JP5945400B2 - 検出光学系および走査型顕微鏡 - Google Patents

Description

本発明は、検出光学系およびこれを備える走査型顕微鏡に関するものである。

従来、分光検出機能を備えた走査型共焦点顕微鏡が知られている（例えば特許文献１参照）。分光検出機能を備えた走査型共焦点顕微鏡の多くは蛍光観察に用いられるが、通常、蛍光は微弱であり、単位時間当たりに得られる蛍光の光量は少ない。また、走査型共焦点顕微鏡の場合、標本を高速に走査するため、標本上の各点を励起する時間も短い。このため、明るい画像を得るためには、発生量が限られる蛍光を効率良く光検出部に導くことが求められる。

しかしながら、特許文献１に開示されるように、現在利用されている分光検出機能を備えた走査型共焦点顕微鏡は、分光手段として反射型回折格子を利用しているため、広い波長域で高い回折効率を得ることができない。これは、反射型回折格子は、一般に、表面のレリーフ構造を利用して回折光を得る表面レリーフ回折格子であり、表面レリーフ回折格子の回折効率は、最大でも７０％程度であるからである。

分光手段は、一般に、光量の損失が大きな光学素子であるため、分光検出機能を備えた走査型共焦点顕微鏡では、分光手段で生じる光量損失を抑制することが、光の利用効率の改善に効果的である。

分光手段で生じる光量損失の抑制を目的とする技術は、例えば、特許文献２に開示されている。特許文献２に開示される技術では、分光手段である反射型回折格子の偏光依存性に着目し、入射光をより高い回折効率を示すＳ偏光に変換してから入射させることで、分光手段で生じる光量損失の抑制を図っている。

特開２００６−０１０９４４号公報 特開２００６−１５３５８７号公報

しかしながら、特許文献２に開示される技術では、回折効率を改善して反射型回折格子自体で生じる光量損失は抑制されるが、反射型回折格子の前後の光学系が複雑化してしまう。また、複雑化した光学系で光量の損失が生じてしまう。

例えば、入射光はＰ偏光とＳ偏光に分割されて、それぞれ異なる光路を通って反射型回折格子に導かれる。このため、入射光をＰ偏光とＳ偏光に分割する偏光ビームスプリッタが用いられるが、その偏光ビームスプリッタで光量の損失が生じてしまう。また、Ｐ偏光をＳ偏光に変換するために偏光を回転させる波長板が用いられるが、その波長板でも光量の損失が生じてしまう。
このため、反射型回折格子自体の回折効率が改善されても、顕微鏡全体として光の利用効率が十分に改善されないという不都合がある。

本発明は、上述した事情に鑑みてなされたものであって、分光検出機能を備え、回折効率を向上して検出光量を高めることができる検出光学系およびこれを備える走査型顕微鏡を提供することを目的とする。

上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を採用する。
本発明の第１の態様は、標本からの光を複数の波長帯域に分光する透過型のＶＰＨ回折格子と、該ＶＰＨ回折格子を前記標本からの光の入射光軸と前記ＶＰＨ回折格子からの出射光軸とに直交する軸線回りに回転させる回転機構と、前記ＶＰＨ回折格子により分光された前記標本からの光を検出する光検出部と、前記回転機構と同期して、前記ＶＰＨ回折格子の回転によって生じる光軸の変位に応じて前記光検出部への入射位置を補正する補正手段とを備え、該補正手段が、（ｉ）前記ＶＰＨ回折格子が第１の回転角にあるときに前記標本からの所定波長の光が前記ＶＰＨ回折格子から射出されるときの第１の出射角と、（ｉｉ）前記ＶＰＨ回折格子が第２の回転角にあるときに前記標本からの前記所定波長の光が前記ＶＰＨ回折格子から射出されるときの第２の出射角とのずれを補正する検出光学系である。

本発明の第１の態様によれば、標本からの光が、透過型のＶＰＨ（Volume Phase Holographic）回折格子により複数の波長帯域の光に分光される。ＶＰＨ回折格子により分光された標本からの光は、光検出部により検出される。この場合において、ＶＰＨ回折格子は、回転機構により、標本からの光の入射光軸と前記ＶＰＨ回折格子からの出射光軸とに直交する軸線回りに回転される。これにより、ＶＰＨ回折格子の回折効率を向上させて、光検出部により検出される光量を向上することができる。

この場合において、ＶＰＨ回折格子を回転させることで、ＶＰＨ回折格子を透過した標本からの光の光軸が変位してしまう。この際、補正手段により、回転機構の動作と同期して、ＶＰＨ回折格子の回転によって生じる光軸の変位に応じて光検出部への入射位置を補正することができる。これにより、ＶＰＨ回折格子により分光された標本からの光を、確実に光検出部の所定位置において検出することができ、その分光精度を向上することができる。
以上のように、本発明の第１の態様によれば、光検出部により検出される光量を向上するとともに、標本からの光の分光精度を向上することができる。

上記態様において、前記補正手段が、前記標本からの光を反射する反射部と、前記回転機構と同期して、前記反射部を前記ＶＰＨ回折格子の回転軸線に平行な軸線回りに回転させる反射部回転機構とを備えることとしてもよい。
反射部回転機構により、回転機構と同期して反射部をＶＰＨ回折格子の回転軸線に平行な軸線回りに回転させることで、ＶＰＨ回折格子の回転によって生じる光軸の変位に応じて光検出部への入射位置を補正することができる。このように補正手段を構成することで、標本からの光の分光精度を向上するとともに、光学系全体をコンパクトにして装置の小型化を図ることができる。

上記態様において、前記反射部回転機構が、以下の式に基づいて、前記反射部を前記標本からの光の入射光軸に直交する軸線回りに角度Δα／２だけ回転させることとしてもよい。
Δα＝２sin^-1{Ｎ（λ_ｓｔｄ＋Δλ）／２}−sin^-1（Ｎλ_ｓｔｄ／２）−sin^-1{Ｎ（λ_ｓｔｄ／２＋Δλ）}
ここで、
Δα：前記ＶＰＨ回折格子を透過した標本からの光の光軸のずれ角度
Ｎ：前記ＶＰＨ回折格子の特性によって決定される定数
λ_ｓｔｄ：前記ＶＰＨ回折格子の角度が基準角度のときに最大効率となる波長
Δλ：検出対象の波長と最大効率となる波長（λ_ｓｔｄ）との差
である。

上記の式に基づいて、反射部をＶＰＨ回折格子の回転軸線に平行な軸線回りに回転させることで、ＶＰＨ回折格子の回転によって生じる光軸の変位を効果的に補正することができる。これにより、標本からの光の分光精度を向上することができる。

上記態様において、前記補正手段が、前記光検出部を前記ＶＰＨ回折格子の回転軸線回りに回転させる光検出部回転機構を備えることとしてもよい。
光検出部回転機構により、光検出部をＶＰＨ回折格子の回転軸線回りに回転させることで、ＶＰＨ回折格子の回転によって生じる光軸の変位に応じて光検出部への入射位置を補正することができる。このように補正手段を構成することで、標本からの光の分光精度を向上するとともに、反射部等の光学部材を無くして該光学部材による標本からの光のロスを無くすことができ、光検出部による検出効率を向上することができる。

上記態様において、前記光検出部回転機構が、以下の式に基づいて、前記光検出部を前記ＶＰＨ回折格子の回転軸線回りに角度Δαだけ回転させることとしてもよい。
Δα＝２sin^-1{Ｎ（λ_ｓｔｄ＋Δλ）／２}−sin^-1（Ｎλ_ｓｔｄ／２）−sin^-1{Ｎ（λ_ｓｔｄ／２＋Δλ）}
ここで、
Δα：前記ＶＰＨ回折格子を透過した標本からの光の光軸のずれ角度
Ｎ：前記ＶＰＨ回折格子の特性によって決定される定数
λ_ｓｔｄ：前記ＶＰＨ回折格子の角度が基準角度のときに最大効率となる波長
Δλ：検出対象の波長と最大効率となる波長（λ_ｓｔｄ）との差
である。

上記の式に基づいて、光検出部をＶＰＨ回折格子の回転軸線回りに回転させることで、ＶＰＨ回折格子の回転によって生じる光軸の変位を効果的に補正することができる。これにより、標本からの光の分光精度を向上することができる。

上記態様において、前記光検出部がマルチチャンネル光電子増倍管であることとしてもよい。
光検出部をマルチチャンネル光電子増倍管とすることで、ＶＰＨ回折格子により分光された標本からの光（複数の波長帯域の光）を同時に検出することができ、リアルタイムでの分光観察を行うことができる。

上記態様において、前記光検出部に入射する光の波長を選択する波長選択スリットを備え、前記光検出部が単チャンネル光電子増倍管であることとしてもよい。
光検出部を単チャンネル光電子増倍管とし、波長選択スリットにより光検出部に入射する光の波長を選択することで、ＶＰＨ回折格子により分光された標本からの光（複数の波長帯域の光）のうち選択した波長の光を検出することができる。このように構成することで、装置コストの低減を図ることができる。

本発明の第２の態様は、光源と、該光源から射出された光を標本上で走査する走査部と、該走査部により走査された光を標本に集光する一方、前記標本からの光を集める対物光学系と、上記の検出光学系とを備える走査型顕微鏡である。
本発明の第２の態様によれば、前述の検出光学系を備えているため、光検出部により検出される光量を向上するとともに、標本からの光の分光精度を向上して、標本の観察精度を向上することができる。

本発明によれば、回折効率を向上して検出光量を高めることができるという効果を奏する。

本発明の各実施形態に係る顕微鏡の概略構成図である。 本発明の第１の実施形態に係る検出光学系の概略構成図である。 図２の光検出部への入射位置を補正する具体的な方法を説明する図である。 図２の光検出部への入射位置を補正する具体的な方法を説明する図である。 本発明の第２の実施形態に係る検出光学系の概略構成図である。 本発明の第３の実施形態に係る検出光学系の概略構成図である。

〔第１の実施形態〕
本発明の第１の実施形態に係る検出光学系およびこれを備える顕微鏡について図面を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る顕微鏡１は、共焦点走査型顕微鏡であり、図１に示されるように、レーザ光を射出するレーザ光源２と、レーザ光と標本Ａからの蛍光とを分岐するダイクロイックミラー３と、レーザ光を標本上で２次元走査するスキャンユニット（走査部）４と、対物レンズ（対物光学系）５と、共焦点レンズ６と、対物レンズ５の焦点位置と共役な位置にピンホールを有する共焦点絞り７と、コリメータレンズ８と、検出光学系１０とを備えている。

レーザ光源２は、標本Ａ中の蛍光物質を励起させて蛍光を発生させるレーザ光（励起光）を射出するようになっている。
ダイクロイックミラー３は、レーザ光源２からのレーザ光を反射する一方、レーザ光が照射されることで標本Ａにおいて発生した蛍光を透過させるようになっている。

スキャンユニット４は、一対のガルバノミラー（図示略）を有しており、該一対のガルバノミラーの揺動角度を変化させ、ラスタスキャン方式で駆動されるようになっている。これにより、レーザ光源２からのレーザ光を標本Ａ上において２次元的に走査させることができるようになっている。

対物レンズ５は、レーザ光源２からのレーザ光を標本Ａに集光する一方、標本Ａにおいて発生した蛍光を集めるようになっている。対物レンズ５によって集められた蛍光は、レーザ光とは逆の順路を辿り、スキャンユニット４を経てダイクロイックミラー３を透過する。
共焦点レンズ６は、ダイクロイックミラー３を透過してきた標本Ａからの蛍光を集光するようになっている。

共焦点絞り７は、標本Ａの焦点面において発生した蛍光のみを通過させるようになっている。これにより、対物レンズ５の焦点位置以外において発生した蛍光が遮断されるようになっている。
コリメータレンズ８は、共焦点絞り７を通過してきた蛍光を平行光にして検出光学系１０に入射させるようになっている。

検出光学系１０は、図２に示すように、標本Ａからの蛍光を複数の波長帯域に分光する透過型のＶＰＨ回折格子１１と、ＶＰＨ回折格子１１を透過してきた蛍光を反射する反射ミラー（反射部）１２と、反射ミラー１２により反射された蛍光を結像する結像レンズ１４と、結像レンズ１４により結像された蛍光を検出する光検出部１５とを備えている。

ＶＰＨ回折格子１１は、透過型のＶＰＨ（Volume Phase Holographic）回折格子であり、図３に示すように、主直線ＰＬに沿って屈折率が周期的に変化するＶＰＨ層を有している。このような構成を有することで、ＶＰＨ回折格子１１は、標本Ａからの蛍光を複数の波長帯域に分光するようなっている。

具体的には、ＶＰＨ回折格子１１は、入射光と平行な方向に０次回折光を射出し、０次回折光から波長毎に異なる角度で１次回折光を射出する透過型回折格子であり、反射型の回折格子に比べて高い回折効率で広帯域の回折特性を有している。

また、透過型回折格子（ＶＰＨ回折格子１１）を含む一般の回折格子では、入射角αと回折角βの間に下式が成り立つ。
ｓｉｎα＋ｓｉｎβ＝Ｎλ
上式において、Ｎは回折格子の格子周波数、λは回折格子への入射波長である。
上式において、Ｎとλが一定の場合、α＝βの近傍では、出射角α＋βはほとんど変化しない。このため、透過型回折格子では、入射角が変化しても、０次光に対する１次回折光の出射角は波長毎に略一定となり、入射角によらず回折方向が略一定に維持される。特に、格子周波数Ｎが小さいときにはこの近似が精度良く成り立つ。

また、本実施形態におけるＶＰＨ回折格子１１は、ＶＰＨ回折格子１１を標本Ａからの蛍光の入射光軸とＶＰＨ回折格子１１により回折された出射光の光軸とに直交する軸線Ｌ回りに回転させる回転機構（図示略）を有している。この回転機構によりＶＰＨ回折格子１１を回転させることで、標本Ａからの蛍光のＶＰＨ回折格子１１による回折効率を向上させるようになっている。

また、図２に示すように、反射ミラー１２には、上記の回転機構と同期して、反射ミラー１２を標本Ａからの蛍光の入射光軸に直交する軸線回りに回転させる反射部回転機構（補正手段）１３が備えられている。反射部回転機構１３により反射ミラー１２を回転させることで、ＶＰＨ回折格子１１の回転によって生じる光軸の変位に応じて光検出部１５への入射位置を補正するようになっている。なお、光検出部１５への入射位置を補正する具体的な方法については後述する。

光検出部１５は、標本Ａからの蛍光を検出するチャンネル（符号１５ａ，１５ｂ，・・・）が蛍光の分光方向に複数配列されて構成されたマルチチャンネルＰＭＴ（Photomultiplier Tube：光電子増倍管）である。光検出部１５は、ＶＰＨ回折格子１１により分光された複数の波長帯域の光を、各チャンネルによりそれぞれ検出するようになっている。

上記構成を有する本実施形態に係る顕微鏡１の作用について以下に説明する。
図１に示すように、レーザ光源２から射出されたレーザ光は、ダイクロイックミラー３により反射されて、スキャンユニット４を介して対物レンズ５に入射する。対物レンズ５は、レーザ光を標本Ａの１点に集光させて照射する。これにより、標本Ａ中の蛍光物質がレーザ光により励起されて蛍光が発生する。

標本Ａからの蛍光は、レーザ光と同じ光路を反対向きに進行し、対物レンズ５及びスキャンユニット４を介してダイクロイックミラー３に入射する。そして、標本Ａからの蛍光は、ダイクロイックミラー３を透過して、共焦点レンズ６により集光される。共焦点絞り７は、対物レンズ５の焦点位置と光学的に共役な位置にピンホールを有しているため、対物レンズ５の焦点位置から生じた蛍光のみが共焦点絞り８を通過する。その後、蛍光は、コリメータレンズ８で略平行光束に変換されて、検出光学系１０に入射する。

検出光学系１０では、図２に示すように、標本Ａからの蛍光は、ＶＰＨ回折格子１１により複数の波長帯域の光に分光される。この際、ＶＰＨ回折格子１１では、蛍光は回折されて、波長毎にそれぞれ異なる回折角で射出される。波長毎に異なる回折角で射出された１次回折光（蛍光）は、反射ミラー１２により反射されて、波長毎に光軸に対して異なる角度で結像レンズ１４に入射する。このため、１次回折光は、結像レンズ１４により、波長毎に光検出部１５の異なる位置（チャンネル）に入射して、波長毎に異なるチャンネルで検出される。

光検出部１５で検出された１次回折光（蛍光）は、電気信号に変換されて、スキャンユニット４によって標本Ａを走査することにより得られる標本Ａの各点に関する電気信号に基づいて、蛍光画像の形成やその他の分析等が行われる。そして、その蛍光画像や分析結果がモニター等の表示手段（図示略）に表示される。

この場合において、検出したい蛍光の波長に応じて、ＶＰＨ回折格子１１は、図示しない回転機構により、標本Ａからの蛍光の入射光軸とＶＰＨ回折格子１１により回折された出射光の光軸とに直交する軸線Ｌ回りに回転される。これにより、ＶＰＨ回折格子１１の回折効率を向上させて、光検出部１５により検出される蛍光の光量を向上することができる。

この際、ＶＰＨ回折格子１１を回転させることで、ＶＰＨ回折格子１１を透過した標本Ａからの蛍光の光軸が変位してしまう。この場合において、回転機構の動作と同期して、反射部回転機構１３により反射ミラー１２を回転させることで、ＶＰＨ回折格子１１の回転によって生じる光軸の変位に応じて、光検出部１５への入射位置を補正することができる。これにより、ＶＰＨ回折格子１１により分光された標本Ａからの蛍光を、確実に光検出部１５の所定位置（チャンネル）において検出することができ、その分光精度を向上することができる。
以上のように、本実施形態に係る検出光学系１０およびこれを備える顕微鏡１によれば、光検出部１５により検出される光量を向上するとともに、標本Ａからの蛍光の分光精度の向上することができる。

また、光検出部１５への入射位置を補正する補正手段を、上記の反射ミラー１２および反射部回転機構１３で構成することで、標本Ａからの蛍光の分光精度を向上するとともに、光学系全体をコンパクトにして装置の小型化を図ることができる。

また、光検出部１５をマルチチャンネルＰＭＴとすることで、ＶＰＨ回折格子１１により分光された標本Ａからの蛍光（複数の波長帯域の光）を同時に検出することができ、リアルタイムでの分光観察を行うことができる。

ここで、光検出部１５への入射位置を補正する具体的な方法、すなわち、反射部回転機構１３による反射ミラー１２の回転角度を調節する際の具体的な方法について、図３および図４を用いて以下に説明する。ここでは、ＶＰＨ回折格子１１を図３から図４のように回転させた場合における、標本Ａからの蛍光の出射光軸の角度のずれの算出方法について説明する。

ＶＰＨ回折格子１１の回転角が基準角度θ_１のときに回折効率が最大となる波長λ_ｓｔｄを５００ｎｍとし、検出したい波長λ_６００が６００ｎｍであるとする。
図３は、ＶＰＨ回折格子１１の回転角度が基準角度θ_１である状態（すなわち、基準波長λ_ｓｔｄの回折効率が最大になっている状態）を示す。
図４は、検出したい波長であるλ_６００（＝６００ｎｍ）の回折効率が最大になる回転角度θ_２にＶＰＨ回折格子１１を回転させた状態を示す。

図３および図４において各記号は以下を示している。
λ_ｓｔｄ：ＶＰＨ回折格子１１が最大効率となる波長（設計基準波長）
Δλ：検出対象の波長と最大効率となる波長（設計基準波長λ_ｓｔｄ）との差
λ_６００：検出対象の波長
Ｎ：ＶＰＨ回折格子１１の特性により決定される定数
θ_１’：設計基準波長λ_ｓｔｄの回折角
θ_６００’：検出波長λ_６００の回折角（図３の状態の場合）
θ_２’：検出波長λ_６００の回折効率が最大になった場合（図４の状態）の回折角
α_１：ＶＰＨ回折格子の回転角がθ１の場合（図３）の検出波長λ_６００出射角
α_２：ＶＰＨ回折格子の回転角がθ２の場合（図４）の検出波長λ_６００出射角

図３，図４において、λ_６００と表示した破線は、ＶＰＨ回折格子の回転角がθ１である図３の状態において波長λ_６００の光が出射する光軸を示す。
図４において、λ_６００ｍａｘと表示した実線は、検出波長λ_６００の回折効率が最大となる図４の状態において波長λ６００の光が出射する光軸を示す。

図３において以下の式が導かれる。
sinθ₁＋sinθ₆₀₀’＝Ｎｍλ₆₀₀・・・（１）
sinθ₁＋sinθ₁’＝Ｎｍλ_ｓｔｄ・・・（２）
上記の（２）式においてλ_ｓｔｄが最大効率となる場合にθ₁＝θ₁’なので、以下の式が導かれる。
sinθ₁＝sinθ₁’＝Ｎｍλ_ｓｔｄ／２・・・（２）’

（１）式および（２）式においてｍ＝１なので、以下の式が導かれる。
sinθ₆₀₀’＝Ｎ（λ₆₀₀−λ_ｓｔｄ／２）
∴θ₆₀₀’＝sin^-1{Ｎ（λ₆₀₀−λ_ｓｔｄ／２）}
ここで、α₁＝θ₁＋θ₆₀₀’＝θ₁’＋θ₆₀₀’なので、以下の式が導かれる。
α₁＝sin^-1（Ｎλ_ｓｔｄ／２）＋sin^-1{Ｎ（λ₆₀₀−λ_ｓｔｄ／２）}・・・（３）

一方、図４において以下の式が導かれる。
sinθ₂＋sinθ₂’＝Ｎｍλ₆₀₀・・・（４）
上記の（４）式においてλ₆₀₀が最大効率となる場合にθ₂＝θ₂’なので、以下の式が導かれる。
sinθ₂＝sinθ₂’＝Ｎｍλ₆₀₀／２・・・（４）’

ここで、上記の（４）’式においてｍ＝１なので、以下の式が導かれる。
θ₂’＝sin^-1（Ｎλ₆₀₀／２）
α₂＝２θ₂’＝２sin^-1（Ｎλ₆₀₀／２）・・・（５）

また、Δα＝α₂−α₁である。
上式に（３）式および（５）式を代入すると、以下の式が導かれる。
Δα＝２sin^-1（Ｎλ₆₀₀／２）−sin^-1（Ｎλ_ｓｔｄ／２）−sin^-1{Ｎ（λ₆₀₀−λ_ｓｔｄ／２）}

ここで、λ₆₀₀＝λ_ｓｔｄ＋Δλなので、以下の式が導かれる。
Δα＝２sin^-1{Ｎ（λ_ｓｔｄ＋Δλ）／２}−sin^-1（Ｎλ_ｓｔｄ／２）−sin^-1{Ｎ（λ_ｓｔｄ／２＋Δλ）}・・・（６）

以上のように、ＶＰＨ回折格子１１を図３から図４のように回転させた場合における、標本Ａからの蛍光の出射光軸の角度のずれΔα（＝α₂−α₁）は、上記の（６）式に示されるように、Δλのみの関数となる。すなわち、上記の（６）式に基づいて、反射ミラー１２を標本Ａからの蛍光の入射光軸に直交する軸線回りに角度Δα／２だけ回転させることで、ＶＰＨ回折格子１１の回転によって生じる光軸の変位を補正することができる。これにより、ＶＰＨ回折格子１１により分光された標本Ａからの蛍光を、確実に光検出部１５の所定位置（チャンネル）において検出することができ、標本Ａからの蛍光の分光精度を向上することができる。

〔第２の実施形態〕
次に、本発明の第２の実施形態に係る検出光学系について、図５を参照して説明する。以降では、各実施形態に係る検出光学系およびこれを備える顕微鏡について、前述の実施形態と共通する点については同一の符号を付して説明を省略し、異なる点について主に説明する。

本実施形態に係る検出光学系２０は、図５に示すように、前述の第１の実施形態に係る検出光学系１０の構成（図２参照）において、マルチチャンネルＰＭＴである光検出部１５に代えて、光検出部１５に入射する光の波長を選択する波長選択スリット１６と、単チャンネルＰＭＴである光検出部１７とを備えている。

光検出部１５を単チャンネルＰＭＴとし、波長選択スリット１６により単チャンネルＰＭＴである光検出部１７に入射する光の波長を選択することで、ＶＰＨ回折格子１１により分光された標本Ａからの蛍光（複数の波長帯域の光）のうち選択した波長の光を検出することができる。このように構成することで、装置コストの低減を図ることができる。

〔第３の実施形態〕
次に、本発明の第３の実施形態に係る検出光学系について、図６を参照して説明する。
本実施形態に係る検出光学系３０は、図６に示すように、前述の第１の実施形態に係る検出光学系１０の構成（図２参照）において、反射ミラー１２および反射部回転機構１３に代えて、光検出部１５および結像レンズ１４をＶＰＨ回折格子１１の回転軸線回りに回転させる光検出部回転機構（補正手段）１９を備えている。

光検出部回転機構１９により、光検出部１５および結像レンズ１４をＶＰＨ回折格子１１の回転軸線回りに回転させることで、ＶＰＨ回折格子１１の回転によって生じる光軸の変位に応じて、標本Ａからの蛍光（複数の波長帯域の光）の光検出部１５への入射位置を補正することができる。このように光検出部１５への入射位置を補正する補正手段を構成することで、標本Ａからの蛍光の分光精度を向上するとともに、第１の実施形態における反射ミラー１２等の光学部材による標本Ａからの蛍光のロスを無くすことができ、光検出部１５による検出効率を向上することができる。

なお、具体的には、光検出部回転機構１９は、前述の（６）式に基づいて、光検出部１５および結像レンズ１４をＶＰＨ回折格子１１の回転軸線回りに角度Δαだけ回転させることで、ＶＰＨ回折格子１１の回転によって生じる光軸の変位を補正することができる。

以上、本発明の各実施形態について図面を参照して詳述してきたが、具体的な構成はこの実施形態に限られるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲の設計変更等も含まれる。例えば、本発明を上記の各実施形態を適宜組み合わせた実施形態に適用してもよい。

Ａ 標本
１ 顕微鏡
２ レーザ光源
３ ダイクロイックミラー
４ スキャンユニット（走査部）
５ 対物レンズ（対物光学系）
６ 共焦点レンズ
７ 共焦点絞り
８ コリメータレンズ
１０，２０，３０ 検出光学系
１１ ＶＰＨ回折格子
１２ 反射ミラー（反射部）
１３ 反射部回転機構（補正手段）
１４ 結像レンズ
１５ 光検出部
１６ 波長選択スリット
１７ 光検出部
１９ 光検出部回転機構（補正手段）

Claims (8)

1. 標本からの光を複数の波長帯域に分光する透過型のＶＰＨ回折格子と、
   該ＶＰＨ回折格子を前記標本からの光の入射光軸と前記ＶＰＨ回折格子からの出射光軸とに直交する軸線回りに回転させる回転機構と、
   前記ＶＰＨ回折格子により分光された前記標本からの光を検出する光検出部と、
   前記回転機構と同期して、前記ＶＰＨ回折格子の回転によって生じる光軸の変位に応じて前記光検出部への入射位置を補正する補正手段とを備え、
   該補正手段が、（ｉ）前記ＶＰＨ回折格子が第１の回転角にあるときに前記標本からの所定波長の光が前記ＶＰＨ回折格子から射出されるときの第１の出射角と、（ｉｉ）前記ＶＰＨ回折格子が第２の回転角にあるときに前記標本からの前記所定波長の光が前記ＶＰＨ回折格子から射出されるときの第２の出射角とのずれを補正する検出光学系。
2. 前記補正手段が、
   前記標本からの光を反射する反射部と、
   前記回転機構と同期して、前記反射部を前記ＶＰＨ回折格子の回転軸線に平行な軸線回りに回転させる反射部回転機構とを備える請求項１に記載の検出光学系。
3. 前記反射部回転機構が、以下の式に基づいて、前記反射部を前記標本からの光の入射光軸に直交する軸線回りに角度Δα／２だけ回転させる請求項２に記載の検出光学系。
   Δα＝２sin^-1{Ｎ（λ_ｓｔｄ＋Δλ）／２}−sin^-1（Ｎλ_ｓｔｄ／２）−sin^-1{Ｎ（λ_ｓｔｄ／２＋Δλ）}
   ここで、
   Δα：前記ＶＰＨ回折格子を透過した標本からの光の光軸のずれ角度
   Ｎ：前記ＶＰＨ回折格子の特性によって決定される定数
   λ_ｓｔｄ：前記ＶＰＨ回折格子の角度が基準角度のときに最大効率となる波長
   Δλ：検出したい波長と最大効率となる波長（λ_ｓｔｄ）との差
   である。
4. 前記補正手段が、
   前記光検出部を前記ＶＰＨ回折格子の回転軸線回りに回転させる光検出部回転機構を備える請求項１に記載の検出光学系。
5. 前記光検出部回転機構が、以下の式に基づいて、前記光検出部を前記ＶＰＨ回折格子の回転軸線回りに角度Δαだけ回転させる請求項４に記載の検出光学系。
   Δα＝２sin^-1{Ｎ（λ_ｓｔｄ＋Δλ）／２}−sin^-1（Ｎλ_ｓｔｄ／２）−sin^-1{Ｎ（λ_ｓｔｄ／２＋Δλ）}
   ここで、
   Δα：前記ＶＰＨ回折格子を透過した標本からの光の光軸のずれ角度
   Ｎ：前記ＶＰＨ回折格子の特性によって決定される定数
   λ_ｓｔｄ：前記ＶＰＨ回折格子の角度が基準角度のときに最大効率となる波長
   Δλ：検出したい波長と最大効率となる波長（λ_ｓｔｄ）との差
   である。
6. 前記光検出部がマルチチャンネル光電子増倍管である請求項１から５のいずれかに記載の検出光学系。
7. 前記光検出部に入射する光の波長を選択する波長選択スリットを備え、
   前記光検出部が単チャンネル光電子増倍管である請求項１から５のいずれかに記載の検出光学系。
8. 光源と、
   該光源から射出された光を標本上で走査する走査部と、
   該走査部により走査された光を標本に集光する一方、前記標本からの光を集める対物光学系と、
   請求項１から７のいずれかに記載の検出光学系とを備える走査型顕微鏡。

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