JP3952499B2 - 共焦点スキャナ顕微鏡 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、共焦点スキャナ顕微鏡に関し、特に、画質と感度の改善に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
従来より共焦点スキャナ顕微鏡はよく知られている（例えば、特許文献１参照。）。図４はそのような共焦点スキャナ顕微鏡の要部の原理構成図である。図４において、レーザ光源１から発せられたレーザ光束は、まず励起フィルター（図示せず）を通して、光源の余分な波長成分を取り除き励起に使用する波長成分のみを出射させる。
【０００３】
この出射光（レーザ光）は適当なビーム径に広げられた後、スキャナ部のマイクロレンズアレイディスク２のマイクロレンズアレイに入射する。一つ一つのマイクロレンズでレーザ光は各々に対応配置されたピンホールディスク３のピンホール上に集光される。
【０００４】
この集光によって、ピンホールディスク３を通過できる光量は大幅に向上される。また同時に、ピンホール以外のディスク表面での反射光（ノイズ光）が減少し、Ｓ／Ｎ比も向上される。
【０００５】
この場合、マイクロレンズアレイディスク２とピンホールディスク３の間にはダイクロイックミラー４が配置されており、励起光はこのダイクロイックミラー４を透過する。
【０００６】
ピンホールディスク３のピンホールを出たレーザ光は、対物レンズ５を通過後サンプル６を励起する。サンプル６から出た蛍光は再び対物レンズ５とピンホールディスク３のピンホールを通過し、ダイクロイックミラー４で反射して観察光路系に導かれる。
【０００７】
スキャナ部から観察光路系に出射された蛍光は、そこに混入している励起光の反射や迷光成分がバリアフィルタ７で除去されてHARP膜を用いたいわゆるHARP方式の高感度撮像カメラ８に入り、サンプル６の蛍光像がこのカメラ８で観測される（HARP膜については例えば非特許文献１参照、HARPカメラについては例えば非特許文献２参照）。
なお、マイクロレンズアレイディスク２とピンホールディスク３は一体構造化されており、回転により観察領域全体をスキャンすることができるようになっている。
【０００８】
【特許文献１】
特開平５−６０９８０号公報 （第３頁、第１図）
【０００９】
【非特許文献１】
「固体撮像デバイス用高感度HARP膜」、［online］、［2002年8月27日検索］、インターネット＜URL：http://www.nhk.or.jp/strl/open99/ki-1/HARP.html＞
【００１０】
【非特許文献２】
"Ultrahigh-sensitivity HDTV Super-HARP Handheld Camera"、［online］、
［2002年8月27日検索］、インターネット＜URL：http://www.nhk.or.jp/strl/open2002/en/tenji/id21/21.html＞
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、このような従来の装置においては、その共焦点光スキャナ部分については結像特性の向上や、ピンホールディスク面からの表面反射の低減が図れるなどの利点を有するものの、カメラ撮像においては次のような課題があった。
（１）蛍光分子が少ない場合（最小の場合は１個）には、リアルタイム計測、あるいはズームアップや３次元計測では感度が低すぎて観察できない。
（２）サンプルからの蛍光が赤色の発光の場合、ＨＡＲＰ方式の高感度撮像カメラ（HARP方式は日本放送協会NHKにより開発された方式である）などの感度特性は半導体薄膜のバンドギャップに依存しているため、赤色の帯域では１／１０になってしまう。
【００１２】
代表的なＨＡＲＰ方式の撮像カメラの特性を図５に示す。Ｂ/Ｇｃｈは感光膜にアモルファスセレンを用い、Ｒｃｈはこれにテルルを加えているが、６００〜７００ｎｍの赤色で必要な感度は緑の１／４〜１／１０００以下と極めて低くなっている。
【００１３】
本発明の目的は、上記の課題を解決するもので、イメージ・インテンシファイヤを用いることにより高感度撮像カメラの波長による感度低下の影響をなくし、高画質、高感度の蛍光像を得ることのできる共焦点スキャナ顕微鏡を実現することにある。
本発明の他の目的は、光検出部にフィルタを配置し、このフィルタの特性を変えることにより、容易にサンプルの蛍光物質の種類を同定することができるようにした共焦点スキャナ顕微鏡を実現することにある。
【００１４】
【課題を解決するための手段】
このような目的を達成するために、本発明では、
サンプルを励起する励起光を発する光源部と、前記励起光を用いてサンプルを複数のビームで走査するスキャナ部と、緑色で高感度の特性を有し前記サンプルから発光した蛍光を受けてサンプルの画像を撮像する撮像カメラを有した共焦点スキャナ顕微鏡において、
ＨＡＲＰ方式の撮像カメラと、
前記サンプルから発光した蛍光を増幅すると共に入力光が緑色に変換されて出力されるイメージインテンシファイアと、
このイメージインテンシファイアと前記ＨＡＲＰ方式の撮像カメラの間に配置されイメージインテンシファイアの出力光を集光するレンズと、
前記ＨＡＲＰ方式の撮像カメラの出力を受けてサンプルの蛍光像を画面表示する手段
を具備したことを特徴とする。
【００１５】
サンプルから発光した蛍光をイメージインテンシファイアで高増幅するため、高感度に観測できる。従来のように蛍光分子が少ないとき感度が低すぎて観察できないという問題は生じない。
また、イメージインテンシファイアを介在させることにより、入力の蛍光はすべて緑色に変換されてＨＡＲＰ方式の撮像カメラに入射するため、ＨＡＲＰ方式の撮像カメラの赤方での感度低下の問題も解消されて、すべての蛍光像が高感度に撮像できるという効果がある。
【００１６】
この場合、請求項２のように、前記サンプルから発光した蛍光における異なる波長の光を個別に透過する複数のフィルタを備え、各フィルタを切換えてフィルタを透過した光が前記イメージインテンシファイアに入射するように構成することができる。
このように透過波長の異なるフィルタを用いると、容易に蛍光の各波長の光を個別に取り出してカメラで撮像することができる。
【００１７】
さらに、請求項３のように、前記フィルタの特性を変えて透過波長領域を変えれば、前記サンプルの蛍光物質を同定することができる。
【００１８】
また、請求項４のように、前記サンプルから発光した蛍光をその異なる波長の光ごとに分岐する分岐手段と、前記イメージインテンシファイアとレンズとＨＡＲＰ方式の撮像カメラでなる複数組の検出系を備え、前記分岐手段からの分岐光を別々に前記検出系に導き、複数の分岐光を同時に観測できるように構成することもできる。
【００１９】
また、請求項５のように、透過波長域を狭め目的の波長域の光を透過させるバリアフィルタを複数個備え、この各バリアフィルタを通して分岐手段の出力光を前記各イメージインテンシファイアに与えるようにすることもできる。
バリアフィルタを用いることにより目的の波長以外の光を除去することができ、高画質の画像を得ることができる。
【００２０】
また、請求項６のように、サンプルの蛍光像を画面表示する手段は、カラー再構成を行って蛍光像を表示できるように構成することもできる。
【００２１】
【発明の実施の形態】
以下図面を用いて本発明を詳しく説明する。図１は本発明に係る共焦点スキャナ顕微鏡の一実施例を示す概念的構成図である。図１において、図４と同等部分には同一符号を付してある。図４と異なるところは、光源部１０、光検出部２０、画像収集装置３０および画像表示装置４０である。
【００２２】
光源部１０は、複数の多波長光源１１ａ，１１ｂ，１１ｃと、光透過帯域の異なるフィルタ１２ａ，１２ｂ，１２ｃと、混合用のダイクロイックミラー１３ａ，１３ｂ，１３ｃと、スイッチング機構１４から構成されている。
【００２３】
各多波長光源１１ａ，１１ｂ，１１ｃの出力光をフィルタ１２ａ，１２ｂ，１２ｃを通すことによりそれぞれＲ、Ｇ、Ｂの波長成分の光が取り出される。ダイクロイックミラー１３ａ，１３ｂ，１３ｃの部分ではこのＲ、Ｇ、Ｂ光を合成し、白色光として出射する。
【００２４】
スイッチング機構１４はこの白色光の通過と遮断を制御するものである。スイッチング機構１４を通過した光は光ファイバ１５を経由してミラー１６に入射する。ミラー１６はこの光を反射してレンズ１７に入射する。レンズ１７は入射光を平行光として、マイクロレンズアレイディスク２に入射する。
【００２５】
光検出部２０は、フィルタ２１と、イメージインテンシファイア２３と、レンズ２４と撮像カメラ８より構成されている。
フィルタ２１は透過波長特性の異なる複数のフィルタから構成されており、その各フィルタは択一的に選択できるように構成されている。選択機構としては、例えば、円板に複数のフィルタを配列しておき、円板の回転によりフィルタを切換えるなどの機構を用いることができる。
【００２６】
フィルタ切り換え期間中は、光源部１０のスイッチング機構１４により合成光を遮断し、サンプル６への励起光照射を中止する。なお、遮断する必要がない場合は、常時通過の状態にするか、またはスイッチング機構１４を除去しておいても構わない。
【００２７】
イメージインテンシファイア２３はフォトンを１００倍程度増幅する。なお、増幅率は可視光の範囲でほぼ一定であり、またその出力は緑色蛍光発光体である。出力が緑色蛍光発光体であるため、すべての入射光は緑色に変換される。
このイメージインテンシファイア２３の出力光はレンズ２４により集光されて撮像カメラ８に入射する。
【００２８】
撮像カメラ８は、撮像画像を増幅し、電気信号に変換して出力する。なお、このHARP方式などの撮像カメラの感度特性は、半導体薄膜のバンドギャップに依存していて、赤方では１／４〜１／１０００に低下する。しかし、本発明では、前述のように撮像カメラは緑色の光しか撮像しないので赤方での感度低下に影響されることはない。
【００２９】
画像収集装置３０は撮像カメラ８が出力する電気信号を画像データに変換して保存する。
画像表示装置４０は、通常コンピュータが用いられ、画像収集装置３０に格納された画像を読み出し、適宜に処理を行って表示画面に表示する。
【００３０】
このような構成における動作を次に説明する。光源部１０では３つの多波長光源１１ａ，１１ｂ，１１ｃから発せられた光をそれぞれフィルタ１２ａ，１２ｂ，１２ｃを通して、Ｒ、Ｇ、Ｂの光を得て、これをダイクロイックミラー１３ａ，１３ｂ，１３ｃにより合成する。合成された白色光はスイッチング機構１４を通過して光ファイバ１５に入射する。
【００３１】
光ファイバ１５から出射された光はミラー１６で反射しレンズ１７に入射する。レンズ１７により平行光となった光はマイクロレンズアレイディスク２に入射する。なお、光ファイバ１５の出力光を直接レンズ１７に入射させることができる場合には、ミラー１６は不要である。
【００３２】
レンズ１７の出力光をマイクロレンズアレイディスク２に入射した後、サンプル６からの蛍光をダイクロイックミラー４にて反射して取り出すまでの動作は、従来装置と同じであり、ここではその説明を省略する。
【００３３】
サンプル６から発せられる蛍光には通常複数の波長が含まれている。そこで、フィルタ２１を切換えて各波長の蛍光を個別に透過させる。フィルタを透過した蛍光はイメージインテンシファイア２３で増幅され、その出力光はレンズ２４で集光され撮像カメラ８に入射する。撮像カメラ８の受像面（図示せず）に結像したサンプル６の蛍光像が撮影される。
【００３４】
イメージインテンシファイア２３の出力光は、フィルタの透過光とは無関係に常に緑色である。撮像カメラ８ではこの緑色に変換された蛍光像を撮像する。画像収集装置３０では、選択したフィルタの種類（または透過波長）の情報と撮像カメラ８の出力画像（緑色画像）信号とを関連付けて保存する。
【００３５】
画像表示装置４０は、画像収集装置３０に保存された画像データとフィルタの情報を読み出し、元の蛍光色に再構成（カラー再構成）して蛍光画像を画面表示する。また、カラー再構成しないで蛍光画像を表示させることももちろん可能である。
【００３６】
このようにして、フィルタの透過波長を時分割で変えて蛍光画像を観察することができる。このとき、フィルタの特性を変えることにより蛍光物質の種類を同定することも可能である。
【００３７】
さらに、本発明ではイメージインテンシファイアにより蛍光を高増幅するため、蛍光分子が少なくても画像として表示でき、確実に観測することができる。また、イメージインテンシファイアによりすべての蛍光は緑色に変換されるため、撮像カメラでは、従来のような赤方での感度低下に影響されることなく、すべての蛍光を同一感度で撮像することができる。
【００３８】
また、インテンシファイア２３とレンズ２４を用いたことにより、従来よりも高画質を維持しながら、１００倍程度の高感度化が得られる。
加えて、光導電膜のバンドギャップ以下の長波長（赤）領域の感度は、撮像カメラの長波長側の感度落ち込みがなく、カメラの赤色の感度低下を１／１０とした場合、イメージインテンシファイアの高感度化１００倍と合わせて本発明では１０００倍程度の高感度化が達成される。
【００３９】
図２は本発明の他の実施例図である。図１に示す実施例ではフィルタの波長を変えて波長の異なる蛍光を時分割で計測しているのに対し、本実施例ではダイクロイックミラーを使用して波長の異なる蛍光を同時計測するようにしている。
【００４０】
図２において図１と異なるところは光検出部２０ａである。光検出部２０ａは、３組の検出系すなわち、ダイクロイックミラー、イメージインテンシファイア、レンズおよび撮像カメラからなる３組の検出系で構成されている。
【００４１】
ダイクロイックミラー２２ａ，２２ｂ，２２ｃは、蛍光に含まれる３つの波長の光を分岐するものである。なお、本実施例では波長の数に合わせて３分岐以外も可能である。その場合、分岐数に見合う個数のダイクロイックミラー、イメージインテンシファイア、レンズ、撮像カメラが必要である。
【００４２】
例えば、第１のダイクロイックミラー２２ａでは波長λ１の光を透過し、他の波長の光は反射する。次に、第２のダイクロイックミラー２２ｂでは、第１のダイクロイックミラー２２ａで反射した光を受けて、波長λ２の光を反射し、他の波長の光を透過する。第３のダイクロイックミラー２２ｃでは第２のダイクロイックミラー２２ｂを透過した光を受けて、波長λ３の光を反射する。
【００４３】
このようにして３つのダイクロイックミラー２２ａ，２２ｂ，２２ｃにより分岐して、３つの波長の蛍光をそれぞれ個別に出力する。なお、各イメージインテンシファイアは、その入力面が前記各蛍光の実像面に一致するように配置される。
【００４４】
各イメージインテンシファイア２３ａ，２３ｂ，２３ｃは、図１のイメージインテンシファイアと同じ特性のものが使用される。この各イメージインテンシファイアの出力光はレンズ２４ａ，２４ｂ，２４ｃによってそれぞれ集光され撮像カメラ８ａ，８ｂ，８ｃに入射する。
【００４５】
撮像カメラ８ａ，８ｂ，８ｃは、図１の撮像カメラ８と同一の感度特性を有し、イメージインテンシファイアからの緑色の光をそれぞれ撮影する。よって、すべての蛍光を同一感度で撮像することができる。
【００４６】
３台の撮像カメラはそれぞれ撮像画像（緑色画像）を電気信号に変換して出力する。画像収集装置３０は、この電気信号をデジタル画像データに変換し、ダイクロイックミラーで分岐した蛍光の色と対応付けて保存する。
画像表示装置４０は、画像収集装置３０に保存された画像データを読み出し適宜の処理を施して蛍光画像を画面に表示する。このとき、当該画像に対応付けられた色に再構成（カラー再構成）して、表示する。
【００４７】
このようにして、ダイクロイックミラーにより分岐した波長の各蛍光像を同時計測することができる。
なお、本実施例においても図１の場合と同様に、容易に高画質、高感度化を実現することができる。
【００４８】
図３は本発明のさらに他の実施例図である。図２と異なるところは各イメージインテンシファイア２３ａ，２３ｂ，２３ｃの前にバリアフィルタ２５ａ，２５ｂ，２５ｃをそれぞれ配置した点である。このバリアフィルタで透過波長領域を狭めることにより、目的とする波長以外を除去し目的とする波長のみをイメージインテンシファイアに入射させることができ、画像のＳＮ比を向上することができる。
【００４９】
なお、本発明は、上記実施例に限定されることなく、その本質から逸脱しない範囲で更に多くの変更、変形をも含むものである。
【００５０】
【発明の効果】
以上説明したように本発明によれば次のような効果がある。
（１）イメージインテンシファイアとその出力光を集光するレンズを配置してＨＡＲＰ方式の撮像カメラではすべて緑色に変換された実像が撮影されるようにしたことにより、容易に、高画質を維持しながら、従来の装置よりも１００倍程度の高感度の画像を得ることができる。
【００５１】
（２）さらに、光導電膜のバンドギャップ以下の長波長（赤色）領域については、ＨＡＲＰ方式の撮像カメラで撮影しないので、従来装置におけるようなＨＡＲＰ方式の撮影カメラでの長波長側の感度落ち込みはない。等価的に、長波長領域の感度は１０００倍程度となる。なお、これは、ＨＡＲＰ方式だけでなく赤に感度の低い他の方式の撮像カメラでも、同様の効果が得られ、有効である。
【００５２】
（３）また、図１の実施例においてフィルタの透過波長特性を変えることにより容易に蛍光物質の同定が可能となる。
（４）イメージインテンシファイアの前にバリアフィルタを配置して透過波長領域を狭めることにより、容易に画像のＳＮ比を上げることができる。
（５）また、フィルタを変えた画面あるいはダイクロイックミラーで分岐した画面を複数種類得ることにより、容易に撮像画像のカラー化を図ることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明に係る共焦点スキャナ顕微鏡の一実施例を示す構成図である。
【図２】本発明の他の実施例を示す構成図である。
【図３】本発明のさらに他の実施例を示す構成図である。
【図４】従来の共焦点スキャナ顕微鏡の要部構成図である。
【図５】ＨＡＲＰ方式の撮像カメラの特性の一例を示す図である。
【符号の説明】
２ マイクロレンズアレイディスク
３ ピンホールディスク
４ ダイクロイックミラー
５ 対物レンズ
６ サンプル
８，８ａ，８ｂ，８ｃ 撮像カメラ
１０ 光源部
１１ａ，１１ｂ，１１ｃ 多波長光源
１２ａ，１２ｂ，１２ｃ フィルタ
１３ａ，１３ｂ，１３ｃ ダイクロイックミラー
１４ スイッチング機構
１５ 光ファイバ
１６ ミラー
１７ レンズ
２０，２０ａ，２０ｂ 光検出部
２１ フィルタ
２２ａ，２２ｂ，２２ｃ ダイクロイックミラー
２３，２３ａ，２３ｂ，２３ｃ イメージインテンシファイア
２４，２４ａ，２４ｂ，２４ｃ レンズ
２５ａ，２５ｂ，２５ｃ バリアフィルタ
３０ 画像収集装置
４０ 画像表示装置
【発明の属する技術分野】
本発明は、共焦点スキャナ顕微鏡に関し、特に、画質と感度の改善に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
従来より共焦点スキャナ顕微鏡はよく知られている（例えば、特許文献１参照。）。図４はそのような共焦点スキャナ顕微鏡の要部の原理構成図である。図４において、レーザ光源１から発せられたレーザ光束は、まず励起フィルター（図示せず）を通して、光源の余分な波長成分を取り除き励起に使用する波長成分のみを出射させる。
【０００３】
この出射光（レーザ光）は適当なビーム径に広げられた後、スキャナ部のマイクロレンズアレイディスク２のマイクロレンズアレイに入射する。一つ一つのマイクロレンズでレーザ光は各々に対応配置されたピンホールディスク３のピンホール上に集光される。
【０００４】
この集光によって、ピンホールディスク３を通過できる光量は大幅に向上される。また同時に、ピンホール以外のディスク表面での反射光（ノイズ光）が減少し、Ｓ／Ｎ比も向上される。
【０００５】
この場合、マイクロレンズアレイディスク２とピンホールディスク３の間にはダイクロイックミラー４が配置されており、励起光はこのダイクロイックミラー４を透過する。
【０００６】
ピンホールディスク３のピンホールを出たレーザ光は、対物レンズ５を通過後サンプル６を励起する。サンプル６から出た蛍光は再び対物レンズ５とピンホールディスク３のピンホールを通過し、ダイクロイックミラー４で反射して観察光路系に導かれる。
【０００７】
スキャナ部から観察光路系に出射された蛍光は、そこに混入している励起光の反射や迷光成分がバリアフィルタ７で除去されてHARP膜を用いたいわゆるHARP方式の高感度撮像カメラ８に入り、サンプル６の蛍光像がこのカメラ８で観測される（HARP膜については例えば非特許文献１参照、HARPカメラについては例えば非特許文献２参照）。
なお、マイクロレンズアレイディスク２とピンホールディスク３は一体構造化されており、回転により観察領域全体をスキャンすることができるようになっている。
【０００８】
【特許文献１】
特開平５−６０９８０号公報 （第３頁、第１図）
【０００９】
【非特許文献１】
「固体撮像デバイス用高感度HARP膜」、［online］、［2002年8月27日検索］、インターネット＜URL：http://www.nhk.or.jp/strl/open99/ki-1/HARP.html＞
【００１０】
【非特許文献２】
"Ultrahigh-sensitivity HDTV Super-HARP Handheld Camera"、［online］、
［2002年8月27日検索］、インターネット＜URL：http://www.nhk.or.jp/strl/open2002/en/tenji/id21/21.html＞
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、このような従来の装置においては、その共焦点光スキャナ部分については結像特性の向上や、ピンホールディスク面からの表面反射の低減が図れるなどの利点を有するものの、カメラ撮像においては次のような課題があった。
（１）蛍光分子が少ない場合（最小の場合は１個）には、リアルタイム計測、あるいはズームアップや３次元計測では感度が低すぎて観察できない。
（２）サンプルからの蛍光が赤色の発光の場合、ＨＡＲＰ方式の高感度撮像カメラ（HARP方式は日本放送協会NHKにより開発された方式である）などの感度特性は半導体薄膜のバンドギャップに依存しているため、赤色の帯域では１／１０になってしまう。
【００１２】
代表的なＨＡＲＰ方式の撮像カメラの特性を図５に示す。Ｂ/Ｇｃｈは感光膜にアモルファスセレンを用い、Ｒｃｈはこれにテルルを加えているが、６００〜７００ｎｍの赤色で必要な感度は緑の１／４〜１／１０００以下と極めて低くなっている。
【００１３】
本発明の目的は、上記の課題を解決するもので、イメージ・インテンシファイヤを用いることにより高感度撮像カメラの波長による感度低下の影響をなくし、高画質、高感度の蛍光像を得ることのできる共焦点スキャナ顕微鏡を実現することにある。
本発明の他の目的は、光検出部にフィルタを配置し、このフィルタの特性を変えることにより、容易にサンプルの蛍光物質の種類を同定することができるようにした共焦点スキャナ顕微鏡を実現することにある。
【００１４】
【課題を解決するための手段】
このような目的を達成するために、本発明では、
サンプルを励起する励起光を発する光源部と、前記励起光を用いてサンプルを複数のビームで走査するスキャナ部と、緑色で高感度の特性を有し前記サンプルから発光した蛍光を受けてサンプルの画像を撮像する撮像カメラを有した共焦点スキャナ顕微鏡において、
ＨＡＲＰ方式の撮像カメラと、
前記サンプルから発光した蛍光を増幅すると共に入力光が緑色に変換されて出力されるイメージインテンシファイアと、
このイメージインテンシファイアと前記ＨＡＲＰ方式の撮像カメラの間に配置されイメージインテンシファイアの出力光を集光するレンズと、
前記ＨＡＲＰ方式の撮像カメラの出力を受けてサンプルの蛍光像を画面表示する手段
を具備したことを特徴とする。
【００１５】
サンプルから発光した蛍光をイメージインテンシファイアで高増幅するため、高感度に観測できる。従来のように蛍光分子が少ないとき感度が低すぎて観察できないという問題は生じない。
また、イメージインテンシファイアを介在させることにより、入力の蛍光はすべて緑色に変換されてＨＡＲＰ方式の撮像カメラに入射するため、ＨＡＲＰ方式の撮像カメラの赤方での感度低下の問題も解消されて、すべての蛍光像が高感度に撮像できるという効果がある。
【００１６】
この場合、請求項２のように、前記サンプルから発光した蛍光における異なる波長の光を個別に透過する複数のフィルタを備え、各フィルタを切換えてフィルタを透過した光が前記イメージインテンシファイアに入射するように構成することができる。
このように透過波長の異なるフィルタを用いると、容易に蛍光の各波長の光を個別に取り出してカメラで撮像することができる。
【００１７】
さらに、請求項３のように、前記フィルタの特性を変えて透過波長領域を変えれば、前記サンプルの蛍光物質を同定することができる。
【００１８】
また、請求項４のように、前記サンプルから発光した蛍光をその異なる波長の光ごとに分岐する分岐手段と、前記イメージインテンシファイアとレンズとＨＡＲＰ方式の撮像カメラでなる複数組の検出系を備え、前記分岐手段からの分岐光を別々に前記検出系に導き、複数の分岐光を同時に観測できるように構成することもできる。
【００１９】
また、請求項５のように、透過波長域を狭め目的の波長域の光を透過させるバリアフィルタを複数個備え、この各バリアフィルタを通して分岐手段の出力光を前記各イメージインテンシファイアに与えるようにすることもできる。
バリアフィルタを用いることにより目的の波長以外の光を除去することができ、高画質の画像を得ることができる。
【００２０】
また、請求項６のように、サンプルの蛍光像を画面表示する手段は、カラー再構成を行って蛍光像を表示できるように構成することもできる。
【００２１】
【発明の実施の形態】
以下図面を用いて本発明を詳しく説明する。図１は本発明に係る共焦点スキャナ顕微鏡の一実施例を示す概念的構成図である。図１において、図４と同等部分には同一符号を付してある。図４と異なるところは、光源部１０、光検出部２０、画像収集装置３０および画像表示装置４０である。
【００２２】
光源部１０は、複数の多波長光源１１ａ，１１ｂ，１１ｃと、光透過帯域の異なるフィルタ１２ａ，１２ｂ，１２ｃと、混合用のダイクロイックミラー１３ａ，１３ｂ，１３ｃと、スイッチング機構１４から構成されている。
【００２３】
各多波長光源１１ａ，１１ｂ，１１ｃの出力光をフィルタ１２ａ，１２ｂ，１２ｃを通すことによりそれぞれＲ、Ｇ、Ｂの波長成分の光が取り出される。ダイクロイックミラー１３ａ，１３ｂ，１３ｃの部分ではこのＲ、Ｇ、Ｂ光を合成し、白色光として出射する。
【００２４】
スイッチング機構１４はこの白色光の通過と遮断を制御するものである。スイッチング機構１４を通過した光は光ファイバ１５を経由してミラー１６に入射する。ミラー１６はこの光を反射してレンズ１７に入射する。レンズ１７は入射光を平行光として、マイクロレンズアレイディスク２に入射する。
【００２５】
光検出部２０は、フィルタ２１と、イメージインテンシファイア２３と、レンズ２４と撮像カメラ８より構成されている。
フィルタ２１は透過波長特性の異なる複数のフィルタから構成されており、その各フィルタは択一的に選択できるように構成されている。選択機構としては、例えば、円板に複数のフィルタを配列しておき、円板の回転によりフィルタを切換えるなどの機構を用いることができる。
【００２６】
フィルタ切り換え期間中は、光源部１０のスイッチング機構１４により合成光を遮断し、サンプル６への励起光照射を中止する。なお、遮断する必要がない場合は、常時通過の状態にするか、またはスイッチング機構１４を除去しておいても構わない。
【００２７】
イメージインテンシファイア２３はフォトンを１００倍程度増幅する。なお、増幅率は可視光の範囲でほぼ一定であり、またその出力は緑色蛍光発光体である。出力が緑色蛍光発光体であるため、すべての入射光は緑色に変換される。
このイメージインテンシファイア２３の出力光はレンズ２４により集光されて撮像カメラ８に入射する。
【００２８】
撮像カメラ８は、撮像画像を増幅し、電気信号に変換して出力する。なお、このHARP方式などの撮像カメラの感度特性は、半導体薄膜のバンドギャップに依存していて、赤方では１／４〜１／１０００に低下する。しかし、本発明では、前述のように撮像カメラは緑色の光しか撮像しないので赤方での感度低下に影響されることはない。
【００２９】
画像収集装置３０は撮像カメラ８が出力する電気信号を画像データに変換して保存する。
画像表示装置４０は、通常コンピュータが用いられ、画像収集装置３０に格納された画像を読み出し、適宜に処理を行って表示画面に表示する。
【００３０】
このような構成における動作を次に説明する。光源部１０では３つの多波長光源１１ａ，１１ｂ，１１ｃから発せられた光をそれぞれフィルタ１２ａ，１２ｂ，１２ｃを通して、Ｒ、Ｇ、Ｂの光を得て、これをダイクロイックミラー１３ａ，１３ｂ，１３ｃにより合成する。合成された白色光はスイッチング機構１４を通過して光ファイバ１５に入射する。
【００３１】
光ファイバ１５から出射された光はミラー１６で反射しレンズ１７に入射する。レンズ１７により平行光となった光はマイクロレンズアレイディスク２に入射する。なお、光ファイバ１５の出力光を直接レンズ１７に入射させることができる場合には、ミラー１６は不要である。
【００３２】
レンズ１７の出力光をマイクロレンズアレイディスク２に入射した後、サンプル６からの蛍光をダイクロイックミラー４にて反射して取り出すまでの動作は、従来装置と同じであり、ここではその説明を省略する。
【００３３】
サンプル６から発せられる蛍光には通常複数の波長が含まれている。そこで、フィルタ２１を切換えて各波長の蛍光を個別に透過させる。フィルタを透過した蛍光はイメージインテンシファイア２３で増幅され、その出力光はレンズ２４で集光され撮像カメラ８に入射する。撮像カメラ８の受像面（図示せず）に結像したサンプル６の蛍光像が撮影される。
【００３４】
イメージインテンシファイア２３の出力光は、フィルタの透過光とは無関係に常に緑色である。撮像カメラ８ではこの緑色に変換された蛍光像を撮像する。画像収集装置３０では、選択したフィルタの種類（または透過波長）の情報と撮像カメラ８の出力画像（緑色画像）信号とを関連付けて保存する。
【００３５】
画像表示装置４０は、画像収集装置３０に保存された画像データとフィルタの情報を読み出し、元の蛍光色に再構成（カラー再構成）して蛍光画像を画面表示する。また、カラー再構成しないで蛍光画像を表示させることももちろん可能である。
【００３６】
このようにして、フィルタの透過波長を時分割で変えて蛍光画像を観察することができる。このとき、フィルタの特性を変えることにより蛍光物質の種類を同定することも可能である。
【００３７】
さらに、本発明ではイメージインテンシファイアにより蛍光を高増幅するため、蛍光分子が少なくても画像として表示でき、確実に観測することができる。また、イメージインテンシファイアによりすべての蛍光は緑色に変換されるため、撮像カメラでは、従来のような赤方での感度低下に影響されることなく、すべての蛍光を同一感度で撮像することができる。
【００３８】
また、インテンシファイア２３とレンズ２４を用いたことにより、従来よりも高画質を維持しながら、１００倍程度の高感度化が得られる。
加えて、光導電膜のバンドギャップ以下の長波長（赤）領域の感度は、撮像カメラの長波長側の感度落ち込みがなく、カメラの赤色の感度低下を１／１０とした場合、イメージインテンシファイアの高感度化１００倍と合わせて本発明では１０００倍程度の高感度化が達成される。
【００３９】
図２は本発明の他の実施例図である。図１に示す実施例ではフィルタの波長を変えて波長の異なる蛍光を時分割で計測しているのに対し、本実施例ではダイクロイックミラーを使用して波長の異なる蛍光を同時計測するようにしている。
【００４０】
図２において図１と異なるところは光検出部２０ａである。光検出部２０ａは、３組の検出系すなわち、ダイクロイックミラー、イメージインテンシファイア、レンズおよび撮像カメラからなる３組の検出系で構成されている。
【００４１】
ダイクロイックミラー２２ａ，２２ｂ，２２ｃは、蛍光に含まれる３つの波長の光を分岐するものである。なお、本実施例では波長の数に合わせて３分岐以外も可能である。その場合、分岐数に見合う個数のダイクロイックミラー、イメージインテンシファイア、レンズ、撮像カメラが必要である。
【００４２】
例えば、第１のダイクロイックミラー２２ａでは波長λ１の光を透過し、他の波長の光は反射する。次に、第２のダイクロイックミラー２２ｂでは、第１のダイクロイックミラー２２ａで反射した光を受けて、波長λ２の光を反射し、他の波長の光を透過する。第３のダイクロイックミラー２２ｃでは第２のダイクロイックミラー２２ｂを透過した光を受けて、波長λ３の光を反射する。
【００４３】
このようにして３つのダイクロイックミラー２２ａ，２２ｂ，２２ｃにより分岐して、３つの波長の蛍光をそれぞれ個別に出力する。なお、各イメージインテンシファイアは、その入力面が前記各蛍光の実像面に一致するように配置される。
【００４４】
各イメージインテンシファイア２３ａ，２３ｂ，２３ｃは、図１のイメージインテンシファイアと同じ特性のものが使用される。この各イメージインテンシファイアの出力光はレンズ２４ａ，２４ｂ，２４ｃによってそれぞれ集光され撮像カメラ８ａ，８ｂ，８ｃに入射する。
【００４５】
撮像カメラ８ａ，８ｂ，８ｃは、図１の撮像カメラ８と同一の感度特性を有し、イメージインテンシファイアからの緑色の光をそれぞれ撮影する。よって、すべての蛍光を同一感度で撮像することができる。
【００４６】
３台の撮像カメラはそれぞれ撮像画像（緑色画像）を電気信号に変換して出力する。画像収集装置３０は、この電気信号をデジタル画像データに変換し、ダイクロイックミラーで分岐した蛍光の色と対応付けて保存する。
画像表示装置４０は、画像収集装置３０に保存された画像データを読み出し適宜の処理を施して蛍光画像を画面に表示する。このとき、当該画像に対応付けられた色に再構成（カラー再構成）して、表示する。
【００４７】
このようにして、ダイクロイックミラーにより分岐した波長の各蛍光像を同時計測することができる。
なお、本実施例においても図１の場合と同様に、容易に高画質、高感度化を実現することができる。
【００４８】
図３は本発明のさらに他の実施例図である。図２と異なるところは各イメージインテンシファイア２３ａ，２３ｂ，２３ｃの前にバリアフィルタ２５ａ，２５ｂ，２５ｃをそれぞれ配置した点である。このバリアフィルタで透過波長領域を狭めることにより、目的とする波長以外を除去し目的とする波長のみをイメージインテンシファイアに入射させることができ、画像のＳＮ比を向上することができる。
【００４９】
なお、本発明は、上記実施例に限定されることなく、その本質から逸脱しない範囲で更に多くの変更、変形をも含むものである。
【００５０】
【発明の効果】
以上説明したように本発明によれば次のような効果がある。
（１）イメージインテンシファイアとその出力光を集光するレンズを配置してＨＡＲＰ方式の撮像カメラではすべて緑色に変換された実像が撮影されるようにしたことにより、容易に、高画質を維持しながら、従来の装置よりも１００倍程度の高感度の画像を得ることができる。
【００５１】
（２）さらに、光導電膜のバンドギャップ以下の長波長（赤色）領域については、ＨＡＲＰ方式の撮像カメラで撮影しないので、従来装置におけるようなＨＡＲＰ方式の撮影カメラでの長波長側の感度落ち込みはない。等価的に、長波長領域の感度は１０００倍程度となる。なお、これは、ＨＡＲＰ方式だけでなく赤に感度の低い他の方式の撮像カメラでも、同様の効果が得られ、有効である。
【００５２】
（３）また、図１の実施例においてフィルタの透過波長特性を変えることにより容易に蛍光物質の同定が可能となる。
（４）イメージインテンシファイアの前にバリアフィルタを配置して透過波長領域を狭めることにより、容易に画像のＳＮ比を上げることができる。
（５）また、フィルタを変えた画面あるいはダイクロイックミラーで分岐した画面を複数種類得ることにより、容易に撮像画像のカラー化を図ることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明に係る共焦点スキャナ顕微鏡の一実施例を示す構成図である。
【図２】本発明の他の実施例を示す構成図である。
【図３】本発明のさらに他の実施例を示す構成図である。
【図４】従来の共焦点スキャナ顕微鏡の要部構成図である。
【図５】ＨＡＲＰ方式の撮像カメラの特性の一例を示す図である。
【符号の説明】
２ マイクロレンズアレイディスク
３ ピンホールディスク
４ ダイクロイックミラー
５ 対物レンズ
６ サンプル
８，８ａ，８ｂ，８ｃ 撮像カメラ
１０ 光源部
１１ａ，１１ｂ，１１ｃ 多波長光源
１２ａ，１２ｂ，１２ｃ フィルタ
１３ａ，１３ｂ，１３ｃ ダイクロイックミラー
１４ スイッチング機構
１５ 光ファイバ
１６ ミラー
１７ レンズ
２０，２０ａ，２０ｂ 光検出部
２１ フィルタ
２２ａ，２２ｂ，２２ｃ ダイクロイックミラー
２３，２３ａ，２３ｂ，２３ｃ イメージインテンシファイア
２４，２４ａ，２４ｂ，２４ｃ レンズ
２５ａ，２５ｂ，２５ｃ バリアフィルタ
３０ 画像収集装置
４０ 画像表示装置
Claims (6)
- サンプルを励起する励起光を発する光源部と、前記励起光を用いてサンプルを複数のビームで走査するスキャナ部と、緑色で高感度の特性を有し前記サンプルから発光した蛍光を受けてサンプルの画像を撮像する撮像カメラを有した共焦点スキャナ顕微鏡において、
ＨＡＲＰ方式の撮像カメラと、
前記サンプルから発光した蛍光を増幅すると共に入力光が緑色に変換されて出力されるイメージインテンシファイアと、
このイメージインテンシファイアと前記ＨＡＲＰ方式の撮像カメラの間に配置されイメージインテンシファイアの出力光を集光するレンズと、
前記ＨＡＲＰ方式の撮像カメラの出力を受けてサンプルの蛍光像を画面表示する手段を具備したことを特徴とする共焦点スキャナ顕微鏡。 - 前記サンプルから発光した蛍光における異なる波長の光を個別に透過する複数のフィルタを備え、各フィルタを切換えてフィルタを透過した光が前記イメージインテンシファイアに入射するように構成したことを特徴とする請求項１記載の共焦点スキャナ顕微鏡。
- 前記フィルタの特性を変えて透過波長領域を変えることにより前記サンプルの蛍光物質を同定することができるように構成したことを特徴とする請求項２記載の共焦点スキャナ顕微鏡。
- 前記サンプルから発光した蛍光をその異なる波長の光ごとに分岐する分岐手段と、
前記イメージインテンシファイアとレンズとＨＡＲＰ方式の撮像カメラでなる複数組の検出系を備え、
前記分岐手段からの分岐光を別々に前記検出系に導き、複数の分岐光を同時に観測できるように構成したことを特徴とする請求項１記載の共焦点スキャナ顕微鏡。 - 透過波長域を狭め目的の波長域の光を透過させるバリアフィルタを複数個備え、この各バリアフィルタを通して分岐手段の出力光を前記各イメージインテンシファイアに与えるようにした請求項４記載の共焦点スキャナ顕微鏡。
- 前記サンプルの蛍光像を画面表示する手段は、カラー再構成を行って蛍光像を表示できるように構成したことを特徴とする請求項２ないし５のいずれかに記載の共焦点スキャナ顕微鏡。
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