JPH054075B2

JPH054075B2 -

Info

Publication number: JPH054075B2
Application number: JP59087190A
Authority: JP
Inventors: Haruki Mikawa; Susumu Hosoi
Original assignee: Shionogi and Co Ltd
Current assignee: Shionogi and Co Ltd
Priority date: 1984-04-27
Filing date: 1984-04-27
Publication date: 1993-01-19
Also published as: DK188185A; DK188185D0; DE3583891D1; DK166503B1; EP0163141A2; EP0163141B1; GB2158094B; GB8510821D0; JPS60228421A; GB2158094A; EP0163141A3; CA1308676C; DE163141T1

Description

【発明の詳細な説明】

イ発明の目的産業上の利用分野抗原抗体反応を基盤とするアレルギー疾患は、
その原因物質（アレルゲン）の探索特定により、
病状の診断分類、治療方針の方法づけが可能とな
つてきた。本発明におけるモノクローナル抗体
は、外因性気管支喘息、アトピー性皮膚炎、免疫
複合体疾患などのアレルギー疾患におけるアレル
ゲンの特定用診断薬として、またアレルギー疾患
の発病機作解明に利用することができる。従来技術ヒト血清中のアレルゲンに対する免疫グロブリ
ンＧ（以下IgGという）抗体を定量することの重
要性が、こゝ数十年の間に認識されるようになつ
てきた［J.W.ヤングインゲル（Younginger）ら、
J.Clin.Invest.52、1268（1973）；A.K.ソボツカ
（Sobotka）ら、J.Immunol.11784（1976）］。最
近、ヒト血清中のアレルゲンに特異性を有する
IgE抗体の測定に、ラジオアレルゴソルベントテ
スト（radioallergosorbent test）（以下RAST法
という）が利用されるようになつてきている
［N.F.アドキンソン・ジユニア−（Adkinson、
Jr）、American Society for Microbiology、
Washington、D.C. p.590−602（1976）］。しかし、
ヒトアレルゲン特異性IgG抗体の測定へのRAST
法の応用は、一部の報告［清水ら、J.Immunol、
Methods、19、317（1978）］を除いて成功してい
ない。不成功の主な理由は、RAST法では正常
血清中の非特異的抗体結合レベルが、特異抗体の
結合レベル以上に高いことであつたためと推定さ
れる。ハミルトン（Hamilton）らは、ウサギ抗
ヒトIgG抗体の代わりに、スタフイロコツカス・
アウレウス（Staphylococcus aureus）由来の
¹²⁵I−プロテインＡを用いて非特異的結合を低下
せしめることに成功した［J.Immunol.122、1073
（1979）］。スタフイロコツカス・アウレウスから
分離したプロテインＡは、ヒトIgGサブクラス
１、２および４のFc部分に優先的に結合するが、
ヒトIgG₃には結合しない。プロテインＡは免疫
グロブリンＡ（以下IgAという）のサブクラスで
あるIgA₁およびIgA₂と結合するが、IgAサブク
ラスとプロテインＡの結合能との間には、特別な
関係はないらしい［ブルンダ（Brunda）ら、J.
Immunol.Vol.123、1457（1979）］．ヨハンソン
（Johansson）およびインガナス（Inganas）は、
ポリクローナル免疫グロブリンＥ（以下IgEとい
う）を含有する血清試料から分離したIgEは、プ
ロテインＡとの高い親和性を示すが、その結合部
位はIgGとは異なつてFc部分ではないとしている
［Immunological Rev.41、248（1978）］。以上の現状から見てヒトアレルゲン特異IgG抗
体の新たな測定法の開発が強く望まれている。モ
ノクローナル抗ヒトIgG抗体は、ヒトIgGの特定
の抗原決定基に対して、均一な親和性を持つて結
合することができる。又、モノクローナル抗体
は、マウスの腹腔内において多量に作成すること
ができる。従つて、アレルゲンに特異的に結合し
たヒトIgGに対して選択的に結合し、正常ヒト
IgGによる非特異的結合の低いモノクローナル抗
体を作製することは、アレルゲン特異ヒトIgG抗
体の測定を可能にするものと思われる。発明が解決しようとする問題点本発明が提供するモノクローナル抗ヒトIgG抗
体の特長は、ヒトIgGのCH₂ドメインを認識するヒトIgGおよびサブクラスに属するIgG₁、
IgG₂、IgG₃、IgG₄に高い結合能を示す。固相化された非特異IgGと比較して、アレル
ゲンに結合した、特異IgG抗体に対し選択的に
結合する。溶液状態にある遊離ヒトIgGとの結合性が極
めて弱い。であり、これらの特長から、RAST法あるいは
ELISA法（enzymelinked Immunosorbent
assay）によるアレルゲン特異IgG抗体、免疫複
合体の測定およびアレルギー疾患の発病機作解明
に利用することができる。該モノクローナル抗体
は、正常血清中での非特異的結合性が非常に低
く、更にIgE抗体測定用に調製した市販のアレル
ゲンデイスクやアレルゲンを固相化した（例え
ば、チユーブコーテイング、ビーズなど）担体を
利用して、アレルゲン特異IgG抗体を測定するこ
ともできる。ロ発明の構成問題点を解決するための手段ヒト免疫グロブリン（IgGなど）に対するモノ
クローナル抗体の調製 (1) 抗体産生脾臓細胞の調製動物、例えばマウス、ラツトなどに、ヒト血
清由来の免疫グロブリンをフロイント
（Freund）完全アジユバンドと共に腹腔内投与
し免疫する。約３週間後、更にヒト血清由来免
疫グロブリン（追加刺激量）をミヨウバンアジ
ユバントと共に腹腔内投与する。３日後に脾臓
を摘出して細胞浮遊液とし、融合用抗体産生細
胞とする。 (2) 骨髄腫細胞の調製ヒポキサンチン・グアニン・ホスホリボシル
トランスフエラーゼ欠損骨髄腫細胞株、例えば
BALB／Ｃ系マウスの骨髄腫細胞P3・NS−
１／１・Ag4・１（以下NS−１／Agという）
［Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.76、4061（1979）］
を培地、例えば15％ウシ胎児血清（FCS）を含
有するPRMI−1640培地中に維持する。NS−
１／Agの生育は、ヒポキサンチン・アミノプ
テリン、チミジン培地（HAT培地）中で阻害
される。 (3) ハイブリドーマの調製前記(1)で調製される脾臓細胞と(2)で調製され
る骨髄腫細胞NS−１／Agとを、オイ（Oi）お
よびヘルゼンベルグ（Herzenberg）の方法
［Selected Methods in Cellular
Immunology、351〜372（1980）、San
Francisco、W.H.Freeman and Co.］に従つ
て、ポリエチレングリコール（PEG）の存在
下に融合させる。得られる融合細胞をHAT培
地中に懸濁し、組織培養プレートの各ウエルに
接種する。この際、栄養細胞として小量の
BALB／Ｃ系マウス胸線細胞または腹腔浸出
細胞を共存させておくのが好ましい。培養開始
後１日、２日、３日、５日、８日、11日、後に
各ウエルのHAT培地の半量を新たなHAT培
地と交換し、更に14日、15日、16日後にその半
量をヒポキサンチン・チミジンのみを含む培地
（HT培地）と交換する。 (4) 抗ヒト免疫グロブリン抗体産生ハイブリドー
マの検定ヒト免疫グロブリン感作ヒツジ赤血球を用
いた受身血球凝集反応による検定ヒトIgGを塩化クロム法［E.R.ゴールド
（Gold）およびH.H.フデンベルグ
（Fudenberg）、J.Immucol.99、859（1967）］
により、三塩化クロムを用いて洗浄したヒツ
ジ赤血球に感作する。同様に、ヒト免疫グロ
ブリンのFcフラグメント、Ｆ（ａ、b′）₂およ
びヒト骨髄腫蛋白で感作したヒツジ赤血球を
得る。以上の感作ヒツジ赤血球を用いて、培
養上清の抗体産生能を受身赤血球凝集反応に
より検定する。 ELISA法を用いた検定ヒト免疫グロブリンを0.05M炭酸緩衝液
（PH9.1）にて、ポリスチレンプレートに固相
化する。ウシ血清アルブミンにて残りの結合
部位を飽和した後、ハイブリドーマの培養上
清と反応させる。洗浄後ヒト免疫グロブリン
と交差結合性をもたないペルオキシダーゼ標
識抗マウス免疫グロブリン抗体と反応させ
る。洗浄後基質（過酸化水素）と反応させ、
ナトリウムアジドにて反応停止した後、吸光
度を測定する。 (5) ハイブリドーマのクローニング・選択上記(4)の操作で抗体活性の認められたハイブ
リドーマをこの技術分野においてよく知られた
限界希釈法によつて更にクローン化する。生育
してきたクローンの培養上清は、更に(4)の方法
によつて抗体活性を検定し、抗体活性の強いク
ローンを選択する。 (6) 抗ヒト免疫グロブリン（IgGなど）モノクロ
ーナル抗体の調製上記(5)で選択したクローンを適当な培地、例
えば15％FCSを含むRPMI−1640培地で細胞濃
度がその上限に達するまで培養するか、あるい
は選択したクローンをプリステン（pristane）
処理したBALB／Ｃ系マウスなどに腹腔内移
植し、約３週間後に貯留腹水を採取することに
より行なう。 (7) モノクローナル抗体の単離精製培養後遠心操作により細胞を除去した培養上
清あるいは腹水からモノクローナル抗体を単離
精製するには、この技術分野においてよく知ら
れた方法、例えばプロテインＡセフアロースに
よるアフイニテイ−クロマトグラフイーによつ
て容易に実施することができる。作用後記の実験例に示すごとく、本発明に係るモノ
クローナル抗ヒトIgG抗体は、その免疫グロブリ
ンとの結合能を凝集反応により検定したところ、
IgGとそのサブクラスに属するIgG₁、IgG₂、
IgG₃、IgG₄には高い親和性を示す。しかし、ヒ
トIgM、IgAまたはヒト血清アルブミンで被覆し
たヒツジ赤血球を凝集しない。また、IgGのFc部
に結合して、Ｆ（ab′）部には殆ど結合しない。免
疫沈降法で検定したアイソタイプはIgG₂aであ
る。該モノクローナル抗ヒトIgG抗体を放射性ヨウ
素（ ¹²⁵I）で標識し、ヒトIgGフラグメントの抑
制作用を利用して、ヒトIgGの抗原決定ドメイン
を決定したところ、HG2−25はFcフラグメント
によりその結合を抑制されるが、pFc′によつて
は抑制されない。このことは、HG2−25がヒト
IgGのCH₂ドメインを認識することを意味してい
る。実施例 (1) 抗ヒトIgG抗体産生ハイブリドーマの調製 BALB／Ｃ系マウス（８〜10週令）を、ヒ
ト血清由来のIgG200μｇ（100μ生理食塩水）
をフロイント完全アジユバント100μと共に
腹腔内投与して免疫した。21日後、更にヒト血
清由来のIgG20μｇをミヨウバン沈降物として
腹腔内投与した。３日後に脾臓を摘出し、
RPMI培地を用いて細胞浮遊液を調製し、10⁸
個の脾臓細胞を含むRPMI培地10mlを、予め
RPMI培地10ml中に浮遊させた５×10⁷個のNS
−１骨髄腫細胞と混合した。この混合物を450
ｇで10分間遠心し、上清液を除去した。次いで
50％PEG4000（メルク社製）を含むRPMI培地
（RPMI−1640）１mlをゆるやかに撹拌しなが
ら添加した。更に１分間撹拌した後、RPMI溶
液の追加量１mlを１分間を要して添加した。同
じく１mlを追加した後、同溶液７mlを約３分を
要して添加した後、400ｇで10分間遠心分離し
て上清液を除去し、得られた細胞を含む15％ウ
シ胎児血清（以下FCSという）を含むRPMI−
1640培地20mlに浮遊させ、組織培養プレート
（コーニング社製96穴）２枚の各ウエルに100μ
ずつ接種し、７％炭酸ガスの存在下37℃で培
養した。１日、２日、３日、５日および８日後に各培
地の半量をHAT培地（10％FCS、４×10^-7M
アミノブテリン、1.6×10^-5Mチミジン、１×
10^-4Mヒポキサンチンを添加したRPMI−1640
培地）と交換し、更に培養を続けた。培養の11
日、13日、14日目に培地の半量をHT培地（10
％FCS、1.6×10^-5Mチミジン、１×10^-4Mヒポ
キサンチンを添加したRPMI−1640培地）と交
換した。融合操作開始から16日後、全てのウエルから
ハイブリドーマのコロニーが出現した。このハ
イブリドーマを15％FCSを含むRPMI−1640培
地中で培養し、その培養上清液中の特異抗体産
生の有無を次のようにして検定した。培養上清を被検液とし、被検液5μと10％
FCSを加えたリン酸塩緩衝食塩水（以下PBS
という）50μとをＵ底組織培養用プレートの
各ウエルに採る。Ｕ底プレートの各ウエルにヒ
トIgG感作ヒツジ赤血球１％浮遊液50μを加
え、静かに撹拌する。２時間室温に静置後、血
球凝集の有無を判定した。結果を第１表に示
す。

【表】 (2) 抗ヒトIgG抗体産生細胞株のクローニング (1)により得られた抗ヒトIgG抗体産生ハイブ
リドーマを、15％FCSを含むRPMI−140培地
中に、５個／mlの濃度になるように浮遊させ、
各ウエルが100μとなるように組織培養プレ
ート（コーニング社製96穴）の40ウエルに接種
した。次いで該浮遊液を１個／ml濃度に稀釈し
て32ウエルに接種し、更に0.5個／ml濃度に希
釈して24ウエルに接種した。５日後に15％FCS
加RPMI−1640培地100μを各ウエルに追加し
た。例えば、クローンHG2−25の場合培養10
日後、0.5個／ml濃度の24ウエルの中２ウエル
に、また１個／ml濃度の32ウエルの中４ウエル
にハイブリドーマクローンが出現した。各クロ
ーンの培養上清につき抗体産生能を検定した。［試験結果］全クローンに抗体産生能が認められた。 (3) 抗ヒトIgG抗体の産生前工程で取得したハイブリドーマクローン
を、あらかじめプリステン0.5mlで腹腔内投与
処理したBALB／Ｃマウスの腹腔内に、抗ヒ
トIgG抗体産生ハイブリドーマを５×10⁶個宛
0.5mlの生理食塩水に懸濁し移植した。３週間
後、マウスの腹部肥大を確かめて、注射器で腹
水を採取し、遠心操作により細胞を除去した。 (4) 抗ヒトIgG抗体の分離精製前工程で採取した腹水を45％飽和硫酸アンモ
ニウム水で塩析し、生じた沈殿を0.1Mリン酸
緩衝液（PH8.0）に溶解後、同液にて透析した。
腹水より塩析にて得られたガンマー分画20mgを
0.1Mリン酸緩衝液（PH8.0）２mlにとかし、プ
ロテインＡ−セフアローズ［フアルマシア社
（Pharmacia AB）］のカラム（1.6×５cm）に
吸着させた。先ず、0.1Mリン酸緩衝液（PH
8.0）約50mlで不純物を流出し、次いで0.1Mク
エン酸緩衝液（PH5.0）約100mlで溶出してモノ
クローナル抗ヒトIgG抗体HG2−25を得た。実験例１モノクローナル抗体HG2−25の特長 HG2−25産生ハイブリドーマの培養上清を10
％FCS含有リン酸緩衝液にて倍々希釈し、それぞ
れの50μをＵ底マイクロタイタープレートの各
ウエルに入れる。次に、ヒトIgG感作ヒツジ赤血
球１％浮遊液50μを加え、プレートミキサーで
撹拌し、室温で２時間反応させた後、凝集像を判
定した。同様に、ヒトIgGのFcフラグメント、Ｆ
（ab′）₂およびヒト骨髄腫蛋白（IgGとそのサブク
ラス、すなわち、HCD₁、IgG₂、HCD₃、IgG₃、
IgG₄）で感作したヒツジ赤血球にて試験し、そ
の凝集像を判定した。その結果、IgGとそのサブ
クラスに属するHCD₁、IgG₂、HCD₃、IgG₃、
IgG₄とFcフラグメントに高い抗体活性を示す凝
集像を認めた。第２表に赤血球凝集反応力価を示
した。

【表】なお、各ヒトIgGの由来は以下のとおりであ
る。 IgG：ヒトIgG（マイルス社製） HCD₁：IgG₁サブクラスに属する骨髄種の１亜型
としてのＨ鎖病の骨髄種蛋白。 IgG₂：ヒトIgGをパパイン限定分解にてIgG₂とし
精製したもの。 HCD₃：IgG₃サブクラスに属する骨髄種の１亜型
としてのＨ鎖病の骨髄腫蛋白。 IgG₃：ヒトIgGをプロテインＡ・セフアロースカ
ラムを通過精製したもの。 IgG₄：IgG₄サブクラスに属する骨髄腫蛋白を、
セフアデツクスG200およびDEAEセルロース
カラムにて精製してもの。Ｆ（ab′）₂：ヒトIgGをペプシン処理精製したもの。 Fc：ヒトIgGをパパイン処理精製したもの。実験例２モノクローナル抗体HG2−25のヨウ素標識
（ヨードゲン法） 40μｇ／ml濃度の１，３，４，６−テトラクロ
ロ−3α，6α−ジフエニルグリコールウリル
［IODO−GEN（ヨードゲン）としてビアスケミカ
ル社（Pierce Chemical Cc.）より入手］ジクロ
ルメタン溶液50μをガラスチユーブに入れ、窒
素気流下室温で風乾した。このチユーブに0.1M
リン酸緩衝液（PH7.4）15μにとかしたHG2−25
抗体溶液（30μｇ／15μ）を加え、更に放射性
ヨウ化ナトリウム（Na ¹²⁵I）0.5ｍCi／5μを加
えて、室温で15分間静かに振盪した。得られた反
応液をセフアデツクスＧ−25（Sephadex；フアル
マシア社）のカラム（1.6×50cm）に通して、リ
ン酸緩衝食塩水で溶出した。最先溶出区分を分取
して ¹²⁵I標識モノクローナル抗体HG2−25を得
た。セフアクロース6B（Sepharose）のカラム
（1.6×56cm）によるクロマトグラム（第１図）
は、本品が殆ど凝集物を含まない純品であること
を示している。実験例３モノクローナル抗体HG2−25の認識部位ポリスチレン製マイクロタイタープレート
（microtiter plate）〔イムロン２プレート
（Immulon ２ plate）．ダイナテク社
（Dynatech Co.）〕の各ウエルに、ヒトIgGを
0.5M炭酸緩衝液（PH9.1）にとかした溶液（2μ
ｇ／ml）100μを入れ、４℃にて一夜放置した。
次いで、0.05％ツイーン20および0.01％ナトリウ
ムアジドを含有する0.1Mリン酸緩衝液（PH7.4）
にて３回洗浄した後、ヒト血清アルブミン１mg／
mlを含む0.1Mリン酸緩衝液にてブロツクした。
同緩衝液にて洗浄後、ヒトIgG、Ｆ（ab′）₂、Fc、
tlmFc、およびpF′cのそれぞれの溶液（5μｇ／ml
を含む0.1Mリン酸緩衝液）と ¹²⁵I標識したHG2
−25抗体とを同時に上記プレートに入れ、室温に
16時間保持し、上記同様に洗浄後、10％酢酸にて
特異的に結合している標識抗体HG2−25を離脱
し、放射能を測定した。第３表に示すごとく、モ
ノクローナル抗体HG2−25は、未処理ヒトIgGに
より96％の高率で特異的結合を抑制される。ま
た、Fcフラグメントでは99％が抑制され、Ｆ
（ab′）₂およびpFc′では殆ど抑制を受けなかつた。

〔実験結果〕

以上の実験による親和定数は2.7×10⁷であつ
た。スキヤツチヤード・プロツトは第２図のごと
くであつた。 (2) アレルゲンデイスクに特異的に結合したヒト
IgGに対する親和性 IgG・RASTのミツバチ毒アレルゲンデイス
ク〔フアデバス（Phadebas）IgG・RAST、
フアルマシア社（Pharmacia AB）〕とミツバ
チ毒特異IgG抗体を5U／ml含む標準溶液A50μ
とを25℃で３時間静置した。 ¹²⁵I標識HG2
−25を0.2μCi／ml〜10μCi／mlの範囲で変化さ
せて50μずつ加え、25℃で16〜18時間静置し
た。同洗浄液で３回洗浄した後、γ−カウンタ
にて計測した。〔実験結果〕以上の実験による親和定数は3.5×10⁹であつ
た。スキヤツチヤード・プロツトは第３図のごと
くであつた。 (3) マイクロタイタープレートに非特異的に結合
したヒトIgGに対する親和性ポリスチレン製マイクロタイタープレート
（microtiter plate）〔イムロン２プレート
（Immulon ２ plate）、ダイナテク社
（Dynatech Co.）〕の各ウエルに、ヒトIgG2μ
ｇ／mlを含有する0.25M炭酸緩衝液（PH9.1）50μ
を入れた。このプレートを37℃で２時間放置
し、次いで0.1％血清アルブミン、0.05％ツイー
ン20および0.01％ナトリウムアジドを含有する
0.1Mリン酸緩衝液（PH7.4）（Ａ緩衝液）で洗浄
し、更にＡ緩衝液中で37℃で１時間放置した。次
いで、Ａ緩衝液で２度洗浄した後、 ¹²⁵I標識
HG2−25抗体の溶液（0.003〜3μCi／ml）50μ
量を各ウエルに加えた。このプレートを室温に16
時間保持した後、Ａ緩衝液で２度洗浄した。プレ
ート上のヒトIgGに結合している ¹²⁵I標識HG2−
25抗体を10％酢酸でプレートから分離し、測定用
チユーブに移して放射能を測定した。測定結果よ
りスキヤツチヤード（Scatchard）の方法にした
がつて結合定数を計算するとＫ＝1.5×10⁹M^-1で
あつた。

【図面の簡単な説明】

第１図は ¹²⁵I標識モノクローナル抗体HG2−
25のクロマトグラムを示し、縦軸はカウント
（％）、横軸はフラクシヨン数をそれぞれ表わす。
第２図および第３図はモノクローナル抗体HG2
−25のスキヤツチヤード・プロツトを示し、Ｆは
ヒトIgGに結合していないHG2−25のモル濃度、
ＢはヒトIgG／HG2−25複合体のモル濃度をそれ
ぞれ表わす。

Claims

【特許請求の範囲】

１ヒトIgGのCH₂ドメインを認識し、IgG₁、
IgG₂、IgG₃およびIgG₄に結合能を示すモノクロ
ーナル抗体HG2−25。