JP5541978B2 - レーザ走査型顕微鏡 - Google Patents
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Description
本発明は、レーザ光を射出するレーザ光源と、該レーザ光源から射出されたレーザ光を走査する走査部と、該走査部により走査されたレーザ光を標本に照射する一方、前記標本からの光を集光する対物レンズと、該対物レンズにより集光された前記標本からの光を複数の波長帯域に分散する透過型のVolume Phase Holographic(VPH)回折格子と、該VPH回折格子により分散された光を検出する光検出部と、前記標本からの光の前記VPH回折格子への入射角を変化させる入射角度変更手段とを備え、前記入射角度変更手段は、前記光検出部により検出される複数の波長帯域の光がブラッグの反射条件をそれぞれ満たすように、前記標本からの光の前記VPH回折格子への入射角を、各検出波長帯域毎に変化させ、前記入射角度変更手段による前記標本からの光の入射角度の切り替えを前記走査部による走査に同期して行うレーザ走査型顕微鏡を採用する。
2dsinΘ=nλ
ここで、dはVPH回折格子の周期、Θは標本からの光のVPH回折格子への入射角、nは整数、λは波長である。
以上のように、本発明によれば、波長幅を切り出すスリットや、高価なマルチチャンネル検出器を用いることなく、簡単かつ安価な構成で、明るく、かつ、波長分解能が高い分光検出を行うことができる。
また、前記入射角度変更手段による前記標本からの光の入射角度の切り替えを前記走査部による走査に同期して行うことで、検出波長毎の時間差を極めて少なくでき、動きのある標本を正確に捉えることができる。
VPH回折格子を分散方向に直交する軸線回りに回転させることで、標本からの光のVPH回折格子への入射角が変化する。この際、光検出部により検出される複数の波長帯域の光のそれぞれについて、ブラッグの反射条件を満たすように、VPH回折格子を軸線回りに回転させることで、高い回折効率を得ることができ、強度の高い光を検出することができる。
このようにすることで、光検出部により検出する波長帯域の中心波長に合わせて、ブラッグの反射条件を満たす波長の光を切り替えるとともに、この切り替えに同期してレーザ光の波長を切り替えることができる。これにより、波長選択用スリットや、マルチチャンネルPMTや、反射型回折格子を用いないで、VPH回折格子により分散された波長毎に標本からの光を検出することができ、多重染色画像を容易に取得することができる。また、検出する波長帯域の中心波長の回折効率が最大となるようにVPH回折格子への入射角を変更することで、従来の反射型回折格子を用いたものに比べて回折効率を向上させることができ、明るい画像を取得することができる。
このようにすることで、分光データを細かく取得できるので、クロストークが大きい色素についても分離が可能である。
このようにすることで、VPH回折格子の回折効率を向上させることができ、明るい画像を取得することができる。
VPH回折格子の一つの回転角での分光特性の回折効率の半値幅は、各蛍光色素のうちバンド幅が最も狭い蛍光色素のバンドの半値幅よりも狭いほうが良く、特に、半分以下が好ましい。
λスキャンの波長ピッチは、複数の蛍光スペクトルのうち、ピーク間隔が最も狭い間隔の半分以下が好ましい。
このようにすることで、効果的に入射角度の切り替えと走査部による走査とを同期させることができ、動きのある標本を正確に捉えることができる。
VPH回折格子と標本からの光の相対角度をブラッグの反射条件に合わせた場合における回折効率の逆数を、光検出部による検出データに波長毎に乗算することで、波長毎の回折効率の違いを補正することができ、正確な分光データを取得することができる。
このようにすることで、VPH回折格子から分散される光を光検出部の有効受光面に集光させることができ、標本からの光の検出効率を向上させて明るい画像を取得することができる。
集光光学系をシリンドリカルレンズとすることで、VPH回折格子による分散方向にのみ標本からの光を集光することができ、効率的に光検出部の有効受光面に集光させることができる。
このようにすることで、光検出部と検出系のいずれか、あるいは両方で標本からの光を検出することができ、同時に多色の光を検出することができる。また、上記構成を有する分光ユニットをメインスキャンユニットに後付け可能な構成とすることで、明るくかつ安価な分光検出手段を容易に付加できる。すなわち、メインスキャンユニットを備えたレーザ走査型顕微鏡を、標本からの光を各蛍光波長帯域毎に対して効率よく検出することができ、波長分解能が高い多重染色標本の観察を行うようにアップグレードすることができる。
このようにすることで、第2の光検出部により広帯域の光を一度に検出するモードと、VPH回折格子による比較的狭い波長帯域(例えば10〜20nm)の光を検出するモードの両方を行うことができ、これらモードの切り換えを、入射角度変更手段により行うことができる。
このようにすることで、VPH回折格子により回折される光とVPH回折格子を直進する光の両方を1つの光検出部で検出することができ、高価な光検出部(例えばPMT)を1個削減できる。なお、再入力手段としては、例えば、VPH回折格子を直進する光を光検出部の受光面に向けて反射するミラーを用いればよい。
このようにすることで、VPH回折格子への入射角を変化させながらノンディスキャン検出器により取得した各画像における対応するピクセルのデータを結合することで、ピクセル毎の分光データを取得することができる。
このようにすることで、ミラーを回転させることにより、VPH回折格子を回転させる場合よりも高速な波長切換に対応することができる。また、回折効率が最大となる波長はブラッグ反射し、光検出部上の1点に集まるので、光検出部の受光面積を小さくすることができる。
本発明の第1の実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡1について、図面を参照して以下に説明する。
本実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡1は、図1に示されるように、レーザ光を射出する光源装置10と、光源装置10からのレーザ光を走査するスキャンユニット20と、結像レンズ41およびミラー42を有し、スキャンユニット20からのレーザ光を導光する接続ユニット40と、接続ユニット40により導光されたレーザ光を標本Aに照射するとともに標本Aからの光を集光する対物レンズ45と、これらを制御する制御ユニット50とを備えている。
スキャンユニット20は、光源装置10からのレーザ光を標本Aに照射する照射光学系25と、標本Aからの光を検出する検出光学系30とを備えている。
透過型のVPH回折格子は、媒質の屈折率を周期的に変化させたもので、ブラッグの反射条件を満たす波長において高い回折効率が得られ、その他の波長においては殆ど回折しないようにすることができる。
例えば白色光Wに対する回折格子37の向きを回転調整することで、ブラッグの反射条件に合った波長の光を効率的に取り出せる。具体的には、図3に示すように、回折格子37が符号Rに示す位置にある場合には赤の波長の光が矢印Rに示す方向に射出し、回折格子37が符号Gに示す位置にある場合には緑の波長の光が矢印Gに示す方向に射出し、回折格子37が符号Bに示す位置にある場合には青の波長の光が矢印Bに示す方向に射出する。
なお、1次回折光として得られる光(矢印R,G,Bの向きにそれぞれ射出される光)の波長幅は、回折格子37の厚みによって変化し、厚みが厚いほど波長幅が狭くなるので、所望の波長幅となるように厚みを選択する。
2dsinΘ=nλ
上記の式において、dは回折格子37の周期、Θは標本Aからの光の回折格子37への入射角、nは整数、λは波長である。透過型のVPH回折格子では、n=1の時に高い回折効率が得られる。
図4において、符号αは、回折格子37の回転角(以下「VPH回折格子回転角」という)、すなわち入射光に対する回折格子37の法線(以下「VPH回折格子法線」という)の角度である。符号βは、VPH回折格子法線に対する1次回折光の出射角度である。符号γは、絶対出射角、すなわち入射光(0次光)に対する1次回折光の出射角度である。
ここでは、本実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡1を用いて、光検出部36により標本Aの蛍光観察を行う場合について説明する。
まず、光源装置10を作動させ、スキャンユニット20にレーザ光を入射させる。スキャンユニット20に導光されたレーザ光は、ダイクロイックミラー21により反射されてXYガルバノスキャナ22に導光される。XYガルバノスキャナ22では、レーザ光を標本A上において2次元的に走査させる。このように走査されたレーザ光は、瞳投影レンズ23および結像レンズ41を透過してミラー42により偏向され、対物レンズ45により標本A上に照射される。
前提条件として、蛍光色素DAPI(405nm励起/450nm検出)、蛍光色素Alexa488(488nm励起/530nm検出)、蛍光色素Alexa560(560nm励起/580nm検出)で3重染色された標本Aの観察を行う。この場合において、ノッチフィルタ34として、405nm、488nm、560nmの波長の光をカットする特性のものを用いる。
この場合には、中心波長450nmの光が回折効率最大となるようにガルバノメータ38を駆動することで、VPH回折格子回転角α(15.7°)を設定し、XYガルバノスキャナ22を動作させて画像を取得する(DAPIの画像)。
この場合には、中心波長530nmの光が回折効率最大となるようにガルバノメータ38を駆動することで、VPH回折格子回転角α(18.5°)を設定し、XYガルバノスキャナ22を動作させて画像を取得する(Alexa488の画像)。
この場合には、中心波長580nmの光が回折効率最大となるようにガルバノメータ38を駆動することで、VPH回折格子回転角α(20.4°)を設定し、XYガルバノスキャナ22を動作させて画像を取得する(Alexa560の画像)。
そして、上記のように取得した3つのモノクロ画像に擬似カラーをつけて、多チャンネル画像として表示する。
以下に、本実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡1の第1の変形例について説明する。
本変形例における、光検出部36により検出する光の波長を順次切り替えてλスキャンを行う際の処理について以下に説明する。
前提条件として、蛍光色素GFPと蛍光色素YFPにより2重染色された標本Aの観察を行う。この場合において、ノッチフィルタ34として488nmの波長の光カットする特性のものを用い、ダイクロイックミラー21は例えば素ガラスを使用する。
この場合には、中心波長500nmの光が回折効率最大となるようにガルバノメータ38を駆動することで、VPH回折格子回転角α(17.5°)を設定し、XYガルバノスキャナ22を動作させて画像を取得する。
以下、検出する光の中心波長を2nmずつずらしながら、回折効率が最大となるVPH回折格子回転角αを設定して画像取得を繰返す。これらの動作を制御ユニット50により時系列的に切り替えながら行う。
以下に、本実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡1の第2の変形例について説明する。
本変形例においては、前述の画像を取得する際の処理において、ガルバノメータ38による回折格子37の回転角度の切り替えを、XYガルバノスキャナ22による走査に同期させ、XYガルバノスキャナ22の主走査であるXライン毎に行う。
このようにすることで、検出波長毎の時間差を極めて少なくでき、動きのある標本Aを正確に捉えることができる。
以下に、本実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡1の第3の変形例について説明する。
前述の第1の実施形態では色素毎に1つの中心波長でのみ検出していたが、本変形例においては、色素の分光特性に合わせて複数の中心波長でデータ取得し、同じ色素のデータとして合算する。
このようにすることで、同じ色素のデータが合算されるので、各画像におけるS/Nを向上することができる。
以下に、本実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡1の第4の変形例について説明する。
本変形例においては、回折格子37と回折格子37に入射する標本Aからの光の相対角度をブラッグの反射条件に合わせた場合における回折効率(図6における曲線51)の逆数を、波長毎に検出データに乗算する。
このようにすることで、波長毎の回折効率の違いを補正することができ、正確な分光データを取得することができる。
以下に、本実施形態の第1の変形例に係るレーザ走査型顕微鏡1の第5の変形例について説明する。
本変形例においては、図7に示すように、3種の蛍光(蛍光スペクトルA,B,C)をλスキャンして分光データを取得し、アンミキシング処理によりこれらの蛍光を分離する。
ΔλWS<ΔλWB
ここで、
ΔλWS:回折格子37の分光特性の回折効率50%地点の波長幅(半値幅)
ΔλWB:最もバンド幅が狭い、蛍光スペクトルBの分光特性の半値幅
ΔλWS<ΔλWB/2
ΔλPS<ΔλP/2
ここで、
ΔλPS:回折格子37によるλスキャンの波長ピッチ
ΔλP:複数の蛍光スペクトルのうち、ピーク間隔が最も近い蛍光色素(蛍光スペクトルA、B間)のピーク波長間隔
ΔλWS>ΔλPS
次に、本発明の第2の実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡について、図面を参照して説明する。本実施形態のレーザ顕微鏡装置2が第1の実施形態のレーザ顕微鏡装置1と異なる点は、標本からの光を導光する光路に検出ユニットを追加した点である。以下、本実施形態のレーザ顕微鏡装置2について、第1の実施形態のレーザ顕微鏡装置1と共通する点については説明を省略し、異なる点について主に説明する。
次に、本発明の第3の実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡について、図面を参照して説明する。本実施形態のレーザ顕微鏡装置3が第1の実施形態のレーザ顕微鏡装置1と異なる点は、回折格子37を透過してきた光(0次光)を検出する検出ユニットを追加した点である。以下、本実施形態のレーザ顕微鏡装置3について、第1の実施形態のレーザ顕微鏡装置1と共通する点については説明を省略し、異なる点について主に説明する。
照射光学系25は、第1の実施形態と同様に、ダイクロイックミラー21と、XYガルバノスキャナ22と、瞳投影レンズ23とを備えている。
また、0次光を検出する光検出部71を利用して、ビデオAFをかけても良い。
また、光検出部71は、IR反射光でDICなどの検出を行っても良い。
以下に、本実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡3の変形例について説明する。
本変形例においては、図11に示すように、光検出部71に代えて、回折格子37を透過する0次光を反射する反射ミラー72と、反射ミラー72により反射された0次光を光検出部36に向けて反射する反射ミラー73とを備えている。
次に、本発明の第4の実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡について、図面を参照して説明する。本実施形態のレーザ顕微鏡装置4が第1の実施形態のレーザ顕微鏡装置1と異なる点は、回折格子37を回転させるのではなく、回折格子37への入射角度を変化させる点である。以下、本実施形態のレーザ顕微鏡装置4について、第1の実施形態のレーザ顕微鏡装置1と共通する点については説明を省略し、異なる点について主に説明する。
照射光学系25は、第1の実施形態と同様に、ダイクロイックミラー21と、XYガルバノスキャナ22と、瞳投影レンズ23とを備えている。
次に、本発明の第5の実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡について、図面を参照して説明する。本実施形態のレーザ顕微鏡装置5が第1の実施形態のレーザ顕微鏡装置1と異なる点は、標本からの光をノンディスキャン検出するノンディスキャン検出ユニット80を備える点である。以下、本実施形態のレーザ顕微鏡装置5について、第1の実施形態のレーザ顕微鏡装置1と共通する点については説明を省略し、異なる点について主に説明する。
照射光学系25は、第1の実施形態と同様に、ダイクロイックミラー21と、XYガルバノスキャナ22と、瞳投影レンズ23とを備えている。
接続ユニット40は、結像レンズ41と、光源装置10からのレーザ光を反射する一方、標本Aからの光を透過するダイクロイックミラー87を備えている。
本実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡5は、多光子励起により生じた蛍光を、XYガルバノスキャナ22に戻さずノンディスキャン検出し、回折格子37を用いて、420〜700nmの波長帯域まで分光検出する。
XYガルバノスキャナ22の光軸と対物レンズ45の光軸との交点には、ダイクロイックミラー87が配置されている。
ダイクロイックミラー87の透過光路には、IRカットフィルタ81、結像レンズ82、反射ミラー83、瞳投影レンズ84、波長選択装置35、レンズ39、および光検出部36が配置されている。
回折格子37に入射する光は、瞳投影レンズ84により常に平行光となるが、XYガルバノスキャナ22による走査位置に応じて光軸に対する入射角度が変化する。
まず、図14に示すように、Xの画像右端(512ピクセル目)に対応する入射光93aが420nmの時に、ブラッグ反射する角度にVPH回折格子回転角(α1)を合わせてXYスキャンを行い、画像を取得する。この時、図15に示すように、画像右端(512ピクセル目)のデータを420nmのデータとして保存し、1〜511ピクセルのデータは廃棄する。
図24の矢印95に示すように、本実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡5によれば、各取得画像のX方向において同一ピクセルのデータをまとめることで、ピクセル毎の420nm〜700nmの分光データが取得できる。
1,2,3,4,5 レーザ走査型顕微鏡
10 光源装置
15 音響光学素子(波長選択手段)
20 スキャンユニット
22 XYガルバノスキャナ(走査部)
25 照射光学系
30 検出光学系
35 波長選択装置
36 光検出部
37 回折格子
38 ガルバノメータ(入射角度変更手段)
39 シリンドリカルレンズ(集光光学系)
40 接続ユニット
45 対物レンズ
50 制御ユニット
60 スキャンユニット(メインスキャンユニット)
70 分光ユニット
Claims (19)
- レーザ光を射出するレーザ光源と、
該レーザ光源から射出されたレーザ光を走査する走査部と、
該走査部により走査されたレーザ光を標本に照射する一方、前記標本からの光を集光する対物レンズと、
該対物レンズにより集光された前記標本からの光を複数の波長帯域に分散する透過型のVolume Phase Holographic(VPH)回折格子と、
該VPH回折格子により分散された光を検出する光検出部と、
前記標本からの光の前記VPH回折格子への入射角を変化させる入射角度変更手段とを備え、
前記入射角度変更手段は、前記光検出部により検出される複数の波長帯域の光がブラッグの反射条件をそれぞれ満たすように、前記標本からの光の前記VPH回折格子への入射角を、各検出波長帯域毎に変化させ、
前記入射角度変更手段による前記標本からの光の入射角度の切り替えを前記走査部による走査に同期して行うレーザ走査型顕微鏡。 - 前記入射角度変更手段が、前記VPH回折格子による分散方向に直交する軸線回りに前記VPH回折格子を回転させる請求項1に記載のレーザ走査型顕微鏡。
- 前記入射角度変更手段は、前記VPH回折格子に入射する検出光の角度を可変する反射ミラーであり、該反射ミラーと前記光検出部とが、前記VPH回折格子を挟んで略対称の位置に配置されている請求項1に記載のレーザ走査型顕微鏡。
- 前記光検出部により検出する波長帯域の中心波長に合わせて、前記入射角度変更手段を駆動させる制御部と、
前記入射角度変更手段の動作に同期して、前記レーザ光の波長を選択する波長選択手段とを備える請求項1から請求項3のいずれかに記載のレーザ走査型顕微鏡。 - 等間隔ピッチで検出波長を時系列的に切り替えて画像を取得(λスキャン)し、
各前記画像において対応するピクセルの輝度変化を用いて、ピクセル毎の分光データを取得する請求項1から請求項3のいずれかに記載のレーザ走査型顕微鏡。 - 前記光検出部により検出される光の中心波長のピッチが、前記VPH回折格子の回折効率が50%における波長幅よりも狭く設定されている請求項5に記載のレーザ走査型顕微鏡。
- 前記VPH回折格子の回折効率が50%における波長幅が、複数の蛍光色素の蛍光スペクトルのうち、バンド幅が最も狭い蛍光スペクトルの半値幅よりも狭く設定されている請求項5に記載のレーザ走査型顕微鏡。
- λスキャンの波長ピッチが、複数の蛍光色素のうちピーク波長の中心間隔が最も狭い間隔の半分以下に設定されている請求項5に記載のレーザ走査型顕微鏡。
- 前記走査部の主走査方向のライン毎に、前記入射角度変更手段による前記標本からの光の入射角度の切り替えを行う請求項1から請求項8のいずれかに記載のレーザ走査型顕微鏡。
- 前記VPH回折格子と前記VPH回折格子に入射する前記標本からの光の相対角度をブラッグの反射条件に合わせた場合における回折効率の逆数を、前記光検出部による検出データに波長毎に乗算する請求項1から請求項9のいずれかに記載のレーザ走査型顕微鏡。
- 前記VPH回折格子と前記光検出部との間に、前記VPH回折格子から分散される光を前記光検出部の有効受光面に集光する集光光学系を備える請求項1から請求項8のいずれかに記載のレーザ走査型顕微鏡。
- 前記集光光学系が、前記分散方向にのみ前記標本からの光を集光するシリンドリカルレンズである請求項11に記載のレーザ走査型顕微鏡。
- 前記VPH回折格子、前記入射角度変更手段、および前記光検出部から構成される分光ユニットと、前記標本からの光のうち検出する波長を選択可能な検出系を含むメインスキャンユニットとを備え、
前記分光ユニットと前記メインスキャンユニットとが着脱可能に構成されている請求項
1から請求項8のいずれかに記載のレーザ走査型顕微鏡。 - 前記VPH回折格子を直進する光(0次光)を検出する第2の光検出部を備える請求項1から請求項8のいずれかに記載のレーザ走査型顕微鏡。
- 前記VPH回折格子を直進する光(0次光)を、前記光検出部に再入力する再入力手段を備える請求項1から請求項8のいずれかに記載のレーザ走査型顕微鏡。
- 前記光検出部が、ノンディスキャン検出器であり、
前記入射角度変更手段により前記VPH回折格子への入射角を変化させながら、前記ノンディスキャン検出器により前記標本からの光から複数の画像を生成し、該複数の画像間のピクセルデータを結合する請求項1に記載のレーザ走査型顕微鏡。 - レーザ光を射出するレーザ光源と、
該レーザ光源から射出されたレーザ光を走査する走査部と、
該走査部により走査されたレーザ光を標本に照射する一方、前記標本からの光を集光する対物レンズと、
該対物レンズにより集光された前記標本からの光を複数の波長帯域に分散する透過型のVolume Phase Holographic(VPH)回折格子と、
該VPH回折格子により分散された光を検出する光検出部と、
前記標本からの光の前記VPH回折格子への入射角を変化させる入射角度変更手段とを備え、
前記入射角度変更手段は、前記光検出部により検出される複数の波長帯域の光がブラッグの反射条件をそれぞれ満たすように、前記標本からの光の前記VPH回折格子への入射角を、各検出波長帯域毎に変化させ、
前記VPH回折格子と前記VPH回折格子に入射する前記標本からの光の相対角度をブラッグの反射条件に合わせた場合における回折効率の逆数を、前記光検出部による検出データに波長毎に乗算するレーザ走査型顕微鏡。 - レーザ光を射出するレーザ光源と、
該レーザ光源から射出されたレーザ光を走査する走査部と、
該走査部により走査されたレーザ光を標本に照射する一方、前記標本からの光を集光する対物レンズと、
該対物レンズにより集光された前記標本からの光を複数の波長帯域に分散する透過型のVolume Phase Holographic(VPH)回折格子と、
該VPH回折格子により分散された光を検出する光検出部と、
前記標本からの光の前記VPH回折格子への入射角を変化させる入射角度変更手段と、
前記VPH回折格子、前記入射角度変更手段、および前記光検出部から構成される分光ユニットと、前記標本からの光のうち検出する波長を選択可能な検出系を含むメインスキャンユニットとを備え、
前記分光ユニットと前記メインスキャンユニットとが着脱可能に構成され、
前記入射角度変更手段は、前記光検出部により検出される複数の波長帯域の光がブラッグの反射条件をそれぞれ満たすように、前記標本からの光の前記VPH回折格子への入射角を、各検出波長帯域毎に変化させるレーザ走査型顕微鏡。 - レーザ光を射出するレーザ光源と、
該レーザ光源から射出されたレーザ光を走査する走査部と、
該走査部により走査されたレーザ光を標本に照射する一方、前記標本からの光を集光する対物レンズと、
該対物レンズにより集光された前記標本からの光を複数の波長帯域に分散する透過型のVolume Phase Holographic(VPH)回折格子と、
該VPH回折格子により分散された光を検出する光検出部と、
前記標本からの光の前記VPH回折格子への入射角を変化させる入射角度変更手段とを備え、
前記光検出部が、ノンディスキャン検出器であり、
前記入射角度変更手段は、前記光検出部により検出される複数の波長帯域の光がブラッグの反射条件をそれぞれ満たすように、前記標本からの光の前記VPH回折格子への入射角を、各検出波長帯域毎に変化させ、
前記入射角度変更手段により前記VPH回折格子への入射角を変化させながら、前記ノンディスキャン検出器により前記標本からの光から複数の画像を生成し、該複数の画像間のピクセルデータを結合するレーザ走査型顕微鏡。
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