇4000、聚乙二醇6000、聚乙二醇8000和聚乙二醇20000中的一种或多种；防腐剂具体为叠氮钠、硫柳汞和Proclin300中的一种或多种。
上述技术方案中，牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)和明胶，能够保护胶乳颗粒表面交联的抗体。聚乙二醇PEG是非离子型水溶性聚合物，有很强的亲水性，可以破坏溶液中蛋白质周围的电子云和水化层，促进特异性的抗原和抗体分子靠近并结合形成大分子复合物。
作为本发明的优选方式之一，所述脂联素R1试剂中，缓冲液A优选Tris-HCl缓冲液或硼酸盐缓冲液，浓度50mM，pH 8.0；保护剂A优选牛血清白蛋白，浓度4mg/mL；反应增强剂优选聚乙二醇6000，质量体积比5％；防腐剂优选叠氮钠，质量体积比0.1％。
作为本发明的优选方式之一，所述脂联素R2试剂中，缓冲液B具体为硼酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液、Tris-HCl缓冲液、磷酸盐缓冲液和甘氨酸缓冲液中的一种或多种，且pH为7～9；保护剂B具体为牛血清白蛋白和卵清蛋白中的一种或两种；防腐剂具体为叠氮钠、硫柳汞和Proclin300中的一种或多种；包被抗人脂联素抗体的致敏聚苯乙烯胶乳颗粒中的抗人脂联素抗体具体为多克隆抗体和单克隆抗体中的一种。
作为本发明的优选方式之一，所述脂联素R2试剂中，缓冲液B优选甘氨酸缓冲液或Tris-HCl缓冲液，浓度60mM，pH 8.0；保护剂B优选牛血清白蛋白，浓度5mg/mL；防腐剂优选叠氮钠，质量体积比0.1％；包被抗人脂联素抗体的致敏聚苯乙烯胶乳颗粒质量体积比终浓度0.1％；包被抗人脂联素抗体的致敏聚苯乙烯胶乳颗粒中的抗人脂联素抗体优选多克隆抗体。
作为本发明的优选方式之一，所述抗人脂联素抗体的致敏聚苯乙烯胶乳颗粒中的抗人脂联素抗体具体为鼠源、兔源或羊源抗体，优选羊源抗体。
作为本发明的优选方式之一，所述脂联素R2试剂中的包被抗人脂联素抗体的致敏聚苯乙烯胶乳颗粒是通过分别制备生物素化抗人脂联素抗体、链亲和素包被的聚苯乙烯胶乳颗粒，并将所述生物素化抗人脂联素抗体与所述链亲和素包被的聚苯乙烯胶乳颗粒混合孵育而制成；在所述生物素化抗人脂联素抗体制备中，所述抗人脂联素抗体与生物素的摩尔比为1：(1～100)，优选1：10。
作为本发明的优选方式之一，所述包被抗人脂联素抗体的致敏聚苯乙烯胶乳颗粒中的致敏聚苯乙烯胶乳颗粒具体为羧基化的聚苯乙烯胶乳颗粒或氨基化的聚苯乙烯胶乳颗粒，优选羧基化的聚苯乙烯胶乳颗粒。其中，所述羧基化的聚苯乙烯胶乳颗粒经碳化二亚胺活化后再进行链亲和素包被；所述氨基化的聚苯乙烯胶乳颗粒经戊二醛活化后再进行链亲和素包被；此外，所述胶乳颗粒的粒径范围为40～500nm，优选200nm。
作为本发明的优选方式之一，还包括脂联素校准品；
所述脂联素校准品包括的成分及相应含量为：缓冲液C 20～200mM，保护剂C 0.5～8mg/L，防腐剂0.03～0.2％，脂联素重组蛋白0.2～100mg/L，溶剂为纯化水。
作为本发明的优选方式之一，所述脂联素校准品中，缓冲液C具体为硼酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液、Tris-HCl缓冲液、磷酸盐缓冲液和甘氨酸缓冲液中的一种或多种，且pH为7～9；保护剂C具体为牛血清白蛋白；防腐剂具体为叠氮钠、硫柳汞和Proclin300中的一种或多种。
作为本发明的优选方式之一，所述脂联素校准品中，缓冲液C优选甘氨酸缓冲液或Tris-HCl缓冲液，浓度60mM，pH 8.0；保护剂C优选牛血清白蛋白，浓度2mg/mL；防腐剂优选叠氮钠，质量体积比0.1％；脂联素重组蛋白为市售产品，优选浓度40mg/L。
一种上述定量检测脂联素ADPN的胶乳增强免疫比浊试剂盒的制备方法，包括如下步骤：
(1)配制脂联素R1试剂：
按照脂联素R1试剂的组分含量，将各组分物质于同一容器中混合，混合均匀后，制得脂联素R1试剂；
(2)配制脂联素R2试剂：
①胶乳粒子的活化、洗涤
将商品化的聚苯乙烯胶乳溶液活化后离心，弃上清，沉淀用洗涤缓冲液重复洗涤2～4次；将末次沉淀重悬于所述洗涤缓冲液中，并使胶乳颗粒的质量体积比终浓度为1％；
②链亲和素包被胶乳颗粒
a.取1mL活化洗涤后的聚苯乙烯胶乳溶液，加入链亲和素，使链亲和素终浓度为0.1mg/mL；混匀后，置4～37℃摇床以220rpm转速包被0.5～18h；
b.用PBS缓冲液洗涤未与胶乳粒子结合的链亲和素，重复2～4次；
c.封闭：将洗涤后的包被链亲和素的胶乳颗粒溶于包含保护剂B的缓冲液B中，使胶乳颗粒的质量体积比终浓度为0.1～0.3％；
③抗人脂联素抗体的生物素化
生物素选用商品化的已活化产品，将生物素与抗人脂联素抗体混合，室温下反应l～4h，离心，除去其中少量的沉淀物，将上清装入透析袋中，在0～4℃下置于PBS缓冲液中透析过夜；其中，所述抗人脂联素抗体与所述生物素的摩尔比为1：(1～100)；
④生物素化脂联素抗体与链亲和素包被胶乳颗粒的连接
在步骤②中所得的链亲和素包被的胶乳颗粒溶液中加入步骤③中所得的生物素化抗人脂联素抗体，混匀后置37℃摇床孵育0.5～2h，形成胶乳颗粒-链亲和素-生物素-抗人脂联素抗体复合物；
⑤清洗
将步骤④中形成的胶乳颗粒-链亲和素-生物素-抗人脂联素抗体复合物溶液离心，弃上清，重复清洗2～4次；将末次沉淀溶于含保护剂B和防腐剂的缓冲液B中，使胶乳颗粒的质量体积比终浓度为0.04～0.16％。
上述技术方案中所述生物素一般选用已活化的产品，抗体的生物素标记反应温和，很少抑制抗体活性，标记抗体稳定，能被链亲和素结合，且背景水平很低，结合紧密迅速。生物素与抗体共价结合常见为生物素酰基化反应，将生物素与N-羟基丁二酰胺在碳化二亚胺的作用下进行缩和，生成生物素N-羟基丁二酰亚胺酯(biotiny-N-hydroxy-succinimide,BNHS)。BNHS分子酯键中的-C＝0基团可与抗体分子中赖氨酸的氨基形成肽键,从而使抗体标记上生物素。生物素的分子量较小，当与抗体或酶反应形成生物素标记结合物后，由于大分子蛋白的空间位阻效应，可能对生物素与链亲和素间的结合以及***的应用效果造成干扰。此时可通过在生物素分子侧链上连接一定数量的基团，形成连接臂，增加生物素与被标记大分子间的距离(如长臂活化生物素)，减少位阻效应，增加检测的灵敏度和特异性。
作为本发明的优选方式之一，所述步骤①中，洗涤缓冲液具体为PBS缓冲液和MES缓冲液中的一种。
作为本发明的优选方式之一，生物素标记抗体时，活化生物素与待标记抗体应有适当的比例，使每个抗体分子上标记的生物素分子数量控制在一定范围。与生物素结合后，抗体的活性可能会降低，这种情况常发生在保持抗体活性所必需的游离氨基基团和生物素过多的结合，此时，生物素化会降低或破坏抗体的抗原结合能力。本发明在所述生物素化ADPN抗体制备的步骤③中，所述抗人脂联素抗体与所述生物素的摩尔比为优选为1：10。
一种上述定量检测脂联素ADPN的胶乳增强免疫比浊试剂盒的应用方法，将所述定量检测脂联素ADPN的胶乳增强免疫比浊试剂盒通过在半自动、全自动生化分析仪及散射比浊分析仪上使用来定量检测人体血液中脂联素的含量；其中，所述血液包括全血、血清及血浆。
作为本发明的优选方式之一，当所述定量检测脂联素ADPN的胶乳增强免疫比浊试剂盒在半自动、全自动生化分析仪上使用并用于检测脂联素含量时，具体采用血清或血浆样本进行检测；当所述所述定量检测脂联素ADPN的胶乳增强免疫比浊试剂盒在散射比浊分析仪上使用并用于检测脂联素含量时，具体采用全血、血清及血浆样本进行检测。
本发明相比现有技术的优点在于：
(1)本发明试剂盒在胶乳增强免疫比浊原理基础上进一步采用了链亲和素-生物素放大***，大大提高了比浊试剂的检测灵敏度；本发明试剂盒的检测浓度范围达0.3-40.0mg/L，且快速、准确、灵敏度高、特异性强；
(2)本发明试剂盒可在散射比浊分析仪上使用，实现多样本类型灵活快速定量检测；市售脂联素ADPN检测多采用血清或血浆进行检测，不能满足临床快速检测需求，本发明试剂盒当在散射比浊分析仪上使用时，可采用的样本类型包括全血、血清或血浆，可在临床多科室应用；另外，市售ADPN检测约需半小时左右的时间，而本发明试剂盒从样本采集到出具检测结果最快只需5-10分钟，为患者争取了更多的宝贵时间，可对患者病情进行动态检测；
(3)本发明试剂盒与进口试剂盒对同一样本的ADPN含量检测结果经统计分析，结果相关性好，无显著差异，检测结果准确可靠，在临床上可以替代进口产品使用，大幅降低检测成本。
附图说明
图1是实施例7中本发明试剂盒的校准曲线图；
图2是实施例8中本发明试剂盒的线性范围图；
图3是实施例8中本发明试剂盒与已上市试剂盒产品的相关性比较图。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1
本实施例的一种定量检测脂联素ADPN的胶乳增强免疫比浊试剂盒，包括脂联素R1试剂、脂联素R2试剂和脂联素校准品。
所述脂联素R1试剂包括的成分及相应含量为：缓冲液A(碳酸盐缓冲液，pH为6.0)20mM，保护剂A(卵清蛋白)1mg/mL，反应增强剂(聚乙二醇4000)1％，防腐剂(硫柳汞)0.03％，溶剂为纯化水。
所述脂联素R2试剂包括的成分及相应含量为：缓冲液B(硼酸盐缓冲液，pH 7.0)20mM，保护剂B(牛血清白蛋白)1mg/mL，防腐剂(硫柳汞)0.03％，包被抗人脂联素抗体的致敏聚苯乙烯胶乳颗粒0.04％，溶剂为纯化水。
所述脂联素校准品包括的成分及相应含量为：缓冲液C(硼酸盐缓冲液，pH为7)20mM，保护剂C(牛血清白蛋白)0.5mg/L，防腐剂(硫柳汞)0.03％，脂联素重组蛋白0.2mg/L，溶剂为纯化水。
进一步地，所述包被抗人脂联素抗体的致敏聚苯乙烯胶乳颗粒中的“抗人脂联素抗体”与“致敏聚苯乙烯胶乳颗粒”之间通过链亲和素-生物素***连接；链亲和素-生物素***可极大地提高检测方法的灵敏度，同时不增加非特异干扰。此外，链亲和素-生物素结合很稳定，不会因反应试剂的高度稀释而受影响,保证了检测结果的准确性。
进一步地，所脂联素R2试剂中，包被抗人脂联素抗体的致敏聚苯乙烯胶乳颗粒中的抗人脂联素抗体为多克隆抗体；并且，抗人脂联素抗体具体为鼠源抗体。
进一步地，所述包被抗人脂联素抗体的致敏聚苯乙烯胶乳颗粒中的致敏聚苯乙烯胶乳颗粒具体为羧基化的聚苯乙烯胶乳颗粒。其中，羧基化的聚苯乙烯胶乳颗粒经碳化二亚胺活化后再进行链亲和素包被，胶乳颗粒的粒径范围为40nm。
实施例2
本实施例的一种定量检测脂联素ADPN的胶乳增强免疫比浊试剂盒，包括脂联素R1试剂、脂联素R2试剂和脂联素校准品。
所述脂联素R1试剂包括的成分及相应含量为：缓冲液A(磷酸盐缓冲液或甘氨酸缓冲液，pH 10)200mM，保护剂A(明胶)10mg/mL，反应增强剂(聚乙二醇8000或聚乙二醇20000)4％，防腐剂(Proclin300)0.2％，溶剂为纯化水。
所述脂联素R2试剂包括的成分及相应含量为：缓冲液B(碳酸盐缓冲液或磷酸盐缓冲液，pH 9；)200mM，保护剂B(卵清蛋白)10mg/mL，防腐剂(Proclin300)0.2％，包被抗人脂联素抗体的致敏聚苯乙烯胶乳颗粒0.16％，溶剂为纯化水。
所述脂联素校准品包括的成分及相应含量为：缓冲液C(碳酸盐缓冲液或磷酸盐缓冲液，pH 9.0)200mM，保护剂C(牛血清白蛋白)8mg/L，防腐剂(Proclin300)0.2％，脂联素重组蛋白100mg/L，溶剂为纯化水。
进一步地，所述包被抗人脂联素抗体的致敏聚苯乙烯胶乳颗粒中的“抗人脂联素抗体”与“致敏聚苯乙烯胶乳颗粒”之间通过链亲和素-生物素***连接；链亲和素-生物素***可极大地提高检测方法的灵敏度，同时不增加非特异干扰。此外，链亲和素-生物素结合很稳定，不会因反应试剂的高度稀释而受影响,保证了检测结果的准确性。
进一步地，所脂联素R2试剂中，包被抗人脂联素抗体的致敏聚苯乙烯胶乳颗粒中的抗人脂联素抗体为单克隆抗体；并且，抗人脂联素抗体具体为兔源抗体。
进一步地，所述包被抗人脂联素抗体的致敏聚苯乙烯胶乳颗粒中的致敏聚苯乙烯胶乳颗粒具体为氨基化的聚苯乙烯胶乳颗粒。其中，氨基化的聚苯乙烯胶乳颗粒经戊二醛活化后再进行链亲和素包被，胶乳颗粒的粒径范围为500nm。
实施例3
本实施例的一种定量检测脂联素ADPN的胶乳增强免疫比浊试剂盒，包括脂联素R1试剂、脂联素R2试剂和脂联素校准品。
所述脂联素R1试剂包括的成分及相应含量为：缓冲液A(硼酸盐缓冲液或Tris-HCl缓冲液，pH为8.0)50mM，保护剂A(牛血清白蛋白)4mg/mL，反应增强剂(聚乙二醇6000)5％，防腐剂(叠氮钠)0.1％，溶剂为纯化水。
所述脂联素R2试剂包括的成分及相应含量为：缓冲液B(Tris-HCl缓冲液或甘氨酸缓冲液，pH 8.0)60mM，保护剂B(牛血清白蛋白)5mg/mL，防腐剂(叠氮钠)0.1％，包被抗人脂联素抗体的致敏聚苯乙烯胶乳颗粒0.1％，溶剂为纯化水。
所述脂联素校准品包括的成分及相应含量为：缓冲液C(Tris-HCl缓冲液或甘氨酸缓冲液，pH 8.0)60mM，保护剂C(牛血清白蛋白)2mg/L，防腐剂(叠氮钠)0.1％，脂联素重组蛋白(市售产品)40mg/L，溶剂为纯化水。
进一步地，所述包被抗人脂联素抗体的致敏聚苯乙烯胶乳颗粒中的“抗人脂联素抗体”与“致敏聚苯乙烯胶乳颗粒”之间通过链亲和素-生物素***连接；链亲和素-生物素***可极大地提高检测方法的灵敏度，同时不增加非特异干扰。此外，链亲和素-生物素结合很稳定，不会因反应试剂的高度稀释而受影响,保证了检测结果的准确性。
进一步地，所脂联素R2试剂中，包被抗人脂联素抗体的致敏聚苯乙烯胶乳颗粒中的抗人脂联素抗体为多克隆抗体；并且，抗人脂联素抗体具体为羊源抗体。
进一步地，所述包被抗人脂联素抗体的致敏聚苯乙烯胶乳颗粒中的致敏聚苯乙烯胶乳颗粒具体为羧基化的聚苯乙烯胶乳颗粒。其中，羧基化的聚苯乙烯胶乳颗粒经碳化二亚胺活化后再进行链亲和素包被，胶乳颗粒的粒径范围为200nm。
实施例4
本实施例的一种上述实施例中定量检测脂联素ADPN的胶乳增强免疫比浊试剂盒的制备方法，包括如下步骤：
(1)配制脂联素R1试剂：
按照脂联素R1试剂的组分含量，将各组分物质于同一容器中混合，混合均匀后，制得脂联素R1试剂。
(2)配制脂联素R2试剂：
①胶乳粒子的活化、洗涤
将商品化的聚苯乙烯胶乳溶液活化后离心，弃上清，沉淀用洗涤缓冲液重复洗涤2次；将末次沉淀重悬于所述洗涤缓冲液中，并使胶乳颗粒的质量体积比终浓度为1％；其中，洗涤缓冲液为PBS缓冲液；
②链亲和素包被胶乳颗粒
a.取1mL活化洗涤后的聚苯乙烯胶乳溶液，加入链亲和素，使链亲和素终浓度为0.1mg/mL；混匀后，置4℃摇床以220rpm转速包被0.5h；
b.用PBS缓冲液(0.1M，pH 7.4)洗涤未与胶乳粒子结合的链亲和素，重复2～4次；
c.封闭：将洗涤后的包被链亲和素的胶乳颗粒溶于包含保护剂B的缓冲液B中，使胶乳颗粒的质量体积比终浓度为0.1％(w/v)；
③抗人脂联素抗体的生物素化
生物素选用商品化的已活化产品，将生物素与抗人脂联素抗体混合，室温下反应lh，离心，除去其中少量的沉淀物；将上清装入透析袋中，在0℃下置于PBS缓冲液(0.1M，pH7.4)中透析过夜；其中，所述抗人脂联素抗体与所述生物素的摩尔比为1：1；
④生物素化脂联素抗体与链亲和素包被胶乳颗粒的连接
在1mL步骤②中所得的链亲和素包被的胶乳颗粒溶液中加入400uL步骤③中所得的生物素化抗人脂联素抗体，混匀后置37℃摇床孵育0.5h，形成胶乳颗粒-链亲和素-生物素-抗人脂联素抗体复合物；
⑤清洗
将步骤④中形成的胶乳颗粒-链亲和素-生物素-抗人脂联素抗体复合物溶液离心，弃上清，重复清洗2次；将末次沉淀溶于含保护剂B和防腐剂的缓冲液B中，使胶乳颗粒的质量体积比终浓度为0.04％。
(3)配制脂联素校准品
将市售人脂联素重组蛋白溶于类似人血清基质的溶液(即，上述实施例脂联素校准品配方中去除脂联素重组蛋白以外的成分)中，制成不同浓度的校准品。以进口的罗氏公司脂联素校准品为原始标准，采用其脂联素试剂盒对不同浓度的校准品分别检测20次，求出均值，得到脂联素校准品的浓度：0.2、l、3、10、30、100mg/L。
实施例5
本实施例的一种上述实施例中定量检测脂联素ADPN的胶乳增强免疫比浊试剂盒的制备方法，包括如下步骤：
(1)配制脂联素R1试剂：
按照脂联素R1试剂的组分含量，将各组分物质于同一容器中混合，混合均匀后，制得脂联素R1试剂。
(2)配制脂联素R2试剂：
①胶乳粒子的活化、洗涤
将商品化的聚苯乙烯胶乳溶液活化后离心，弃上清，沉淀用洗涤缓冲液重复洗涤4次；将末次沉淀重悬于所述洗涤缓冲液中，并使胶乳颗粒的质量体积比终浓度为1％；其中，洗涤缓冲液具体为PBS缓冲液；
②链亲和素包被胶乳颗粒
a.取1mL活化洗涤后的聚苯乙烯胶乳溶液，加入链亲和素，使链亲和素终浓度为0.1mg/mL；混匀后，置37℃摇床以220rpm转速包被18h；
b.用PBS缓冲液(0.1M，pH 7.4)洗涤未与胶乳粒子结合的链亲和素，重2～4次；
c.封闭：将洗涤后的包被链亲和素的胶乳颗粒溶于包含保护剂B的缓冲液B中，使胶乳颗粒的质量体积比终浓度为0.3％(w/v)；
③抗人脂联素抗体的生物素化
生物素选用商品化的已活化产品，将生物素与抗人脂联素抗体混合，室温下反应4h，离心，除去其中少量的沉淀物；将上清装入透析袋中，在4℃下置于PBS缓冲液(0.1M，pH7.4)中透析过夜；其中，所述抗人脂联素抗体与所述生物素的摩尔比为1：100；
④生物素化脂联素抗体与链亲和素包被胶乳颗粒的连接
在1mL步骤②中所得的链亲和素包被的胶乳颗粒溶液中加入400uL步骤③中所得的生物素化抗人脂联素抗体，混匀后置37℃摇床孵育2h，形成胶乳颗粒-链亲和素-生物素-抗人脂联素抗体复合物；
⑤清洗
将步骤④中形成的胶乳颗粒-链亲和素-生物素-抗人脂联素抗体复合物溶液离心，弃上清，重复清洗4次；将末次沉淀溶于含保护剂B和防腐剂的缓冲液B中，使胶乳颗粒的质量体积比终浓度为0.16％。
(4)配制脂联素校准品
将市售人脂联素重组蛋白溶于类似人血清基质的溶液(即，上述实施例脂联素校准品配方中去除脂联素重组蛋白以外的成分)中，制成不同浓度的校准品。以进口的罗氏公司脂联素校准品为原始标准，采用其脂联素试剂盒对不同浓度的校准品分别检测20次，求出均值，得到脂联素校准品的浓度：0.2、l、3、10、30、100mg/L。
实施例6
本实施例的一种上述实施例中定量检测脂联素ADPN的胶乳增强免疫比浊试剂盒的制备方法，包括如下步骤：
(1)配制脂联素R1试剂：
按照脂联素R1试剂的组分含量，将各组分物质于同一容器中混合，混合均匀后，制得脂联素R1试剂。
(2)配制脂联素R2试剂：
①胶乳粒子的活化、洗涤
将商品化的聚苯乙烯胶乳溶液活化后离心，弃上清，沉淀用洗涤缓冲液重复洗涤3次；将末次沉淀重悬于所述洗涤缓冲液中，并使胶乳颗粒的质量体积比终浓度为1％；其中，洗涤缓冲液为MES缓冲液(50mM，pH 6.5)；
②链亲和素包被胶乳颗粒
a.取1mL活化洗涤后的聚苯乙烯胶乳溶液，加入链亲和素，使链亲和素终浓度为0.1mg/mL；混匀后，置30℃摇床以220rpm转速包被16h；
b.用PBS缓冲液(0.1M，pH 7.4)洗涤未与胶乳粒子结合的链亲和素，重复3次；
c.封闭：将洗涤后的包被链亲和素的胶乳颗粒溶于包含保护剂B的缓冲液B中，使胶乳颗粒的质量体积比终浓度为0.2％(w/v)；
③抗人脂联素抗体的生物素化
生物素选用商品化的已活化产品，将生物素与抗人脂联素抗体混合，室温下反应2h，离心，除去其中少量的沉淀物；将上清装入透析袋中，在2℃下置于PBS缓冲液(0.1M，pH7.4)中透析过夜24h；其中，所述抗人脂联素抗体与所述生物素的摩尔比为1：10；
④生物素化脂联素抗体与链亲和素包被胶乳颗粒的连接
在1mL步骤②中所得的链亲和素包被的胶乳颗粒溶液中加入400uL步骤③中所得的生物素化抗人脂联素抗体，混匀后置37℃摇床孵育1h，形成胶乳颗粒-链亲和素-生物素-抗人脂联素抗体复合物；
⑤清洗
将步骤④中形成的胶乳颗粒-链亲和素-生物素-抗人脂联素抗体复合物溶液离心，弃上清，重复清洗3次；将末次沉淀溶于含保护剂B和防腐剂的缓冲液B中，使胶乳颗粒的质量体积比终浓度为0.1％。
(5)配制脂联素校准品
将市售人脂联素重组蛋白溶于类似人血清基质的溶液(即，上述实施例脂联素校准品配方中去除脂联素重组蛋白以外的成分)中，制成不同浓度的校准品。以进口的罗氏公司脂联素校准品为原始标准，采用其脂联素试剂盒对不同浓度的校准品分别检测20次，求出均值，得到脂联素校准品的浓度：0.2、l、3、10、30、100mg/L。
实施例7
本实施例的一种上述实施例中定量检测脂联素ADPN的胶乳增强免疫比浊试剂盒的检测方法：
1、生化分析仪检测
以日立7080操作为例：测定波长为700nm，分别取不同浓度的校准品溶液(3uL)，加入脂联素R1试剂(160uL)，混匀，37℃孵育5分钟后，加入脂联素R2试剂(80uL)，混匀，37℃孵育1分钟后，读取各管吸光度值A1，反应4～5分钟后，读取各管吸光度值A2，计算吸光度差值△A＝A2-A1，每管重复测定3次，以各校准管3次测得的吸光度差值△A的平均值为纵坐标，对应的校准品浓度为横坐标，绘制“浓度-吸光度差值”校准曲线(见图1)。
取待测血清或血浆样本，同法测定样本的吸光度差值，代入校准曲线，即可计算出待测样本中脂联素ADPN的含量。如果血清或血浆中脂联素的浓度超出校准曲线范围，需对样本进行稀释后再检测以保证检测结果的准确性。
本试剂盒不仅适用于日立7080，还适用于其它品牌和型号的半自动、全自动生化分析仪，具体参数可根据仪器进行调整。
2、NORMAN系列散射比浊分析仪检测
将全血35uL(血清或血浆20uL)加入样品反应杯中，然后加入R1试剂240uL，混匀，等反应杯中的散射光强度稳定后，加入R2试剂80uL，混匀，在1-2分钟之内测定散射光强度的变化差值△A，将△A代入校准曲线，即可计算出待测样本中脂联素的含量。
实施例8
本实施例用以评价上述实施例中定量检测脂联素ADPN的胶乳增强免疫比浊试剂盒：
(1)线性范围
用接近线性范围上限的脂联素高浓度样本(40mg/L)，用生理盐水将其按1/2、1/4、1/8、1/16、1/32、1/64稀释，共配制成6个稀释浓度(xi)的溶液，用所述生化分析仪检测方法测定各稀释样本浓度。每个浓度重复测定3次，分别求出测定结果的平均值(yi)。以稀释浓度(xi)为自变量，以测定结果平均值(yi)为因变量求出线性回归方程。按公式(1)计算线性回归的相关系数r，结果显示回归方程为y＝1.0086X-0.1464，相关系数r＝0.9998，表明本发明试剂盒在0.3mg/L-40mg/L线性范围内相关性较好(见图2)。
(2)灵敏度(最低检测限)
以5％牛血清白蛋白溶液为空白样本，按生化分析仪检测方法重复测定20次，以空白均值加两倍标准差报告最低检测限，结果显示本发明试剂盒的最低检测限为0.3mg/L。
(3)重复性和准确度
用AUDIT公司标示值分别为0.67mg/L和51.4mg/L的脂联素校准品作为样本，按所述生化分析仪检测方法进行测定，各浓度分别重复测定10次，分别计算测定均值
和标准差(S)，以
计算变异系数进行重复性考察，结果显示变异系数分别为2.86％和1.38％；以
计算相对偏差进行准确度考察，其相对偏差分别为1.49％和0.79％，具体见表1。.
表1脂联素试剂盒的重复性和准确度考察
(4)批间差
按本发明实施例所述方法制备三批试剂盒，用三批试剂盒对同一份血清样本进行重复测定，每个批号重复测定3次，分别计算每批3次测定的均值
(i＝l,2,3)，按公式(2)、(3)计算相对偏差(R)，结果显示相对偏差R为2.68％，具体见表2。
式中：
中的最大值；式中：
中的最小值；
三批试剂检测均值。
表2脂联素试剂盒的批间差考察
(5)干扰实验
取浓度为0.67mg/L的脂联素校准品溶液，分别加入相同体积的各干扰物质溶液，使加入后的各干扰物质浓度分别为血红蛋白10g/L、胆红素684umol/L、甘油三酯20g/L，用本发明试剂盒对每个制备样本重复测定3次，取平均值，与加入相同体积蒸馏水的样本比较，观察加入干扰物质与加入蒸馏水后ADPN测定值的相对偏差。结果显示，加入以上浓度干扰物质测定值与加入同体积蒸馏水后测定值相对偏差不超过4％。当检测样本中存在一定浓度的干扰物质包括血红蛋白、胆红素和甘油三酯，对本发明试剂盒的测定结果影响很小。
(6)稳定性
对本发明试剂盒进行开瓶稳定性和长期稳定性考察。
开瓶稳定性：将本发明试剂盒开瓶后置于2℃-8℃保存30天后，取出按所述生化分析仪检测方法测定AUDIT公司标示值分别为0.67mg/L和51.4mg/L的脂联素校准品，各浓度重复测定3次，计算检测结果与标示值的相对偏差。结果显示，开瓶30天后本发明剂盒检测值与标示值的相对偏差分别为1.99％和1.12％，开瓶稳定性较好。
长期稳定性：将本发明试剂盒置于2℃-8℃保存12个月后，取出按所述生化分析仪检测方法测定AUDIT公司标示值分别为0.24mg/L和45.9mg/L的脂联素校准品，各浓度重复测定3次，计算检测结果与标示值的相对偏差。结果表明，本发明试剂盒检测值与标示值的相对偏差分别为2.78％和1.32％，试剂盒在2℃-8℃保存12个月是比较稳定的。
具体见表3。
表3脂联素试剂盒的开瓶及长期稳定性考察
(7)本发明试剂盒与已上市产品的比较
医院提供79例住院患者血清，其中男性45例，女性34例，平均年龄39岁。用本发明脂联素测定试剂盒和市售进口罗氏脂联素电化学发光试剂盒分别对样本重复测2次，分别计算平均值，对79例样本检测结果进行线性回归分析，计算两种试剂盒检测结果的相关系数。结果显示，两种试剂盒检测结果的相关系数r＝0.9986，线性回归方程为y＝0.9475x+0.1073(见图3)。根据美国临床实验室标准化协会(CLSI)文件要求(r>0.975),本发明脂联素测定试剂盒和市售进口罗氏脂联素电化学发光试剂盒具有很好的一致性。由此可见本发明脂联素测定试剂盒在临床上可以代替进口试剂盒使用，降低检测成本，减轻患者的经济负担。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种定量检测脂联素ADPN的胶乳增强免疫比浊试剂盒，其特征在于，包括脂联素R1试剂和脂联素R2试剂；
所述脂联素R1试剂包括的成分及相应含量为：缓冲液A20～200mM，保护剂A1～10mg/mL，反应增强剂1～5％，防腐剂0.03～0.2％，溶剂为纯化水；
所述脂联素R2试剂包括的成分及相应含量为：缓冲液B 20～200mM，保护剂B1～10mg/mL，防腐剂0.03～0.2％，包被抗人脂联素抗体的致敏聚苯乙烯胶乳颗粒0.04～0.16％，溶剂为纯化水；其中，所述包被抗人脂联素抗体的致敏聚苯乙烯胶乳颗粒中的“抗人脂联素抗体”与“致敏聚苯乙烯胶乳颗粒”之间通过链亲和素-生物素***连接。
2.根据权利要求1所述的定量检测脂联素ADPN的胶乳增强免疫比浊试剂盒，其特征在于，所述脂联素R1试剂中，缓冲液A具体为硼酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液、Tris-HCl缓冲液、磷酸盐缓冲液和甘氨酸缓冲液中的一种或多种，且pH为6～10；保护剂A具体为牛血清白蛋白、卵清蛋白和明胶中的一种或多种；反应增强剂具体为聚乙二醇4000、聚乙二醇6000、聚乙二醇8000和聚乙二醇20000中的一种或多种；防腐剂具体为叠氮钠、硫柳汞和Proclin300中的一种或多种。
3.根据权利要求1所述的定量检测脂联素ADPN的胶乳增强免疫比浊试剂盒，其特征在于，所述脂联素R2试剂中，缓冲液B具体为硼酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液、Tris-HCl缓冲液、磷酸盐缓冲液和甘氨酸缓冲液中的一种或多种，且pH为7～9；保护剂B具体为牛血清白蛋白和卵清蛋白中的一种或两种；防腐剂具体为叠氮钠、硫柳汞和Proclin300中的一种或多种；包被抗人脂联素抗体的致敏聚苯乙烯胶乳颗粒中的抗人脂联素抗体具体为多克隆抗体和单克隆抗体中的一种。
4.根据权利要求1所述的定量检测脂联素ADPN的胶乳增强免疫比浊试剂盒，其特征在于，所述脂联素R2试剂中的包被抗人脂联素抗体的致敏聚苯乙烯胶乳颗粒是通过分别制备生物素化抗人脂联素抗体、链亲和素包被的聚苯乙烯胶乳颗粒，并将所述生物素化抗人脂联素抗体与所述链亲和素包被的聚苯乙烯胶乳颗粒混合孵育而制成；在所述生物素化抗人脂联素抗体制备中，所述抗人脂联素抗体与生物素的摩尔比为1：(1～100)。
5.根据权利要求1所述的定量检测脂联素ADPN的胶乳增强免疫比浊试剂盒，其特征在于，所述包被抗人脂联素抗体的致敏聚苯乙烯胶乳颗粒中的致敏聚苯乙烯胶乳颗粒具体为羧基化的聚苯乙烯胶乳颗粒或氨基化的聚苯乙烯胶乳颗粒；其中，所述羧基化的聚苯乙烯胶乳颗粒经碳化二亚胺活化后再进行链亲和素包被；所述氨基化的聚苯乙烯胶乳颗粒经戊二醛活化后再进行链亲和素包被；所述胶乳颗粒的粒径范围为40～500nm。
6.根据权利要求1～5任一所述的定量检测脂联素ADPN的胶乳增强免疫比浊试剂盒，其特征在于，还包括脂联素校准品；
所述脂联素校准品包括的成分及相应含量为：缓冲液C 20～200mM，保护剂C 0.5～8mg/L，防腐剂0.03～0.2％，脂联素重组蛋白0.2～100mg/L，溶剂为纯化水。
7.根据权利要求6所述的定量检测脂联素ADPN的胶乳增强免疫比浊试剂盒，其特征在于，所述脂联素校准品中，缓冲液C具体为硼酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液、Tris-HCl缓冲液、磷酸盐缓冲液和甘氨酸缓冲液中的一种或多种，且pH为7～9；保护剂C具体为牛血清白蛋白；防腐剂具体为叠氮钠、硫柳汞和Proclin300中的一种或多种。
8.一种如权利要求1～7任一所述的定量检测脂联素ADPN的胶乳增强免疫比浊试剂盒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)配制脂联素R1试剂：
按照脂联素R1试剂的组分含量，将各组分物质于同一容器中混合，混合均匀后，制得脂联素R1试剂；
(2)配制脂联素R2试剂：
①胶乳粒子的活化、洗涤
将聚苯乙烯胶乳溶液活化后离心，弃上清，沉淀用洗涤缓冲液重复洗涤2～4次；将末次沉淀重悬于所述洗涤缓冲液中，并使胶乳颗粒的质量体积比终浓度为1％；
②链亲和素包被胶乳颗粒
a.取1mL活化洗涤后的聚苯乙烯胶乳溶液，加入链亲和素，使链亲和素终浓度为0.1mg/mL；混匀后，置4～37℃摇床以220rpm转速包被0.5～18h；
b.用PBS缓冲液洗涤未与胶乳粒子结合的链亲和素，重复2～4次；
c.封闭：将洗涤后的包被链亲和素的胶乳颗粒溶于包含保护剂B的缓冲液B中，使胶乳颗粒的质量体积比终浓度为0.1～0.3％；
③抗人脂联素抗体的生物素化
生物素选用已活化产品，将生物素与抗人脂联素抗体混合，室温下反应l～4h，离心，除去其中少量的沉淀物，将上清装入透析袋中，在0～4℃下置于PBS缓冲液中透析过夜；其中，所述抗人脂联素抗体与所述生物素的摩尔比为1：(1～100)；
④生物素化脂联素抗体与链亲和素包被胶乳颗粒的连接
在步骤②中所得的链亲和素包被的胶乳颗粒溶液中加入步骤③中所得的生物素化抗人脂联素抗体，混匀后置37℃摇床孵育0.5～2h，形成胶乳颗粒-链亲和素-生物素-抗人脂联素抗体复合物；
⑤清洗
将步骤④中形成的胶乳颗粒-链亲和素-生物素-抗人脂联素抗体复合物溶液离心，弃上清，重复清洗2～4次；将末次沉淀溶于含保护剂B和防腐剂的缓冲液B中，使胶乳颗粒的质量体积比终浓度为0.04～0.16％。
9.根据权利要求8所述的定量检测脂联素ADPN的胶乳增强免疫比浊试剂盒的制备方法，其特征在于，所述步骤①中，洗涤缓冲液具体为PBS缓冲液和MES缓冲液中的一种；所述步骤③中，所述抗人脂联素抗体与所述生物素的摩尔比为具体为1：10。
10.一种如权利要求1～7任一所述的定量检测脂联素ADPN的胶乳增强免疫比浊试剂盒的应用方法，其特征在于，将所述定量检测脂联素ADPN的胶乳增强免疫比浊试剂盒通过在半自动、全自动生化分析仪及散射比浊分析仪上使用来定量检测人体血液中脂联素的含量；其中，所述血液包括全血、血清及血浆。
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