JP2002316999A - モノクローナル抗体 - Google Patents
モノクローナル抗体Info
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Abstract
(57)【要約】
【解決手段】 遊離のヒトアンチトロンビンIIIと反応
し、かつヒトトロンビン・ヒトアンチトロンビンIII複
合体とも反応する抗ヒトトロンビン・ヒトアンチトロン
ビンIII複合体モノクローナル抗体、及びこれを含有す
る免疫測定試薬。 【効果】 ヒト検体中のＴＡＴ濃度を精度良く、簡便、
迅速かつ高感度に検出することができる。
し、かつヒトトロンビン・ヒトアンチトロンビンIII複
合体とも反応する抗ヒトトロンビン・ヒトアンチトロン
ビンIII複合体モノクローナル抗体、及びこれを含有す
る免疫測定試薬。 【効果】 ヒト検体中のＴＡＴ濃度を精度良く、簡便、
迅速かつ高感度に検出することができる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、新規なモノクロー
ナル抗体、及びこれを用い、ヒト検体中のヒトトロンビ
ン・ヒトアンチトロンビンIII複合体濃度を精度良く、
簡便に測定することができ、血液凝固傾向の診断に有用
な免疫測定試薬に関する。
ナル抗体、及びこれを用い、ヒト検体中のヒトトロンビ
ン・ヒトアンチトロンビンIII複合体濃度を精度良く、
簡便に測定することができ、血液凝固傾向の診断に有用
な免疫測定試薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】ヒトアンチトロンビンIII（以下、ＡＴI
IIという）は、血液凝固系のセリンプロテアーゼの重要
なインヒビターであり、ヒトトロンビンを始めとして活
性化されたヒト血液凝固第ＸII因子、ヒト血液凝固第Ｘ
Ｉ因子、ヒト血液凝固第Ｘ因子、ヒト血液凝固第ＩＸ因
子の活性を阻害する。ＡＴIIIとセリンプロテアーゼと
の反応は、１：１のモル比で進行し、ＡＴIIIのアルギ
ニン残基がセリンプロテアーゼの活性中心であるセリン
残基とエステル結合して複合体を形成することによりセ
リンプロテアーゼの活性を抑制する。このような複合体
のひとつとして、ヒトトロンビン・ヒトアンチトロンビ
ンIII複合体（以下、ＴＡＴという）が知られている。
ヒトの血液中におけるＴＡＴの増加は、血液凝固機序の
始動、及びその活性化によってヒトトロンビン又は他の
血液凝固系のセリンプロテアーゼが生成したことを示す
ものと考えられている。従って、血液中のＴＡＴ量を測
定することにより、血液凝固系の動態の一端を知り得る
ものと推察され、それによって血液凝固面から患者の病
態を解明すること、例えば血栓形成あるいは汎発性血管
内血液凝固症（ＤＩＣ）への病態の進展を早期に予知
し、適切な治療をすることが可能となる。
IIという）は、血液凝固系のセリンプロテアーゼの重要
なインヒビターであり、ヒトトロンビンを始めとして活
性化されたヒト血液凝固第ＸII因子、ヒト血液凝固第Ｘ
Ｉ因子、ヒト血液凝固第Ｘ因子、ヒト血液凝固第ＩＸ因
子の活性を阻害する。ＡＴIIIとセリンプロテアーゼと
の反応は、１：１のモル比で進行し、ＡＴIIIのアルギ
ニン残基がセリンプロテアーゼの活性中心であるセリン
残基とエステル結合して複合体を形成することによりセ
リンプロテアーゼの活性を抑制する。このような複合体
のひとつとして、ヒトトロンビン・ヒトアンチトロンビ
ンIII複合体（以下、ＴＡＴという）が知られている。
ヒトの血液中におけるＴＡＴの増加は、血液凝固機序の
始動、及びその活性化によってヒトトロンビン又は他の
血液凝固系のセリンプロテアーゼが生成したことを示す
ものと考えられている。従って、血液中のＴＡＴ量を測
定することにより、血液凝固系の動態の一端を知り得る
ものと推察され、それによって血液凝固面から患者の病
態を解明すること、例えば血栓形成あるいは汎発性血管
内血液凝固症（ＤＩＣ）への病態の進展を早期に予知
し、適切な治療をすることが可能となる。
【０００３】ヒト検体中のＴＡＴを免疫学的に測定する
方法として、抗ＴＡＴneoantigen−ポリクローナル抗体
を、125Ｉで標識したＴＡＴを用いてインヒビションア
ッセイすることによりＴＡＴを測定する方法（ Herber
t, L. Lau, The Journal ofBiological Chemistry, 25
5, 5885-5893(1980)）；抗トロンビン−ポリクローナル
抗体を固相抗体に用い、抗ＡＴIII−ポリクローナル抗
体を酵素標識抗体に用いたサンドイッチ系によるヒト検
体中のＴＡＴの測定方法（H. Pelzer, Thrombosis & Ha
emostasis, 59, 101-106(1988)）などが提案されてい
る。また、H. Pelzerらの方法に準じたポリクローナル
抗体を用いたサンドイッチ系のキット（特開平3-48158
号）が提案され、商品化されている。
方法として、抗ＴＡＴneoantigen−ポリクローナル抗体
を、125Ｉで標識したＴＡＴを用いてインヒビションア
ッセイすることによりＴＡＴを測定する方法（ Herber
t, L. Lau, The Journal ofBiological Chemistry, 25
5, 5885-5893(1980)）；抗トロンビン−ポリクローナル
抗体を固相抗体に用い、抗ＡＴIII−ポリクローナル抗
体を酵素標識抗体に用いたサンドイッチ系によるヒト検
体中のＴＡＴの測定方法（H. Pelzer, Thrombosis & Ha
emostasis, 59, 101-106(1988)）などが提案されてい
る。また、H. Pelzerらの方法に準じたポリクローナル
抗体を用いたサンドイッチ系のキット（特開平3-48158
号）が提案され、商品化されている。
【０００４】しかしながら、これらの測定方法は、いず
れもポリクローナル抗体を使用するため、抗体の均一性
に問題がある。また、ラジオイムノアッセイや酵素免疫
測定法であるため、汎用性の高い自動分析機への適用に
課題が残っている。すなわち、この均一でない抗体は検
体中に含まれる交差反応物と反応する確率が高く、測定
値が変動しやすいため、これまでの方法は、感度、精
度、簡便性、更に汎用性などの点で、現在の医療ニーズ
に合致するものとは云い難かった。
れもポリクローナル抗体を使用するため、抗体の均一性
に問題がある。また、ラジオイムノアッセイや酵素免疫
測定法であるため、汎用性の高い自動分析機への適用に
課題が残っている。すなわち、この均一でない抗体は検
体中に含まれる交差反応物と反応する確率が高く、測定
値が変動しやすいため、これまでの方法は、感度、精
度、簡便性、更に汎用性などの点で、現在の医療ニーズ
に合致するものとは云い難かった。
【０００５】このような欠点を克服するには、モノクロ
ーナル抗体の利用が考えられる。抗ＴＡＴモノクローナ
ル抗体としては、S. Asakuraら、Biochemica Biophysic
a Acta, 952, 37-47(1988)、フランス特許第2645647
号、特公平6-44876号、特開平7-238099号等が知られて
いる。しかしながら、これらのモノクローナル抗体にお
いても、実際に臨床検体中のＴＡＴを汎用性の高い自動
分析機を用いて簡便に定量測定できるラテックス凝集免
疫測定法等の凝集を原理とする免疫測定法に適用できる
ものはなかった。
ーナル抗体の利用が考えられる。抗ＴＡＴモノクローナ
ル抗体としては、S. Asakuraら、Biochemica Biophysic
a Acta, 952, 37-47(1988)、フランス特許第2645647
号、特公平6-44876号、特開平7-238099号等が知られて
いる。しかしながら、これらのモノクローナル抗体にお
いても、実際に臨床検体中のＴＡＴを汎用性の高い自動
分析機を用いて簡便に定量測定できるラテックス凝集免
疫測定法等の凝集を原理とする免疫測定法に適用できる
ものはなかった。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の目的
は、ヒト検体中のＴＡＴ測定において、ラテックス凝集
免疫測定法等の凝集を原理とする免疫測定法に用いるの
に好適なモノクローナル抗体を提供することにある。
は、ヒト検体中のＴＡＴ測定において、ラテックス凝集
免疫測定法等の凝集を原理とする免疫測定法に用いるの
に好適なモノクローナル抗体を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】かかる実情において、本
発明者らは鋭意検討した結果、抗原に特異的なモノクロ
ーナル抗体を選択する際に、従来の酵素免疫測定法に加
え、ＴＡＴを担持したラテックス等の不溶性担体を利用
することにより、汎用性、簡便性の高い免疫測定法に好
適に用いることができるモノクローナル抗体が得られ、
これを用いれば、ヒト検体中のＴＡＴ濃度を精度良く、
汎用性の高い自動分析機を用いて簡便に測定できること
を見出し、本発明を完成した。
発明者らは鋭意検討した結果、抗原に特異的なモノクロ
ーナル抗体を選択する際に、従来の酵素免疫測定法に加
え、ＴＡＴを担持したラテックス等の不溶性担体を利用
することにより、汎用性、簡便性の高い免疫測定法に好
適に用いることができるモノクローナル抗体が得られ、
これを用いれば、ヒト検体中のＴＡＴ濃度を精度良く、
汎用性の高い自動分析機を用いて簡便に測定できること
を見出し、本発明を完成した。
【０００８】すなわち、本発明は、遊離のヒトアンチト
ロンビンIIIと反応し、かつヒトトロンビン・ヒトアン
チトロンビンIII複合体とも反応する抗ヒトトロンビン
・ヒトアンチトロンビンIII複合体モノクローナル抗体
を提供するものである。
ロンビンIIIと反応し、かつヒトトロンビン・ヒトアン
チトロンビンIII複合体とも反応する抗ヒトトロンビン
・ヒトアンチトロンビンIII複合体モノクローナル抗体
を提供するものである。
【０００９】また、本発明は、抗原物質で免疫した哺乳
動物の抗体産生細胞と、哺乳動物の骨髄腫細胞とを融合
させた後、酵素免疫測定法（以下、「ＥＬＩＳＡ法」と
いう）により抗原物質と反応する抗体を産生する細胞を
選択し、選択した細胞の中から、更にラテックス凝集免
疫測定法（以下、「ＬＴＩＡ法」という）等の凝集を原
理とする免疫測定法により抗原物質と反応する抗体を産
生する細胞を選択して該細胞を培養することを特徴とす
るモノクローナル抗体の製造方法を提供するものであ
る。
動物の抗体産生細胞と、哺乳動物の骨髄腫細胞とを融合
させた後、酵素免疫測定法（以下、「ＥＬＩＳＡ法」と
いう）により抗原物質と反応する抗体を産生する細胞を
選択し、選択した細胞の中から、更にラテックス凝集免
疫測定法（以下、「ＬＴＩＡ法」という）等の凝集を原
理とする免疫測定法により抗原物質と反応する抗体を産
生する細胞を選択して該細胞を培養することを特徴とす
るモノクローナル抗体の製造方法を提供するものであ
る。
【００１０】また、本発明は、ヒトトロンビン・ヒトア
ンチトロンビンIII複合体で免疫した哺乳動物の抗体産
生細胞と、哺乳動物の骨髄腫細胞とを融合させて得られ
た、前記モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ
を提供するものである。
ンチトロンビンIII複合体で免疫した哺乳動物の抗体産
生細胞と、哺乳動物の骨髄腫細胞とを融合させて得られ
た、前記モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ
を提供するものである。
【００１１】さらに、本発明は、前記抗ヒトトロンビン
・ヒトアンチトロンビンIII複合体モノクローナル抗体
を含有するヒトトロンビン・ヒトアンチトロンビンIII
複合体の免疫測定試薬を提供するものである。
・ヒトアンチトロンビンIII複合体モノクローナル抗体
を含有するヒトトロンビン・ヒトアンチトロンビンIII
複合体の免疫測定試薬を提供するものである。
【００１２】
【発明の実施の形態】本発明のモノクローナル抗体は、
ＴＡＴで免疫した哺乳動物の抗体産生細胞と、哺乳動物
由来の骨髄腫細胞とを融合して得られるハイブリドーマ
により産生され、常法により調製することができる（G.
Kohler and C. Milstein, Nature, 1975, 256 ; Yarmu
sh M. et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 2899-,
1980）。
ＴＡＴで免疫した哺乳動物の抗体産生細胞と、哺乳動物
由来の骨髄腫細胞とを融合して得られるハイブリドーマ
により産生され、常法により調製することができる（G.
Kohler and C. Milstein, Nature, 1975, 256 ; Yarmu
sh M. et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 2899-,
1980）。
【００１３】免疫原として用いられるＴＡＴは、ヒトト
ロンビンとＡＴIIIを結合させることにより作成され
る。ここで用いられるヒトトロンビンとＡＴIIIは、市
販品及びヒト血漿からの精製品のいずれでも使用するこ
とができる。ヒトトロンビンとＡＴIIIは、１：１〜
１：５のモル比で混合し、結合したＴＡＴはカラムクロ
マトグラフィー等で精製して用いるのが好ましい。
ロンビンとＡＴIIIを結合させることにより作成され
る。ここで用いられるヒトトロンビンとＡＴIIIは、市
販品及びヒト血漿からの精製品のいずれでも使用するこ
とができる。ヒトトロンビンとＡＴIIIは、１：１〜
１：５のモル比で混合し、結合したＴＡＴはカラムクロ
マトグラフィー等で精製して用いるのが好ましい。
【００１４】ハイブリドーマは、例えば、得られたＴＡ
Ｔを免疫原として哺乳動物体内に注射等することにより
調製される。免疫する哺乳動物は特に制限されず、後の
操作において細胞融合に使用する骨髄腫細胞との適合性
を考慮して選択するのが好ましく、具体的には、マウ
ス、ラット等が挙げられ、ＢＡＬＢ／ｃマウスを用いる
のが一般的である。
Ｔを免疫原として哺乳動物体内に注射等することにより
調製される。免疫する哺乳動物は特に制限されず、後の
操作において細胞融合に使用する骨髄腫細胞との適合性
を考慮して選択するのが好ましく、具体的には、マウ
ス、ラット等が挙げられ、ＢＡＬＢ／ｃマウスを用いる
のが一般的である。
【００１５】前記の免疫原を哺乳動物に免疫する方法は
特に制限されず、例えばＴＡＴ単独又はＴＡＴ構成物質
の１種以上を組み合わせた免疫原を、哺乳動物の皮下、
皮内、腹腔内、血管内、筋肉、脾臓内等に注射する方
法；飼料又は水に加え、経口的に投与する方法等を用い
ることができる。また、免疫する際には、必要に応じて
アジュバントと併用することもできる。
特に制限されず、例えばＴＡＴ単独又はＴＡＴ構成物質
の１種以上を組み合わせた免疫原を、哺乳動物の皮下、
皮内、腹腔内、血管内、筋肉、脾臓内等に注射する方
法；飼料又は水に加え、経口的に投与する方法等を用い
ることができる。また、免疫する際には、必要に応じて
アジュバントと併用することもできる。
【００１６】次に、免疫動物から採取した脾臓細胞をマ
ウス骨髄腫細胞と融合させる。マウス骨髄腫細胞として
は、ヒポキサンチン−グアニン−ホスホリボシルトラン
スフェラーゼ欠損（ＨＧＰＲＴ-）、チミジンキナーゼ
欠損（ＴＫ-）等の適切なマーカーを有するものが好ま
しい。融合は、公知の方法に準じて行なうことができ、
融合促進剤として、ポリエチレングリコール、センダイ
ウイルス等を用いることができる。脾臓細胞と骨髄腫細
胞との混合比は、１：１〜１０：１が好ましい。また、
電気融合法等による細胞融合を行なうこともできる。
ウス骨髄腫細胞と融合させる。マウス骨髄腫細胞として
は、ヒポキサンチン−グアニン−ホスホリボシルトラン
スフェラーゼ欠損（ＨＧＰＲＴ-）、チミジンキナーゼ
欠損（ＴＫ-）等の適切なマーカーを有するものが好ま
しい。融合は、公知の方法に準じて行なうことができ、
融合促進剤として、ポリエチレングリコール、センダイ
ウイルス等を用いることができる。脾臓細胞と骨髄腫細
胞との混合比は、１：１〜１０：１が好ましい。また、
電気融合法等による細胞融合を行なうこともできる。
【００１７】本発明において、ラテックス凝集免疫測定
試薬等の凝集を原理とする免疫測定試薬に用いるのに好
適なモノクローナル抗体は、細胞融合の後、ＥＬＩＳＡ
法により抗原物質と反応する抗体を産生する細胞を選択
し、選択した細胞の中から、更にＬＴＩＡ法等の凝集を
原理とする免疫測定法により抗原物質と反応する抗体を
産生する細胞を選択して該細胞を培養することにより、
製造することができる。
試薬等の凝集を原理とする免疫測定試薬に用いるのに好
適なモノクローナル抗体は、細胞融合の後、ＥＬＩＳＡ
法により抗原物質と反応する抗体を産生する細胞を選択
し、選択した細胞の中から、更にＬＴＩＡ法等の凝集を
原理とする免疫測定法により抗原物質と反応する抗体を
産生する細胞を選択して該細胞を培養することにより、
製造することができる。
【００１８】具体的には、ラテックス凝集免疫測定試薬
等の凝集を原理とする免疫測定試薬に用いるのに好適な
モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを選択するに
は、細胞融合の後、通常の細胞選択用培地（ＨＡＴ培
地）で培養することによりハイブリドーマを選択すると
ともに、目的とするモノクローナル抗体を産生するハイ
ブリドーマをＥＬＩＳＡ法及びＬＴＩＡ法等の凝集を原
理とする免疫測定法による選択と限界希釈法によるクロ
ーニングを繰り返すことにより、目的のハイブリドーマ
を樹立することができる。限界希釈法によるクローニン
グにおいては、フィーダーとしてマウス胸腺細胞、脾臓
細胞、腹腔マクロファージ、あるいは、これらと同様の
効果を示す公知の添加剤を用いるのが好ましい。
等の凝集を原理とする免疫測定試薬に用いるのに好適な
モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを選択するに
は、細胞融合の後、通常の細胞選択用培地（ＨＡＴ培
地）で培養することによりハイブリドーマを選択すると
ともに、目的とするモノクローナル抗体を産生するハイ
ブリドーマをＥＬＩＳＡ法及びＬＴＩＡ法等の凝集を原
理とする免疫測定法による選択と限界希釈法によるクロ
ーニングを繰り返すことにより、目的のハイブリドーマ
を樹立することができる。限界希釈法によるクローニン
グにおいては、フィーダーとしてマウス胸腺細胞、脾臓
細胞、腹腔マクロファージ、あるいは、これらと同様の
効果を示す公知の添加剤を用いるのが好ましい。
【００１９】ＥＬＩＳＡ法は、公知の方法に準じて行な
うことができ、例えば、ＴＡＴを直接又はＴＡＴ結合体
を介してＥＬＩＳＡプレートに吸着させるか、あるい
は、抗マウスＩｇ抗体を直接ＥＬＩＳＡプレートに吸着
させた後、ハイブリドーマの培養上清を反応させ、次
に、酵素標識抗マウスＩｇ抗体を反応させ、未反応の酵
素標識抗マウスＩｇ抗体をＥＬＩＳＡプレートから洗浄
除去した後に酵素反応を行ない、反応が陽性となったウ
エルに含まれる細胞を選択する。ＴＡＴ結合体として
は、抗ＡＴIII抗体、抗トロンビン抗体、抗プロトロン
ビン抗体、ヘパリン等を用いることができる。また、Ｅ
ＬＩＳＡプレートへの吸着は、物理吸着法又は化学結合
法を用いることができる。
うことができ、例えば、ＴＡＴを直接又はＴＡＴ結合体
を介してＥＬＩＳＡプレートに吸着させるか、あるい
は、抗マウスＩｇ抗体を直接ＥＬＩＳＡプレートに吸着
させた後、ハイブリドーマの培養上清を反応させ、次
に、酵素標識抗マウスＩｇ抗体を反応させ、未反応の酵
素標識抗マウスＩｇ抗体をＥＬＩＳＡプレートから洗浄
除去した後に酵素反応を行ない、反応が陽性となったウ
エルに含まれる細胞を選択する。ＴＡＴ結合体として
は、抗ＡＴIII抗体、抗トロンビン抗体、抗プロトロン
ビン抗体、ヘパリン等を用いることができる。また、Ｅ
ＬＩＳＡプレートへの吸着は、物理吸着法又は化学結合
法を用いることができる。
【００２０】また、ＬＴＩＡ法等の凝集を原理とする免
疫測定法は、生化学用自動分析装置を用い、ＴＡＴを直
接又はＴＡＴ結合体を介して担持させた不溶性担体とモ
ノクローナル抗体結合体担持不溶性担体を用いてハイブ
リドーマの培養上清と反応させ、凝集が生じたウエルに
含まれる細胞を選択する方法である。ＴＡＴ結合体とし
ては、抗ＡＴIII抗体、抗トロンビン抗体、抗プロトロ
ンビン抗体、ヘパリン等を用いることができ、モノクロ
ーナル抗体結合体としては、プロテインＡ、プロテイン
Ｇ、抗マウスＩｇ抗体等を用いることができる。また、
不溶性担体への吸着は、物理吸着法又は化学結合法を用
いることができる。
疫測定法は、生化学用自動分析装置を用い、ＴＡＴを直
接又はＴＡＴ結合体を介して担持させた不溶性担体とモ
ノクローナル抗体結合体担持不溶性担体を用いてハイブ
リドーマの培養上清と反応させ、凝集が生じたウエルに
含まれる細胞を選択する方法である。ＴＡＴ結合体とし
ては、抗ＡＴIII抗体、抗トロンビン抗体、抗プロトロ
ンビン抗体、ヘパリン等を用いることができ、モノクロ
ーナル抗体結合体としては、プロテインＡ、プロテイン
Ｇ、抗マウスＩｇ抗体等を用いることができる。また、
不溶性担体への吸着は、物理吸着法又は化学結合法を用
いることができる。
【００２１】上記で選択したハイブリドーマは、適当な
培地中で培養するか、又はマウス等の腹腔内で培養する
ことにより、本発明のモノクローナル抗体を得ることが
できる。ここで用いられる培地としては、牛胎児血清、
抗生物質（ペニシリン、ストレプトマイシン等）を含む
ＲＰＭＩ１６４０培地が好ましい。培養は、例えば、上
記ハイブリドーマを１０4〜１０5個／mL濃度で培地に加
え、５％の炭酸ガス濃度、３７℃の条件下で２〜４日間
程度行なうのが好ましい。得られた培養上清を遠心分離
すれば、本発明のモノクローナル抗体を得ることができ
る。一方、腹腔内培養の場合には、上記ハイブリドーマ
をＢＡＬＢ／ｃマウス、ヌードマウス、ヌードラット等
の腹腔内に投与し、その腹水を回収すれば良い。
培地中で培養するか、又はマウス等の腹腔内で培養する
ことにより、本発明のモノクローナル抗体を得ることが
できる。ここで用いられる培地としては、牛胎児血清、
抗生物質（ペニシリン、ストレプトマイシン等）を含む
ＲＰＭＩ１６４０培地が好ましい。培養は、例えば、上
記ハイブリドーマを１０4〜１０5個／mL濃度で培地に加
え、５％の炭酸ガス濃度、３７℃の条件下で２〜４日間
程度行なうのが好ましい。得られた培養上清を遠心分離
すれば、本発明のモノクローナル抗体を得ることができ
る。一方、腹腔内培養の場合には、上記ハイブリドーマ
をＢＡＬＢ／ｃマウス、ヌードマウス、ヌードラット等
の腹腔内に投与し、その腹水を回収すれば良い。
【００２２】このようにして得られた培養上清中又は腹
水中の本発明モノクローナル抗体は、このままでも使用
することができるが、例えば硫安沈澱による分画法、イ
オン交換クロマトグラフィー法、あるいはプロテイン
Ａ、プロテインＧ若しくは抗マウスＩｇ抗体結合担体を
用いるアフィニティークロマトグラフィー法、又は限外
膜濾過法等によって精製して用いるのが好ましい。
水中の本発明モノクローナル抗体は、このままでも使用
することができるが、例えば硫安沈澱による分画法、イ
オン交換クロマトグラフィー法、あるいはプロテイン
Ａ、プロテインＧ若しくは抗マウスＩｇ抗体結合担体を
用いるアフィニティークロマトグラフィー法、又は限外
膜濾過法等によって精製して用いるのが好ましい。
【００２３】本発明の免疫測定試薬は、前記のようにし
て得られた抗ＴＡＴモノクローナル抗体を含有するもの
であり、当該モノクローナル抗体を１種又は２種以上組
み合わせて用いることができる。また、ＴＡＴに結合性
を有する物質、例えば抗ＡＴIII抗体、抗トロンビン抗
体、抗プロトロンビン抗体、ヘパリン等を配合すること
もできる。
て得られた抗ＴＡＴモノクローナル抗体を含有するもの
であり、当該モノクローナル抗体を１種又は２種以上組
み合わせて用いることができる。また、ＴＡＴに結合性
を有する物質、例えば抗ＡＴIII抗体、抗トロンビン抗
体、抗プロトロンビン抗体、ヘパリン等を配合すること
もできる。
【００２４】本発明の試薬は、モノクローナル抗体結合
不溶性担体を懸濁させることにより調製されるが、不溶
性担体を懸濁させる液としては、例えばリン酸緩衝液、
グリシン緩衝液、トリス緩衝液、グッド緩衝液等の緩衝
液が使用される。反応のｐＨは５〜１０、特にｐＨ６〜
９が好ましい。
不溶性担体を懸濁させることにより調製されるが、不溶
性担体を懸濁させる液としては、例えばリン酸緩衝液、
グリシン緩衝液、トリス緩衝液、グッド緩衝液等の緩衝
液が使用される。反応のｐＨは５〜１０、特にｐＨ６〜
９が好ましい。
【００２５】また、モノクローナル抗体を結合する不溶
性担体としては、特に制限されず、通常抗原又は抗体を
測定するのに用いられる物質であればいずれでも使用す
ることができ、ラテックス等の有機高分子物質、金属コ
ロイド等の無機高分子物質が好ましい。有機高分子物質
としては、特にアクリル酸重合体、スチレン重合体、メ
タクリル酸重合体等の樹脂から選ばれた１種又は２種以
上の微粉末を均一に懸濁させたラテックス粒子が好まし
い。また、カルボキシル基又はアミノ基等を有するラテ
ックスは、縮合剤又は二架橋試薬等を用いてモノクロー
ナル抗体を化学的に結合させる場合に好適に使用され
る。
性担体としては、特に制限されず、通常抗原又は抗体を
測定するのに用いられる物質であればいずれでも使用す
ることができ、ラテックス等の有機高分子物質、金属コ
ロイド等の無機高分子物質が好ましい。有機高分子物質
としては、特にアクリル酸重合体、スチレン重合体、メ
タクリル酸重合体等の樹脂から選ばれた１種又は２種以
上の微粉末を均一に懸濁させたラテックス粒子が好まし
い。また、カルボキシル基又はアミノ基等を有するラテ
ックスは、縮合剤又は二架橋試薬等を用いてモノクロー
ナル抗体を化学的に結合させる場合に好適に使用され
る。
【００２６】不溶性担体の粒径は特に制限されず、凝集
体を直接光学的に測定する場合、又はイムノクロマトグ
ラフィー法による担体上で肉眼的に観察する場合は、一
般に、平均粒子径が１．６μm以下のものが好ましく、
特に平均粒子径０．０１〜１μm、更に０．０１〜０．
５μmのものが好ましい。また、凝集体を凝集板上で肉
眼的に観察する場合には、平均粒子径が１μm以上、特
に１〜２０μmのものが好ましい。
体を直接光学的に測定する場合、又はイムノクロマトグ
ラフィー法による担体上で肉眼的に観察する場合は、一
般に、平均粒子径が１．６μm以下のものが好ましく、
特に平均粒子径０．０１〜１μm、更に０．０１〜０．
５μmのものが好ましい。また、凝集体を凝集板上で肉
眼的に観察する場合には、平均粒子径が１μm以上、特
に１〜２０μmのものが好ましい。
【００２７】モノクローナル抗体を不溶性担体に結合さ
せる方法は特に制限されず、モノクローナル抗体を直接
不溶性担体に物理吸着又は化学結合させることができ、
更に、モノクローナル抗体結合体を介して不溶性担体に
結合させることもできる。ここで、モノクローナル抗体
結合体としては、プロテインＡ、プロテインＧ、抗マウ
スＩｇ抗体等を使用することができ、これらモノクロー
ナル抗体結合体の不溶性担体への結合は、物理吸着又は
化学結合のいずれでも良い。
せる方法は特に制限されず、モノクローナル抗体を直接
不溶性担体に物理吸着又は化学結合させることができ、
更に、モノクローナル抗体結合体を介して不溶性担体に
結合させることもできる。ここで、モノクローナル抗体
結合体としては、プロテインＡ、プロテインＧ、抗マウ
スＩｇ抗体等を使用することができ、これらモノクロー
ナル抗体結合体の不溶性担体への結合は、物理吸着又は
化学結合のいずれでも良い。
【００２８】本発明の免疫測定試薬は、測定対象となる
試料（血液等のヒト検体）と混合することにより使用さ
れ、試料中に存在するＴＡＴと本発明のモノクローナル
抗体が反応して凝集することにより、ＴＡＴを測定する
ことができる。試料中のＴＡＴと反応して生じた凝集塊
の程度の測定は、光学的に測定することができ、かかる
凝集塊の光学的測定法としては、通常行なわれている方
法であれば特に制限されず、汎用の分光光度計、分光光
度測定を測定原理とした生化学用自動分析装置、近赤外
を測定波長とした装置、積分球濁度を測定原理とした装
置、散乱光強度を測定する装置等の光学的測定機器など
を用いることができる。本発明の免疫測定試薬は、特に
ラテックス凝集免疫測定試薬として好適である。
試料（血液等のヒト検体）と混合することにより使用さ
れ、試料中に存在するＴＡＴと本発明のモノクローナル
抗体が反応して凝集することにより、ＴＡＴを測定する
ことができる。試料中のＴＡＴと反応して生じた凝集塊
の程度の測定は、光学的に測定することができ、かかる
凝集塊の光学的測定法としては、通常行なわれている方
法であれば特に制限されず、汎用の分光光度計、分光光
度測定を測定原理とした生化学用自動分析装置、近赤外
を測定波長とした装置、積分球濁度を測定原理とした装
置、散乱光強度を測定する装置等の光学的測定機器など
を用いることができる。本発明の免疫測定試薬は、特に
ラテックス凝集免疫測定試薬として好適である。
【００２９】
【実施例】次に、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説
明するが、本発明はこれらにより何ら制限されるもので
はない。
明するが、本発明はこれらにより何ら制限されるもので
はない。
【００３０】実施例１ （１）ＴＡＴの調製：トロンビン製剤（ミドリ十字社
製）のα−トロンビンとＡＴIII製剤（ヘキスト社製）
のＡＴIIIを、０．０２Ｍトリス緩衝液（ｐＨ７．４）
に溶解し、α−トロンビン：ＡＴIII＝１：１．５のモ
ル比で混合した後、３７℃で１０分間反応を行なった。
反応物をHeparin−Sepharose（ファルマシア社製）の２
×６cmのカラムにアプライし、吸着画分を０．１−２Ｍ
ＮａＣｌ／０．０２Ｍトリス緩衝液（ｐＨ７．４）の
リニアグラジエントで溶出した。各フラクションを４−
２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（第一化学薬品社製）にて分析
し、ＴＡＴ画分を回収した。ＴＡＴ濃度はＥＬＩＳＡ
（エンザイグノストＴＡＴベーリングベルケ社製）で測
定した結果、７５０μg／mLであった。
製）のα−トロンビンとＡＴIII製剤（ヘキスト社製）
のＡＴIIIを、０．０２Ｍトリス緩衝液（ｐＨ７．４）
に溶解し、α−トロンビン：ＡＴIII＝１：１．５のモ
ル比で混合した後、３７℃で１０分間反応を行なった。
反応物をHeparin−Sepharose（ファルマシア社製）の２
×６cmのカラムにアプライし、吸着画分を０．１−２Ｍ
ＮａＣｌ／０．０２Ｍトリス緩衝液（ｐＨ７．４）の
リニアグラジエントで溶出した。各フラクションを４−
２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（第一化学薬品社製）にて分析
し、ＴＡＴ画分を回収した。ＴＡＴ濃度はＥＬＩＳＡ
（エンザイグノストＴＡＴベーリングベルケ社製）で測
定した結果、７５０μg／mLであった。
【００３１】（２）免疫：上記ＴＡＴの１００μgを、
１回の免疫に使用した。初回免疫及び追加免疫ともにフ
ロインドの完全アジュバントを使用した。ＴＡＴ１００
μLとフロインドのアジュバント１００μLを混合し、得
られたエマルジョン２００μLを１回の免疫につき１匹
のＢＡＬＢ／ｃ 雄マウスの腹腔に注射し、４回免疫を
２週間間隔で繰り返した。マウスの眼底静脈から採血
し、抗体価をＥＬＩＳＡ法で測定し、抗体価の高いマウ
スを選んで細胞融合に使用した。
１回の免疫に使用した。初回免疫及び追加免疫ともにフ
ロインドの完全アジュバントを使用した。ＴＡＴ１００
μLとフロインドのアジュバント１００μLを混合し、得
られたエマルジョン２００μLを１回の免疫につき１匹
のＢＡＬＢ／ｃ 雄マウスの腹腔に注射し、４回免疫を
２週間間隔で繰り返した。マウスの眼底静脈から採血
し、抗体価をＥＬＩＳＡ法で測定し、抗体価の高いマウ
スを選んで細胞融合に使用した。
【００３２】（３）細胞融合：４回目の免疫から２週間
後に、生理食塩水２００μLに希釈したＴＡＴ１００μg
をマウス腹腔に注射し、その３日後にマウスから脾臓を
摘出した。摘出した脾臓から脾細胞を回収し、生きた脾
細胞１０8個と予め培養しておいた対数増殖期のマウス
骨髄腫細胞（ＳＰ２／ＯあるいはＰ３Ｕ１）の１０7個
を混合した後、５０％（ｗ／ｖ）のポリエチレングリコ
ール１５４０を含むＧＫＮ溶液（ＮａＣｌ：８ｇ，ＫＣ
ｌ：０．４ｇ，グルコース：２ｇ，Ｎａ2ＨＰＯ4：１．
４１ｇ，ＮａＨ2ＰＯ4・２Ｈ2Ｏ：０．７８ｇを精製水
１Ｌに溶解）を用いて細胞を融合した。融合後の細胞を
ＨＡＴ（１０-4Ｍ ヒポキサンチン、４×１０-7Ｍ アミ
ノプテリン、１．５×１０-5Ｍ チミジン）、フィーダ
ー細胞を含む１５％ＦＣＳ ＲＰＭＩ培地に懸濁し、９
６穴マイクロカルチャープレートを用い、３７℃、５％
炭酸ガス培養器中で培養した。
後に、生理食塩水２００μLに希釈したＴＡＴ１００μg
をマウス腹腔に注射し、その３日後にマウスから脾臓を
摘出した。摘出した脾臓から脾細胞を回収し、生きた脾
細胞１０8個と予め培養しておいた対数増殖期のマウス
骨髄腫細胞（ＳＰ２／ＯあるいはＰ３Ｕ１）の１０7個
を混合した後、５０％（ｗ／ｖ）のポリエチレングリコ
ール１５４０を含むＧＫＮ溶液（ＮａＣｌ：８ｇ，ＫＣ
ｌ：０．４ｇ，グルコース：２ｇ，Ｎａ2ＨＰＯ4：１．
４１ｇ，ＮａＨ2ＰＯ4・２Ｈ2Ｏ：０．７８ｇを精製水
１Ｌに溶解）を用いて細胞を融合した。融合後の細胞を
ＨＡＴ（１０-4Ｍ ヒポキサンチン、４×１０-7Ｍ アミ
ノプテリン、１．５×１０-5Ｍ チミジン）、フィーダ
ー細胞を含む１５％ＦＣＳ ＲＰＭＩ培地に懸濁し、９
６穴マイクロカルチャープレートを用い、３７℃、５％
炭酸ガス培養器中で培養した。
【００３３】（４）ＥＬＩＳＡ法による抗ＴＡＴモノク
ローナル抗体の選択：培養上清中の抗ＴＡＴモノクロー
ナル抗体を選択するため、ＰＢＳで希釈したＴＡＴ（１
μg／mL）、ＡＴIII（１μg／mL）、あるいはヤギ抗マ
ウスＩｇ抗体（１μg／mL：カッペルプロダクト社製）
を固相化した９６穴マイクロプレートに培養上清を加
え、３７℃１時間保温の後、ＰＢＳで洗浄し、０．１％
ＢＳＡ−ＰＢＳで１０００倍に希釈したペルオキシダー
ゼ標識抗マウスＩｇ抗体（ヤギ由来：カッペルプロダク
ト社製）を加え、３７℃で１時間保温した。これをＰＢ
Ｓで洗浄後、基質液（０．２％ オルトフェニレンジア
ミン、０．０２％過酸化水素水を含むクエン酸−リン酸
緩衝液；ｐＨ５．０）を加えて室温で３０分反応させ、
硫酸を加えて反応を停止させた後、吸光度を測定した。
吸光度が高い結果を出した上清のウエルを選択した。
ローナル抗体の選択：培養上清中の抗ＴＡＴモノクロー
ナル抗体を選択するため、ＰＢＳで希釈したＴＡＴ（１
μg／mL）、ＡＴIII（１μg／mL）、あるいはヤギ抗マ
ウスＩｇ抗体（１μg／mL：カッペルプロダクト社製）
を固相化した９６穴マイクロプレートに培養上清を加
え、３７℃１時間保温の後、ＰＢＳで洗浄し、０．１％
ＢＳＡ−ＰＢＳで１０００倍に希釈したペルオキシダー
ゼ標識抗マウスＩｇ抗体（ヤギ由来：カッペルプロダク
ト社製）を加え、３７℃で１時間保温した。これをＰＢ
Ｓで洗浄後、基質液（０．２％ オルトフェニレンジア
ミン、０．０２％過酸化水素水を含むクエン酸−リン酸
緩衝液；ｐＨ５．０）を加えて室温で３０分反応させ、
硫酸を加えて反応を停止させた後、吸光度を測定した。
吸光度が高い結果を出した上清のウエルを選択した。
【００３４】（５）ヘパリン担持ラテックス液の調製：
０．０５Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ７．５）で２％濃度に調
製したアミノ化ポリスチレンラテックス（平均粒径０．
２μm、インターヘイシャル・ダイナミックス社製）の
懸濁液 ６mLに、０．０５Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ７．
５）で８mg／mLの濃度に調製したヘパリンナトリウム
（第一化学薬品社製）溶液 ３mL及び０．０５Ｍホウ酸
緩衝液（ｐＨ７．５）で２mg／mLの濃度に調製した１−
エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジ
イミド塩酸塩（同仁化学研究所製）溶液 ３mLを加え、
２５℃で４時間反応させた。さらに、グリシンを２％含
有した０．０５Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ７．５） ４mLを
加え、２５℃で一晩攪拌した。０．０５Ｍグリシン緩衝
液（ｐＨ８．４）を用いて遠心洗浄を２回行なった後、
０．０５Ｍグリシン緩衝液（ｐＨ８．４） ８４mLに再
分散させ、ヘパリン担持ラテックス液（ヘパリン−Ｌ
ｘ）を得た。
０．０５Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ７．５）で２％濃度に調
製したアミノ化ポリスチレンラテックス（平均粒径０．
２μm、インターヘイシャル・ダイナミックス社製）の
懸濁液 ６mLに、０．０５Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ７．
５）で８mg／mLの濃度に調製したヘパリンナトリウム
（第一化学薬品社製）溶液 ３mL及び０．０５Ｍホウ酸
緩衝液（ｐＨ７．５）で２mg／mLの濃度に調製した１−
エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジ
イミド塩酸塩（同仁化学研究所製）溶液 ３mLを加え、
２５℃で４時間反応させた。さらに、グリシンを２％含
有した０．０５Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ７．５） ４mLを
加え、２５℃で一晩攪拌した。０．０５Ｍグリシン緩衝
液（ｐＨ８．４）を用いて遠心洗浄を２回行なった後、
０．０５Ｍグリシン緩衝液（ｐＨ８．４） ８４mLに再
分散させ、ヘパリン担持ラテックス液（ヘパリン−Ｌ
ｘ）を得た。
【００３５】（６）プロテインＡ担持ラテックス液の調
製：プロテインＡ（シグマ社製）６０mgを精製水 ８．
４mLに溶解した後、０．２５Ｍグリシン緩衝液（ｐＨ
８．４）で一晩透析した。このプロテインＡ液 ７．７m
Lに、０．２５Ｍグリシン緩衝液（ｐＨ８．４）を加え
て１３mLとし、これに、０．２５Ｍグリシン緩衝液（ｐ
Ｈ８．４）で２％濃度に調製した平均粒径０．２μmの
ポリスチレンラテックス（積水化学工業社製）の懸濁液
１３mLを加え、４℃にて一晩攪拌した。次に、２％牛
血清アルブミンを含む０．０５Ｍグリシン緩衝液（ｐＨ
８．４）を加え、４℃で一晩攪拌した。遠心洗浄により
上清を除去した後、０．０５Ｍグリシン緩衝液（ｐＨ
８．４）１８２mLを加えて良く混和し、プロテインＡ担
持ラテックス液（プロテインＡ−Ｌｘ）を得た。
製：プロテインＡ（シグマ社製）６０mgを精製水 ８．
４mLに溶解した後、０．２５Ｍグリシン緩衝液（ｐＨ
８．４）で一晩透析した。このプロテインＡ液 ７．７m
Lに、０．２５Ｍグリシン緩衝液（ｐＨ８．４）を加え
て１３mLとし、これに、０．２５Ｍグリシン緩衝液（ｐ
Ｈ８．４）で２％濃度に調製した平均粒径０．２μmの
ポリスチレンラテックス（積水化学工業社製）の懸濁液
１３mLを加え、４℃にて一晩攪拌した。次に、２％牛
血清アルブミンを含む０．０５Ｍグリシン緩衝液（ｐＨ
８．４）を加え、４℃で一晩攪拌した。遠心洗浄により
上清を除去した後、０．０５Ｍグリシン緩衝液（ｐＨ
８．４）１８２mLを加えて良く混和し、プロテインＡ担
持ラテックス液（プロテインＡ−Ｌｘ）を得た。
【００３６】（７）ＴＡＴ担持ラテックス液の調製：上
記（１）で調製した１０mgのＴＡＴを、０．２５Ｍグリ
シン緩衝液（ｐＨ８．４）で一晩透析した。このＴＡＴ
溶液に、０．２５Ｍグリシン緩衝液（ｐＨ８．４）を加
えて１３mLとし、これに、０．２５Ｍグリシン緩衝液
（ｐＨ８．４）で２％濃度に調製した平均粒径０．２μ
mのポリスチレンラテックス（積水化学工業社製）の懸
濁液 １３mLを加え、４℃で一晩攪拌した。次に、２％
牛血清アルブミンを含む０．０５Ｍグリシン緩衝液（ｐ
Ｈ８．４）を加え、４℃で一晩攪拌した。遠心洗浄によ
り上清を除去した後、０．０５Ｍグリシン緩衝液（ｐＨ
８．４）１８２mLを加えてよく混和し、ＴＡＴ担持ラテ
ックス液（ＴＡＴ−Ｌｘ）を得た。
記（１）で調製した１０mgのＴＡＴを、０．２５Ｍグリ
シン緩衝液（ｐＨ８．４）で一晩透析した。このＴＡＴ
溶液に、０．２５Ｍグリシン緩衝液（ｐＨ８．４）を加
えて１３mLとし、これに、０．２５Ｍグリシン緩衝液
（ｐＨ８．４）で２％濃度に調製した平均粒径０．２μ
mのポリスチレンラテックス（積水化学工業社製）の懸
濁液 １３mLを加え、４℃で一晩攪拌した。次に、２％
牛血清アルブミンを含む０．０５Ｍグリシン緩衝液（ｐ
Ｈ８．４）を加え、４℃で一晩攪拌した。遠心洗浄によ
り上清を除去した後、０．０５Ｍグリシン緩衝液（ｐＨ
８．４）１８２mLを加えてよく混和し、ＴＡＴ担持ラテ
ックス液（ＴＡＴ−Ｌｘ）を得た。
【００３７】（８）ＬＴＩＡ法による抗ＴＡＴモノクロ
ーナル抗体の選択：前記（４）において、ＥＬＩＳＡ法
にて培養上清中の抗ＴＡＴモノクローナル抗体の存在が
確認されたハイブリドーマについて、更に、ラテックス
凝集免疫測定試薬に好適なモノクローナル抗体を選択し
た。すなわち、第１試薬として、１０％グリセリン、
０．１％アルブミンを含有した０．０２Ｍトリス緩衝液
（ｐＨ９．０）に１μg／mLのＴＡＴ又はＡＴIIIを溶解
した液を用い、第１試薬２００μLに培養上清２０μLを
加え、３７℃で５分間加温後、第２試薬として上記で調
製した２mLのヘパリン担持ラテックス液と２mLのプロテ
インＡ担持ラテックス液を混合した溶液１００μLを加
えて攪拌した。また、ＴＡＴ及びＡＴIIIを除いた第１
試薬２００μLに培養上清２０μLを加え、３７℃で５分
間加温後、第２試薬として、上記で調製した２mLのＴＡ
Ｔ担持ラテックス液と２mLのプロテインＡ担持ラテック
ス液を混合した溶液１００μLを加えて攪拌した。その
後、波長６００nmにおける１〜５分間の吸光度変化量を
測定し、いずれの場合にも吸光度の高いものを選択し
た。
ーナル抗体の選択：前記（４）において、ＥＬＩＳＡ法
にて培養上清中の抗ＴＡＴモノクローナル抗体の存在が
確認されたハイブリドーマについて、更に、ラテックス
凝集免疫測定試薬に好適なモノクローナル抗体を選択し
た。すなわち、第１試薬として、１０％グリセリン、
０．１％アルブミンを含有した０．０２Ｍトリス緩衝液
（ｐＨ９．０）に１μg／mLのＴＡＴ又はＡＴIIIを溶解
した液を用い、第１試薬２００μLに培養上清２０μLを
加え、３７℃で５分間加温後、第２試薬として上記で調
製した２mLのヘパリン担持ラテックス液と２mLのプロテ
インＡ担持ラテックス液を混合した溶液１００μLを加
えて攪拌した。また、ＴＡＴ及びＡＴIIIを除いた第１
試薬２００μLに培養上清２０μLを加え、３７℃で５分
間加温後、第２試薬として、上記で調製した２mLのＴＡ
Ｔ担持ラテックス液と２mLのプロテインＡ担持ラテック
ス液を混合した溶液１００μLを加えて攪拌した。その
後、波長６００nmにおける１〜５分間の吸光度変化量を
測定し、いずれの場合にも吸光度の高いものを選択し
た。
【００３８】（９）抗ＴＡＴモノクローナル抗体産生細
胞の樹立：ＥＬＩＳＡ法及びＬＴＩＡ法で陽性を示した
細胞について、常法により、限界希釈法にて単クローン
化を行なった。すなわち、ＢＡＬＢ／ｃマウスの胸腺細
胞及び１５％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地を含む９
６穴マイクロカルチャープレートを用い、特異抗体陽性
細胞を３７℃、５％炭酸ガス培養器中で培養した。ＥＬ
ＩＳＡ法による特異抗体陽性ウエルの選択及び限界希釈
法による単クローン化操作を各３回繰り返して、抗ＴＡ
Ｔモノクローナル抗体産生細胞を樹立した。得られたハ
イブリドーマのうち３株は、それぞれ２６２２１、２６
２２３、２６４０３と命名し、産業技術総合研究所生命
工学工業技術研究所に寄託した。この株名と受託番号を
表１に示す。
胞の樹立：ＥＬＩＳＡ法及びＬＴＩＡ法で陽性を示した
細胞について、常法により、限界希釈法にて単クローン
化を行なった。すなわち、ＢＡＬＢ／ｃマウスの胸腺細
胞及び１５％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地を含む９
６穴マイクロカルチャープレートを用い、特異抗体陽性
細胞を３７℃、５％炭酸ガス培養器中で培養した。ＥＬ
ＩＳＡ法による特異抗体陽性ウエルの選択及び限界希釈
法による単クローン化操作を各３回繰り返して、抗ＴＡ
Ｔモノクローナル抗体産生細胞を樹立した。得られたハ
イブリドーマのうち３株は、それぞれ２６２２１、２６
２２３、２６４０３と命名し、産業技術総合研究所生命
工学工業技術研究所に寄託した。この株名と受託番号を
表１に示す。
【００３９】
【表１】
【００４０】（１０）抗ＴＡＴモノクローナル抗体の分
離及び精製：前記で得た抗ＴＡＴモノクローナル抗体産
生ハイブリドーマをマウス腹腔内で培養して、モノクロ
ーナル抗体を調製した。前処理として８週齢のＢＡＬＢ
／ｃマウスの腹腔内に０．５mLのプリスタン（２，６，
１０，１４−テトラメチルペンタデカン）を投与した。
８日後、０．５mLのＲＰＭＩ１６４０培地に浮遊した細
胞５×１０5個をこのマウスの腹腔内に投与した。投与
後９日目から腹水を繰り返し採取してプールした。集め
た腹水は３，０００rpmで１０分遠心分離を行ない、細
胞等の不溶物を除去した。上清部分に等量の飽和硫酸ア
ンモニウム溶液を攪拌しながら加え、一夜、４℃に放置
して得られた沈澱を遠心分離によって回収した。沈澱を
２０mM Tris-HCl緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解、透析し
た。同緩衝液で平衡化したDEAE-Sephacel（ファルマシ
ア社製）カラムに透析内容物を吸着させた後、同緩衝液
中のＮａＣｌ ０−０．３Ｍの濃度勾配で溶出させ、精
製抗体を得た。
離及び精製：前記で得た抗ＴＡＴモノクローナル抗体産
生ハイブリドーマをマウス腹腔内で培養して、モノクロ
ーナル抗体を調製した。前処理として８週齢のＢＡＬＢ
／ｃマウスの腹腔内に０．５mLのプリスタン（２，６，
１０，１４−テトラメチルペンタデカン）を投与した。
８日後、０．５mLのＲＰＭＩ１６４０培地に浮遊した細
胞５×１０5個をこのマウスの腹腔内に投与した。投与
後９日目から腹水を繰り返し採取してプールした。集め
た腹水は３，０００rpmで１０分遠心分離を行ない、細
胞等の不溶物を除去した。上清部分に等量の飽和硫酸ア
ンモニウム溶液を攪拌しながら加え、一夜、４℃に放置
して得られた沈澱を遠心分離によって回収した。沈澱を
２０mM Tris-HCl緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解、透析し
た。同緩衝液で平衡化したDEAE-Sephacel（ファルマシ
ア社製）カラムに透析内容物を吸着させた後、同緩衝液
中のＮａＣｌ ０−０．３Ｍの濃度勾配で溶出させ、精
製抗体を得た。
【００４１】（１１）抗ＴＡＴモノクローナル抗体の反
応特異性：上記で得られたモノクローナル抗体の反応特
異性は、固相化したＴＡＴ、ＡＴIII、トロンビン及び
プロトロンビンとの反応性をＥＬＩＳＡ法により、遊離
のＴＡＴ及びＡＴIIIとの反応性をＬＴＩＡ法により確
認した。すなわち、ＥＬＩＳＡ法は、ＴＡＴ（１μg／m
L）、ＡＴIII（１μg／mL）、トロンビン（１μg／m
L）、プロトロンビン（１μg／mL）を９６穴マイクロプ
レートに固相化し、培養上清の代わりに精製モノクロー
ナル抗体（５μg／mL）を用い、前記（４）と同様にし
て、行なった。また、ＬＴＩＡ法は、第１試薬として１
０％グリセリン、０．１％アルブミンを含有した０．０
２Ｍトリス緩衝液（ｐＨ９．０）に１μg／mLのＴＡＴ
又はＡＴIIIを溶解した液を用い、第１試薬２００μLに
試料として５μg／mLの精製抗モノクローナル抗体２０
μLを加え、３７℃で５分間加温後、第２試薬として上
記で調製した２mLのヘパリン担持ラテックス液と２mLの
プロテインＡ担持ラテックス液を混合した溶液１００μ
Lを加えて攪拌した。その後、波長６００nmにおける吸
光度を測定した。結果を表２に示す。
応特異性：上記で得られたモノクローナル抗体の反応特
異性は、固相化したＴＡＴ、ＡＴIII、トロンビン及び
プロトロンビンとの反応性をＥＬＩＳＡ法により、遊離
のＴＡＴ及びＡＴIIIとの反応性をＬＴＩＡ法により確
認した。すなわち、ＥＬＩＳＡ法は、ＴＡＴ（１μg／m
L）、ＡＴIII（１μg／mL）、トロンビン（１μg／m
L）、プロトロンビン（１μg／mL）を９６穴マイクロプ
レートに固相化し、培養上清の代わりに精製モノクロー
ナル抗体（５μg／mL）を用い、前記（４）と同様にし
て、行なった。また、ＬＴＩＡ法は、第１試薬として１
０％グリセリン、０．１％アルブミンを含有した０．０
２Ｍトリス緩衝液（ｐＨ９．０）に１μg／mLのＴＡＴ
又はＡＴIIIを溶解した液を用い、第１試薬２００μLに
試料として５μg／mLの精製抗モノクローナル抗体２０
μLを加え、３７℃で５分間加温後、第２試薬として上
記で調製した２mLのヘパリン担持ラテックス液と２mLの
プロテインＡ担持ラテックス液を混合した溶液１００μ
Lを加えて攪拌した。その後、波長６００nmにおける吸
光度を測定した。結果を表２に示す。
【００４２】
【表２】
【００４３】（１２）抗ＴＡＴモノクローナル抗体の反
応性：前記（１１）のＬＴＩＡ法と同様にして、精製抗
モノクローナル抗体（２６２２１、２６２２３、２６４
０３又は２６２１０（特開平7-238099号記載のもの））
を用い、反応性を確認した。波長６００nmにおける１〜
５分間の吸光度変化量を測定した結果を表３に示す。
応性：前記（１１）のＬＴＩＡ法と同様にして、精製抗
モノクローナル抗体（２６２２１、２６２２３、２６４
０３又は２６２１０（特開平7-238099号記載のもの））
を用い、反応性を確認した。波長６００nmにおける１〜
５分間の吸光度変化量を測定した結果を表３に示す。
【００４４】
【表３】
【００４５】表３の結果より、本発明のモノクローナル
抗体は、ＴＡＴ及びＡＴIIIとの反応性が高く、ラテッ
クス凝集免疫測定試薬に好適であることが確認された。
抗体は、ＴＡＴ及びＡＴIIIとの反応性が高く、ラテッ
クス凝集免疫測定試薬に好適であることが確認された。
【００４６】（１３）抗ＴＡＴモノクローナル抗体担持
ラテックスの調製：上記で精製した抗ＴＡＴモノクロー
ナル抗体（２６２２１、２６２２３、２６４０３又は２
６２１０）を、０．２５Ｍグリシン緩衝液（ｐＨ８．
４）で一晩透析した後、１．４mg／mLの濃度に調製した
液５mLに、０．２５Ｍグリシン緩衝液（ｐＨ８．４）で
２％の濃度に調製した平均粒径０．２μmのポリスチレ
ンラテックスの懸濁液５mLを加え、４℃にて一晩攪拌し
た。次に、２％牛血清アルブミンを含む０．０５Ｍグリ
シン緩衝液（ｐＨ８．４）５０mLを加えてよく混和し、
各モノクローナル抗体担持ラテックス液を得た。
ラテックスの調製：上記で精製した抗ＴＡＴモノクロー
ナル抗体（２６２２１、２６２２３、２６４０３又は２
６２１０）を、０．２５Ｍグリシン緩衝液（ｐＨ８．
４）で一晩透析した後、１．４mg／mLの濃度に調製した
液５mLに、０．２５Ｍグリシン緩衝液（ｐＨ８．４）で
２％の濃度に調製した平均粒径０．２μmのポリスチレ
ンラテックスの懸濁液５mLを加え、４℃にて一晩攪拌し
た。次に、２％牛血清アルブミンを含む０．０５Ｍグリ
シン緩衝液（ｐＨ８．４）５０mLを加えてよく混和し、
各モノクローナル抗体担持ラテックス液を得た。
【００４７】（１４）ラテックス凝集免疫測定試薬での
ＴＡＴの測定：第１試薬として、２％ＮａＣｌ、２％ポ
リエチレングリコール６０００、０．１％アルブミンを
含有する０．０２Ｍトリス緩衝液（ｐＨ９．０）を調製
した。一方、第２試薬として、上記で調製した各モノク
ローナル抗体担持ラテックス液とヘパリン担持ラテック
ス液の１：１混合液を調製した。第１試薬２００μL
に、１、１０又は１００ng／mLのＴＡＴ溶解液２０μL
を加え、３７℃で５分間加温後、第２試薬１００μLを
加えて攪拌した。その後、波長６００nmにおける１〜５
分間の吸光度変化量を測定した。結果を表４に示す。
ＴＡＴの測定：第１試薬として、２％ＮａＣｌ、２％ポ
リエチレングリコール６０００、０．１％アルブミンを
含有する０．０２Ｍトリス緩衝液（ｐＨ９．０）を調製
した。一方、第２試薬として、上記で調製した各モノク
ローナル抗体担持ラテックス液とヘパリン担持ラテック
ス液の１：１混合液を調製した。第１試薬２００μL
に、１、１０又は１００ng／mLのＴＡＴ溶解液２０μL
を加え、３７℃で５分間加温後、第２試薬１００μLを
加えて攪拌した。その後、波長６００nmにおける１〜５
分間の吸光度変化量を測定した。結果を表４に示す。
【００４８】
【表４】
【００４９】
【発明の効果】本発明のモノクローナル抗体は、ＴＡＴ
及びＡＴIIIとの反応性が高く、免疫測定試薬として好
適であり、ヒト検体中のＴＡＴ濃度を精度良く、簡便、
迅速かつ高感度に検出することができる。
及びＡＴIIIとの反応性が高く、免疫測定試薬として好
適であり、ヒト検体中のＴＡＴ濃度を精度良く、簡便、
迅速かつ高感度に検出することができる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/543 ５８１ Ｃ１２Ｎ 5/00 33/577 15/00 Ｃ Ｆターム(参考） 4B024 AA11 BA44 GA03 HA15 4B064 AG27 CA10 CA20 CC24 DA01 DA13 4B065 AA92X AB05 CA25 CA44 CA46 4H045 AA11 AA20 AA30 CA42 DA76 EA24 EA50 FA72 GA10 GA15
Claims (8)
- 【請求項１】 遊離のヒトアンチトロンビンIIIと反応
し、かつヒトトロンビン・ヒトアンチトロンビンIII複
合体とも反応する抗ヒトトロンビン・ヒトアンチトロン
ビンIII複合体モノクローナル抗体。 - 【請求項２】 抗原物質で免疫した哺乳動物の抗体産生
細胞と、哺乳動物の骨髄腫細胞とを融合させた後、酵素
免疫測定法により抗原物質と反応する抗体を産生する細
胞を選択し、選択した細胞の中から、更にラテックス凝
集免疫測定法により抗原物質と反応する抗体を産生する
細胞を選択して該細胞を培養することを特徴とするモノ
クローナル抗体の製造方法。 - 【請求項３】 モノクローナル抗体が、ラテックス凝集
免疫測定試薬に用いるものである請求項２記載の製造方
法。 - 【請求項４】 ヒトトロンビン・ヒトアンチトロンビン
III複合体で免疫した哺乳動物の抗体産生細胞と、哺乳
動物の骨髄腫細胞とを融合させた後、酵素免疫測定法に
よりヒトトロンビン・ヒトアンチトロンビンIII複合体
と反応する抗体を産生する細胞を選択し、選択した細胞
の中から、更にラテックス凝集免疫測定法によりヒトト
ロンビン・ヒトアンチトロンビンIII複合体と反応する
抗体を産生する細胞を選択して該細胞を培養することを
特徴とする請求項１記載の抗ヒトトロンビン・ヒトアン
チトロンビンIII複合体モノクローナル抗体の製造方
法。 - 【請求項５】 ヒトトロンビン・ヒトアンチトロンビン
III複合体で免疫した哺乳動物の抗体産生細胞と、哺乳
動物の骨髄腫細胞とを融合させて得られた、請求項１記
載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。 - 【請求項６】 受託番号が、ＦＥＲＭ Ｐ−１８２７
６、ＦＥＲＭ Ｐ−１８２７７、又はＦＥＲＭ Ｐ−１
８２７８である請求項５記載のハイブリドーマ。 - 【請求項７】 請求項１記載の抗ヒトトロンビン・ヒト
アンチトロンビンIII複合体モノクローナル抗体を含有
するヒトトロンビン・ヒトアンチトロンビンIII複合体
の免疫測定試薬。 - 【請求項８】 請求項１記載の抗ヒトトロンビン・ヒト
アンチトロンビンIII複合体モノクローナル抗体を含有
するヒトトロンビン・ヒトアンチトロンビンIII複合体
のラテックス凝集免疫測定試薬。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001118285A JP2002316999A (ja) | 2001-04-17 | 2001-04-17 | モノクローナル抗体 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001118285A JP2002316999A (ja) | 2001-04-17 | 2001-04-17 | モノクローナル抗体 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002316999A true JP2002316999A (ja) | 2002-10-31 |
Family
ID=18968701
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2001118285A Pending JP2002316999A (ja) | 2001-04-17 | 2001-04-17 | モノクローナル抗体 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2002316999A (ja) |
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| CN105223348A (zh) * | 2014-05-26 | 2016-01-06 | 北京九强生物技术股份有限公司 | 人抗凝血酶iii的胶乳增强免疫比浊法检测试剂盒 |
| US9593166B2 (en) | 2013-03-14 | 2017-03-14 | Bayer Healthcare Llc | Monoclonal antibodies against antithrombin β |
| KR20170132310A (ko) | 2015-03-31 | 2017-12-01 | 가부시키가이샤 엘에스아이 메디엔스 | 트롬빈 안티트롬빈 복합체의 측정 시약 및 측정 방법 |
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-
2001
- 2001-04-17 JP JP2001118285A patent/JP2002316999A/ja active Pending
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