JP2001503131A

JP2001503131A - 医薬ライブラリーをスクリーニングするための組成物および方法

Info

Publication number: JP2001503131A
Application number: JP09535624A
Authority: JP
Inventors: スピネラ，ドミニク・グレゴリー; ベチャラー，カサリーン・アン; ブラウン，ステイーブン・ジョエル
Original assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1996-04-03
Filing date: 1997-04-02
Publication date: 2001-03-06
Also published as: CA2250870A1; US5866341A; EP0801307A2; EP0801307A3; WO1997037220A1; AU717289B2; AU2661997A

Abstract

(57)【要約】特定分子の結合パートナーをスクリーニングする方法。該方法は、少なくとも２つの異なる結合領域をもつキメラタンパク質を使用し、１つは特定分子またはその類似体の少なくとも一部含み、他方は免疫グロブリン鎖の結合領域を含む。好ましい態様では、この方法を用いて潜在的生物活性を求めてコンビナトリアルライブラリーメンバーを迅速にスクリーニングする。

Description

【発明の詳細な説明】医薬ライブラリーをスクリーニングするための組成物および方法発明の分野本発明は、化学、分子生物学および生化学の分野に関する。本発明は、ランダム合成分子または非ランダム合成分子の大きな集合から、標的分子の特定ドメインに結合できる分子の候補を同定する方法に関する。従って、本発明は、基礎生化学および生物医学研究ならびに医薬開発を含む諸分野で有用性をもつ。発明の背景医薬の発見と設計における最近の重要な発展は、可能性のある新規医薬の化学ライブラリーを作成するためのコンビナトリアルケミストリの開発であった。化学ライブラリーとは、意図的に作成した異なる分子からなる集合体であり、これらの分子は有機合成法または生化学的に製造できる。後者の場合、分子はin vit roまたはin vivoで製造できる。コンビナトリアルケミストリとは、ライブラリーの化学メンバーを化学サブユニットの組立による系統的方法によって製造する合成戦略である。ライブラリー中の各分子は従ってこれらのサブユニットの１以上から作られている。化学サブユニットには天然または修飾アミノ酸、天然または修飾ヌクレオチド、天然または修飾糖、あるいは有機または無機のその他の分子を含む。典型的には、各サブユニットは少なくとも２つの反応基をもち、はじめに各サブユニットの１つの反応基を反応させ、次に別の反応基を反応させて大きな分子を合成できるようにして、段階的により複雑で多様な分子を順次合成できる。一定数の個々の構成ブロック、例えば20個の天然アミノ酸を合成の各工程で等しく利用できるような合成条件を作ることによって、ほんの数工程の合成反応後であっても非常に大きな化合物の並列またはライブラリーを組み立てることができる。例えばアミノ酸を例にとると、第１の合成工程で得られる化合物の数（Ｎ）は利用できる構成ブロックの数と等しく、これをｂで表す。天然アミノ酸の場合、ｂ＝２０である。合成の第２工程では、各アミノ酸がそれぞれ別のアミノ酸とジペプチドを作る等しい機会をもつと仮定すると、可能性のある化合物の数はＮ＝ｂ²＝２０²＝４００である。これに続く合成工程について、前の工程で得られる化合物に対して構成ブロックが再びランダムで等しい効率で組み立てられると仮定すると、Ｎ＝ｂ^x（ここで、ｘは合成組立工程の数である）となる。従って、デカペプチドの場合であってもランダム組立で得られる化合物数は２０¹⁰または１．０２ｘ１０¹³である。このような極めて多数の異なる化合物によって、所望の酵素的、免疫学的または生物活性をもつ多数の種々の候補化合物を組み立てたりスクリーニングすることができる。生物学的に合成されたコンビナトリアルライブラリーが，細菌またはバクテリオファージ粒子で分子生物学的方法を用いて構築されてきた。例えば、Schatzに与えられた米国特許第5,270,170号および5,338,665号はプラスミドのクローニング部位に挿入されたランダムオリゴヌクレオチドを用いて作成した融合タンパク質をコードする組換えプラスミドの構築を記載する。このクローニング部位は、ＤＮＡ結合タンパク質の特異的結合機能が遺伝子の発現によって破壊されないように、ＤＮＡ結合タンパク質をコードする遺伝子のコーディング領域内に、例えばlacリプレッサーとして配置されている。このプラスミドにはＤＮＡ結合タンパク質によって結合部位として認識されるヌクレオチド配列も含む。従って、適当な細菌細胞を形質転換して融合タンパク質が発現すると、このタンパク質はこれが産生するプラスミドと結合する。ついで細菌細胞は溶解し、融合タンパク質が一定の生物活性を有するかアッセイする。さらに、各融合タンパク質はこれをコードする核酸と関連するので、さらに性状決定するために選択されたタンパク質：核酸複合体の核酸部分の核酸増幅と配列決定を行うことにより、候補化合物の正確な構造が決定できる。上記Schatzの特許を参照としてここに援用する。その他の生物学的系、例えばGoedellらの米国特許第5,223,408では、核酸ベクターを用い、ランダムオリゴヌクレオチドを内在性タンパク質の膜貫通部分をコードする遺伝子の部分と融合する。融合タンパク質が発現すると、これがタンパク質のランダムポリペプチド部分を外側に向けて細胞外膜に埋め込まれる。従って、この種のコンビナトリアルライブラリーでは、試験化合物が固体支持体、すなわち細胞自体に結合する。このようにして発現した多数の異なるランダムポリペプチドの集合をディスプレイライブラリーと呼ぶ。なぜなら、タンパク質を産生する細胞がその表面に薬剤を”ディスプレイ”するからである。細胞は、融合タンパク質のランダム部分をコードする組換えベクターも含んでいるので、予備スクリーニングで可能性がある、と思われたランダムポリペプチドをもつ細胞は溶解し、そのベクターを抽出して核酸配列を決定し、融合タンパク質のランダム部分のアミノ酸配列を導き出し、さらに研究することができる。上記Goedell の特許と参照としてここに援用する。同様にして、１以上のファージコートタンパク質をコードする遺伝子の一部内にあるランダムオリゴヌクレオチドのクローニングによってバクテリオファージディスプレイライブラリーを構築できる。ファージ粒子を組み立てると、ランダムポリペプチドはこの場合もスクリーニングできるように外側に向く。前記の系と同様に、ファージ粒子は融合タンパク質をコードする核酸を含むので、医薬候補を同定するヌクレオチド配列情報が医薬自体と関連している。このようなファージ発現ライブラリーは例えば、Swayer et al.，A Protein Engineering947-53 (1991)；Akamatsu et al.，151 J．Immunol．4651-59(1993)およびDower et al. ，米国特許第5,427,908号に記載されている。これらの特許および文献を参照として援用する。試験化合物を、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）またはその他の増幅法によって増幅できる核酸と結合できる点を含めて、生細胞中でのコンビナトリアルライブラリーの合成には大きな利点があるが、このような系を用いる不利な点も明らかにある。コンビナトリアルライブラリーの多様性が構築に用いる構成ブロックの数や性質によって限定されてしまうことであり、従って、新規なペプチドおよびオリゴヌクレオチドの合成に修飾アミノ酸またはＲ−アミノ酸または典型的でないヌクレオチドが正細胞（またはバクテリオファージやウイルス粒子）で使用できない。このような系では、宿主細胞またはバクテリオファージの感染性または組立プロセスに致死的または有害な化合物は存在しないであろうし、またライブラリー中でネガティブに選択されるであろうから、選択方法も限定される。重要なことは、このような系ではペプチドまたはオリゴヌクレオチド化合物のみが製造されることであり、従ってライブラリーの多様性は天然のモノマー単位からなるペプチドおよびポリヌクレオチド巨大分子に限定されてしまうことである。多様な分子のコンビナトリアルライブラリーを作るための別のアプローチでは、試験化合物の組立に典型的でない、または非生物学的構成ブロックを用いる化学合成法を使用する。かくして、Zuckermann et al.，37 J．Med．Chem．2678-8 5(1994)は、種々のＮ−（置換）グリシンを用いて、”ペプチオード（peptiodes ）”と呼ぶペプチド様化合物の合成のためのライブラリー構築を記述する。置換は、一連の芳香族置換、一連の水酸化された側鎖置換、および分枝、アミノ、複素環構造を含む種々の置換を提供するように選ばれた。この文献を参照として援用する。その他の研究者は、医学または生物学的興味のあるライブラリーまたは化合物集合を組み立てるのに、アミノ酸に代えて、あるいはこれに加えて、小さい二官能性または多官能性有機化合物を使用した。有用な可能性のある化合物の大きな多様なライブラリーを作るために化学合成法を用いると、ある種の固体支持体と結合した化合物が合成できる。しかしながら、このような合成法を用いると、スクリーニングプロセスを通過したライブラリーの優れた（rare）メンバーの構造を合成後に同定する能力を必要とする。従って、このようなライブラリーではかかる同定ができるように合理的に設計されていなければならない。可能性のある化合物の数はどんどん多くなるのでこのような仕事は実際には極めて大変である。この後者の点を考慮に入れて、スクリーニングプロセスがさらに研究すべき候補として示した特定化合物を”指示する（addressing）”スクリーニング後の方法を工夫する試みが多数行われてきた。このような指示可能なライブラリーの１つでは、ライブラリーの個々のペプチドをこれをコードする核酸に結合する戦略を用いる。このような系の例示として、ライブラリーの化合物またはメンバー化合物と融合したプラスミド結合タンパク質をディスプレイするバクテリオファージなどの生物体の使用を上述した。しかしながら、この方法は生物系に限定されず、試験化合物と対応のヌクレオチド配列を単一の固体支持体上に共重合させることによって用いることができる。別の戦略では、各ライブラリーメンバーの配置がその化合物の合成構造に関する情報を与えるように、秩序立った、予め定められた様式で固体支持体上にコンビナトリアルライブラリーを化学合成することを含む。このような方法の例は、例えばGeysenの米国特許第4,833,092号に記載されており、ここではピンの位置が研究者に化合物の構造についての情報を与えるように、９６ウエルのミクロタイターディッシュに適合するように設計された官能化されたポリエチレンピン上で化合物を合成する。同様に、HudsonらのＰＣＴ出願公開ＷＯ94/05394では、官能化されたポリマーフィルムで被覆された空間的に指示可能な（specially addr essable）固相プレート上で、ポリペプチド、オリゴヌクレオチド、オリゴ糖などの生物ポリマーのコンビナトリアルライブラリーを構築する方法を記載する。この系では、化合物はプレート上で直接合成されスクリーニングされる。プレート上でのある特定の化合物の位置がわかると、その化合物を構成する構成ブロックの性質と順序に関する情報が得られる。同様の指示可能なコンビナトリアルライブラリーの構築法を生物ポリマー以外の化合物の合成にも使用できる。別のアプローチでは、非常に小さい誘導体化ビーズを多数使用し、これを異なる構成ブロックの数と同数の等しい部分に分ける。合成の第１工程では、これらの部分のそれぞれを異なる構成ブロックと反応する。次にビーズをよく混合し、再度同じ数に等分する。合成の第２工程では、ビーズと結合した等量の各構成ブロックを理論的に含む各部分を異なる構成ブロックと反応させる。ビーズを再度混合して分け、このプロセスを所望の回数繰り返して、多数の異なる化合物を作り、各ビーズが１つの型の化合物だけを含むようにする。 ”１ビーズ１化合物”法と呼ばれるこの方法は、各ビーズが異なる化合物を潜在的にもつビーズ混合物が得られる。従って、この方法では、ビーズ自体が、上述した固相支持体およびアレイや、あるいは細胞ライブラリーまたはファージライブラリーと同じ意味で”指示可能”であるとは考えられない。しかし、各ビーズの表面にディスプレイされた化合物の特定化合物との結合能を試験することはでき、そしてもしも（典型的には）少数のビーズが同定でき他のビーズから分離できるならば、推定の純粋化合物集団を回収し分析することができる。もちろん、後者の可能性は、意味のある次の分析に感受性である各ビーズの表面に化合物に関する情報を十分にのせて、これを引き出せる能力に依存する。このような情報は単に、その構造を決定できる十分な量の興味のある化合物の形でありうる。例えば、ペプチドの場合、ペプチドの配列決定を行い、ペプチドのアミノ酸配列を得られるのに十分なペプチドが合成されなければならない。前記の１ビーズ１化合物法に限らず、興味のある化合物が天然ペプチドやオリゴヌクレオチドではない合成化学ライブラリーにとって、分析は時間のかかる困難な仕事である。このような場合、簡単に合成でき分析済みの”タグ”分子（例えば、アミノ酸やハロゲン化芳香族などのその他の小さい多官能性分子）から作られる暗号を、ライブラリーを構成する化合物といっしょに同時合成できる。スクリーニングを行った後、タグを”脱暗号化”して興味のある化合物の構造を導き出すことができる。暗号は比較的任意のものであり、構成ブロック（構成ブロックのメンバーは例えばアミノ酸、またはジペプチド、トリペプチドなどと対応するように命名することができる）から作られたあらゆる試験化合物をこの方法で同定できる。上述したように、コンビナトリアルライブラリーの構築は、基礎および応用の構造と機能に関する疑問に答えるための膨大な数の潜在的化学候補を構築する機会を研究者に与える。このような疑問には、リガンドとその受容体の関係、ある抗体とその抗原の関係、および酵素と基質の関係を含むが、これに限定されない。しかし、潜在的な医薬化合物の大きなライブラリーを作る能力があっても、利用できるスクリーニング方法の点で困難に直面する。従って、この最近の強力な技術の問題点は、ライブラリー中にある何千、何百万、何十億というその他の化合物から、さらに研究すべき有力な候補である少数の化合物を同定する、一定時間に処理能力の高い適切なスクリーニング方法にある。治療剤または診断剤の存在を求めてコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングするときには、一般に候補化合物を、まず特定メンバーの生物学的結合パートナーと結合する能力についてスクリーニングする。”結合パートナー”とは、適切な生物学的またはin vitro条件下で結合して特定の複合体を形成できる２以上の化合物を意味する。このような結合パートナーの例としては、抗体と抗原、リガンドと受容体、および酵素と基質が挙げられるが、これに限定されない。ときには、リガンドか受容体の一方、または両方が１以上の化合物またはポリペプチド鎖の複合体に含まれる。例えば、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）の場合、可溶性リガンドＴＮＦがその受容体とＴＮＦホモ三量体の形で結合し；各ＴＮＦ三量体は受容体３コピーと結合でき、ＴＮＦ受容体のクラスター形成が生物学的効果を奏するために必要であると考えられている。クラスターした受容体とＴＮＦ三量体との結合に関与するポリペプチド鎖の各々および全ては別々の結合パートナーであると考えられている。現在用いられている普通のスクリーニング法の１つは、ミクロタイターディッシュのウエルのような固体支持体を、結合パートナーが結合すべき特定分子で被覆することからなる。次にライブラリーメンバーの化合物を標識し、固体支持体上にのせ、ライブラリーメンバーを結合させる。洗浄工程の後、結合パートナー複合体を、結合したライブラリーメンバーに結合させた標識を検出することによって検出する。メンバー化合物が溶液または媒質中にあるときには、この種の方法はコンビナトリアルライブラリーに特に適している。この方法はやや労働集約的であり、多数の試験化合物を一定時間に高い処理能力でスクリーニングするためには、第１工程で試験化合物のプールをスクリーニングし、次に興味のある化合物を特定して同定するための１以上の再スクリーニングを要する。逆の場合も可能であり、ライブラリーメンバーを個々のウエルに被覆して、特定分子でプローブする。コンビナトリアルライブラリーが抗体類似体または特定エピトープを標的とするペプチドを含む場合、例えば酵素結合免疫アッセイ（ＥＬＩＳＡ）では、ライブラリーメンバーには、検出可能な第２抗体によって、あるいは例えば放射性核、化学発光化合物、蛍光体、および酵素または染料で直接、間接に標識することによって認識される抗体部分を含む。 Tawflk et al.，90 Proc．Natl．Acad．Sci．373-77(1993)は抗体ライブラリー（この場合、酵素反応の遷移状態中間体を模倣して作ったハイブリドーマライブラリーから得られたもの）から、所望の触媒活性をもつ優れた抗体の存在をスクリーニングする方法を記載する。スクリーニング化合物（この場合酵素基質）を９６ウエルのミクロタイターディッシュに固定化した。各クローンからの上清をそれぞれのウエルに酵素反応を促進する条件下に入れた。ミクロタイターディッシュに固定化されたままの酵素反応の生成物を、生成物特異的モノクーナル抗体を用いてアッセイした。ここでも、このタイプのスクリーニング法は極めて労働集約的であり、大きなライブラリーを一定時間に効率よく処理するには試験化合物のプールを繰り返しスクリーニングする必要がある。上述した細胞またはファージディスプレイライブラリーや”１ビーズ１化合物 ”合成ライブラリーでは、ライブラリーメンバーは、フルオレセインまたはフィコエリスリンなどの検出可能な蛍光体で標識した特異的結合パートナー（例えば受容体）との結合能についてスクリーニングできる。各粒子（例えば、細胞またはビーズ）はただ１種類の試験化合物をディスプレイするので、蛍光標識された粒子を検出して蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）を用いてソーティングできる。必要ならば陽性のビーズまたは粒子に富む集団を次に再スクリーニングして個々に分析する。この戦略は、試験化合物をディスプレイする細胞またはその上で試験化合物を合成したビーズを用いて実施できる。しかしながら、この方法も実施が容易でなく、労働集約的である。スクリーニングが上述したパニング法であれ、固相に結合した試験化合物への標識結合であれ、共通のスクリーニング法は検出可能な対照リガンド（試験化合物が結合すると思われる特定の結合パートナーのための天然リガンドであることが多い）の存在下で試験化合物の競合結合を行うことによる。この方法もかなり労働集約的であり、標準曲線の作成と、意味のあるデータを得るには標準曲線で競合実験から得たデータを補正することが必要である。従って、競合アッセイは何千、何百万という異なるライブラリーメンバーを初期スクリーニングするときに、容易に解釈できたり迅速な結果を得ることができない。ライブラリーメンバーが抗体の誘導体であって既知の抗原に対する可変領域を含む場合にはＥＬＩＳＡおよびこれと類似のアッセイが有用である。しかし、特定結合パートナーと所望の試験化合物のいずれもが抗体でないとき、またはこれに対する第２抗体を容易に作れる利用可能なエピトープを含まないときにはこの方法を非競合的（すなわち直接的）に使用できない。ペプチドリガンドの一部および抗体の特異的ドメインを含むキメラペプチドからなる生化学手段が作られている。このような手段は患者の体内に医薬を送達するための治療補助として主に開発されてきた。特にサイトカインや他の薬剤の可溶性アゴニストのようなペプチド医薬の場合、治療剤または医薬は短い全身での半減期をもつものが多く、このためこのような医薬のin vivoでの安定性が減少する。安定性が減少するために、投与量を多くしたり頻度を多くする場合があるが、このため医薬耐性、毒性効果、および医薬コストの高騰などの望ましくない結果を患者にもたらすことになる。これらの欠点、特に全身性の生化学アゴニストを使用するときの欠点を克服する１つの戦略は、循環系でより長い半減期をもつ融合ペプチドを使用することであった。融合ペプチドは一般に免疫グロブリン鎖の一部と融合したサイトカイン受容体のような結合パートナーを含む。免疫グロブリン鎖は分子カモフラージュとして作用し、結合パートナーが生物体によって”外来”抗原として認識される機会を減少する。そこで、Shin，et al.，92Proc．Natl．Acad．Sci．2820-24(1995)では、可変部と定常部をコードするキメラマウス−ヒトＩｇＧ３遺伝子の３’末端とインフレームで融合したヒトトランスフェリンをコードする遺伝子をもつ組換えベクターを構築することによって作製した融合ペプチドを用いる。得られる融合分子は抗原（ダンシル）および精製トランスフェリン受容体と結合することができ、循環系からの輸送のためのトランスフェリン受容体を用いてラットの脳柔組織に入ることができた。抗体の残りの可変部は別の任意の特異性を含むことができるので、この部位は治療目的などのために、脳−血管関門を通過後の、分子の第２標的に利用できる。 Evansおよび共同研究者による180 J．Exp．Med．2173-79(1994)は、分子クローニング法を用いる、ヒトＩｇＧの定常部と融合させた組織壊死因子α（ＴＮＦ α−Ｒ）に特異的なｐ７５高親和性受容体、あるいはｐ５５低親和性受容体の細胞外部分を含む融合タンパク質の構築を報告した。可溶性で非融合型のＴＮＦ受容体はin vivoで迅速に分解されることが知られている。それぞれのＴＮＦ受容体と融合した免疫グロブリンＨ鎖の部分を発現するベクターで細胞を形質転換した。融合ペプチドは血清中で可溶性受容体よりも安定であった。さらに、融合ペプチドはジスルフィド結合で結合された２本のＨ鎖を含む二量体として分泌された。この二量体はＴＮＦの三量体（ＴＮＦαの天然のコンホメーション）と２つの別個の領域で、従って融合ペプチドが可溶性単量体形であるときに起こり得るよりも高い親和性で結合できる。リガンドまたは受容体および抗体部分を含むその他の融合タンパク質を用いて、体液性薬剤に対する有効な治療アゴニストを探してきた。Fountoulakis et al .，270 J．Biol．Chem．3958-64(1995)では、ヒトインターフェロンγ受容体の細胞外ドメインを、ＩｇＧヒンジ部のＣ_H２およびＣ_H３ドメインとの融合タンパク質として発現させ、これがインターフェロンと結合し、組織培養細胞の細胞表面受容体とインターフェロン結合を競合し、そしてインターフェロン媒介性の抗ウイルス活性を阻害することを示した。融合タンパク質の免疫グロブリン部分があるために、タンパク質はジスルフィド結合したホモ二量体としてチャイニーズハムスター卵巣細胞で発現された。この二量体は可溶性受容体単量体よりも強くインターフェロンと結合した。 Pittl et al.，31 Molec．Immunol．1345-51(1994)では、ヒトインターロキン −１（ＩＬ−１）受容体をトランスフェクトしたヒト細胞中でＩｇＧのＨ鎖のヒンジ部とＦｃ領域を含む融合タンパク質として発現させた。この融合ペプチドは、マウスの循環系で長い薬理学的半減期をもち、ＩＬ−１と結合することが報告されている。 Crowe et al.，168 J．Immunol．Meth．79-89（1994）では、ヒトＩｇＧＨ鎖の定常部をコードする遺伝子セグメントと融合したヒトリンホトキシンα受容体の細胞外ドメインをコードする配列を含む遺伝子を発現させた。融合タンパク質をバキュロウイルスベクター中にクローニングし、昆虫細胞とアフリカミドリザル腎臓細胞の両方で二量体として発現させた。融合ペプチドのＩｇＧ部分を融合ペプチドのアフィニティ精製のリガンドとして用い、また融合ペプチドのジスルフィドにより促進される二量体化を可能にしてリンホトキシン用の高アフィニティリガンドを得た。これらの最後の５つの文献を参照として援用する。発明の概要本発明は、コンビナトリアル化学ライブラリー中に含まれていることが好ましいが、必ずしもそうでなくともよい生物活性な候補化合物をスクリーニングする方法に関し、該方法では、多機能性キメラタンパク質を構築し、これを生物活性または結合強度のスクリーニングプロセスにおいて候補化合物と直接結合するのに用いる。キメラタンパク質には、試験化合物が相互作用しようとする特定の結合パートナーまたはそのペプチド類似体の少なくとも一部を含む。好ましくは、特定の結合パートナーはリガンドまたはリガンド受容体である。キメラタンパク質はまた、抗原を認識でき、エピトープとして認識されることができ、および／または免疫グロブリンヒンジドメインとして機能する抗体鎖の少なくとも一部をも含む。特に好ましい態様では、キメラタンパク質は、抗原を認識でき、および／またはエピトープとして認識されることができ、かつキメラタンパク質の免疫グロブリン部分と受容体部分との間に位置する免疫グロブリンＨ鎖の曲げやすい ”ヒンジ”領域をも含む免疫グロブリンドメインを含む。好ましくは、キメラタンパク質の免疫グロブリン部分は免疫グロブリンＨ鎖由来のものである。発明の詳細な説明定義 ”特定分子”とは、リガンド；受容体、例えばリガンドと結合できる細胞表面受容体；抗体；抗原；酵素；ホルモン；および酵素基質のような分子を意味するが、これに限定されない。本明細書から明らかなように、本発明の方法で用いるキメラタンパク質は特定分子またはそのペプチド類似体の全てを含む必要はないが、ある化合物によって認識され、かつ結合されるのに十分な部分を含んでいることだけが必要である。特定分子は天然のものである必要はなく、１以上の結合パートナーを見つけようとする分子であることだけが必要である。 ”ペプチド類似体”とは、結合能および／または特異性の点で、前記の特定分子と類似する分子を意味する。このようなペプチド類似体は見つけたり、あるいは当業者に公知のタンパク質工学技術によって製造できる。あるいは、このようなペプチド類似体はスクリーニングプロセスを繰り返すことによって見つけることができる。例えば、特定分子（この特定分子はタンパク質またはペプチドである必要はない）またはその一部の天然の結合パートナーを本明細書に記載するように（すなわち、キメラタンパク質で）用いて、これと結合することのできるペプチド化合物をスクリーニングする。第２のスクリーニング工程では、新しく見つけたペプチド化合物（またはその一部）自体を、キメラタンパク質中の特定分子のペプチド類似体として用いて、天然の結合パートナーの類似体をスクリーニングする。ペプチド類似体を見つけたり作製するためのその他の方法は当業者に公知である。 ”エピトープ”とは、抗原決定基として抗体と結合できる抗原またはその一部を意味する。 ”結合パートナー複合体”とは、特定の検出可能な様式で互いに結合する２以上の分子の会合体を意味し、従ってリガンドと受容体、抗体と抗原、およびキメラタンパク質とこれが結合する化合物の会合体をいう。 ”キメラタンパク質”とは、少なくとも２つの異なるタンパク質あるいはポリペプチド、または１つのタンパク質あるいはポリペプチドと非天然のポリペプチド鎖由来のアミノ酸配列の一部あるいは全てを含む非天然のタンパク質あるいはポリペプチドを意味する。本明細書では、キメラタンパク質を設計、作製、または意図的に選択し、これには少なくとも２つのドメインを含む。 ”直接または間接に標識した”とは、分子が検出されうるようなシグナルを放射する標識部分、例えば放射性同位体、染料、蛍光または化学発光部分を含むか、またはそれ自体は検出されないが、何らかの追加の反応によって化合物の存在を示すことのできる結合された酵素、ビオチンなどのリガンド、酵素基質、エピトープまたは核酸配列などの部分を含むことを意味する。 ”第２分子”とは、キメラタンパク質の第２ドメイン内にある領域と結合することができ、これによってその検出または精製が可能となる分子を意味する。 ”ヒンジ領域”または”免疫グロブリンＨ鎖ヒンジ領域”とは、多くの免疫グロブリンＨ鎖のＣ_H２とＣ_H１領域の間にあるプロリンとシステイン含有アミノ酸配列領域、またはこれらのアミノ酸配列の類似体のファミリーの１つを意味する。ここで、ヒンジのアミノ末端側領域とカルボキシ末端側領域はポリペプチド鎖中のターンまたは曲がり（kink）で空間的に分離されて、これらの領域が他の分子と別々にかつ同時に特異的結合できるようになっている。 ”リガンド”とは、別のある分子または分子複合体と特異的に結合することができる分子または多量体分子複合体を意味する。必ずしもそうではないが、多くの場合、リガンドは可溶性であり、その標的は細胞膜に埋め込まれたアンカードメインなどによって固定されている。 ”受容体”とは、細胞膜に埋め込まれてある分子と結合することができるアンカードメインをもつ分子の少なくとも一部または多量体分子複合体の少なくとも一部を意味する。受容体あるいはリガンドの一方または両方が二量体のようなホモーまたはヘテロ多量体形であるときには、多くの受容体はリガンドに対して特に高い親和性をもつ。 ”固体支持体”とは、これに可溶性分子が連結または結合できる、性質が生物的である（細胞またはバクテリオファージなどであるが、これに限定されない）または合成的である（アクリルアミド誘導体、セルロース、ナイロン、シリカ、磁気粒子などであるが、これに限定されない）不溶性マトリックスを意味する。 ”天然（に存在する）”とは、天然で普通に見られることを意味する。一般には化学物質は天然のものであるが、すべての特定の場合に天然源から作られたり由来するものである必要はない。 ”非天然（天然に存在しない）”とは、天然でめったに、または全く見られないもの、および／または有機合成法を用いて作られるものを意味する。 ”二価（bivalent）”とは、２つの化学化合物と特異的に結合できることを意味する。 ”多価（multivalent）”とは、２以上の化学化合物と特異的に結合できることを意味する。 ”二官能性”とは、１以上の追加の化合物と別々の反応をすることができる２つの異なる化学基をもつ化合物を意味する。 ”多官能性”とは、１以上の追加の化合物と別々の反応をすることができる２以上の異なる化学基をもつ化合物を意味する。 ”多量体複合体”とは、結合パートナーによって認識される構造を形成するような、２以上の同一または異なるポリペプチド鎖の安定な共有性または非共有性の会合体を意味する。 ”修飾”とは、非天然のもの、または天然化合物から逸脱するように改変されたものを意味する。本発明のキメラタンパク質は、キメラタンパク質の第１結合ドメイン中に含まれる、特定結合パートナー、該特定結合パートナーの少なくとも一部、またはそのタンパク質あるいはペプチド類似体との結合能について化合物集団をスクリーニングする道具として有用である。好ましい態様では、同じキメラ分子が、１以上の追加の結合特異性を与える少なくとも１つの免疫的活性領域（抗原性または抗原結合性）を含む第２結合ドメインをも含む。この追加の特異性は、例えば、直接または間接に標識された第２抗体を用いて（ただしこれに限定されない）キメラタンパク質を検出するための手段として用いることができ、または例えば、固定化プロテインＡあるいはプロテインＧまたはキメラタンパク質の第２ドメインと結合できる固定化抗体を用いて興味のあるキメラタンパク質または化合物の結合および／またはアフィニティ精製のための手段として用いることができる。もしもキメラタンパク質の第２結合ドメインが免疫グロブリン鎖由来のものでない場合には、これにアビジンまたはビオチンなどのリガンドが結合するアミノ酸鎖を単に含む。しかし、このような場合にはキメラタンパク質は免疫グロブリン鎖由来のプロリン含有ヒンジ領域を少なくとも含むであろう。本発明の方法はコンビナトリアルライブラリーメンバーをスクリーニングする道具として特に有用であるが、細菌あるいはファージ溶解物のスクリーニング、または結合パートナー間の特定の相互作用を検出したり、化合物を単離したりするあらゆる診断アッセイあるいは分析アッセイあるいは調製プロトコルに使用できる。受容体または結合パートナーと特異性にまたは半特異性に結合することによって生物学的効果を奏することが知られているか、またはそう考えられる生化学物質の例としては以下のものを含む：成長ホルモン、ヒト成長ホルモン、ウシ成長ホルモン、上皮小体ホルモン、チロキシン、インシュリン−Ａ鎖、インシュリン −Ｂ鎖、プロインシュリン、リラクシンＡ−鎖、レプチン受容体、繊維芽細胞増殖因子、リラクシンＢ−鎖、プロリラクシン、濾胞子激ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、黄体形成ホルモン、糖タンパク質ホルモン受容体、カルシトニン、グルカゴン、第ＶＩＩＩ因子、抗体、肺界面活性剤、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、組織プラスミノーゲン活性化因子、ボンベシン、第ＩＸ因子、トロンビン、造血細胞増殖因子、組織壊死因子α、組織壊死因子β、エンケファリナーゼ、ヒト血清アルブミン、ムレリアン（mullerian）阻害物質、ゴナドトロピン関連ペプチド、βラクタマーゼ、組織因子タンパク質、インヒビチン、アクチビン、血管内皮細胞増殖因子、インテグリン受容体、トロンボポエチン、プロテインＡまたはＤ、リューマチ因子、ＮＧＦ−β、血小板増殖因子、トランスフォーミング成長因子、ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β、インシュリン様増殖因子ＩおよびＩＩ、インシュリン増殖因子結合タンパク質、ＣＤ４、ＣＤ８、Ｄｎａｓｅ、Ｒｎａｓｅ、潜伏関連ペプチド、エリスロポエチン、骨誘導性因子、インターフェロン− α、−β、−γ、コロニー刺激因子、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ，Ｇ−ＣＳＦ、幹細胞因子、インターロイキン、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、スーパーオキシドジスムターゼ、ウイルス抗原、ＨＩＶエンベロープタンパク質、ｇｐ１２０、ｇｐ１４０、免疫グロブリンおよびＩｇスーパージーンファミリーによってコードされるタンパク質。これらのタンパク質、そのリガンドまたは受容体、ならびにこれらの断片または一部はキメラタンパク質の第１ドメイン中に含まれる可能性のある結合パートナーに含まれる。従って、本発明は一面で、化合物を検出または単離する方法に関し、該方法は、前記化合物を、受容体、抗原、抗体、リガンド、酵素、酵素基質またはその他の上述したタンパク質の少なくとも一部のような特定結合パートナーを含む第１ドメインと、抗原または抗体と特異的に結合できる免疫グロブリン分子の少なくとも１つの領域を含む第２ドメインとを含むキメラタンパク質と接触させることを含み、ここで第１ドメインによって認識される分子は第２ドメインによって認識される分子とは異なる。好ましくは、第１ドメインと第２ドメインは免疫グロブリンＨ鎖のプロリン含有”ヒンジ”領域によって２つのドメインが空間的に離れるように分離されている。キメラタンパク質は、キメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むベクター中の組換えＤＮＡ分子から発現させることが好ましいが、必ずしもそうでなくてもよい。第１ドメインは第２ドメインのアミノ末端側またはカルボキシル末端側のいずれかに位置してよく、特に好ましい態様では、キメラタンパク質は第２ドメインのアミノ末端側に位置する第１ドメインをもつ。本発明のこの面では、興味のある化合物が存在する場合には、この化合物がキメラタンパク質の第１ドメイン内の領域と結合するであろう。細胞あるいはファージディスプレイライブラリー中または”１ビーズ、１化合物”ライブラリー中などに化合物が固定されている場合には、固体支持体を洗浄して過剰のキメラタンパク質を遊離させて、キメラタンパク質：化合物の複合体（結合パートナー複合体）を検出する。好ましい態様では、キメラタンパク質の第２ドメインを、第２ドメインの領域に特異的な酵素標識した抗−ＩｇＧ第２抗体のような標識した第２結合パートナーと結合することによってキメラタンパク質を検出する。第２抗体を検出することによって、第１ドメインの結合パートナーと相互作用できる化合物を含む固体支持体の同定が可能になる。次にこれらの化合物を分析して構造や追加のアッセイプロトコルを導き出すことができる。この好ましい態様では、第２ドメインと結合するのに用いる標識した第２結合パートナーが蛍光あるいは色素標識をもっている場合、または反応に関与して蛍光あるいは色素生成物を形成するような部分を含んでいる場合には、固体支持体に結合した候補化合物を非候補（すなわち非結合性）化合物からセルソーターを用いて分離でき；蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）などのこのような装置は当業者に公知である。ソーティングの後、個々の固体支持体を単離し、キメラタンパク質を興味のある結合化合物から溶出し、そして化合物の性状決定を行う。あるいは、固定された化合物を同定するタグを含む固体支持体については、タグを”読み取って”化合物に関する情報を得ることができる。粒子が操作できるくらい十分に大きい場合には、固体支持体を手でソーティングすることもできる。あるいは、第２結合パートナーを結合パートナー複合体の精製を可能にする磁気小球などの固体支持体と結合することができる。このような場合、磁場を適用することによって、単離と精製の前にビーズを洗浄して未結合化合物を遊離できる。このような戦略は、ライブラリーメンバー自体が固体支持体と結合している場合においても使用できる。別の面では、第１ドメインの結合パートナーが溶液中の化合物と結合できるような様式で、キメラタンパク質を固体支持体上に固定化できる。固定化は、固体支持体とキメラタンパク質の第２ドメインの可変部または抗原性エピトープとの間に抗体：抗原結合複合パートナーを形成することによって実施できる（例えば、固体支持体と共有結合した抗ＩｇＧ抗体で、またはプロテインＧあるいはプロテインＡによって）。固定化されたキメラタンパク質を興味のある１以上の化合物を含むことが疑われるサンプルと接触させた後、サンプルのその他の成分を洗い流し、次いで化合物を溶出して候補化合物に富む集団を得る。さらに別の面では、本発明はサンプル中の結合ペアのメンバー、例えば受容体、サイトカイン、酵素、抗体、リガンドなどの検出または定量のための診断アッセイ法に関する。この方法は、上述のキメラタンパク質を興味のある化合物を含むことが疑われるサンプルと、キメラタンパク質の第１ドメインと該化合物との結合を可能にする条件下に接触させることを含む。好ましくは、化合物を固体支持体に固定化し、キメラタンパク質：化合物の結合パートナー複合体が該接触工程の後で形成されるようにする。次に固体支持体に結合した結合複合体を洗浄し、キメラタンパク質の第２ドメインと、例えば第２抗体などの直接または間接に標識されたリガンドとの相互作用によって複合体を検出する。さらに別の面では、本発明は化学的コンビナトリアルライブラリーのメンバーを迅速にスクリーニングする方法に関する。ライブラリーメンバーは溶液中に含まれていてもよいし、合成または生物的固相支持体に固定されていてもよい。スクリーニングすべき化合物は、結合パートナーとの相互作用に基づいて予めスクリーニングすることが望ましいペプチド、オリゴヌクレオチド、糖、あらゆる型のこれらの分子の混合物または類似体、その他の有機分子、または非有機化合物であってよい。結合パートナーとスクリーニングすべき化合物との関係は、例えば、抗体：抗原、リガンド：受容体、酵素：基質またはその他のあらゆるタンパク質結合パートナーと化合物との特異的結合相互作用であってよい。このような方法は、これらの結合パートナーの天然リガンドの類似体および非天然の模倣体または改変体をスクリーニングし、同定を助けるのに使用できる。さらに、キメラタンパク質中に含まれる特異的結合パートナーは天然リガンドである必要はないが、それ自体が天然リガンドの類似体であってもよい。本発明のこの面において、コンビナトリアルライブラリーのメンバーを、キメラタンパク質の第１ドメイン中に含まれる結合パートナーとリガンドとの結合に有利な条件下で、キメラタンパク質と接触させる。キメラタンパク質を、同一または異なっていてよい少なくとも別のキメラタンパク質と結合させて、例えば１以上のジスルフィド結合で結合された多量体、最も好ましくは二量体を形成するのが好ましい。この形では、第１ドメインの特異的結合パートナーに関してキメラタンパタ質は少なくとも二価であり、従って１以上の位置で、そして単量体形、または単量体化合物を含む固体支持体が支持体の表面上で密に詰め込まれているものよりも強く、ある化合物と結合する可能性をもっている。化合物自体が多量体形である場合には特にそうである。多量体形のキメラタンパク質を使用することは、ライブラリー中から低−または中程度の親和性の候補化合物の存在を検出するのに特に有利である；これらの化合物は高親和性化合物とは全く異なる構造をもち、代替のリガンド構造を解明することによって、種々の化学的、生化学的または物理的性質をもつ種々の高親和性リガンドを後に設計するときの価値ある情報をもたらす。次にキメラタンパク質を用いて、抗原または抗体と特異的に結合できる免疫グロブリン分子の少なくとも１つの領域を含むキメラタンパク質の第２ドメインを介してこれが結合するライブラリーメンバーを単離または検出する。ここで、第１ドメインによって認識される分子は第２ドメインによって認識される分子とは異なる。もしもコンビナトリアルライブラリーのメンバーが固体支持体に結合しているならば、固体支持体を洗浄してあらゆる未結合キメラタンパク質を遊離させ、特異的に結合したキメラタンパク質分子の第２ドメインに蛍光、酵素標識放射活性、または色素で標識した第２抗体を結合させることができる。次に標識と結合した固体支持体粒子を検出することにより興味のある化合物の同定と単離が可能になる。本明細書の開示から、スクリーニングすべき化合物がペプチドである場合には、既知のペプチド、例えば特定の体液性因子に対する細胞表面受容体の細胞外部分を含む第１ドメインをもつようにキメラタンパク質を作ることができる。細胞表面受容体の類似体を所望する場合には、該受容体と結合しうるペプチドコンビナトリアルライブラリーから本明細書で開示する方法を用いて化合物を単離できる。このような化合物の構造を決定し、この新しい化合物を新しいキメラタンパク質の第１ドメインの”結合パートナー”部分とし、この新しいキメラタンパク質を用いて受容体の類似体について同一または異なるコンビナトリアルライブラリーからスクリーニングする。この方法は、ある化合物の天然の結合パートナーの構造がたとえわからない場合であっても、ある化合物の”結合類似体”を得るために使用できることは明らかであろう。従って、本発明の別の面は、あるペプチドと結合する能力について化合物をスクリーニングするのに有用なキメラタンパク質を作製する方法に関し、該方法は、プロモーター配列の下流に位置する、免疫グロブリン鎖の少なくとも定常部（Ｃ）または可変部（Ｖ）をコードするヌクレオチド配列を含む組換えプラスミドの構築を含む。免疫グロブリン鎖をコードする遺伝子の部分が、成熟免疫グロブリン分子のアミノ末端領域またはカルボキシ末端領域のいずれかに対応することが好ましいが、前記ヌクレオチド配列が抗原または抗体によって認識される少なくとも１つのＣまたはＶ領域の一部をコードすることだけが必要である。免疫グロブリン（Ｃ）および／または（Ｖ）領域をコードするヌクレオチド配列の一部は、その３’または５’末端のいずれかに、コーディング配列中にＤＮＡ断片を発現可能なように挿入するための１以上の制限酵素部位をもち、該領域はクローニングを容易にするために約４個以上の異なる制限酵素切断配列からなる制限クラスターを含む。この制限クラスターが免疫グロブリン配列の５’側に位置している場合には、制限クラスターは免疫グロブリン配列とプロモーター配列の間に位置していなければならない。また、クローン化した免疫グロブリン鎖部分は、免疫グロブリン鎖の”ヒンジ”領域をコードするヌクレオチド配列を含むことが好ましく；このような領域は通常、少なくとも１つのシステイン残基をもつプロリン含有領域を含む。特定ヌクレオチド配列または配列領域の３’側または５’ 側というときは、そうでないことを特記しない限り、ＤＮＡ分子のコーディング鎖に関していうものとする。好ましくは、免疫グロブリン鎖は、定常部（Ｃ）ヌクレオチド配列を含む免疫グロブリンＨ鎖由来の配列を含む。このようなベクターは”カセットホルダー”と見なすことができ；すなわち、ベクターのこの部分が受容体、リガンド、またはその他の結合パートナーの一部をコードする多くの変更可能な核酸断片（”カセット”）を受け取ることができる。断片は免疫グロブリン配列の一方の末端にあるものとマッチングする制限部位を含むように操作されるか選択されているべきであり；このような場合、結合パートナー断片をベクター中にライゲートすることが普通である。しかしながら、結合パートナー遺伝子断片（”カセット”）をキメラ遺伝子の免疫グロブリン部分と同じリーディングフレームになるように入れることを確認する注意が必要である。必要ならば、キメラ遺伝子の免疫グロブリン部分と同じリーディングフレームにカセットを入れるのに十分な数の塩基を含む適当なオリゴヌクレオチドプライマーまたはリンカーを構築し、使用することによってこれは達成できる。所望するならば、１以上のプライマーまたはリンカーを構築して、クローニングを可能にし、結合パートナーのサブユニットを変更するための１以上の制限酵素切断部位を導入することもできる。例えばＰＣＲまたはその他の核酸増幅法を用いて適当なカセットは容易に構築できる。このような方法では一般に、異なる鎖に対して、そしてクローン化しようとする遺伝子部分の５’および３’の異なる位置（コーディング鎖について）に対して割り当てた少なくとも２つのプライマーを用いる。例えば受容体分子の一部をコードする遺伝子断片を発現遺伝子の５’末端にクローン化しようとするときは、増幅すべき核酸の５’部分が一般にＡＴＧスタートコドンを含む。このようなプライマーの例を以下の実施例に示す。その他の転写または翻訳制御配列（ＴＡＴＡボックスまたはリボゾーム結合配列（ＲＢＳ）など）も増幅核酸中に含むことを確実にするために、このようなプライマーは増幅すべきＡＴＧの５’ にある遺伝子の非翻訳領域に対して割り当てることもできる。コンセンサスな真核生物ＲＢＳの例としては、配列番号１９：５’−ＧＣＣＲＣＣＡＴＧＧ−３’ （ここで”Ｒ”はＡまたはＧである）がある。プライマーはこのような制御配列の５’側に割り当ててもよく、このような配列自体のいくつかまたは全てに割り当ててもよく、またはこのような配列を全く増幅しないように設計してもよい。当業者は本明細書の開示に照らして、ある結合パートナーにとって、これらの選択肢の１つを選ぶことによってキメラ遺伝子の発現を最適にすることを認識するであろうし、この３つの選択肢のうちのどれが最適かを決定することは当業者が容易になしうる日常的スクリーニング事項である。組換えベクターは、真核生物細胞中で複製してキメラタンパク質を発現できることが好ましく、従ってベクターはこれらの細胞中でエピソーム複製できるように複製起点を含むことが好ましい。このような場合、キメラタンパク質をコードするクローン化した合成遺伝子のすぐ上流にあるプロモーターは真核生物宿主中で転写を指示することができるものである。真核生物細胞によってベクターが高いコピー数で複製、転写されるようにベクターと宿主細胞を選択することも好ましい。このようなキメラタンパク質が真核生物細胞中で発現すると、細胞は発現したキメラタンパク質を免疫グロブリン分子のように扱うようになる。従って、キメラタンパク質はグリコシル化され、二量体またはその他の多量体を形成することが可能となり、天然の免疫グロブリンと全く同様に細胞表面に輸送されて分泌される。また、これによって細胞を溶解することなく、組織培養上清からキメラタンパク質を回収して精製することも可能になる。後述するように、出願人はアフリカミドリザル細胞中でキメラタンパク質をクローン化し、分泌生成物として発現することによって、このアプローチが実現可能であることを証明した。キメラタンパク質の精製は、アフィニティクロマトグラフィーによって最小工程で、キメラタンパク質の２つの特異的結合ドメインの１つを利用して実施できる；例えば、溶解した抗ＩｇＧ抗体を用いて。次にキメラタンパク質をアフィニティマトリックスから溶出して使用する。あるいは、キメラタンパク質を含む無細胞組織培養培地をさらに精製を行わずに用いることができる。生物でない固体支持体を用いる本発明の態様では、固体支持体は、抗体およびその他のタンパク質およびコンビナトリアルライブラリーのメンバーを含む化合物をその上で結合できるあらゆる不溶性または半可溶性のマトリックスである。このようなマトリックスに、ニトロセルロース、セルロース誘導体、ナイロン、制御多孔性ガラス、ポリスチレンまたはポリアクリルアミド誘導体、デンドロメア、磁気ビーズ、粒子または小球を含む。本発明のさらなる態様は本明細書に記載したキメラタンパク質の使用法に関する。このような使用法の１つである、興味のある化合物またはライブラリーメンバーをディスプレイする固体支持体と結合させるためのキメラタンパク質の第１ドメインの利用、タンパク質の第２ドメインに標識リガンドを割り当てることによる結合キメラタンパク質の同定、標識の検出、および同定した固体支持体のソーティングとしての使用については上述した。候補化合物をミクロタイターウエルに被覆し、キメラタンパク質を添加し、そして第２キメラタンパク質ドメインに割り当てられた直接または間接に標識されたリガンドを用いて結合キメラタンパク質を同定する、というような適用にキメラタンパク質を用いることも可能である。間接に標識されたリガンドの例としては、ホースラディッシュパーオキシダーゼまたはアルカリ性ホスファターゼのような酵素で標識した抗体であり、これを次に分光学的反応で基質に暴露し、興味のある化合物の存在を示す。この様式とは逆のものも可能であり、ここではキメラタンパク質を固定化し、ライブラリーメンバーを用いてこれと結合する。アッセイの処理量を増加するためには、最初のスタリーニングは種々の化合物の混合物を用いて行い、次のスクリーニングで特定の興味ある化合物を同定することができる。さらなる態様は実施例および本明細書を締めくくる請求の範囲に見いだされるであろう。実施例実施例１：ベクターの構築市販ベクターｐｃＤＮＡ３をInvitrogen社（San Diego，CA）から購入した。この長さ５．４ｋｂの真核／原核生物シャトルベクターには以下の成分が含有される：時計回りの方向に転写を開始する、サイトメガロウィルス（ＣＭＶ）真核生物プロモーターおよびＴ７バクテリオファージプロモーター；反時計回りに転写を開始する、ＳＰ６バクテリオファージプロモータ一；以下のクローン化された配列：HlndIII、KpnＩ Bam Hl、BstXＩ、EcoRＩ、EcoRＶ、BstXＩ、NotＩ、Xh oＩ、XbaＩ、およびApaＩが５’から３’の方向に並んだ制限部位を有するポリリンカー；ＳＶ４０真核生物複製開始点、ColE1細菌エピソーム複製開始点、アンピシリン耐性遺伝子、およびネオマイシン耐性遺伝子。このプラスミドを制限酵素NotＩおよびXhoＩを使用して、以下のように直線化した。３０（New England Biolabs社）、１０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７．９）、１０ｍＭＭｇＣｌ₂、５０ｍＭＮａＣｌ、１ｍＭＤＴＴ、および１００ μｇ／ｍｌＢＳＡ（牛血清アルブミン）を含有する反応混液２００ｕｌを３７ ℃で一晩インキュベートした。ＤＮＡフラグメントをＴＢＥ（８９ｍＭトリス（ｐＨ８．０）、８９ｍＭホウ酸、２ｍＭＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸））を使用した１％アガロースゲルで分離した。直線化した大きなＤＮＡフラグメントをゲルから切り出し、ゲル切片を粉砕し、ガラス粒子への吸着によりＤＮＡを抽出し、エタノール沈殿で精製した。精製したＤＮＡフラグメントをＴＥ（１０ｍＭトリス（ｐＨ７．５、１ｍＭＥＤＴＡ））に再び懸濁し、分光光度計で２６０ｎｍにおける溶液の吸収を測定して精製したＤＮＡフラグメントの濃度を確認した。単離したＤＮＡは、使用まで−２０℃で保存した。マウスゲノムＤＮＡは、凍結ＮＩＨ３Ｔ３細胞（マウス線維芽細胞系）の細胞抽出液から調製した。ＮＩＨ３Ｔ３細胞の一部（５ｘ１０⁵）を２５００ｘｇで４分間遠心分離し、ＰＢＳ（リン酸緩衝液）で３回洗浄した。０．５％（ｖ／ｖ）張緩衝液（５０ｍＭＫＣｌ、１０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ８．４）、１．５ｍＭＭｇＣｌ₂）１００μｌに細胞を再び懸濁し、５６℃で４５分間インキュベートした。その後、細胞粗抽出液を９５℃で１０分間インキュベートし、４℃ で保存した。ＩｇＧ１免疫グロブリンフラグメントのクローニングネズミＩｇＧ１Ｈ鎖の定常領域Ｃ_H２、Ｃ_H３、および、ヒンジドメインをコードするカルボキシ末端のマウスＤＮＡ配列を、ＮＩＨ３Ｔ３ゲノムＤＮＡよりＰＣＲを用いて増幅した。次のオリゴヌクレオチドプライマーを、免疫グロブリン遺伝子に相当する部分に相補的になるように合成した。配列番号１の下線部分はNotＩ制限酵素切断部位に相当し、配列番号２の太い下線部分はXhoＩ制限酵素切断部位に相当する。センスプライマー（配列番号１）：アンチセンスプライマー（配列番号２）：無菌の０．６ｍｌマイクロフュージチューブに以下の試薬を以下の順序で添加し、ＰＣＲ反応を開始した：１０μｌの１０ＸＰＣＲ緩衝液II（１００ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５００ｍＭＫＣｌ）、６μｌの２５ｍＭＭｇＣｌ₂、２μｌの各ｄＮＴＰの１０ｍＭ溶液、２．５μｌの１０μＭマウスＩｇＧ１センスプライマー（配列番号1）、２．５μｌの１０μＭマウスＩｇＧ１アン安定性ＤＮＡポリメラーゼ（Perkin Elmer社）、６６．５μｌの超純水、およびワックスビーズ１個。反応混液をワックスビーズが溶解するまで、７０℃でインキュベートし、１０μｌのＮＩＨ３Ｔ３細胞抽出液を添加した。反応混液をPerk in Elmer 480 Thermal Cyclerに配置し、サイクラーを以下の条件：９４℃で１分間、５５℃で１分間、７２℃で１．５分間で３０サイクル行い、使用まで４℃ で保存するようプログラムした。ＰＣＲ反応で増幅したＤＮＡを、ＴＢＥを使用した１％アガロースゲル電気泳動で精製した。増幅したＤＮＡに相当するＤＮＡのバンドをゲルから切り出し、上記のように４０μｌの水に抽出した。精製した増幅ＩｇＧ１遺伝子フラグメントを、上記のように制限酵素NotＩおよびXhoＩで分解した。制限酵素による分解物を１％アガロース／ＴＢＥゲルで泳動し、約１ｋｂのフラグメントをゲルから切り出し、４０μｌの水でＤＮＡをゲル切片から抽出した。Beckman DU 600分光光度計で２６０ｎｍにおける溶液の光学密度を測定し、収量を算出した。 XhoＩおよびNotＩで分解したＩｇＧ１のＰＣＲ産物を、XhoＩおよびNotＩで分解したｐｃＤＮＡ３ベクターに、以下のようにライゲートした。ライゲーション反応は、約１００ｎｇのｐｃＤＮＡ３および１００ｎｇのＩｇＧ１のＰＣＲフラグメントを含有する総容量２０μｌの溶液中で行った。これを、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．８）、１０ｍＭＭｇＣｌ₂、１０ｍＭＤＴＴ、１ｍＭＡＴＰ、２５μｇ／ｍＬＢＳＡ中で、１ユニットＤＮＡリガーゼと共に室温で一晩インキュベートした。ピーテント細胞の形質転換に使用した（これらの細胞はジェノタイプ：ｅ１４− （ＭｃｒＡ−）Δ（ｍｃｒＣＢ−ｈｓｄＳＭＲ−ｍｒｒ）１７１ｅｎｄＡ１ｓｕｐＥ４４ｔｈｉ−１ｇｙｒＡ９６ｒｅｌＡ１ｌａｃｒｅｃＢｒｅｃＪｓｂｃＣｕｍｕＣ：：Ｔｎ５（Ｋａｎ^r）ｕｖｒＣ［Ｆ’ｐｒｏＡＢｌａｃＩ^qＺΔＭ１５Ｔｎ１０（Ｔｅｔ^r）］を有し、形質転換の緩衝液中に供給される）。５０μｌの解凍した細胞を１μｌのライゲーション反応混液と混合して氷上に３０分間放置し、４２℃で４５秒間、熱処理した。５００μｌのルリアブイヨン培地を添加し、細胞を撹拌しながら３７℃で１時間インキュベートした。形質転換した細胞をＬＢプレート（５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有するルリアブイヨンプレート）に塗布した；ｐｃＤＮＡ３は、アンピシリン耐性を与えるβ−ラクタマーゼ遺伝子を保有するが、形質転換されていない細胞はこの遺伝子を含有しない。形質転換した細胞の一部を、Sambrookらの分子クローニング：実験マニュアル(Molecular Cloning:A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Press，第２版，1989）に記載される一般的な“ミニプレップ”によるベクターＤＮＡの調製に使用した。クローン化されたＰＣＲ−誘導マウスＩｇＧ１の定常領域およびヒンジ領域の存在を確認するため、ベクターＤＮＡをNotＩおよびXhoＩで分解し、１％アガロース／ＴＢＥ分析ゲルで分離した。核酸のシークエンシングを行う前に、NotＩ／XhoＩのインサートを含有するクローンから得たベクターＤＮＡを上記のように精製した。 Cycle Sequencing Ready Reaction Kitを使用し、取り扱い説明書に従って実施した。このプロトコールでは、シークエンシング反応の鎖伸長停止剤として蛍光で標識したジデオキシリボヌクレオチドを使用し、結果を自動的に記録する。シークエンシング反応混液を尿素を含有する４％アクリルアミド変性ゲルで１０時間泳動し、フラグメントの全配列を決定した。クローンが正しい配列を有していることを確認した後、ベクターの大量調製を行った。マウスＩｇＧ１のＣ_H２、Ｃ_H ３、およびヒンジ領域を含有する新しいベクターをｐｃＤＮＡ３−ＩｇＧ１と呼び、ここでは配列番号５として表す。NotＩの制限酵素部位を３’末端に持つＤＮＡフラグメントをクローン化するためにこのベクターを使用してもよいことは、認識されるところである。我々はまた、Ｃ_H２、Ｃ_H３、およびヒンジ領域を含有するＩｇＧ２ｂ重鎖の相当するセグメントを、同様の方法でクローン化することができることを発見した。これらのＩｇＧ２ｂのキメラタンパク質はある種の適用に好適でありうる。多くの免疫グロブリンの一次構造は知られているので、同様の方法を、受容体や他のペプチドが結合するパートナーをコードするＤＮＡフラグメントを、その３’位（上記のように、５’位よりも）で免疫グロブリンをコードする部分のキメラ遺伝子としてクローニングできることは、当該分野に精通する者には明白である。発現に際して、キメラタンパク質はカルボキシ末端で結合するパートナーを含有する。このコンフォメーションは、アミノ−およびカルボキシ−の方向性という点で、テストもしくはライブラリー化合物に結合するパートナーの施与を可能とするだけでなく、免疫グロブリン鎖の所望の可変領域（例えばモノクローナル抗体）をキメラタンパク質の第２ドメインの一部として含有する可能性も提供する。さらに、もしＶ_H、そして少なくともＣ_H２、Ｃ_H３の免疫グロブリン領域および結合パートナーがキメラタンパク質に含まれていれば、本開示の観点から、キメラタンパク質は第２ドメインに特異的結合領域を一つではなく二つ有することが予期される。腫瘍壊死因子の受容体（ＴＮＦ−Ｒ）のｐｃＤＮＡ３−ＩｇＧ１へのクローニングヒトの腫瘍壊死因子−αの受容体の細胞外部分をコードするＤＮＡフラグメントを、ヒトの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から、トータルＲＮＡｃＤＮＡのＰＣＲ増幅により得た。ＰＢＭＣからＲＮＡは一般的な方法で調製した。１μｇのＰＢＭＣのトータルＲＮＡ、１２．５ｍＭのそれぞれのｄＮＴＰ、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、４０ｍＭＫＣｌ、５ｍＭＤＴＴ（ジチオールスレトール）、２０ｐｍｏｌのランダムなデオキシリボヌクレオチドのヘキサマＮＡを逆転写した。反応混液を４２℃で１時間インキュベートした後、９５℃で５分間処理し、使用まで４℃で保存した。ＰＢＭＣのｃＤＮＡ調製のＰＣＲ反応は、以下のプライマーを使用して実施した。ＴＮＦ−Ｒセンスプライマー（配列番号３）：ＴＮＦ−Ｒアンチセンスプライマー（配列番号４）：配列番号３を有するプライマーは、増幅された核酸にＡＴＧ開始コドン（下線）およびBam HI部位（太線）を含む。ＰＣＲ反応は前記のように実施した。ＴＮＦ−ＲのＰＣＲ産物およびｐｃＤＮＡ３−ＩｇＧ１をそれぞれBam HIおよびNot Ｉで分解し、それぞれの反応のより大きなＤＮＡフラグメントを上記のようにゲルで精製した。適当な方向性でＴＮＦ−Ｒフラグメントを有するキメラタンパク質発現ベクター、ｐｃＤＮＡ３−ＩｇＧ１−ＴＮＦ−Ｒ（ここでは配列番号６として表す）を得るために、精製したＴＮＦ−ＲのＤＮＡフラグメントおよびベクターフラグメントを上記のようにライゲートした。ベクターの構築は、試験的制限酵素分解および核酸シークエンシングによって確認した。ベクターの大量調製は、形質転換したE ．Coliのクローンを使用して行った。実施例２：アフリカミドリザル細胞におけるｐｃＤＮＡ３−ＩｇＧ１−ＴＮＦ− Ｒのトランスフェクションおよびキメラタンパク質の発現本発明のキメラタンパク質の発現を証明するために選択した宿主細胞はアフリカミドリザルの腎細胞ＣＯＳ−７であった。この細胞系は、ｐｃＤＮＡ３−ＩｇＧ１−ＴＮＦ−Ｒのような適当な調節要素を有する組換えベクターのトランスフェクションおよび発現によって、融合タンパク質の大量生成に使用することができる。ＣＯＳ−７細胞を、４５００ｍｇ／ｎｌのＤ−グルコース、５８４ｍｇ／ｍｌのＬ−グルタミン、および１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したDulbecco社 Modified Eagle培地で培養した。形質転換のために、細胞を１−２ｘ１０⁵細胞／ｍｌで播種し、被覆率（confluent）が５０−７０％となるまで、５％ＣＯ₂中、３７℃でインキュベートした。百分率による被覆率とは、例えばmicrotiter d ishの底を、細胞が占める百分率を意味する。その後、以下のように細胞をトランス −，３−ジオレイロキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎトリメチルアンモニウムクロライド）およびDOPE（ジオレイルホスファチジルエタノールアミン）を含有する陽イオン脂質製剤）を１００μｌの血清を含有していない培地と混合してそれぞれのトランスフェクションのための溶液を調製し、室温で３０分間放置した。１〜２μｌのｐｃＤＮＡ３−ＩｇＧ１−ＴＮＦ−Ｒ溶液も１００μｌの血清を含有していない培地で希釈した。二つの溶液を合一し、緩やかに撹拌し、室温で１０重層し、３７℃で一晩インキュベートした。トランスフェクション混合液を除去し、培地で置き換えた。ＣＯＳ−７細胞内でのｐｃＤＮＡ−ＩｇＧ１−ＴＮＦ− Ｒベクターの発現は恒常的である。キメラタンパク質は培地内に分泌され、培地の細胞を含有していない部分をデカントまたはアスピレートすることにより回収できる。トランスフェクト後４８−７２時間に細胞を除いた上清を用いて、キメラタンパク質の分泌を測定した。実施例３：免疫グロブリン結合性パートナーキメラタンパク質を使用したマイクロタイターウェルにコートした化合物のスクリーニングキメラタンパク質の発現に次いで、細胞を含有していない培地を回収し、融合タンパク質の存在を確認した。プラスチックのマイクロタイターディッシュのウェルをＰＢＳ中で１ウェルあたりｎｇの組換えＴＮＦαを添加し、４℃で一晩、あるいは室温で２時間反応することにより調製したＴＮＦαでコートした。その性剤）で３回洗浄した。洗浄に次いで、非特異的な結合を防止するために、１％ＰＢＳ（ブロッキング緩衝液）でウェルをブロックした。ウェルを上記のように再び洗浄した。培養液を１１回、ブロッキング緩衝液で２倍に逐次希釈し、それぞれの希釈液（および未希釈培養液）の５０μｌをコートおよびブロックしたウェルに添加した。一連のコートしていないウェルにも希釈した細胞未含有培養液を添加した。その後マイクロタイタープレートを室温で２時間インキュベートし、上記のように３回洗浄した。ホースラディッシュパーオキシダーゼで標識した抗マウスＩｇＧ抗体の１：５０００希釈液１００μｌを使用して、結合したキメラタンパク質の存在をアッセイした（ＥＬＩＳＡ）。市販のホースラディッシュパーオキシダーゼ（ＨＲＰ）基質（ＴＭＢ色素試薬、Kirkegaard & Perry Laboratories社）１００μｌをそれぞれのmicrotiterウェルに添加して発色を開始した。プレートを室温で２０分間インキュベートした。このアッセイシステムでの発色は、１００μｌの停止溶液（Kirkegaard & Per ry社、商品コード５０−８５−０５）をそれぞれのウェルに添加して終了させることができる。コントロールのウェルは発色しなかった。これと対照的に、ＴＮＦ／ＴＮＦ− Ｒ複合体が形成されていたウェルは、明瞭な青から紫の着色が観測された。それぞれの希釈液の４５０ｎｍの吸収を測定し、６５０ｎｍの吸収を減じて結果をプロットした。結果は以下の通りである。結果は、トランスフェクトしていない細胞の組織培養液を含有するコントロールウェルも、ＴＮＦ非存在下でのトランスフェクトした細胞の培養液を含有するウェルも、着色した；すなわち、キメラタンパク質およびＴＮＦ結合パートナー間の特異的結合が生成したことを示す。しかしながら、キメラタンパク質をコードするベクターをトランスフェクトした細胞の培養液はＴＮＦでコートしたウェルに結合することができ、特異的標的結合の存在を示すタイトレーション曲線が得られた。実施例４：免疫グロブリン結合パートナーキメラタンパク質を用いる粒子結合化合物のスクリーニング組換えＴＮＦα（R & D Systemsから入手）を臭化シアンで活性化したSEPHARO SE（登録商標）CL 4Bアガロースビーズに以下のようにして固定した。0.5mlの臭化シアンで活性化したSEPHAROSE（登録商標）4Bを氷冷0.1N HClで洗浄した。TNF α１０μｇをＰＢＳ１０μｌに溶解し、0.1M HCO₃および0.5M NaClの溶液１００ μｌ中に加えた。これを洗浄し、活性化したSEPHAROSEビーズ１００μｌと混合し、懸濁液を室温で２時間インキュベートした。ＴＮＦと結合したSEPHAROSEビーズに50mMグリシン（ｐＨ８．０）５００μｌを加えて、未反応の臭化シアンで活性化した部位をブロックした。陰性対照として、洗浄した未結合のSEPHAROSE １００μｌに同量のグリシン溶液を加えた。１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ１０容量とＴＢＳＴ（２０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭＮａＣｌおよび０．０５％（ｖ／ｖ）ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０非イオン性界面活性剤）中で、室温で１５分、２つのビーズスラリー（ＴＮＦおよび対照）を再懸濁しインキュベートすることによって、SEPHAROSEビーズへのタンパク質の非特異的結合の推定部位をブロックした。ＴＮＦおよび対照のSEPHAROSEビーズ４０μｌを、トランスフェクトしていないか、またはｐｃＤＮＡ３−ＩｇＧ１−ＴＮＦ−ＲでトランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞のいずれかから得られる組織培養上清１００μｌにそれぞれ暴露して、室温で１時間インキュベートした。次にビーズをＴＢＳＴで洗浄した。結合キメラタンパク質の検出は、アルカリ性ホスファターゼ（ＡＰ）と結合させた第２の抗−マウスＩｇＧ１抗体を用いて行った。アルカリ性ホスファターゼと結合させた抗体およびその色原性基質は市販のキットPROTOBLOT(登録商標）II AP System（Promega Corp.）を用いて、使用説明書に従って使用した。ＡＰ− 抗−マウスＩｇＧ（１ｍｇ／ｍｌ）をトリス緩衝塩液（ＴＢＳ：２０ｍＭトリス −ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭＮａＣｌ）中に１：５０００で希釈した。この溶液１００μｌをSEPHAROSEビーズ少量に加えて、室温で１時間インキュベートした。次にビーズをＴＢＳ中で３回洗浄した。上記少量のSEPHAROSEビーズのそれぞれにWESTERN BLUE（登録商標）色原体ＡＰ基質１００μｌを加えて発色を行った。これを室温で２０分インキュベートした。ビーズを水で洗浄してアッセイ系の発色を停止した。各SEPHAROSEビーズ混合物の少量を１０倍の対物レンズで顕微鏡観察した。対照のビーズは無色のままであった。これとは対照的に、ＴＮＦ／ＴＮＦ−Ｒ複合体が形成されたビーズは鮮やかな青から紫色に染色された。実施例５：さらなる融合ペプチドの構築ｐＣＤＮＡ３−ＩｇＧ１”カセットホルダー”と前記実施例と同様の方法を用いて、アミノ末端領域に、エリスロポエチン受容体、ＦＡＳ（ＴＮＦα−Ｒと類似の性質をもつ神経成長因子ファミリーの受容体）、インターロキン４受容体、およびインターロイキン６受容体の細胞外リガンド結合部分をもつ個々のキメラタンパク質をさらに作製した。これらの受容体のヌクレオチド配列はGENBANKヌクレオチド配列データベースから入手した。その他の結合パートナーのヌクレオチド配列も文献またはデータベースから入手できるか、または単離したタンパク質のペプチド配列を直接決定することにより入手できる。上に示した受容体の細胞外部分を増幅するよう設計されたプライマーを用いて、ＰＣＲで増幅した”クローン化可能な”二本鎖ＤＮＡを得た。上述したようにして、センスプライマーにはＡＴＧ開始コドンの直前にＢａｍＨ１部位を導入し、アンチセンスプライマーには終始コドンの後にＮｏｔ１制限部位を導入した。プライマーセット（センス鎖の開始コドンに下線を引いた）および増幅したＤＮＡ配列（コード鎖配列のみ）を以下に示す：エリスロポエチン受容体センスプライマーアンチセンスプライマー増幅したＥＰＯ受容体ＤＮＡ配列インターロイキン４受容体センスプライマーアンチセンスプライマー増幅したＩＬ−４受容体ＤＮＡ配列インターロイキン６受容体センスプライマーアンチセンスプライマー増幅したＩＬ−６受容体ＤＮＡ配列ＦＡＳセンスプライマーアンチセンスプライマー増幅したＦＡＳＤＮＡ配列増幅したＤＮＡ断片およびｐＤＮＡ３−ＩｇＧ１ベクターの両方を上述した精製ＢａｍＨ１とＮｏｔ１ゲルで消化し、キメラタンパク質のヒンジ−ＩｇＧ部分をコードする領域のすぐ５’側の位置で制限酵素で消化したベクター中に上記と同様に増幅断片をライゲートした。次に組換えベクターを用いて上記と同様にＣＯＳ−７細胞を形質転換した。いずれの場合も、キメラタンパク質が細胞外の培地に分泌され、それぞれの意図するリガンドとの結合能を確認した。実施例６：分泌されたキメラタンパク質の構造個々のキメラタンパク質の細胞外培地を少量とって還元性および非還元性のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで、分子量マーカーおよび抗ＧＭ−ＣＳＦモノクローナル抗体（二価）対照とともに電気泳動にかけた。抗体対照とキメラタンパク質は非還元性ゲルと比較して還元性ゲル上で電気泳動移動度が大きく増加し、これは抗体と同様に、分泌されたキメラタンパク質がジスルフィド結合した二価の二量体として生産されたことを示すものである。以上の実施例は本発明の特に好ましい態様を記載するものであって、本発明を限定するものと解してはならない。さらに別の態様が本明細書および以下の請求の範囲に含まれる。本発明の範囲は本明細書全体に記載され示唆された態様ならびにその均等なものから決定されることを出願人は意図している。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】平成１０年６月１日（１９９８．６．１）【補正内容】請求の範囲を以下のものと差し替える。『１．特定結合パートナーとの結合能について試験化合物をスクリーニングする方法であって、以下の工程を含んでなる方法：ａ）少なくとも２つの異なる結合ドメインを含むキメラタンパク質と少なくとも１つの試験化合物を接触させ、ここで第１ドメインは特定結合パートナーの少なくとも一部またはそのペプチド類似体を含み、第２ドメインはエピトープまたはエピトープを認識できる領域である少なくとも１つの領域をもつ免疫グロブリン鎖の少なくとも一部を含み、ｂ）前記キメラタンパク質と少なくとも１つの試験化合物を結合し、これによって結合パートナー複合体を形成し、ｃ）結合しないキメラタンパク質から結合パートナー複合体を分離し、ｄ）結合パートナー複合体を、キメラタンパク質の第２ドメインを結合することのできる直接標識または間接標識された第２分子と接触させ、そしてｅ）標識された第２分子を検出し、これによって試験化合物の存在を示す。２．キメラタンパク質の第１ドメインと第２ドメインが免疫グロブリンＨ鎖ヒンジ領域によって分けられている請求項１記載の方法。３．特定結合パートナーが抗原、抗体、酵素、酵素基質、受容体またはリガンドである請求項１または２記載の方法。４．特定結合パートナーが以下のものである請求項１または２記載の方法：成長ホルモン、ヒト成長ホルモン、ウシ成長ホルモン、上皮小体ホルモン、チロキシン、インシュリン−Ａ鎖、インシュリン−Ｂ鎖、プロインシュリン、リラクシンＡ−鎖、レプチン受容体、繊維芽細胞増殖因子、リラクシンＢ−鎖、プロリラクシン、濾胞刺激ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、黄体形成ホルモン、糖タンパタ質ホルモン受容体、カルシトニン、グルカゴン、第ＶＩＩＩ因子、抗体、肺界面活性剤、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、組織プラスミノーゲン活性化因子、ボンベシン、第ＩＸ因子、トロンビン、造血細胞増殖因子、組織壊死因子α 、組織壊死因子β、エンケファリナーゼヒト血清アルブミン、ムレリアン阻害物質、ゴナドトロピン関連ペプチド、βラクタマーゼ、組織因子タンパク質、インヒビチン、アクチビン、血管内皮細胞増殖因子、インテグリン受容体、トロンボポエチン、プロテインＡまたはＤ、リューマチ因子、ＮＧＦ−β、血小板増殖因子、トランスフォーミング成長因子、ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β、インシュリン様増殖因子ＩまたはＩＩ、インシュリン増殖因子結合タンパク質、ＣＤ４、ＣＤ８、ＤＮａｓｅ、ＲＮａｓｅ、潜伏関連ペプチド、エリスロポエチン、骨誘導性因子、インターフェロン−α、−β、−γ、コロニー刺激因子、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、幹細胞因子、インターロイキン、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ −３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ− １０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、スーパーオキシドジスムターゼ、ウイルス抗原、ＨＩＶエンベロープタンパク質、ｇｐ１２０、ｇｐ１４０、免疫グロブリン、Ｉｇスーパージーンファミリーによってコードされるタンパク質、前記特定結合パートナーのあらゆるものの天然のリガンドまたは受容体、またはその類似体。５．特定結合パートナーが腫瘍壊死因子α受容体の少なくとも一部を含む請求項１または２記載の方法。６．特定結合パートナーが内皮細胞増殖因子受容体の少なくとも一部を含む請求項１または２記載の方法。７．特定結合パートナーがトロンボポエチン受容体の少なくとも一部を含む請求項１または２記載の方法。８．特定結合パートナーがＴＧＦα受容体の少なくとも一部を含む請求項１または２記載の方法。９．特定結合パートナーがＴＧＦβ受容体の少なくとも一部を含む請求項１または２記載の方法。１０．特定結合パートナーがエリスロポエチン受容体の少なくとも一部を含む請求項１または２記載の方法。１１．特定結合パートナーがインターフェロンγ受容体の少なくとも一部を含む請求項１または２記載の方法。１２．特定結合パートナーがＧＭ−ＣＳＦ受容体の少なくとも一部を含む請求項１または２記載の方法。１３．特定結合パートナーがＧ−ＣＳＦ受容体の少なくとも一部を含む請求項１または２記載の方法。１４．特定結合パートナーがＩＬ−４受容体の少なくとも一部を含む請求項１または２記載の方法。１５．特定結合パートナーがＩＬ−６受容体の少なくとも一部を含む請求項１または２記載の方法。１６．特定結合パートナーがレプチン受容体の少なくとも一部を含む請求項１または２記載の方法。１７．特定結合パートナーが繊維芽細胞増殖因子受容体の少なくとも一部を含む請求項１または２記載の方法。１８．第１ドメインがキメラタンパク質上の第２ドメインのアミノ末端側に位置する請求項２記載の方法。１９．第１ドメインがキメラタンパク質上の第２ドメインのカルボキシ末端側に位置する請求項２記載の方法。２０．第２ドメインの免疫グロブリン部分が免疫グロブリンＨ鎖のＣ_H３領域を含む請求項１８記載の方法。２１．第２ドメインの免疫グロブリン部分が免疫グロブリンＨ鎖のＣ_H２領域をさらに含む請求項２０記載の方法。２２．試験化合物を固体支持体に固定する請求項１または２記載の方法。２３．試験化合物が化学コンビナトリアルライブラリーの少なくとも一部を含む請求項１、２または１８−２１のいずれかに記載の方法。２４．ライブラリーが、天然に存在するかまたは天然に存在しないアミノ酸、天然に存在するかまたは天然に存在しないヌクレオチド、天然に存在するかまたは天然に存在しない糖、または二官能性もしくはまたは多官能性の小さい有機分子であるメンバーを含む請求項２３記載の方法。２５．工程ｃ）が、固体支持体から結合しなかったキメラタンパク質を洗浄することを含む請求項２２記載の方法。２６．キメラタンパク質をコードする組換えＤＮＡオープンリーディングフレームを宿主細胞中で発現させることによってキメラタンパク質を産生する請求項１または２記載の方法。２７．宿主細胞がキメラタンパク質を少なくとも１つのジスルフィド結合で結合された二量体として発現し、該二量体が少なくとも２つの特定結合パートナーを含む請求項２６記載の方法。２８．試験化合物を、少なくとも２つの特定結合パートナーを含む二価のキメラタンパク質二量体と接触させる請求項２２記載の方法。２９．宿主細胞が第２のキメラタンパク質をコードする第２のオープンリーディングフレームを含むＤＮＡをさらに発現し、該第２のキメラタンパク質は、特定結合パートナーの少なくとも一部またはその類似体を含む第１ドメインと、エピトープである領域またはエピトープを認識できる領域をもつ免疫グロブリンＬ鎖の少なくとも一部を含む第２ドメインを含む、請求項２６記載の方法。３０．キメラタンパク質と第２のキメラタンパク質が少なくとも１つのジスルフィド結合で結合されて、これによって多量体複合体を形成する請求項２９記載の方法。３１．キメラタンパク質と第２のキメラタンパク質の第１ドメインが同じ特定結合パートナー部分またはそのペプチド類似体を含む請求項３０記載の方法。３２．キメラタンパク質と第２のキメラタンパク質の第１ドメインが異なる特定結合パートナー部分またはそのペプチド類似体を含む請求項３０記載の方法。３３．少なくとも１つの試験化合物が多量体の形で存在し、単量体のキメラタンパク質が試験化合物の多量体形と結合するよりも強く、二価のキメラタンパク質二量体が試験化合物の多量体形と結合する請求項２８記載の方法。３４．少なくとも１つの試験化台物が多量体形で存在し、第１キメラタンパク質または第２キメラタンパク質のいずれかが単独で試験化合物の多量体形と結合するよりも強く、多量体複合体が試験化合物の多量体形と結合する請求項３０記載の方法。３５．宿主細胞が真核生物細胞である請求項２６記載の方法。３６．宿主細胞が真核生物細胞である請求項２９記載の方法。３７．オープンリーディングフレームが、細胞から発現されるキメラタンパク質にＮ−結合した糖残基を付加するように細胞に指示をするヌクレオチド配列を含む請求項２６記載の方法。３８．固体支持体が細胞である請求項２２記載の方法。３９．固体支持体がバクテリオファージ粒子である請求項２２記載の方法。４０．特定結合パートナーとの結合能について１以上の試験化合物をスクリーニングする方法であって、以下の工程を含んでなる方法：ａ）少なくとも２つの異なる結合ドメインを含むキメラタンパク質を固体支持体に固定し、ここで第１ドメインは特定結合パートナーの少なくとも一部またはそのペプチド類似体を含み、第２ドメインはエピトープである領域またはエピトープを認識できる領域をもつ免疫グロブリン鎖の少なくとも一部を含み、ｂ）固定されたキメラタンパク質と少なくとも１つの試験化合物を接触させて、キメラタンパク質および特定結合パートナー部分または類似体と結合しうる試験化合物を含む結合パートナー複合体を形成し、ｃ）固体支持体を洗浄して、結合しないキメラタンパク質から結合パートナー複合体を分離し、そしてｄ）結合パートナー複合体中のキメラタンパク質を検出し、これによって試験化合物の存在を示す。４１．キメラタンパク質の第１ドメインと第２ドメインが免疫グロブリンＨ鎖ヒンジ領域によって分けられている請求項４０記載の方法。４２．第１ドメインがキメラタンパク質上の第２ドメインのアミノ末端側に位置する請求項４１記載の方法。４３．第１ドメインがキメラタンパク質上の第２ドメインのカルボキシ末端側に位置する請求項４１記載の方法。４４．第２ドメインの免疫グロブリン部分が免疫グロブリンＨ鎖のＣ_H３領域を含む請求項４２記載の方法。４５．第２ドメインの免疫グロブリン部分が免疫グロブリンＨ鎖のＣ_H２領域をさらに含む請求項４４記載の方法。４６．固定したキメラタンパク質がジスルフィド結合した多量体複合体である請求項４０または４１記載の方法。４７．多量体複合体が試験化合物の少なくとも２つの部位と結合する請求項４６記載の方法。４８．試験化合物が、天然に存在するかまたは天然に存在しないアミノ酸、天然に存在するかまたは天然に存在しないヌクレオチド、天然に存在するかまたは天然に存在しない糖、または二官能性もしくはまたは多官能性の小さい有機分子である請求項４０または４１記載の方法。４９．固定化工程によってキメラタンパク質を、固体支持体と結合した部分に結合し、ここで前記部分が抗原、抗体の少なくとも一部、プロテインＧ、またはプロテインＡである請求項４０記載の方法。５０．工程ｄ）の前に試験化合物を固体支持体から溶出する工程をさらに含む請求項４９記載の方法。５１．特定結合パートナーが抗原、抗体、酵素、酵素基質、受容体またはリガンドである請求項４０または４１記載の方法。４．特定結合パートナーが以下のものである請求項４０または４１記載の方法：成長ホルモン、ヒト成長ホルモン、ウシ成長ホルモン、上皮小体ホルモン、チロキシン、インシュリン−Ａ鎖、インシュリン−Ｂ鎖、プロインシュリン、リラクシンＡ−鎖、レプチン受容体、繊維芽細胞増殖因子、リラクシンＢ−鎖、プロリラクシン、濾胞刺激ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、黄体形成ホルモン、糖タンパク質ホルモン受容体、カルシトニン、グルカゴン、第ＶＩＩＩ因子、抗体、肺界面活性剤、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、組織プラスミノーゲン活性化因子、ボンベシン、第ＩＸ因子、トロンビン、造血細胞増殖因予、組織壊死因子α、組織壊死因子β、エンケファリナーゼヒト血清アルブミン、ムレリアン阻害物質、ゴナドトロピン関連ペプチド、βラクタマーゼ、組織因子タンパク質、インヒビチン、アクチビン、血管内皮細胞増殖因子、インテグリン受容体、トロンボポエチン、プロテインＡまたはＤ、リューマチ因子、ＮＧＦ−β、血小板増殖因子、トランスフォーミング成長因子、ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β、インシュリン様増殖因子ＩまたはＩＩ、インシュリン増殖因子結合タンパク質、ＣＤ４、ＣＤ８、ＤＮａｓｅ、ＲＮａｓｅ、潜伏関連ペプチド、エリスロポエチン、骨誘導性因子、インターフェロン−α、−β、−γ、コロニー刺激因子、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、幹細胞因子、インターロイキン、ＩＬ−１、ＩＬ− ２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−1０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、スーパーオキシドジスムターゼ、ウイルス抗原、ＨＩＶエンベロープタンパク質、ｇｐ１２０、ｇｐ１４０、免疫グロブリン、Ｉｇスーパージーンファミリーによってコードされるタンパク質、前記特定結合パートナーのあらゆるものの天然のリガンド、受容体もしくは基質、またはその類似体。５３．特定結合パートナーとの結合能について試験化合物をスクリーニングする方法であって、以下の工程を含んでなる方法：ａ）以下のものを含む、キメラタンパク質をコードする組換えＤＮＡベクターを構築し：ｉ）抗原に結合しうるか、抗体に結合しうるか、または免疫グロブリンヒンジ領域に由来する少なくとも１つの領域を含む、免疫グロブリン鎖の少なくとも一部をコードする第１ヌクレオチド配列を含むオープンリーディングフレーム、ｉｉ）第１ヌクレオチド配列の３’末端またはその後に位置する終始コドン、ｉｉｉ）該オープンリーディングフレームの上流に位置し、宿主細胞内でオープンリーディングフレームのＲＮＡ転写を指示することのできるプロモーター配列、およびｉｖ）特定結合パートナーの少なくとも一部をコードする第２ヌクレオチド配列をクローニングするための、第１ヌクレオチド配列とプロモーター配列との間に位置する少なくとも１つの制限酵素認識部位、ｂ）該制限酵素認識部位に特異的な制限酵素でベクターを開裂し、プロモーター配列と終始コドンとの間のオープンリーディングフレームが維持されるように、第２ヌクレオチド配列を制限酵素認識部位でベクター中に挿入し、ｃ）ベクターを宿主細胞に入れ、ｄ）組換えＤＮＡベクターからの遺伝子発現を引き起こす条件下で宿主細胞をインキュベートすることによって、第１および第２ヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸を含むキメラタンパク質を生産し、ｅ）宿主細胞からキメラタンパク質を分離し、ｆ）キメラタンパク質の特定結合パートナー部分と試験化合物との結合に好ましい条件下で、試験化合物をキメラタンパク質と接触させ、これによってキメラタンパク質と試験化合物を含む複合体を形成し、そしてｇ）特定結合パートナーに結合しうる試験化合物の存在を示すものとして、複合体の存在を特異的に検出する。５４．免疫グロブリンＨ鎖のヒンジ領域の少なくとも一部をコードする第３ヌクレオチド配列領域を、第１ヌクレオチド配列と第２ヌクレオチド配列との間に挿入して、プロモーター配列と終始コドンとの間のオープンリーディングフレームを維持する工程をさらに含む請求項５３記載の方法。５５．キメラタンパク質が少なくとも２つの異なる結合ドメインを含み、ここで第１ドメインは特定結合パートナーの少なくとも一部を含み、第２ドメインはエピトープまたはエピトープを認識できる領域である免疫グロブリン鎖領域の少なくとも一部を含む請求項５３記載の方法。５６．特定結合パートナーが抗原、抗体、酵素、酵素基質、受容体またはリガンドと結合しうる請求項５５記載の方法。５７．特定結合パートナーが以下の試験化合物の少なくとも一部と結合しうる請求項５６記載の方法：成長ホルモン、ヒト成長ホルモン、ウシ成長ホルモン、上皮小体ホルモン、チロキシン、インシュリン−Ａ鎖、インシュリン−Ｂ鎖、プロインシュリン、リラクシンＡ−鎖、レプチン受容体、繊維芽細胞増殖因子、リラクシンＢ−鎖、プロリラクシン、濾胞刺激ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、黄体形成ホルモン、糖タンパク質ホルモン受容体、カルシトニン、グルカゴン、第ＶＩＩＩ因子、抗体、肺界面活性剤、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、組織プラスミノーゲン活性化因子、ボンベシン、第ＩＸ因子、トロンビン、造血細胞増殖因子、組織壊死因子α、組織壊死因子β、エンケファリナーゼヒト血清アルブミン、ムレリアン阻害物質、ゴナドトロピン関連ペプチド、βラクタマーゼ、組織因子タンパク質、インヒビチン、アクチビン、血管内皮細胞増殖因子、インテグリン受容体、トロンボポエチン、プロテインＡまたはＤ、リューマチ因子、ＮＧＦ−β、血小板増殖因子、トランスフォーミング成長因子、ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β、インシュリン様増殖因子ＩまたはＩＩ、インシュリン増殖因子結合タンパク質、ＣＤ４、ＣＤ８、ＤＮａｓｅ、ＲＮａｓｅ、潜伏関連ペプチド、エリスロポエチン、骨誘導性因子、インターフェロン−α、−β、−γ、コロニー刺激因子、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、幹細胞因子、インターロイキン、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、スーパーオキシドジスムターゼ、ウイルス抗原、ＨＩＶエンベロープタンパク質、ｇｐ１２０、ｇｐ１４０、免疫グロブリン、Ｉｇスーパージーンファミリーによってコードされるタンパク質、前記試験化合物のあらゆるものの天然のリガンド、受容体、もしくは基質、またはその類似体。５８．特定結合パートナーとの結合能について試験化合物をスクリーニングする方法であって、以下の工程を含んでなる方法：ａ）以下のものを含む、キメラタンパク質をコードする組換えＤＮＡベクターを構築し：ｉ）免疫グロブリン鎖の少なくとも一部をコードする第１ヌクレオチド配列を含むオープンリーディングフレーム、ｉｉ）該オープンリーディングフレームの上流に位置し、宿主細胞内でオープンリーディングフレームのＲＮＡ転写を指示することのできるプロモーター配列、およびｉｉｉ）特定結合パートナーの少なくとも一部をコードする第２ヌクレオチド配列をクローニングするための、第１ヌクレオチド配列の３’末端またはその近傍に位置する少なくとも１つの制限酵素認識部位、ｂ）該制限酵素認識部位に特異的な制限酵素でベクターを開裂し、プロモーター配列と第２ヌクレオチド配列領域の３’末端またはその近傍に位置する終始コドンとの間のオープンリーディングフレームが維持されるように、第２ヌクレオチド配列を制限酵素認識部位でベクター中に挿入し、ｃ）ベクターを宿主細胞に入れ、ｄ）第１および第２ヌクレオチド配列の遺伝子発現を引き起こす条件下で宿主細胞をインキュベートすることによって、キメラタンパク質を生産し、ｅ）宿主細胞からキメラタンパク質を分離し、ｆ）キメラタンパク質の特定結合パートナー部分と試験化合物との結合に好ましい条件下で、試験化合物をキメラタンパク質と接触させ、これによってキメラタンパク質と試験化合物を含む複合体を形成し、そしてｇ）特定結合パートナーに結合しうる試験化合物の存在を示すものとして、複合体の存在を特異的に検出する。５９．免疫グロブリンＨ鎖のヒンジ領域の少なくとも一部をコードする第３ヌクレオチド配列領域を、第１配列と第２配列との間に挿入して、プロモーター配列と終始コドンとの間のオープンリーディングフレームを維持する工程をさらに含む請求項５８記載の方法。６０．キメラタンパク質が少なくとも２つの異なる結合ドメインを含み、ここでここで第１ドメインは特定結合パートナーの少なくとも一部を含み、第２ドメインはエピトープまたはエピトープを認識できる免疫グロブリン鎖の少なくとも一部を含む請求項５８記載の方法。６１．第１ヌクレオチド配列が免疫グロブリン可変部の少なくとも一部をコードする請求項５８記載の方法。６２．特定結合パートナー部分が抗原、抗体、酵素、酵素基質、受容体またはリガンドと結合しうる請求項６０または６１記載の方法。６３．特定結合パートナーが以下の試験化合物の少なくとも一部と結合しうる請求項６０または６１記載の方法：成長ホルモン、ヒト成長ホルモン、ウシ成長ホルモン、上皮小体ホルモン、チロキシン、インシュリン−Ａ鎖、インシュリン− Ｂ鎖、プロインシュリン、リラクシンＡ−鎖、レプチン受容体、繊維芽細胞増殖因子、リラクシンＢ−鎖、プロリラクシン、濾胞刺激ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、黄体形成ホルモン、糖タンパク質ホルモン受容体、カルシトニン、グルカゴン、第ＶＩＩＩ因子、抗体、肺界面活性剤、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、組織プラスミノーゲン活性化因子、ボンベシン、第ＩＸ因子、トロンビン、造血細胞増殖因子、組織壊死因子α、組織壊死因子β、エンケファリナーゼヒト血清アルブミン、ムレリアン阻害物質、ゴナドトロピン関連ペプチド、βラクタマーゼ、組織因子タンパク質、インヒビチン、アクチビン、血管内皮細胞増殖因子、インテグリン受容体、トロンボポエチン、プロテインＡまたはＤ、リューマチ因子、ＮＧＦ−β、血小板増殖因子、トランスフォーミング成長因子、ＴＧＦ −α、ＴＧＦ−β、インシュリン様増殖因子ＩまたはＩＩ、インシュリン増殖因子結合タンパク質、ＣＤ４、ＣＤ８、ＤＮａｓｅ、ＲＮａｓｅ、潜伏関連ペプチド、エリスロポエチン、骨誘導性因子、インターフェロン−α、−β、−γ、コロニー刺激因子、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、幹細胞因子、インターロイキン、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、スーパーオキシドジスムターゼ、ウイルス抗原、ＨＩＶエンベロープタンパク質、ｇｐ１２０、ｇｐ１４０、免疫グロブリン、Ｉｇスーパージーンファミリーによってコードされるタンパク質、前記試験化合物のあらゆるものの天然のリガンド、受容体、もしくは基質、またはその類似体。』

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/19 5/10 Ｃ１２Ｑ 1/00 15/09 ＺＮＡ 1/70 Ｃ１２Ｑ 1/00 Ｇ０１Ｎ 33/543 ５１５Ａ 1/70 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡＧ０１Ｎ 33/543 ５１５ 5/00 Ａ

Claims

【特許請求の範囲】１．特定分子との結合能について複数の化合物をスクリーニングする方法であって、以下の工程を含んでなる方法：ａ）２以上の異なるドメインを含むキメラタンパク質と１以上の化合物を接触させ、ここで第１ドメインは前記特定分子の少なくとも一部またはそのペプチド類似体を含み、第２ドメインは以下のものからなる群から選択される１以上の領域をもつ免疫グロブリン鎖の少なくとも一部を含み：ｉ）エピトープ、およびｉｉ）エピトープを認識できる免疫グロブリン領域、ｂ）前記キメラタンパク質と前記化合物の少なくとも１つとの間に結合パートナー複合体を形成し、ｃ）少なくとも１つの化合物と結合しないキメラタンパク質分子から複合体を分離し、ｄ）結合パートナー複合体を、キメラタンパク質の第２ドメインを結合することのできる直接または間接に標識された第２分子と接触させ、そしてｅ）化合物の存在を示すものとして前記標識を検出する。２．キメラタンパク質の第１ドメインと第２ドメインが免疫グロブリンＨ鎖ヒンジ領域によって分けられている請求項１記載の方法。３．特定分子が以下のものからなる群から選択される請求項１または２記載の方法：ａ）抗原、ｂ）抗体、ｃ）酵素、ｄ）酵素基質、ｅ）受容体、およびｆ）リガンド。４．特定分子が以下のものからなる群から選択される請求項１または２記載の方法：成長ホルモン、ヒト成長ホルモン、ウシ成長ホルモン、上皮小体ホルモン、チロキシン、インシュリン−Ａ鎖、インシュリン−Ｂ鎖、プロインシュリン、リラクシンＡ−鎖、レプチン受容体、繊維芽細胞増殖因子、リラクシンＢ−鎖、プロリラクシン、濾胞刺激ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、黄体形成ホルモン、糖タンパク質ホルモン受容体、カルシトニン、グルカゴン、第ＶＩＩＩ因子、抗体、肺界面活性剤、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、組織プラスミノーゲン活性化因子、ボンベシン、第ＩＸ因子、トロンビン、造血細胞増殖因子、組織壊死因子α、組織壊死因子β、エンケファリナーゼ、ヒト血清アルブミン、ムレリアン阻害物質、ゴナドトロピン関連ペプチド、βラクタマーゼ、組織因子タンパク質、インヒビチン、アクチビン、血管内皮細胞増殖因子、インテグリン受容体、トロンボポエチン、プロテインＡまたはＤ、リューマチ因子、ＮＧＦ−β、血小板増殖因子、トランスフォーミング成長因子、ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β、インシュリン様増殖因子ＩおよびＩＩ、インシュリン増殖因子結合タンパク質、ＣＤ４、ＣＤ８、Ｄｎａｓｅ、Ｒｎａｓｅ、潜伏関連ペプチド、エリスロポエチン、骨誘導性因子、インターフェロン−α、−β、−γ、コロニー刺激因子、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、幹細胞因子、インターロイキン類、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、スーパーオキシドジスムターゼ、ウイルス抗原、ＨＩＶエンベロープタンパク質、ｇｐ１２０、ｇｐ１４０、免疫グロブリンおよびＩｇスーパージーンファミリーによってコードされるタンパク質、ならびにこれらの化合物の天然のリガンドまたは受容体。５．特定分子が腫瘍壊死因子α受容体の少なくとも一部を含む請求項４記載の方法。６．特定分子が内皮細胞増殖因子受容体の少なくとも一部を含む請求項４記載の方法。７．特定分子がトロンボポエチン受容体の少なくとも一部を含む請求項４記載の方法。８．特定分子がＴＧＦα受容体の少なくとも一部を含む請求項４記載の方法。９．特定分子がＴＧＦβ受容体の少なくとも一部を含む請求項４記載の方法。１０．特定分子がエリスロポエチン受容体の少なくとも一部を含む請求項４記載の方法。１１．特定分子がインターフェロンγ受容体の少なくとも一部を含む請求項４記載の方法。１２．特定分子がＧＭ−ＣＳＦ受容体の少なくとも一部を含む請求項４記載の方法。１３．特定分子がＧ−ＣＳＦ受容体の少なくとも一部を含む請求項４記載の方法。１４．特定分子がＩＬ−４受容体の少なくとも一部を含む請求項４記載の方法。１５．特定分子がＩＬ−６受容体の少なくとも一部を含む請求項４記載の方法。１６．特定分子がレプチン受容体の少なくとも一部を含む請求項４記載の方法。１７．特定分子が繊維芽細胞増殖因子受容体の少なくとも一部を含む請求項４記載の方法。１８．第１ドメインがキメラタンパク質の第２ドメインのアミノ末端側に位置する請求項２記載の方法。１９．第１ドメインがキメラタンパク質の第２ドメインのカルボキシ末端側に位置する請求項２記載の方法。２０．第２ドメインの免疫グロブリン部分が免疫グロブリンＨ鎖のＣ_H３領域を含む請求項１８記載の方法。２１．第２ドメインの免疫グロブリン部分が免疫グロブリンＨ鎖のＣ_H２領域を含む請求項２０記載の方法。２２．化合物を固体支持体に固定する請求項１または２記載の方法。２３．化合物が化学コンビナトリアルライブラリーの少なくとも一部を含む請求項１、２または１８記載の方法。２４．ライブラリーが以下のものから選択される群のメンバーを含む請求項２３記載の方法：ａ）天然に存在するかまたは天然に存在しないアミノ酸、ｂ）天然に存在するかまたは天然に存在しないヌクレオチド、ｃ）天然に存在するかまたは天然に存在しない糖、およびｄ）二−または多官能性の小さい有機分子。２５．固体支持体から複合体を形成しなかったキメラタンパク質を洗浄することによって工程ｃ）を実施する請求項２２記載の方法。２６．キメラタンパク質をコードする組換えＤＮＡオープンリーディングフレームを宿主細胞中で発現させることによってキメラタンパク質を産生する請求項１または２記載の方法。２７．宿主細胞がキメラタンパク質を少なくとも１つのジスルフィド結合で結合された二量体として発現し、該二量体が少なくとも２つの特定結合パートナーを含む請求項２６記載の方法。２８．化合物を、少なくとも２つの特定結合パートナーを含む二価のキメラタンパク質二量体と接触させる請求項２２記載の方法。２９．宿主細胞が第２のキメラタンパク質をコードする第２のオープンリーディングフレームを含むＤＮＡを発現し、該第２のキメラタンパク質は特定分子の少なくとも一部またはその類似体を含む第１ドメインと、以下のものからなる群から選択される領域をもつ免疫グロブリンの少なくとも一部を含む第２ドメインを含み：ｉ）エピトープ、およびｉｉ）エピトープを認識できる免疫グロブリン領域、ここで第２のキメラタンパク質は免疫グロブリンＬ鎖の少なくとも一部を含む、請求項２６記載の方法。３０．キメラタンパク質と第２のキメラタンパク質が少なくとも１つのジスルフィド結合で結合された多量体複合体中に含まれる請求項２９記載の方法。３１．キメラタンパク質と第２のキメラタンパク質の第１ドメインが同じ特定分子部分またはそのペプチド類似体を含む請求項３０記載の方法。３２．キメラタンパク質と第２のキメラタンパク質の第１ドメインが異なる特定分子部分またはそのペプチド類似体を含む請求項３０記載の方法。３３．少なくとも１つの化合物が多量体の形で存在し、結合した融合タンパク質二量体が、単量体のキメラタンパク質が単独で結合するよりも強く該化合物と結合する請求項２８記載の方法。３４．少なくとも１つの化合物が多量体の形で存在し、多量体複合体が、第１キメラタンパク質または第２キメラタンパク質のいずれかが単独で結合するよりも強く該化合物と結合する請求項３０記載の方法。３５．宿主細胞が真核生物細胞である請求項２６記載の方法。３６．宿主細胞が真核生物細胞である請求項２９記載の方法。３７．オープンリーディングフレームが、細胞から発現されるキメラタンパク質にＮ−結合した糖残基を付加するように細胞に指示をするヌクレオチド配列を含む請求項２６記載の方法。３８．固体支持体が細胞である請求項２記載の方法。３９．固体支持体がバクテリオファージ粒子である請求項２記載の方法。４０．特定分子との結合能について１以上の化合物をスクリーニングする方法であって、以下の工程を含んでなる方法：ａ）２以上の異なるドメインを含むキメラタンパク質を固体支持体に固定し、ここで第１ドメインは前記特定分子の少なくとも一部またはそのペプチド類似体を含み、第２ドメインは以下のものからなる群から選択される領域をもつ免疫グロブリン鎖の少なくとも一部を含み：ｉ）エピトープ、およびｉｉ）エピトープを認識できる免疫グロブリン領域、ここで、キメラタンパク質は、固体支持体と第２ドメインとの間の相互作用によって固体支持体に固定されており、ｂ）固定されたキメラタンパク質と前記化合物の１つまたは複数を接触させて、キメラタンパク質と特定分子に結合できる化合物との問に結合パートナー複合体を形成し、ｃ）固体支持体を洗浄して少なくとも１つの化合物と結合しないキメラタンパク質分子から複合体を分離し、ｄ）化合物の存在を示すものとしてキメラタンパク質を検出する。４１．キメラタンパク質の第１ドメインと第２ドメインが免疫グロブリンＨ鎖ヒンジ領域によって分けられている請求項４０記載の方法。４２．第１ドメインがキメラタンパク質の第２ドメインのアミノ末端側に位置する請求項４１記載の方法。４３．第１ドメインがキメラタンパク質の第２ドメインのカルボキシ末端側に位置する請求項４１記載の方法。４４．第２ドメインの免疫グロブリン部分が免疫グロブリンＨ鎖のＣ_H３領域を含む請求項４２記載の方法。４５．第２ドメインの免疫グロブリン部分が免疫グロブリンＨ鎖のＣ_H２領域を含む請求項４４記載の方法。４６．固定したキメラタンパク質がジスルフィド結合した多量体複合体である請求項４０または４１記載の方法。４７．多量体複合体が１つまたは複数の化合物の２以上の部位と結合する請求項４６記載の方法。４８．化合物が以下のものからなる群から選択されるメンバーを含む請求項４０または４１記載の方法：ａ）天然に存在するかまたは天然に存在しないアミノ酸、ｂ）天然に存在するかまたは天然に存在しないヌクレオチド、ｃ）天然に存在するかまたは天然に存在しない糖、およびｄ）二−または多官能性の小さい有機分子。４９．キメラタンパク質を、キメラタンパク質と以下のものからなる群から選択される固体支持体と結合した部分との間の結合性相互作用によって固定する請求項４０記載の方法：ａ）抗原、ｂ）抗体の少なくとも一部、ｃ）プロテインＧ、およびｄ）プロテインＡ。５０．工程ｄ）の前に化合物を固体支持体から溶出する請求項４９記載の方法。５１．特定分子が以下のものからなる群から選択される請求項４０または４１記載の方法：ａ）抗原、ｂ）抗体、ｃ）酵素、ｄ）酵素基質、ｅ）受容体、およびｆ）リガンド。５２．特定分子が以下のものからなる群から選択される請求項４０または４１記載の方法：成長ホルモン、ヒト成長ホルモン、ウシ成長ホルモン、上皮小体ホルモン、チロキシン、インシュリン−Ａ鎖、インシュリン−Ｂ鎖、プロインシュリン、リラクシンＡ−鎖、レプチン受容体、繊維芽細胞増殖因子、リラクシンＢ− 鎖、プロリラクシン、濾胞刺激ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、黄体形成ホルモン、糖タンパク質ホルモン受容体、カルシトニン、グルカゴン、第ＶＩＩＩ因子、抗体、肺界面活性剤、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、組織プラスミノーゲン活性化因子、ボンベシン、第ＩＸ因子、トロンビン、造血細胞増殖因子、組織壊死因子α、組織壊死因子β、エンケファリナーゼ、ヒト血清アルブミン、ムレリアン阻害物質、ゴナドトロピン関連ペプチド、βラクタマーゼ、組織因子タンパク質、インヒビチン、アクチビン、血管内皮細胞増殖因子、インテグリン受容体、トロンボポエチン、プロテインＡまたはＤ、リューマチ因子、ＮＧＦ−β 、血小板増殖因子、トランスフォーミング成長因子、ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β、インシュリン様増殖因子ＩおよびＩＬインシュリン増殖因子結合タンパク質、ＣＤ４、ＣＤ８、Ｄｎａｓｅ、Ｒｎａｓｅ、潜伏関連ペプチド、エリスロポエチン、骨誘導性因子、インターフェロン−α、−β、−γ、コロニー刺激因子、Ｍ− ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、幹細胞因子、インターロイキン類、ＩＬ− １、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、スーパーオキシドジスムターゼ、ウイルス抗原、ＨＩＶエンベロープタンパク質、ｇｐ１２０、ｇｐ１４０、免疫グロブリンおよびＩｇスーパージーンファミリーによってコードされるタンパク質、ならびにこれらの化合物の天然のリガンド、受容体および／または基質。５３．特定結合パートナーとの結合能について化合物をスクリーニングする方法であって、以下の工程を含んでなる方法：ａ）宿主細胞中で発現可能な組換えＤＮＡベクターを構築し、該ベクターは以下のものを含み：ｉ）抗原に結合しうる領域、抗体に結合しうる領域、および免疫グロブリン由来のヒンジ領域からなる群から選択される１以上の領域を含む免疫グロブリン鎖の少なくとも一部をコードする第１配列領域を含むオープンリーディングフレーム、およびｉｉ）該オープンリーディングフレームの上流に位置し、宿主細胞内でオープンリーディングフレームのＲＮＡ転写を指示することのできるプロモーター配列、ここで、該オープンリーディングフレームは、特定結合パートナーの少なくとも一部をコードする第２ヌクレオチド配列領域をクローニングするための、第１配列領域とプロモーター領域との間に位置する少なくとも１つの制限部位を含み、ただし第１および第２ヌクレオチド配列領域は、プロモーター配列と第１ヌクレオチド配列領域の３’末端の前でないところに位置する終始コドンとの間にあるオープンリーディングフレームを維持するようにクローニングされ、ｂ）第２ヌクレオチド配列を該制限部位でベクター中に挿入し、ｃ）ベクターを宿主細胞に入れ、ｄ）第１および第２ヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸を含むキメラタンパク質の発現を引き起こす条件下に宿主細胞をインキュベートし、ｅ）宿主細胞からキメラタンパク質を分離し、ｆ）キメラタンパク質の特定結合パートナー部分と化合物との結合に好ましい条件下で、化合物をキメラタンパク質と接触させ、そしてｇ）特定結合パートナーに結合しうる化合物の存在を示すものとして、結合した融合タンパク質：化合物の複合体の存在を特異的に検出する。５４．免疫グロブリンＨ鎖のヒンジ領域の少なくとも一部をコードする第３ヌクレオチド配列領域を、第１配列領域と第２配列領域との間に配置して、プロモーター配列と第１ヌクレオチド配列領域の３’末端またはその近傍に位置する終始コドンとの間のオープンリーディングフレームを維持する請求項５３記載の方法。５５．オープンリーディングフレームが発現時に２以上の異なるドメインを含むキメラタンパク質をコードする請求項５３記載の方法であって、ここで第１ドメインは特定結合パートナーの少なくとも一部を含み、第２ドメインは以下のものからなる群から選択される領域をもつ免疫グロブリン鎖の少なくとも一部を含む前記方法：ｉ）エピトープ、およびｉｉ）エピトープを認識できる免疫グロブリン領域。５６．特定結合パートナーが以下のものからなる群のメンバーと結合する請求項５５記載の方法：ａ）抗原、ｂ）抗体、ｃ）酵素、ｄ）酵素基質、ｅ）受容体、およびｆ）リガンド。５７．特定結合パートナーが以下のものからなる群から選択される化合物の少なくとも一部と結合する請求項５６記載の方法：成長ホルモン、ヒト成長ホルモン、ウシ成長ホルモン、上皮小体ホルモン、チロキシン、インシュリン−Ａ鎖、インシュリン−Ｂ鎖、プロインシュリン、リラクシンＡ−鎖、レプチン受容体、繊維芽細胞増殖因子、リラクシンＢ−鎖、プロリラクシン、濾胞刺激ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、黄体形成ホルモン、糖タンパク質ホルモン受容体、カルシトニン、グルカゴン、第ＶＩＩＩ因子、抗体、肺界面活性剤、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、組織プラスミノーゲン活性化因子、ボンベシン、第ＩＸ因子、トロンビン、造血細胞増殖因子、組織壊死因子α、組織壊死因子β、エンケファリナーゼ、ヒト血清アルブミン、ムレリアン阻害物質、ゴナドトロピン関連ペプチド、βラクタマーゼ、組織因子タンパク質、インヒビチン、アクチビン、血管内皮細胞増殖因子、インテグリン受容体、トロンボポエチン、プロテインＡまたはＤ、リューマチ因子、ＮＧＦ−β、血小板増殖因子、トランスフォーミング成長因子、ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β、インシュリン様増殖因子ＩおよびＩＩ、インシュリン増殖因子結合タンパク質、ＣＤ４、ＣＤ８、Ｄｎａｓｅ、Ｒｎａｓｅ、潜伏関連ペプチド、エリスロポエチン、骨誘導性因子、インターフェロン−α、 −β、−γ、コロニー刺激因子、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、幹細胞因子、インターロイキン類、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ − ５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ −１２、スーパーオキシドジスムターゼ、ウイルス抗原、ＨＩＶエンベロープタンパク質、ｇｐ１２０、ｇｐ１４０、免疫グロブリンおよびＩｇスーパージーンファミリーによってコードされるタンパク質、ならびにこれらの化合物の天然のリガンド、受容体および／またはこれらの化合物の基質、ならびにこれらの化合物、受容体及びその基質の類似体。５８．特定結合パートナーとの結合能について化合物をスクリーニングする方法であって、以下の工程を含んでなる方法：ａ）宿主細胞中で発現可能な組換えＤＮＡベクターを構築し、該ベクターは以下のものを含み：ｉ）免疫グロブリン鎖の少なくとも一部をコードする第１配列領域を含むオープンリーディングフレーム、およびｉｉ）該オープンリーディングフレームの上流に位置し、宿主細胞内でオープンリーディングフレームのＲＮＡ転写を指示することのできるプロモーター配列、ここで、該オープンリーディングフレームは、特定結合パートナーの少なくとも一部をコードする第２ヌクレオチド配列領域をクローニングするための、第１配列領域の３’末端またはその近傍に位置する少なくとも１つの制限部位を含み、ただし第１および第２ヌクレオチド配列領域は、プロモーター配列と第２ヌクレオチド配列領域の３’末端の前でないところに位置する終始コドンとの間にあるオープンリーディングフレームを維持するようにクローニングされ、ｂ）第２ヌクレオチド配列を該制限部位でベクター中に挿入し、ｃ）ベクターを宿主細胞に入れ、ｄ）第１および第２ヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸を含むキメラタンパク質の発現を引き起こす条件下に宿主細胞をインキュベートし、ｅ）宿主細胞からキメラタンパク質を分離し、ｆ）キメラタンパク質の特定結合パートナー部分と化合物との結合に好ましい条件下で、化合物をキメラタンパク質と接触させ、そしてｇ）特定結合パートナーに結合しうる化合物の存在を示すものとして、結合した融合タンパク質：化合物の複合体の存在を特異的に検出する。５９．免疫グロブリンＨ鎖のヒンジ領域の少なくとも一部をコードする第３ヌクレオチド配列領域を、第１配列領域と第２配列領域との間に配置して、プロモーター配列と第２ヌクレオチド配列領域の３’末端またはその近傍に位置する終始コドンとの間のオープンリーディングフレームを維持する請求項５８記載の方法。６０．第１ヌクレオチド領域オープンリーディングフレームが発現時に２以上の異なるドメインを含むキメラタンパク質をコードする請求項５９記載の方法であって、ここで第１ドメインは特定結合パートナーの少なくとも一部を含み、第２ドメインは以下のものからなる群から選択される領域をもつ免疫グロブリン鎖の少なくとも一部を含む前記方法：ｉ）エピトープ、およびｉｉ）エピトープを認識できる免疫グロブリン領域。６１．第１ヌクレオチド配列領域が免疫グロブリン可変部の少なくとも一部をコードする請求項６０記載の方法。６２．特定結合パートナーが以下のものからなる群のメンバーと結合する請求項６０または６１記載の方法：ａ）抗原、ｂ）抗体、ｃ）酵素、ｄ）酵素基質、ｅ）受容体、およびｆ）リガンド。６３．特定結合パートナーが以下のものからなる群から選択される化合物の少なくとも一部と結合する請求項６０または６１記載の方法：成長ホルモン、ヒト成長ホルモン、ウシ成長ホルモン、上皮小体ホルモン、チロキシン、インシュリン −Ａ鎖、インシュリン−Ｂ鎖、プロインシュリン、リラクシンＡ−鎖、レプチン受容体、繊維芽細胞増殖因子、リラクシンＢ−鎖、プロリラクシン、濾胞刺激ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、黄体形成ホルモン、糖タンパク質ホルモン受容体、カルシトニン、グルカゴン、第ＶＩＩＩ因子、抗体、肺界面活性剤、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、組織プラスミノーゲン活性化因子、ボンベシン、第ＩＸ因子、トロンビン、造血細胞増殖因子、組織壊死因子α、組織壊死因子β、エンケファリナーゼ、ヒト血清アルブミン、ムレリアン阻害物質、ゴナドトロピン関連ペプチド、βラクタマーゼ、組織因子タンパク質、インヒビチン、アクチビン、血管内皮細胞増殖因子、インテグリン受容体、トロンボポエチン、プロテインＡまたはＤ、リューマチ因子、ＮＧＦ−β、血小板増殖因子、トランスフォーミング成長因子、ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β、インシュリン様増殖因子ＩおよびＩＩ、インシュリン増殖因子結合タンパク質、ＣＤ４、ＣＤ８、Ｄｎａｓｅ、Ｒｎａｓｅ、潜伏関連ペプチド、エリスロポエチン、骨誘導性因子、インターフェロン−α、−β、−γ、コロニー刺激因子、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、幹細胞因子、インターロイキン類、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ− ４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ− ＩＬＩＬ−１２、スーパーオキシドジスムターゼ、ウイルス抗原、ＨＩＶエンベロープタンパク質、ｇｐ１２０、ｇｐ１４０、免疫グロブリンおよびＩｇスーパージーンファミリーによってコードされるタンパク質、ならびにこれらの化合物の天然のリガンド、受容体および／またはこれらの化合物の基質、ならびにこれらの化合物、受容体及びその基質の類似体。