JP2002316999A - モノクローナル抗体 - Google Patents
モノクローナル抗体Info
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- JP2002316999A JP2002316999A JP2001118285A JP2001118285A JP2002316999A JP 2002316999 A JP2002316999 A JP 2002316999A JP 2001118285 A JP2001118285 A JP 2001118285A JP 2001118285 A JP2001118285 A JP 2001118285A JP 2002316999 A JP2002316999 A JP 2002316999A
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- cells
- antibody
- tat
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- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【解決手段】 遊離のヒトアンチトロンビンIIIと反応
し、かつヒトトロンビン・ヒトアンチトロンビンIII複
合体とも反応する抗ヒトトロンビン・ヒトアンチトロン
ビンIII複合体モノクローナル抗体、及びこれを含有す
る免疫測定試薬。 【効果】 ヒト検体中のTAT濃度を精度良く、簡便、
迅速かつ高感度に検出することができる。
し、かつヒトトロンビン・ヒトアンチトロンビンIII複
合体とも反応する抗ヒトトロンビン・ヒトアンチトロン
ビンIII複合体モノクローナル抗体、及びこれを含有す
る免疫測定試薬。 【効果】 ヒト検体中のTAT濃度を精度良く、簡便、
迅速かつ高感度に検出することができる。
Description
【0001】
【発明の属する技術分野】本発明は、新規なモノクロー
ナル抗体、及びこれを用い、ヒト検体中のヒトトロンビ
ン・ヒトアンチトロンビンIII複合体濃度を精度良く、
簡便に測定することができ、血液凝固傾向の診断に有用
な免疫測定試薬に関する。
ナル抗体、及びこれを用い、ヒト検体中のヒトトロンビ
ン・ヒトアンチトロンビンIII複合体濃度を精度良く、
簡便に測定することができ、血液凝固傾向の診断に有用
な免疫測定試薬に関する。
【0002】
【従来の技術】ヒトアンチトロンビンIII(以下、ATI
IIという)は、血液凝固系のセリンプロテアーゼの重要
なインヒビターであり、ヒトトロンビンを始めとして活
性化されたヒト血液凝固第XII因子、ヒト血液凝固第X
I因子、ヒト血液凝固第X因子、ヒト血液凝固第IX因
子の活性を阻害する。ATIIIとセリンプロテアーゼと
の反応は、1:1のモル比で進行し、ATIIIのアルギ
ニン残基がセリンプロテアーゼの活性中心であるセリン
残基とエステル結合して複合体を形成することによりセ
リンプロテアーゼの活性を抑制する。このような複合体
のひとつとして、ヒトトロンビン・ヒトアンチトロンビ
ンIII複合体(以下、TATという)が知られている。
ヒトの血液中におけるTATの増加は、血液凝固機序の
始動、及びその活性化によってヒトトロンビン又は他の
血液凝固系のセリンプロテアーゼが生成したことを示す
ものと考えられている。従って、血液中のTAT量を測
定することにより、血液凝固系の動態の一端を知り得る
ものと推察され、それによって血液凝固面から患者の病
態を解明すること、例えば血栓形成あるいは汎発性血管
内血液凝固症(DIC)への病態の進展を早期に予知
し、適切な治療をすることが可能となる。
IIという)は、血液凝固系のセリンプロテアーゼの重要
なインヒビターであり、ヒトトロンビンを始めとして活
性化されたヒト血液凝固第XII因子、ヒト血液凝固第X
I因子、ヒト血液凝固第X因子、ヒト血液凝固第IX因
子の活性を阻害する。ATIIIとセリンプロテアーゼと
の反応は、1:1のモル比で進行し、ATIIIのアルギ
ニン残基がセリンプロテアーゼの活性中心であるセリン
残基とエステル結合して複合体を形成することによりセ
リンプロテアーゼの活性を抑制する。このような複合体
のひとつとして、ヒトトロンビン・ヒトアンチトロンビ
ンIII複合体(以下、TATという)が知られている。
ヒトの血液中におけるTATの増加は、血液凝固機序の
始動、及びその活性化によってヒトトロンビン又は他の
血液凝固系のセリンプロテアーゼが生成したことを示す
ものと考えられている。従って、血液中のTAT量を測
定することにより、血液凝固系の動態の一端を知り得る
ものと推察され、それによって血液凝固面から患者の病
態を解明すること、例えば血栓形成あるいは汎発性血管
内血液凝固症(DIC)への病態の進展を早期に予知
し、適切な治療をすることが可能となる。
【0003】ヒト検体中のTATを免疫学的に測定する
方法として、抗TATneoantigen−ポリクローナル抗体
を、125Iで標識したTATを用いてインヒビションア
ッセイすることによりTATを測定する方法( Herber
t, L. Lau, The Journal ofBiological Chemistry, 25
5, 5885-5893(1980));抗トロンビン−ポリクローナル
抗体を固相抗体に用い、抗ATIII−ポリクローナル抗
体を酵素標識抗体に用いたサンドイッチ系によるヒト検
体中のTATの測定方法(H. Pelzer, Thrombosis & Ha
emostasis, 59, 101-106(1988))などが提案されてい
る。また、H. Pelzerらの方法に準じたポリクローナル
抗体を用いたサンドイッチ系のキット(特開平3-48158
号)が提案され、商品化されている。
方法として、抗TATneoantigen−ポリクローナル抗体
を、125Iで標識したTATを用いてインヒビションア
ッセイすることによりTATを測定する方法( Herber
t, L. Lau, The Journal ofBiological Chemistry, 25
5, 5885-5893(1980));抗トロンビン−ポリクローナル
抗体を固相抗体に用い、抗ATIII−ポリクローナル抗
体を酵素標識抗体に用いたサンドイッチ系によるヒト検
体中のTATの測定方法(H. Pelzer, Thrombosis & Ha
emostasis, 59, 101-106(1988))などが提案されてい
る。また、H. Pelzerらの方法に準じたポリクローナル
抗体を用いたサンドイッチ系のキット(特開平3-48158
号)が提案され、商品化されている。
【0004】しかしながら、これらの測定方法は、いず
れもポリクローナル抗体を使用するため、抗体の均一性
に問題がある。また、ラジオイムノアッセイや酵素免疫
測定法であるため、汎用性の高い自動分析機への適用に
課題が残っている。すなわち、この均一でない抗体は検
体中に含まれる交差反応物と反応する確率が高く、測定
値が変動しやすいため、これまでの方法は、感度、精
度、簡便性、更に汎用性などの点で、現在の医療ニーズ
に合致するものとは云い難かった。
れもポリクローナル抗体を使用するため、抗体の均一性
に問題がある。また、ラジオイムノアッセイや酵素免疫
測定法であるため、汎用性の高い自動分析機への適用に
課題が残っている。すなわち、この均一でない抗体は検
体中に含まれる交差反応物と反応する確率が高く、測定
値が変動しやすいため、これまでの方法は、感度、精
度、簡便性、更に汎用性などの点で、現在の医療ニーズ
に合致するものとは云い難かった。
【0005】このような欠点を克服するには、モノクロ
ーナル抗体の利用が考えられる。抗TATモノクローナ
ル抗体としては、S. Asakuraら、Biochemica Biophysic
a Acta, 952, 37-47(1988)、フランス特許第2645647
号、特公平6-44876号、特開平7-238099号等が知られて
いる。しかしながら、これらのモノクローナル抗体にお
いても、実際に臨床検体中のTATを汎用性の高い自動
分析機を用いて簡便に定量測定できるラテックス凝集免
疫測定法等の凝集を原理とする免疫測定法に適用できる
ものはなかった。
ーナル抗体の利用が考えられる。抗TATモノクローナ
ル抗体としては、S. Asakuraら、Biochemica Biophysic
a Acta, 952, 37-47(1988)、フランス特許第2645647
号、特公平6-44876号、特開平7-238099号等が知られて
いる。しかしながら、これらのモノクローナル抗体にお
いても、実際に臨床検体中のTATを汎用性の高い自動
分析機を用いて簡便に定量測定できるラテックス凝集免
疫測定法等の凝集を原理とする免疫測定法に適用できる
ものはなかった。
【0006】
【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の目的
は、ヒト検体中のTAT測定において、ラテックス凝集
免疫測定法等の凝集を原理とする免疫測定法に用いるの
に好適なモノクローナル抗体を提供することにある。
は、ヒト検体中のTAT測定において、ラテックス凝集
免疫測定法等の凝集を原理とする免疫測定法に用いるの
に好適なモノクローナル抗体を提供することにある。
【0007】
【課題を解決するための手段】かかる実情において、本
発明者らは鋭意検討した結果、抗原に特異的なモノクロ
ーナル抗体を選択する際に、従来の酵素免疫測定法に加
え、TATを担持したラテックス等の不溶性担体を利用
することにより、汎用性、簡便性の高い免疫測定法に好
適に用いることができるモノクローナル抗体が得られ、
これを用いれば、ヒト検体中のTAT濃度を精度良く、
汎用性の高い自動分析機を用いて簡便に測定できること
を見出し、本発明を完成した。
発明者らは鋭意検討した結果、抗原に特異的なモノクロ
ーナル抗体を選択する際に、従来の酵素免疫測定法に加
え、TATを担持したラテックス等の不溶性担体を利用
することにより、汎用性、簡便性の高い免疫測定法に好
適に用いることができるモノクローナル抗体が得られ、
これを用いれば、ヒト検体中のTAT濃度を精度良く、
汎用性の高い自動分析機を用いて簡便に測定できること
を見出し、本発明を完成した。
【0008】すなわち、本発明は、遊離のヒトアンチト
ロンビンIIIと反応し、かつヒトトロンビン・ヒトアン
チトロンビンIII複合体とも反応する抗ヒトトロンビン
・ヒトアンチトロンビンIII複合体モノクローナル抗体
を提供するものである。
ロンビンIIIと反応し、かつヒトトロンビン・ヒトアン
チトロンビンIII複合体とも反応する抗ヒトトロンビン
・ヒトアンチトロンビンIII複合体モノクローナル抗体
を提供するものである。
【0009】また、本発明は、抗原物質で免疫した哺乳
動物の抗体産生細胞と、哺乳動物の骨髄腫細胞とを融合
させた後、酵素免疫測定法(以下、「ELISA法」と
いう)により抗原物質と反応する抗体を産生する細胞を
選択し、選択した細胞の中から、更にラテックス凝集免
疫測定法(以下、「LTIA法」という)等の凝集を原
理とする免疫測定法により抗原物質と反応する抗体を産
生する細胞を選択して該細胞を培養することを特徴とす
るモノクローナル抗体の製造方法を提供するものであ
る。
動物の抗体産生細胞と、哺乳動物の骨髄腫細胞とを融合
させた後、酵素免疫測定法(以下、「ELISA法」と
いう)により抗原物質と反応する抗体を産生する細胞を
選択し、選択した細胞の中から、更にラテックス凝集免
疫測定法(以下、「LTIA法」という)等の凝集を原
理とする免疫測定法により抗原物質と反応する抗体を産
生する細胞を選択して該細胞を培養することを特徴とす
るモノクローナル抗体の製造方法を提供するものであ
る。
【0010】また、本発明は、ヒトトロンビン・ヒトア
ンチトロンビンIII複合体で免疫した哺乳動物の抗体産
生細胞と、哺乳動物の骨髄腫細胞とを融合させて得られ
た、前記モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ
を提供するものである。
ンチトロンビンIII複合体で免疫した哺乳動物の抗体産
生細胞と、哺乳動物の骨髄腫細胞とを融合させて得られ
た、前記モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ
を提供するものである。
【0011】さらに、本発明は、前記抗ヒトトロンビン
・ヒトアンチトロンビンIII複合体モノクローナル抗体
を含有するヒトトロンビン・ヒトアンチトロンビンIII
複合体の免疫測定試薬を提供するものである。
・ヒトアンチトロンビンIII複合体モノクローナル抗体
を含有するヒトトロンビン・ヒトアンチトロンビンIII
複合体の免疫測定試薬を提供するものである。
【0012】
【発明の実施の形態】本発明のモノクローナル抗体は、
TATで免疫した哺乳動物の抗体産生細胞と、哺乳動物
由来の骨髄腫細胞とを融合して得られるハイブリドーマ
により産生され、常法により調製することができる(G.
Kohler and C. Milstein, Nature, 1975, 256 ; Yarmu
sh M. et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 2899-,
1980)。
TATで免疫した哺乳動物の抗体産生細胞と、哺乳動物
由来の骨髄腫細胞とを融合して得られるハイブリドーマ
により産生され、常法により調製することができる(G.
Kohler and C. Milstein, Nature, 1975, 256 ; Yarmu
sh M. et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 2899-,
1980)。
【0013】免疫原として用いられるTATは、ヒトト
ロンビンとATIIIを結合させることにより作成され
る。ここで用いられるヒトトロンビンとATIIIは、市
販品及びヒト血漿からの精製品のいずれでも使用するこ
とができる。ヒトトロンビンとATIIIは、1:1〜
1:5のモル比で混合し、結合したTATはカラムクロ
マトグラフィー等で精製して用いるのが好ましい。
ロンビンとATIIIを結合させることにより作成され
る。ここで用いられるヒトトロンビンとATIIIは、市
販品及びヒト血漿からの精製品のいずれでも使用するこ
とができる。ヒトトロンビンとATIIIは、1:1〜
1:5のモル比で混合し、結合したTATはカラムクロ
マトグラフィー等で精製して用いるのが好ましい。
【0014】ハイブリドーマは、例えば、得られたTA
Tを免疫原として哺乳動物体内に注射等することにより
調製される。免疫する哺乳動物は特に制限されず、後の
操作において細胞融合に使用する骨髄腫細胞との適合性
を考慮して選択するのが好ましく、具体的には、マウ
ス、ラット等が挙げられ、BALB/cマウスを用いる
のが一般的である。
Tを免疫原として哺乳動物体内に注射等することにより
調製される。免疫する哺乳動物は特に制限されず、後の
操作において細胞融合に使用する骨髄腫細胞との適合性
を考慮して選択するのが好ましく、具体的には、マウ
ス、ラット等が挙げられ、BALB/cマウスを用いる
のが一般的である。
【0015】前記の免疫原を哺乳動物に免疫する方法は
特に制限されず、例えばTAT単独又はTAT構成物質
の1種以上を組み合わせた免疫原を、哺乳動物の皮下、
皮内、腹腔内、血管内、筋肉、脾臓内等に注射する方
法;飼料又は水に加え、経口的に投与する方法等を用い
ることができる。また、免疫する際には、必要に応じて
アジュバントと併用することもできる。
特に制限されず、例えばTAT単独又はTAT構成物質
の1種以上を組み合わせた免疫原を、哺乳動物の皮下、
皮内、腹腔内、血管内、筋肉、脾臓内等に注射する方
法;飼料又は水に加え、経口的に投与する方法等を用い
ることができる。また、免疫する際には、必要に応じて
アジュバントと併用することもできる。
【0016】次に、免疫動物から採取した脾臓細胞をマ
ウス骨髄腫細胞と融合させる。マウス骨髄腫細胞として
は、ヒポキサンチン−グアニン−ホスホリボシルトラン
スフェラーゼ欠損(HGPRT-)、チミジンキナーゼ
欠損(TK-)等の適切なマーカーを有するものが好ま
しい。融合は、公知の方法に準じて行なうことができ、
融合促進剤として、ポリエチレングリコール、センダイ
ウイルス等を用いることができる。脾臓細胞と骨髄腫細
胞との混合比は、1:1〜10:1が好ましい。また、
電気融合法等による細胞融合を行なうこともできる。
ウス骨髄腫細胞と融合させる。マウス骨髄腫細胞として
は、ヒポキサンチン−グアニン−ホスホリボシルトラン
スフェラーゼ欠損(HGPRT-)、チミジンキナーゼ
欠損(TK-)等の適切なマーカーを有するものが好ま
しい。融合は、公知の方法に準じて行なうことができ、
融合促進剤として、ポリエチレングリコール、センダイ
ウイルス等を用いることができる。脾臓細胞と骨髄腫細
胞との混合比は、1:1〜10:1が好ましい。また、
電気融合法等による細胞融合を行なうこともできる。
【0017】本発明において、ラテックス凝集免疫測定
試薬等の凝集を原理とする免疫測定試薬に用いるのに好
適なモノクローナル抗体は、細胞融合の後、ELISA
法により抗原物質と反応する抗体を産生する細胞を選択
し、選択した細胞の中から、更にLTIA法等の凝集を
原理とする免疫測定法により抗原物質と反応する抗体を
産生する細胞を選択して該細胞を培養することにより、
製造することができる。
試薬等の凝集を原理とする免疫測定試薬に用いるのに好
適なモノクローナル抗体は、細胞融合の後、ELISA
法により抗原物質と反応する抗体を産生する細胞を選択
し、選択した細胞の中から、更にLTIA法等の凝集を
原理とする免疫測定法により抗原物質と反応する抗体を
産生する細胞を選択して該細胞を培養することにより、
製造することができる。
【0018】具体的には、ラテックス凝集免疫測定試薬
等の凝集を原理とする免疫測定試薬に用いるのに好適な
モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを選択するに
は、細胞融合の後、通常の細胞選択用培地(HAT培
地)で培養することによりハイブリドーマを選択すると
ともに、目的とするモノクローナル抗体を産生するハイ
ブリドーマをELISA法及びLTIA法等の凝集を原
理とする免疫測定法による選択と限界希釈法によるクロ
ーニングを繰り返すことにより、目的のハイブリドーマ
を樹立することができる。限界希釈法によるクローニン
グにおいては、フィーダーとしてマウス胸腺細胞、脾臓
細胞、腹腔マクロファージ、あるいは、これらと同様の
効果を示す公知の添加剤を用いるのが好ましい。
等の凝集を原理とする免疫測定試薬に用いるのに好適な
モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを選択するに
は、細胞融合の後、通常の細胞選択用培地(HAT培
地)で培養することによりハイブリドーマを選択すると
ともに、目的とするモノクローナル抗体を産生するハイ
ブリドーマをELISA法及びLTIA法等の凝集を原
理とする免疫測定法による選択と限界希釈法によるクロ
ーニングを繰り返すことにより、目的のハイブリドーマ
を樹立することができる。限界希釈法によるクローニン
グにおいては、フィーダーとしてマウス胸腺細胞、脾臓
細胞、腹腔マクロファージ、あるいは、これらと同様の
効果を示す公知の添加剤を用いるのが好ましい。
【0019】ELISA法は、公知の方法に準じて行な
うことができ、例えば、TATを直接又はTAT結合体
を介してELISAプレートに吸着させるか、あるい
は、抗マウスIg抗体を直接ELISAプレートに吸着
させた後、ハイブリドーマの培養上清を反応させ、次
に、酵素標識抗マウスIg抗体を反応させ、未反応の酵
素標識抗マウスIg抗体をELISAプレートから洗浄
除去した後に酵素反応を行ない、反応が陽性となったウ
エルに含まれる細胞を選択する。TAT結合体として
は、抗ATIII抗体、抗トロンビン抗体、抗プロトロン
ビン抗体、ヘパリン等を用いることができる。また、E
LISAプレートへの吸着は、物理吸着法又は化学結合
法を用いることができる。
うことができ、例えば、TATを直接又はTAT結合体
を介してELISAプレートに吸着させるか、あるい
は、抗マウスIg抗体を直接ELISAプレートに吸着
させた後、ハイブリドーマの培養上清を反応させ、次
に、酵素標識抗マウスIg抗体を反応させ、未反応の酵
素標識抗マウスIg抗体をELISAプレートから洗浄
除去した後に酵素反応を行ない、反応が陽性となったウ
エルに含まれる細胞を選択する。TAT結合体として
は、抗ATIII抗体、抗トロンビン抗体、抗プロトロン
ビン抗体、ヘパリン等を用いることができる。また、E
LISAプレートへの吸着は、物理吸着法又は化学結合
法を用いることができる。
【0020】また、LTIA法等の凝集を原理とする免
疫測定法は、生化学用自動分析装置を用い、TATを直
接又はTAT結合体を介して担持させた不溶性担体とモ
ノクローナル抗体結合体担持不溶性担体を用いてハイブ
リドーマの培養上清と反応させ、凝集が生じたウエルに
含まれる細胞を選択する方法である。TAT結合体とし
ては、抗ATIII抗体、抗トロンビン抗体、抗プロトロ
ンビン抗体、ヘパリン等を用いることができ、モノクロ
ーナル抗体結合体としては、プロテインA、プロテイン
G、抗マウスIg抗体等を用いることができる。また、
不溶性担体への吸着は、物理吸着法又は化学結合法を用
いることができる。
疫測定法は、生化学用自動分析装置を用い、TATを直
接又はTAT結合体を介して担持させた不溶性担体とモ
ノクローナル抗体結合体担持不溶性担体を用いてハイブ
リドーマの培養上清と反応させ、凝集が生じたウエルに
含まれる細胞を選択する方法である。TAT結合体とし
ては、抗ATIII抗体、抗トロンビン抗体、抗プロトロ
ンビン抗体、ヘパリン等を用いることができ、モノクロ
ーナル抗体結合体としては、プロテインA、プロテイン
G、抗マウスIg抗体等を用いることができる。また、
不溶性担体への吸着は、物理吸着法又は化学結合法を用
いることができる。
【0021】上記で選択したハイブリドーマは、適当な
培地中で培養するか、又はマウス等の腹腔内で培養する
ことにより、本発明のモノクローナル抗体を得ることが
できる。ここで用いられる培地としては、牛胎児血清、
抗生物質(ペニシリン、ストレプトマイシン等)を含む
RPMI1640培地が好ましい。培養は、例えば、上
記ハイブリドーマを104〜105個/mL濃度で培地に加
え、5%の炭酸ガス濃度、37℃の条件下で2〜4日間
程度行なうのが好ましい。得られた培養上清を遠心分離
すれば、本発明のモノクローナル抗体を得ることができ
る。一方、腹腔内培養の場合には、上記ハイブリドーマ
をBALB/cマウス、ヌードマウス、ヌードラット等
の腹腔内に投与し、その腹水を回収すれば良い。
培地中で培養するか、又はマウス等の腹腔内で培養する
ことにより、本発明のモノクローナル抗体を得ることが
できる。ここで用いられる培地としては、牛胎児血清、
抗生物質(ペニシリン、ストレプトマイシン等)を含む
RPMI1640培地が好ましい。培養は、例えば、上
記ハイブリドーマを104〜105個/mL濃度で培地に加
え、5%の炭酸ガス濃度、37℃の条件下で2〜4日間
程度行なうのが好ましい。得られた培養上清を遠心分離
すれば、本発明のモノクローナル抗体を得ることができ
る。一方、腹腔内培養の場合には、上記ハイブリドーマ
をBALB/cマウス、ヌードマウス、ヌードラット等
の腹腔内に投与し、その腹水を回収すれば良い。
【0022】このようにして得られた培養上清中又は腹
水中の本発明モノクローナル抗体は、このままでも使用
することができるが、例えば硫安沈澱による分画法、イ
オン交換クロマトグラフィー法、あるいはプロテイン
A、プロテインG若しくは抗マウスIg抗体結合担体を
用いるアフィニティークロマトグラフィー法、又は限外
膜濾過法等によって精製して用いるのが好ましい。
水中の本発明モノクローナル抗体は、このままでも使用
することができるが、例えば硫安沈澱による分画法、イ
オン交換クロマトグラフィー法、あるいはプロテイン
A、プロテインG若しくは抗マウスIg抗体結合担体を
用いるアフィニティークロマトグラフィー法、又は限外
膜濾過法等によって精製して用いるのが好ましい。
【0023】本発明の免疫測定試薬は、前記のようにし
て得られた抗TATモノクローナル抗体を含有するもの
であり、当該モノクローナル抗体を1種又は2種以上組
み合わせて用いることができる。また、TATに結合性
を有する物質、例えば抗ATIII抗体、抗トロンビン抗
体、抗プロトロンビン抗体、ヘパリン等を配合すること
もできる。
て得られた抗TATモノクローナル抗体を含有するもの
であり、当該モノクローナル抗体を1種又は2種以上組
み合わせて用いることができる。また、TATに結合性
を有する物質、例えば抗ATIII抗体、抗トロンビン抗
体、抗プロトロンビン抗体、ヘパリン等を配合すること
もできる。
【0024】本発明の試薬は、モノクローナル抗体結合
不溶性担体を懸濁させることにより調製されるが、不溶
性担体を懸濁させる液としては、例えばリン酸緩衝液、
グリシン緩衝液、トリス緩衝液、グッド緩衝液等の緩衝
液が使用される。反応のpHは5〜10、特にpH6〜
9が好ましい。
不溶性担体を懸濁させることにより調製されるが、不溶
性担体を懸濁させる液としては、例えばリン酸緩衝液、
グリシン緩衝液、トリス緩衝液、グッド緩衝液等の緩衝
液が使用される。反応のpHは5〜10、特にpH6〜
9が好ましい。
【0025】また、モノクローナル抗体を結合する不溶
性担体としては、特に制限されず、通常抗原又は抗体を
測定するのに用いられる物質であればいずれでも使用す
ることができ、ラテックス等の有機高分子物質、金属コ
ロイド等の無機高分子物質が好ましい。有機高分子物質
としては、特にアクリル酸重合体、スチレン重合体、メ
タクリル酸重合体等の樹脂から選ばれた1種又は2種以
上の微粉末を均一に懸濁させたラテックス粒子が好まし
い。また、カルボキシル基又はアミノ基等を有するラテ
ックスは、縮合剤又は二架橋試薬等を用いてモノクロー
ナル抗体を化学的に結合させる場合に好適に使用され
る。
性担体としては、特に制限されず、通常抗原又は抗体を
測定するのに用いられる物質であればいずれでも使用す
ることができ、ラテックス等の有機高分子物質、金属コ
ロイド等の無機高分子物質が好ましい。有機高分子物質
としては、特にアクリル酸重合体、スチレン重合体、メ
タクリル酸重合体等の樹脂から選ばれた1種又は2種以
上の微粉末を均一に懸濁させたラテックス粒子が好まし
い。また、カルボキシル基又はアミノ基等を有するラテ
ックスは、縮合剤又は二架橋試薬等を用いてモノクロー
ナル抗体を化学的に結合させる場合に好適に使用され
る。
【0026】不溶性担体の粒径は特に制限されず、凝集
体を直接光学的に測定する場合、又はイムノクロマトグ
ラフィー法による担体上で肉眼的に観察する場合は、一
般に、平均粒子径が1.6μm以下のものが好ましく、
特に平均粒子径0.01〜1μm、更に0.01〜0.
5μmのものが好ましい。また、凝集体を凝集板上で肉
眼的に観察する場合には、平均粒子径が1μm以上、特
に1〜20μmのものが好ましい。
体を直接光学的に測定する場合、又はイムノクロマトグ
ラフィー法による担体上で肉眼的に観察する場合は、一
般に、平均粒子径が1.6μm以下のものが好ましく、
特に平均粒子径0.01〜1μm、更に0.01〜0.
5μmのものが好ましい。また、凝集体を凝集板上で肉
眼的に観察する場合には、平均粒子径が1μm以上、特
に1〜20μmのものが好ましい。
【0027】モノクローナル抗体を不溶性担体に結合さ
せる方法は特に制限されず、モノクローナル抗体を直接
不溶性担体に物理吸着又は化学結合させることができ、
更に、モノクローナル抗体結合体を介して不溶性担体に
結合させることもできる。ここで、モノクローナル抗体
結合体としては、プロテインA、プロテインG、抗マウ
スIg抗体等を使用することができ、これらモノクロー
ナル抗体結合体の不溶性担体への結合は、物理吸着又は
化学結合のいずれでも良い。
せる方法は特に制限されず、モノクローナル抗体を直接
不溶性担体に物理吸着又は化学結合させることができ、
更に、モノクローナル抗体結合体を介して不溶性担体に
結合させることもできる。ここで、モノクローナル抗体
結合体としては、プロテインA、プロテインG、抗マウ
スIg抗体等を使用することができ、これらモノクロー
ナル抗体結合体の不溶性担体への結合は、物理吸着又は
化学結合のいずれでも良い。
【0028】本発明の免疫測定試薬は、測定対象となる
試料(血液等のヒト検体)と混合することにより使用さ
れ、試料中に存在するTATと本発明のモノクローナル
抗体が反応して凝集することにより、TATを測定する
ことができる。試料中のTATと反応して生じた凝集塊
の程度の測定は、光学的に測定することができ、かかる
凝集塊の光学的測定法としては、通常行なわれている方
法であれば特に制限されず、汎用の分光光度計、分光光
度測定を測定原理とした生化学用自動分析装置、近赤外
を測定波長とした装置、積分球濁度を測定原理とした装
置、散乱光強度を測定する装置等の光学的測定機器など
を用いることができる。本発明の免疫測定試薬は、特に
ラテックス凝集免疫測定試薬として好適である。
試料(血液等のヒト検体)と混合することにより使用さ
れ、試料中に存在するTATと本発明のモノクローナル
抗体が反応して凝集することにより、TATを測定する
ことができる。試料中のTATと反応して生じた凝集塊
の程度の測定は、光学的に測定することができ、かかる
凝集塊の光学的測定法としては、通常行なわれている方
法であれば特に制限されず、汎用の分光光度計、分光光
度測定を測定原理とした生化学用自動分析装置、近赤外
を測定波長とした装置、積分球濁度を測定原理とした装
置、散乱光強度を測定する装置等の光学的測定機器など
を用いることができる。本発明の免疫測定試薬は、特に
ラテックス凝集免疫測定試薬として好適である。
【0029】
【実施例】次に、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説
明するが、本発明はこれらにより何ら制限されるもので
はない。
明するが、本発明はこれらにより何ら制限されるもので
はない。
【0030】実施例1 (1)TATの調製:トロンビン製剤(ミドリ十字社
製)のα−トロンビンとATIII製剤(ヘキスト社製)
のATIIIを、0.02Mトリス緩衝液(pH7.4)
に溶解し、α−トロンビン:ATIII=1:1.5のモ
ル比で混合した後、37℃で10分間反応を行なった。
反応物をHeparin−Sepharose(ファルマシア社製)の2
×6cmのカラムにアプライし、吸着画分を0.1−2M
NaCl/0.02Mトリス緩衝液(pH7.4)の
リニアグラジエントで溶出した。各フラクションを4−
20%SDS−PAGE(第一化学薬品社製)にて分析
し、TAT画分を回収した。TAT濃度はELISA
(エンザイグノストTATベーリングベルケ社製)で測
定した結果、750μg/mLであった。
製)のα−トロンビンとATIII製剤(ヘキスト社製)
のATIIIを、0.02Mトリス緩衝液(pH7.4)
に溶解し、α−トロンビン:ATIII=1:1.5のモ
ル比で混合した後、37℃で10分間反応を行なった。
反応物をHeparin−Sepharose(ファルマシア社製)の2
×6cmのカラムにアプライし、吸着画分を0.1−2M
NaCl/0.02Mトリス緩衝液(pH7.4)の
リニアグラジエントで溶出した。各フラクションを4−
20%SDS−PAGE(第一化学薬品社製)にて分析
し、TAT画分を回収した。TAT濃度はELISA
(エンザイグノストTATベーリングベルケ社製)で測
定した結果、750μg/mLであった。
【0031】(2)免疫:上記TATの100μgを、
1回の免疫に使用した。初回免疫及び追加免疫ともにフ
ロインドの完全アジュバントを使用した。TAT100
μLとフロインドのアジュバント100μLを混合し、得
られたエマルジョン200μLを1回の免疫につき1匹
のBALB/c 雄マウスの腹腔に注射し、4回免疫を
2週間間隔で繰り返した。マウスの眼底静脈から採血
し、抗体価をELISA法で測定し、抗体価の高いマウ
スを選んで細胞融合に使用した。
1回の免疫に使用した。初回免疫及び追加免疫ともにフ
ロインドの完全アジュバントを使用した。TAT100
μLとフロインドのアジュバント100μLを混合し、得
られたエマルジョン200μLを1回の免疫につき1匹
のBALB/c 雄マウスの腹腔に注射し、4回免疫を
2週間間隔で繰り返した。マウスの眼底静脈から採血
し、抗体価をELISA法で測定し、抗体価の高いマウ
スを選んで細胞融合に使用した。
【0032】(3)細胞融合:4回目の免疫から2週間
後に、生理食塩水200μLに希釈したTAT100μg
をマウス腹腔に注射し、その3日後にマウスから脾臓を
摘出した。摘出した脾臓から脾細胞を回収し、生きた脾
細胞108個と予め培養しておいた対数増殖期のマウス
骨髄腫細胞(SP2/OあるいはP3U1)の107個
を混合した後、50%(w/v)のポリエチレングリコ
ール1540を含むGKN溶液(NaCl:8g,KC
l:0.4g,グルコース:2g,Na2HPO4:1.
41g,NaH2PO4・2H2O:0.78gを精製水
1Lに溶解)を用いて細胞を融合した。融合後の細胞を
HAT(10-4M ヒポキサンチン、4×10-7M アミ
ノプテリン、1.5×10-5M チミジン)、フィーダ
ー細胞を含む15%FCS RPMI培地に懸濁し、9
6穴マイクロカルチャープレートを用い、37℃、5%
炭酸ガス培養器中で培養した。
後に、生理食塩水200μLに希釈したTAT100μg
をマウス腹腔に注射し、その3日後にマウスから脾臓を
摘出した。摘出した脾臓から脾細胞を回収し、生きた脾
細胞108個と予め培養しておいた対数増殖期のマウス
骨髄腫細胞(SP2/OあるいはP3U1)の107個
を混合した後、50%(w/v)のポリエチレングリコ
ール1540を含むGKN溶液(NaCl:8g,KC
l:0.4g,グルコース:2g,Na2HPO4:1.
41g,NaH2PO4・2H2O:0.78gを精製水
1Lに溶解)を用いて細胞を融合した。融合後の細胞を
HAT(10-4M ヒポキサンチン、4×10-7M アミ
ノプテリン、1.5×10-5M チミジン)、フィーダ
ー細胞を含む15%FCS RPMI培地に懸濁し、9
6穴マイクロカルチャープレートを用い、37℃、5%
炭酸ガス培養器中で培養した。
【0033】(4)ELISA法による抗TATモノク
ローナル抗体の選択:培養上清中の抗TATモノクロー
ナル抗体を選択するため、PBSで希釈したTAT(1
μg/mL)、ATIII(1μg/mL)、あるいはヤギ抗マ
ウスIg抗体(1μg/mL:カッペルプロダクト社製)
を固相化した96穴マイクロプレートに培養上清を加
え、37℃1時間保温の後、PBSで洗浄し、0.1%
BSA−PBSで1000倍に希釈したペルオキシダー
ゼ標識抗マウスIg抗体(ヤギ由来:カッペルプロダク
ト社製)を加え、37℃で1時間保温した。これをPB
Sで洗浄後、基質液(0.2% オルトフェニレンジア
ミン、0.02%過酸化水素水を含むクエン酸−リン酸
緩衝液;pH5.0)を加えて室温で30分反応させ、
硫酸を加えて反応を停止させた後、吸光度を測定した。
吸光度が高い結果を出した上清のウエルを選択した。
ローナル抗体の選択:培養上清中の抗TATモノクロー
ナル抗体を選択するため、PBSで希釈したTAT(1
μg/mL)、ATIII(1μg/mL)、あるいはヤギ抗マ
ウスIg抗体(1μg/mL:カッペルプロダクト社製)
を固相化した96穴マイクロプレートに培養上清を加
え、37℃1時間保温の後、PBSで洗浄し、0.1%
BSA−PBSで1000倍に希釈したペルオキシダー
ゼ標識抗マウスIg抗体(ヤギ由来:カッペルプロダク
ト社製)を加え、37℃で1時間保温した。これをPB
Sで洗浄後、基質液(0.2% オルトフェニレンジア
ミン、0.02%過酸化水素水を含むクエン酸−リン酸
緩衝液;pH5.0)を加えて室温で30分反応させ、
硫酸を加えて反応を停止させた後、吸光度を測定した。
吸光度が高い結果を出した上清のウエルを選択した。
【0034】(5)ヘパリン担持ラテックス液の調製:
0.05Mホウ酸緩衝液(pH7.5)で2%濃度に調
製したアミノ化ポリスチレンラテックス(平均粒径0.
2μm、インターヘイシャル・ダイナミックス社製)の
懸濁液 6mLに、0.05Mホウ酸緩衝液(pH7.
5)で8mg/mLの濃度に調製したヘパリンナトリウム
(第一化学薬品社製)溶液 3mL及び0.05Mホウ酸
緩衝液(pH7.5)で2mg/mLの濃度に調製した1−
エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジ
イミド塩酸塩(同仁化学研究所製)溶液 3mLを加え、
25℃で4時間反応させた。さらに、グリシンを2%含
有した0.05Mホウ酸緩衝液(pH7.5) 4mLを
加え、25℃で一晩攪拌した。0.05Mグリシン緩衝
液(pH8.4)を用いて遠心洗浄を2回行なった後、
0.05Mグリシン緩衝液(pH8.4) 84mLに再
分散させ、ヘパリン担持ラテックス液(ヘパリン−L
x)を得た。
0.05Mホウ酸緩衝液(pH7.5)で2%濃度に調
製したアミノ化ポリスチレンラテックス(平均粒径0.
2μm、インターヘイシャル・ダイナミックス社製)の
懸濁液 6mLに、0.05Mホウ酸緩衝液(pH7.
5)で8mg/mLの濃度に調製したヘパリンナトリウム
(第一化学薬品社製)溶液 3mL及び0.05Mホウ酸
緩衝液(pH7.5)で2mg/mLの濃度に調製した1−
エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジ
イミド塩酸塩(同仁化学研究所製)溶液 3mLを加え、
25℃で4時間反応させた。さらに、グリシンを2%含
有した0.05Mホウ酸緩衝液(pH7.5) 4mLを
加え、25℃で一晩攪拌した。0.05Mグリシン緩衝
液(pH8.4)を用いて遠心洗浄を2回行なった後、
0.05Mグリシン緩衝液(pH8.4) 84mLに再
分散させ、ヘパリン担持ラテックス液(ヘパリン−L
x)を得た。
【0035】(6)プロテインA担持ラテックス液の調
製:プロテインA(シグマ社製)60mgを精製水 8.
4mLに溶解した後、0.25Mグリシン緩衝液(pH
8.4)で一晩透析した。このプロテインA液 7.7m
Lに、0.25Mグリシン緩衝液(pH8.4)を加え
て13mLとし、これに、0.25Mグリシン緩衝液(p
H8.4)で2%濃度に調製した平均粒径0.2μmの
ポリスチレンラテックス(積水化学工業社製)の懸濁液
13mLを加え、4℃にて一晩攪拌した。次に、2%牛
血清アルブミンを含む0.05Mグリシン緩衝液(pH
8.4)を加え、4℃で一晩攪拌した。遠心洗浄により
上清を除去した後、0.05Mグリシン緩衝液(pH
8.4)182mLを加えて良く混和し、プロテインA担
持ラテックス液(プロテインA−Lx)を得た。
製:プロテインA(シグマ社製)60mgを精製水 8.
4mLに溶解した後、0.25Mグリシン緩衝液(pH
8.4)で一晩透析した。このプロテインA液 7.7m
Lに、0.25Mグリシン緩衝液(pH8.4)を加え
て13mLとし、これに、0.25Mグリシン緩衝液(p
H8.4)で2%濃度に調製した平均粒径0.2μmの
ポリスチレンラテックス(積水化学工業社製)の懸濁液
13mLを加え、4℃にて一晩攪拌した。次に、2%牛
血清アルブミンを含む0.05Mグリシン緩衝液(pH
8.4)を加え、4℃で一晩攪拌した。遠心洗浄により
上清を除去した後、0.05Mグリシン緩衝液(pH
8.4)182mLを加えて良く混和し、プロテインA担
持ラテックス液(プロテインA−Lx)を得た。
【0036】(7)TAT担持ラテックス液の調製:上
記(1)で調製した10mgのTATを、0.25Mグリ
シン緩衝液(pH8.4)で一晩透析した。このTAT
溶液に、0.25Mグリシン緩衝液(pH8.4)を加
えて13mLとし、これに、0.25Mグリシン緩衝液
(pH8.4)で2%濃度に調製した平均粒径0.2μ
mのポリスチレンラテックス(積水化学工業社製)の懸
濁液 13mLを加え、4℃で一晩攪拌した。次に、2%
牛血清アルブミンを含む0.05Mグリシン緩衝液(p
H8.4)を加え、4℃で一晩攪拌した。遠心洗浄によ
り上清を除去した後、0.05Mグリシン緩衝液(pH
8.4)182mLを加えてよく混和し、TAT担持ラテ
ックス液(TAT−Lx)を得た。
記(1)で調製した10mgのTATを、0.25Mグリ
シン緩衝液(pH8.4)で一晩透析した。このTAT
溶液に、0.25Mグリシン緩衝液(pH8.4)を加
えて13mLとし、これに、0.25Mグリシン緩衝液
(pH8.4)で2%濃度に調製した平均粒径0.2μ
mのポリスチレンラテックス(積水化学工業社製)の懸
濁液 13mLを加え、4℃で一晩攪拌した。次に、2%
牛血清アルブミンを含む0.05Mグリシン緩衝液(p
H8.4)を加え、4℃で一晩攪拌した。遠心洗浄によ
り上清を除去した後、0.05Mグリシン緩衝液(pH
8.4)182mLを加えてよく混和し、TAT担持ラテ
ックス液(TAT−Lx)を得た。
【0037】(8)LTIA法による抗TATモノクロ
ーナル抗体の選択:前記(4)において、ELISA法
にて培養上清中の抗TATモノクローナル抗体の存在が
確認されたハイブリドーマについて、更に、ラテックス
凝集免疫測定試薬に好適なモノクローナル抗体を選択し
た。すなわち、第1試薬として、10%グリセリン、
0.1%アルブミンを含有した0.02Mトリス緩衝液
(pH9.0)に1μg/mLのTAT又はATIIIを溶解
した液を用い、第1試薬200μLに培養上清20μLを
加え、37℃で5分間加温後、第2試薬として上記で調
製した2mLのヘパリン担持ラテックス液と2mLのプロテ
インA担持ラテックス液を混合した溶液100μLを加
えて攪拌した。また、TAT及びATIIIを除いた第1
試薬200μLに培養上清20μLを加え、37℃で5分
間加温後、第2試薬として、上記で調製した2mLのTA
T担持ラテックス液と2mLのプロテインA担持ラテック
ス液を混合した溶液100μLを加えて攪拌した。その
後、波長600nmにおける1〜5分間の吸光度変化量を
測定し、いずれの場合にも吸光度の高いものを選択し
た。
ーナル抗体の選択:前記(4)において、ELISA法
にて培養上清中の抗TATモノクローナル抗体の存在が
確認されたハイブリドーマについて、更に、ラテックス
凝集免疫測定試薬に好適なモノクローナル抗体を選択し
た。すなわち、第1試薬として、10%グリセリン、
0.1%アルブミンを含有した0.02Mトリス緩衝液
(pH9.0)に1μg/mLのTAT又はATIIIを溶解
した液を用い、第1試薬200μLに培養上清20μLを
加え、37℃で5分間加温後、第2試薬として上記で調
製した2mLのヘパリン担持ラテックス液と2mLのプロテ
インA担持ラテックス液を混合した溶液100μLを加
えて攪拌した。また、TAT及びATIIIを除いた第1
試薬200μLに培養上清20μLを加え、37℃で5分
間加温後、第2試薬として、上記で調製した2mLのTA
T担持ラテックス液と2mLのプロテインA担持ラテック
ス液を混合した溶液100μLを加えて攪拌した。その
後、波長600nmにおける1〜5分間の吸光度変化量を
測定し、いずれの場合にも吸光度の高いものを選択し
た。
【0038】(9)抗TATモノクローナル抗体産生細
胞の樹立:ELISA法及びLTIA法で陽性を示した
細胞について、常法により、限界希釈法にて単クローン
化を行なった。すなわち、BALB/cマウスの胸腺細
胞及び15%FCS含有RPMI1640培地を含む9
6穴マイクロカルチャープレートを用い、特異抗体陽性
細胞を37℃、5%炭酸ガス培養器中で培養した。EL
ISA法による特異抗体陽性ウエルの選択及び限界希釈
法による単クローン化操作を各3回繰り返して、抗TA
Tモノクローナル抗体産生細胞を樹立した。得られたハ
イブリドーマのうち3株は、それぞれ26221、26
223、26403と命名し、産業技術総合研究所生命
工学工業技術研究所に寄託した。この株名と受託番号を
表1に示す。
胞の樹立:ELISA法及びLTIA法で陽性を示した
細胞について、常法により、限界希釈法にて単クローン
化を行なった。すなわち、BALB/cマウスの胸腺細
胞及び15%FCS含有RPMI1640培地を含む9
6穴マイクロカルチャープレートを用い、特異抗体陽性
細胞を37℃、5%炭酸ガス培養器中で培養した。EL
ISA法による特異抗体陽性ウエルの選択及び限界希釈
法による単クローン化操作を各3回繰り返して、抗TA
Tモノクローナル抗体産生細胞を樹立した。得られたハ
イブリドーマのうち3株は、それぞれ26221、26
223、26403と命名し、産業技術総合研究所生命
工学工業技術研究所に寄託した。この株名と受託番号を
表1に示す。
【0039】
【表1】
【0040】(10)抗TATモノクローナル抗体の分
離及び精製:前記で得た抗TATモノクローナル抗体産
生ハイブリドーマをマウス腹腔内で培養して、モノクロ
ーナル抗体を調製した。前処理として8週齢のBALB
/cマウスの腹腔内に0.5mLのプリスタン(2,6,
10,14−テトラメチルペンタデカン)を投与した。
8日後、0.5mLのRPMI1640培地に浮遊した細
胞5×105個をこのマウスの腹腔内に投与した。投与
後9日目から腹水を繰り返し採取してプールした。集め
た腹水は3,000rpmで10分遠心分離を行ない、細
胞等の不溶物を除去した。上清部分に等量の飽和硫酸ア
ンモニウム溶液を攪拌しながら加え、一夜、4℃に放置
して得られた沈澱を遠心分離によって回収した。沈澱を
20mM Tris-HCl緩衝液(pH8.0)に溶解、透析し
た。同緩衝液で平衡化したDEAE-Sephacel(ファルマシ
ア社製)カラムに透析内容物を吸着させた後、同緩衝液
中のNaCl 0−0.3Mの濃度勾配で溶出させ、精
製抗体を得た。
離及び精製:前記で得た抗TATモノクローナル抗体産
生ハイブリドーマをマウス腹腔内で培養して、モノクロ
ーナル抗体を調製した。前処理として8週齢のBALB
/cマウスの腹腔内に0.5mLのプリスタン(2,6,
10,14−テトラメチルペンタデカン)を投与した。
8日後、0.5mLのRPMI1640培地に浮遊した細
胞5×105個をこのマウスの腹腔内に投与した。投与
後9日目から腹水を繰り返し採取してプールした。集め
た腹水は3,000rpmで10分遠心分離を行ない、細
胞等の不溶物を除去した。上清部分に等量の飽和硫酸ア
ンモニウム溶液を攪拌しながら加え、一夜、4℃に放置
して得られた沈澱を遠心分離によって回収した。沈澱を
20mM Tris-HCl緩衝液(pH8.0)に溶解、透析し
た。同緩衝液で平衡化したDEAE-Sephacel(ファルマシ
ア社製)カラムに透析内容物を吸着させた後、同緩衝液
中のNaCl 0−0.3Mの濃度勾配で溶出させ、精
製抗体を得た。
【0041】(11)抗TATモノクローナル抗体の反
応特異性:上記で得られたモノクローナル抗体の反応特
異性は、固相化したTAT、ATIII、トロンビン及び
プロトロンビンとの反応性をELISA法により、遊離
のTAT及びATIIIとの反応性をLTIA法により確
認した。すなわち、ELISA法は、TAT(1μg/m
L)、ATIII(1μg/mL)、トロンビン(1μg/m
L)、プロトロンビン(1μg/mL)を96穴マイクロプ
レートに固相化し、培養上清の代わりに精製モノクロー
ナル抗体(5μg/mL)を用い、前記(4)と同様にし
て、行なった。また、LTIA法は、第1試薬として1
0%グリセリン、0.1%アルブミンを含有した0.0
2Mトリス緩衝液(pH9.0)に1μg/mLのTAT
又はATIIIを溶解した液を用い、第1試薬200μLに
試料として5μg/mLの精製抗モノクローナル抗体20
μLを加え、37℃で5分間加温後、第2試薬として上
記で調製した2mLのヘパリン担持ラテックス液と2mLの
プロテインA担持ラテックス液を混合した溶液100μ
Lを加えて攪拌した。その後、波長600nmにおける吸
光度を測定した。結果を表2に示す。
応特異性:上記で得られたモノクローナル抗体の反応特
異性は、固相化したTAT、ATIII、トロンビン及び
プロトロンビンとの反応性をELISA法により、遊離
のTAT及びATIIIとの反応性をLTIA法により確
認した。すなわち、ELISA法は、TAT(1μg/m
L)、ATIII(1μg/mL)、トロンビン(1μg/m
L)、プロトロンビン(1μg/mL)を96穴マイクロプ
レートに固相化し、培養上清の代わりに精製モノクロー
ナル抗体(5μg/mL)を用い、前記(4)と同様にし
て、行なった。また、LTIA法は、第1試薬として1
0%グリセリン、0.1%アルブミンを含有した0.0
2Mトリス緩衝液(pH9.0)に1μg/mLのTAT
又はATIIIを溶解した液を用い、第1試薬200μLに
試料として5μg/mLの精製抗モノクローナル抗体20
μLを加え、37℃で5分間加温後、第2試薬として上
記で調製した2mLのヘパリン担持ラテックス液と2mLの
プロテインA担持ラテックス液を混合した溶液100μ
Lを加えて攪拌した。その後、波長600nmにおける吸
光度を測定した。結果を表2に示す。
【0042】
【表2】
【0043】(12)抗TATモノクローナル抗体の反
応性:前記(11)のLTIA法と同様にして、精製抗
モノクローナル抗体(26221、26223、264
03又は26210(特開平7-238099号記載のもの))
を用い、反応性を確認した。波長600nmにおける1〜
5分間の吸光度変化量を測定した結果を表3に示す。
応性:前記(11)のLTIA法と同様にして、精製抗
モノクローナル抗体(26221、26223、264
03又は26210(特開平7-238099号記載のもの))
を用い、反応性を確認した。波長600nmにおける1〜
5分間の吸光度変化量を測定した結果を表3に示す。
【0044】
【表3】
【0045】表3の結果より、本発明のモノクローナル
抗体は、TAT及びATIIIとの反応性が高く、ラテッ
クス凝集免疫測定試薬に好適であることが確認された。
抗体は、TAT及びATIIIとの反応性が高く、ラテッ
クス凝集免疫測定試薬に好適であることが確認された。
【0046】(13)抗TATモノクローナル抗体担持
ラテックスの調製:上記で精製した抗TATモノクロー
ナル抗体(26221、26223、26403又は2
6210)を、0.25Mグリシン緩衝液(pH8.
4)で一晩透析した後、1.4mg/mLの濃度に調製した
液5mLに、0.25Mグリシン緩衝液(pH8.4)で
2%の濃度に調製した平均粒径0.2μmのポリスチレ
ンラテックスの懸濁液5mLを加え、4℃にて一晩攪拌し
た。次に、2%牛血清アルブミンを含む0.05Mグリ
シン緩衝液(pH8.4)50mLを加えてよく混和し、
各モノクローナル抗体担持ラテックス液を得た。
ラテックスの調製:上記で精製した抗TATモノクロー
ナル抗体(26221、26223、26403又は2
6210)を、0.25Mグリシン緩衝液(pH8.
4)で一晩透析した後、1.4mg/mLの濃度に調製した
液5mLに、0.25Mグリシン緩衝液(pH8.4)で
2%の濃度に調製した平均粒径0.2μmのポリスチレ
ンラテックスの懸濁液5mLを加え、4℃にて一晩攪拌し
た。次に、2%牛血清アルブミンを含む0.05Mグリ
シン緩衝液(pH8.4)50mLを加えてよく混和し、
各モノクローナル抗体担持ラテックス液を得た。
【0047】(14)ラテックス凝集免疫測定試薬での
TATの測定:第1試薬として、2%NaCl、2%ポ
リエチレングリコール6000、0.1%アルブミンを
含有する0.02Mトリス緩衝液(pH9.0)を調製
した。一方、第2試薬として、上記で調製した各モノク
ローナル抗体担持ラテックス液とヘパリン担持ラテック
ス液の1:1混合液を調製した。第1試薬200μL
に、1、10又は100ng/mLのTAT溶解液20μL
を加え、37℃で5分間加温後、第2試薬100μLを
加えて攪拌した。その後、波長600nmにおける1〜5
分間の吸光度変化量を測定した。結果を表4に示す。
TATの測定:第1試薬として、2%NaCl、2%ポ
リエチレングリコール6000、0.1%アルブミンを
含有する0.02Mトリス緩衝液(pH9.0)を調製
した。一方、第2試薬として、上記で調製した各モノク
ローナル抗体担持ラテックス液とヘパリン担持ラテック
ス液の1:1混合液を調製した。第1試薬200μL
に、1、10又は100ng/mLのTAT溶解液20μL
を加え、37℃で5分間加温後、第2試薬100μLを
加えて攪拌した。その後、波長600nmにおける1〜5
分間の吸光度変化量を測定した。結果を表4に示す。
【0048】
【表4】
【0049】
【発明の効果】本発明のモノクローナル抗体は、TAT
及びATIIIとの反応性が高く、免疫測定試薬として好
適であり、ヒト検体中のTAT濃度を精度良く、簡便、
迅速かつ高感度に検出することができる。
及びATIIIとの反応性が高く、免疫測定試薬として好
適であり、ヒト検体中のTAT濃度を精度良く、簡便、
迅速かつ高感度に検出することができる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 FI テーマコート゛(参考) G01N 33/543 581 C12N 5/00 33/577 15/00 C Fターム(参考) 4B024 AA11 BA44 GA03 HA15 4B064 AG27 CA10 CA20 CC24 DA01 DA13 4B065 AA92X AB05 CA25 CA44 CA46 4H045 AA11 AA20 AA30 CA42 DA76 EA24 EA50 FA72 GA10 GA15
Claims (8)
- 【請求項1】 遊離のヒトアンチトロンビンIIIと反応
し、かつヒトトロンビン・ヒトアンチトロンビンIII複
合体とも反応する抗ヒトトロンビン・ヒトアンチトロン
ビンIII複合体モノクローナル抗体。 - 【請求項2】 抗原物質で免疫した哺乳動物の抗体産生
細胞と、哺乳動物の骨髄腫細胞とを融合させた後、酵素
免疫測定法により抗原物質と反応する抗体を産生する細
胞を選択し、選択した細胞の中から、更にラテックス凝
集免疫測定法により抗原物質と反応する抗体を産生する
細胞を選択して該細胞を培養することを特徴とするモノ
クローナル抗体の製造方法。 - 【請求項3】 モノクローナル抗体が、ラテックス凝集
免疫測定試薬に用いるものである請求項2記載の製造方
法。 - 【請求項4】 ヒトトロンビン・ヒトアンチトロンビン
III複合体で免疫した哺乳動物の抗体産生細胞と、哺乳
動物の骨髄腫細胞とを融合させた後、酵素免疫測定法に
よりヒトトロンビン・ヒトアンチトロンビンIII複合体
と反応する抗体を産生する細胞を選択し、選択した細胞
の中から、更にラテックス凝集免疫測定法によりヒトト
ロンビン・ヒトアンチトロンビンIII複合体と反応する
抗体を産生する細胞を選択して該細胞を培養することを
特徴とする請求項1記載の抗ヒトトロンビン・ヒトアン
チトロンビンIII複合体モノクローナル抗体の製造方
法。 - 【請求項5】 ヒトトロンビン・ヒトアンチトロンビン
III複合体で免疫した哺乳動物の抗体産生細胞と、哺乳
動物の骨髄腫細胞とを融合させて得られた、請求項1記
載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。 - 【請求項6】 受託番号が、FERM P−1827
6、FERM P−18277、又はFERM P−1
8278である請求項5記載のハイブリドーマ。 - 【請求項7】 請求項1記載の抗ヒトトロンビン・ヒト
アンチトロンビンIII複合体モノクローナル抗体を含有
するヒトトロンビン・ヒトアンチトロンビンIII複合体
の免疫測定試薬。 - 【請求項8】 請求項1記載の抗ヒトトロンビン・ヒト
アンチトロンビンIII複合体モノクローナル抗体を含有
するヒトトロンビン・ヒトアンチトロンビンIII複合体
のラテックス凝集免疫測定試薬。
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---|---|---|---|
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JP (1) | JP2002316999A (ja) |
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN105223348A (zh) * | 2014-05-26 | 2016-01-06 | 北京九强生物技术股份有限公司 | 人抗凝血酶iii的胶乳增强免疫比浊法检测试剂盒 |
US9593166B2 (en) | 2013-03-14 | 2017-03-14 | Bayer Healthcare Llc | Monoclonal antibodies against antithrombin β |
KR20170132310A (ko) | 2015-03-31 | 2017-12-01 | 가부시키가이샤 엘에스아이 메디엔스 | 트롬빈 안티트롬빈 복합체의 측정 시약 및 측정 방법 |
KR20180069913A (ko) | 2015-10-30 | 2018-06-25 | 가부시키가이샤 엘에스아이 메디엔스 | 트롬빈 안티트롬빈 복합체의 측정 시약 및 측정 방법 |
Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS62138187A (ja) * | 1985-12-13 | 1987-06-20 | Yatoron:Kk | 抗トロンビン・アンチトロンビン3複合体モノクローナル抗体、及びその製造方法、並びにそれを用いるトロンビン・アンチトロンビン3複合体の免疫定量法、及びそれを用いるトロンビン・アンチトロンビン3複合体の精製方法 |
JPH08120000A (ja) * | 1994-10-18 | 1996-05-14 | Iatron Lab Inc | 抗ヒトビトロネクチン・トロンビン・アンチトロンビンiii 複合体モノクローナル抗体、ハイブリドーマ及び免疫学的測定方法 |
JPH0967398A (ja) * | 1995-08-30 | 1997-03-11 | Eiken Chem Co Ltd | 血清アミロイドaを認識するモノクローナル抗体 |
JPH09176199A (ja) * | 1995-12-26 | 1997-07-08 | Iatron Lab Inc | 抗ファクターXa・ティシュファクターパスウェイインヒビター複合体モノクローナル抗体及びその使用 |
JP2000146973A (ja) * | 1998-11-17 | 2000-05-26 | Sekisui Chem Co Ltd | Iv型コラーゲンの免疫測定法及び試薬 |
JP2001221800A (ja) * | 2000-02-14 | 2001-08-17 | Internatl Reagents Corp | 複合体の測定方法 |
-
2001
- 2001-04-17 JP JP2001118285A patent/JP2002316999A/ja active Pending
Patent Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS62138187A (ja) * | 1985-12-13 | 1987-06-20 | Yatoron:Kk | 抗トロンビン・アンチトロンビン3複合体モノクローナル抗体、及びその製造方法、並びにそれを用いるトロンビン・アンチトロンビン3複合体の免疫定量法、及びそれを用いるトロンビン・アンチトロンビン3複合体の精製方法 |
JPH08120000A (ja) * | 1994-10-18 | 1996-05-14 | Iatron Lab Inc | 抗ヒトビトロネクチン・トロンビン・アンチトロンビンiii 複合体モノクローナル抗体、ハイブリドーマ及び免疫学的測定方法 |
JPH0967398A (ja) * | 1995-08-30 | 1997-03-11 | Eiken Chem Co Ltd | 血清アミロイドaを認識するモノクローナル抗体 |
JPH09176199A (ja) * | 1995-12-26 | 1997-07-08 | Iatron Lab Inc | 抗ファクターXa・ティシュファクターパスウェイインヒビター複合体モノクローナル抗体及びその使用 |
JP2000146973A (ja) * | 1998-11-17 | 2000-05-26 | Sekisui Chem Co Ltd | Iv型コラーゲンの免疫測定法及び試薬 |
JP2001221800A (ja) * | 2000-02-14 | 2001-08-17 | Internatl Reagents Corp | 複合体の測定方法 |
Cited By (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US9593166B2 (en) | 2013-03-14 | 2017-03-14 | Bayer Healthcare Llc | Monoclonal antibodies against antithrombin β |
US9908942B2 (en) | 2013-03-14 | 2018-03-06 | Bayer Healthcare, Llc | Monoclonal antibodies against antithrombin β |
US10144784B2 (en) | 2013-03-14 | 2018-12-04 | Bayer Healthcare Llc | Monoclonal antibodies against antithrombin beta |
CN105223348A (zh) * | 2014-05-26 | 2016-01-06 | 北京九强生物技术股份有限公司 | 人抗凝血酶iii的胶乳增强免疫比浊法检测试剂盒 |
KR20170132310A (ko) | 2015-03-31 | 2017-12-01 | 가부시키가이샤 엘에스아이 메디엔스 | 트롬빈 안티트롬빈 복합체의 측정 시약 및 측정 방법 |
US11237157B2 (en) | 2015-03-31 | 2022-02-01 | Lsi Medience Corporation | Reagent and method for assaying thrombin-antithrombin complex |
KR20180069913A (ko) | 2015-10-30 | 2018-06-25 | 가부시키가이샤 엘에스아이 메디엔스 | 트롬빈 안티트롬빈 복합체의 측정 시약 및 측정 방법 |
US11378577B2 (en) | 2015-10-30 | 2022-07-05 | Lsi Medience Corporation | Reagent and method for measuring thrombin-antithrombin complex |
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