JP3127158B2 - 新規の遺伝子及びポリペチドの無細胞合成並びに単離 - Google Patents

新規の遺伝子及びポリペチドの無細胞合成並びに単離

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Description

【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明は一般に生体内における新規の遺伝子及びポリ
ペプチドの合成並びに単離に関し、より詳しくはセミラ
ンダムDNA又はRNA配列を生成及び発現せしめる方法、こ
れらの配列から新規の遺伝子を単離する方法、並びに新
規のポリペプチドを作り出すためのこれらの遺伝子の利
用の方法に関する。
発明の背景 セミランダム配列からの新規の遺伝子及びポリペプチ
ドの単離は一般に、対象の（複数の）配列を得るための
遺伝子的に雑多な大量の細胞集団をスクリーンする必要
性によって制限されていた。例えば10個のアミノ酸のポ
リペプチド鎖は2010種類又はおよそ1013種類の順列が考
えられる。もしこの順列のうち10種が所望する特性（例
えば特異的な抗原に結合する能力）を有していた場合、
1012個の集団を１つの所望する新規遺伝子を探す期待の
ためにスクリーンする。（微生物を介して新規遺伝子を
発現せしめる）常用の方法の利用を介しての特定の性質
に関する大量の新しい配列のスクリーニングは、この新
規遺伝子が生体に明確な増殖又は生存のための利点を付
与しない限り事実上実施しがたい。実際、従来技術のも
とでは、1012個の個々の形質転換微生物を、所望する１
新規遺伝子を見つけるためにそれぞれスクリーンする必
要がある。
細胞内に局在する新規の遺伝子生成物を検出するため
の本スクリーニング工程において、各形質転換細胞由来
のコロニーはその細胞を開裂せしめるために処理されな
ければならない。一般には標準ペトリ皿一枚当り1000−
2000個の細菌コロニーをこのスクリーニング工程のため
に溶解せしめる（例えばクロロホルムにより）。従っ
て、1012個の形質転換生物のためには500,000から10億
枚のペトリ皿を必要とするであろう。更に、10,000から
100,000リットルの対数増殖***細胞が大量の形質転換
可能細胞を製造するために必要でありうる。
他方、遺伝子生成物が分泌されて細胞の外側に結合す
る場合、これはそれらの蛍光化合物又はその他のマーカ
ーに結合する能力によって検出されうる。これらの場合
において、新規の所望するポリペプチドの合成に関して
セルソーターがスクリーンのために利用されうる。しか
しながら、１秒当り5,000個の細胞の流速にてさえも、
セルソーターで1012個の細胞をスクリーンするためには
60年以上もかかるであろう。従って、非常に高額且つ時
間のかかる現在のスクリーニング方法は明らかにセミラ
ンダム配列からの新規の遺伝子及びポリペプチドの単離
の妨げとなっている。
上記に簡潔した方法の他に、FieldsとSong（Nature 3
40:245−246,1989）は酵母GAL4遺伝子のドメインを用い
た、その他のポリペプチドと特異的に結合するポリペプ
チドを選択的に得るための方法を紹介している。しかし
ながらこのシステムは重要なる制限を有す。第１にポリ
ペプチド−ポリペプチド結合のみが選択され、即ちポリ
ペプチド−非ポリペプチド相互作用は除外される。第２
にこの方法が商業適用性を有すためには、既知及び新規
の結合性ポリペプチドはかなり高いレベル且つ「天然」
の形態に酵母において発現させなければならない。第３
に、グリコシル化ポリペプチド又は特定の改質されたポ
リペプチドもこの方法により除外されるであろう。第４
に、彼らは物理相互作用のよく解明されている既知のポ
リペプチドを用いたにもかかわらずコントロールGAL4活
性の4.5％のみを示したことから、ランダム又はセミラ
ンダム配列が働くかどうか明白でない。第５に、Fields
とSongは非常に大きい配列、即ち、633個のアミノ酸のS
NF1タンパク質及び322個のアミノ酸のSNF4タンパク質で
あって互いに相互作用する二次構造を有すものを利用し
ている。第６に、1010の多様性のセミランダム配列につ
いてさえも、彼の方法を用いることによって極端に大量
のDNA、改質酵素及び感受性酵母細胞の必要性を回避せ
しめた。
既に開示されている方法に対し、本発明は新規の遺伝
子及びポリペプチドの無細胞スクリーニングについての
方法を詳細する。本方法は大量の形質転換生物に関連す
る問題及びFieldsとSongにより開示された方法の制限を
回避せしめ、そして数週間以内に完了しうる。従って、
本方法論は新規の遺伝子生成物の単離における時間及び
費用の実質的な節約を可能とする。
発明の概容 簡単に述べると、本発明は多数の新規なる遺伝子及び
ポリペプチドの合成、スクリーニング並びに選別に関す
る。本方法は一般に以下の段階、（ａ）RNAポリメラー
ゼ結合性配列、リボソーム結合性配列及び翻訳開始シグ
ナルを含む５′非翻訳領域を含んで成るインビトロ発現
ユニットを作製し、ここで該発現ユニットはmRNAを製造
可能であり；（ｂ）１又は複数の種類のセミランダムヌ
クレオチド配列を該発現ユニットに連結させ；（ｃ）RN
Aを生産するために該発現ユニットとセミランダムヌク
レオチド配列に関連する配列を転写又は複製せしめ；
（ｄ）ポリソームを生産するため、該ポリソームを維持
せしめるのに十分な条件のもとで該RNAを翻訳せしめ；
（ｅ）該ポリソームを対象の物質と結合せしめ；（ｆ）
該対象の物質と結合するポリソームを単離せしめ；
（ｇ）mRNAを遊離せしめるために該単離化ポリソームを
解離せしめ；（ｈ）該遊離化mRNAからcDNAを回収且つ作
製せしめ；そして（ｉ）新規のポリペプチドを生産する
ために遺伝子を発現せしめること、を含んで成る。
上記の方法の第１の形態において、この方法は前記の
RNA又は関連するcDNAを増幅せしめることによって所望
する配列の富んでいるmRNAにおいて繰り返すことができ
うる。その後、所望する遺伝子を更に純化するために、
有意な割合（＞10-3）の切り捨て集団（truncated popu
lation）を所望する配列が示す迄、この遺伝子の増幅せ
しめたサブセットを前記の種々の段階のサイクルにかけ
ることができうる。主として方法は遺伝子の集団がほぼ
均一となる迄繰り返しうる。
本発明の第２の態様において、新規なるポリペプチド
を生産するための方法であって、以下の段階、 （ａ）RNAポリメラーゼ結合性配列、リボソーム結合
性配列及び翻訳開始シグナルを含む５′非翻訳領域を含
んで成るインビトロ（試験管内）発現ユニットを作製
し、ここで該発現ユニットはmRNAを生産することが可能
であり；（ｂ）該発現ユニットに１又は複数のセミラン
ダムヌクレオチド配列を連結せしめ；（ｃ）該発現ユニ
ットとセミランダムヌクレオチド配列に関連する配列を
転写せしめてRNAを生産せしめ；（ｄ）該RNAを翻訳せし
めて生物学的に活性なポリペプチドを生産せしめ；
（ｅ）該生物学活性ポリペプチドをコード化するRNAを
再分（subdivide）せしめ；（ｆ）上記に記載の段階
（ｃ）−（ｅ）の通りに転写、翻訳及び再分せしめて対
象の遺伝子を単離せしめ；（ｇ）該単離化遺伝子からcD
NAを作製せしめ；そして（ｈ）新規なるポリペプチドを
生産するように該cDNAを発現せしめること、を含んで成
る方法を提供する。
本発明の他の態様において、新規なるポリペプチドを
生産するための方法であって、以下の段階、 （ａ）RNAポリメラーゼ結合性配列、リボソーム結合
性配列及び翻訳開始シグナルを含むインビトロ発現ユニ
ットを作製せしめ、ここで該発現ユニットはmRNAを生産
可能であり；（ｂ）該発現ユニットに１又は複数のセミ
ランダムヌクレオチド配列を連結せしめ；（ｃ）該発現
ユニットとセミランダム配列に関連する配列を複製せし
めてRNAを生産せしめ；（ｄ）生物学的に活性なポリペ
プチドを生産せしめるために該RNAを翻訳せしめ；
（ｅ）該生物学的に活性なポリペプチドをコード化する
RNAを再分せしめ；（ｆ）上記の段階（ｄ）−（ｅ）の
通りに翻訳及び再分せしめて対象の遺伝子を単離せし
め；（ｇ）該単離化遺伝子からcDNAを作製せしめ、そし
て（ｈ）新規なるポリペプチドを生産するようにcDNAを
発現せしめること、を含んで成る方法を提供する。
上記の発現ユニットはRNAポリメラーゼ結合性配列、
リボソーム結合性部位及び翻訳開始シグナルを含んで成
る。該発現ユニットは翻訳エンハンサー又は「活性化」
配列、選んだ配列の３′尾部及び適切な制限部位を更に
含んで成りうる。該セミランダムDNA配列は天然DNAの機
械的、化学的もしくは酵素的断片化により、DNAの化学
合成により、又はDNAを直接該発現ユニット上に重合せ
しめることにより作られる。該対象の物質は表層抗原、
リセプタータンパク質、毒素、有機ポリマー、タンパク
質分子の活性部位、中間代謝物、抗体、金属、ホルモン
又はその他の化合物でありうる。
上記及びその他の態様は以下の詳細の説明を参照する
ことによって明らかとなるであろう。
好ましい態様の詳細 本発明は新規なる遺伝子及びポリペプチドの単離に関
する。このような新規なる遺伝子は本質的に無数の多様
性（diversity）を有し、そして商業的に重要な特性、
例えば新規なる触媒活性又は特定の物質に選択的に結合
する能力、を有す新しいポリペプチドをコードしうる。
現存する遺伝子又は化学合成DNAのセミランダムヌクレ
オチド配列に由来する読み取り枠（open reading fram
e）を含んで成る新規なる遺伝子が作製されうる。これ
らは現存するプロモーター、エンハンサー、開始コド
ン、プラスミド、リボソーム結合性部位及び／又はター
ミネーターを用いることにより広範囲の生物において発
現されうる。ある場合において、該新規なる遺伝子を大
量生産プロセスの一部としてインビトロにおいて発現せ
しめることは好適でありうる。
上記の通り、本発明は特異的な結合性並びに／又は生
物学的活性を有する新規なるポリペプチドをコード化す
る新規なる遺伝子及び遺伝子フラグメントを作製し、そ
して単離するための複数段階プロセスを詳細する。好適
な態様において、該プロセスは以下の段階を含んで成
る： 1. RNAポリメラーゼ結合性配列（即ち、プロモーター
又はRNA依存性RNAポリメラーゼ開始部位）、リボソーム
結合性部位及び翻訳開始シグナルを含む発現ユニットを
作製する。この発現ユニットは適当な制限部位、翻訳エ
ンハンサー又は「活性化」配列、及び選んだ配列の３′
尾部も含むことがありうる。
2. 次にセミランダムDNA又はRNAを、天然DNA,RNAもし
くはcDNA配列の機械的、化学的又は酵素的断片化によ
り、あるいはヌクレオチドの化学合成により作る。この
セミランダムDNA又はRNA配列を次に前記の発現ユニット
に挿入せしめる。他方、このセミランダム配列を該発現
ユニット上に直接重合化せしめてもよい。これによって
1012種又はそれより多くの異なる配列のライブラリーが
作られうる。
3. 次にこの新規なる遺伝子をインビトロで転写せしめ
てオリジナルDNAライブラリーのRNAコピーのプールを作
る。もしRNA依存性RNAポリメラーゼが含まれている場
合、これらのレプリカーゼをRNAの増幅のために用いう
る。
4. RNA（mRNA）をインビトロで翻訳してポリソームを
生産する。「ポリソーム」（RNA−リボソーム−形成期
ポリペプチド複合体）を維持せしめる条件を、所望のポ
リペプチドとmRNAを一緒に保つために用いる。
5. 次にこのポリソームを対象の物質、例えば表層抗
原、リセプタータンパク質、毒素、有機ポリマー、抗
体、中間代謝物、ホルモン及びタンパク質分子の活性部
位と結合させるか、又は生物活性を表示させる。
6.対象の物質と結合しているポリソームは、未結合ポリ
ソームの除去により実質的に純化される。このポリソー
ム複合体を維持する条件のもとでの系列的又はフロース
ルー洗浄は、このポリソームの構造を通じて対象の物質
に結合し続ける所望のmRNAの度数を実質的に高める。
7. 次に、このポリソーム複合体からmRNAを遊離するた
めにこの結合／活性ポリソームを解離せしめる。
8. 次に微量mRNAを、cDNAコピーを作ることにより又は
RNA依存性RNAポリメラーゼによるRNAの直接的な増幅に
よって回収する。DNAポリメラーゼ及び／又は逆転写酵
素反応によるcDNAの増幅はこのような微量の豊富な情報
（low abundance messages）を回収することを大いに容
易化せしめる。
9. 次に得られるcDNAをポリペプチドを生産するために
発現させる。
ほとんどの場合において、特異的な結合性タンパク質
の度数をポリソームの非特異的な結合性のバックグラン
ドよりも更に高めるために段階３−８の反復が好適であ
る。
本明細書に詳細の方法により生産した、（複数の）単
離化精製新規遺伝子は、標準的な発現技術を利用するこ
とにより種々の対象の（複数の）ポリペプチドを作り上
げることが可能であり、これに陽性であることは所望の
生成物をコードする遺伝子であることが証明される。更
に、常用の方法によるDNA及び／又はポリペプチドのシ
ーケンシングが、新規なるポリペプチドの組成物の同定
に利用されうる。
この新規なる遺伝子によりコード化されるポリペプチ
ドが単離且つ同定されたなら、この新規なる（複数の）
ポリペプチドの大量生産が、化学合成により（もしその
アミノ酸配列が比較的短い場合）、又は遺伝子操作微生
物を利用する組換DNA法を介して成し遂げられうる。他
方、大量インビトロ転写及び／又は翻訳法が商業的な量
のポリペプチドの生産のために利用されうる。
オリジナルの単離化新規ポリペプチドの特異的結合性
及び／又は生物学活性を、その他の結合及び生物学活性
に加えて有するハイブリドタンパク質を作るため、選ば
れたポリペプチドをコード化するDNA配列をより大きい
遺伝子（即ち、例えば抗体遺伝子の超可変性領域の中）
に組込むこともできうる。
I.発現ユニット 該発現ユニットは５′非翻訳領域を含んで成り、そし
て更に３′領域を含んで成りうる。この発現ユニットの
５′非翻訳領域はプロモーター又はRNAポリメラーゼ結
合性配列、リボソーム結合性配列及び翻訳開始シグナル
を含む。この５′非翻訳領域（頭部）は適当な制限部位
及び翻訳エンハンサー又は「活性化」配列も含みうる。
この３′領域は適当な制限部位及び選ばれた配列の３′
尾部を含みうる。この発現ユニットは当業者によく知ら
れた方法によって化学合成されうる。他方、これらの構
成要素をこの発現ユニットに集成化せしめる前に、１又
は複数のプラスミドに組み込み、微生物内で増幅せし
め、標準的な方法により精製し、そして制限酵素により
適当なフラグメントへと切断せしめることができうる。
この５′非翻訳領域はプロモーター又はRNAポリメラ
ーゼ結合性配列を含む。効率性の高いプロモーター、例
えばT7,T3又はSP6 RNAポリメラーゼに関するそれが以
下の理由により本発明に好適である。このようなプロモ
ーターは既知の組成の短いDNA配列であり、それらに対
応するポリメラーゼに非常に特異的であり、そして活性
が高く、DNA鋳型当り50回以上の転写を可能にするから
である。更に、T7,T3及びSP6ポリメラーゼはあらゆるソ
ースから市販され、そしてよく特徴付けられている転写
キットの構成員である。T7プロモーターのためのその共
通配列はTAATACGACTCACTATAGGGAGA（23塩基対）であ
る。この配列が本発明の好適な態様との関連において説
明されているが、T7 RNAポリメラーゼのために機能し
うる関連するDNA配列及びその他のRNAポリメラーゼのた
めに適するであろうその他の配列が利用されうることが
明白であろう。一定の態様において、２種のプロモータ
ー、例えばT7及びSP6プロモーターの両方を利用するこ
とを所望することがある。
このプロモーター領域の下流もしくはその中に位置す
るのはリボソーム結合性部位をコードするDNA配列であ
る。もし原核細胞翻訳方法を用いる場合、このリボソー
ム結合性部位は原核細胞リボソーム複合体（リボソーム
RNAを含む）に特異的でありうる。しかしながら、本発
明の好適な態様は真核細胞配列及びインビトロ真核細胞
翻訳系、例えばウサギ網状赤血球系を利用する（Krawet
zら、Can.J.Biochem.Cell.Biol.61:274−286,1983;Merr
ick,Meth.Enzymol.101:38,1983）。共通翻訳開始配列GC
CGCCACCATGG及びその他の機能的に関連する配列が脊椎
動物のmRNAに関して確立されている（Kozak,Nucleic Ac
ids Res.15:8125−8148,1987）。この配列又は関連する
配列はインビトロタンパク質合成をもたらすために、新
規なる遺伝子の作製において利用されうる。この開始配
列におけるATGトリプレットはメチオニンに関する翻訳
開始コドンである；インビトロタンパク質合成はこの位
置にて開始するものと予測される。
このプロモーターと翻訳開始部位との間に、その他の
既知配列、例えば翻訳エンハンサー又は「活性化」配列
を置くことを所望することがある。例えば、Joblingら
は（Nucleic Acids Res.16:4483−4483,1988）、タバコ
モザイクウィルス由来の翻訳されない「リーダー配列」
がSP6−生成mRNAにおいて「有意に翻訳を活性化せしめ
た」ことを示した。彼らはムラサキウマゴヤシ（alfalf
a）モザイクウィルスRNA4の36個のヌクレオチドの５′
非翻訳領域がオオムギ（barley）アミラーゼ及びヒトイ
ンターロイキンmRNAの翻訳効率を高めることも報告して
いる（Jobling and Genrke,Nature 325:622−625,198
7）。ゴキブリ（black beetle）ウィルス（ノダウィル
ス;Nodovirus）RNA2（FriesenとRueckert,J.Virol.37:8
76−886,1981）、カブラ（turnip）モザイクウィルス及
びスズメノチャヒキ属（brome）モザイクウィルスコー
トタンパク質mRNA（Zagorskiら、Biochimie 65:127−13
3,1983）も高い効率で翻訳される。対照的に、一定の翻
訳されないリーダーはSP6 RNAの発現を強く抑えた（Jo
blingら、前記、1988）。
適切な制限部位をその後の遺伝子操作に役立てさせる
ためにこの発現ユニットに含ませることもできる。例え
ば、セクスチュプレットCCATGGは制限エンドヌクレアー
ゼNco Iのための認識配列である。リボソーム結合部位
の下流に位置するNco I「切断部位」は逐次の遺伝子操
作のための好適なスプライス部位である。それ故、所望
の新規遺伝子の精製後、この発現ユニットをこの部位に
て該新規遺伝子から切り離すことができ、そして新規の
ポリペプチドのインビボ及び大量生産発現のためにその
他のプロモーターを連結させることができうる。Nco I
部位は２種類のポリペプチドドメインが一緒となり、そ
して単一タンパク質として発現されるハイブリドタンパ
ク質の作製のための好適なクローニング部位としても利
用されうる。
更に、プラスミドへの新規遺伝子の逐次的クローニン
グのために、この５′非翻訳領域に少なくとも１つの制
限エンドヌクレアーゼ部位を有すDNA配列を含ませるこ
とが最も有利な傾向にある。オクタマー配列GCGGCCGGC
はNot Iヌクレアーゼにより認識され、そしてそれらは
新規なる遺伝子のコード領域にあることは稀であるため
に特に有用である（Not IはランダムDNA全体を一度に6
5,536塩基対毎に切断すると予測される）。その他の制
限部位も利用されうる；新規遺伝子コード領域を切断す
る予測頻度はヌクレオチド組成又はコード領域のDNA起
源に依存する。一定のパリンドローム配列が翻訳を妨害
しうることが理解されるであろう；しかしながら、ある
配列は翻訳の速度を高めることもある。
この発現ユニットは３′領域も含みうる。パリンドロ
ーム配列を有す既知の３′領域（尾部）を作製すること
が少なくとも２つの理由のために所望される。第１に、
３′制限部位はあらゆるその後のポリペプチドコード領
域の遺伝子的操作のために好適であろう。例えばもしNo
t I部位が５′及び３′領域の両方において位置する場
合、所望のポリペプチドをコードする配列は更なるクロ
ーニングのためのNot I「接着末端」を伴って切り出さ
れうる。第２、パリンドロームはトランスロケーション
（転位）を妨げる二次構造をもたらすことがあり、従っ
て、３′領域におけるパリンドロームは翻訳の際のリボ
ソームの移動を遅くらせうる。この第２の性質はリボソ
ームはmRNAから脱離することを防止するために所望さ
れ、そしてそれ故インビトロ翻訳段階におけるリボソー
ムの数を高める。この３′領域はポリ−Ａ又はその他の
ポリヌクレオチド鎖であって、相補的なホモポリマー配
列とのハイブリダイゼーションにより、インビトロ翻訳
反応におけるその他の成分からmRNAを後に精製するため
のものをも含みうる。
更に、その他のランダムでな配列をこの発現ユニット
に組み込むことがありうる。１つの態様において、発現
されたポリペプチドは非ランダム及びセミランダムアミ
ノ酸配列の両方を含む。コード領域の非ランダム成分は
非ランダム５′非翻訳化領域及び／又は３′領域を伴っ
て合成且つ製造される。この非ランダムコード配列は何
十億の新規ポリペプチドの中に保存されているアミノ酸
の鎖（同定又は「ID」ペプチド）を特定する。このIDペ
プチドは新規なポリペプチドの定量のため、及び新規ポ
リペプチドの精製のために有用である（このIDペプチド
に対する抗体が入手又は生産された場合）。１つの例は
11個のアミノ酸物質Ｐであって他のポリペプチドの融合
ペプチドとして結合できるものである。抗−物質Ｐ抗体
は、物質Ｐを含む融合タンパク質を検出及び定量するた
めに市販されている。その他の例は８個のアミノ酸マー
カーペプチド「フラグ」（“Flag"）である（Hoppら、B
io/Technology ６:1204−1210,1988）。
アミノ末端IDペプチドはカルボキシル末端IDペプチド
よりも少なくとも２つの利点を有す。第１に、Ｎ−末端
IDの適当な解読枠を保持する遺伝子構造体を作製するこ
とは容易であり、その理由はセミランダムDNA又はRNAの
長い鎖はＣ末端IDに関する３つの全ての解読枠において
終結する傾向にあるからである。第２に、このＮ−末端
IDは形質転換生物においてシグナルペプチドとして働く
ようにデザインされており、大量生産の際に新規のポリ
ペプチドの分泌を可能にする。
にもかかわらず、Ｃ−末端IDポリペプチドも利用され
うる。１つの好適なＣ−末端ポリペプチドはポリグリシ
ンであり、これはポリdGによりコード化され、セミラン
ダム配列の解読枠に関係なくGly−Gly−Gly…を読ませ
る。このポリペプチドのポリグリシン３′末端は形成期
ペプチドの不干渉性つなぎ鎖（noninterfering tethe
r）として働き、そしてこのセミランダム配列が対象の
分子に結合することを大いに高める。更にこのポリ−dG
配列はcDNAの第２の鎖を合成せしめるために利用され、
そしてポリＣもしくはポリ−dCを有すRNA又はDNAの精製
のために有用でありうる。その他の繰り返し配列、例え
ばGGGCGGGC…が、全ての解読枠において発現される認識
されるペプチド配列をコードするために利用されうる。
このIDペプチドの好ましい型は簡単な化学又は酵素手段
によって新規ポリペプチドから切断されうるものであ
る。
このDNA発現ユニットの他に、セミランダムポリペプ
チド合成のためのRNA発現ユニットを作製することがあ
る。このRNA発現ユニットの１つの考えられる利点は、
このポリソームmRNAの回収が初期のcDNA段階を行なう必
要がないことにある。その代り、所望の配列を有すmRNA
はRNA依存性RNAポリメラーゼ、例えばQB（Ｑベーター）
レプリカーゼのそれにより増幅されうる（HarunaとSpie
gelman,Proc.Nat.Acad.Sci.54:579−587,1965）。この
酵素は30分において10億の組換RNAコピーを作製できる
（Lizardiら、Bio/Technology ６:1197−1202,1988）。
組換RNAの増幅のための１つの適当なクローニング法はL
izardiらにより詳細されている（前記、1988）。本発明
の目的のため、その他の構成要素、例えば制限部位、エ
ンハンサー及びID配列を、このQB RNA鋳型を引き起こ
すDNAプラスミドに加えることができうる。セミランダ
ムコード化配列を標準のDNA方法論によってこれらのプ
ラスミド上に挿入せしめることができうる。このQBレプ
リカーゼ鋳型が転写される場合（例えばT7 RNAポリメ
ラーゼにより）、セミランダム遺伝子配列を含むインビ
トロ複製の可能なRNAライブラリーを作り上げることが
できうる。他方、類似のRNA発現ユニットは、適切なRNA
分子を化学合成し、それらをRNAリガーゼ例えばT4 RNA
リガーゼ（市販）であって一本鎖RNA及び／又は一本鎖D
NAを結合させるものを介して集成せしめることによって
作製されうる。
II.セミランダムヌクレオチド配列 DNA又はRNAのセミランダム配列を該発現ユニットに連
結させる。RNA発現ユニット及びセミランダム配列はDNA
鋳型から作るか又はDNA発現ユニットと同様の方法にお
いて化学的に合成したRNAもしくはmRNAのフラグメント
から作製されうるため、以下の詳細はセミランダムDNA
の発現ユニットへの連結についての方法のみを説明す
る。当業者は容易に、セミランダムポリヌクレオチドに
連結する発現ユニットのRNA相当品を作製することがで
きるであろう。
セミランダムDNAは少なくとも３種の方法により作ら
れうる。第１は、事実上あらゆる生存起源由来の天然DN
Aを機械的、化学的又は酵素的に断片化せしめ、そしてD
NAリガーゼによって５′非翻訳領域に連結せしめる。異
なったDNA起源由来のフラグメントの混合物を利用でき
うる。これにより、活性な「読み取り枠」〔活性がこの
分子の最Ｃ末端にない限り、「ナンセンス」（又は「終
止」）コドンを有さないタンパク質の領域（フラグメン
ト）〕の選択的な発現が得られうる。本発明の１つの態
様において、既知の機能をコードする遺伝子を断片化せ
しめることがある；得られる断片を５′非翻訳領域にリ
ゲートせしめ、そしてその後ポリソームアッセイにおい
て、活性の発現についてスクリーンする。生物学的活性
を示す最も小さい遺伝子フラグメントを調べる。ことに
より、タンパク質ドメインの分析が行なわれる。遺伝子
フラグメント分析は小さな生物学的活性ペプチド及びハ
イブリド治療的タンパク質を作り上げるために有用であ
り、そしてもしより小さいサイズがペプチドの標的部位
への到達に役立つならば、薬剤輸送のために有利であり
うる。
本発明の他の態様において、この「フラグメント化」
DNAはcDNAライブラリー由来のセミランダムにサイズ化
したcDNA分子でありうる。インビトロでcDNAを発現させ
且つポリソーム選別を用いることにより、抗体、リセプ
タータンパク質又はその他の検査用分子との該ポリソー
ムの結合を介して非常に微量の、部分的もしくはおそら
く全長遺伝子さえも単離されうる。本明細書記載のcDNA
「フラグメント」の無細胞発現は、所望のcDNAクローン
を見つける従来の方法よりも高感度であった。
セミランダムDNAを作り上げる第２の方法はDNAを化学
合成することである。例えば、約100ヌクレオチドの比
較的長いDNA分子を、それぞれの位置にてヌクレオチド
の混合物により合成することができうる。しかしながら
化学合成したDNAからナンセンスコドンの統計学的問題
が明らかとなる。前記の遺伝子フラグメント及びcDNAの
手法に関しては、活性なる読み取り枠は現存のタンパク
質配列内から見い出せる。「読み取り枠」は、終止コド
ンが存在しないことを意味し、そしてしばしばタンパク
質コード領域内由来の配列を意味する。
しかしながら、全ての位置にて20種の共通アミノ酸全
てをコードする十分な多様性を有す化学合成DNAは読み
取り枠を有す必要がないことが明らかであろう。終止コ
ドンは64種の考えられるDNAトリプレットのうちの３種
（TAA,TAG及びTGA）で表される。完全にランダムなDNA
に関して、各位置おける４種のヌクレオチド全ての等し
い確率により、ナンセンスコドンの確率は3/64＝4.6875
％である。30個のアミノ酸の鎖をコードするランダムDN
A鎖に関して、その鎖内における少なくとも１個の終止
コドンを有す確率は約76％である。終止コドンは翻訳の
終結及びリボソーム複合体からの形成期ポリペプチドの
遊離をもたらす。従って、ナンセンスコドンの頻度を引
き上げ、且つタンパク質翻訳の際のナンセンスコドンの
通常の効果を回避する手法は好ましく、そして以下に詳
細する。
より詳しくは、A,T,C及びＧ塩基組成を好ましい一定
のコドンへの操作し、そして特にナンセンスコドンの可
能性を引き下げるよう操作する。極端な場合において、
各トリプレットコドンの第３の位置をＣ及びＴのみによ
って合成してナンセンスコドンを理論的に回避する。し
かしながら、この場合において20種のアミノ酸全てがコ
ードされない。LimとSauer（Nature 339:31−36,1989）
はラムダリプレッサーの新しい領域の合成において、最
初の２つのコドン位置において４種の塩基全ての等量混
合物を、そして第３のコドン位置にてＣ及びＧの等量混
合物を用いた。この組合せは各コドンにて20種のアミノ
酸全てを可能とし、そしてナンセンストリプレットの頻
度を1/32＝3.125％に引き下げた。しかしながら、30個
のアミノ酸における少なくとも１個のTAG終止コドンを
有す確率は約61％である。
本発明の好ましい態様において、全てのコドンにて20
種のアミノ酸全ての高い頻度を可能にしながら終止コド
ンの頻度を引き下げるために、全ての３つのコドン位置
において等量でない塩基の混合物を用いた。第１のコド
ン位置においては等モル量のC,A及びＧを用いたが、Ｔ
はそれらの半分量で用いた。第２のコドン位置にてはＡ
の量をその他の３種塩基のレベルの半分に下げた。第３
のコドン位置においては、Ｇ及びＣ又はＧ及びＴのみを
等モル量において用いた。この手法の結果、終止コドン
が30個のアミノ酸の鎖中に存在しない可能性が79％以上
となった。この場合において個々のアミノ酸の比率は全
ランダムDNA手法に比べてわずかに変化した。しかしな
がら、ランダム状態と比べてチロシンのみが半分以下の
予測頻度で示されるであろう。
化学合成DNAを用いる場合のナンセンスコドンの存在
を更に解決するためには、インビトロ翻訳段階において
ナンセンス抑制tRNAを用いることが好適である。特に、
前記の手法はTAG終止コドン以外の全てを削除するた
め、且つ各コドン位置での等量でない塩基の混合物の結
果としてチロシンコドンが過少表現されるため、TAG（m
RNAにおいては事実上UAG）を認識し且つ成長しているポ
リペプチドの中にチロシンを挿入せしめるナンセンスサ
プレッサーが最も所望される。このようなチロシン−挿
入ナンセンスサプレッサーは、チロシル−tRNAのアンチ
コドン領域を変えてチロシル−tRNAがmRNAにおける正常
のUAU及びUACチロシンコドンの代りにUAGを読むような
状態にすることによって作られうる。正常チロシル−tR
NAはチロシンコドンを読むために翻訳段階に含ませるこ
ともできるであろう。その他の２種類のナンセンスコド
ンのためのナンセンスサプレッサーを作ることもでき
る。例えば、UGA終止コドンのトリプトファン−又はロ
イシン−挿入サプレッサーが、その他の多数のナンセン
スリプレッサーと同様によく特徴付けられている。多数
のナンセンスサプレッサーのヌクレオチド配列が知られ
ている；そしてそれ故、このような分子の作製は当業者
に明らかであろう。
哺乳類翻訳系のナンセンスサプレッサーはよく知られ
ている（BurkeとMogg,Nucleic Acids Res.13:1317−132
6,1985;Caponeら、EMBO J.４:213−221,1985;Diamond
ら、Cell 25:497−506,1981;Hudziakら、Cell 31:137−
146,1982;Laskiら、EMBO J.３:2445−2452,1984）。更
に、別の研究者は、真核細胞インビトロ翻訳系における
ナンセンスコドンの「解読」は、酵母由来のチロシン−
挿入UAGサプレッサーtRNAを含むサプレッサーtRNAの利
用により可能であることを示した（Capecchiら、Cell
６:269−277,1975;Gestelandら、Cell ７:381−390,197
6）。このような酵母サプレッサーによるUAG終止コドン
の読み過し（readthrough）はインビトロで70％ほどの
高さであることが報告されている（Pelham,Nature 272:
469−471,1978）。GellerとRich（Nature 283:41−46,1
980）は、酵母サプレッサーtRNAより、並びに細菌性サ
プレッサーtRNA及びcRNAシンテターゼより、網状赤血球
系におけるナンセンスコドンの抑制に成功した。従っ
て、翻訳段階の際にリボソームからのポリペプチドの早
期遊離を引き下げるための本発明におけるtRNAサプレッ
サーの利用は、当技術的水準の範囲に属する。更に、Pe
lham（前記、1978）及びGellerとRich（前記、1980）の
両者は真核翻訳系における高レベルの天然ナンセンスの
抑制を詳細している。特にPelhamは、モザイクウィルス
において特にUAGコドンが「Mg2+の超最適濃度」又は報
告されている2.1mMのMgCl2により、現状の40％近く「解
読」（抑制）されうることを示している。従って、この
レベルのマグネシウムイオン（又はそれ以上）はナンセ
ンスコドンの読み過しを高めるため、そしてそれ故長い
セミランダムヌクレオチド配列の翻訳終結の問題を引き
下げるために本発明において好適に利用される。
化学的手段によってセミランダムDNAを作り上げるこ
とにおいて、選んだコドン位置での異なる塩基の混合が
特定のアミノ酸の偏りのために利用されうる。例えば、
コドンにおける第３の位置でのＧの削減は、ペプチド中
にメチオニン及びトリプトファンが含まれる妨げとな
る。他の例として、高システイン含有に向けて偏らせた
ヌクレオチド混合物は、構造の強化のために内在ジスル
フィド結合を有す短いペプチドを製造するために所望さ
れている。このような頑強ペプチドはその他の分子とよ
り強く結合しうる。
このような人工ヌクレオチドの第２鎖合成は「ランダ
ムプライミング」及びDNAポリメラーゼによる伸長によ
り、並びに／又はポリ−dX尾部であってポリ−dXとプラ
イムするものを含ませることにより、成し遂げられう
る。その他の方法、例えば自己プライミングのための
「ヘアーピンループ」を作り上げる末端パリンドローム
の利用を第２鎖合成のために利用しうる。100個のヌク
レオチドの二本鎖DNA 100μｇは約1015個の分子を含
む。もしセミランダム合成手法を利用した場合、このよ
うな分子それぞれが異なるポリペプチドをコードするこ
とが予測される。従って、非常に大いなる多様性が実験
室レベル量のDNAにおけるコード化潜在能力に存在す
る。このような100個のヌクレオチドの合成DNA分子は例
示の目的のためにのみ提供した；より長い配列も合成さ
れうる。更に、より短い合成分子を作り上げ、そしてあ
らゆる長さのセミランダム配列を作るために互いにリゲ
ートせしめることができうる。より短い分子はより長い
分子よりも合成DNAの読み取り枠をよく保存するものと
予測され、その理由は化学合成塩基のそれぞれの付加は
100％でないためである。従って、より短い人工DNA分子
の利用によってナンセンスコドンがより回避されうる。
T4 RNAリガーゼ又はその他の手段が短い一本鎖DNAを互
いに連結せしめるために用いられうる。
セミランダムDNAを作るための第３の方法は、この分
子を５′非翻訳領域の３′末端上に直接的に重合せしめ
ることである。Ｎ−末端ID配列を用いない場合、この重
合はATG開始配列のすぐ後に、又は好ましくはATGG配列
のすぐ後（共通脊椎動物開始部位及びNco I部位を共に
保有するケ所）にて起こりうる。この重合のために最も
一般的に利用される酵素は末端基転移酵素（通常牛甲状
腺に由来）であり、これはDNAクローニングのためのホ
モポリマー領域を作るためによく利用される。しかしな
がら、異なるデオキシヌクレオチド三リン酸を混ぜ合わ
せることにより、DNAのセミランダムヘテロポリマーが
遊離３′−OHを有すDNAプライマー上において合成され
うる。ここでも、一定のコドンに偏らせるため及びナン
センスコドンの頻度を引き下げるため、４種のデオキシ
ヌクレオチド三リン酸の相対濃度を調節することによっ
て、A,T,C及びＧ塩基組成を操作する。特により少量のd
ATPがナンセンスコドン（TAA,TAG及びTGA）の頻度を引
き下げうる。E.コリ（E.coli）DNAポリメラーゼＩがDNA
の非鋳型（新規:de novo）合成の実施において報告さ
れ、そして末端基転移酵素の代りに利用されうる（A.Ko
rnberg,DNA Replication,W.H.Freeman ＆ Co.,San Fran
cisco,Calif.,1980）。その他の酵素又は化学方法も該
発現ユニット上にDNAを直接重合せしめうる。第２鎖の
合成はランダムプライマー伸長により最も容易に成し遂
げられうるが、しかしその他の方法も同様の結果を提供
しうる。ここでも、ナンセンス抑制tRNAの利用がこのセ
ミランダムDNA配列における終止コドンの問題の解決に
大きく役立つことができうる。
III.新規遺伝子の転写 もしDNA発現ユニットをセミランダム配列を伴って用
いると、mRNAはRNAポリメラーゼによって容易に作り上
げられる。前述した通り、T7,T3及びSP6 RNAポリメラ
ーゼが市販され、そして非常に有用である。例として、
T7プロモーターを有すDNA発現ユニットをT7 RNAポリメ
ラーゼにより、その製造者の仕様書に従って処理せしめ
る。およそ50のmRNAコピーが各DNA分子について30分で
通常合成されうる。このDNAはRNaseを含まないDNaseに
より分解されうる。もしオリジナルDNAライブラリーが1
012個の分子の多様性の配列を有す場合、得られるmRNA
のプールは同一レベルの多様性を示すがしかし尚も50又
はそれ以上の異なるDNA分子のそれぞれのRNAコピーを含
むであろう。６μｇのRNAライブラリーは、30個のアミ
ノ酸のセミランダムポリペプチドをそれぞれ発現可能な
1012種の異なるmRNAの50コピーを含みうる。小さな試験
管中で６μｇは取り扱い易いため、標準的な実験器具及
び容器が利用されうる。
mRNAの５′末端は真核細胞系における効率的な翻訳の
ためにジクアノシン三リン酸「キャップ」（又は類似
体）の付加による修飾を必要とする。この５′キャップ
化mRNAはインビトロ転写（HopeとStruhl,Cell 43:177−
188,1985）及び／又はインビトロ翻訳工程（KriegとMel
ton,Nucleic Acids Res.12:7057−7070,1984）の際中に
作られうる。転写にわたり情報物をキャップするため、
GTPに対して過剰量のジグアノシン三リン酸又はその類
似体（例えばm7G（５′）ppp（５′）G;ベーリンガーマ
ンハイムバイオケミカル社）がRNA重合の間に利用され
る。この方法に基づくmRNAのキャッピングキットはスト
ラタジーン（Stratagene）（California）より市販さ
れ、これは得られるRNAの90％95％をキャップする。
もしこの発現ユニットがQBレプリカーゼ系のようにRN
Aを基礎とする場合、いくつかのRNAコピーが、この新規
遺伝子構造体がDNAをプラスミドを含むならばT7又はそ
の他のプロモーターにより作られうる（Lizardiら、前
記、1988を参照のこと）。RNAコピーが存在すると（又
は新規遺伝子がRNAレベルで組立てられる場合）、RNA依
存性RNAポリメラーゼは事実上無数のRNAライブラリーの
コピーを作ることができる（10億のコピーは容易に達成
されうる）。しかしながら、このライブラリーの多様性
はそのままである。RNAファージ、例えばQBにより、こ
のライブラリーはDNA中間体を経る必要なくRNAレベルに
て自己維持（self−sustaining）しうる。
IV.RNAの翻訳 複数のインビトロ翻訳法が広く知られている。都合
上、若干の改良を伴ってウサギ網状赤血球又は小麦胚芽
系が利用さうる。インビトロ翻訳キットは市販されてい
る。例えばベーリンガーマンハイムバイオケミカル社の
「トランスレーションキット、網状赤血球、型Ｉ」
（“Translation Kit,Reticulocyte,Type I"）は100種
の翻訳反応のための全ての成分を有する。各反応は25μ
ｌの容量中の約１μｇのmRNAにて最適である。１μｇの
mRNAは前記した通り、４×1012個以上の新規遺伝子をコ
ードするのに十分である。従って、比較的少量において
非常に大きい数の新規遺伝子を翻訳可能である。例えば
1013個の80Sリボソームは約66μｇの重さのみである。m
RNAの小さいサイズのため、１情報当り数個のリボソー
ムでmRNAを飽和せしめるものと予測される。
上記の代表的な翻訳キットのプロトコールに詳細の通
り、GTP及びm7G（５′）ppp（５′）Ｇがインビトロ転
写RNAの効率的な翻訳のために必要とされる。mRNAキャ
ッピングが転写の際に既に行なわれている場合でさえ
も、前記の通りこの翻訳反応にジグアノシン三リン酸
（又はその類似体）及びグアニリルトランスフェラーゼ
（KriegとMelton,前記、1984）を加えることが好都合で
ありうる。転写の際にキャッピングを行わない場合、こ
の２種の試薬はmRNAの効率的な翻訳に必要でありうる。
特にQB構造体が翻訳される場合、ジグアノシン三リン酸
（又はその類似体）及びグアニリルトランスフェラーゼ
は翻訳の際にRNA分子をキャッピングするために必要で
ありうる。
翻訳の最適化及び特にmRNAへのリボソームの結合のた
めにその他の技術も採用されうる。例えば、リボヌクレ
アーゼインヒビター、例えばヘパリンを加えることが所
望されうる。真核細菌系、例えば小麦胚芽及び網状赤血
球翻訳法は原核細胞系と類似の結果をもたらしうる。原
核細胞系はより小さいリボソーム及びより容易に入手で
きるナンセンスサプレッサーtRNAの利点を有す。更に、
原核細胞において転写及び翻訳はしばしば同時反応であ
る。原核細胞において転写と翻訳の組合せが行なわれな
い場合、mRNAの安定性は大きく下がる。従って、転写及
び翻訳の組合さる原核細胞インビトロ発現系が利用され
うる。
前記の通り、本発明の好ましい態様は、サプレッサー
tRNA（特にチロシン−挿入サプレッサー）であって、組
換DNA工学及び／又は突然変異細胞系由来のこれらの分
子の部分精製により得られるものの利用にある。放射活
性アミノ酸、特にS35−メチオニンはインビトロ翻訳の
モニターのため及びその後の段階における微量のポリソ
ームを追うために有用でありうる。
約30−60分後、翻訳反応においてタンパク質合成は開
始する。任意に付与した翻訳条件のセットについての正
確な時間は、放射性活性アミノ酸（例えばS35−メチオ
ニン）及びTCA沈殿計測であってポリペプチド合成の指
標であるものによって決定される。タンパク質合成の開
始後、最終濃度μg/mlでのシクロヘキシミドをmRNA上の
リボソームの移動の防止のために加える（Lynch,Meth.E
nzym.152:248253,1987）。このレベルのシクロヘキシミ
ド及び5mMのMg2+濃度がmRNA−80Sリボソーム−形成期ポ
リペプチド複合体（ポリソーム）の維持のために利用さ
れうる。その他のリボソームインヒビターも利用される
ことがあり、何故ならシクロヘキシミドは例えば原核細
胞リボソーム上では働かないためである。しかしなが
ら、GTPの非存在下において、ポリペプチドのリボソー
ムからの遊離は通常起きない。
V.対象の物質へのポリソームの結合 形成期ペプチドが結合しうる潜在化合物のリストは事
実上無限である。このような化合物のカラム、マトリッ
クス、フィルター、ビーズ等への結合のためのカプリン
グ化学剤はこの化合物の性質に大いに依存するであろ
う。ある場合において、完全細胞又は細胞画分が細胞成
分、例えばリセプタータンパク質及びその他の膜結合型
分子に結合するペプチドを見つけるために利用されう
る。
多数のタンパク質及び核酸に対するニトロセルロース
又は類似の人工表層への結合性はフィルター又はファイ
バーの特性である。このような場合において、対象の物
質を確立されたプロトコールによって膜に付着せしめ
る。牛血清アルブミン（BSA）、ゼラチン、カゼインも
しくは脱脂乳又はその他のタンパク質性物質を次に過剰
量において一般的に加え、すべての「自由」表層部位に
結合させる。例えば抗体の溶液をマイクロタイターディ
ッシュ中のニトロセルロースディスク上に加えることに
よって抗体をまずニトロセルロースに結合させる。この
抗体をニトロセルロースに吸収させた後、このニトロセ
ルロースディスクを食塩水を含む新しいマイクロタイタ
ーディッシュに移すことによってこのディスクを洗浄す
る。洗浄後、このディスクを溶液中のゼラチンを含むマ
イクロタイターディッシュに移す。次にこのディスクを
再び食塩水で洗浄する。
ポリソームを対象の物質に結合させる前に、このポリ
ソーム混合物を前述の通りに過剰量において使用したBS
A、ゼラチン、そして特にタンパク質性物質（ブロッキ
ングタンパク質）に予備吸収せしめることが所望されう
る。この方法において、ブロッキングタンパク質に結合
するか又は任意のタンパク質に非特異的に結合するポリ
ソームが除去される。この予備吸着段階は対象の物質に
結合するより特異性の高いポリソームをもたらすであろ
う。特異的な抗体に結合させるため（上記の場合と同様
に）、この（複数の）予備吸着段階はその他の抗体、好
ましくは類似のクラスであるが異なる可変／超可変領域
を有す抗体を含みうる。一般的に抗体とは結合するが可
変／超可変領域には結合しないポリソームをスクリーニ
ングして排除することにより、本発明は抗イディオタイ
プ結合タンパク質を選ぶために有用でありうる。このよ
うな分子は生物学的もしくは酵素的活性（いくつかの抗
−イディオタイプ抗体に見られるように）を有すか、又
はワクチンとして有用である。
対象の物質へのポリソームの結合はMgCl2（5mM）及び
RNaseインヒビター、例えばヘパリンの存在下において
成し遂げられうる。更に、特定のインキュベーションパ
ラメーター（例えば低もしくは高温度、高もしくは低量
の塩、又は異なるpH）が、環境に依存して条件的に結合
するポリペプチドを見い出すのに利用される。インキュ
ベーション時間は対象の物質の結合濃度及びこのような
物質の性質に依存するであろう。
VI.（複数の）対象の物質に結合するポリソームの単離 ポリソームを対象の物質に選択的に結合させた後、未
結合のポリソームを洗浄により一般的に除去する。この
洗浄液はMgCl2及びおそらくポリソームの非特異的な結
合を減ずるのに役立つゼラチン、BSA又はその他のタン
パク質を含むべきである。もし放射性標識アミノ酸を翻
訳において用いる場合、対象の物質に結合する放射性活
性物質のカウントにおいてわずかな検出可能な変化が見
られる迄洗浄（系列的又はフロースルー）を続けるべき
である。もしこのアミノ酸が標識されていない場合、ポ
リソーム溶液の少なくとも10-6希釈が得られる迄洗浄を
続けるべきである。
これらの洗浄後、結合しないために所望される環境、
例えば高温、異なるpH、高金属イオン濃度又は低塩濃度
にこのポリソームを移すことにより、条件的に結合性の
新規ペプチドを単離する。この第２（緊張）条件のもと
で結合しないこれらのペプチド（及びそれらに結合して
いるリボソームmRNA複合体）は溶液中で遊離し、そして
対象の物質に対する潜在的な条件的結合性因子を代表す
るであろう。固定化せしめたら、条件的結合性ペプチド
は対象の物質の精製に利用されうる。他方、条件的結合
性ペプチドは環境変化のモニターにおける試薬として働
きうる。
VII.単離化ポリソームの解離 この単離化（結合）ポリソームはMg2+の除去（希釈も
しくはキレート剤を介して）又は多数の方法によるタン
パク質の破壊（プロテアーゼ、クロロホルム等）によっ
て容易に解離しうる。希釈が最も簡単な方法ではある
が、これはその他の方法に比べてポリソームの完全なる
解離をもたらさないことがある。mRNAを遊離化させるた
めに結合ポリソームをMg+2の含まない溶液に移す;RNase
インヒビターが所望される。
任意の所望する環境のもとで遊離せしめた条件的結合
性ポリソームを、ポリソームを解離せしめてそれらのmR
NAを遊離せしめるのと類似の方法において処理すること
ができうる。
VIII.メッセンジャーRNAの回収及びcDNAの作製 理論的にもし対象の物質に結合している単一ポリソー
ムがmRNAを保有している場合、この微量mRNAはmRNAのラ
イブラリー全体から単離（回収）されることができる。
このmRNAは単離を促進せしめるためのいくつかの技術に
よって増幅されることもできうる。
DNAの単一コピー及び微量mRNAにおけるポリメラーゼ
連鎖反応（PCR）の利用はよく報告されている。（Erlic
h（編）,PCR Technology,Stockton Press,New York,N.
Y.,1989;M.A.Innisら（編）,PCR Protocols:A Guide to
Methods and Application,Academic Press,San Diego,
Calif.,1989;H.A.Erlich（編）,Polymerase Chain Reac
tion:Current Communications in Molecular Biology,C
old Sring Harbor Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,198
9,を参照のこと）。簡単に述べると、微量mRNAをまず標
準の方法によりcDNA合成にかける。５′及び３′領域の
配列は既知であるため、特定のプライマーをcDNA合成の
ために利用できうる。第２に、単一cDNAを特定のプライ
マーの利用（cDNA合成に利用するものと同一のプライマ
ーさえも利用できる）を介して次に増幅せしめる。PCR
のために利用するプライマーはオリジナルの発現ユニッ
トの５′及び３′領域を保有する配列を含むことがで
き、ここでプロモーター（例えばT7ポリメラーゼ認識配
列）及び３′領域を保有する配列が所望される。この方
法において発現ユニットを再生せしめることにより、転
写−翻訳−ポリソーム選別の繰り返しラウンドを、実質
的に全ての選別遺伝子が結合性ペプチドをコードするよ
うにする迄行うことができる。RNAファージ、例えばQ
B、を基礎とする発現ユニットに関しては、微量mRNAの
回収及び増幅は容易化され、その理由は適当なレプリカ
ーゼを利用することにより各mRNAは10億以上のコピーを
複製可能であるからである。
IX.新規遺伝子の発現 新規遺伝子を単離且つシーケンス化せしめたら、それ
ら又は関連する配列を当業界によく知られる方法により
（１）クローン化し、（２）化学的に再生し、（３）突
然変異せしめ、そして（４）発現させる。新規ポリペプ
チドの大量生産は遺伝子操作微生物を用いる組換DNA法
を介して成し遂げられうる。新規の結合性ペプチドのイ
ンビトロ合成のために多彩なる真核及び原核発現系が存
在する。前記した適当なNco I部位又はその他の制限部
位が、この新規遺伝子のコード領域を所望のプロモータ
ーに接続させるために利用できうる。その他の遺伝子ス
プライシング法が同様に存在していることが当業者に明
らかであろう。微生物における新規遺伝子の適切な発現
のためにこの遺伝子の３′末端に翻訳終止コドン及び転
写終結配列を加えることができうる。この遺伝子操作配
列を次にプラスミド又はベクターに移し入れ、そして形
質転換、形質導入、感染、エレクトロポレーション、マ
イクロインジェクション又はその他の類似の方法により
所望の宿主細胞に移し入れる。得られる遺伝子生成物を
定量且つ精製するためにこの新規ペプチド配列を微生物
から分泌されるようにシグナルペプチドに連結せしめる
こと及び／又は本明細書詳細の通りにIDペプチドを含ま
せることができる。この新規ペプチド又は関連する配列
を、遺伝子操作生物において同様に発現するハイブリド
又は融合タンパク質を形成せしめるためにその他の翻訳
化配列に連結させることができうる。他方、商業的な量
のポリペプチドを生産するために大量インビトロ転写及
び翻訳法が利用されうる。
最後に、この新規ペプチドのアミノ酸配列が短いなら
ば、通常の有用な技術がポリペプチドの大量化学合成を
可能にする。新規ペプチドの化学合成はインビトロ及び
インビボ（生体内）発現系に勝る利点を有す。これらの
利点の中で、化学合成は（１）よりよく定義され、従っ
て合成のためのより再現性のある系であり、（２）DNA
及びRNAの夾雑起源を有さず、（３）ヌクレアーゼ、プ
ロテアー及びその他の改質酵素の夾雑起源を有さず、
（４）合成の後に比較的純粋な生成物を提供する。
X.特定のポリソームについての反復純化 バックグランド、即ち、対象の物質へのポリソームの
非特異的結合の量に依存して、所望のポリペプチドをコ
ードする配列の度数を高めるために任意の回数の前述し
た翻訳−転写−結合−回収のサイクルを選びうる。例え
ば、もし各サイクルが所望の新規遺伝子の度数を104倍
高めるなら、10-12の度数にてオリジナルライブラリー
に存在する配列の単離のためには３回のサイクルが十分
でありうる。各サイクルは１〜３回で完了する；そして
この方法の多数の段階は自動化ワークステーション又は
ロボットにより行なわれることがある。従って、所望の
結合活性のための多数のサイクルは通常１週間以内に成
し遂げられうる。
XI.ポリソーム結合を伴わない翻訳化生成物の活性につ
いてのスクリーニング 本発明の１態様は遺伝子の単離のためのポリソーム結
合を必要としない。その代りに、新規ポリペプチドがリ
ボソームから遊離することがもたらされる完了時迄イン
ビトロ翻訳を進行させる。これはナンセンスコドンの利
用又はリボソームのmRNAの末端からの「脱離」により成
し遂げられる。この新しいペプチドは、この翻訳生成物
の濃縮のためにゲル濾過及び／もしくは遠心、並びに／
又はその他の手段により、リボソーム及びその他の翻訳
反応の成分から分離できうる。次にこのペプチド混合物
に生物学又は酵素活性を表現させる。例えば、成長因子
に欠く組織培養細胞を処理することにより、このペプチ
ドをミトゲン活性をついてアッセイする。
該新規ペプチドの全体又はサブセット内に生物学もし
くは酵素活性が観察されるなら、この活性をコードする
遺伝子は、オリジナルライブラリー又はそのライブラリ
ーのRNAコピーを再分せしめ、そしてこの再分体におけ
る活性についてスクリーニングすることにより見い出す
ことができうる。適切な再分後、この所望遺伝子を（例
えば）1000種類以下の配列を含むプールへと単離化せし
めることができうる。理論上、この所望遺伝子は再分に
より完全に単離できうる（たった１つの遺伝子を含むプ
ール）。PCR、QBレプリカーゼ又はその他の方法（前記
の通り）により、所望の配列は、インビトロ転写及び翻
訳が生物学／酵素活性を有す高い純度のペプチド溶液を
提供するレベル迄増幅されうる。１〜10-3の度数で、こ
の対象の遺伝子を常用の方法を用いて単離且つ適切な発
現系にクローン化せしめることが容易にできうる。
XII.新規遺伝子及びペプチドの無細胞同定 予測の結合性又は生物学活性を有す新規遺伝子を単離
させた後、この精製配列が対象の活性をコードするか
を、DNA及び／又はRNAを増幅せしめて大量インビトロ翻
訳のために十分なmRNAが生産されているかによって確認
する。この精製配列の翻訳生成物はアッセイ可能な活性
を有すほぼ均一なポリペプチドであるべきである。この
遺伝子及び／又はポリペプチドは新規ポリペプチドの組
成を確定する現存の方法によりシーケンス化されうる。
他方、この精製遺伝子を増幅及び発現のために微生物の
中にクローン化せしめることもできうる。その後、新規
遺伝子及びポリペプチドについての生物学／結合活性及
び配列同定の確定しうる。
XIII.新規ハイブリドタンパク質の作製 新規遺伝子についての核酸配列が決定された後、該新
規ペプチドの特性及びその他の所望する性質を有すハイ
ブリドタンパク質を作るために該配列をより大きい遺伝
子の中に組入れる。この方法により作られうる１つのク
ラスのハイブリドタンパク質は細胞への特異的な結合性
及び細胞障害性能力により特徴付けられる。例えば、細
胞表層リセプター結合性ペプチドをDNAスプライシング
法を介してリシン又はその他の毒素に連結させることが
できる。このタイプのハイブリドタンパク質は、病原体
及び腫瘍細胞を含む異なる細胞タイプを選択的に殺傷す
るために用いられうる。このハイブリドタンパク質をコ
ードする遺伝子を完全合成されうるか、又は適当な遺伝
子フラグメントの互いのスプライシングにより得られう
る。この遺伝子は種々の発現系において発現されうる。
本発明の好ましい態様は、抗体並びに抗体様遺伝子の
可変及び超可変領域を、対象の物質に対する結合活性コ
ードする新規遺伝子配列により置換することである。こ
の方法において、対象の抗原に対するより広い多様性が
可能である；そしてスクリーニングプロセスは同一の抗
原に対するモノクローナル抗体についての生産方法より
もより効率的且つ時間がかからないプロセスでありう
る。このような「特注」（“custom"）ハイブリド抗体
遺伝子は、新しい特異性又は性質を有す活性抗体を生産
せしめるよう多数の生物において発現されうる。
XIV.本発明のその他の商業的利用 診断検査における本発明の適用はモノクローナル／ポ
リクローナル抗体の利用に匹敵し、そしてより好都合で
あり、その理由は第１に本明細書記載の新規ポリペプチ
ドの単離はかなり短い時間で行われることにある（１週
間に対して抗体は数ケ月）。更に、その他の利点も見ら
れる。この新規ポリペプチドは抗体よりもかなり小さい
分子である。従って、該新規ペプチドの合成、精製及び
／又は製造は抗体に比べて容易であり、且つ安価であ
る。このより小さいサイズは安定化、製剤化及び標的分
子への到達にも役立ちうる。
この新規ポリペプチドは、（１）これらを定量可能な
活性（例えばペルオキシダーゼもしくはその他の酵素活
性）を有す生物学的に活性なペプチドに融合させる、
（２）現存している抗体に結合するものと分っている前
記のIDペプチドとそれらを合成せしめる、（３）これら
を放射性活性標識せしめる、（４）マーカー、例えば蛍
光色素もしくは金属性物質を化学的に付加せしめるか、
又は（５）上記の任意の組合せにより、同定可能であり
うる。この新規ポリペプチドの診断利用において特異性
を高めるため、２種以上の異なるポリペプチドを利用で
きうる。更に、新規ポリペプチドを、抗原又は基質への
競合的な結合性に基づく診断検査における競合的結合性
構成要素として利用しうる。
本発明によって作られる新規ポリペプチドの他の利点
は、それらが強い免疫応答を引き出すことのないであろ
う多数のクラスの分子と結合しうることにあり、その理
由はいくつかの分子は抗体の形成を誘発するほど複雑で
ない。又は生物に内在する成分に似すぎているためであ
る。更に、診断結合性アッセイにおける新規ポリペプチ
ドの利用は、伝統的な抗体を基礎とする方法よりもより
広い目的を有しうる。
オリジナルの状態で単離した又は融合タンパク質の一
部としての本発明の新規ポリペプチドは治療的にも利用
されうる。例えば、一定の毒素に結合せしめるために新
規ポリペプチドを選んだ場合、これは該毒素を中和する
こともある。もし新規ポリペプチドを細胞膜上ウィルス
リセプター部位又はウィルス結合メカニズムに結合させ
た場合、細胞の感染化は小さくなりうる。先に述べた通
り、毒素の他に新規ポリペプチド認識配列を保有する融
合タンパク質が疾患性又は悪性細胞を選択的に殺傷せし
めるのに用いられうる。感染又は悪性細胞への新規配列
の結合は、細胞−ペプチド複合体に対する免疫応答の引
き金となることがあり、従って疾患の抑制に有用であり
うる。
実施例 以下の実施例は例示であって限定ではない。これらの
実施例において、夾雑活性物質を含まない（使用する際
に）標準試薬及び緩衝液を利用した。リボヌクレアーゼ
及びPCR生成物の夾雑を回避する注意を払うことが好ま
しい。
実施例１ 新規遺伝子ライブラリーの合成 新規遺伝子ライブラリーを作るための配列及び手法は
当業者による慎重な計画を必要とする。発現ユニットの
５′非翻訳領域はRNAポリメラーゼ部位、リボソーム結
合部位、開始コドン及び選ばれた５′非翻訳配列を含
む。本実施例において利用したポリメラーゼ結合部位は
T7プロモーター、TAATACGACTCACTATAGGGAGA（23−mer）
であり、これは該発現ユニットの５′末端に位置する。
T7プロモーターより合成したRNAの翻訳のために、ウサ
ギ網状赤血球系を利用した。従って、このリボソーム結
合部位は真核細胞非翻訳領域についての共通配列の少な
くとも一部を含むべきである。参照論文において、Koza
k（前記、1987）は非常に短い非翻訳領域（10個のヌク
レオチド以下）はタンパク質合成を効率的に開始せしめ
ないものと述べている。ここでは36個のヌクレオチドの
選択した非翻訳領域を利用している。この非翻訳領域は
成体ウサギヘモグロビン（アルファー−グロブリン）天
然（36塩基付）上流配列： ACACTTCTGGTCCAGTCCGACTGAGAAGGAACCACCATGG に由来し、ここで下線部のATGはメチオニン開始コドン
での翻訳の開始位置を示す（Baralle,Nature 267:279−
281,1977）。ウサギアルファー−グロブリン非翻訳配列
を選んだ理由は、（１）これはウサギ網状赤血球系にお
ける好適な基質であると期待され、そして（２）これは
KozakのモデルmRNAの重要な「モチーフ」含むからであ
る。
アルファー−グロブリン配列はインビトロ遺伝子発現
のための以下の方法において改質される。第１に、５′
のＡ（上記の下線部）をＧにより置換したmRNAのキャッ
ピングに役立たせる（Greenら、Cell 32:681−694,198
3）。第２に、Ｇ（アルファー−グロブリン配列におけ
る下線部）をＡと交換し、ベーター−グロブリンmRNAに
比べてタンパク質合成の開始を60％引き下げるものと考
えられている（Baralle、前記、1977）アルファー−グ
ロブリンの非翻訳領域における予測される二次構造をな
くすことに役立たせる。この第２の変化は５′非翻訳領
域において適当なるGATC制限部位をも作り上げる。コー
ド領域のATGGを含む得られるリーダー配列は従って以下
の通りである： GCACTTCTGATCCAGTCCGACTGAGAAGGAACCACCATGG このリーダー配列をT7プロモーターのすぐ下流に置い
た。
３′領域は、（１）特定−プライマー依存性DNA合成
のための選ばれた配列、（２）形成期ポリペプチドに、
対象の物質を結合させるための自由空間を提供するポリ
グリシンつなぎ鎖をコードするGGGに富む領域、及び
（３）適当な制限部位を含み、結果としてのRNA二次構
造はmRNAから脱離するリボソームのトランスロケーショ
ンを妨げうる。このポリグリシン領域はグリシンに関す
る20個のコドンを含んで成り；ほとんどのグリシンコド
ンは隣り合うGGGトリプレットであり、これは全ての解
読枠においてグリシンをコードする。しかしながら、い
くつかのグリシンコドンはDNA鎖を適当な記録体（regis
ter）に保つためのGGT又はGGAである。BamH Iについて
の制限部位（GGATCC）及びNot Iについてのそれ（GCGGC
CGC）はこの遺伝子の３′末端の非常に近くに置くよう
に選んだ;mRNAにおいてこれらの配列はヘアピンループ
を形成するものと予測される。Not I配列による第２鎖
の自己プライミング（ヘアピンループの）を防止するた
め、３′末端にAAAAを付加した。従って３′領域は（GG
G又はGGT/A）20の一般配列、それに続くGGATCCGCGGCCGC
AAAAを有す。この領域に特異的な配列を以下に挙げる。
セミランダム配列は、完全に詳細した５′非翻訳領域
及び３′領域セグメントと塩基対合並びにリゲーション
を受ける既知の５′及び３′末端により合成した。この
目的を成し遂げるため、このセミランダム遺伝子を、
５′非翻訳領域の相補鎖上のオクタマーCCATGGTGと塩基
対合しうる５′CACCATGGを伴って合成せしめた。開始
（最初の）コドンATGはセミランダム配列の翻訳のため
に不可欠である。その後のＧは第２のコドンの第１位で
あり、そしてこれはNco I部位をこの遺伝子の前端に保
存するために不変である。この第２コドンの残り及びそ
れに続く28個のコドンはナンセンストリプレットを減ら
すために最初に説明した法則に従って合成する。即ち、
第１のコドン位置において、等モル量のC,A及びＧを用
いるが、利用するＴの量は半分のみにする。第２のコド
ン位置において、Ａの量をその他の三種の塩基のレベル
の半分に減らす。第３のコドン位置において、Ｇ及びＣ
のみを等モル量において用いる。
コドン30を合成せしめた後、GGTGGGGGを付加する。こ
の配列は２個のグリシン残基をコードし、そして３′領
域のセミランダム配列であってその反対の差に相補性の
CCCCCACC突出しを有す配列をリゲートせしめるために用
いる。この合成の結果物は、事実上30個のアミノ酸ポリ
ペプチドをコードする配列（メチオニンより始まる）で
あり、そしてポリグリシンつなぎ鎖を有す。このトリプ
レットの鎖に終止コドンのない確率はおよそ80％であ
る。逐次の翻訳の際に部分精製した酵母チロシン挿入UA
GサプレッサーtRNAを用いることにより（Pelham,前記、
1978）、90％のセミランダム配列が全長ポリペプチドを
コードするものと予測される。
合成のための特定のオリゴヌクレオチドを以下に挙げ
る： 配列Ｉ及びIIを等モル量において標準TE緩衝液中に混
合し、そして65℃で５〜10分間加熱せしめる。相補性の
配列（５′非翻訳領域を含んで成る）を１時間又はそれ
より長く50゜−60℃でアニール化させ、室温迄ゆっくり
冷却せしめ、そしてこれらをその後０゜−４℃で保存し
た。配列IV及びＶを、二本鎖３′領域の形成のために同
様に処理した。この二重鎖はそれぞれ８個の塩基の一本
鎖突出し配列を有し、これは配列IIIの既知の末端と相
補する。
等モル量のI/II二本鎖、IV/V二本鎖及びセミランダム
配列IIIをT4 DNAリガーゲにより、リガーゼ緩衝液中で
13゜−15℃にて一夜リゲートせしめた。所望のリゲーシ
ョン生成物を選別するためにこのリゲーション混合物を
1.5％のアガロースゲル上で泳動させ、これはおよそ200
塩基対であった（もし完全に二本鎖であるなら233bpで
あるがそうではなかった）。この「200bp」DNAバンドを
NA45紙（Ｓ＆Ｓ）によりゲル精製するか又は任意の複数
のプロトコールにより精製した。全量2.5μｇ（約1013
個のDNA分子を示す）又はそれより多くが所望される。
新規遺伝子の完全二本鎖合成がDNAポリメラーゼ、ク
レノウにより、標準方法によって成し遂げられる。この
二本鎖３′領域はセミランダム配列の「第２鎖」の合成
のためのプライマーを提供する。新しく合成されたDNA
を配列IIに連結させるためにT4 DNAリガーゼが利用さ
れ、これによってこの第２鎖におけるニックは補完され
る。このDNAライブラリーをフェノール／クロロホルム
抽出し、そしてエタノール沈殿させる。
完全に二本鎖となったDNA分子10μｇは４×1013の配
列多様性を有す。翻訳可能なmRNAを得るために、次にこ
のライブラリーをT7 RNAポリメラーゼによって転写す
る。しかしながら、DNAコピーを作らない限り、各転写
によってこのDNAライブラリーは消費される。このDNAラ
イブラリーを複製させるため、200−μｌ反応におけるP
CR増幅のために100ngのこのアリコートを500−μｌの試
験管それぞれに分配した。PCR Technology、頁８−19
（Erlich,前記、1989）に従い、200−μｌ PCR反応そ
れぞれは、各アリコートにおいて約5.2μｇのDNA、又は
約50倍のDNAの二本鎖を生成する。このアリコートをプ
ールした。プールしたサンプルは各セミランダム配列の
コピーを平均50個含み、従ってT7 RNAポリメラーゼに
よる各翻訳についての多様性の大いなる損失を伴わずに
繰り返し利用されうる（例えば、50回）。もしこのライ
ブラリーがPCRにより複製される場合、前記のクレノウ
補完及びリゲーション段階は不必要となり、なぜならTa
qポリメラーゼはギャップ及びニック−トランスレーシ
ョンDNAにおける補完が可能であるからである（D.H.Gel
fand,PCR Workshop,Society of Industrial Microbiolo
gy Meeting,Seattle,Wash.,1989）。ニックトランスレ
ーションの後、この遺伝子は二本鎖となり、そしてPCR
増幅させることが可能となる。
DNAライブラリーのPCR増幅のためのオリゴヌクレオチ
ドプライマーの例は、配列Ｉ及びVIにおいて前記した。
一般に、25−30塩基のオリゴヌクレオチドをPCR増幅の
ために用いる；しかしながら、より長いプライマーが利
用されうる。これらのプライマーは有意な同一性又は相
補性３′末端を分ち合わないことが重要である。配列Ｉ
及びVIは相補性であり末端を有し、そして広範囲にわた
る明らかに同一性の領域を有さない。
更に、これら新規遺伝子配列の翻訳後のmRNAはT7プロ
モーター配列を欠損する。配列VIは第１鎖cDNA合成のた
めのプライマーとして利用される。この方法において、
翻訳のその後のラウンドは選ばれた新規遺伝子配列にお
いて可能である。PCR増幅はもし得られるcDNAが比較的
微量である場合に必要となりうる。
実施例２ 新規遺伝子の転写 実施例１に詳細のDNAライブラリー（又はそれらの配
列の代表的な部分）をT7 RNAポリメラーゼにより転写
せしめた。このDNA 2.5μｇはほぼ1013種のポリペプチ
ドをコードする。このDNAはストラタジーンのmCAP（商
標）キットによって転写の際にキャップする（製造者の
仕様書に従って）。約５−10μｇのmRNAが期待される。
一般にT7 RNAポリメラーゼにより、このレベルのほぼ1
0倍のRNAが合成される；しかしながら、キャッピング反
応のための条件はこの場合においてmRNAの製造を制限す
る。このDNAを、このキットに付いているDNase Iにより
除去した。キャッピングせしめたRNAをフェノール／ク
ロロホルム抽出し、そしてエタノールにより沈殿させ
た。このRNAを10μｌのTEに再懸濁せしめ、そして０゜
−４℃で保存した。
実施例３ 新規遺伝子の翻訳 キャップせしめたmRNAをベーリンガーマンハイムバイ
オケミカル社のウサギ網状赤血球キットにより、20種全
てのアミノ酸をそれぞれ312.5μmol/lにて翻訳した。実
施例２からのキャッピング化mRNAを各反応液に、反応液
当り0.5μｇにて加え、そしてこの製造者のプロトコー
ルに従って処理せしめた。30℃にて約60分後、シクロヘ
キシミドを最終濃度１μg/mlにて加えた。MgCl2を5mMと
なるように調整し、そしてヘパリンを0.2mg/mlとなる迄
加えた。この反応液をプールし、そしてLynch（前記、1
987）に従い、不連続スクロース勾配にかけた。このポ
リソームを−70℃で凍結せしめるか、又は直ちに使用し
た。
実施例４ 対象の物質としての抗体の固定化 新規の結合性ペプチドについて選別するために抗体が
利用されうる。抗体の超可変／可変領域に結合するペプ
チド（「抗−イディオタイプペプチド」）は、イムノゲ
ンとして利用されるオリジナルエピトープのように働
く。この新規抗−イディオタイプペプチドはオリジナル
エピトープを擬態するため、これらのペプチドはワクチ
ンとして有用である、及び／又は生物学的活性を表現
し、あたかもこの抗−イディオタイプ抗体は生物学的
（時折触媒）活性を有するものと示される。
有用な抗体の例は抗−フィブロネクチン、抗−神経成
長因子、抗−CD4及び抗−腫瘍壊死因子であり、これら
は全てベーリンガーマンハイムバイオケミカル社より入
手できる。一般に、リセプター分子、成長因子、表層抗
原及び生物学活性ペプチド、並びに毒素及び疾病のため
の中和抗体が、抗−イディオタイプ結合性ペプチドであ
って、相乗もしくは拮抗特性を有すか又はワクチンとし
て働くものを単離せしめるためのよい候補である。
これらの抗体をミリポア（株）由来のイモビロン（商
標）PVDF（ポリビニリデンジフルオリド）膜に、Peuska
lら（BioTechniques ４:272−283,1986）に従って固定
した。例えば、抗−フィブロネクチン抗体（クローン3E
3由来；ベーリンガーマンハイムバイオケミカル社）
を、100％のメタノールで「湿潤化」させた0.5cm×0.5c
mのPVDF四辺形（square）上に吸収させ、そして10mMの
トリス緩衝液pH7.4中の0.9％（W/V）のNaCl（食塩水緩
衝液）により２回洗浄する。必要な抗体の量は所望する
抗−イディオタイプペプチドの結合パラメーターに依存
する；イモビロンPVDFはIgGを172μg/cm2結合せしめる
と報告されている。便宜上、食塩緩衝液中の抗−フィブ
ロネクチンIgG1 １μｇをPVDF四辺形上に、室温で少な
くとも２時間インキュベートすることによって吸収させ
た。次にこのPVDFを食塩緩衝液で２回洗浄した。次いで
この膜を、食塩緩衝液中に５％（W/V）のゼラチンを含
む「ブロッキング溶液」により、室温にて少なくとも２
時間インキュベートし、これによりゼラチンはPVDFの未
結合化部位に吸着される。次いでこの膜を食塩緩衝液中
の0.1％のゼラチンにより２回洗浄した。同様の処理を1
0μｇの抗−ケラチン抗体（クローンAE1由来、ベーリン
ガーマンハイムバイオケミカル社）によって行い、これ
は下記のコントロールIgG1である。
実施例５ 抗体に結合性のポリソーム 形成期セミランダムペプチドを有すポリソームを1ml
の反応液においてインキュベートした。それぞれにPS緩
衝液（0.9％のNaCl,10mMのトリスpH7.4,1％のゼラチ
ン、15mMのMgCl2,0.2mg/mlのヘパリン及び１μg/mlのシ
クロヘキシミド）並びに実施例４に記載の10μｇの抗−
ケラチンIgG1を有すPVDF四辺形を含んだ。この予備吸着
段階は緩かな撹拌を伴って０゜−４℃にて４時間にわた
り行い、ゼラチン及びIgG1と非特異的に結合するポリソ
ームを排除した。この抗−ケラチンPVDF四辺形を宝石用
ピンセットで取り出し、そして抗−フィブロネクチンPV
DF四辺形と交換した。この混合物を、同一条件のもとで
更に４時間インキュベートし、特異的なポリソームを抗
−フィブロネクチン抗体の可変／超可変領域に結合させ
た。この抗−フィブロネクチンPVDF四辺形を取り出し、
そしてそれらを新鮮なPS緩衝液に系列的に３回移し換え
ることにより洗浄した。
実施例６ ポリソーム由来の抗−イディオタイプペプチドをコード
する新規遺伝子の回収 洗浄せしめた抗体−結合ポリソームを保有するPVDF膜
を、0.1mMのEDTA 100μｌを含む試験管に移し、そして
室温で５−10分間ゆっくり振騰させてポリソームを解離
及びmRNAを遊離させた。このPVDFを取り出し、0.1mMのE
DTAの新鮮な試験管に移し、そして０゜−４℃で一夜又
はそれ以上長く（予備品として）保存した。この第１の
EDTA処理から遊離したmRNAを逆転転写せしめた；そして
得られるcDNAを若干の改良を伴ってPCR Technology（前
記、1989）、頁91に従って増幅せしめた。cDNAをプライ
ムするためにランダムヘキサマーを用いる代りに、既知
の３′領域に相補する配列（例えば下流プライマーとし
ての、先に挙げた配列VI）をcDNA合成及びPCR反応の両
方のために用いた。この逆転写酵素段階は、適当なその
他の試薬の相対量を有すPCR緩衝液100μｌ（20μｌ反応
の代りに）中に行った。逆転写酵素反応後、この混合物
を20μｌのアリコートに分けた。そして各アリコート
を、PCR Technologyに詳細の通りに、配列Ｉ又は類似の
DNA上流プライマーを用いて増幅させた。PCR増幅後、５
つのアリコートをプールし、フェノール／クロロホルム
抽出し、そしてエタノール沈殿させた。このcDNAを次に
TEに再懸濁させ、そして０゜−４℃で保存した。
選別したDNAをT7 RNAポリメラーゼにより転写し、そ
して前記した網状赤血球系において翻訳させた。この場
合において、所望する配列はオリジナルのDNAライブラ
リーと比較して大いに増幅される。プログラムされたワ
ークステーションにより大いに補助されながらこのサイ
クルを繰り返すことにより、所望する新規遺伝子は常用
のクローニング及び発現方法が実施できるレベル迄濃縮
される。更に、遺伝子の低ボアゾン分布への希釈によ
り、単独の新規遺伝子が単離、増幅、転写及びこの遺伝
子生成物の特異的な結合能力を示すよう翻訳されうる。
結合性が示されたなら、この単離遺伝子及びポリペプチ
ドを同定のためにシーケンス化する。
この新規なる結合ペプチドの配列がわかった後、本明
細書に記載の通り、このペプチドの操作及び大量合成の
ために多数の方法が存在する。
実施例７ 結合性ペプチドに関する競合アッセイ 結合性ペプチドをコードする新規遺伝子を選別後、増
幅せしめた回収cDNAのプールを遺伝子の存在についてア
ッセイした。ID配列をセミランダムDNA配列と一緒に発
現させるために意識的に含ませている場合、ペプチドの
既知の部分に対するELISA又はその他の免疫学的アッセ
イをペプチドの新規部分の対象の物質への結合性の検出
のために用いる。しかしながら、ID配列がない場合及び
／又は結合特異性の確認が所望される場合、ペプチドに
対する競合アッセイが行なわれる。競合ELISA試験を含
む競合アッセイは、本発明により作られた種々のcDNAプ
ールにおける結合性配列の存在についてモニターするた
めに用いる。
１例は、抗−シュードモナス（Pseudomonas）外毒素
（抗−PE）抗体に結合するペプチドをコード化する遺伝
子に関するcDNAプールのスクリーニングである。抗−PE
抗体に結合性のポリソームについての２ラウンドの選別
後、得られるcDNAプールの異なるアリコートを標準的な
条件のもとで、約200ngのDNAから出発して、T7 RNAポ
リメラーゼ（30ユニット）を有す200−μｌ反応におい
てそれぞれ転写せしめた。このmRNA生成物をフェノール
／クロロホルム／イソアミルアルコール抽出し、そして
酢酸ナトリウム及びエタノールにより−20℃で沈殿させ
た。この沈殿物をそれぞれ遠心し、そして16μｌの蒸留
水に再懸濁させ、ヌクレアーゼを除去するためにジエチ
ルプロカーボネートにより処理せしめた。
再懸濁せしめたmRNAを65℃で５分間加熱し、その後氷
の上に置いた。このmRNAを小麦胚芽キット（ベーリンガ
ーマンハイムバイオケミカル社）により、製造者の推奨
に従って翻訳した。各RNAサンプルを、25マイクロキュ
ーリーの35S−メチオニン及び0.5μｌのRNaseインヒビ
ターを有す50μｌの翻訳反応液中において発現させる。
この反応を30℃で15−60分間行った。この翻訳の終了時
にこのサンプルをそれぞれ等分した。その半分は競合基
質を含ませずに対象の物質と結合させ、他の半分は過剰
量の競合基質の存在下において対象の物質と結合させる
ために用いた。この場合において、この対象の物質は抗
−PE抗体である。この競合基質は、毒性タンパク質配列
に由来し、抗体に競合することで知られる14個のアミノ
酸のペプチド（PEペプチドである）。このペプチド配列
は、Val−Gal−Arg−Leu−Leu−Gln−Ala−His−Arg−G
ln−Len−Glu−Glu−Argである。Wozniakら、Proc.Nta
l.Acad.Sci.,85:8880−8884（1988）。
競合アッセイは96−穴平底マイクロタイターディッシ
ュ中において氷上に行った。標準1/4インチホールパン
チによりイモビロンPVDFディスクを作り、そして“A"と
表示したウェルに入れた。50μｌのメタノールを“A"に
おけるディスクに加え、この膜を湿らし且つ殺菌した。
このディスクをピンセットにより、10mMのMgCl2を含ん
だ200μｌの食塩緩衝液（TSM緩衝液）を含むウェル“B"
に移した。このディスクをウェル“C"であってこれも20
0μｌのTSMを含むウェルに移すことによって更に洗浄し
た。次にこれらを、３μｌの抗−PE抗体（4.6μg/μ
ｌ）を含んだTSM 25μｌを含むウェル“D"に移した。
抗体をゆっくり振騰させながら（プラットホームシェー
カー上で50−100RPM）氷上で３時間にわたりディスクに
吸着せしめた。その後、２％の無ヌクレアーゼBSA 75
μｌを“D"に加え、そして１時間100RPMにて吸着させ
た。
このディスクを0.1％のBSAを含んだTSM 200μｌ中で
（ウィルス“E"と“F"）、各ウェルにおいて30分間にわ
たり２回洗浄し、そしてペプチド結合のための準備がで
きた。ウェル“G"において、26μｌのTSMと0.1％のBSA
を、前述した25μｌの各翻訳反応液（小麦胚芽系50μｌ
と半分）と混ぜた。半数の各“G"ウェルに１μｌのPEペ
プチド（TSM中で1mg/ml）を加え、新規の放射性活性標
識化ペプチドの抗体への結合を競争的に阻害せしめた；
これらのウェルを「＋ペプチド」と表示した。コントロ
ールの“G"ウェルに１μｌのTSMを加え、そしてこれら
のウェルを「無ペプチド」と表示した。ディスクを適当
な“G"ウェルに入れ、そしてペプチドをこの固定化抗体
に結合させるために氷上に100RPMにて３時間インキュベ
ートせしめた。
結合反応の後、各ディスクを200μｌの新鮮TSM中で段
階的に８回、０℃にて洗浄した。各洗浄は10分間のイン
キュベーションによった。各ディスクの結合放射性活性
はエコシント（Ecoscint）の1mlのカクテルを有す液体
シンチレーションカウンターで測定した。以下の表は、
ポリソームの抗−PE抗体への結合に由来する、cDNAの種
々のアリコートにおける競合アッセイの結果を示す。 サンプル CPM 35S−MET WE1＋ペプチド 6969 WE1、無ペプチド 8337 WE2＋ペプチド 6163 WE2、無ペプチド 7693 WP1＋ペプチド 5792 WP1、無ペプチド 6303 WP2＋ペプチド 5845 WP2無ペプチド 6368 各場合において、競合するPEペプチドは無ペプチドコ
ントロールに比べて、選別したcDNAプールの放射性活性
標識化翻訳生成物の結合量を低めた。この結果は、抗−
PE抗体に結合性のペプチドをコードする遺伝子配列の存
在を示唆する。これらDNAの単離及び特徴付けは、個々
の遺伝子をプラスミド、例えばpUC18,pUC19、ブルース
クリプト及びその他の有用なベクターにクローニングす
ることによって行なわれる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭62−281（ＪＰ，Ａ) 特表 昭62−502235（ＪＰ，Ａ) 米国特許4710464（ＵＳ，Ａ) Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏ ｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．152（1987）ｐｐ. 248−252 Ｃａｎ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌ ｌ Ｂｉｏｌ．，Ｖｏｌ．61（1983）ｐ ｐ．274−286 Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅ ｓ．，Ｖｏｌ．12（18）（1984）ｐｐ. 7057−7070 Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏ ｌ．６（1988）ｐｐ．1197−1202

Claims (19)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】対象のポリペプチドをコードするヌクレオ
    チド配列を単離するための方法であって、 mRNAライブラリーを提供するために、RNAポリメラーゼ
    結合性配列、リボソーム結合性配列及び翻訳開始シグナ
    ルを含む５′非翻訳領域と、１又は複数のセミランダム
    ヌクレオチド配列とを含んで成るインビトロ発現ユニッ
    トを転写又は複製せしめ； ポリペプチド鎖がポリソームに結合していることを維持
    する条件のもとで該mRNAライブラリーを翻訳せしめ； 該ポリソームを対象のポリペプチドと特異的に反応する
    ことのできる対象の物質に接触せしめ、そして該対象の
    物質に特異的に反応するポリソームからmRNAを単離する
    こと、 を含んで成る方法。
  2. 【請求項２】前記ポリソームから単離したmRNAよりcDNA
    を構築することを更に含んで成る、請求項１記載の方
    法。
  3. 【請求項３】前記cDNAを増幅することを更に含んで成
    る、請求項２記載の方法。
  4. 【請求項４】ポリペプチドを生成するために、前記の増
    幅したDNAを発現せしめることを更に含んで成る、請求
    項２記載の方法。
  5. 【請求項５】前記セミランダムヌクレオチド配列が、デ
    オキシリボ核酸又はリボ核酸を含んで成る、請求項１記
    載の方法。
  6. 【請求項６】前記発現ユニットが少なくとも一のRNA依
    存性RNAポリメラーゼ認識配列を含む、請求項１記載の
    方法。
  7. 【請求項７】前記ポリソームから単離したmRNAをRNA依
    存性RNAポリメラーゼで増幅せしめることを更に含んで
    成る、請求項１記載の方法。
  8. 【請求項８】前記の対象の物質に結合しないポリソーム
    を、系列的希釈又はフロースルー洗浄工程によって除去
    する、請求項１記載の方法。
  9. 【請求項９】前記の結合しないポリソームの除去の工程
    の後に、該ポリソームが前記の対象の物質から遊離する
    ように選ばれた緊縮条件に該ポリソームを暴露せしめる
    請求項８記載の方法。
  10. 【請求項１０】請求項１記載の方法において単離したヌ
    クレオチド配列を発現させることにより新規ポリペプチ
    ドを生産するための方法であって、請求項１記載の接触
    工程の後に、 前記対象の物質に結合した前記ポリソームを単離し； 前記単離したポリソームを破壊してmRNAを遊離し； 前記mRNAを回収し； 前記回収したmRNAからcDNAを構築し；そして 新規ポリペプチドを生産するために前記cDNAを発現せし
    めること、 を含んで成る方法。
  11. 【請求項１１】前記発現ユニットが、開始コドンに位置
    する選ばれたアミノ末端同定用ペプチドをコードする配
    列又は選ばれたカルボキシ末端同定用ペプチドをコード
    する配列を更に含んで成る、請求項１又は10記載の方
    法。
  12. 【請求項１２】前記発現ユニットが、制限部位、パリン
    ドローム配列、同定用ペプチドをコードする配列、特異
    的プライマー依存性DNA合成のための配列、ポリA+また
    はその他ホモポリマーポリヌクレオチド配列から選ばれ
    た選定の配列の３′領域を更に含んで成る、請求項１又
    は10記載の方法。
  13. 【請求項１３】前記発現ユニットが、インビボでの新規
    遺伝子の発現を可能とするために利用される制限部位を
    更に含んで成る、請求項１又は10記載の方法。
  14. 【請求項１４】前記発現ユニットがT7,T3又はSP6ポリメ
    ラーゼのためのプロモーター配列を含む請求項１又は10
    記載の方法。
  15. 【請求項１５】前記のセミランダムヌクレオチド配列が
    天然DNAもしくはcDNAを、機械的、化学的又は酵素的に
    フラグメント化せしめることにより作られる請求項１又
    は10記載の方法。
  16. 【請求項１６】前記のヌクレオチドを化学的に合成する
    段階が、（１）実質的に等モル量のC,A及びＧ、並びに
    該実質的に等モル量の半分量のみのＴを第１コドン位置
    において利用し；（２）実質的に等モル量のC,T及び
    Ｇ、並びに該実質的に等モル量の半分量のみのＡを第２
    コドン位置において利用し；そして（３）実質的に等モ
    ル量のＣ及びＧ又はＴ及びＧを第３コドン位置において
    利用することを含んで成る請求項15記載の方法。
  17. 【請求項１７】前記の翻訳の段階が、ナンセンス抑制tR
    NAの存在下において行なわれる請求項１又は10記載の方
    法。
  18. 【請求項１８】前記の対象の物質が、表層抗原、リセプ
    タータンパク質、毒素、有機ポリマー、代謝物、タンパ
    ク質分子の活性部位、ホルモン、抗体、抗体の可変及び
    ／又は超可変領域、並びに汚染物質から成る群から選ば
    れる請求項１又は10記載の方法。
  19. 【請求項１９】前記cDNAを発現せしめる段階が、ヌクレ
    オチド配列のインビトロ転写及び／もしくは翻訳、又は
    遺伝子操作された微生物の中で合成するために発現ベク
    ターの中にこのヌクレオチド配列をクローニングせしめ
    ることを含んで成る、請求項４又は10記載の方法。
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