JP5663494B2 - 尿検体中のサブスタンスｐの測定方法 - Google Patents

Description

本発明は、炎症、アレルギー疾患等のマーカーとして有用なサブスタンスＰの測定方法に関する。

臨床診断において、尿を検体として用いる尿中の測定対象成分の測定と、その測定に基づく疾患の診断がしばしば行われている。例えば、尿試験紙を用いた尿蛋白、尿潜血、尿中ヘモグロビン、尿糖等の検査は日常的に行われている。また、尿中の蛋白質及びペプチドは、腎臓、泌尿器系、循環器系等の疾患及び状態のマーカーとして有用であり、例えばＣ−ペプチド、Ｌ型脂肪酸結合蛋白（Ｌ−ＦＡＢＰ）等が尿を検体として用いて測定されている。

尿は、全血、血清や血漿とは異なり、被検者へ負担を掛けることなく採取することができる、という利点を有する一方、細菌が繁殖し易く、また、蛋白質分解酵素の影響を受け易い、という欠点を有する。従って、２４時間蓄尿を検体として用いる場合や、長期間保存する場合には、保存剤を共存させて、尿中の測定対象成分を安定化させることがしばしば行われる。保存剤として、プロテアーゼ阻害剤、塩酸、トルエン、キシレン、アジ化ナトリウム、キレート剤、アルブミン、イソチアゾロン系化合物、緩衝剤、界面活性剤の他、これらの要素の組み合わせ等が知られている（例えば、特許文献１〜４参照）。しかしながら、保存剤が測定対象成分の測定に影響することもあり、尿を検体として用いる場合には充分な管理が必要であり、尿は検体として使い辛い面を有している。

また、従来、尿中の測定対象成分を測定するに際しては、尿中に存在する生体由来の妨害物質や上記の保存剤の影響を回避するために、採取した尿そのもの（原尿）を緩衝液等の水性媒体で高度に希釈し、高度に希釈された尿を測定に供することもしばしば行われる。しかしながら、原尿を希釈して、測定対象成分を測定する方法は、測定対象成分濃度が尿検体毎に異なり、尿検体毎に適切な希釈率を設定する必要があり、操作が煩雑になると共に、尿を高度に希釈することにより、測定対象成分の濃度が著しく低下し、測定の正確性と信頼性が著しい低下する、という欠点を有している。

サブスタンスＰは、１１個のアミノ酸配列からなるペプチドである。サブスタンスＰは、第一次知覚神経の化学伝達物質であり、この物質が体内に高濃度で存在することは、痛みや炎症の神経伝達亢進が疑われる。サブスタンスＰは、炎症、アレルギー疾患の有用なマーカーとして注目を集めている。

検体中のサブスタンスＰ測定方法としては、これまで、血清を酸処理した後、アセトンおよびエーテルで抽出し、さらに逆相カラムによるＨＰＬＣで精製したサブスタンスＰを酵素免疫測定法で測定する方法が知られている（非特許文献１参照）。しかしながら、本方法は操作が非常に煩雑で、かつ、化学的処理条件が過酷なため、正確な測定値を与えるものではなかった。

また、採血後の血液中サブスタンスＰは非常に不安定であるため、正確な測定値を得ることは困難であったが、採血後の血液に糖類を添加することにより、採血後の血液中のサブスタンスＰが安定化され、本安定化方法を利用した血液中のサブスタンスＰの正確な測定方法が報告されている（特許文献５参照）。

しかしながら、この方法も検体として血液を用いることから、被検者に採血という負担を強いることになる。

特表平１０−５０７２６９号公報 特開平１０−２８２０９５号公報 特開２０００−３５２５６５号公報 国際公開第２００９／０４１５７７号パンフレット 国際公開第２００７／０１０９９５号パンフレット

クリニカル・アンド・ディアグノスティック・ラボラトリー・イムノロジー（Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology），（米国），1998年，第5巻，第3号，p.303-307

本発明の目的は、尿検体中のサブスタンスＰを簡便、かつ、正確に測定するための方法を提供することにある。

本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、ペプチドは通常、加熱処理によって変性を受けるため、検体中のペプチドの測定に際して、検体を加熱することは行わないが、尿検体中のサブスタンスＰについては、尿検体を加熱処理することによって、正確に測定できる、という知見を見出し、本発明を完成させた。すなわち、本発明は以下の（１）〜（５）に関する。

（１） 尿検体を加熱処理し、加熱処理後の尿検体中のサブスタンスＰを測定することを特徴とする、尿検体中のサブスタンスＰの測定方法。
（２） 加熱処理が、尿検体を３０〜５５℃で加熱する処理である、（１）記載の測定方法。
（３） 加熱処理が、尿検体を３５〜５０℃で、１５分間〜４時間加熱する処理である、（１）または（２）記載の測定方法。
（４） サブスタンスＰの測定が、免疫学的測定法により行われる、（１）〜（３）のいずれかに記載の測定方法。
（５） 尿検体が、原尿である、（１）〜（４）のいずれかに記載の測定方法。

本発明により、尿検体中のサブスタンスＰを簡便、かつ、正確に測定するための方法が提供される。

本発明における尿検体は、サブスタンスＰを含む尿検体であれば特に制限はなく、例えば動物より採取された尿等が挙げられる。動物としては、例えばヒト、猿、類人猿（ゴリラ、オランウータン、チンパンジー、てながざる）、イヌ、ネコ、ラット、マウス、ウサギ等が挙げられる。本発明においては、原尿のみならず、原尿に保存剤等の添加物が添加された尿等も用いることができるが、原尿を用いることが好ましい。保存剤としては、例えばプロテアーゼインヒビター、塩酸、トルエン、アジ化ナトリウム等の公知の保存剤等が挙げられる。

本発明における尿検体の加熱処理は、尿検体中のサブスタンスＰの測定を可能とする範囲であれば特に制限はなく、例えば尿を３０〜５５℃で加熱する処理が挙げられ、３５〜５０℃で加熱する処理が好ましい。加熱処理における尿検体の加熱時間は、尿検体中のサブスタンスＰの測定を可能とする範囲であれば特に制限はなく、例えば１０分間〜６時間である。特に、加熱温度が３５〜５０℃であれば、１５分間〜４時間が好ましく、１時間〜３時間が特に好ましい。

本発明においては、尿検体を少なくとも１回加熱処理すれば、加熱処理の前後に冷蔵処理、冷凍処理または保存処理等の処理を行ってもよい。また、加熱処理は複数回行ってもよい。冷蔵処理としては、例えば尿検体を−２０〜０℃で冷蔵する処理等が挙げられる。冷凍処理としては、例えば尿検体を−８０〜−２０℃で冷凍する処理等が挙げられる。保存処理としては、例えば尿検体を４〜２５℃で、２時間以上放置する処理等が挙げられる。

本発明の尿検体中のサブスタンスＰの測定方法は、加熱処理された尿検体を用いる方法であり、具体的には以下の工程により行うことができる。
［１］尿検体を加熱処理する工程；
［２］［１］で加熱処理された尿検体を用いて、尿検体中のサブスタンスＰを測定する工程；及び、
［３］予め、既知濃度のサブスタンスＰを用いて作成された、サブスタンスＰの濃度と情報量との関係を表す検量線に、［２］での測定で得られた測定値を照らし合わせて、尿検体中のサブスタンスＰの濃度を決定する工程。

尿検体中のサブスタンスＰの測定は、サブスタンスＰの測定を可能とする方法であればいかなる方法によっても行うことができ、例えば免疫学的測定法等の公知の方法により行うことができる。尿検体中のサブスタンスＰの測定は、市販のキットを用いて行うこともできる。免疫学的測定法は、測定対象成分と、測定対象成分と結合する抗体またはそのフラグメントとの反応（抗原抗体反応）を用いる方法であり、サンドイッチ法、競合法、酵素免疫測定法、化学発光酵素免疫測定法、蛍光免疫測定法、電気化学発光免疫測定法、ラジオイムノアッセイ等が挙げられる。市販のキットとしては、「Substance P EIA Kit」（Cayman Chemical社製）、「Substance P EIA Kit」（Assay Designs社製）、「DRG Human Substance P ELISA (EIA-3120)」（DRGインターナショナル社製）等が挙げられる。

以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、これらは本発明の範囲を何ら限定するものではない。尚、本実施例においては、下記メーカーの試薬を使用した。

（１）コントロール実験
健常人Ａ，Ｂ，Ｃより採取したそれぞれの新鮮尿（原尿）を、サブスタンスＰ測定用キット「Substance P EIA Kit」（Cayman Chemical社製）中の検体希釈液(EIA Buffer)で希釈することにより、２倍希釈尿、４倍希釈尿、８倍希釈尿を調製した。これらの各尿検体（原尿、２倍希釈尿、４倍希釈尿、８倍希釈尿）中のサブスタンスＰ濃度を、「Substance P EIA Kit」（Cayman Chemical社製）を用いて、当該キットの添付文書に記載された方法に従って決定した。「Substance P EIA Kit」（Cayman Chemical社製）の添付文書には、当該キットを用いる測定の測定範囲として、8.2〜500 pg/mLの範囲が記載されている。別途、原尿を４０℃で６０分間加熱処理して得られた尿検体を用いて、同様に、尿検体中のサブスタンスＰ濃度を決定した。測定結果を第１表に示す。第１表中、補正値とは、実際の測定値に希釈倍率を乗じて算出した値である。

第１表に示される様に、どの健常人においても、加熱処理を行わない原尿を用いた測定における測定値は、希釈された尿を用いた測定における補正値に比較して、低い値を示した。健常人Ａにおいては、２倍希釈での補正値が、加熱処理した原尿を用いた測定の測定値とほぼ一致した。尚、健常人Ａにおいては、８倍希釈した尿では、希釈された尿中のサブスタンスＰの濃度が非常に低くなり、用いたキットの測定範囲外となったため、正確な測定ができなかった。健常人Ｂにおいては、８倍希釈での補正値が、加熱処理した原尿を用いた測定の測定値とほぼ一致した。健常人Ｃにおいては、８倍希釈での補正値が、加熱処理した原尿を用いた測定の測定値とほぼ一致した。この様に、加熱処理を行わない場合には、正確な測定を行うためには、用いる尿検体によって、希釈倍率を変える必要があるが、本発明の加熱処理を行う方法では、用いる尿検体によらず、単に尿検体を加熱処理するだけでよいことが判明した。従って、本発明の方法により、煩雑な操作を伴うことなく、簡便、かつ、正確に尿検体中のサブスタンスＰを測定できる。

（２）添加回収実験
加熱処理後の尿検体を用いた測定が、尿検体中のサブスタンスＰの正確な測定であることを、サブスタンスＰの標準品を用いた添加回収実験で検証した。

＜添加回収実験＞
１）手順
健常人より採取した尿、及び、サブスタンスＰ測定用キット「Substance P EIA Kit」（Cayman Chemical社製）中の標準品(1,000 pg/mL)を用いて、以下の様に、添加回収試験用試料(1)〜(3)を調製した。試料希釈液は、サブスタンスＰ測定用キット中の希釈液(EIA Buffer)を用いた。
(1)尿 ９容 ＋ 試料希釈液 １容
(2)尿 ９容 ＋ 標準品 １容
(3)試料希釈液 ９容 ＋ 標準品 １容

調製した添加回収試験用試料(1)〜(3)それぞれを４０℃で２０〜１２０分間、加熱処理し、加熱処理した後の各試料中のサブスタンスＰを、サブスタンスＰ測定用キット「Substance P EIA Kit」（Cayman Chemical社製）を用いて、当該キットの添付文書に記載された方法に従って測定した。

２）データ解析
添加回収率を下記の式（Ｉ）により算出した。

添加回収率の結果を第２表に示す。

添加回収率が100％に近い程、正確な測定であることを意味する。第２表に示される様に、４０℃で６０分間以上加熱処理された尿検体において、良好な添加回収率を確認した。従って、４０℃で６０分間以上加熱処理された尿検体を用いた測定が、尿検体中のサブスタンスＰの正確な測定であることが判明した。

・加熱処理条件の検討
健常人より採取した尿検体（原尿）を、３０℃、３５℃、４０℃、４５℃、５０℃及び５５℃の各温度で加熱した後、当該加熱処理された尿検体を用いて、尿検体中のサブスタンスＰを、サブスタンスＰ測定用キット「Substance P EIA Kit」（Cayman Chemical社製）を用いて、当該キットの添付文書に記載された方法に従って測定した。測定結果を第３表に示す。

ここで、第３表中の数値は、４０℃で６０分間加熱処理された尿検体を用いた測定での測定値を１００とした時の相対値（％）を表す。第３表から、尿検体の加熱温度により、正確な測定が可能となる加熱時間が異なり、加熱温度が高い程、加熱時間が短縮されると共に、長時間の加熱では却って、測定値が低下することが判明した。

・尿検体の加熱条件の検討
健常人より採取した尿検体（原尿）を、第４表に示す１０の条件で処理し、当該処理された尿検体中のサブスタンスＰを、サブスタンスＰ測定用キット「Substance P EIA Kit」（Cayman Chemical社製）を用いて、当該キットの添付文書に記載された方法に従って測定した。測定結果を第４表に示す。

ここで、第４表中の測定値とは、４０℃で６０分間加熱処理された尿検体を用いた測定（条件３）における測定値を１００とした時の相対値（％）を意味する。第４表から、加熱処理された尿検体（条件３〜６、９〜１０）を用いた場合には、尿検体中のサブスタンスＰを正確に測定できるのに対して、加熱処理されていない尿検体（条件１〜２、７〜８）を用いた場合には、測定値が著しく低くなり、これらの尿検体では、尿検体中のサブスタンスＰを正確に測定できないことが判明した。本結果から、尿検体を加熱処理することにより、尿検体中のサブスタンスＰを正確に測定できることが判明した。

本発明により、炎症やアレルギー疾患の診断に有用な、尿検体中のサブスタンスＰの簡便、かつ、正確な測定方法が提供される。

Claims (5)

1. 尿検体を加熱処理し、加熱処理後の尿検体中のサブスタンスＰを測定することを特徴とする、尿検体中のサブスタンスＰの測定方法。
2. 加熱処理が、尿検体を３０〜５５℃で加熱する処理である、請求項１記載の測定方法。
3. 加熱処理が、尿検体を３５〜５０℃で、１５分間〜４時間加熱する処理である、請求項１または２記載の測定方法。
4. サブスタンスＰの測定が、免疫学的測定法により行われる、請求項１〜３のいずれかに記載の測定方法。
5. 尿検体が、原尿である、請求項１〜４のいずれかに記載の測定方法。