JP2001004624A - Age化タンパクの定量用試薬および測定法 - Google Patents
Age化タンパクの定量用試薬および測定法Info
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- JP2001004624A JP2001004624A JP11178168A JP17816899A JP2001004624A JP 2001004624 A JP2001004624 A JP 2001004624A JP 11178168 A JP11178168 A JP 11178168A JP 17816899 A JP17816899 A JP 17816899A JP 2001004624 A JP2001004624 A JP 2001004624A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 従来の免疫学的測定法よりも更に迅速かつ簡
便にAGE化タンパクを測定でき、非特異的な凝集反応
が起こりにくく、かつ保存安定性の良いAGE化タンパ
ク定量用試薬を提供する。 【解決手段】 AGE化タンパクを特異的に認識する抗
体が感作されたラテックスと第4級アンモニウム塩を共
存させる。
便にAGE化タンパクを測定でき、非特異的な凝集反応
が起こりにくく、かつ保存安定性の良いAGE化タンパ
ク定量用試薬を提供する。 【解決手段】 AGE化タンパクを特異的に認識する抗
体が感作されたラテックスと第4級アンモニウム塩を共
存させる。
Description
【0001】
【発明の属する技術分野】本発明は、AGE化タンパク
定量用試薬およびその測定法に関する。更に詳しくは、
試料中のAGE化タンパクを免疫反応にてラテックス凝
集反応を利用して定量を行うに適した試薬およびその測
定法に関する。
定量用試薬およびその測定法に関する。更に詳しくは、
試料中のAGE化タンパクを免疫反応にてラテックス凝
集反応を利用して定量を行うに適した試薬およびその測
定法に関する。
【0002】
【従来の技術】AGE(終末糖化産物)は、糖尿病性合
併症の重篤度(Brownlee,M.,et al,
1988,N.Engl.J.Med.,318:13
15−1321)や老化(Araki,N.,et a
l,1992,J.Biol.Chem.,267:1
0211−10214)、慢性腎疾患(Miyata,
T.,et al,1996,J.Am.Soc.Ne
phrol.,7:1198−1206)、アルツハイ
マー病(Smith,M.A.,et al,199
4,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,
91:5710)等と関連があることが明らかになって
きており、上記疾患の診断、治療、予防あるいはその薬
効評価に有用な指標とされている。AGE化タンパクの
うち、カルボキシメチル化タンパク(以下、「CM化タ
ンパク」と呼ぶこともある。)はAGE化タンパクの主
成分であること(Reddy,S.,et al,19
95,Biochemistry,34:10872−
10878)から、AGE化タンパクの有用な指標とさ
れている。
併症の重篤度(Brownlee,M.,et al,
1988,N.Engl.J.Med.,318:13
15−1321)や老化(Araki,N.,et a
l,1992,J.Biol.Chem.,267:1
0211−10214)、慢性腎疾患(Miyata,
T.,et al,1996,J.Am.Soc.Ne
phrol.,7:1198−1206)、アルツハイ
マー病(Smith,M.A.,et al,199
4,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,
91:5710)等と関連があることが明らかになって
きており、上記疾患の診断、治療、予防あるいはその薬
効評価に有用な指標とされている。AGE化タンパクの
うち、カルボキシメチル化タンパク(以下、「CM化タ
ンパク」と呼ぶこともある。)はAGE化タンパクの主
成分であること(Reddy,S.,et al,19
95,Biochemistry,34:10872−
10878)から、AGE化タンパクの有用な指標とさ
れている。
【0003】従来、血液中のAGE化タンパクの測定
は、液体クロマトグラフィーやガスクロマトグラフィー
/質量分析等の機器分析による方法で行われていた。し
かしながら、機器分析による測定法は操作が煩雑であり
感度も低いという問題点があることから、測定が容易で
感度も高い抗原抗体反応による方法が多用されるように
なった。抗原抗体反応によるAGE化タンパクの測定法
としては、ELISA法(酵素標識免疫測定法)(特表
平10−504640号公報)、ドットブロッティング
法あるいはラテックス凝集法が知られているが、ELI
SA法においては、例えば、特表平10−504640
号公報に記してあるように、界面活性剤、蛋白変性剤等
による被検体の前処理が必要であり、操作が煩雑で時間
もかかるという問題がある。また、ELISA法、ドッ
トブロッティング法とも機器分析よりは迅速で簡便なも
のの、半日〜1日の時間を要し、操作においても熟練度
が必要であるという問題があった。一方、ラテックス凝
集法を用いた場合、測定操作は簡便でしかも迅速に測定
できるという利点はあるものの、B/F分離を行わない
ためELISA法やドットブロッティング法に比べ非特
異的な反応(凝集)が起こり易く、また、AGE化タン
パクを特異的に認識する抗体が感作されたラテックスの
保存安定性も悪いという欠点があった。
は、液体クロマトグラフィーやガスクロマトグラフィー
/質量分析等の機器分析による方法で行われていた。し
かしながら、機器分析による測定法は操作が煩雑であり
感度も低いという問題点があることから、測定が容易で
感度も高い抗原抗体反応による方法が多用されるように
なった。抗原抗体反応によるAGE化タンパクの測定法
としては、ELISA法(酵素標識免疫測定法)(特表
平10−504640号公報)、ドットブロッティング
法あるいはラテックス凝集法が知られているが、ELI
SA法においては、例えば、特表平10−504640
号公報に記してあるように、界面活性剤、蛋白変性剤等
による被検体の前処理が必要であり、操作が煩雑で時間
もかかるという問題がある。また、ELISA法、ドッ
トブロッティング法とも機器分析よりは迅速で簡便なも
のの、半日〜1日の時間を要し、操作においても熟練度
が必要であるという問題があった。一方、ラテックス凝
集法を用いた場合、測定操作は簡便でしかも迅速に測定
できるという利点はあるものの、B/F分離を行わない
ためELISA法やドットブロッティング法に比べ非特
異的な反応(凝集)が起こり易く、また、AGE化タン
パクを特異的に認識する抗体が感作されたラテックスの
保存安定性も悪いという欠点があった。
【0004】
【発明が解決しようとする課題】そこで、本発明者の目
的は、ELISA法やドットブロッティング法よりも更
に迅速かつ簡便にAGE化タンパクを測定でき、かつ非
特異的な凝集反応が起こりにくく、AGE化タンパクを
特異的に認識する抗体が感作されたラテックスの保存安
定性も良い、ラテックス凝集法によるAGE化タンパク
の定量用試薬を提供することにある。
的は、ELISA法やドットブロッティング法よりも更
に迅速かつ簡便にAGE化タンパクを測定でき、かつ非
特異的な凝集反応が起こりにくく、AGE化タンパクを
特異的に認識する抗体が感作されたラテックスの保存安
定性も良い、ラテックス凝集法によるAGE化タンパク
の定量用試薬を提供することにある。
【0005】本発明の他の目的は、本発明の上記定量用
試薬を用いてラテックス凝集法によりAGE化タンパク
を精度良く定量する方法を提供することにある。本発明
の更に他の目的および利点は、以下の説明から明らかに
なろう。
試薬を用いてラテックス凝集法によりAGE化タンパク
を精度良く定量する方法を提供することにある。本発明
の更に他の目的および利点は、以下の説明から明らかに
なろう。
【0006】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、試料中の
AGE化タンパクを測定するにあたり、AGE化タンパ
クを特異的に認識する抗体が感作されたラテックスと第
4級アンモニウム塩を共存させることによって非特異的
な凝集が抑制でき、しかも、AGE化タンパクを特異的
に認識する抗体が感作されたラテックスの保存安定性も
向上することを見出し、本発明を完成するに至った。
AGE化タンパクを測定するにあたり、AGE化タンパ
クを特異的に認識する抗体が感作されたラテックスと第
4級アンモニウム塩を共存させることによって非特異的
な凝集が抑制でき、しかも、AGE化タンパクを特異的
に認識する抗体が感作されたラテックスの保存安定性も
向上することを見出し、本発明を完成するに至った。
【0007】すなわち、本発明の上記目的および利点
は、第1に、AGE化タンパクを特異的に認識する抗体
が感作されたラテックスおよび第4級アンモニウム塩を
組み合わせてなる、AGE化タンパク定量用試薬によっ
て達成される。また、本発明の上記目的および利点は、
第2に、溶血試料中のAGE化タンパクを、AGE化タ
ンパクを特異的に認識する抗体が感作されたラテックス
と、第4級アンモニウム塩の存在下に免疫凝集反応せし
め、次いで免疫凝集物の濃度を測定することを特徴とす
る、AGE化タンパクの測定法によって達成される。
は、第1に、AGE化タンパクを特異的に認識する抗体
が感作されたラテックスおよび第4級アンモニウム塩を
組み合わせてなる、AGE化タンパク定量用試薬によっ
て達成される。また、本発明の上記目的および利点は、
第2に、溶血試料中のAGE化タンパクを、AGE化タ
ンパクを特異的に認識する抗体が感作されたラテックス
と、第4級アンモニウム塩の存在下に免疫凝集反応せし
め、次いで免疫凝集物の濃度を測定することを特徴とす
る、AGE化タンパクの測定法によって達成される。
【0008】
【発明の実施の形態】以下、本発明をより詳細に説明す
る。本発明のAGE化タンパクとは、メイラード反応の
後期段階反応に見られる3つの特徴的な現象(蛍光性、
褐色変化、および分子内/分子間架橋形成)の少なくと
も1つを伴う反応生成物が付加したタンパク、および/
或いはCM化タンパクを指す。3つの特徴的な現象の少
なくとも1つを伴う反応生成物として、例えば、ペント
シジン化タンパク、イミダゾロン化タンパク、クロスリ
ン化タンパク等が挙げられる。特に、CM化タンパクは
AGE化タンパクを特異的に認識する抗体の主要なエピ
トープであり、また、糖尿病性の合併症を発症している
患者においては該血中濃度が健常者のそれと比較して有
意に高いことから、糖尿病性合併症用マーカーとして好
適に用いられる。
る。本発明のAGE化タンパクとは、メイラード反応の
後期段階反応に見られる3つの特徴的な現象(蛍光性、
褐色変化、および分子内/分子間架橋形成)の少なくと
も1つを伴う反応生成物が付加したタンパク、および/
或いはCM化タンパクを指す。3つの特徴的な現象の少
なくとも1つを伴う反応生成物として、例えば、ペント
シジン化タンパク、イミダゾロン化タンパク、クロスリ
ン化タンパク等が挙げられる。特に、CM化タンパクは
AGE化タンパクを特異的に認識する抗体の主要なエピ
トープであり、また、糖尿病性の合併症を発症している
患者においては該血中濃度が健常者のそれと比較して有
意に高いことから、糖尿病性合併症用マーカーとして好
適に用いられる。
【0009】かかるAGEが付加したタンパクの種類と
しては特に限定はされないが、例えば、血中濃度の高い
アルブミン、寿命の長いヘモグロビン、沈着アミロイド
の主要成分であるβ2マイクログロブリン(β2M)、
動脈硬化の発症と関連の深い低密度リポタンパク(LD
L)や高密度リポタンパク(HDL)等が挙げらる。特
に、ヘモグロビンは血液中のタンパクの中でも最も寿命
が長いことが知られており、AGEが付加したタンパク
の中でも好適なタンパクとして用いられる。
しては特に限定はされないが、例えば、血中濃度の高い
アルブミン、寿命の長いヘモグロビン、沈着アミロイド
の主要成分であるβ2マイクログロブリン(β2M)、
動脈硬化の発症と関連の深い低密度リポタンパク(LD
L)や高密度リポタンパク(HDL)等が挙げらる。特
に、ヘモグロビンは血液中のタンパクの中でも最も寿命
が長いことが知られており、AGEが付加したタンパク
の中でも好適なタンパクとして用いられる。
【0010】AGE化タンパクを特異的に認識する抗体
(以下、「AGE化タンパク抗体」と呼ぶこともあ
る。)は、ポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体
でもよく、ポリクローナル抗体あるいはモノクローナル
抗体の作製は公知の方法に従って行うことが出来る。本
発明で用いるラテックスは、通常の免疫測定用担体とし
て用いられているもの、例えば、スチレン、プロピレ
ン、アクリルアミド、アクリロニトリル等の合成樹脂、
またはこれらにそれ自体公知の方法により反応性官能基
を導入したものであれば特に制限されず、使用できる。
(以下、「AGE化タンパク抗体」と呼ぶこともあ
る。)は、ポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体
でもよく、ポリクローナル抗体あるいはモノクローナル
抗体の作製は公知の方法に従って行うことが出来る。本
発明で用いるラテックスは、通常の免疫測定用担体とし
て用いられているもの、例えば、スチレン、プロピレ
ン、アクリルアミド、アクリロニトリル等の合成樹脂、
またはこれらにそれ自体公知の方法により反応性官能基
を導入したものであれば特に制限されず、使用できる。
【0011】ラテックスの形状は特に制限はされない
が、球状のものがラテックスの製造が容易なこと、或い
はAGE化タンパク抗体感作ラテックスの作製が容易な
こと、から一般的に用いられている。AGE化タンパク
を感作する球状ラテックスの平均粒子径は、抗原抗体反
応後の凝集の起こり易さや凝集度(濁度)の測定、凝集
度の判別のし易さなどの観点から0.05〜0.5μmで
あることが好ましい。
が、球状のものがラテックスの製造が容易なこと、或い
はAGE化タンパク抗体感作ラテックスの作製が容易な
こと、から一般的に用いられている。AGE化タンパク
を感作する球状ラテックスの平均粒子径は、抗原抗体反
応後の凝集の起こり易さや凝集度(濁度)の測定、凝集
度の判別のし易さなどの観点から0.05〜0.5μmで
あることが好ましい。
【0012】AGE化タンパク抗体のラテックスへの感
作は、一般的には物理的吸着法にて4〜50℃で行われ
るが、これに限定されず、例えば化学的にラテックス表
面に結合させてもよい。感作時のpHは特に制限はされ
ないが、抗体の立体構造の変化が起こりにくいpH4〜
10で感作を行うことが好ましい。通常、ラテックスに
対し0.001〜10重量%程度のAGE化タンパク抗
体を担持させたものが、AGE化タンパク抗体感作ラテ
ックスとしてAGE化タンパク定量用試薬に供される。
作は、一般的には物理的吸着法にて4〜50℃で行われ
るが、これに限定されず、例えば化学的にラテックス表
面に結合させてもよい。感作時のpHは特に制限はされ
ないが、抗体の立体構造の変化が起こりにくいpH4〜
10で感作を行うことが好ましい。通常、ラテックスに
対し0.001〜10重量%程度のAGE化タンパク抗
体を担持させたものが、AGE化タンパク抗体感作ラテ
ックスとしてAGE化タンパク定量用試薬に供される。
【0013】AGE化タンパク定量用試薬を構成する第
4級アンモニウム塩としては、例えば、塩化コリン、臭
化コリン、塩化アセチルコリン、臭化アセチルコリン、
塩化テトラメチルアンモニウム等が挙げられる。これら
の化合物は、1種類または2種類以上で使用される。抗
原抗体反応時の第4級アンモニウム塩の濃度は0.1重
量%以上であることが好ましい。これ以下の濃度だと、
第4級アンモニウム塩の添加効果が見られ難くなる。
4級アンモニウム塩としては、例えば、塩化コリン、臭
化コリン、塩化アセチルコリン、臭化アセチルコリン、
塩化テトラメチルアンモニウム等が挙げられる。これら
の化合物は、1種類または2種類以上で使用される。抗
原抗体反応時の第4級アンモニウム塩の濃度は0.1重
量%以上であることが好ましい。これ以下の濃度だと、
第4級アンモニウム塩の添加効果が見られ難くなる。
【0014】本発明のAGE化タンパク定量用試薬を用
いて、AGE化タンパクを測定する方法は、例えば、以
下のようにして行われる。AGE化タンパクを含むかも
しれない試料、およびAGE化タンパク抗体が感作され
たラテックスが含まれる溶液に、少なくとも1種類の第
4級アンモニウム塩を共存させて抗原抗体反応を起こさ
せ、吸光度を測定し、そしてこの測定値から試料中のA
GE化タンパクを定量する。
いて、AGE化タンパクを測定する方法は、例えば、以
下のようにして行われる。AGE化タンパクを含むかも
しれない試料、およびAGE化タンパク抗体が感作され
たラテックスが含まれる溶液に、少なくとも1種類の第
4級アンモニウム塩を共存させて抗原抗体反応を起こさ
せ、吸光度を測定し、そしてこの測定値から試料中のA
GE化タンパクを定量する。
【0015】上記試料としては、AGE化タンパクを含
むかもしれない試料であれば特に限定はされないが、本
発明のAGE化タンパク定量用試薬を臨床検査薬として
用いる場合の試料としては、血液、血漿、血清、尿等が
挙げられる。また、第4級アンモニウム塩は、試料ある
いはAGE化タンパク抗体が感作されたラテックスが含
まれる溶液に予め添加しておいても、或いは試料とAG
E化タンパク抗体が感作されたラテックスが含まれる溶
液を混合するする時に第4級アンモニウム塩の水溶液を
添加してもよい。
むかもしれない試料であれば特に限定はされないが、本
発明のAGE化タンパク定量用試薬を臨床検査薬として
用いる場合の試料としては、血液、血漿、血清、尿等が
挙げられる。また、第4級アンモニウム塩は、試料ある
いはAGE化タンパク抗体が感作されたラテックスが含
まれる溶液に予め添加しておいても、或いは試料とAG
E化タンパク抗体が感作されたラテックスが含まれる溶
液を混合するする時に第4級アンモニウム塩の水溶液を
添加してもよい。
【0016】上記抗原抗体反応開始後、上記混合液の吸
光度は340〜800nmの範囲から適切な波長を選択
して測定される。吸光度の測定は、特定の時間の吸光度
を求めてもよいし、特定の2点の吸光度を測定し、その
間の吸光度の増加分または単位時間当たりの増加分を求
めてもよい。AGE化タンパクの定量は、既知量のAG
E化タンパクを含む試料を用いて上記測定方法にて吸光
度または吸光度増加分を求め、AGE化タンパク濃度と
吸光度または吸光度増加分との関係から検量線を作成
し、次いで同一条件で未知量のAGE化タンパクを含む
試料の吸光度または吸光度増加分を求め、前記検量線か
ら吸光度または吸光度増加分に対応するAGE化タンパ
ク濃度を求めることにより行われる。
光度は340〜800nmの範囲から適切な波長を選択
して測定される。吸光度の測定は、特定の時間の吸光度
を求めてもよいし、特定の2点の吸光度を測定し、その
間の吸光度の増加分または単位時間当たりの増加分を求
めてもよい。AGE化タンパクの定量は、既知量のAG
E化タンパクを含む試料を用いて上記測定方法にて吸光
度または吸光度増加分を求め、AGE化タンパク濃度と
吸光度または吸光度増加分との関係から検量線を作成
し、次いで同一条件で未知量のAGE化タンパクを含む
試料の吸光度または吸光度増加分を求め、前記検量線か
ら吸光度または吸光度増加分に対応するAGE化タンパ
ク濃度を求めることにより行われる。
【0017】
【発明の効果】本発明のAGE化タンパク定量用試薬を
用いることにより、被検体中のAGE化タンパク濃度を
簡便かつ迅速に測定でき、かつ非特異的な凝集反応を抑
制できた。また、該試薬の構成成分であるAGE化タン
パク抗体が感作されたラテックスの保存安定性も向上す
る。
用いることにより、被検体中のAGE化タンパク濃度を
簡便かつ迅速に測定でき、かつ非特異的な凝集反応を抑
制できた。また、該試薬の構成成分であるAGE化タン
パク抗体が感作されたラテックスの保存安定性も向上す
る。
【0018】AGE化タンパク定量用試薬に第4級アン
モニウム塩を共存させることによって非特異的な凝集が
抑制できかつAGE化タンパク抗体感作ラテックスの保
存安定性を向上できる理由は必ずしも明らかではない
が、第4級アンモニウム塩を添加することにより反応系
内のイオン強度が高くなったことが一因となって、タン
パク間の非特異的な結合が抑制でき、ひいてはAGE化
タンパク抗体感作ラテックスの分散性も良くなり、保存
安定性が向上したのではないかと考えられる。
モニウム塩を共存させることによって非特異的な凝集が
抑制できかつAGE化タンパク抗体感作ラテックスの保
存安定性を向上できる理由は必ずしも明らかではない
が、第4級アンモニウム塩を添加することにより反応系
内のイオン強度が高くなったことが一因となって、タン
パク間の非特異的な結合が抑制でき、ひいてはAGE化
タンパク抗体感作ラテックスの分散性も良くなり、保存
安定性が向上したのではないかと考えられる。
【0019】
【実施例】以下、実施例を挙げて本発明を詳細に説明す
るが、本発明はこれらの実施例に制限されるものではな
い。
るが、本発明はこれらの実施例に制限されるものではな
い。
【0020】実施例1〜5 (1)CM化ヘモグロビン抗体の調製 ハイブリドーマ2B3株(寄託番号:生命研菌寄第16
632号(FERMP−16632))を、10%FC
Sを含むRPMI−1640培地で培養した。ハイブリ
ドーマの培養上清に等量の飽和硫酸アンモニウムを加
え、遠心分離し沈殿を分取した。この沈殿を少量の10
mMトリス塩酸緩衝液(pH8.5)に溶解させ、同じ
緩衝液に対して透析した。透析後遠心分離し不溶物を除
き、これをDEAE−セルロースカラムにかけた。緩衝
液で洗浄後、食塩濃度勾配により溶出しIgG画分を分
取した。この画分をゲル濾過HPLCカラム(バイオラ
ッド社、Bio−Sil TSK250)にかけ、クロ
マトグラフィーを行うことにより精製モノクローナル抗
体を得た。
632号(FERMP−16632))を、10%FC
Sを含むRPMI−1640培地で培養した。ハイブリ
ドーマの培養上清に等量の飽和硫酸アンモニウムを加
え、遠心分離し沈殿を分取した。この沈殿を少量の10
mMトリス塩酸緩衝液(pH8.5)に溶解させ、同じ
緩衝液に対して透析した。透析後遠心分離し不溶物を除
き、これをDEAE−セルロースカラムにかけた。緩衝
液で洗浄後、食塩濃度勾配により溶出しIgG画分を分
取した。この画分をゲル濾過HPLCカラム(バイオラ
ッド社、Bio−Sil TSK250)にかけ、クロ
マトグラフィーを行うことにより精製モノクローナル抗
体を得た。
【0021】(2)甲剤(CM化ヘモグロビン抗体担持ラ
テックス懸濁液)の調製 20mMリン酸緩衝液(pH7.2)で希釈した平均粒子
径0.32μm、ラテックス濃度1%のポリスチレン粒
子(藤倉化成(株)、Cat. No.2880)懸濁
液5mlと、20mMリン酸緩衝液(pH7.2)で希釈
した0.3mg/mlのCM化ヘモグロビン抗体溶液5
mlを混合し、37℃で1時間静置した。次いで、0.
25%牛血清アルブミン(SIGMA)を含む20mM
リン酸緩衝液(pH7.2)10mlを添加し、更に、3
7℃で2時間静置した。得られたCM化ヘモグロビン抗体
担持ラテックスを遠心分離にて20mMリン酸緩衝液
(pH7.2)で2回洗浄した後、33.5mlの100
mM塩化ナトリウム、0.1%アジ化ナトリウム、並び
に7.5%スクロースを含む100mMトリス塩酸緩衝
液(pH8.0)を沈さに加えて甲剤を調製した。
テックス懸濁液)の調製 20mMリン酸緩衝液(pH7.2)で希釈した平均粒子
径0.32μm、ラテックス濃度1%のポリスチレン粒
子(藤倉化成(株)、Cat. No.2880)懸濁
液5mlと、20mMリン酸緩衝液(pH7.2)で希釈
した0.3mg/mlのCM化ヘモグロビン抗体溶液5
mlを混合し、37℃で1時間静置した。次いで、0.
25%牛血清アルブミン(SIGMA)を含む20mM
リン酸緩衝液(pH7.2)10mlを添加し、更に、3
7℃で2時間静置した。得られたCM化ヘモグロビン抗体
担持ラテックスを遠心分離にて20mMリン酸緩衝液
(pH7.2)で2回洗浄した後、33.5mlの100
mM塩化ナトリウム、0.1%アジ化ナトリウム、並び
に7.5%スクロースを含む100mMトリス塩酸緩衝
液(pH8.0)を沈さに加えて甲剤を調製した。
【0022】(3)乙剤(緩衝液)の調製 100mM塩化ナトリウム、0.1%アジ化ナトリウ
ム、1.9%ポリビニルピロリドンK30(東京化成
(株)、分子量40,000)、並びに表1に示す塩化
コリン濃度となるように、100mMトリス塩酸緩衝液
(pH8.0)に加えて乙剤とした。
ム、1.9%ポリビニルピロリドンK30(東京化成
(株)、分子量40,000)、並びに表1に示す塩化
コリン濃度となるように、100mMトリス塩酸緩衝液
(pH8.0)に加えて乙剤とした。
【0023】(4)被検体 アミノ酸分析でカルボキシメチルバリン(以下、「CM
V」と呼ぶこともある。)濃度が確認されている糖尿病
患者の全血、赤血球画分、および血漿画分を用いた。ア
ミノ酸分析の結果から、該全血中、赤血球画分中、血漿
画分中のCMV濃度は、それぞれヘモグロビン1mg当
たり30pmol、30pmol、検出限界以下(2p
mol以下)であった。
V」と呼ぶこともある。)濃度が確認されている糖尿病
患者の全血、赤血球画分、および血漿画分を用いた。ア
ミノ酸分析の結果から、該全血中、赤血球画分中、血漿
画分中のCMV濃度は、それぞれヘモグロビン1mg当
たり30pmol、30pmol、検出限界以下(2p
mol以下)であった。
【0024】(5)測定法 乙剤220μlに被検体10μlをガラスセル中で添加
撹拌した後、37℃で約5分間静置した。次いで甲剤を
100μl添加して撹拌し、30秒後から200秒まで
の波長804nmにおける光学密度変化量を測定し、光
学密度変化量から被検体中のCM化ヘモグロビン濃度を
求めた。以上の操作には、自動分析装置TBA−30R
形(東芝メディカル)を用いた。
撹拌した後、37℃で約5分間静置した。次いで甲剤を
100μl添加して撹拌し、30秒後から200秒まで
の波長804nmにおける光学密度変化量を測定し、光
学密度変化量から被検体中のCM化ヘモグロビン濃度を
求めた。以上の操作には、自動分析装置TBA−30R
形(東芝メディカル)を用いた。
【0025】(6)甲剤(CM化ヘモグロビン)の保存
安定性の評価 試薬を静置し、転倒混和せずに37℃、5日間保存後の
感度(30秒後から200秒までの波長804nmにお
ける光学密度変化量)を測定した。その結果を表1に示
した。
安定性の評価 試薬を静置し、転倒混和せずに37℃、5日間保存後の
感度(30秒後から200秒までの波長804nmにお
ける光学密度変化量)を測定した。その結果を表1に示
した。
【0026】
【表1】
【0027】実施例6 CM化ヘモグロビン抗体の代わりにAGE化ヘモグロビ
ン抗体を用いたこと以外は実施例1と同様の操作で行っ
た。結果を表1に示した。尚、AGE化ヘモグロビン抗
体は、以下のように作製した。
ン抗体を用いたこと以外は実施例1と同様の操作で行っ
た。結果を表1に示した。尚、AGE化ヘモグロビン抗
体は、以下のように作製した。
【0028】(1)AGE化ヘモグロビンの作製 0.15Mの塩化ナトリウムを含む0.5Mリン酸緩衝液1
mlに、ヒトヘモグロビン(SIGMA、フラクション
V)を6mg/ml、グルコースを0.17Mとなるよ
うに溶解した。この溶解液を0.22μmのフィルター
で濾過した後、37℃で2ヶ月間静置した。次いで、2
0mMリン酸緩衝液(pH7.4)で4℃にて2日間透
析され、未反応のグルコースを除去した後に、AGE化
ヘモグロビン抗体作製のための免疫原として供された。
mlに、ヒトヘモグロビン(SIGMA、フラクション
V)を6mg/ml、グルコースを0.17Mとなるよ
うに溶解した。この溶解液を0.22μmのフィルター
で濾過した後、37℃で2ヶ月間静置した。次いで、2
0mMリン酸緩衝液(pH7.4)で4℃にて2日間透
析され、未反応のグルコースを除去した後に、AGE化
ヘモグロビン抗体作製のための免疫原として供された。
【0029】(2)AGE化ヘモグロビン抗体の作製 体重が2kg以上のウサギに、上記作製したAGE化ヘ
モグロビンを抗原として、以下の要領で免疫した。2m
g/mlになるように調製した該抗原溶液0.5ml
に、フロイントの完全アジュバント0.5mlを加えた
ものをウサギの耳静脈に注射した。その後、2週間おき
に2mg/mlの該抗原溶液0.25mlにフロイント
の不完全アジュバント0.25mlを加えたものを追加
免疫した。この間、AGE化ヘモグロビン抗体が産生さ
れたか否かを確認するために、2週間に1回ウサギの外
縁耳静脈から部分採血した。6週間後、AGE化ヘモグ
ロビン抗体が産生されたことを酵素免疫測定(ELIS
A)法で確認し、全採血した。
モグロビンを抗原として、以下の要領で免疫した。2m
g/mlになるように調製した該抗原溶液0.5ml
に、フロイントの完全アジュバント0.5mlを加えた
ものをウサギの耳静脈に注射した。その後、2週間おき
に2mg/mlの該抗原溶液0.25mlにフロイント
の不完全アジュバント0.25mlを加えたものを追加
免疫した。この間、AGE化ヘモグロビン抗体が産生さ
れたか否かを確認するために、2週間に1回ウサギの外
縁耳静脈から部分採血した。6週間後、AGE化ヘモグ
ロビン抗体が産生されたことを酵素免疫測定(ELIS
A)法で確認し、全採血した。
【0030】(3)アフィニティ精製カラムの作製 25mlのアフィゲル15(BIO−RAD)を75m
lの10mM酢酸緩衝液(pH4.5)で洗浄した後、
10mg/mlのヒトヘモグロビン溶液を62.5ml
加え、室温で緩やかに撹拌した。次いで、未反応のヒト
ヘモグロビンを濾過にて除去し、1Mのエタノールアミ
ンを30ml加え、室温で緩やかに撹拌し、未反応のN
−ヒドロキシサクシイミドエステルをブロッキングし
た。該ヒトヘモグロビンを固定化した支持体をカラムに
詰め、280nmの吸光度が0になるまでイオン交換水
で洗浄した。更に、0.15Mの塩化ナトリウムを含む
20mMのリン酸緩衝液(pH7.4)でカラムを平衡
化した。
lの10mM酢酸緩衝液(pH4.5)で洗浄した後、
10mg/mlのヒトヘモグロビン溶液を62.5ml
加え、室温で緩やかに撹拌した。次いで、未反応のヒト
ヘモグロビンを濾過にて除去し、1Mのエタノールアミ
ンを30ml加え、室温で緩やかに撹拌し、未反応のN
−ヒドロキシサクシイミドエステルをブロッキングし
た。該ヒトヘモグロビンを固定化した支持体をカラムに
詰め、280nmの吸光度が0になるまでイオン交換水
で洗浄した。更に、0.15Mの塩化ナトリウムを含む
20mMのリン酸緩衝液(pH7.4)でカラムを平衡
化した。
【0031】(4)AGE化ヘモグロビン抗体のアフィ
ニティ精製 作製したAGE化ヘモグロビン抗体を1mg/mlにな
るように0.15Mの塩化ナトリウムを含む20mMの
リン酸緩衝液(pH7.4)で希釈したものを、100
mg程度になるように該アフィニティ精製カラムにアプ
ライした。次いで、280nmの吸光度が0になるまで
前記リン酸緩衝液を流速0.5ml/minで流した。
カラムに結合しなかった抗体をAGE化ヘモグロビン抗
体として回収した。280nmの吸光度が0になったと
ころで、リン酸緩衝液から0.1Mのグリシン緩衝液
(pH3.0)に換え、カラムに結合している抗体を溶
離させ、0.15Mの塩化ナトリウムを含む20mMリ
ン酸緩衝液(pH7.4)でカラムを平衡化し、回収し
た抗体を再度カラムにアプライし、カラムに結合しなか
った抗体を回収した。次いで、50mMのグリシン緩衝
液(pH8.2)で透析し、ラテックス凝集法の抗体と
して供された。
ニティ精製 作製したAGE化ヘモグロビン抗体を1mg/mlにな
るように0.15Mの塩化ナトリウムを含む20mMの
リン酸緩衝液(pH7.4)で希釈したものを、100
mg程度になるように該アフィニティ精製カラムにアプ
ライした。次いで、280nmの吸光度が0になるまで
前記リン酸緩衝液を流速0.5ml/minで流した。
カラムに結合しなかった抗体をAGE化ヘモグロビン抗
体として回収した。280nmの吸光度が0になったと
ころで、リン酸緩衝液から0.1Mのグリシン緩衝液
(pH3.0)に換え、カラムに結合している抗体を溶
離させ、0.15Mの塩化ナトリウムを含む20mMリ
ン酸緩衝液(pH7.4)でカラムを平衡化し、回収し
た抗体を再度カラムにアプライし、カラムに結合しなか
った抗体を回収した。次いで、50mMのグリシン緩衝
液(pH8.2)で透析し、ラテックス凝集法の抗体と
して供された。
【0032】比較例1 塩化コリンを用いない以外は実施例1と同様の操作で行
った。結果を表1に示した。
った。結果を表1に示した。
【0033】比較例2 8%塩化コリンの代わりに、0.01%塩化コリンを用
いたこと以外は実施例1と同様の操作で行った。結果を
表1に示した。
いたこと以外は実施例1と同様の操作で行った。結果を
表1に示した。
Claims (3)
- 【請求項1】 AGE化タンパクを特異的に認識する抗
体が感作されたラテックスおよび第4級アンモニウム塩
を組み合わせてなる、AGE化タンパク定量用試薬。 - 【請求項2】 AGE化タンパクを特異的に認識する抗
体がカルボキシメチル化タンパクを特異的に認識する抗
体である請求項1に記載の定量試薬。 - 【請求項3】 溶血試料中のAGE化タンパクを、AG
E化タンパクを特異的に認識する抗体が感作されたラテ
ックスと、第4級アンモニウム塩の存在下に免疫凝集反
応せしめ、次いで免疫凝集物の濃度を測定することを特
徴とする、AGE化タンパクの測定法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP11178168A JP2001004624A (ja) | 1999-06-24 | 1999-06-24 | Age化タンパクの定量用試薬および測定法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP11178168A JP2001004624A (ja) | 1999-06-24 | 1999-06-24 | Age化タンパクの定量用試薬および測定法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2001004624A true JP2001004624A (ja) | 2001-01-12 |
Family
ID=16043813
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP11178168A Withdrawn JP2001004624A (ja) | 1999-06-24 | 1999-06-24 | Age化タンパクの定量用試薬および測定法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP2001004624A (ja) |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP1243924A1 (en) * | 2001-03-22 | 2002-09-25 | Boehringer Mannheim Gmbh | Reagents and solid phase components in specific binding assays free of advanced glycosylation endproducts |
WO2004086040A1 (ja) * | 2003-03-24 | 2004-10-07 | Mitsubishi Kagaku Iatron, Inc. | アディポネクチン分析用ラテックス試薬及びアディポネクチン分析方法 |
WO2007037554A1 (ja) * | 2005-09-30 | 2007-04-05 | Kurume University | 終末糖化産物吸着剤 |
-
1999
- 1999-06-24 JP JP11178168A patent/JP2001004624A/ja not_active Withdrawn
Cited By (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP1243924A1 (en) * | 2001-03-22 | 2002-09-25 | Boehringer Mannheim Gmbh | Reagents and solid phase components in specific binding assays free of advanced glycosylation endproducts |
WO2004086040A1 (ja) * | 2003-03-24 | 2004-10-07 | Mitsubishi Kagaku Iatron, Inc. | アディポネクチン分析用ラテックス試薬及びアディポネクチン分析方法 |
JPWO2004086040A1 (ja) * | 2003-03-24 | 2006-06-29 | 株式会社三菱化学ヤトロン | アディポネクチン分析用ラテックス試薬及びアディポネクチン分析方法 |
US7659125B2 (en) | 2003-03-24 | 2010-02-09 | Mitsubishi Kagaku Latron, Inc. | Latex reagent for adiponectin analysis and method of adiponectin analysis |
JP4509933B2 (ja) * | 2003-03-24 | 2010-07-21 | 三菱化学メディエンス株式会社 | アディポネクチン分析用ラテックス試薬及びアディポネクチン分析方法 |
WO2007037554A1 (ja) * | 2005-09-30 | 2007-04-05 | Kurume University | 終末糖化産物吸着剤 |
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A300 | Withdrawal of application because of no request for examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A300 Effective date: 20060905 |