JP2014531425A - 肥満の代謝異常を治療するためのＣａＭＫＩＩ、ＩＰ３Ｒ、カルシニューリン、ｐ３８、およびＭＫ２／３阻害剤 - Google Patents

肥満の代謝異常を治療するためのＣａＭＫＩＩ、ＩＰ３Ｒ、カルシニューリン、ｐ３８、およびＭＫ２／３阻害剤 Download PDF

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Abstract

本発明は、対象における代謝障害を治療または予防する方法、代謝障害を有する対象における冠動脈疾患を治療または予防する方法、ならびに対象における肝臓のグルコース生成を低減させる方法に関する。このような方法には、限定されないが、ＣａＭＫＩＩ、ＩＰ３Ｒ、カルシニューリン、ｐ３８、ＭＫ２／３、またはそれらの任意の組み合わせの阻害剤を対象に投与することが含まれる。本発明は、また、ＣａＭＫＩＩ、ＩＰ３Ｒ、カルシニューリン、ｐ３８、もしくはＭＫ２／３の活性を阻害するか、またはＣａＭＫＩＩ、ＩＰ３Ｒ、カルシニューリン、ｐ３８、もしくはＭＫ２／３の活性および／もしくは活性化を低減させる化合物を識別する方法を提供する。【選択図】 図２Ｃ

Description

本出願は、２０１１年９月２日に出願された米国仮出願第６１／５３０，８５１号、２０１２年３月３０日に出願された米国仮出願第６１／６１８，５５１号、２０１２年４月６日に出願された米国仮出願第６１／６２１，４０７号、２０１２年７月２６日に出願された米国仮出願第６１／６７６，０９１号、および２０１２年７月２６日に出願された米国仮出願第６１／６７６，１５２号に対する優先権を主張し、これらの全ては、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本特許の開示は、著作権保護の対象となる要素を含む。著作権所有者は、米国特許商標庁の特許包袋または記録で見られるような特許文書または特許開示のいずれのものによる複写生成にも異存はないが、それ以外については、いかなる著作権の権利も留保する。
本明細書に引用される全ての特許、特許出願、および公開は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。これらの出版物の開示の全体は、本明細書に記載される発明の日付において、当業者に既知の最先端技術をより完全に記載するために、参照により本明細書に組み込まれる。
政府支援
本発明は、国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）および国立心肺血液研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｈｅａｒｔ，Ｌｕｎｇ ａｎｄ Ｂｌｏｏｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）によって付与された認可番号Ｐ０１ ＨＬ０８７１２３号のもとに、政府の支援によりなされた。したがって、米国政府は本発明に一定の権利を有する。
肥満に誘発されるインスリン耐性ならびに肝臓のグルコースおよび脂肪の代謝における異常は、心臓疾患、癌、ならびに他の広範囲および深刻な疾患の危険性を増加させる。現在の治療の選択肢は非常に限られており、重大な満たされない臨床的必要性が現在の肥満蔓延における何億もの過体重の人々に影響を及ぼすことにつながっている。肥満に誘発されるインスリン耐性ならびに肝臓のグルコースおよび脂肪の代謝における異常を治療および診断するための方法に対する必要性が存在する。本発明は、これらの必要性に取り組む。
本開示は、代謝障害の治療および／または予防のための方法を提供する。本開示はまた、対象における代謝障害の治療および／または予防のための化合物または化合物の組み合わせを識別するための方法を提供する。
本開示は、代謝障害の治療および／または予防のための方法を提供する。一態様において、本開示は、対象における代謝障害を治療または予防する方法であって、障害は肥満によって誘発され、方法は、ＣａＭＫＩＩの活性を低減させ、それによって障害を治療または予防することを含む、方法を提供する。一実施形態において、障害は、１型糖尿病、２型糖尿病、インスリン耐性、および代謝症候群からなる群から選択される。別の実施形態において、治療または予防は、対象におけるグリコーゲン分解またはグルコース新生に影響を及ぼす。一実施形態において、治療または予防は、対象における肝臓のグルコース生成、高血糖、脂肪肝、インスリン耐性、インスリン耐性に関連する炎症、インスリン耐性に関連する脂質異常症、またはそれらの任意の組み合わせを低減させる。別の実施形態において、治療または予防は、ＣａＭＫＩＩのリン酸化および／または活性化を低減させる。一実施形態において、ＣａＭＫＩＩの活性は、グルカゴンに誘発される活性である。一実施形態において、治療または予防は、対象の細胞におけるＧ６ｐｃおよび／またはＰｃｋ１の発現を低減させる。別の実施形態において、治療または予防は、対象の細胞核中のＦｏｘＯ１タンパク質レベルの量を低減させる。別の実施形態において、治療または予防は、ＦｏｘＯ１タンパク質のアミノ酸Ｓ２８４、Ｓ２９５、Ｓ３２６、Ｓ４６７、Ｓ４７５、Ｓ２４６、Ｓ２５３、Ｓ４１３、もしくはＳ４１５、またはそれらの任意の組み合わせのリン酸化を低減する。
別の態様において、本開示は、代謝障害を有する対象における冠動脈疾患の治療または予防の方法であって、対象におけるＣａＭＫＩＩの活性を低減させ、それによって冠動脈疾患を治療または予防することを含む、方法を提供する。一実施形態において、障害は、１型糖尿病、２型糖尿病、インスリン耐性、および代謝症候群からなる群から選択される。別の実施形態において、治療または予防は、対象におけるグリコーゲン分解またはグルコース新生に影響を及ぼす。一実施形態において、治療または予防は、対象における肝臓のグルコース生成、高血糖、脂肪肝、インスリン耐性、インスリン耐性に関連する炎症、インスリン耐性に関連する脂質異常症、またはそれらの任意の組み合わせを低減させる。別の実施形態において、治療または予防は、ＣａＭＫＩＩのリン酸化および／または活性化を低減させる。一実施形態において、ＣａＭＫＩＩの活性は、グルカゴンに誘発される活性である。一実施形態において、治療または予防は、対象の細胞におけるＧ６ｐｃおよび／またはＰｃｋ１の発現を低減させる。別の実施形態において、治療または予防は、対象の細胞核におけるＦｏｘＯ１タンパク質レベルの量を低減させる。別の実施形態において、治療または予防は、ＦｏｘＯ１タンパク質のアミノ酸Ｓ２８４、Ｓ２９５、Ｓ３２６、Ｓ４６７、Ｓ４７５、Ｓ２４６、Ｓ２５３、Ｓ４１３、もしくはＳ４１５、またはそれらの任意の組み合わせのリン酸化を低減する。一実施形態において、治療または予防は、対象のマクロファージにおけるＣａＭＫＩＩ活性を低減させることを含む。
一実施形態において、冠動脈疾患は、アテローム発生および／またはアテローム性動脈硬化症と関連する。別の実施形態において、本方法は、心不全、高血圧、および／または腎疾患を治療または予防することをさらに含む。別の実施形態において、障害は、進行病変のマクロファージのアポトーシスと関連する。別の実施形態において、障害は、プラーク壊死と関連する。別の実施形態において、代謝障害を有する対象における冠動脈疾患の治療または予防は、高インスリン血症および／または脂質異常症の低下をもたらす。別の実施形態において、対象における冠動脈疾患の治療または予防は、アテローム発生および／またはアテローム性動脈硬化症の低下をもたらす。
一実施形態において、治療または予防は、対象にＣａＭＫＩＩタンパク質をコードする遺伝子の発現を低減させる、アンチセンスＲＮＡを投与するステップを含む。別の実施形態において、治療または予防は、対象にＣａＭＫＩＩタンパク質に特異的に結合するペプチドまたはポリペプチドを投与するステップを含む。別の実施形態において、治療または予防は、対象に小分子を投与するステップを含む。一実施形態において、小分子は、ＫＮ−９３、ラベンダスチンＣ、ＣＫ５９、Ａｎｔ−ＣａＭＫＩＩＮｔｉｄｅ、ＫＮ６２、ＤＹ９７６０ｅ、Ｋ−２５２ａノカルジオプシスｓｐ．、Ｈ８９ジヒドロクロリド、ＰＰ１アナログＩＩ、１ＮＭ−ＰＰ１、ｅＥＦ−２キナーゼ阻害剤ＮＨ１２５、およびＳＴＯ−６０９からなる群から選択される、ＣａＭＫＩＩ阻害剤である。
別の態様において、本開示は、対象における肝臓のグルコース生成を低減させる方法であって、ＣａＭＫＩＩの活性を低減させ、それによって対象における肝臓のグルコースの低減をもたらすことを含む、方法を提供する。一実施形態において、肝臓のグルコース生成の低減は、ＣａＭＫＩＩのリン酸化および／または活性化を低減させる。別の実施形態において、ＣａＭＫＩＩの活性は、グルカゴンに誘発される活性である。別の実施形態において、肝臓のグルコース生成の低減は、対象の細胞におけるＧ６ｐｃおよび／またはＰｃｋ１の発現を低減させる。一実施形態において、肝臓のグルコース生成の低減は、対象における肝臓のグルコース生成、高血糖、脂肪肝、インスリン耐性、インスリン耐性に関連する炎症、インスリン耐性に関連する脂質異常症、またはそれらの任意の組み合わせを低減させる。別の実施形態において、肝臓のグルコース生成の低減は、対象の細胞核におけるＦｏｘＯ１タンパク質レベルの量を低減させる。別の実施形態において、肝臓のグルコース生成の低減は、ＦｏｘＯ１タンパク質のアミノ酸Ｓ２８４、Ｓ２９５、Ｓ３２６、Ｓ４６７、Ｓ４７５、Ｓ２４６、Ｓ２５３、Ｓ４１３、もしくはＳ４１５、またはそれらの任意の組み合わせのリン酸化を低減させる。
一実施形態において、肝臓のグルコース生成の低減は、対象にＣａＭＫＩＩタンパク質をコードする遺伝子の発現を低減させるアンチセンスＲＮＡを投与するステップを含む。別の実施形態において、肝臓のグルコース生成の低減は、対象にＣａＭＫＩＩタンパク質に特異的に結合するペプチドまたはポリペプチドを投与するステップを含む。別の実施形態において、肝臓のグルコース生成の低減は、対象に小分子を投与するステップを含む。一実施形態において、小分子は、ＫＮ−９３、ラベンダスチンＣ、ＣＫ５９、Ａｎｔ−ＣａＭＫＩＩＮｔｉｄｅ、ＫＮ６２、ＤＹ９７６０ｅ、Ｋ−２５２ａノカルジオプシスｓｐ．、Ｈ８９ジヒドロクロリド、ＰＰ１アナログＩＩ、１ＮＭ−ＰＰ１、ｅＥＦ−２キナーゼ阻害剤ＮＨ１２５、およびＳＴＯ−６０９からなる群から選択される、ＣａＭＫＩＩ阻害剤である。
別の態様において、本開示は、ＣａＭＫＩＩの活性を阻害する化合物を識別するための方法であって、ａ）細胞をＣａＭＫＩＩ融合タンパク質と接触させることであって、ＣａＭＫＩＩ融合タンパク質は、一端にアクセプターフルオロフォアタンパク質と、他端にドナーフルオロフォアタンパク質とを含むことと、ｂ）試験化合物の不在下および存在下において、ＦＲＥＴ効率を測定することであって、試験化合物の非存在下におけるＦＲＥＴ効率と比較して、試験化合物の存在下においてより高いＦＲＥＴ効率は、試験化合物がＣａＭＫＩＩの活性を阻害することを示す。
一実施形態において、アクセプターフルオロフォアタンパク質は、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、Ｖｅｎｕｓ、黄色蛍光タンパク質、シアン蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、および緑色蛍光タンパク質からなる群から選択される。
別の実施形態において、細胞は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、肝細胞、Ｕ２ＯＳ細胞、ＨｅＬａ細胞、マウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）、またはマクロファージである。別の実施形態において、細胞は、Ｉｎｓｒ−／−マウス、Ｃａｍｋ２ｇ−／−マウス、Ｆｏｘｏ１−／−マウス、ｄｂ／ｄｂマウス、ｏｂ／ｏｂマウス、ｐ３８−／−マウス、非肥満糖尿病（ＮＯＤ）マウス、高脂肪食を与えたマウス、またはストレプトゾトシン処置マウスに由来する。別の実施形態において、細胞は、突然変異ＦｏｘＯ１タンパク質を発現するマウスに由来する。一実施形態において、突然変異ＦｏｘＯ１タンパク質は、Ｓ２８４、Ｓ２９５、Ｓ３２６、Ｓ４６７、Ｓ４７５、Ｓ２４６、Ｓ２５３、Ｓ４１３、もしくはＳ４１５にアラニン置換、またはＳ２８４、Ｓ２９５、Ｓ３２６、Ｓ４６７、Ｓ４７５、Ｓ２４６、Ｓ２５３、Ｓ４１３、もしくはＳ４１５にアスパラギン酸置換、またはそれらの任意の組み合わせを含む。
一実施形態において、細胞は、ＥＲストレスに供される。別の実施形態において、細胞は、グルカゴン、８−ブロモｃＡＭＰ、Ｈ８９ジヒドロクロリド、ゼストスポンジンＣ、ホルスコリン、飽和脂肪酸、またはそれらの任意の組み合わせで処置される。
一態様において、本開示は、対象における代謝障害を治療または予防する方法であって、障害は肥満によって誘発され、方法は、ＩＰ３Ｒ１、ＩＰ３Ｒ２、またはＩＰ３Ｒ３の活性を低減させ、それによって障害を治療または予防することを含む、方法を提供する。別の態様において、本開示は、対象における代謝障害を治療または予防する方法であって、障害は肥満によって誘発され、方法は、カルシニューリンの活性を低減させ、それによって障害を治療または予防することを含む、方法を提供する。
一実施形態において、障害は、１型糖尿病、２型糖尿病、インスリン耐性、肥満、および代謝症候群からなる群から選択される。
別の実施形態において、治療または予防は、対象におけるグリコーゲン分解またはグルコース新生に影響を及ぼす。
一実施形態において、治療または予防は、対象における肝臓のグルコース生成、高血糖、脂肪肝、インスリン耐性、インスリン耐性に関連する炎症、インスリン耐性に関連する脂質異常症、またはそれらの任意の組み合わせを低減させる。
一実施形態において、治療または予防は、対象にＩＰ３Ｒ１タンパク質、ＩＰ３Ｒ２タンパク質、ＩＰ３Ｒ３タンパク質をコードする遺伝子の発現を低減させる、アンチセンスＲＮＡを投与するステップを含む。別の実施形態において、治療または予防は、対象に、ＩＰ３Ｒ１タンパク質、ＩＰ３Ｒ２タンパク質、またはＩＰ３Ｒ３タンパク質に特異的に結合するペプチドまたはポリペプチドを投与するステップを含む。
一実施形態において、治療または予防は、対象に小分子を投与するステップを含む。一実施形態において、小分子は、ＩＰ３Ｒ１タンパク質阻害剤、ＩＰ３Ｒ２タンパク質阻害剤、またはＩＰ３Ｒ３タンパク質阻害剤である。
一実施形態において、治療または予防は、対象にカルシニューリンタンパク質をコードする遺伝子の発現を低減させる、アンチセンスＲＮＡを投与するステップを含む。別の実施形態において、治療または予防は、対象にカルシニューリンタンパク質に特異的に結合するペプチドまたはポリペプチドを投与するステップを含む。
一実施形態において、治療または予防は、対象に小分子を投与するステップを含む。別の実施形態において、小分子は、カルシニューリン阻害剤である。
別の態様において、本開示は、ＩＰ３Ｒ１、ＩＰ３Ｒ２、またはＩＰ３Ｒ３の活性を阻害する化合物を識別するための方法であって、ａ）細胞を試験化合物と接触させることと、ｂ）ＩＰ３Ｒ１、ＩＰ３Ｒ２、またはＩＰ３Ｒ３の活性を測定することであって、化合物の不在下におけるＩＰ３Ｒ１、ＩＰ３Ｒ２、またはＩＰ３Ｒ３の活性と比較して、化合物の存在下におけるＩＰ３Ｒ１、ＩＰ３Ｒ２、またはＩＰ３Ｒ３の活性の低減は、化合物が、それぞれ、ＩＰ３Ｒ１、ＩＰ３Ｒ２、またはＩＰ３Ｒ３の阻害剤であることを示すことと、を含む、方法を提供する。
一実施形態において、活性は、ＩＰ３の誘発物質での刺激後、細胞のサイトゾルへのカルシウム放出によって測定される。一実施形態において、カルシウム放出は、サイトゾルカルシウム染料の蛍光の増加によって測定される。一実施形態において、サイトゾルカルシウム染料は、Ｆｌｕｏ−３である。
別の態様において、本開示は、カルシニューリンの活性を阻害する化合物を識別するための方法であって、ａ）細胞を試験化合物と接触させることと、ｂ）カルシニューリン活性を測定することであって、化合物の不在下におけるカルシニューリンの活性と比較して、化合物の存在下におけるカルシニューリンの活性の低減は、化合物が、カルシニューリンの阻害剤であることを示すことと、を含む、方法を提供する。
一実施形態において、カルシニューリンの活性は、カルシニューリン基質ペプチドを使用して、ホスファターゼ活性の検出を通じて測定される。一実施形態において、細胞は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、肝細胞、Ｕ２ＯＳ細胞、ＨｅＬａ細胞、またはマウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）である。別の実施形態において、細胞は、ｄｂ／ｄｂマウス、ｏｂ／ｏｂマウス、非肥満糖尿病（ＮＯＤ）マウス、高脂肪食を与えたマウス、またはストレプトゾトシン処置マウスに由来する。
一実施形態において、細胞は、グルカゴン、Ｈ８９ジヒドロクロリド、インスリン、ホルスコリン、ＥＲストレスの誘発物質、ツニカマイシン、飽和脂肪酸、またはそれらの任意の組み合わせで処置される。
別の態様において、本開示は、対象における代謝障害を治療または予防する方法であって、障害は肥満によって誘発され、方法は、ｐ３８の活性を低減させ、それによって障害を治療または予防することを含む、方法を提供する。別の態様において、本開示は、対象における代謝障害を治療または予防する方法であって、障害は肥満によって誘発され、方法は、ＭＫ２／３の活性を低減させ、それによって障害を治療または予防することを含む、方法を提供する。
一実施形態において、障害は、１型糖尿病、２型糖尿病、インスリン耐性、肥満、および代謝症候群からなる群から選択される。
一実施形態において、治療または予防は、対象におけるグリコーゲン分解またはグルコース新生に影響を及ぼす。別の実施形態において、治療または予防は、対象において、肝臓のグルコース生成、高血糖、脂肪肝、インスリン耐性、インスリン耐性に関連する炎症、インスリン耐性に関連する脂質異常症、またはそれらの任意の組み合わせを低減させる。
一実施形態において、治療または予防は、対象にｐ３８タンパク質をコードする遺伝子の発現を低減させる、アンチセンスＲＮＡを投与するステップを含む。別の実施形態において、治療または予防は、対象にｐ３８タンパク質に特異的に結合するペプチドまたはポリペプチドを投与するステップを含む。別の実施形態において、治療または予防は、対象に小分子を投与するステップを含む。一実施形態において、小分子は、ｐ３８阻害剤である。
一実施形態において、治療または予防は、対象にＭＫ２／３タンパク質をコードする遺伝子の発現を低減させる、アンチセンスＲＮＡを投与するステップを含む。別の実施形態において、治療または予防は、対象にＭＫ２／３タンパク質に特異的に結合するペプチドまたはポリペプチドを投与するステップを含む。一実施形態において、治療または予防は、対象に小分子を投与するステップを含む。一実施形態において、小分子は、ＭＫ２／３阻害剤である。
別の態様において、本開示は、ｐ３８の活性を阻害する化合物を識別するための方法であって、ａ）細胞を試験化合物と接触させることと、ｂ）ｐ３８キナーゼ活性を測定することであって、化合物の不在下におけるｐ３８のキナーゼ活性と比較して、化合物の存在下におけるｐ３８のキナーゼ活性の低減は、化合物がｐ３８の阻害剤であることを示すことと、を含む、方法を提供する。別の態様において、本開示は、ＭＫ２／３の活性を阻害する化合物を識別するための方法であって、ａ）細胞を試験化合物と接触させることと、ｂ）ＭＫ２／３キナーゼ活性を測定することであって、化合物の不在下におけるＭＫ２／３のキナーゼ活性と比較して、化合物の存在下におけるＭＫ２／３のキナーゼ活性の低減は、化合物がＭＫ２／３の阻害剤であることを示すことと、を含む、方法を提供する。
一実施形態において、ｐ３８キナーゼ活性は、ｐ３８特異的ペプチドを使用して測定される。一実施形態において、ＭＫ２／３キナーゼ活性は、ＭＫ２／３特異的ペプチドを使用して測定される。
一実施形態において、細胞は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、肝細胞、Ｕ２ＯＳ細胞、ＨｅＬａ細胞、マクロファージ、またはマウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）である。別の実施形態において、細胞は、Ｉｎｓｒ−／−マウス、ｄｂ／ｄｂマウス、ｏｂ／ｏｂマウス、非肥満糖尿病（ＮＯＤ）マウス、高脂肪食を与えたマウス、またはストレプトゾトシン処置マウスに由来する。別の実施形態において、細胞は、グルカゴン、８−ブロモｃＡＭＰ、Ｈ８９ジヒドロクロリド、ホルスコリン、飽和脂肪酸、またはそれらの任意の組み合わせで処置される。
本発明のこれらおよび他の実施形態は、以下の説明および添付の図面と併せて考えると、より明らかとなり理解されるであろう。しかしながら、以下の説明は、本発明の種々の実施形態および多数の具体的なそれらの詳細を示すが、制限ではなく例示の目的で提供されることを理解されたい。多数の置き換え、修正、追加、および／または再配置が、本発明の範囲内で、その精神から逸脱することなくなされ得、本発明は、全てのこのような置き換え、修正、追加、および／または再配置を含む。
グルカゴンおよび絶食は、肝臓のＣａＭＫＩＩを活性化する。図１Ａ．ＣａＭＫＩＩ酵素活性を、示される時間、１００ｎＭグルカゴン（Ｇｌｕｃ）またはビヒクル対照（Ｖｅｈ）で刺激した初代マウスＨＣの３通りのウェルにおいてアッセイした（ビヒクルと対比して＊Ｐ＜０．０５および＊＊Ｐ＜０．０１、平均±標準誤差）。図１Ｂ〜１Ｊ．ＨＣまたは肝臓の抽出物を、免疫ブロットアッセイによって、リン酸化ＣａＭＫＩＩ、全ＣａＭＫＩＩ、およびβ−アクチンについて調べた。図１Ｂ．ＨＣを、示される時間、００ｎＭグルカゴンとともにインキュベートした；図１Ｃ．グルカゴンを、ビヒクル対照（Ｖｅｈ）または５μＭ ＢＡＰＴＡ−ＡＭで１時間事前処置したＨＣに添加した；図１Ｄ．グルカゴンを、０．５μＭゼストスポンジン（ＸｅｓＣ）で事前処置したＨＣ、またはアデノ−ＬａｃＺ対照もしくはアデノ−Ｃｒｅを形質導入したＩｐ３ｒ１ｆｌ／ｆｌマウス由来のＨＣに添加した（棒グラフ＝Ｉｐ３ｒ１ ｍＲＮＡレベル）、図１Ｅ．グルカゴンを、ビヒクル対照（Ｖｅｈ）または１０μＭ Ｈ８９で１時間事前処置したＨＣに添加した。図１Ｆ．ＨＣを、示される時間、１００μＭ ８−ブロモ−ｃＡＭＰとともにインキュベートした。図１Ｇ〜１Ｊ．インビボ実験。図１Ｇにおいて、マウスを、２００μｇ ｋｇ−１（体重）のグルカゴンで３０分間腹腔内処置し、図１Ｈでは、マウスを、グルカゴン処置の４日前に、１０ｐｍｏｌ ｇ−１ゼストスポンジンＣまたはビヒクル対照で、腹腔内事前処置した。図１Ｉ〜１Ｊにおいて、マウスを、自由に給餌させたかもしくは１２時間絶食させた、または１２時間絶食させて次いで４時間再給餌させた。 ＣａＭＫＩＩは、初代肝細胞におけるグルコース生成および肝臓Ｇ６ＰｃおよびＰｃｋ１の発現を調節する。図２Ａ、初代マウス肝細胞に、２０のＭＯＩで、ＬａｃＺ、ＣＡ−ＣａＭＫＩＩ、またはＫ４３Ａ−ＣａＭＫＩＩを発現するアデノウイルスベクターを形質導入した。細胞を、一晩血清枯渇させ、次いで、血清およびグルコース不含培地中で、ホルスコリン（１０μｍ）とともに１４時間インキュベートした。グルコース含量を、記載のように測定した。図２Ｂ、ＷＴおよびＣａｍｋ２ｇ−／−肝細胞を使用したことを除き、図２Ａと同様である。図２Ｃ、初代マウス肝細胞に、ＬａｃＺ、ＣＡ−ＣａＭＫＩＩ、またはＫ４３Ａ−ＣａＭＫＩＩを発現するアデノウイルスベクターを、２０のＭＯＩで感染させた。細胞を、一晩血清枯渇させ、次いで、血清不含培地中で、ホルスコリン（１０μｍ）とともに５時間インキュベートした。ＲＮＡを単離し、遺伝子発現を、実時間Ｑ−ＰＣＲによって分析した。（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１）図２Ｄ、ＷＴおよびＣａｍｋ２ｇ−／−マウスに由来する初代肝細胞を、一晩血清枯渇させ、血清不含培地中でホルスコリン（１０μｍ）とともに５時間インキュベートした。ＲＮＡを、実時間Ｑ−ＰＣＲによって、Ｇ６ｐｃおよびＰｃｋ１ ｍＲＮＡについてアッセイした。（＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００５）。図２Ｅ．グルカゴン（１００ｎｍ）を使用してグルコース新生を刺激したことを除き、図２Ｄと同様である。（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１） ＣａＭＫＩＩは、初代肝細胞における肝臓ＦｏｘＯ１の細胞内局在化を調節する。図３Ａ、ＷＴおよびＣａｍｋ２ｇ−／−マウスに由来する初代肝細胞に、２のＭＯＩで、マウスＧＦＰ−ＦｏｘＯ１を発現するアデノウイルスを形質導入した。細胞を、一晩血清枯渇させ、次いで、血清不含培地中で５時間インキュベートした。ＦｏｘＯ１の細胞内局在化を、間接免疫蛍光法によって評価した。バー１０μｍ。データを、右側のパネルに定量化した。（＊＊＊＊Ｐ＜０．０００５）。図３Ｂ、初代マウス肝細胞に、２０のＭＯＩで、ＬａｃＺ、ＣＡ−ＣａＭＫＩＩ、またはＫ４３Ａ−ＣａＭＫＩＩを発現するアデノウイルスベクターを形質導入した。４時間後、細胞に、５のＭＯＩでマウスＧＦＰ−ＦｏｘＯ１アデノウイルスを感染させた。細胞を、一晩血清枯渇させ、次いで、血清不含培地中で５時間インキュベートした。ＦｏｘＯ１の細胞内局在化を、続いて、間接免疫蛍光法によって評価した。バー５μｍ。データを、下のパネルに定量化した。（＊＊＊＊Ｐ＜０．０００５、＃＃＃＃Ｐ＜０．０００５）。図３Ｃ、初代マウス肝細胞に、ＬａｃＺまたはＣＡ−ＣａＭＫＩＩを発現するアデノウイルスベクターを感染させた。核抽出物を、免疫ブロットによってＦｏｘＯ１およびヌクレオホスミン（核充填対照（ｎｕｃｌｅａｒ ｌｏａｄｉｎｇ ｃｏｎｔｒｏｌ））についてアッセイした。 ＣａＭＫＩＩγ欠損は、血中グルコース、Ｇ６ｐｃおよびＰｃｋ１の発現、ならびに核内ＦｏｘＯ１を減少させる。図４Ａ、１２時間絶食させた８週齢のＷＴおよびＣａｍｋ２ｇ−／−マウスの血中グルコース濃度。（＊Ｐ＜０．０５）図４Ｂ、８〜１０週齢のＷＴおよびＣａｍｋ２ｇ−／−マウスを、１８時間絶食させて、次いでピルビン酸塩（２ｍｇ ｋｇ−１）でチャレンジした。（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００５）図４Ｃ、１２時間絶食させたＷＴおよびＣａｍｋ２ｇ−／−マウスにおける肝臓Ｇ６ｐｃおよびＰｃｋ１遺伝子の発現レベル。（＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１）図４Ｄ、肝臓核抽出物を、免疫ブロットによってＦｏｘＯ１およびヌクレオホスミンについてアッセイしたことを除き、図４Ｃと同様である。これらのデータの濃度測定的定量化を、下のパネルに示す。（＊＊＊Ｐ＜０．００１） ＣａＭＫＩＩの急性阻害は、血中グルコース、Ｇ６ｐｃおよびＰｃｋ１の発現、ならびに核内ＦｏｘＯ１を減少させる。９週齢のＷＴマウスに、尾静脈を通じて、対照ＬａｃＺ（ｎ＝５）またはＫ４３Ａ−ＣａＭＫＩＩ（ｎ＝５）のいずれかを含有する１．５×１０９ｐｆｕのアデノウイルスを注射した。図５Ａ、１２時間の絶食の５日後の血中グルコースレベル。（＊＊＊Ｐ＜０．００１）図５Ｂ、１２時間絶食させたマウスにおける肝臓のグルコース新生遺伝子の発現。（＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１）。図５Ｃ．肝臓核抽出物を、免疫ブロットによってＦｏｘＯ１およびヌクレオホスミンについてアッセイしたことを除き、図５Ｂと同様である。図５Ｄ、肝臓グリコーゲン含量。図５Ｅ〜５Ｆ、ＬａｃＺまたはＫ４３Ａ−ＣａＭＫＩＩで処置したマウスに、２００μｇ ｋｇ−１（体重）のグルカゴンを腹腔内注射し、３０分後に殺処理した。肝臓Ｇ６ｐｃ ｍＲＮＡをアッセイし、肝臓切片を、ＰＡＳ染色によってグリコーゲン含量について試験し、それを、ＰＡＳ陽性肝細胞の割合として定量化した（ｎ＝４匹のマウス）。バー２０μｍ。 構造的に活性なＣａＭＫＩＩは、血中グルコース、Ｇ６ｐｃおよびＰｃｋ１の発現、ならびに核内ＦｏｘＯ１を増加させる。９週齢のＷＴマウスに、対照ＬａｃＺ（ｎ＝５）またはＣＡ−ＣａＭＫＩＩ（ｎ＝５）のいずれかを含有する１．５×１０９ｐｆｕのアデノウイルスを注射した。図６Ａ、血中グルコースを、１２時間の絶食の６日後にアッセイした。（＊Ｐ＜０．０５）図６Ｂ、ピルビン酸塩チャレンジ試験を、１７時間絶食させたマウスにおいて実行した（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００５）図６Ｃ Ｇ６ｐｃおよびＰｃｋ１ ｍＲＮＡレベルを、１２時間絶食させたマウス（＊Ｐ＜０．０５）または自由に給餌させたマウス（＊Ｐ＜０．０５、＊＊＊Ｐ＜０．００５）においてアッセイした。図６Ｄ、肝臓核抽出物を、対照ＬａｃＺ（ｎ＝５）またはＣＡ−ＣａＭＫＩＩ（ｎ＝５）のいずれかを注射した給餌マウスにおいて、免疫ブロットによってＦｏｘＯ１およびヌクレオホスミンについてアッセイした。 Ｃａｍｋ２ｇ−／−肝細胞およびインビボにおけるグルコース代謝の損傷は、構造的に核内のＦｏｘＯ１−ＡＤＡでの形質導入によって回復する。図７Ａ、ＷＴおよびＣａｍｋ２ｇ−／−マウスに由来する初代肝細胞に、０．２のＭＯＩで、ＦｏｘＯ１−ＡＤＡを発現するアデノウイルスを形質導入した。細胞を、一晩血清枯渇させ、次いで、血清不含培地中でホルスコリン（１０μｍ）とともに５時間インキュベートした。ＲＮＡを単離し、遺伝子の発現を、実時間Ｑ−ＰＣＲによって分析した。（＊＊Ｐ＜０．０１、＃Ｐ＜０．０５、＃＃Ｐ＜０．０１）図７Ｂ、８週齢のＷＴマウスに、対照ＬａｃＺ（ｎ＝５）またはＫ４３Ａ−ＣａＭＫＩＩ（ｎ＝１０）のいずれかを含有する１．５×１０９ｐｆｕのアデノウイルスを注射した。１日後、アデノ−Ｋ４３Ａ−ＣａＭＫＩＩを注射したマウスの半数に、ＦｏｘＯ１−ＡＤＡを含有する０．１×１０９ｐｆｕのアデノウイルスを受容させ、一方で、残りのマウスには、ＬａｃＺ対照を受容させた。血中グルコースレベルを、１２時間の絶食の５日後にアッセイした。（＊Ｐ＜０．０５、＃Ｐ＜０．０５）図７Ｃ、肝臓核抽出物を、免疫ブロットによって、ＦｏｘＯ１およびヌクレオホスミンについてアッセイした。図７Ｄ、Ｇ６ｐｃ、Ｐｃｋ１、およびＩｇｆｂｐ１ ｍＲＮＡのレベルを、１２時間絶食させたマウスの肝臓からアッセイした。（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＃Ｐ＜０．０５） 肥満肝臓におけるＰ−ＣａＭＫＩＩγ。１０週齢のＷＴもしくはｏｂ／ｏｂマウスおよび通常食もしくは高カロリー（ＤＩＯ）食を２０週間給餌させたマウス（図８Ａ）、または痩せ型もしくは病的肥満のヒト（図８Ｂ）に由来する肝臓抽出物の免疫ブロット。濃度測定的定量化を、図８Ａにおいてマウスデータに対して示す、Ｐ＜０．００１。 ＣａＭＫＩＩγ欠損は、高インスリン血症を低減させ、肥満マウスにおけるインスリンおよびグルコース代謝を改善する。図９Ａ〜９Ｂ、給餌および絶食ＷＴ（ｎ＝１０）ならびにＣａｍｋ２ｇ−／−（ｎ＝７）ＤＩＯ肥満雄性マウスにおける血漿インスリン。図９Ｃ、ＷＴおよびＣａｍｋ２ｇ−／−マウスにおけるインスリン寛容性試験（ＩＴＴ）（ｎ＝５）。図９Ｄ、体重。図９Ｅ〜Ｇ、アデノ−ＬａｃＺ対照またはアデノ−Ｋ４３ＡＣａＭＫＩＩ（優性阻害（ｄｏｍｉｎａｎｔ−ｎｅｇａｔｉｖｅ））での処置の前または後のＤＩＯマウスにおける、ＦｏｘＯ１標的に対する血漿インスリン、グルコース寛容性試験（ＧＴＴ）、および肝臓ｍＲＮＡ（ｎ＝６）。図９Ｅにおいて、＊は、アデノ前と対比してＰ＜０．０１、７日目のＬａｃＺと対比して＜０．００５。図９Ｇにおいて、＊Ｐ＜０．０１。図９Ｈ〜Ｉ、ｏｂ／ｏｂ肥満マウスを、ＣａＭＫＩＩ阻害剤ＫＮ９３またはその不活性相同体ＫＮ９２で処置した。肝臓における血中グルコースならびにＧ６ｐｃおよびＰｃｋ１の発現を、次いで、アッセイした（１０％変化した重複値）。 ＣａＭＫＩＩγ欠損は、肥満マウスにおける脂肪変性、脂質異常症、および炎症を改善する。図１０Ａ〜Ｂ、１０Ｄ、肝臓ＴＧ含量、血漿脂質、および肝臓ＴｎｆａｍＲＮＡを、２０週間のＤＩＯ食の後、ＷＴ（ｎ＝１０）およびＣａｍｋ２ｇ−／−（ｎ＝７）マウスにおいてアッセイした（Ｇ、＊Ｐ＜０．００５、Ｈ、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、Ｉ、＊Ｐ＜０．０５）。図１０Ｃ、アデノ−ＬａｃＺ対照またはアデノ−Ｋ４３ＡＣａＭＫＩＩ（優性阻害）での処置の前または後の、ＤＩＯマウス由来の肝臓におけるｐ−および全Ｓ６Ｋおよびソルチリン−１の免疫ブロット。 ＣａＭＫＩＩγ欠損は、相補的機序によってアテローム性動脈硬化症の抑制を媒介した。 ＵＰＲに誘発されるＭφのアポトーシスにおけるＣａＭＫＩＩγの役割 ＣａＭＫＩＩγハプロ不全は、ＥＲストレスに誘発されるアポトーシスからＭφを保護する。ＷＴ、Ｃａｍｋ２ｇ＋／−、またはＣａｍｋ２ｇ−／−マウスに由来するＭφを、対照またはＦＣ充填（Ｃｈｏｌ）条件下で処置し、次いで、アポトーシスについてアッセイした。互いに対比して、＊、＃、＠＝Ｐ＜０．０１。 インスリン耐性環境下でＥＲストレスに誘発されるＭφのアポトーシスにおけるＣａＭＫＩＩγの重要な役割の概要。 Ｍφのインスリン耐性およびＥＲＫ１／２阻害は、ｐ−ＣａＭＫＩＩを増加させる。ＷＴ、Ｉｎｓｒ−／−、およびｏｂ／ｏｂＭφ±ＦＣ充填またはｏｘＬＤＬ（図１５Ａ）、ならびにＷＴのＭφ±５μＭのＵ０１２６ ＥＲＫ阻害剤での４時間の処置（図１５Ｂ）における、ｐＴｈｒ２８７−ＣａＭＫＩＩの免疫ブロット。 ＣａＭＫＩＩγ欠損は、ＵＰＲを抑制する。ＷＴまたはＣａｍｋ２ｇ−／−マウスに由来するＭφを、タプシガルギン（Ｔｈａｐｓ）とともに、またはＦＣ充填条件下（Ｃｈｏｌ）でインキュベートし、次いで、ＵＰＲタンパク質、ＣａＭＫＩＩγ、およびβ−アクチンについて、免疫ブロットを行った。 進行したヒト冠動脈プラークのマクロファージにおけるｐ−ＣａＭＫＩ。試験した範囲は、Ｍｏｖａｔ Ｐｅｎｔａｃｈｒｏｍｅにより染色したプラーク標本中の四角によって示す；ＮＣは壊死性コア；バー２ｍｍ。抗体反応により、陽性であれば赤褐色の生成物が得られ、陰性であれば薄青色である。拡大画像については、バー１００μｍ。 肝細胞ＣａＭＫＩＩγ欠損は、ＦｏｘＯ１の核排除を伴う機序を介して、グルコース新生（ＧＮＧ）および肝臓のグルコース生成（ＨＧＰ）を減少させることによって、高インスリン血症および続いて生じる脂質異常症を軽減する。 絶食は肝臓のＣａＭＫＩＩを活性化し、ＣａＭＫＩＩの欠損または阻害は、ＧＮＧおよび核内ＦｏｘＯ１を抑制する。図１９Ａ、ＷＴマウスを、自由に給餌させたかもしくは１２時間絶食させた（上）、または１２時間絶食させて、次いで４時間再給餌させた（下）。肝臓抽出物に、ｐ−ＣａＭＫＩＩ、全ＣａＭＫＩＩ、およびβ−アクチンについて免疫ブロットを行った。図１９Ｂ、１２時間絶食させたＷＴおよびＣａｍｋ２ｇ−／−マウス、またはアデノ−ＬａｃＺもしくはアデノ−Ｋ４３Ａ−ＣａＭＫＩＩで処置したＷＴマウスにおける血中グルコース（＊Ｐ＜０．００１）。図１９Ｃ、２ｍｇ／ｋｇのピルビン酸塩でチャレンジした、１８時間絶食させたＷＴおよびＣａｍｋ２ｇ−／−マウスにおける血中グルコース。図１９Ｄ、アデノ−ＬａｃＺまたはアデノ−Ｋ４３Ａ−ＣａＭＫＩＩで処置したマウスにおける肝臓Ｇ６ｐｃおよびＰｃｋ１ｍＲＮＡ（＊Ｐ＜０．０１）。図１９Ｅ、Ｂ（左）の実験からの肝臓由来の核抽出物に、ＦｏｘＯ１およびヌクレオホスミン（Ｎｐ、核充填対照）について免疫ブロットを行い、濃度測定法によって定量化した（＊Ｐ＜０．００１）。図１９Ｆ、ＷＴもしくはＣａｍｋ２ｇ−／−マウスに由来する初代ＨＣ（左）、またはアデノ−ＬａｃＺ、構造的に活性なＣａＭＫＩＩ（Ｔ２８７Ｄ）、もしくはＫ４３Ａ−ＣａＭＫＩＩを形質導入したＷＴ ＨＣ（右）に、アデノ−ＧＦＰ−ＦｏｘＯ１を、（共）形質導入した。血清飢餓細胞におけるＦｏｘＯ１の細胞内局在化を、免疫蛍光共焦点顕微鏡データの画像分析によって定量化した（＊、＃、Ｐ＜０．００５）。図１９Ｇ、ＷＴまたはＣａｍｋ２ｇ−／−マウスに由来するＨＣに、アデノ−ＬａｃＺまたはＦｏｘＯ１−ＡＤＡを形質導入し、次いで血清飢餓させ、ホルスコリンで処置し、Ｇ６ｐｃ ｍＲＮＡについてアッセイした（＊Ｐ＜０．０１）。図１９Ｈ、血清飢餓させたＷＴ ＨＣにおいてはリン酸化されたが、ＣａＭＫＩＩ欠損ＨＣではリン酸化されなかったＳｅｒ残基、ＤＢＤ＝ＤＮＡ結合ドメイン。 ＣａＭＫＩＩγは、ＷＤ給餌Ｌｄｌｒ−／−マウスの肝臓においてリン酸化されている。１１週間、通常食または西洋食を与えたＬｄｌｒ−／−マウスを、免疫ブロットによって、血中グルコースについて（図２０Ａ、Ｐ＜０．００１）、肝臓ｐ−ＣａＭＫＩＩ、全ＣａＭＫＩＩ、およびβ−アクチンについて（図２０Ｂ）アッセイした。 絶食時および肥満におけるグルカゴンに誘発される肝臓のグルコース生成における分子の関連性を示す。図２１Ａは、直接的なシグナル伝達、ならびに肝臓のグルコース生成の際のグリコーゲン分解およびグルコース新生の転写調節を示す。図２１Ｂは、肝臓のグルコース生成（ＨＧＰ）の転写制御を示す。図２１Ｃは、肝臓のグルコース生成、絶食時／グルカゴン、インスリン耐性／ＤＭ２、およびカルシウム、ならびに肥満の間の関連性を示す。カルシウムの増加とＨＧＰとの間の関連性を研究する。図２１Ｄ〜Ｆは、カルシウム、肝臓のグルコース生成、およびアポトーシスの間の関連性の簡単な歴史的観点を示す。図２１Ｄは、進行したアテローム性動脈硬化症におけるマクロファージの死亡を示す図である。図２１Ｅは、カルシウムを感知するシグナル伝達分子であるカルシウム／カルモジュリン依存性タンパク質キナーゼＩＩ（ＣａＭＫＩＩ）を示す図である。図２１Ｆは、アテローム性動脈硬化症におけるマクロファージの死亡の機序を示す図である。図２１Ｇは、理論に束縛されるものではなく、ＣａＭＫＩＩ−γが、ＨＧＰを調節することができることを示す図である。図２１Ｈ〜Ｌは、グルカゴンが、培養初代マウス肝細胞においてＣａＭＫＩＩを活性化することを示す。図２１Ｈは、グルカゴンが、初代マウス肝細胞においてＣａＭＫＩＩを活性化することを示す。図２１Ｉは、グルカゴンとＣａＭＫＩＩの活性化との間の関連性を示す。図２１Ｊは、グルカゴンとカルシウムの増加との間の関連性を示す。図２１Ｋは、グルカゴンが、ＩＰ３Ｒを介して、インビボで肝臓ＣａＭＫＩＩを活性化することを示す。図２１Ｌは、絶食が、インビボで肝臓ＣａＭＫＩＩを活性化し、再給餌がそれを抑制することを示す。図２１Ｍは、ＣａＭＫＩＩが、ＰＫＡに誘発される初代肝細胞によるグルコース生成に重要な役割を果たすことを示す。図２１Ｎは、ＣａｍＫＩＩが、ＰＫＡおよびグルカゴンに媒介される、初代肝細胞におけるＧｃｐｃおよびＰｃｋ１の誘発に重要な役割を果たすことを示す。図２１Ｏは、遺伝子の誘発機序を通じた、絶食およびグルカゴン、ＣａＭＫＩＩ、ならびにグルコース生成の間の関連性を示す図である。図２１Ｐは、ＨＧＰの転写制御を示す図である。図２１Ｑは、ＦｏｘＯ１が、血清飢餓させた初代肝細胞における核であることを示す。図２１Ｒは、ＣａｍＫＩＩが、血清飢餓させた初代肝細胞におけるＦｏｘＯ１の核局在化に重要な役割を果たすことを示す。図２１Ｓは、ＣａＭＫＩＩが、血清飢餓させた初代肝細胞におけるＦｏｘＯ１の核局在化に重要な役割を果たすことを示す。図２１Ｔは、ＣａＭＫＩＩが、血清飢餓させた初代肝細胞におけるＦｏｘＯ１の核局在化に重要な役割を果たすことを示す、核抽出物のウエスタンブロットアッセイを示す。図２１Ｕは、ＣＲＴＣ２−ＰＧＣ１α経路を含む、ＨＧＰの転写制御を示す図である。図２１Ｖは、ＣａＭＫＩＩが、初代肝細胞におけるＰｇｃ１誘発のＣＲＴＣ２核局在化に役割を果たさないことを示す。図２１Ｗは、絶食およびグルカゴン生成、ＣａＭＫＩＩ、ＦｏｘＯ１、ならびにグルコース生成の間の関連性を示す図である。図２１Ｘは、絶食ＣａＭＫＩＩγ−／−マウスにおける血中グルコースおよびピルビン酸塩チャレンジ試験のインビボでの証拠を提示する。図２１Ｙは、絶食ＣａＭＫＩＩγ−／−マウスにおける肝臓Ｇｃｐｃ／Ｐｃｋ１ ｍＲＮＡおよび核内ＦｏｘＯ１のインビボでの証拠を提示する。図２１Ｚは、絶食アデノ−Ｋ４３Ａ ＣａＭＫＩＩ形質導入ＷＴマウスにおける血中グルコースおよびグリコーゲン貯蔵のインビボでの証拠を提示する。図２１ＡＡは、絶食アデノ−Ｋ４３Ａ ＣａＭＫＩＩ形質導入ＷＴマウスにおける肝臓Ｇｃｐｃ／Ｐｃｋ１ ｍＲＮＡおよび核内ＦｏｘＯ１のインビボでの証拠を提示する。図２１ＡＢは、グルカゴンで処置したアデノ−Ｋ４３Ａ ＣａＭＫＩＩ形質導入ＷＴマウスにおける肝臓Ｇｃｐｃ ｍＲＮＡおよびグリコーゲン貯蔵のインビボでの証拠を提示する。図２１ＡＣは、絶食アデノ−ＣＡ ＣａＭＫＩＩ形質導入ＷＴマウスにおける血中グルコースおよびピルビン酸塩チャレンジ試験のインビボでの証拠を提示する。図２１ＡＤは、絶食および給餌アデノ−ＣＡ ＣａＭＫＩＩ形質導入ＷＴマウスにおける肝臓Ｇｃｐｃ／Ｐｃｋ１ ｍＲＮＡのインビボでの証拠を提示する。図２１ＡＥは、絶食および給餌アデノ−ＣＡ ＣａＭＫＩＩ形質導入ＷＴマウスにおける核内ＦｏｘＯ１のインビボでの証拠を提示する。図２１ＡＦ〜ＡＨは、ＣａＭＫＩＩ欠損のＨＧＰに対する抑制効果が、ＦｏｘＯ１の核排除を通じて媒介されることの原因となる根拠を示す。図２１ＡＦは、理論に束縛されるものではなく、ＣａＭＫＩＩ欠損の効果が、構造的に核内のＦｏｘＯ−ＡＤＡを形質導入することによって阻止可能であることを示す図である。図２１ＡＧは、ホルスコリンで処置した初代肝細胞におけるＧ６ｐｃ／Ｐｃｋ１を示す。図２１ＡＨは、絶食アデノ−Ｋ４３Ａ ＣａＭＫＩＩ形質導入マウスにおける、血中グルコースレベル、ならびに血中グルコース中およびＦｏｘＯ１遺伝子における相対ｍＲＮＡレベルを示す。図２１ＡＩは、ＦｏｘＯ１を通じたＣａＭＫＩＩに媒介されるグルコース生成の調節と、肥満およびインスリン耐性との関係を示す図である。図２１ＡＪは、ＣａＭＫＩＩγが、肥満マウスの肝臓において活性化されることを示す。図２１ＡＫは、ＣａＭＫＩＩγが、肥満のヒトの肝臓におきて活性化されることを示す。図２１ＡＬは、ＣａＭＫＩＩγ欠損が、肥満マウスにおいて、血漿インスリンを低減させ、インスリン感受性を改善することを示す。図２１ＡＭは、ＣａＭＫＩＩγ欠損が、肥満マウスにおいて、急性インスリンに対する肝臓応答を改善することを示す。図２１ＡＮ〜ＡＯは、アデノウイルスに媒介されるＣａＭＫＩＩγの急性阻害が、ｏｂ／ｏｂマウスにおいて、代謝パラメータを改善することを示す。図２１ＡＰは、アデノウイルスに媒介されるＣａＭＫＩＩγの急性阻害が、ｏｂ／ｏｂマウスの肝臓におけるＧ６ｐｃおよびＰｃｋ１の発現を減少させることを示す。図２１ＡＱは、アデノウイルスに媒介されるＣａＭＫＩＩγの急性阻害が、ｏｂ／ｏｂマウスの肝臓において、核内ＦｏｘＯ１を減少させることを示す。図２１ＡＲは、ＣａＭＫＩＩγ欠損が、肥満マウスにおいて脂肪肝を低減させることを示す。図２１ＡＳは、ＣａＭＫＩＩ阻害が、ｏｂ／ｏｂマウスにおいて、肝臓での脂質合成遺伝子の発現を減少させることを示す。図２１ＡＴは、ＣａＭＫＩＩγ欠損が、肥満マウスにおいて、血漿コレステロールおよびトリグリセリドを部分的に低減させることを示す。図２１ＡＵは、ＣａＭＫＩＩγ欠損が、肥満マウスにおいて、肝臓ＴＮＦαを低減させることを示す。図２１ＡＶは、グルカゴンに誘発されるグルコース生成の調節の作業モデルを示す。今後の研究には、ＨＧＰおよびグルコース利用の直接アッセイ（クランプ研究）、核内ＦｏｘＯ１のＣａＭＫＩＩ調節の機序、ＣａＭＫＩＩ欠損がどのように肝臓ＥＲストレスに影響を及ぼし得るか、およびその逆、ＣａＭＫＩＩ欠損がインスリン感受性にどのような効果を有するか、肝臓マクロファージにおけるＣａＭＫＩＩが肥満に役割を果たすかどうか、アテローム性動脈硬化症に対するＣａＭＫＩＩの効果、ならびにＣａＭＫＩＩの治療的可能性が含まれるが、これらに限定されない。 ＣａＭＫＩＩは、初代ＨＣにおいて、グルコース生成および肝臓Ｇ６ＰｃおよびＰｃｋ１の発現を調節する。図２２Ａ、３匹のＷＴおよび３匹のＣａｍｋ２ｇ−／−マウスに由来するＨＣ、ならびにＷＴマウスに由来するマウスの脳からのＲＮＡを、ＲＴ−ＰＣＲによって、示されるＣａｍｋ２アイソフォームｍＲＮＡについて、調べた。図２２Ｂ、ＷＴおよびＣａｍｋ２ｇ−／−マウスに由来するＨＣを、一晩血清枯渇させ、次いで、血清およびグルコース不含培地中で、ホルスコリン（１０μｍ）とともに、１４時間インキュベートし、続いて、培地中のグルコースをアッセイした（各群のＷＴと対比して＊＊Ｐ＜０．０１、平均±標準誤差）。図２２Ｃ、ＷＴマウスに由来するＨＣに、２０のＭＯＩで、ＬａｃＺ、ＣＡ−ＣａＭＫＩＩ、またはＫＤ−ＣａＭＫＩＩを発現するアデノウイルスベクターを形質導入し、次いで、図２２Ｂのようにグルコース生成についてアッセイした（各群のＬａｃＺと対比して、＊Ｐ＜０．０５および＊＊Ｐ＜０．０１、平均±標準誤差）。図２２Ｄ〜２２Ｅ、図２２Ｂおよび図２２Ｃのものと類似のＨＣを、一晩血清枯渇させ、次いで、示されるように、血清不含培地中で、１０μＭホルスコリンまたは１００ｍＭグルカゴンとともに、５時間インキュベートした。ＲＮＡを、ＲＴ−ｑＰＣＲによってＧ６ｐｃおよびＰｃｋ１ ｍＲＮＡについてアッセイした（各群のＬａｃＺまたはＷＴと対比して、＊Ｐ＜０．０５および＊＊Ｐ＜０．０１、平均±標準誤差）。 インビボでのＣａＭＫＩＩγの欠損または急性阻害は、血中グルコースならびに肝臓Ｇ６ｐｃおよびＰｃｋ１を減少させる。図２３Ａ、１２時間絶食させた８週齢のＷＴおよびＣａｍｋ２ｇ−／−マウスの血中グルコース（＊Ｐ＜０．０５）。図２３Ｂ、図２３Ａと同様であるが、マウスを１８時間絶食させ、次いで、２ｍｇ ｋｇ−１のピルビン酸塩でチャレンジした（図２３Ｂ）。（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００５、平均±標準誤差）。図２３Ｃ、１２時間絶食させたＷＴおよびＣａｍｋ２ｇ−／−マウスにおける肝臓Ｇ６ｐｃおよびＰｃｋ１ ｍＲＮＡ（＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、平均±標準誤差）。図２３Ｄ、ＷＴおよびＣａｍｋ２ｇ−／−マウスに、グルカゴン（２００μｇ ｋｇ−１）を腹腔内注射し、３０分後に殺処理した。肝臓Ｇ６ｐｃ ｍＲＮＡをアッセイした（＊Ｐ＜０．０５、平均±標準誤差）。図２３Ｅ〜Ｇ、９週齢のＷＴマウスに、１．５×１０９ｐｆｕのアデノ−ＬａｃＺまたはＫＤ−ＣａＭＫＩＩを投与し、５日後に、次のパラメータを１２時間絶食させたマウスにおいてアッセイした：図２３Ｅ、血中グルコース（＊＊＊Ｐ＜０．００１、平均±標準誤差）、図２３Ｆ、肝臓Ｇ６ｐｃおよびＰｃｋ１ ｍＲＮＡ（＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、平均±標準誤差）、ならびに図２３Ｇ、肝臓グリコーゲン含量およびＰＡＳ陽性細胞（＊＊Ｐ＜０．０１、平均±標準誤差）。パネルＧはまた、ＷＴおよびＣａｍｋ２ｇ−／−マウスにおける肝臓グリコーゲン含量を示す（＊Ｐ＜０．０５、平均±標準誤差）。全てのパネルについて、ｎ＝４／群であるパネルＤを除き、ｎ＝５／群である。 ＣａＭＫＩＩは、肝臓ＦｏｘＯ１の細胞内局在化を調節する。図２４Ａ、ＷＴおよびＣａｍｋ２ｇ−／−マウスに由来するＨＣに、２のＭＯＩで、マウスＧＦＰ−ＦｏｘＯ１を発現するアデノウイルスを形質導入した。細胞を、一晩血清枯渇させ、次いで、血清不含培地中で５時間インキュベートした。ＦｏｘＯ１の細胞内局在化を、間接免疫蛍光法によって評価した。バー１０μｍ。データを、右のパネルに定量化した。（＃Ｐ＜０．０００５、平均±標準誤差）。図２４Ｂ、ＨＣに、２０のＭＯＩで、ＬａｃＺ、ＣＡ−ＣａＭＫＩＩ、またはＫＤ−ＣａＭＫＩＩを発現するアデノウイルスベクターを形質導入し、次いで、４時間後にアデノ−ＧＦＰ−ＦｏｘＯ１を形質導入し、続いて図２４Ａにあるように、蛍光顕微鏡法および定量化を行った（ＬａｃＺと対比して＃Ｐ＜０．００５、平均±標準誤差）。バー５μｍ。図２４Ｃ、ＨＣに、図２４Ｂのように、アデノ−ＬａｃＺまたはＣＡ−ＣａＭＫＩＩを形質導入し、次いで、アデノ−ＧＦＰ−ＦｏｘＯ１を形質導入した。血清枯渇培地中で一晩インキュベーションし、次いで血清不含培地で５時間インキュベートした後、細胞を、示される時間、１００ｎＭインスリンで処置した。ＦｏｘＯ１の細胞内局在化を、図２４Ｂにあるように定量化した（各群においてＬａｃＺと対比して＊Ｐ＜０．００５、平均±標準誤差）。図２４Ｄ、核内ＦｏｘＯ１およびヌクレオホスミンを、絶食ＷＴマウス、Ｃａｍｋ２ｇ−／−マウス、またはアデノ−ＬａｃＺもしくはＫＤ−ＣａＭＫＩＩで処置したＷＴマウス；アデノ−ＬａｃＺまたはＣＡ−ＣａＭＫＩＩで処置した給餌ＷＴマウス；あるいは３０分間２００μｇ ｋｇ−１（体重）のグルカゴンで腹腔内処置した給餌ＷＴマウスに由来する肝臓において、免疫ブロットによって調べた。グルカゴン実験については、平均ＦｏｘＯ：Ｎｐ濃度測定比の値を、グラフに示す（＊Ｐ＝０．０２９、レーン６および８の染色については、濃度測定分析から除外した）。 ＣａＭＫＩＩ阻害によるグルコース代謝の損傷は、構造的に核内のＦｏｘＯ１−ＡＤＡの形質導入によって回復する。図２５Ａ、野生型またはＬ−ＦｏｘＯ１ノックアウトマウスに由来するＨＣに、アデノ−ＬａｃＺまたはＣＡ−ＣａＭＫＩＩを形質導入した。細胞を、一晩血清枯渇させ、次いで、血清不含培地中で、ホルスコリン（１０μｍ）の不在下または存在下で、５時間インキュベートした。ＲＮＡを、Ｇ６ｐｃ ｍＲＮＡについてアッセイした（＊Ｐ＜０．００１、平均±標準誤差）。図２５Ｂ、ＷＴおよびＣａｍｋ２ｇ−／−マウスに由来するＨＣに、０．２のＭＯＩで、アデノ−ＬａｃＺまたはＦｏｘＯ１−ＡＤＡを投与した。細胞を、一晩血清枯渇させ、次いで、血清不含培地中で、１０μＭホルスコリンとともに５時間インキュベートした。ＲＮＡを、Ｇ６ｐｃおよびＰｃｋ１ ｍＲＮＡについてアッセイした（ＷＴ群と対比して＊＊Ｐ＜０．０１、Ｃａｍｋ２ｇ−／−／ＬａｃＺ群と対比して＃Ｐ＜０．０５および＃＃Ｐ＜０．０１、平均±標準誤差）。挿入図、同様の細胞に由来する核を、免疫ブロットによって、ＦｏｘＯ１およびヌクレオホスミンについて調べ、平均濃度測定比は、レーンのそれぞれの対を下回ると考えられる。図２５Ｃ〜Ｅ、８週齢のＷＴマウスに、アデノ−ＬａｃＺまたはＫＤ−ＣａＭＫＩＩを投与し、次いで、１日後に、アデノ−ＫＤ−ＣａＭＫＩＩマウスの半数に、アデノ−ＦｏｘＯ１−ＡＤＡを受容させ、一方で、残りの半数にはアデノ−ＬａｃＺ対照を受容させた。血中グルコースレベルを、５日目に１２時間の絶食後にアッセイし（ＬａｃＺ／ＬａｃＺと対比して＊Ｐ＜０．０５、ＫＤ／ＬａｃＺと対比して＃Ｐ＜０．０５、ｎ＝５／群、平均±標準誤差）、肝臓を、核内ＦｏｘＯ１タンパク質（ＫＤ／ＬａｃＺと対比して＊＊Ｐ＜０．０１、平均±標準誤差）、Ｇ６ｐｃ、Ｐｃｋ１、およびＩｇｆｂｐ１ ｍＲＮＡ（ＬａｃＺ／ＬａｃＺと対比して＊Ｐ＜０．０５および＊＊Ｐ＜０．０１、ＫＤ／ＬａｃＺと対比して＃Ｐ＜０．０５、ｎ＝３／群、平均±標準誤差）についてアッセイした。パネルＥへの挿入図は、赤血球凝集素（ＨＡ）タグ化ＫＤ−ＣａＭＫＩＩタンパク質のレベルを示す（抗ＨＡ免疫ブロット）。 ＣａＭＫＩＩに媒介されるＦｏｘＯ１核局在化における非ＡＫＴ−ホスホ部位の役割。図２６Ａ、ＷＴおよびＣａｍｋ２ｇ−／−マウスに由来するＨＣに、２のＭＯＩで、アデノ−ＦＬＡＧ−ＦｏｘＯ１を形質導入した。細胞を、一晩血清枯渇させ、次いで、血清不含培地中で５時間インキュベートした。ＦｏｘＯ１を、抗ＦＬＡＧを使用して免疫精製し、続いて、還元、アルキル化、およびタンパク質分解を行った。リン酸化されたペプチドを、ＴｉＯ２クロマトグラフィーによって強化し、次いで、実験手順に記載のようにＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって分析した。表は、ＫＯおよびＷＴ試料におけるリン酸化されたペプチドのスペクトル計数の数、Ｄｅｂｕｎｋｅｒスコア、およびＡｓｃｏｒｅを示し、ペプチド配列中の△は、リン酸化部位を示す。スペクトル計数＃、Ｄｅｂｕｎｋｅｒスコア、およびＡｓｃｏｒｅのカットオフ値は、それぞれ、５、０．５、および１２に設定した。これらの値を下回るスコア（斜体）を有するペプチドのスペクトルを、手作業で調べ、不確かなリン酸化部位を排除した（ＷＴペプチド４および５については図３１Ａ〜Ｂ、ＫＯペプチド７、１０、および１１についてはｈｔｔｐ：／／ｆｉｅｌｄｓ．ｓｃｒｉｐｐｓ．ｅｄｕ／ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ／ｆｏｘｏ１＿Ｔａｂａｓ＿２０１２／、これは参照によりその全体が組み込まれる）。スペクトル計数のＫＯ／ＷＴ比は、ＫＯとＷＴの合計スペクトル計数が１０を上回るペプチドについてのみ計算した。図２６Ｂ、Ｌ−ＦｏｘＯ１マウスに由来するＨＣに、マウスＦｌａｇ−ＦｏｘＯ１またはＦｌａｇ−７Ａ−ＦｏｘＯ１突然変異をコードする発現プラスミドをトランスフェクトした。４８時間後、細胞を、一晩血清枯渇させ、次いで、血清不含培地中でグルカゴン（１００ｎｍ）とともに４時間インキュベートした。核抽出物を、Ｆｌａｇおよびヌクレオホスミン（核充填対照）について、免疫ブロットによってアッセイし、同様の細胞集団に由来するＲＮＡを、ＲＴ−ｑＰＣＲによってＦｏｘｏ１ ｍＲＮＡについて調べた。ｍＲＮＡおよび免疫ブロットデータの濃度測定的定量化を、グラフに示す（＊Ｐ＜０．００５、平均±標準誤差）。図２６Ｃ、ＨＣに、ＷＴまたは突然変異ＦｏｘＯ１プラスミドをトランスフェクションした１日後に、アデノ−ＬａｃＺまたはＣＡ−ＣａＭＫＩＩを形質導入したことを除き、図２６Ｂと同様である（＊Ｐ＝０．００３、平均±標準誤差）。 肥満の肝臓のグルコース代謝におけるＣａＭＫＩＩの役割。図２７Ａ、１０週齢のＷＴもしくはｏｂ／ｏｂマウス、または通常食もしくは抗カロリー食を２０週間与えたＷＴマウス（食餌誘発型肥満、ＤＩＯ）に由来する肝臓抽出物を、免疫ブロットによって、ｐ−および全ＣａＭＫＩＩγならびにβ・アクチンについて調べた。濃度測定的定量化を、棒グラフに示す（＊＊＊Ｐ＜０．００１、平均±標準誤差）。抗体特異性は、ＤＩＯ Ｃａｍｋ２ｇ−／−マウスに由来する肝臓抽出物におけるｐ−および全ＣａＭＫＩＩγ帯域（ｂａｎｄ）の不在によって示される。図２７Ｂ〜Ｄ、アデノ−ＬａｃＺまたはＫＤ−ＣａＭＫＩＩでの処置の前または後の、ｏｂ／ｏｂマウスにおける絶食時血中グルコース、ピルビン酸塩チャレンジ後の血中グルコース、ならびに肝臓Ｇ６ｐｃ、Ｐｃｋ１、およびＩｇｆｂｐ１ ｍＲＮＡ（ｎ＝５／群、ＬａｃＺと対比して、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００５、および＊＊＊＊Ｐ＜０．００１、平均±標準誤差）。 （図１および２２に関連）。図２８Ａ、マウスに、示される用量のグルカゴンを腹腔内注射し、１５分後に殺処理した。肝臓を、免疫ブロットによって、リン酸化および全ＣａＭＫＩＩ、ならびにβ−アクチンについて調べた。図２８Ｂ、マウス（ｎ＝５／群）を、自由に給餌させたか１２時間絶食させ、次いで、血漿をグルカゴンについてアッセイした（＊Ｐ＝０．００７、平均±標準誤差）。図２８Ｃ、マウスに、１０ｐｍｏｌ ｇ−１のゼストスポンジンＣ（ＸｅｓＣ）またはビヒクル対照を４日間毎日腹腔内注射し、次いで、自由に給餌させたか１２時間絶食させた。肝臓のリン酸化ＣａＭＫＩＩ、全ＣａＭＫＩＩ、およびβ−アクチンのレベルを、免疫ブロットによってアッセイした。図２８Ｄ、ＣＡ−ＣａＭＫＩＩと対比してアデノ−ＬａｃＺを形質導入したＨＣにおけるＣａＭＫＩＩの免疫ブロット。図２８Ｅ、ＨＣに、アデノ−ＬａｃＺまたはＫＤ−ＣａＭＫＩＩを形質導入した。細胞を、一晩血清枯渇させ、次いで、ＣａＭＫＩＩ活性についてアッセイした（＊Ｐ＜０．００５、平均±標準誤差）。図２８Ｆ、ＷＴとＣａｍｋ２ｇ−／−マウスとに由来する未処置ＨＣにおけるＧ６ｐｃおよびＰｃｋ１ ｍＲＮＡのレベル（＊Ｐ０．０５）。図２２Ｄのホルスコリンで処置したＷＴ ＨＣにおけるｍＲＮＡレベルと比較して、未処置のＷＴ ＨＣにおけるＧ６ｐｃおよびＰｃｋ１は、それぞれ、約１６５倍および約２５００倍低かった。図２８Ｇ、Ｃａｍｋ２ｇ−／−マウスに由来するＨＣに、図２８Ｄにあるように、アデノ−ＬａｃＺまたはＫＤ−ＣａＭＫＩＩを形質導入し、ホルスコリンありまたはなしで、１４時間インキュベートし、次いで、Ｇ６ｐｃ ｍＲＮＡについてアッセイした（他の２群と対比して、＊Ｐ＜０．０５、平均±標準誤差）。黒丸は、ホルスコリンで処置したアデノ−ＬａｃＺ ＷＴ ＨＣのＧ６ｐｃ ｍＲＮＡ値を表す（１．９９±０．３、Ｃａｍｋ２ｇ−／−値と対比して＊Ｐ＜０．００１、平均±標準誤差）。 図２３に関連。図２９Ａ、絶食時グルカゴンおよびインスリンレベルを、ＷＴおよびＣａｍｋ２ｇ−／−マウスの血漿において、ならびにアデノ−ＬａｃＺまたはＫＤ−ＣａＭＫＩＩで処置したＷＴマウスにおいてアッセイした（ｎ＝５／群）、ｎ．ｓ．は非有意。図２９Ｂ、ＣａＭＫＩＩを、アデノ−ＬａｃＺまたはＫＤ−ＣａＭＫＩＩで処置したマウスの肝臓から免疫沈降させ（ＩＰ）、次いで、ＣａＭＫＩＩ活性についてアッセイした。挿入図のデータは、キナーゼ活性が、Ｃａｍｋ２ｇ−／−マウスの肝臓において、および非免疫ＩｇＧをプロトコルのＣａＭＫＩＩ ＩＰ部分に使用した場合には無視できるほどであったことを示すことによって、ＣａＭＫＩＩアッセイの正当性を立証する（＊Ｐ＜０．００６、平均±標準誤差）。図２９Ｃ〜Ｄ、ＷＴマウスを、アデノ−ＬａｃＺまたはＣＡ−ＣａＭＫＩＩで処置した（ｎ＝５／群）。５日後、マウスを、ピルビン酸塩チャレンジの前または後に、血中グルコースについてアッセイし、次いで、自由給餌期間後にマウスを殺処理し、肝臓を、Ｇ６ｐｃおよびＰｃｋ１ ｍＲＮＡについてアッセイした（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００５、平均±標準誤差）。図２９Ｅ、マウスを、アデノ−ＬａｃＺまたはＣＡ−ＣａＭＫＩＩで処置した（ｎ＝５／群）。５日後、マウスを一晩絶食させ、次いで、肝臓をグリコーゲン含量についてアッセイした（＊Ｐ＜０．０５、平均±標準誤差）。 図２４〜２５に関連。図３０Ａ、ＨＣに、１のＭＯＩで、アデノ−ＬａｃＺまたはＣＡ−ＣａＭＫＩＩを形質導入し、４時間後にアデノ−ＧＦＰ−ＦｏｘＯ１を形質導入した。血清枯渇培地中で一晩インキュベートし、次いで血清不含培地で５時間インキュベートした後に、細胞を、１５分間１００ｎＭインスリンで処置した。ＦｏｘＯ１の細胞内局在化を定量化した。（＊Ｐ＜０．００５、平均±標準誤差）。挿入図、同様の細胞集団からの溶解物を、免疫ブロットによって、ＣａＭＫＩＩおよびβ−アクチンについて調べた。図３０Ｂ、ＦＡＯ肝細胞に、インタクト（−１２２７ＷＴ）または突然変異したＦｏｘＯ結合部位（−１２２７Ｍｕｔ）のいずれかを含有するＧ６ＰＣプロモーターのヌクレオチド−１２２７〜＋５７をコードするルシフェラーゼ融合構築物をトランスフェクトした。相対ルシフェラーゼ活性を、０．１ｍＭ ｃＡＭＰおよび１μＭデキサメタゾンの不在下または存在下で、１６時間インキュベートした後に測定した。全ての他の群と対比して＊Ｐ＜０．００１、未処置Ｍｕｔと対比して＊＊Ｐ＝０．００９（平均±標準誤差）。図３０Ｃ、アデノ−ＬａｃＺおよびＫＤ−ＣａＭＫＩＩ処置マウスの肝臓に由来する核を、免疫ブロットによって、ＣＲＥＢまたはＣｒｔｃ２およびヌクレオホスミン（Ｎｐ）について調べ、ＷＴまたはＣａｍｋ２ｇ−／−マウスに由来するグルカゴン処置ＨＣの細胞抽出物を、ｐ−ＣＲＥＢおよびβ−アクチンについて調べた、図３０Ｄ、ＷＴまたはＣａｍｋ２ｇ−／−マウスに由来するグルカゴン処置ＨＣ由来の核を、Ｃｒｔｃ２およびヌクレオホスミン（Ｎｐ）について調べた。 図２６、ＦｏｘＯ１リン酸化に関連。図３１Ａ、絶食させたＷＴおよびＣａｍｋ２ｇ−／−マウスに由来する肝臓の抽出物を、リン酸化Ｔ２４−、２５３−、および３１６−ＦｏｘＯ１、ならびにβ−アクチンについて免疫ブロットした。図３１Ｂ、絶食させたアデノ−ＦｏｘＯ１処置ＷＴおよびＣａｍｋ２ｇ−／−マウスに由来する肝臓の抽出物を、アセチル化ＦｏｘＯ１（Ａｃ−ＦｏｘＯ１）およびβ−アクチンについて免疫ブロットした。平均Ａｃ−ＦｏｘＯ：β−アクチンの濃度測定比の値は、ブロットの下に表し、ｎ．ｓ．は非有意。図３１Ｃ、識別されたリン酸化部位を太字で表したマウスＦｏｘＯ１の配列、図２６、３１Ｆ、および３２に関連する重要な残基のデータの要約は、下に、配列下の箇条書きに示す。図３１Ｄ、ＭＳ／ＭＳスペクトル、およびＣａｍｋ２ｇ−／−ＨＣ由来のリン酸化ペプチド＃４のｂ、ｙイオンの表。図３１Ｅ、ＭＳ／ＭＳスペクトル、およびＣａｍｋ２ｇ−／−ＨＣ由来のリン酸化ペプチド＃５のｂ、ｙイオンの表。図３１Ｆ、Ｌ−Ｆｏｘｏ１ ＨＣに、ＦＬＡＧ−７Ａ−Ｆｏｘｏ１の代わりにＦＬＡＧ−９Ａ−ＦｏｘＯ１突然変異をトランスフェクトしたことを除き、図２６Ｂの実験と同様である（＊Ｐ＝０．００６、＊＊Ｐ＝０．０２、平均±標準誤差）。 図２６のｐ３８と関連。図３２Ａ、マウスを、自由に給餌させたかまたは１２時間絶食させた。肝臓のリン酸化ｐ３８、全ｐ３８、ｐ−ＭＫ２、全ＭＫ−２、およびβ−アクチンを、免疫ブロットによってアッセイした。図３２Ｂ、ＷＴ ＨＣを、一晩血清枯渇させ、次いで、ＳＢ２０２１９０ありまたはなしで、血清不含培地中で１００ｎｍグルカゴンとともに５時間インキュベートし、グルカゴンを、アデノ−ＬａｃＺ（対照）またはアデノ−Ｃｒｅで処置したＰ３８ａｆｌ／ｆｌマウスに由来するＨＣに添加した。ＲＮＡを、Ｇ６ｐｃおよびＰｃｋ１ ｍＲＮＡについてアッセイした（＊Ｐ＜０．０５、平均±標準誤差）。図３２Ｃ、絶食ＷＴおよびＣａｍｋ２ｇ−／−マウスに由来するＨＣを、ｐ−ｐ３８、全ｐ３８、およびβ−アクチンについてアッセイした。図３２Ｄ、ＷＴマウスに、１２．５ｍｇ ｋｇ−１（体重）のｐ３８阻害剤（ＳＢ２０２１９０）またはビヒクル対照を、腹腔内注射した。１２時間後、マウスに、追加用量のＳＢ２０２１９０を注射し、一晩絶食させた。肝臓を、核内ＦｏｘＯ１、ヌクレオホスミン、ｐ−ＭＫ２、全ＭＫ−２、およびβ−アクチンについてアッセイした。核内ＦｏｘＯ１およびｐ−ＭＫ２間の帯域強度（ｂａｎｄ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）の相関性を、グラフに示す。図３２Ｅ、アデノ−ＧＦＰ−ＦｏｘＯ１を形質導入したＨＣを、一晩血清枯渇させ、次いで、ＳＢ２０２１９０またはビヒクル（Ｖｅｈ）対照とともに、血清不含培地中で、５時間インキュベートした。ＦｏｘＯ１局在化を、間接免疫蛍光法によって評価した（バー１０μｍ、＊Ｐ＜０．０５、平均±標準誤差）。 カルシニューリンは、絶食時にＣＲＴＣ２活性化を促進する。図３３Ａ．Ｓｅｒ／Ｔｈｒホスファターゼ阻害剤の効果（ＣＲＴＣ２脱リン酸化に対するオカダ酸（ＯＡ）、シクロスポリンＡ（ＣｓＡ）、およびＣＲＥルシフェラーゼ（ｌｕｃ）レポーター活性化（＊Ｐ＜０．００１、ｎ＝３）。図３３Ｂ．脱リン酸化に対するグルカゴン（Ｇｃｇ）の効果（左）、ならびに肝細胞における野生型（ＷＴ）およびカルシニューリン欠損（△Ｃａｌｎａ）ＣＲＴＣ２ の活性（右）（＊Ｐ＜０．００１、ｎ＝３）。図３３Ｃ．カルシニューリンＡの過剰発現（左）またはノックダウン（右）の、ＣＲＴＣ２脱リン酸化（上）、ＣＲＥ−ｌｕｃレポーター活性（中、＊Ｐ＜０．００１、ｎ＝３）、および肝細胞からのグルコース産出（下、＊Ｐ＜０．００１、ｎ＝３）に対する効果。図３３Ｄ．６〜８時間絶食させたマウスにおける、肝臓のカルシニューリン過剰発現（左）またはノックダウン（右）の、ＣＲＥ−ｌｕｃ活性、グルコース新生遺伝子（Ｐｃｋ１、Ｇ６ｐｃ）の発現、および血中グルコース濃度に対する効果（＊Ｐ＜０．０１、ｎ＝５）。この図および他の図について、データは平均±標準誤差として示される。 グルカゴンは、ＩｎｓＰ３受容体の活性化を介してＣＲＴＣ２の脱リン酸化を刺激する。図３４Ａ．蛍光撮像による肝細胞におけるカルシウム動員に対するグルカゴン（Ｇｃｇ）の効果。３つ全てのＩｎｓＰ３Ｒファミリーメンバーのノックダウン後のカルシウム動員およびカルシニューリン活性化を示す（＊Ｐ＜０．００１、ｎ＝３）。図３４Ｂ．ＣＲＴＣ２脱リン酸化およびＣＲＥ−ｌｕｃ活性化に対するカルシウムキレート化剤（ＢＡＰＴＡ）の効果（＊Ｐ＜０．００１、ｎ＝３）。図３４Ｃ．ＣＲＴＣ２脱リン酸化、ＣＲＥ−ｌｕｃ活性、および肝細胞からのグルコース産出に対するＩｎｓＰ３Ｒ枯渇の効果（＊Ｐ＜０．００１、ｎ＝３）。図３４Ｄ．ＣＲＥ−ｌｕｃ活性、血中グルコース、およびグルコース新生遺伝子の発現に対する肝臓ＩｎｓＰ３Ｒノックダウンの効果（＊Ｐ＜０．０１、ｎ＝５）。 グルカゴンは、ＩｎｓＰ３ＲのＰＫＡ依存性リン酸化を介してＣＲＴＣ２活性を刺激する。図３５ＡおよびＢ．リン酸化ＰＫＡ基質抗血清を使用して、グルカゴン（Ｇｃｇ）に暴露された肝細胞におけるＩｎｓＰ３Ｒ１リン酸化に対する、１つまたは両方の（ＤＭ）ＰＫＡコンセンサス部位（Ｓｅｒ１５８９、Ｓｅｒ１７５６）におけるＨ８９（Ａ）およびＡｌａ突然変異（Ｂ）の効果を示す、ＩｎｓＰ３Ｒ１免疫沈降物の免疫ブロット。ＧｃＧ（Ｂ）に応じたカルシウム動員に対する野生型およびＰＫＡ突然変異ＩｎｓＰ３Ｒ１の効果を示す（＊Ｐ＜０．００１、ｎ＝３）。図３５ＣおよびＤ．カルシニューリン（Ｃａｌｎａ）活性化（Ｃ）およびＣＲＴＣ２脱リン酸化（Ｃ）、ならびにＣＲＥ−ｌｕｃ活性化（Ｄ）および肝細胞からのグルコース産出（Ｄ）に対する野生型またはＰＫＡ欠損ＩｎｓＰ３Ｒ１（ＤＭ）の効果（＊Ｐ＜０．００１、ｎ＝３）。図３５Ｅ．肝臓ＣＲＥ−ｌｕｃ活性、絶食時血中グルコース、およびグルコース新生遺伝子の発現（Ｇ６ｐｃ、Ｐｃｋ１）に対する野生型およびＰＫＡ欠損ＩｎｓＰ３Ｒ１の効果（野生型と対比して＊Ｐ＜０．０１、ｎ＝５）。図３５Ｆ．初代肝細胞におけるＣＲＴＣ２とＩｎｓＰ３Ｒ１の共免疫沈降。グルカゴンへの暴露（１００ｎＭ、１５分）を示す。ＣＲＴＣ２およびＩｎｓＰ３Ｒ１の核内（Ｎｕ）および核外（ｐ／Ｎｕ）上清分画のインプットレベルを示す。 ＩｎｓＰ３Ｒ活性は、糖尿病において上方調節される。図３６Ａ．痩せ型およびｄｂ／ｄｂマウスにおける肝臓ＣＲＥ−ｌｕｃおよびカルシニューリン活性（＊Ｐ＜０．００１、ｎ＝５）。図３６Ｂ．自由に給餌させた痩せ型、ｄｂ／ｄｂ、またはｏｂ／ｏｂマウスの肝臓における、ＩｎｓＰ３Ｒファミリーメンバーの相対量およびリン酸化を示す、免疫ブロット。ＰＫＡまたはＡＫＴ部位におけるＩｎｓＰ３Ｒリン酸化を示す。図３６Ｃ．ピルビン酸塩寛容性試験によって判定される、ｄｂ／ｄｂマウスにおけるＣＲＥ−ｌｕｃ活性、グルコース新生遺伝子の発現、および肝臓のグルコース生成に対する、ＲＮＡｉに媒介されるＩｎｓＰ３ＲまたはカルシニューリンＡの枯渇の効果（＊Ｐ＜０．０１、ｎ＝５）。 グルカゴンは、カルシニューリン依存性機序を介して、肝細胞におけるＣＲＴＣ２活性を刺激する。図３７Ａ．グルカゴン（Ｇｃｇ）に暴露された初代マウス肝細胞におけるＣＲＴＣ２局在化に対するＳｅｒ／Ｔｈｒホスファターゼ阻害剤（オカダ酸（ＯＡ）、シクロスポリンＡ（ＣｓＡ））の効果。スケールバー５μｍ。図３７Ｂ．初代肝細胞におけるＣＲＥ−ルシフェラーゼレポーター活性に対するカルシニューリン阻害剤（カルシニューリン自己阻害剤性ペプチド（ＣＡＰ）、ＣＮ５８５）およびＰＰ１／ＰＰ２Ａ阻害剤（カリクリンＡ）の効果（＊Ｐ＜０．００１、ｎ＝３）。図３７ＣおよびＤ．ＣＲＥ−ｌｕｃ活性（Ｃ）（＊Ｐ＜０．００１、ｎ＝３）およびＣＲＴＣ２細胞局在化に対する野生型およびリン酸化欠損（Ｓ１７１Ａ、Ｓ２７５Ａ）活性ＣＲＴＣ２突然変異の効果。図３７Ｄ．グルカゴン処置を示す。スケールバー５μｍ。図３７Ｅ．野生型または構造的に活性な（Ｓ１７１Ａ／Ｓ２７５Ａ）突然変異 ＣＲＴＣ２を発現する細胞におけるＣＲＥ−ｌｕｃ活性に対するＣｓＡの効果（＊Ｐ＜０．００１、ｎ＝３）。ＮＳは、統計学的差がない。 カルシニューリンは、肝細胞におけるＣＲＴＣ２活性を調整する。図３８Ａ．ＣＲＴＣ２にけるカルシニューリン結合部位の分析。異なるＣＲＴＣ２ポリペプチドおよびアミノ酸の置換／欠失を概略図で示す。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＨＡタグ付けカルシニューリン（Ｃａｌｎａ）のＩＰにより回収されたｆｌａｇタグ付けＣＲＴＣ２の免疫ブロットを示す。図３８Ｂ．初代肝細胞の培養物における野生型および突然変異ＣＲＴＣ２ポリペプチドのカルシニューリンへの相対的な結合を示す、共免疫沈降アッセイ。野生型またはカルシニューリン欠損（△Ｃａｌｎａ）のＦｌａｇタグ化ＣＲＴＣ２に加えて、ＨＡタグ化カルシニューリンＡ（Ｃａｌｎａ）をコードするアデノウイルスで感染させた細胞を示す。ＨＡ−カルシニューリンＩＰによるＣＲＴＣ２ポリペプチドの回収を示す。図３８Ｃ．グルカゴンに暴露した肝細胞における野生型（ＷＴ）およびカルシニューリン欠損（△Ｃａｌｎａ）ＣＲＴＣ２の核の往復。スケールバー５μｍ。図３８Ｄ．リン酸化ＰＫＡ基質抗体（抗ＲＲＸｐＳ／Ｔ）を使用した、肝細胞における下流ＰＫＡシグナル伝達に対するＣａｌｎａの過剰発現（Ｏ．Ｅ．）またはＲＮＡｉに媒介されるノックダウンによる枯渇の効果。 カルシニューリンは、肝臓におけるＣＲＴＣ２活性を調節する。絶食マウスの肝臓における絶食に誘発されるＣＲＥＢ標的遺伝子（Ｎｒ４ａ１、Ｎｒ４ａ２、Ｐｇｃ１α）のｍＲＮＡ量に対する、カルシニューリン（Ｃａｌｎａ）の過剰発現（Ａ）またはＲＮＡｉに媒介される枯渇（Ｂ）の効果（＊Ｐ＜０．０１、ｎ＝５）。対照と比較して、カルシニューリン過剰発現またはノックダウンマウスに由来する肝臓における相対カルシニューリンタンパク質量を示す免疫ブロット。 カルシニューリンおよびＩｎｓＰ３Ｒは、ＣＲＴＣ２活性を調整することによって、グルコース新生を調節する。図４０Ａ〜Ｂ．示されるように、アデノウイルスでコードしたカルシニューリンまたはＩｎｓＰ３Ｒ１を発現する絶食マウスにおける、アデノウイルスでコードしたＣｒｔｃ２ ＲＮＡｉの血中グルコース濃度（Ａ）および肝臓遺伝子発現（Ｂ）の効果。ｎ＝４。ＮＳは、統計的有意差なし。図４０Ｃ．パネルＡおよびＢに特徴付けられるマウスにおける。ＣＲＴＣ２、カルシニューリン（Ｃａｌｎａ）、およびＩｎｓＰ３Ｒ１の肝臓タンパク質量を示す免疫ブロット。 グルカゴンは、肝細胞におけるカルシウム動員を刺激する。図４１ＡおよびＢ．蛍光撮像による、初代肝細胞におけるカルシウム動員に対するグルカゴン（Ｇｃｇ）およびＰＫＡ阻害剤Ｈ８９の効果（＊Ｐ＜０．００１、ｎ＝３）。図４１Ｃ．グルカゴン（Ｇｃｇ）に暴露した初代肝細胞由来の溶解物上でリン酸化ＰＫＡ基質抗血清を用いて調製した免疫沈降物のＭＳ分析によって識別されたＩｎｓＰ３Ｒ１ペプチド。 ＩｎｓＰ３受容体は、ｃＡＭＰアゴニストに応じたＣＲＴＣ２活性化に必要である。図４２Ａ、Ｂ．ホルスコリン（ＦＳＫ）に暴露した初代肝細胞における、カルシウム動員およびＣＲＴＣ２脱リン酸化（Ａ）、ならびにグルコース−６−ホスファターゼ（Ｇ６ｐｃ）およびＰＥＰＣＫ（Ｐｃｋ１）のｍＲＮＡ量（Ｂ）に対するゼストスポンジンＣ（Ｘｃ）の効果（＊Ｐ＜０．００１、ｎ＝３）。図４２Ｃ〜Ｅ．ＩｎｓＰ３Ｒ２ノックアウトマウスおよび対照同腹子に由来する初代肝細胞における、カルシウム動員およびカルシニューリン活性化（Ｃ）（＊Ｐ＜０．００１、ｎ＝４）、ならびにＣＲＥ−ｌｕｃレポーター活性化およびグルコース分泌（Ｄ）（＊Ｐ＜０．００１、ｎ＝４）、ならびにＣＲＴＣ２脱リン酸化（Ｅ）に対する、グルカゴンの効果。図４２Ｅ．右側の棒グラフは、濃度測定法によって判定される、グルカゴンに暴露した野生型およびＩｎｓＰ３Ｒ２ノックアウト肝細胞におけるＣＲＴＣ２の相対脱リン酸化を示す（＊Ｐ＜０．０１、ｎ＝３）。 ＩｎｓＰ３Ｒは、肝臓のグルコース新生を調整する。図４３Ａ．絶食の肝臓におけるカルシニューリン活性化に対する、ＲＮＡｉに媒介される３つ全てのＩｎｓＰ３Ｒファミリーメンバーの枯渇の効果（＊Ｐ＜０．００１、ｎ＝５）。図４３ＢおよびＣ． マウスの肝臓における絶食に誘発されるＣＲＥＢ標的遺伝子のｍＲＮＡ量（Ｂ）およびＩｎｓＰ３Ｒタンパク質の量（Ｃ）に対する、肝臓ＩｎｓＰ３Ｒノックダウンの効果（＊Ｐ＜０．０１、ｎ＝５）。図４３ＤおよびＥ．野生型およびＩｎｓＰ３Ｒ２ノックアウトマウスにおける、ピルビン酸塩寛容性試験によって測定される肝臓のグルコース新生（Ｄ）（＊Ｐ＜０．０２、＊＊Ｐ＜０．０１、ｎ＝４）、およびグルコース新生遺伝子の発現（Ｅ）（＊Ｐ＜０．０１、ｎ＝４）。免疫ブロットは、対照およびＩｎｓＰ３Ｒ２ノックアウトマウスに由来する肝臓抽出物におけるＩｎｓＰ３Ｒ２タンパク質の量を示す。 グルカゴンは、ＰＫＡに媒介されるリン酸化を介して、ＩｎｓＰ３Ｒ活性を調整する。図４４Ａ．初代肝細胞から調製したＩｎｓＰ３Ｒの免疫沈降物にリン酸化ＰＫＡ基質抗血清を使用して、ＩｎｓＰ３Ｒリン酸化に対するグルカゴン（Ｇｃｇ）の効果を示す免疫ブロット。図４４Ｂ．６〜８時間絶食させた肝臓、または２時間再給餌させたマウスの肝臓における、ＰＫＡまたはＡＫＴ部位でのＩｎｓＰ３Ｒのリン酸化を示す免疫ブロット。図４４ＣおよびＤ．絶食の肝臓における、カルシニューリン（Ｃａｌｎａ）活性化（Ｃ、＊Ｐ＜０．００１、ｎ＝５）およびＣＲＥＢ標的遺伝子（Ｄ、＊Ｐ＜０．０１、ｎ＝５）に対する野生型およびＰＫＡ欠損（ＤＭ）ＩｎｓＰ３Ｒ１の効果。右は、野生型またはＰＫＡ欠損（ＤＭ）ＩｎｓＰ３Ｒ１をコードするアデノウイルスを注射した肝臓における、相対ＩｎｓＰ３Ｒタンパク質の量を示す免疫ブロットである。 肝細胞におけるＩｎｓＰ３ＲとＣＲＴＣ２との関係。図４５Ａ．ＭＳ分析による抗ＣＲＴＣ２免疫沈降物から回収したＩｎｓＰ３Ｒ１ペプチド。図４５Ｂ．ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＨＡタグ化ＩｎｓＰ３Ｒ１から回収されたＦｌａｇタグ化ＣＲＴＣ２の量を示す共免疫沈降アッセイ。図４５ＣおよびＤ．ＣＲＴＣ２：ＩｎｓＰ３Ｒ１の相互作用に必要なＣＲＴＣ２（Ｃ）およびＩｎｓＰ３Ｒ１（Ｄ）内の領域の欠失分析。相互作用可能なＣＲＴＣ２およびＩｎｓＰ３Ｒ１ポリペプチドを、各図に（＋）で示す。図４５Ｅ．グルカゴン（Ｇｃｇ）に暴露した肝細胞におけるＥＲ強化高密度ミクロソーム（ＨＤＭ）ならびにサイトゾル（Ｃｙｔｏ）および核（Ｎｕｃｌ）分画と関連付けた、ＣＲＴＣ２タンパク質の量に対するＩｎｓＰ３Ｒ欠失の効果。各分画におけるＥＲ局在化（ＧＲＰ７８）、サイトゾル（チューブリン）、および核内（ＣＲＥＢ）タンパク質の相対量を示す。図４５Ｆ．肝細胞におけるＣＲＴＣ２に対するＩｎｓＰ３Ｒ欠失の効果。スケールバー５μｍ。図４５Ｇ〜Ｉ．野生型のＩｎｓＰ３Ｒ欠損（△ＣＢＤ、５１〜６９２ａａ）、およびミリストイル化ＣＲＴＣ２突然変異ポリペプチドの細胞局在化（Ｇ）、リン酸化状態（Ｈ）、および活性（Ｉ）（＊Ｐ＜０．００１、ｎ＝３）。スケールバー５μｍ。 インスリンは、ＡＫＴに媒介されるＩｎｓＰ３Ｒのリン酸化を介してＣＲＴＣ２を下方調節する。図４６Ａ．左、初代肝細胞から調製したＩｎｓＰ３Ｒの免疫沈降物にリン酸化ＡＫＴ基質抗血清を使用して、ＩｎｓＰ３Ｒのリン酸化に対するインスリン（ＩＮＳ）の効果を示す免疫ブロット。右下、野生型およびコンセンサスＡＫＴリン酸化部位（Ｓｅｒ２６８２）にアラニン置換を含有する突然変異ＩｎｓＰ３Ｒ１のリン酸化に対するインスリン（ＩＮＳ）の効果。図４６Ｂ．野生型およびＡＫＴ欠損（Ｓ２６８２Ａ）ＩｎｓＰ３Ｒ１を発現する初代肝細胞における、グルカゴン（Ｇｃｇ）に誘発されるカルシウム動員およびカルシニューリン（Ｃａｌｎａ）活性に対するインスリンの効果（＊Ｐ＜０．００１、ｎ＝３）。図４６Ｃ．野生型およびＡＫＴ欠損（Ｓ２８６２Ａ）ＩｎｓＰ３Ｒ１の効果。肝細胞からのＣＲＴＣ２脱リン酸化（上）、ＣＲＥ−ｌｕｃレポーター活性化（左下）、およびグルコース産出（右下）（＊Ｐ＜０．００１、ｎ＝３）。図４６Ｄ．絶食または再給餌マウスにおける、ＣＲＥ−ｌｕｃ活性、血中グルコース、およびＣＲＥＢ標的遺伝子の発現（Ｇ６ｐｃ、Ｐｃｋ１、Ｎｒ４ａ１、Ｎｒ４ａ２、Ｐｇｃ１α）に対する野生型およびＡＫＴ欠損（Ｓ２６８２Ａ）ＩｎｓＰ３Ｒ１の効果（＊Ｐ＜０．０１、ｎ＝５）。右下、野生型またはＡＫＴ欠損（Ｓ２６８２Ａ）ＩｎｓＰ３Ｒ１をコードするアデノウイルスを注射したマウスの肝臓における相対ＩｎｓＰ３Ｒタンパク質量を示す免疫ブロット（＊Ｐ＜０．０１、ｎ＝５）。 肝臓のｃＡＭＰシグナル伝達およびカルシニューリン活性は、肥満において増加する。図４７ＡおよびＢ．痩せ型、ｄｂ／ｄｂ、およびｏｂ／ｏｂマウスにおける肝臓のＣＲＥ−ｌｕｃレポーター活性およびカルシニューリン活性（Ａ）、ならびにｃＡＭＰ含量（Ｂ）（＊Ｐ＜０．００１、ｎ＝５）。図４７Ｃ．Ｉｎｓｐ３ｒまたはＣａｌｎａ ＲＮＡｉアデノウイルスを注射したマウスの肝臓におけるＩｎｓＰ３Ｒおよびカルシニューリン（Ｃａｌｎａ）タンパク質の免疫ブロット。 絶食および給餌経路は、ＩｎｓＰ３Ｒ活性に対するアンタゴニスト効果を通じてＣＲＴＣ２依存性グルコース新生を調節する。絶食時のシグナル伝達は、ＰＫＡ依存性リン酸化を介してＩｎｓＰ３Ｒを活性化し、カルシニューリン（Ｃａｌｎａ）活性の増加、および続くＣＲＴＣ２の脱リン酸化の増加をもたらす。対照的に、給餌は、ＡＫＴ依存性リン酸化を介してＩｎｓＰ３Ｒ活性を阻害し、それによって、カルシニューリン依存性のＣＲＴＣ２の脱リン酸化を遮断する。 培養肝細胞におけるホルスコリン／グルカゴン誘発性Ｇ６Ｐａｓｅ／ＰＥＰＣＫ、およびインビボでの絶食時血中グルコースにおけるＩＰ３Ｒの役割。図４９Ａ、Ｂ．ＦＳＫに誘発されるＧ６ＰａｓｅおよびＰＥＰＣＫは、カルシウム依存性である。図４９Ｃ〜Ｄ．ＩＰ３Ｒ活性は、ホルスコリンおよびグルカゴンに誘発されるＧ６ＰａｓｅおよびＰＥＰＣＫに必要である（ＦＡＯラット肝細胞の細胞系）。図４９Ｅ〜Ｆ．ＩＰ３Ｒ活性は、ホルスコリンに誘発されるＧ６ＰａｓｅおよびＰＥＰＣＫに必要である（初代マウス肝細胞）。図４９Ｇ〜Ｈ．ＩＰ３Ｒ１アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ホルスコリンに誘発されるＧ６ＰａｓｅおよびＰＥＰＣＫを抑制する（初代マウス肝細胞）。図４９Ｉ．ホルスコリンは、ＦＡＯ肝細胞においてＩＰ３Ｒ活性を活性化する（イノシトール／ＡＴＰ誘発性カルシウム放出アッセイ）。図４９Ｊ．ＰＫＡ阻害剤Ｈ８９は、ホルスコリンに誘発されるＩＰ３Ｒ活性化を抑制する。図４９Ｋ〜Ｌ．ＩＰ３Ｒ活性は、ホルスコリンに誘発されるＰＧＣ１αに必要である。図４９Ｍ〜Ｎ．カルシニューリン阻害性ペプチドは、ホルスコリンに誘発されるＧ６ＰａｓｅおよびＰＥＰＣＫを抑制する。図４９Ｏ．ＩＰ３Ｒ活性は、ホルスコリンに誘発されるカルシニューリン活性化に必要である。図４９Ｐ〜Ｑ．ＩＰ３Ｒ活性は、ホルスコリンに誘発されるＴＯＲＣ２脱リン酸化および核局在化に必要である。図４９Ｒ．ＴＯＲＣ２形質導入は、ＩＰ３Ｒが阻害された肝細胞において、ホルスコリンに誘発されるＧ６Ｐａｓｅを部分的に回復させる。図４９Ｓ．ゼストスポンジンＣ処置は、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスにおける絶食時グルコースレベルを低減させる。 肥満／インスリン耐性に誘発される高血糖およびグルコース新生におけるＩＰ３Ｒの役割。図５０Ａ．ｏｂ／ｏｂマウスのゼストスポンジンＣ処置がＩＰ３Ｒを阻害する根拠、新たに単離した腹膜腔マクロファージにおけるＩＩＣＲのアッセイ。図５０Ｂ〜Ｅ．ＩＰ３Ｒの阻害は、ｏｂ／ｏｂマウスにおける絶食時血中グルコースレベルを低減させる。図５０Ｆ．ＩＰ３Ｒの阻害は、ｏｂ／ｏｂにおいてＰＥＰＣＫ、Ｇ６Ｐａｓｅ、およびＰＧＣ１αの肝臓での発現を低減させる。図５０Ｇ〜Ｉ．ＩＰ３Ｒの阻害は、ＥＲストレスおよびインスリン耐性のモデルとしてのパルミチン酸塩処置肝細胞において、ＰＥＰＣＫ、Ｇ６Ｐａｓｅ、およびＰＧＣ１αの発現を低減させる。図５０Ｊ〜Ｋ．ＩＰ３Ｒの阻害は、インスリン耐性のモデルでとしてのＡＫt阻害肝細胞においてＧ６ＰａｓｅおよびＰＥＰＣＫを低減させる。図５０Ｌ．ＩＰ３Ｒ活性は、ホルスコリンに誘発されるＴＯＲＣ２の脱リン酸化に必要である。図５０Ｍ．ＩＰ３Ｒ活性化は、ＴＯＲＣ２の核保持に必要である。 ＩＰ３Ｒ経路を示す図である。 ＣＡ−ＣａＭＫＩＩは、ｐ３８欠損肝細胞において核内ＦｏｘＯ１を増加させない。ｐ３８ｆｌ／ｆｌマウス由来の初代肝細胞（ＨＣ）に、アデノ−ＬａｃＺまたはアデノ−Ｃｒｅを形質導入した。１２時間後、細胞の半数にアデノ−ＣＡ−ＣａＭＫＩＩを形質導入し、一方で残りの半数にはアデノ−ＬａｃＺを形質導入した。細胞を、血清枯渇培地中で一晩インキュベートし、次いで、血清不含培地中で５時間インキュベートした。核抽出物を、免疫ブロットによって、ＦｏｘＯ１およびヌクレオホスミン（Ｎｐ）についてアッセイした。 ＭＫ−２は、肝臓ＦｏｘＯ１の細胞内局在化および肝臓Ｇ６ＰｃおよびＰｃｋ１を調節する。図５３Ａ．アデノ−ＧＦＰ−ＦｏｘＯ１を形質導入したＨＣを、一晩血清枯渇させ、次いで、２ｕＭ ＭＫ−２阻害剤またはビヒクル（Ｖｅｈ）対照とともに、血清不含培地中で３０分間インキュベートした。ＦｏｘＯ１局在化を、間接免疫蛍光法によって評価した（バー１０μｍ、＊Ｐ＜０．００５、平均±標準誤差）。図５３Ｂ、ＷＴ ＨＣを、一晩血清枯渇させ、次いで、ＭＫ−２阻害剤ありまたはなしで、血清不含培地中で、１０ｎｍグルカゴンとともに５時間インキュベートした。ＲＮＡを、Ｇ６ｐｃおよびＰｃｋ１ ｍＲＮＡについてアッセイした（＊Ｐ＜０．００５、平均±標準誤差）。ＭＫ−２阻害剤は、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ（ｃａｔ＃４７５８６４）から入手した：２−（２−キノリン−３−イルピリジン−４−イル）−１，５，６，７−テトラヒドロ−４Ｈ−ピロロ−［３，２−ｃ］ピリジン−４−オン。 ｐ３８欠損は、ツニカマイシンに誘発されるＵＰＲ活性化を抑制する。ツニカマイシンを、アデノ−ＬａｃＺ対照またはアデノ−Ｃｒｅを形質導入したｐ３８ｆｌ／ｆｌマウス由来のＨＣに添加した。溶解物を、ｐ−ＰＥＲＫ、ＰＥＲＫ、ＣＨＯＰ、ｐ５８ＩＰＫ、およびアクチンについて免疫ブロットした。 ｐ３８欠損は、パルミチン酸塩に誘発されるＵＰＲ活性化を抑制する。パルミチン酸塩を、アデノ−ＬａｃＺ対照またはアデノ−Ｃｒｅを形質導入したｐ３８ｆｌ／ｆｌマウス由来のＨＣに添加した。溶解物を、ｐ−ＰＥＲＫ、ＣＨＯＰ、およびアクチンについて免疫ブロットした。 ＨＣにおける急性インスリン誘発性ｐ−ＡＫＴは、ｐ３８欠損によって強化される。ＨＣを５分間１００ｎＭインスリンで処置したことを除き、図５５と同様である。溶解物を、ｐ−Ａｋｔ、Ａｋｔ、およびアクチンについて免疫ブロットした。 図５７Ａ．マウスを、自由に給餌させたかまたは１２時間絶食させた。肝臓のリン酸化ｐ３８、全ｐ３８、ｐ−ＭＫ２、全ＭＫ−２、およびβ−アクチンを、免疫ブロットによってアッセイした。図５７Ｂ、ＷＴ ＨＣを、一晩血清枯渇させ、次いで、ＳＢ２０２１９０ありまたはなしで、血清不含培地中で１００ｎｍグルカゴンとともに５時間インキュベートし、グルカゴンを、アデノ−ＬａｃＺ（対照）またはアデノ−Ｃｒｅで処置したＰ３８ａｆｌ／ｆｌマウスに由来するＨＣに添加した。ＲＮＡを、Ｇ６ｐｃおよびＰｃｋ１ ｍＲＮＡについてアッセイした（＊Ｐ＜０．０５、平均±標準誤差）。図５７Ｃ．絶食ＷＴおよびＣａｍｋ２ｇ−／−マウスに由来するＨＣを、ｐ−ｐ３８、全ｐ３８、およびβ−アクチンについてアッセイした。図５７Ｄ．ＷＴマウスに、１２．５ｍｇ ｋｇ−１（体重）のｐ３８阻害剤（ＳＢ２０２１９０）またはビヒクル対照を腹腔内注射した。１２時間後、マウスに、追加用量のＳＢ２０２１９０を注射し、一晩絶食させた。肝臓を、核内ＦｏｘＯ１、ヌクレオホスミン、ｐ−ＭＫ２、全ＭＫ−２、およびβ−アクチンについてアッセイした。核内ＦｏｘＯ１およびｐ−ＭＫ２間の帯域強度の相関性を、グラフに示す。図５７Ｅ．アデノ−ＧＦＰ−ＦｏｘＯ１を形質導入したＨＣを、一晩血清枯渇させ、次いで、ＳＢ２０２１９０またはビヒクル（Ｖｅｈ）対照とともに、血清不含培地中で５分間インキュベートした。ＦｏｘＯ１局在化を、間接免疫蛍光法によって評価した（バー１０μｍ、＊Ｐ＜０．０５、平均±標準誤差）。 ｐ３８欠損は、ツニカマイシンに誘発されるＵＰＲ活性化を減少させる。ｐ３８αｆｌｏｘ／ｆｌｏｘマウスに由来する初代肝細胞に、５のＭＯＩで、対照アデノ−ＬａｃＺ（Ａｄ−ＬａｃＺ）またはアデノ−Ｃｒｅ（Ａｄ−Ｃｒｅ）を形質導入して、ｐ３８を欠失させた。３６時間後、細胞を、４時間０．５ｕｇ／ｍｌツニカマイシンで処置した。溶解物を、次いで、ｐ−Ｐｅｒｋ、ＣＨＯＰ、Ｔｒｂ３、ｐ５８ＩＰＫ、およびアクチンについて免疫ブロットした。 ｐ３８欠損は、パルミチン酸塩に誘発されるインスリン耐性を鈍化させる。ｐ３８ｆｌ／ｆｌマウスに由来する初代肝細胞に、５のＭＯＩで、アデノ−ＬａｃＺ（Ａｄ−ＬａｃＺ）またはアデノ−Ｃｒｅ（Ａｄ−Ｃｒｅ）を形質導入した。２４時間後、細胞を、パルミチン酸塩で一晩処置した。血清不含培地中でパルミチン酸塩とともに５時間インキュベートした後、細胞を、５分間１００ｎＭインスリンで処置した。溶解物を、次いで、ｐ−Ａｋｔ、Ａｋｔ、アクチン、ｐ−ｐｅｒｋ、ＣＨＯＰ、およびＴｒｂ３について免疫ブロットした。 ＣＡ−ＣａＭＫＩＩは、ｐ３８欠損肝細胞において核内ＦｏｘＯ１を増加させない：ＣａＭＫＩＩおよびｐ３８が、同じシグナル伝達経路であることの根拠。ｐ３８ｆｌ／ｆｌマウスに由来する初代肝細胞に、５のＭＯＩで、アデノ−ＬａｃＺ（Ａｄ−ＬａｃＺ）またはアデノ−Ｃｒｅ（Ａｄ−Ｃｒｅ）を一晩形質導入し、続いて、１のＭＯＩでアデノ−ＬａｃＺまたはアデノ−ＣＡ−ＣａＭＫＩＩ（ＣＡ）を形質導入した。１２時間後、細胞を、一晩血清枯渇させ、次いで、血清不含培地中で４時間インキュベートした。核抽出物を、免疫ブロットによって、ＦｏｘＯ１およびヌクレオホスミン（核充填対照）についてアッセイした。 優性阻害（ＤＮ）−ＭＫ２は、ホルスコリンに誘発されるＰｃｋ１およびＧ６Ｐｃの誘発を抑制する。ＷＴマウスに由来する初代肝細胞に、ＬａｃＺまたはＤＮ−ＭＫ２のいずれかを発現するアデノウイルスベクターを形質導入した。次いで、細胞を一晩血清枯渇させ、続いて、血清不含培地中で２μＭホルスコリンとともに５時間インキュベートした。ＲＮＡを、ＲＴ−ｑＰＣＲによって、Ｇ６ｐｃおよびＰｃｋ１ ｍＲＮＡについてアッセイした。＊Ｐ＜０．０００１ ＤＮ−ＭＫ２は、核内ＦｏｘＯ１レベルを減少させる。ＷＴマウスに由来する初代肝細胞に、１のＭＯＩでアデノ−ＬａｃＺ（ＬａｃＺ）またはアデノ−ＤＮ−ＭＫ２（ＤＮ−ＭＫ２）を形質導入した。２４時間後、細胞を、一晩血清枯渇させ、次いで、血清不含培地中で４時間インキュベートした。核抽出物を、免疫ブロットによって、ＦｏｘＯ１およびヌクレオホスミン（核充填対照）についてアッセイした。 構造的に活性な（ＣＡ）−ＣａＭＫＩＩは、ＭＫ−２が阻害された肝細胞において核内ＦｏｘＯ１を増加させない：ＣａＭＫＩＩおよびＭＫ２が同じシグナル伝達経路であることの根拠。ＷＴマウスに由来する初代肝細胞に、１のＭＯＩで、アデノ−ＬａｃＺ（ＬａｃＺ）またはアデノ−ＤＮ−ＭＫ２（ＤＮ−ＭＫ２）を一晩形質導入し、続いて、１のＭＯＩでアデノ−ＬａｃＺまたはアデノ−ＣＡ−ＣａＭＫＩＩ（ＣＡ−ＣａＭＫＩＩ）を形質導入した。１２時間後、細胞を、一晩血清枯渇させ、次いで、血清不含培地中で４時間インキュベートした。核抽出物を、免疫ブロットによって、ＦｏｘＯ１およびヌクレオホスミン（核充填対照）についてアッセイした。 肝臓ＭＫ−２阻害は、体重および食物摂取量を変化させない。１０週齢のｏｂ／ｏｂマウスに、対照ＬａｃＺ（ｎ＝５）またはＤＮ−ＭＫ−２（ｎ＝５）を含有する１×１０＾９ｐｆｕのアデノウイルスを注射した。 肝臓のＭＫ−２阻害は、肥満マウスにおける高血糖を改善する。１０週齢のｏｂ／ｏｂマウスに、対照ＬａｃＺ（ｎ＝５）またはＤＮ−ＭＫ−２（ｎ＝５）を含有する１×１０＾９ｐｆｕのアデノウイルスを注射した。３日目における６時間の絶食後血中グルコースレベル、＊＊＝ｐ＜０．０５ 肝臓のＭＫ−２阻害は、肥満マウスにおける高血糖を改善する（絶対値）。グルコース寛容性試験（０．５ｇ／ｋｇ腹腔内）を、５日目に行った（各群についてｎ＝５）＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１、＊＊＊＝ｐ＜０．００５ 肝臓のＭＫ−２阻害は、肥満マウスにおける高血糖を改善する（時間に相対的＝０）。グルコース寛容性試験（０．５ｇ／ｋｇ腹腔内）を、５日目に行った（各群についてｎ＝５）＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１、＊＊＊＝ｐ＜０．００５ 肝臓のＭＫ−２阻害は、肥満マウスにおいて高インスリン血症を改善する。１０週齢のｏｂ／ｏｂマウスに、対照ＬａｃＺ（ｎ＝５）またはＤＮ−ＭＫ−２（ｎ＝５）を含有する１×１０＾９ｐｆｕのアデノウイルスを注射した。８日目における６時間の血清インスリンレベル、＊＊＝ｐ＜０．０５ ＭＫ−２阻害剤は、初代肝細胞における、ホルスコリンに誘発されるＰｃｋ１およびＧ６Ｐｃの誘発を抑制する。ＷＴマウスに由来する初代肝細胞を、一晩血清枯渇させ、次いで、３００ｎＭ ＭＫ−２阻害剤（化合物２８）またはビヒクルで１時間前処置した。細胞を、次いで、阻害剤ありまたはなしで、血清不含培地中において２μＭホルスコリンで４時間処置した。ＲＮＡを、ＲＴ−ｑＰＣＲによってＧ６ｐｃおよびＰｃｋ１ ｍＲＮＡについてアッセイした。＊Ｐ＜０．０００１。 肥満マウスにおけるＭＫ−２阻害剤研究（Ｈｕａｎｇら＊からの化合物２８）。−ＭＫ−２阻害剤（１０μｇ／マウス、０．２ｍｇ／ｋｇ）またはビヒクル対照を、１日１回腹腔内注射によってｏｂ／ｏｂマウスに投与した（総量１５０ｕｌで）。Ｈｕａｎｇ Ｘ，Ｚｈｕ Ｘ，Ｃｈｅｎ Ｘ，Ｚｈｏｕ Ｗ，Ｘｉａｏ Ｄ，Ｄｅｇｒａｄｏ Ｓ，Ａｓｌａｎｉａｎ Ｒ，Ｆｏｓｓｅｔｔａ Ｊ，Ｌｕｎｄｅｌｌ Ｄ，Ｔｉａｎ Ｆ，Ｔｒｉｖｅｄｉ Ｐ，Ｐａｌａｎｉ Ａ．Ｂｉｏｏｒｇ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ Ｌｅｔｔ．２０１２ Ｊａｎ １；２２（１）：６５−７０，“Ａ ｔｈｒｅｅ−ｓｔｅｐ ｐｒｏｔｏｃｏｌ ｆｏｒ ｌｅａｄ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ：ｑｕｉｃｋ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｋｅｙ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ ｆｅａｔｕｒｅｓ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ ｔｈｅ ＳＡＲ ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｆ ｎｏｎ−ＡＴＰ ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ ＭＫ２（ＭＡＰＫＡＰＫ２）ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ”．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｍｅｒｃｋ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，２０１５ Ｇａｌｌｏｐｉｎｇ Ｈｉｌｌ Ｒｏａｄ，Ｋｅｎｉｌｗｏｒｔｈ，ＮＪ ０７０３３，ＵＳＡを参照されたい。 ＭＫ−２阻害剤が体重を変化させないことを示す。１０週齢のｏｂ／ｏｂマウスに、１日１回腹腔内注射によってＭＫ−２阻害剤を投与した（総量１５０ｕｌ）。 ＭＫ−２阻害剤が食物摂取量を変化させないことを示す。１０週齢のｏｂ／ｏｂマウスに、１日１回腹腔内注射によってＭＫ−２阻害剤を投与した（総量１５０ｕｌ）。 ＭＫ−２阻害剤が絶食時血中グルコースを減少させることを示す。１０週齢のｏｂ／ｏｂマウスに、１日１回腹腔内注射によってＭＫ−２阻害剤を投与した（総量１５０ｕｌ）。５日目における６時間の絶食後の血中グルコースレベル。＊ｐ＜０．０５ ＭＫ−２阻害剤が、肥満マウスにおける高血糖を改善することを示す。１０週齢のｏｂ／ｏｂマウスに、１日１回腹腔内注射によってＭＫ−２阻害剤を投与した（総量１５０ｕｌ）。グルコース寛容性試験（０．５ｇ／ｋｇ腹腔内）を、７日目に行った。＊ｐ＜０．０５ ＭＫ−２阻害剤が、肥満マウスにおけるインスリン耐性を改善することを示す。１０週齢のｏｂ／ｏｂマウスに、１日１回腹腔内注射によってＭＫ−２阻害剤を投与した（総量１５０ｕｌ）。インスリン寛容性試験（１．５ＩＵ／ｋｇ）を、１２日目に行った。＊ｐ＜０．０５ ＭＫ−２阻害剤が絶食時インスリンレベルを減少させることを示す。１０週齢のｏｂ／ｏｂマウスに、１日１回腹腔内注射によってＭＫ−２阻害剤を投与した（総量１５０ｕｌ）。１０日目における６時間の絶食後のインスリンレベル。＊ｐ＜０．０５ ＭＫ−２阻害剤が総ＷＢＣを変化させないことを示す。１０週齢のｏｂ／ｏｂマウスに、１日１回腹腔内注射によってＭＫ−２阻害剤を投与した（総量１５０ｕｌ）。１８日めの総ＷＢＣ数レベル。 ｐ３８によるインビトロでのＦｏｘＯ１のリン酸化。１ｕｇのＷＴ ＧＳＴ−ＦｏｘＯ１またはＧＳＴ対照を、２５ｍＭ トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭ β−グリセロリン酸塩、２ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）、０．１ｍＭ Ｎａ３ＶＯ４、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、および２．５μＣｉ［γ−３２Ｐ］ＡＴＰを含有する１５ｕｌのキナーゼ緩衝液中で、２５ｕｇの活性化ｐ３８（Ｕｐｓｔａｔｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）とともに、３０℃で３０分間インキュベートした。試料を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離させ、オートラジオグラフィーによって視覚化し、続いて免疫ブロット分析を行った。 ＭＫ−２によるインビトロでのＦｏｘＯ１のリン酸化。１ｕｇのＷＴ ＧＳＴ−Ｆｏｘｏ１、ＧＳＴ（対照）、またはＧＳＴ−Ｈｓｐ２５を、２５ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭ β−グリセロリン酸塩、２ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）、０．１ｍＭ Ｎａ３ＶＯ４、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、および２．５μＣｉ［γ−３２Ｐ］ＡＴＰを含有する１５ｕｌのキナーゼ緩衝液中で、２５ｕｇの活性化ＭＫ−２（Ｕｐｓｔａｔｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）ありまたはなしで、３０℃で３０分間インキュベートした。試料を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離させ、オートラジオグラフィーによって視覚化し、続いて免疫ブロット分析を行った。 優性阻害ＭＫ２は、ｏｂ／ｏｂマウスにおける肝臓のＧ６ｐｃを低下させる。９週齢のＷＴマウスに、対照ＬａｃＺ（ｎ＝５）またはＤＮ−ＭＫ２（ｎ＝５）のいずれかを含有する１×１０９ｐｆｕのアデノウイルスを注射した。肝臓Ｇ６ｐｃ ｍＲＮＡを、注射の８日後に分析した。（＊ｐ＜０．０５）。 ＭＫ−２阻害剤は、ｏｂ／ｏｂマウスの肝臓におけるＦｏｘＯ１標的遺伝子を低下させる。１０週齢のｏｂ／ｏｂマウスを、１日１回の腹腔内注射によって、ＭＫ−２阻害剤（０．２ｍｇ／ｋｇ）またはビヒクル対照で２０日間処置した。肝臓のＧ６ｐｃ、Ｐｃｋ１、およびＩｇｆｂｐ−１ ｍＲＮＡを、ｑＲＴ-ＰＣＲによって分析した。（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０５）。図８０〜８５で使用したＭＫ−２阻害剤は、Ｈｕａｎｇ Ｘ，Ｚｈｕ Ｘ，Ｃｈｅｎ Ｘ，Ｚｈｏｕ Ｗ，Ｘｉａｏ Ｄ，Ｄｅｇｒａｄｏ Ｓ，Ａｓｌａｎｉａｎ Ｒ，Ｆｏｓｓｅｔｔａ Ｊ，Ｌｕｎｄｅｌｌ Ｄ，Ｔｉａｎ Ｆ，Ｔｒｉｖｅｄｉ Ｐ，Ｐａｌａｎｉ Ａ． Ｂｉｏｏｒｇ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ Ｌｅｔｔ．２０１２ Ｊａｎ １；２２（１）：６５−７０，“Ａ ｔｈｒｅｅ−ｓｔｅｐ ｐｒｏｔｏｃｏｌ ｆｏｒ ｌｅａｄ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ： ｑｕｉｃｋ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｋｅｙ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ ｆｅａｔｕｒｅｓ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ ｔｈｅ ＳＡＲ ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｆ ｎｏｎ−ＡＴＰ ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ ＭＫ２（ＭＡＰＫＡＰＫ２ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ”．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｍｅｒｃｋ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，２０１５ Ｇａｌｌｏｐｉｎｇ Ｈｉｌｌ Ｒｏａｄ，Ｋｅｎｉｌｗｏｒｔｈ，ＮＪ ０７０３３，ＵＳＡに記載されている化合物２８である。 ＭＫ−２阻害剤は、ｏｂ／ｏｂマウスにおける肝臓のインスリンシグナル伝達を改善する。１０週齢のｏｂ／ｏｂマウスを、１日１回の腹腔内注射によって、ＭＫ−２阻害剤（０．２ｍｇ／ｋｇ）またはビヒクル対照で２０日間処置した。６時間の絶食後に、インスリン（２ＩＵ／ｋｇ）を、門脈を通じて３分間注射した。肝臓のリン酸化Ａｋｔ（セリン４７３）および総Ａｋｔレベルを、ウエスタンブロットによって分析した。面基ブロットデータの濃度測定的定量化を、グラフに示す。（＊ｐ＜０．０５）。 ＭＫ−２阻害剤は、ｏｂ／ｏｂマウスの肝臓におけるＣｈｏｐおよびＴｒｉｂ３ ｍＲＮＡを低下させる。肝臓ＣｈｏｐおよびＴｒｂ３ ｍＲＮＡレベルを分析したことを除いて、図８０と同様である。（＊ｐ＜０．０５）。 ＭＫ−２阻害剤は、ｏｂ／ｏｂマウスの肝臓におけるＦＡ合成ｍＲＮＡおよびＴｎｆａ ｍＲＮＡを低下させる。肝臓Ｆａｓ、Ｓｃｄ１、Ｓｒｅｂｐ１、ＴｎｆａｍＲＮＡレベルを分析したことを除いて、図８０と同様である。（＊ｐ＜０．０５）。 ＭＫ−２阻害剤に誘発されるＦＢＧの減少は、メトホルミンにより付加される。１０週齢のｏｂ／ｏｂマウスを、ビヒクル対照、ＭＫ−２阻害剤（０．２ｍｇ／ｋｇ）単独、メトホルミン（２５０ｍｇ／ｋｇ）単独、またはＭＫ−２阻害剤とメトホルミンとを合わせた１日１回の注射で５日間処置した。６時間の絶食後の血中グルコースレベルを示す。（＊ｐ＜０．０５）。 ＭＫ−２阻害剤に媒介される肝臓Ｇ６ｐｃの減少は、メトホルミンにより付加される。肝臓Ｇ６Ｐｃ ｍＲＮＡをｑＲＴ-ＰＣＲによって分析したことを除き、図８４と同様である。（＊ｐ＜０．０５）。 ｐ３８欠損は、ツニカマイシンに誘発されるＵＰＲ活性化およびＴｒｂ３の上方調節を抑制する。ｐ３８ ｌｏｘＰ導入マウスに由来する初代肝細胞に、１０のＭＯＩで、ＬａｃＺまたはＣｒｅを発現するアデノウイルスベクターを形質導入した。トランスフェクションの３６時間後、細胞を、ツニカマイシン（１μｇ／ｍｌ）で４時間処置した。細胞溶解物を、免疫ブロットによって、リン酸化Ｐｅｒｋ、Ｐｅｒｋ、Ｃｈｏｐ、β−アクチン、およびＴｒｂ３についてアッセイした。 ｐ３８欠損は、Ｔｒｂ３ ｍＲＮＡレベルを抑制する。ｐ３８ ｌｏｘＰ導入マウスに由来する初代肝細胞に、１０のＭＯＩで、ＬａｃＺまたはＣｒｅを発現するアデノウイルスベクターを形質導入した。トランスフェクションの２４時間後、細胞を、パルミチン酸塩（３００μｍ）で１８時間処置した。Ｔｒｂ３ ｍＲＮＡを、ｑＲＴ-ＰＣＲによってアッセイした。（†Ｐ＜０．０００５、＊Ｐ＜０．０００１）。 ｐ３８−／−肝細胞における急性インスリン誘発性ｐ−ＡＫＴ強化は、Ａｄ−Ｔｒｂ３の形質導入によって回復される。ｐ３８ ｌｏｘＰ導入マウスに由来する初代マウス肝細胞に、１０のＭＯＩで、ＬａｃＺまたはＣｒｅを発現するアデノウイルスベクターを形質導入した。一晩インキュベートした後、アデノ−Ｃｒｅ処置細胞の半数に、アデノ−Ｔｒｂ３を形質導入し、一方で残りの細胞にはアデノ−ＬａｃＺを受容させた。１２時間後、細胞を、パルミチン酸塩（３００μｍ）で１４時間処置し、続いて、血清不含培地中で５時間処置した。血清不含培地中で５時間インキュベートした後、細胞を、インスリン（１００ｎｍ）で５分間刺激した。細胞溶解物を、次いで、免疫ブロットによって、リン酸化Ａｋｔ（セリン４７３）、Ａｋｔ、Ｔｒｂ３、およびβ−アクチンについてアッセイした。
本明細書において参照される特許および科学文献は、当業者に利用可能な知識を確立する。本明細書に引用される発行済みの特許、出願、および他の出版物は、それぞれが、参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示されるのと同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。
当業者には明らかなように、本明細書に記載される任意の方法または組成物は、本明細書に記載される任意の他の方法または組成物に関して実装され得る。
定義および略語
単数形の「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、文脈によりそうでないことが明確に示されない限り、複数形の参照を含む。
特許請求の範囲および／または明細書において「含む」という用語と併せて使用される際、「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」という単語の使用は、「１つ」を意味し得るが、「１つ以上」、「少なくとも１つ」、および「１つまたは１つを上回る」の意味とも一致する。
「約」という用語は、おおよそ、ほぼ、大体、または前後を意味して本明細書に使用される。「約」という用語が数値範囲と併せて使用される場合、その範囲を、記載される数値範囲の上下に境界を拡大して修飾する。一般に、「約」という用語は、数値を、記述された値の上下２０％の差異で修飾して、本明細書に使用される。
本明細書に使用される際、「ＣａＭＫＩＩ」という略語は、酵素カルシウムカルモジュリン依存性キナーゼＩＩを指し、そのアイソフォームおよびそれらのスプライス変異体の全てを含む。遺伝子のオープンリーディングフレームの核酸配列を含むがこれらに限定されない、ＣａＭＫＩＩの異なるアイソフォームをコードする遺伝子の核酸配列は、当該技術分野で既知である。遺伝子のオープンリーディングフレームの核酸配列を含むがこれらに限定されない、ヒトＣａＭＫＩＩの異なるアイソフォームをコードする遺伝子の核酸配列は、当該技術分野で既知である。ヒトＣａＭＫＩＩポリペプチドおよびタンパク質のアミノ酸配列を含むがこれらに限定されない、ＣａＭＫＩＩポリペプチドおよびタンパク質のアミノ酸配列は、当該技術分野で既知である。転写変異体およびスプライス変異体の配列もまた、当該技術分野で既知である（例えば、Ｃｏｕｃｈｏｎｎａｌ ａｎｄ Ａｎｄｅｒｓｏｎ，２００８を参照されたく、これは、参照によりその全体が組み込まれる）。ハツカネズミＣａＭＫＩＩ−γの核酸配列の受託番号は、ＮＭ＿１７８５９７であり、ヒトＣａＭＫＩＩ−γの核酸配列の受託番号は、ＮＭ＿１７２１７１．２である。ハツカネズミＣａＭＫＩＩ−γのアミノ酸配列の受託番号は、ＮＰ＿８４８７１２．２であり、ヒトＣａＭＫＩＩ−γのアミノ酸配列の受託番号は、ＮＰ＿７５１９１１．１である。
本明細書に使用される際、「ＩＰ３Ｒ」という略語は、イノシトール１，４，５−三リン酸塩受容体を指し、そのアイソフォームおよびそれらのスプライス変異体の全てを含む。ＩＰ３Ｒファミリー内で、複数のアイソフォームが識別され、特徴付けられている。「ＩＰ３Ｒ１」という略語は、ＩＰ３ＲアイソフォームＩを指し、「ＩＰ３Ｒ２」という略語は、ＩＰ３ＲアイソフォームＩＩを指し、「ＩＰ３Ｒ３」という略語は、ＩＰ３ＲアイソフォームＩＩＩを指す。遺伝子のオープンリーディングフレームの核酸配列を含むがこれらに限定されない、ＩＰ３Ｒの異なるアイソフォームをコードする遺伝子の核酸配列は、当該技術分野で既知である。遺伝子のオープンリーディングフレームの核酸配列を含むがこれらに限定されない、ヒトＩＰ３Ｒの異なるアイソフォームをコードする遺伝子の核酸配列は、当該技術分野で既知である。異なるＩＰ３ＲアイソフォームのヒトＩＰ３Ｒポリペプチドおよびタンパク質のアミノ酸配列を含むがこれらに限定されない、ＩＰ３Ｒポリペプチドおよびタンパク質のアミノ酸配列は、当該技術分野で既知である。ハツカネズミＩＰ３Ｒ１の核酸配列の受託番号は、ＮＭ＿０１０５８５．５であり、ヒトＩＰ３Ｒ１の核酸配列の受託番号は、ＮＭ＿００１０９９９５２．２である。ハツカネズミＩＰ３Ｒ１のアミノ酸配列の受託番号は、ＮＰ＿０３４７１５．３であり、ヒトＩＰ３Ｒ１のアミノ酸配列の受託番号は、ＮＰ＿００１０９３４２２．２である。ＩＰ３Ｒについてのさらなる情報は、例えば、Ｗｅｈｒｅｎｓ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｐｈｙｓｉｏｌ．，６７：６９−９８．“Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｌｃｉｕｍ ｒｅｌｅａｓｅ ａｎｄ ｃａｒｄｉａｃ ｄｉｓｅａｓｅ”を参照されたく、また、Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ．７３：４３７−６５．“Ｉｎｏｓｉｔｏｌ １，４，５−ｔｒｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ａｓ ｓｉｇｎａｌ ｉｎｔｅｇｒａｔｏｒｓ．”、およびＶｏｌｐｅ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ．；２５８（６ Ｐｔ １）：Ｃ１０８６−９１．“Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｏｓｉｔｏｌ １，４，５−ｔｒｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ Ｃａ２＋ ｒｅｌｅａｓｅ．ＩＩ．Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｃＡＭＰ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ．”を参照されたく、これらの全ては参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書に使用される際、「ｐ３８」という略語は、ｐ３８マイトジェン活性化タンパク質（ＭＡＰ）キナーゼのいずれかを指す。ｐ３８−α（ＭＡＰＫ１４としても知られる）、ｐ３８−β（ＭＡＰＫ１１としても知られる）、ｐ３８−γ（ＭＡＰＫ１２／ＥＲＫ６としても知られる）、およびｐ３８−δ（ＭＡＰＫ１３／ＳＡＰＫ４としても知られる）を含む、いくつかのｐ３８ＭＡＰキナーゼが識別されている。遺伝子のオープンリーディングフレームの核酸配列を含むがこれらに限定されない、ｐ３８をコードする遺伝子の核酸配列は、当該技術分野で既知である。遺伝子のオープンリーディングフレームの核酸配列を含むがこれらに限定されない、ヒトｐ３８をコードする遺伝子の核酸配列は、当該技術分野で既知である。ヒトｐ３８ポリペプチドおよびタンパク質のアミノ酸配列を含むがこれらに限定されない、ｐ３８ポリペプチドおよびタンパク質のアミノ酸配列は、当該技術分野で既知である。ハツカネズミｐ３８−α（ＭＡＰＫ１４）の核酸配列の受託番号は、ＮＭ＿０１１９５１．３であり、ヒトｐ３８−α（ＭＡＰＫ１４）の核酸配列の受託番号は、ＮＭ＿００１３１５．２である。ハツカネズミｐ３８−α（ＭＡＰＫ１４）のアミノ酸配列の受託番号は、ＮＰ＿０３６０８１．１であり、ヒトｐ３８−α（ＭＡＰＫ１４）のアミノ酸配列の受託番号は、ＮＰ＿００１３０６．１である。ｐ３８についてのさらなる情報は、Ｍａｒｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｊ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｃａｒｄｉｏｌ．；５１（４）：４８５−９０“Ｔｈｅ ｐ３８ ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ｐａｔｈｗａｙ−−ａ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｔａｒｇｅｔ ｆｏｒ ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎ ｉｎ ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ，ｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｙ，ａｎｄ ｈｅａｒｔ ｆａｉｌｕｒｅ．”を参照されたく、また、Ｋｏｓｔｅｎｋｏ ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｗｏｒｌｄ Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２６；２（５）：７３−８９．“Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｒｏｌｅｓ ｏｆ ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ−ｐｒｏｔｅｉｎ−ｋｉｎａｓｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐ３８−ｒｅｇｕｌａｔｅｅｄ／ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ．”、およびＣｕａｄｒａｄｏ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．；４２９（３）：４０３−１７．“Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ｐ３８ ＭＡＰＫ ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ．”を参照されたく、これらの全ては、参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書に使用される際、「ＭＫ２」という略語は、ＭＡＰキナーゼ活性化タンパク質キナーゼ２（またはＭＡＰＫＡＰＫ２）としても知られる、ｐ３８活性化キナーゼＭＫ２を指す。遺伝子のオープンリーディングフレームの核酸配列を含むがこれらに限定されない、ＭＫ２をコードする遺伝子の核酸配列は、当該技術分野で既知である。遺伝子のオープンリーディングフレームの核酸配列を含むがこれらに限定されない、ヒトＭＫ２をコードする遺伝子の核酸配列は、当該技術分野で既知である。ＭＫ２ポリペプチドおよびタンパク質のアミノ酸配列は、ヒトＭＫ２ポリペプチドおよびタンパク質のアミノ酸配列は、当該技術分野で既知である。ハツカネズミＭＫ２の核酸配列の受託番号は、ＮＭ＿００８５５１であり、ヒトＭＫ２の核酸配列の受託番号は、ＮＭ＿００４７５９．４である。ハツカネズミＭＫ２のアミノ酸配列の受託番号は、ＮＰ＿０３２５７７．１であり、ヒトＭＫ２のアミノ酸配列の受託番号は、ＮＰ＿００４７５０．１である。
本明細書に使用される際、「ＭＫ３」という略語は、ＭＡＰキナーゼ活性化タンパク質キナーゼ３（またはＭＡＰＫＡＰＫ３）としても知られる、ｐ３８活性化キナーゼＭＫ３を指す。遺伝子のオープンリーディングフレームの核酸配列を含むがこれらに限定されない、ＭＫ３をコードする遺伝子の核酸配列は、当該技術分野で既知である。遺伝子のオープンリーディングフレームの核酸配列を含むがこれらに限定されない、ヒトＭＫ３をコードする遺伝子の核酸配列は、当該技術分野で既知である。ヒトＭＫ３ポリペプチドおよびタンパク質のアミノ酸配列を含む、ＭＫ３ポリペプチドおよびタンパク質のアミノ酸配列は、当該技術分野で既知である。「ＭＫ２／３」という略語は、ＭＫ２もしくはＭＫ３、またはＭＫ２およびＭＫ３の両方を指す。ハツカネズミＭＫ３の核酸配列の受託番号は、ＮＭ＿１７８９０７．３であり、ヒトＭＫ３の核酸配列の受託番号は、ＮＭ＿００１２４３９２６．１である。ハツカネズミＭＫ３のアミノ酸配列の受託番号は、ＮＰ＿８４９２３８であり、ヒトＭＫ３のアミノ酸配列の受託番号は、ＮＰ＿００４６２６．１である。ＭＫ２およびＭＫ３についてのさらなる情報は、Ｇａｅｓｔｅｌ ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．７（２）：１２０−３０．“ＭＡＰＫＡＰ ｋｉｎａｓｅｓ−ＭＫｓ−ｔｗｏ’ｓ ｃｏｍｐａｎｙ，ｔｈｒｅｅ’ｓ ａ ｃｒｏｗｄ．”を参照されたく、また、Ｓｈｉｒｙａｅｖ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌ．；２２（８）：１１８５−９２．“Ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ｐ３８ ａｎｄ ＭＫ２，ＭＫ３ ａｎｄ ＭＫ５：ｍｅｎａｇｅ ａ ｔｒｏｉｓ ｏｒ ｍｅｎａｇｅ ａ ｑｕａｔｒｅ？”およびＫｏｔｌｙａｒｏｖ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｏｃ Ｔｒａｎｓ．；３０（Ｐｔ ６）：９５９−６３．“Ｉｓ ＭＫ２（ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ２）ｔｈｅ ｋｅｙ ｆｏｒ ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ？”を参照されたく、これらの全ては、参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書に使用される際、「カルシニューリン」という用語は、タンパク質ホスファターゼカルシニューリンの触媒ユニット、もしくはタンパク質ホスファターゼカルシニューリンの調節サブユニットのいずれか、またはその両方を指し、それらのアイソフォームおよびそれらのスプライス変異体の全てを含む。遺伝子のオープンリーディングフレームの核酸配列を含むがこれらに限定されない、カルシニューリンのサブユニットの異なるアイソフォームをコードする遺伝子の核酸配列は、当該技術分野で既知である。遺伝子のオープンリーディングフレームの核酸配列を含むがこれらに限定されない、ヒトカルシニューリンのサブユニットの異なるアイソフォームをコードする遺伝子の核酸配列は、当該技術分野で既知である。ヒトカルシニューリンポリペプチドおよびタンパク質を含むがこれらに限定されない、カルシニューリンポリペプチドおよびタンパク質のアミノ酸配列は、当該技術分野で既知である。ハツカネズミカルシニューリンサブユニットＢの核酸配列の受託番号は、ＮＭ＿０２４４５９．２であり、ヒトカルシニューリン触媒サブユニットの核酸配列の受託番号は、ＮＭ＿０００９４４．４である。ハツカネズミカルシニューリンサブユニットＢのアミノ酸配列の受託番号は、ＮＰ＿０７７７７９．２であり、ヒトカルシニューリン触媒サブユニットのアミノ酸配列の受託番号は、ＮＰ＿０００９３５．１である。カルシニューリンについてのさらなる情報は、Ｗｉｌｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ．１；３２２（４）：１１７８−９１．“Ｃａｌｃｉｕｍ−ｃａｌｃｉｎｅｕｒｉｎ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｉｎ ｔｈｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｒｄｉａｃ ｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｙ．”を参照されたく、また、Ｐｅｒｉａｓａｍｙ，２００２，Ｊ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｃａｒｄｉｏｌ．３４（３）：２５９−６２．“Ｃａｌｃｉｎｅｕｒｉｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｈｅａｒｔｂｅａｔ，ａｎ ｅｖｏｌｖｉｎｇ ｓｔｏｒｙ．”およびＢｕｃｈｈｏｌｚ ｅｔ ａｌ．，２００７，Ｃｅｌｌ Ｃｙｃｌｅ．６（１）：１６−９．“Ａｎ ｅｍｅｒｇｉｎｇ ｒｏｌｅ ｆｏｒ Ｃａ２＋／ｃａｌｃｉｎｅｕｒｉｎ／ＮＦＡＴ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｉｎ ｃａｎｃｅｒｏｇｅｎｅｓｉｓ．”を参照されたく、これらの全ては、参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書に使用される際、「代謝症候群」という用語は、併発すると、心血管疾患、脳卒中、および２型糖尿病の危険性を増加させる、医学的障害の組み合わせを記載して使用される。これらの障害には、中心性肥満（身体の中央部および上部の周辺の過体重）、インスリン耐性、加齢、ストレス、ホルモンの変化、過剰な血液凝固、低ＨＤＬを含む脂質異常症、心臓疾患を促進するＬＤＬの一種、およびアポリポタンパク質Ｂ１００の上昇が含まれるが、これらに限定されない。
治療および予防のための方法。
本発明は、カルシウム感知酵素であるＣａＭＫＩＩが、カルシウムおよびＩＰ３Ｒに依存する方式で、初代ＨＣではｃＡＭＰおよびグルカゴンによって、ならびにインビボではグルカゴンおよび絶食によって、活性化されるという発見に関する。ＣａＭＫＩＩの遺伝的欠損または阻害は、そのリン酸化に影響を及ぼすことによってＦｏｘＯ１の核転座を遮断し、絶食およびグルカゴン／ｃＡＭＰに誘発されるグリコーゲン分解およびグルコース新生を損傷し、血中グルコースレベルを低下させるが、構造的に活性なＣａＭＫＩＩは、逆の効果を有する。ＣａＭＫＩＩ欠損がグルコース代謝に及ぼす抑制効果は、構造的に核内のＦｏｘＯ１の形質導入によって無効となり、ＣａＭＫＩＩ欠損の効果が、ＦｏｘＯ１の核排除を必要とすることを示す。この同じ経路はまた、肥満環境下における過剰なＨＧＰにも関与する。これらの結果は、ＦｏｘＯ１核局在化および肝臓のグルコース恒常性に関与する、カルシウムに媒介されるシグナル伝達経路を明らかにする。
本発明はまた、ＩＰ３受容体と称される肝臓カルシウム輸送体およびカルシニューリンと称される肝臓ホスファターゼ酵素の２つの薬物標的の阻害剤が、このニッチにおいては非常に貴重であることを示す肥満モデルにおける検証を含む、発見に関する。肥満および２型糖尿病において過剰に活性化される肝臓のグルコース生成（ＨＧＰ）におけるＩＰ３受容体およびカルシニューリンの新たな役割が、最近発見された。絶食時または肥満におけるグルカゴンは、ＩＰ３受容体、およびＩＰ３Ｒに誘発される小胞体からサイトゾルへのカルシウム放出を活性化する。放出されたカルシウムは、次いで、２つのカルシウム感受性酵素を活性化する。酵素のうちの１つは、ＣａＭＫＩＩである。ＣａＭＫＩＩの活性化は、それがＦｏｘＯ１の核への侵入を促進するため必須であり、これは、次いでＨＧＰのための遺伝子を誘発し、肥満のマウスモデルにおいて絶食時高血糖および代謝異常に部分的に関与する。カルシニューリンは、放出されたカルシウムによって活性化される、もう一方の酵素である。カルシニューリンは、Ｃｒｔｃ２と称される別の転写因子を脱リン酸化し、したがって核へのその侵入を促進する、ホスファターゼである。Ｃｒｔｃ２は、ＦｏｘＯ１と一緒に機能して、肥満においてＨＧＰのための遺伝子を誘発する。したがって、Ｃｒｔｃ２の阻害は、ＣａＭＫＩＩのものと同様に、肥満のマウスモデルにおいて、絶食時高血糖を抑制する。したがって、本発明は、肥満およびインスリン耐性の前臨床モデルにおけるＩＰ３受容体およびカルシニューリン阻害剤の開発および試験を提供する。
最後に、本発明は、ｐ３８およびＭＫ２／３の阻害剤がまた、このニッチにおいて非常に貴重であり得るという発見に関する。
本発明は、対象における代謝障害の治療または予防の方法、代謝障害を有する対象における冠動脈疾患の治療または予防の方法、ならびに対象における肝臓のグルコース生成を低減する方法を提供する。本発明は、対象に、ＩＰ３Ｒ１、ＩＰ３Ｒ２、およびＩＰ３Ｒ３、カルシニューリン、ｐ３８、ＭＫ２／３、またはそれらの組み合わせを含むがこれらに限定されない、ＣａＭＫＩＩ、ＩＰ３Ｒの活性を阻害または低減する本主題の化合物（複数可）を投与することによって、対象における代謝障害の治療および／または予防、代謝障害を有する対象における冠動脈疾患の治療および／または予防、ならびに対象における肝臓のグルコース生成を低減する方法を、提供する。
本発明はまた、ＣａＭＫＩＩの活性を阻害するか、またはＣａＭＫＩＩの活性および／もしくは活性化を低減させる、化合物を識別する方法を提供する。本発明は、したがって、肥満、１型糖尿病、および２型糖尿病の代謝異常を予防するためのＣａＭＫＩＩの阻害剤のスクリーニング、開発、および試験もまた提供する。本発明は、肥満、１型糖尿病、および２型糖尿病の代謝異常の予防のためのＣａＭＫＩＩの阻害剤を、ＩＰ３Ｒ１、ＩＰ３Ｒ２、およびＩＰ３Ｒ３を含むがこれらに限定されないＩＰ３Ｒの阻害剤、カルシニューリン、ｐ３８、ならびに／またはＭＫ２／３等であるがこれらに限定されない他の阻害剤と組み合わせて、スクリーニング、開発、および試験することを提供する。
本発明はまた、肥満、１型糖尿病、および２型糖尿病の代謝異常を予防するための、ＩＰ３Ｒ１、ＩＰ３Ｒ２、およびＩＰ３Ｒ３を含むがこれらに限定されないＩＰ３Ｒの阻害剤、ならびにカルシニューリンの阻害剤のスクリーニング、開発、および試験を提供する。本発明はさらに、ＣａＭＫＩＩ、カルシニューリン、ｐ３８および／またはＭＫ２／３阻害剤等であるがこれらに限定されない他の阻害剤と組み合わせて、肥満、１型糖尿病、および２型糖尿病の代謝異常を予防するための、ＩＰ３Ｒ１、ＩＰ３Ｒ２、およびＩＰ３Ｒ３を含むがこれらに限定されないＩＰ３Ｒの阻害剤、ならびに／またはカルシニューリンの阻害剤のスクリーニング、開発、および試験を提供する。
本発明はまた、肥満、１型糖尿病、および２型糖尿病の代謝異常を予防するためのｐ３８およびＭＫ２／３の阻害剤のスクリーニング、開発、および試験を提供する。本発明は、ＣａＭＫＩＩ、ＩＰ３Ｒ１、ＩＰ３Ｒ２、およびＩＰ３Ｒ３を含むがこれらに限定されないＩＰ３Ｒ、ならびに／またはカルシニューリンの阻害剤等であるがこれらに限定されない他の阻害剤と組み合わせて、肥満、１型糖尿病、および２型糖尿病の代謝異常を予防するためのｐ３８およびＭＫ２／３のスクリーニング、開発、および試験をさらに提供する。
ある特定の態様において、本明細書に記載される発明は、ＣａＭＫＩＩの阻害剤が、肥満に誘発されるインスリン耐性ならびに肝臓のグルコースおよび脂肪の代謝における異常を治療することができるという所見に基づく。
ある特定の態様において、本明細書に記載される発明は、代謝異常、ならびに肥満、代謝症候群、１型糖尿病、および２型糖尿病におけるそれらの影響を改善するための薬物開発の目的で、ＣａＭＫＩＩ阻害剤を提供する。
ある特定の態様において、本明細書に記載される発明は、心臓疾患を含む、肥満、代謝症候群、および２型糖尿病といったインスリン耐性状態の代謝異常を治療および診断するための方法を提供する。
ある特定の態様において、本発明は、グルカゴンに媒介される肝臓のグルコース生成（ＨＧＰ）における肝臓ＣａＭＫＩＩの役割に関連する所見に関する。
本明細書に記載される際、ＣａＭＫＩＩは、初代肝細胞ではグルカゴンによって、ならびにインビボではグルカゴンおよび絶食によって活性化される。肝臓ＣａＭＫＩＩの遺伝的欠損または阻害は、血中グルコースレベルを低下させ、ＨＧＰ遺伝子Ｇ６ｐｃおよびＰｃｋ１を抑制し、グリコーゲン枯渇を減少させ、ＨＧＰの転写因子ＦｏｘＯ１の核転座を遮断する。逆に、構造的に活性なＣａＭＫＩＩは、Ｇ６ｐｃおよびＰｃｋ１を誘発し、グルコース生成を刺激し、血中グルコースレベルを上昇させる。グルコース代謝に対するＣａＭＫＩＩ欠損の抑制効果は、構造的に活性な核ＦｏｘＯ１によって無効となり、ＣａＭＫＩＩ欠損の効果は、ＦｏｘＯ１の核排除を必要とし得る。
本明細書に記載される結果は、ＨＧＰの制御下において、ＣａＭＫＩＩによって調節される分子経路を特定する。
ある特定の態様において、本発明は、絶食およびグルカゴンが、肝臓ＣａＭＫＩＩを活性化するといいう所見に関連する。ある特定の態様において、本発明は、ＣａＭＫＩＩが肝臓のグルコース生成を刺激するという所見に関連する。ある特定の態様において、本発明は、ＣａＭＫＩＩがＦｏｘＯ１の核局在化および活性化を促進するという所見に関連する。ある特定の態様において、本発明は、ＣａＭＫＩＩ欠損における損傷したグルコース生成は、ＦｏｘＯ１の核排除を必要とするという所見に関連する。ある特定の態様において、本明細書に記載される方法は、過活性ＣａＭＫＩＩは、心不全に関与しているため、心不全の治療および診断に有用である。
本開示は、代謝障害の治療および／または予防のための方法を提供する。一態様において、本開示は、代謝障害の治療または予防を、それを必要とする対象において行う方法であって、対象に、ＣａＭＫＩＩの阻害剤の治療有効量を投与し、それによって障害を治療または予防することを含む、方法を提供する。別の態様において、本開示は、代謝障害の治療または予防を、それを必要とする対象において行う方法であって、対象に、ＩＰ３Ｒ１、ＩＰ３Ｒ２、および／またはＩＰ３Ｒ３の阻害剤の治療有効量を投与し、それによって障害を治療または予防することを含む、方法を提供する。別の態様において、本開示は、代謝障害の治療または予防を、それを必要とする対象において行う方法であって、対象に、カルシニューリンの阻害剤の治療有効量を投与し、それによって障害を治療または予防することを含む、方法を提供する。別の態様において、本開示は、代謝障害の治療または予防を、それを必要とする対象において行う方法であって、対象に、ｐ３８の阻害剤の治療有効量を投与し、それによって障害を治療または予防することを含む、方法を提供する。別の態様において、本開示は、代謝障害の治療または予防を、それを必要とする対象において行う方法であって、対象に、ＭＫ２／３の阻害剤の治療有効量を投与し、それによって障害を治療または予防することを含む、方法を提供する。別の態様において、本開示は、代謝障害の治療または予防を、それを必要とする対象において行う方法であって、対象に、ＣａＭＫＩＩ、ＩＰ３Ｒ１、ＩＰ３Ｒ２、ＩＰ３Ｒ３、カルシニューリン、ｐ３８、ＭＫ２／３、またはそれらの任意の組み合わせの阻害剤の治療有効量を投与し、それによって、障害を治療または予防することを含む、方法を提供する。
一態様において、本開示は、対象における代謝障害を治療または予防する方法であって、ＣａＭＫＩＩの活性を低減させ、それによって障害を治療または予防することを含む、方法を提供する。一態様において、本開示は、対象における代謝障害を治療または予防する方法であって、障害は肥満によって誘発され、方法は、ＣａＭＫＩＩの活性を低減させ、それによって障害を治療または予防することを含む、方法を提供する。一態様において、本開示は、対象における代謝障害を治療または予防する方法であって、障害は肥満によって誘発されず、方法は、ＣａＭＫＩＩの活性を低減させ、それによって障害を治療または予防することを含む、方法を提供する。
一実施形態において、障害は、１型糖尿病、２型糖尿病、インスリン耐性、および代謝症候群からなる群から選択される。
一実施形態において、治療または予防は、対象におけるグリコーゲン分解またはグルコース新生に影響を及ぼす。別の実施形態において、治療または予防は、対象におけるグリコーゲン分解またはグルコース新生に影響を及ぼさない。
一実施形態において、治療または予防は、対象において、肝臓のグルコース生成、高血糖、脂肪肝、インスリン耐性、インスリン耐性に関連する炎症、インスリン耐性に関連する脂質異常症、またはそれらの任意の組み合わせを低減させる。別の実施形態において、治療または予防は、対象において、肝臓のグルコース生成、高血糖、脂肪肝、インスリン耐性、インスリン耐性に関連する炎症、インスリン耐性に関連する脂質異常症、またはそれらの任意の組み合わせを増加させる。別の実施形態において、治療または予防は、対象において、肝臓のグルコース生成、高血糖、脂肪肝、インスリン耐性、インスリン耐性に関連する炎症、インスリン耐性に関連する脂質異常症、またはそれらの任意の組み合わせに対する効果を全く有さない。
一実施形態において、治療または予防は、ＣａＭＫＩＩのリン酸化および／または活性化を低減させる。別の実施形態において、治療または予防は、ＣａＭＫＩＩのリン酸化を阻害する。別の実施形態において、治療または予防は、ＣａＭＫＩＩの活性および／または活性化を阻害する。一実施形態において、治療または予防は、ＣａＭＫＩＩのリン酸化および／または活性化を増加させる。別の実施形態において、治療または予防は、ＣａＭＫＩＩの活性および／または活性化を増加させる。
一実施形態において、ＣａＭＫＩＩの活性は、グルカゴンに誘発される活性である。
一実施形態において、治療または予防は、対象の細胞におけるＧ６ｐｃおよび／またはＰｃｋ１の発現を低減または阻害する。一実施形態において、治療または予防は、対象の細胞におけるＧ６ｐｃおよび／またはＰｃｋ１の発現を増加させる。
別の実施形態において、治療または予防は、対象の細胞核におけるＦｏｘＯ１タンパク質レベルの量を低減させる。別の実施形態において、治療または予防は、対象の細胞核におけるＦｏｘＯ１タンパク質レベルの量を増加させる。
別の実施形態において、治療または予防は、ＦｏｘＯ１タンパク質のアミノ酸Ｓ２８４、Ｓ２９５、Ｓ３２６、Ｓ４６７、Ｓ４７５、Ｓ２４６、Ｓ２５３、Ｓ４１３、もしくはＳ４１５、またはそれらの任意の組み合わせのリン酸化を低減または阻害する。別の実施形態において、治療または予防は、ＦｏｘＯ１タンパク質のアミノ酸Ｓ２８４、Ｓ２９５、Ｓ３２６、Ｓ４６７、Ｓ４７５、Ｓ２４６、Ｓ２５３、Ｓ４１３、もしくはＳ４１５、またはそれらの任意の組み合わせのリン酸化を増加させる。
別の態様において、本開示は、対象における冠動脈疾患を治療または予防する方法であって、対象におけるＣａＭＫＩＩの活性を低減させ、それによって冠動脈疾患を治療または予防することを含む、方法を提供する。本開示は、対象における冠動脈疾患を治療または予防する方法であって、対象におけるＣａＭＫＩＩの活性を増加させ、それによって前記冠動脈疾患を治療または予防することを含む、方法を提供する。
一実施形態において、障害は、１型糖尿病、２型糖尿病、インスリン耐性、および代謝症候群からなる群から選択される。
別の実施形態において、治療または予防は、対象におけるグリコーゲン分解またはグルコース新生に影響を及ぼす。別の実施形態において、治療または予防は、対象におけるグリコーゲン分解またはグルコース新生に影響を及ぼさない。
一実施形態において、治療または予防は、対象において、肝臓のグルコース生成、高血糖、脂肪肝、インスリン耐性、インスリン耐性に関連する炎症、インスリン耐性に関連する脂質異常症、またはそれらの任意の組み合わせを低減させる。別の実施形態において、治療または予防は、対象において、肝臓のグルコース生成、高血糖、脂肪肝、インスリン耐性、インスリン耐性に関連する炎症、インスリン耐性に関連する脂質異常症、またはそれらの任意の組み合わせを増加させる。
一実施形態において、治療または予防は、ＣａＭＫＩＩのリン酸化および／または活性化を低減させる。別の実施形態において、治療または予防は、ＣａＭＫＩＩのリン酸化および／または活性化を増加させる。
一実施形態において、ＣａＭＫＩＩの活性は、グルカゴンに誘発される活性である。別の実施形態において、ＣａＭＫＩＩの活性は、グルカゴンに誘発される活性ではない。
一実施形態において、治療または予防は、対象の細胞におけるＧ６ｐｃおよび／またはＰｃｋ１の発現を低減させる。別の実施形態において、治療または予防は、対象の細胞におけるＧ６ｐｃおよび／またはＰｃｋ１の発現を増加させる。
一実施形態において、治療または予防は、対象の細胞核におけるＦｏｘＯ１タンパク質レベルの量を低減させる。別の実施形態において、治療または予防は、対象の細胞核におけるＦｏｘＯ１タンパク質レベルの量を増加させる。
別の実施形態において、治療または予防は、ＦｏｘＯ１タンパク質のアミノ酸Ｓ２８４、Ｓ２９５、Ｓ３２６、Ｓ４６７、Ｓ４７５、Ｓ２４６、Ｓ２５３、Ｓ４１３、もしくはＳ４１５、またはそれらの任意の組み合わせのリン酸化を低減させる。別の実施形態において、治療または予防は、ＦｏｘＯ１タンパク質のアミノ酸Ｓ２８４、Ｓ２９５、Ｓ３２６、Ｓ４６７、Ｓ４７５、Ｓ２４６、Ｓ２５３、Ｓ４１３、もしくはＳ４１５、またはそれらの任意の組み合わせのリン酸化を増加させる。
一実施形態において、治療または予防は、対象のマクロファージにおけるＣａＭＫＩＩ活性を低減させることを含む。別の実施形態において、治療または予防は、対象のマクロファージにおけるＣａＭＫＩＩ活性を増加させることを含む。
一実施形態において、冠動脈疾患は、アテローム発生および／またはアテローム性動脈硬化症と関連する。別の実施形態において、本方法は、心不全、高血圧、および／または腎疾患を治療または予防することをさらに含む。別の実施形態において、障害は、進行病変のマクロファージのアポトーシスと関連する。別の実施形態において、障害は、プラーク壊死と関連する。
一実施形態において、代謝障害を有する対象における冠動脈疾患の治療または予防は、高インスリン血症および／または脂質異常症の低下をもたらす。別の実施形態において、代謝障害を有する対象における冠動脈疾患の治療または予防は、高インスリン血症および／または脂質異常症の増加をもたらす。
一実施形態において、対象における冠動脈疾患の治療または予防は、アテローム発生および／またはアテローム性動脈硬化症の低下をもたらす。別の実施形態において、対象における冠動脈疾患の治療または予防は、アテローム発生および／またはアテローム性動脈硬化症の増加をもたらす。
一実施形態において、治療または予防は、対象にＣａＭＫＩＩタンパク質の阻害剤を投与するステップを含む。一実施形態において、治療または予防は、対象にＣａＭＫＩＩタンパク質をコードする遺伝子の発現を低減させる、アンチセンスＲＮＡまたはｓｉＲＮＡを投与するステップを含む。別の実施形態において、治療または予防は、対象にＣａＭＫＩＩタンパク質に特異的に結合するペプチドまたはポリペプチドを投与するステップを含む。別の実施形態において、治療または予防は、対象に小分子を投与するステップを含む。一実施形態において、小分子は、ＫＮ−９３、ラベンダスチンＣ、ＣＫ５９、Ａｎｔ−ＣａＭＫＩＩＮｔｉｄｅ、ＫＮ６２、ＤＹ９７６０ｅ、Ｋ−２５２ａノカルジオプシスｓｐ．、Ｈ８９ジヒドロクロリド、ＰＰ１アナログＩＩ、１ＮＭ−ＰＰ１、ｅＥＦ−２キナーゼ阻害剤ＮＨ１２５、およびＳＴＯ−６０９からなる群から選択される、ＣａＭＫＩＩ阻害剤である。
別の態様において、本開示は、対象における肝臓のグルコース生成を低減させる方法であって、ＣａＭＫＩＩの活性を低減させ、それによって対象における肝臓のグルコースの低減をもたらすことを含む、方法を提供する。別の態様において、本開示は、対象における肝臓のグルコース生成を低減させる方法であって、ＣａＭＫＩＩの活性を増加させ、それによって対象における肝臓のグルコースの低減をもたらすことを含む、方法を提供する。
別の態様において、本開示は、対象における肝臓のグルコース生成を増加させる方法であって、ＣａＭＫＩＩの活性を増加させ、それによって対象における肝臓のグルコースの増加をもたらすことを含む、方法を提供する。別の態様において、本開示は、対象における肝臓のグルコース生成を増加させる方法であって、ＣａＭＫＩＩの活性を低減させ、それによって対象における肝臓のグルコースの増加をもたらすことを含む、方法を提供する。
一実施形態において、肝臓のグルコース生成の低減は、ＣａＭＫＩＩのリン酸化および／または活性化を低減させる。別の実施形態において、肝臓のグルコース生成の低減は、ＣａＭＫＩＩのリン酸化および／または活性化を増加させる。
一実施形態において、肝臓のグルコース生成の増加は、ＣａＭＫＩＩのリン酸化および／または活性化を低減させる。別の実施形態において、肝臓のグルコース生成の増加は、ＣａＭＫＩＩのリン酸化および／または活性化を増加させる。
一実施形態において、ＣａＭＫＩＩの活性は、グルカゴンに誘発される活性である。
一実施形態において、肝臓のグルコース生成の低減は、対象の細胞におけるＧ６ｐｃおよび／またはＰｃｋ１の発現を低減させる。別の実施形態において、肝臓のグルコース生成の低減は、対象の細胞におけるＧ６ｐｃおよび／またはＰｃｋ１の発現を増加させる。一実施形態において、肝臓のグルコース生成の増加は、対象の細胞におけるＧ６ｐｃおよび／またはＰｃｋ１の発現を低減させる。別の実施形態において、肝臓のグルコース生成の増加は、対象の細胞におけるＧ６ｐｃおよび／またはＰｃｋ１の発現を増加させる。
一実施形態において、肝臓のグルコース生成の低減は、対象において、肝臓のグルコース生成、高血糖、脂肪肝、インスリン耐性、インスリン耐性に関連する炎症、インスリン耐性に関連する脂質異常症、またはそれらの任意の組み合わせを低減させる。別の実施形態において、肝臓のグルコース生成の低減は、対象において、肝臓のグルコース生成、高血糖、脂肪肝、インスリン耐性、インスリン耐性に関連する炎症、インスリン耐性に関連する脂質異常症、またはそれらの任意の組み合わせを増加させる。一実施形態において、肝臓のグルコース生成の増加は、対象において、肝臓のグルコース生成、高血糖、脂肪肝、インスリン耐性、インスリン耐性に関連する炎症、インスリン耐性に関連する脂質異常症、またはそれらの任意の組み合わせを低減させる。別の実施形態において、肝臓のグルコース生成の増加は、対象において、肝臓のグルコース生成、高血糖、脂肪肝、インスリン耐性、インスリン耐性に関連する炎症、インスリン耐性に関連する脂質異常症、またはそれらの任意の組み合わせを増加させる。
別の実施形態において、肝臓のグルコース生成の低減は、対象の細胞核におけるＦｏｘＯ１タンパク質レベルの量を低減させる。別の実施形態において、肝臓のグルコース生成の低減は、ＦｏｘＯ１タンパク質のアミノ酸Ｓ２８４、Ｓ２９５、Ｓ３２６、Ｓ４６７、Ｓ４７５、Ｓ２４６、Ｓ２５３、Ｓ４１３、もしくはＳ４１５、またはそれらの任意の組み合わせのリン酸化を低減させる。別の実施形態において、肝臓のグルコース生成の低減は、対象の細胞核におけるＦｏｘＯ１タンパク質レベルの量を増加させる。別の実施形態において、肝臓のグルコース生成の低減は、ＦｏｘＯ１タンパク質のアミノ酸Ｓ２８４、Ｓ２９５、Ｓ３２６、Ｓ４６７、Ｓ４７５、Ｓ２４６、Ｓ２５３、Ｓ４１３、もしくはＳ４１５、またはそれらの任意の組み合わせのリン酸化を増加させる。
別の実施形態において、肝臓のグルコース生成の増加は、対象の細胞核におけるＦｏｘＯ１タンパク質レベルの量を低減させる。別の実施形態において、肝臓のグルコース生成の増加は、ＦｏｘＯ１タンパク質のアミノ酸Ｓ２８４、Ｓ２９５、Ｓ３２６、Ｓ４６７、Ｓ４７５、Ｓ２４６、Ｓ２５３、Ｓ４１３、もしくはＳ４１５、またはそれらの任意の組み合わせのリン酸化を低減させる。別の実施形態において、肝臓のグルコース生成の増加は、対象の細胞核におけるＦｏｘＯ１タンパク質レベルの量を増加させる。別の実施形態において、肝臓のグルコース生成の増加は、ＦｏｘＯ１タンパク質のアミノ酸Ｓ２８４、Ｓ２９５、Ｓ３２６、Ｓ４６７、Ｓ４７５、Ｓ２４６、Ｓ２５３、Ｓ４１３、もしくはＳ４１５、またはそれらの任意の組み合わせのリン酸化を増加させる。
一実施形態において、肝臓のグルコース生成の低減は、対象にＣａＭＫＩＩタンパク質をコードする遺伝子の発現を低減させるアンチセンスＲＮＡを投与するステップを含む。一実施形態において、肝臓のグルコース生成の増加は、対象にＣａＭＫＩＩタンパク質をコードする遺伝子の発現を低減させるアンチセンスＲＮＡを投与するステップを含む。
別の実施形態において、肝臓のグルコース生成の低減は、対象にＣａＭＫＩＩタンパク質に特異的に結合するペプチドまたはポリペプチドを投与するステップを含む。別の実施形態において、肝臓のグルコース生成の増加は、対象にＣａＭＫＩＩタンパク質に特異的に結合するペプチドまたはポリペプチドを投与するステップを含む。
別の実施形態において、肝臓のグルコース生成の低減は、対象に小分子を投与するステップを含む。別の実施形態において、肝臓のグルコース生成の増加は、対象に小分子を投与するステップを含む。
一実施形態において、小分子は、ＫＮ−９３、ラベンダスチンＣ、ＣＫ５９、Ａｎｔ−ＣａＭＫＩＩＮｔｉｄｅ、ＫＮ６２、ＤＹ９７６０ｅ、Ｋ−２５２ａノカルジオプシスｓｐ．、Ｈ８９ジヒドロクロリド、ＰＰ１アナログＩＩ、１ＮＭ−ＰＰ１、ｅＥＦ−２キナーゼ阻害剤ＮＨ１２５、およびＳＴＯ−６０９からなる群から選択される、ＣａＭＫＩＩ阻害剤である。
一態様において、本開示は、対象における代謝障害を治療または予防する方法であって、対象に、ＩＰ３Ｒ１、ＩＰ３Ｒ２、またはＩＰ３Ｒ３の活性を低減させ、それによって障害を治療または予防することを含む、方法を提供する。本開示は、対象における代謝障害を治療または予防する方法であって、障害は肥満によって誘発され、方法は、ＩＰ３Ｒ１、ＩＰ３Ｒ２、またはＩＰ３Ｒ３の活性を低減させ、それによって障害を治療または予防することを含む、方法を提供する。本開示は、対象における代謝障害を治療または予防する方法であって、障害は肥満によって誘発されず、方法は、ＩＰ３Ｒ１、ＩＰ３Ｒ２、またはＩＰ３Ｒ３の活性を低減させ、それによって障害を治療または予防することを含む、方法を提供する。
別の態様において、本開示は、対象における代謝障害を治療または予防する方法であって、カルシニューリンの活性を低減させ、それによって障害を治療または予防することを含む、方法を提供する。別の態様において、本開示は、対象における代謝障害を治療または予防する方法であって、障害は肥満によって誘発され、方法は、カルシニューリンの活性を低減させ、それによって障害を治療または予防することを含む、方法を提供する。別の態様において、本開示は、対象における代謝障害を治療または予防する方法であって、障害は肥満によって誘発されず、方法は、カルシニューリンの活性を低減させ、それによって障害を治療または予防することを含む、方法を提供する。
一実施形態において、障害は、１型糖尿病、２型糖尿病、インスリン耐性、肥満、および代謝症候群からなる群から選択される。
一実施形態において、治療または予防は、対象におけるグリコーゲン分解またはグルコース新生に影響を及ぼす。別の実施形態において、治療または予防は、対象におけるグリコーゲン分解またはグルコース新生に影響を及ぼさない。
一実施形態において、治療または予防は、対象において、肝臓のグルコース生成、高血糖、脂肪肝、インスリン耐性、インスリン耐性に関連する炎症、インスリン耐性に関連する脂質異常症、またはそれらの任意の組み合わせを低減させる。別の実施形態において、治療または予防は、対象において、肝臓のグルコース生成、高血糖、脂肪肝、インスリン耐性、インスリン耐性に関連する炎症、インスリン耐性に関連する脂質異常症、またはそれらの任意の組み合わせを増加させる。
一実施形態において、治療または予防は、対象に、ＩＰ３Ｒ１タンパク質、ＩＰ３Ｒ２タンパク質、ＩＰ３Ｒ３タンパク質、またはそれらの任意の組み合わせの阻害剤を投与するステップを含む。一実施形態において、阻害剤は、ゼストスポンジンＣである。別の実施形態において、阻害剤は、２−ＡＰＢである。別の実施形態において、阻害剤は、カフェインである。
一実施形態において、治療または予防は、対象に、ＩＰ３Ｒ１タンパク質、ＩＰ３Ｒ２タンパク質、もしくはＩＰ３Ｒ３タンパク質、またはこれらの任意の組み合わせをコードする遺伝子の発現を低減させるアンチセンスＲＮＡまたはｓｉＲＮＡを投与するステップを含む。別の実施形態において、治療または予防は、対象に、ＩＰ３Ｒ１タンパク質、ＩＰ３Ｒ２タンパク質、もしくはＩＰ３Ｒ３タンパク質、またはそれらの任意の組み合わせに特異的に結合するペプチドまたはポリペプチドを投与するステップを含む。
一実施形態において、治療または予防は、対象に小分子を投与するステップを含む。一実施形態において、小分子は、ＩＰ３Ｒ１タンパク質阻害剤、ＩＰ３Ｒ２タンパク質阻害剤、またはＩＰ３Ｒ３タンパク質阻害剤である。一実施形態において、小分子は、ゼストスポンジンＣである。別の実施形態において、小分子は、２−ＡＰＢである。別の実施形態において、小分子は、カフェインである。
一実施形態において、治療または予防は、対象にカルシニューリンの阻害剤を投与するステップを含む。一実施形態において、カルシニューリンの阻害剤は、シクロスポリンＡである。別の実施形態において、カルシニューリンの阻害剤は、ピメクロリムスである。別の実施形態において、カルシニューリンの阻害剤は、タクロリムスである。
一実施形態において、治療または予防は、対象に、カルシニューリンタンパク質をコードする遺伝子の発現を低減させるアンチセンスＲＮＡまたはｓｉＲＮＡを投与するステップを含む。別の実施形態において、治療または予防は、対象にカルシニューリンタンパク質に特異的に結合するペプチドまたはオリゴペプチドまたはポリペプチドを投与するステップを含む。一実施形態において、オリゴペプチドは、シクロスポリンＡである。
一実施形態において、治療または予防は、対象に小分子を投与するステップを含む。別の実施形態において、小分子は、カルシニューリン阻害剤である。一実施形態において、小分子は、ピメクロリムスである。別の実施形態において、小分子は、タクロリムスである。
別の態様において、本開示は、対象における代謝障害を治療または予防する方法であって、ｐ３８の活性を低減させ、それによって障害を治療または予防することを含む、方法を提供する。別の態様において、本開示は、対象における代謝障害を治療または予防する方法であって、障害は肥満によって誘発され、方法は、ｐ３８の活性を低減させ、それによって障害を治療または予防することを含む、方法を提供する。別の態様において、本開示は、対象における代謝障害を治療または予防する方法であって、障害は肥満によって誘発されず、方法は、ｐ３８の活性を低減させ、それによって障害を治療または予防することを含む、方法を提供する。
別の態様において、本開示は、対象における代謝障害を治療または予防する方法であって、ＭＫ２／３の活性を低減させ、それによって障害を治療または予防することを含む、方法を提供する。別の態様において、本開示は、対象における代謝障害を治療または予防する方法であって、障害は肥満によって誘発され、方法は、ＭＫ２／３の活性を低減させ、それによって障害を治療または予防することを含む、方法を提供する。別の態様において、本開示は、対象における代謝障害を治療または予防する方法であって、障害は肥満によって誘発されず、方法は、ＭＫ２／３の活性を低減させ、それによって障害を治療または予防することを含む、方法を提供する。
一実施形態において、障害は、１型糖尿病、２型糖尿病、インスリン耐性、肥満、および代謝症候群からなる群から選択される。
一実施形態において、治療または予防は、対象におけるグリコーゲン分解またはグルコース新生に影響を及ぼす。別の実施形態において、治療または予防は、対象におけるグリコーゲン分解またはグルコース新生に影響を及ぼさない。
一実施形態において、治療または予防は、対象において、肝臓のグルコース生成、高血糖、脂肪肝、インスリン耐性、インスリン耐性に関連する炎症、インスリン耐性に関連する脂質異常症、またはそれらの任意の組み合わせを低減させる。別の実施形態において、治療または予防は、対象において、肝臓のグルコース生成、高血糖、脂肪肝、インスリン耐性、インスリン耐性に関連する炎症、インスリン耐性に関連する脂質異常症、またはそれらの任意の組み合わせを増加させる。
一実施形態において、治療または予防は、対象にｐ３８の阻害剤を投与するステップを含む。一実施形態において、ｐ３８の阻害剤は、ＳＢ２０３５８０である。別の実施形態において、ｐ３８の阻害剤は、ＳＢ２０２１９０である。別の実施形態において、ｐ３８の阻害剤は、ＳＢ２３９０６３である。
一実施形態において、治療または予防は、対象に、ｐ３８タンパク質をコードする遺伝子の発現を低減させるアンチセンスＲＮＡまたはｓｉＲＮＡを投与するステップを含む。別の実施形態において、治療または予防は、対象にｐ３８タンパク質に特異的に結合するペプチドまたはポリペプチドを投与するステップを含む。別の実施形態において、治療または予防は、対象に小分子を投与するステップを含む。一実施形態において、小分子は、ｐ３８阻害剤である。一実施形態において、小分子は、ＳＢ２０３５８０である。別の実施形態において、小分子は、ＳＢ２０２１９０である。別の実施形態において、小分子は、ＳＢ２３９０６３である。
一実施形態において、治療または予防は、対象にＭＫ２／３の阻害剤を投与するステップを含む。一実施形態において、ＭＫ２／３の阻害剤は、Ｈｓｐ２５キナーゼ阻害剤である。
一実施形態において、治療または予防は、対象に、ＭＫ２／３タンパク質をコードする遺伝子の発現を低減させるアンチセンスＲＮＡまたはｓｉＲＮＡを投与するステップを含む。別の実施形態において、治療または予防は、対象にＭＫ２／３タンパク質に特異的に結合するペプチドまたはポリペプチドを投与するステップを含む。一実施形態において、ペプチドは、Ｈｓｐ２５キナーゼ阻害剤である。一実施形態において、治療または予防は、対象に小分子を投与するステップを含む。一実施形態において、小分子は、ＭＫ２／３阻害剤である。
スクリーニングの方法
本開示は、対象における代謝障害を治療または予防する化合物または化合物の組み合わせを識別するための方法を提供する。本開示はまた、代謝障害を有する対象における冠動脈疾患を治療または予防する化合物または化合物の組み合わせを識別するための方法を提供する。一実施形態において、障害は肥満によって誘発される。別の実施形態において、障害は、肥満によって誘発されない。本開示は、対象における肝臓のグルコース生成を低減させる化合物または化合物の組み合わせを識別するための方法を提供する。
本開示はまた、ＣａＭＫＩＩの活性および／または活性化を阻害または低減する化合物または化合物の組み合わせの識別のための方法を提供する。本開示はまた、ＩＰ３Ｒ１、ＩＰ３Ｒ２、およびＩＰ３Ｒ３を含むがこれらに限定されないＩＰ３Ｒの活性および／または活性化を阻害または低減する化合物または化合物の組み合わせの識別のための方法を提供する。本開示はまた、カルシニューリンの活性および／または活性化を阻害または低減する化合物または化合物の組み合わせの識別のための方法を提供する。本開示はまた、ｐ３８の活性および／または活性化を阻害または低減する化合物または化合物の組み合わせの識別のための方法を提供する。本開示はまた、ＭＫ２／３の活性および／または活性化を阻害または低減する化合物または化合物の組み合わせの識別のための方法を提供する。
本開示はまた、ＣａＭＫＩＩ、ＩＰ３Ｒ１、ＩＰ３Ｒ２、およびＩＰ３Ｒ３を含むがこれらに限定されないＩＰ３Ｒ、カルシニューリン、ｐ３８、ＭＫ２／３、またはそれらの任意の組み合わせの活性および／または活性化を阻害する化合物または化合物の組み合わせの識別のための方法を提供する。本開示はまた、ＣａＭＫＩＩ、ＩＰ３Ｒ１、ＩＰ３Ｒ２、およびＩＰ３Ｒ３を含むがこれらに限定されないＩＰ３Ｒ、カルシニューリン、ｐ３８、ＭＫ２／３、またはそれらの任意の組み合わせの活性を低減させる化合物または化合物の組み合わせの識別のための方法を提供する。
本開示は、ＣａＭＫＩＩの活性を阻害する化合物を識別するための方法であって、ａ）細胞をＣａＭＫＩＩ融合タンパク質と接触させることであって、ＣａＭＫＩＩ融合タンパク質は、一端にアクセプターフルオロフォアタンパク質と、他端にドナーフルオロフォアタンパク質とを含むことと、ｂ）試験化合物の不在下および存在下においてＦＲＥＴ効率を測定することであって、試験化合物の不在下におけるＦＲＥＴ効率と比較して、試験化合物の存在下においてより高いＦＲＥＴ効率は、士官籠部鬱が、ＣａＭＫＩＩの活性を阻害することを示す（Ｔａｋａｏ ｅｔ ａｌ．，２００５およびＫｗｏｋ ｅｔ ａｌ．，２００８を参照されたく、これらは参照によりその全体が組み込まれる）ことと、を含む、方法を提供する。
本開示は、ＣａＭＫＩＩの活性を阻害する化合物を識別するための方法であって、ａ）細胞をＣａＭＫＩＩ融合タンパク質と接触させることであって、ＣａＭＫＩＩ融合タンパク質は、一端にアクセプターフルオロフォアタンパク質と、他端にドナーフルオロフォアタンパク質とを含むことと、ｂ）試験化合物の不在下および存在下においてアクセプタータンパク質に対するドナータンパク質の比率を測定することであって、試験化合物の存在下における比率と比較して、試験化合物の存在下における比率の減少は、試験化合物がＣａＭＫＩＩの活性を阻害することを示す（Ｔａｋａｏ ｅｔ ａｌ．，２００５およびＫｗｏｋ ｅｔ ａｌ．，２００８を参照されたく、これらは参照によりその全体が組み込まれる）ことと、を含む、方法を提供する。
一実施形態において、アクセプターフルオロフォアタンパク質は、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、Ｖｅｎｕｓ、黄色蛍光タンパク質、シアン蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、および緑色蛍光タンパク質からなる群から選択される。別の実施形態において、ドナータンパク質は、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、Ｖｅｎｕｓ、黄色蛍光タンパク質、シアン蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、および緑色蛍光タンパク質からなる群から選択される（Ｔａｋａｏ ｅｔ ａｌ．，２００５およびＫｗｏｋ ｅｔ ａｌ．，２００８を参照されたく、これらは参照によりその全体が組み込まれる）。
一実施形態において、細胞は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、肝細胞、Ｕ２ＯＳ細胞、ＨｅＬａ細胞、マウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）、またはマクロファージである。別の実施形態において、細胞は、Ｉｎｓｒ−／−マウス、Ｃａｍｋ２ｇ−／−マウス、Ｆｏｘｏ１−／−マウス、ｄｂ／ｄｂマウス、ｏｂ／ｏｂマウス、ｐ３８−／−マウス、非肥満糖尿病（ＮＯＤ）マウス、高脂肪食を与えたマウス、またはストレプトゾトシン処置マウスに由来する。別の実施形態において、細胞は、突然変異ＦｏｘＯ１タンパク質を発現するマウスに由来する。一実施形態において、突然変異ＦｏｘＯ１タンパク質は、Ｓ２８４、Ｓ２９５、Ｓ３２６、Ｓ４６７、Ｓ４７５、Ｓ２４６、Ｓ２５３、Ｓ４１３、もしくはＳ４１５にアラニン置換、またはＳ２８４、Ｓ２９５、Ｓ３２６、Ｓ４６７、Ｓ４７５、Ｓ２４６、Ｓ２５３、Ｓ４１３、もしくはＳ４１５にアスパラギン酸置換、またはそれらの任意の組み合わせを含む。
一実施形態において、細胞は、ＥＲストレスに供される。別の実施形態において、細胞は、グルカゴン、８−ブロモｃＡＭＰ、Ｈ８９ジヒドロクロリド、ゼストスポンジンＣ、ホルスコリン、飽和脂肪酸、またはそれらの任意の組み合わせで処置される。
別の態様において、本開示は、ＩＰ３Ｒ１、ＩＰ３Ｒ２、またはＩＰ３Ｒ３の活性を阻害する化合物を識別するための方法であって、ａ）細胞を試験化合物と接触させることと、ｂ）ＩＰ３Ｒ１、ＩＰ３Ｒ２、またはＩＰ３Ｒ３の活性を測定することであって、化合物の不在下におけるＩＰ３Ｒ１、ＩＰ３Ｒ２、またはＩＰ３Ｒ３の活性と比較して、化合物の存在下におけるＩＰ３Ｒ１、ＩＰ３Ｒ２、またはＩＰ３Ｒ３の活性の低減は、化合物が、それぞれ、ＩＰ３Ｒ１、ＩＰ３Ｒ２、またはＩＰ３Ｒ３の阻害剤であることを示すことと、を含む、方法を提供する。
一実施形態において、活性は、ＩＰ３の誘発物質での刺激後、細胞のサイトゾルへのカルシウム放出によって測定される。一実施形態において、カルシウム放出は、サイトゾルカルシウム染料の蛍光の増加によって測定される。一実施形態において、サイトゾルカルシウム染料は、Ｆｌｕｏ−３である。
別の態様において、本開示は、カルシニューリンの活性を阻害する化合物を識別するための方法であって、ａ）細胞を試験化合物と接触させることと、ｂ）カルシニューリン活性を測定することであって、化合物の不在下におけるカルシニューリンの活性と比較して、化合物の存在下におけるカルシニューリンの活性の低減は、化合物が、カルシニューリンの阻害剤であることを示すことと、を含む、方法を提供する。
一実施形態において、カルシニューリンの活性は、カルシニューリン基質ペプチドを使用して、ホスファターゼ活性の検出を通じて測定される。一実施形態において、細胞は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、肝細胞、Ｕ２ＯＳ細胞、ＨｅＬａ細胞、またはマウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）である。別の実施形態において、細胞は、ｄｂ／ｄｂ マウス、ｏｂ／ｏｂマウス、非肥満糖尿病（ＮＯＤ）マウス、高脂肪食を与えたマウス、またはストレプトゾトシン処置マウスに由来する。
一実施形態において、細胞は、グルカゴン、Ｈ８９ジヒドロクロリド、インスリン、ホルスコリン、ＥＲストレスの誘発物質、ツニカマイシン、飽和脂肪酸、またはそれらの任意の組み合わせで処置される。
別の態様において、本開示は、ｐ３８の活性を阻害する化合物を識別するための方法であって、ａ）細胞を試験化合物と接触させることと、ｂ）ｐ３８キナーゼ活性を測定することであって、化合物の不在下におけるｐ３８のキナーゼ活性と比較して、化合物の存在下におけるｐ３８のキナーゼ活性の低減は、化合物がｐ３８の阻害剤であることを示すことと、を含む、方法を提供する。別の態様において、本開示は、ＭＫ２／３の活性を阻害する化合物を識別するための方法であって、ａ）細胞を試験化合物と接触させることと、ｂ）ＭＫ２／３キナーゼ活性を測定することであって、化合物の不在下におけるＭＫ２／３のキナーゼ活性と比較して、化合物の存在下におけるＭＫ２／３のキナーゼ活性の低減は、化合物がＭＫ２／３の阻害剤であることを示すことと、を含む、方法を提供する。
一実施形態において、ｐ３８キナーゼ活性は、ｐ３８特異的ペプチドを使用して測定される。一実施形態において、ＭＫ２／３キナーゼ活性は、ＭＫ２／３特異的ペプチドを使用して測定される。
一実施形態において、細胞は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、肝細胞、Ｕ２ＯＳ細胞、ＨｅＬａ細胞、マクロファージ、またはマウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）である。別の実施形態において、細胞は、Ｉｎｓｒ−／−マウス、ｄｂ／ｄｂマウス、ｏｂ／ｏｂマウス、非肥満糖尿病（ＮＯＤ）マウス、高脂肪食を与えたマウス、またはストレプトゾトシン処置マウスに由来する。別の実施形態において、細胞は、グルカゴン、８−ブロモｃＡＭＰ、Ｈ８９ジヒドロクロリド、ホルスコリン、飽和脂肪酸、またはそれらの任意の組み合わせで処置される。
一態様において、本方法は、代謝障害、または冠動脈疾患等の心血管疾患のモデルである動物に、試験化合物または試験化合物の組み合わせを投与すること、ならびに化合物または化合物の組み合わせが、その処置を受けなかった動物と比較して、動物における代謝機能および／または心血管機能を改善するかどうかを判定することを含む。
本発明は、対象における代謝障害の治療もしくは予防、代謝障害を有する対象における冠動脈疾患の治療もしくは予防、および／または対象における肝臓のグルコース生成の低減に使用可能な化合物を識別するための方法を提供する。本発明は、ＣａＭＫＩＩの活性を阻害するか、またはＣａＭＫＩＩのリン酸化および／もしくは活性化を低減させる化合物を識別する方法を提供する。本発明は、ＩＰ３Ｒ１、ＩＰ３Ｒ２、およびＩＰ３Ｒ３を含むがこれらに限定されないＩＰ３Ｒの活性を阻害するか、またはＩＰ３Ｒ１、ＩＰ３Ｒ２、およびＩＰ３Ｒ３を含むがこれらに限定されないＩＰ３Ｒのリン酸化および／もしくは活性化を低減させる化合物を識別するための方法を提供する。本発明は、カルシニューリンの活性を阻害するか、またはカルシニューリンのリン酸化および／もしくは活性化を低減させる化合物を識別するための方法を提供する。本発明は、ｐ３８の活性を阻害するか、またはｐ３８のリン酸化および／もしくは活性化を低減させる化合物を識別するための方法を提供する。本発明は、ＭＫ２／３の活性を阻害するか、またはＭＫ２／３のリン酸化および／もしくは活性化を低減させる化合物を識別するための方法を提供する。
本方法は、試験化合物または薬剤（例えば、ペプチド（抗体もしくはそのフラグメント等）、小分子、または核酸（ｓｉＲＮＡまたはアンチセンスＲＮＡ等）、または他の薬剤）の識別を含み得る。
一実施形態において、化合物は、ペプチドフラグメントであってもよい。フラグメントには、約８以上〜約１００以下のアミノ酸の全ての可能性のあるアミノ酸長、例えば、約１０〜約１００のアミノ酸、約１５〜約１００のアミノ酸、約２０〜約１００のアミノ酸、約３５〜約１００のアミノ酸、約４０〜約１００のアミノ酸、約５０〜約１００のアミノ酸、約７０〜約１００のアミノ酸、約７５〜約１００のアミノ酸、または約８０〜約１００のアミノ酸の長さが含まれる。これらのペプチドフラグメントは、市販入手するか、または液相もしくは固相合成方法により合成することができる（Ａｔｈｅｒｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ．ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ）。ペプチドフラグメントは、天然源から単離するか、遺伝子組み換えを行うか、または化学的に調製することができる。これらの方法は、当該技術分野で周知である。
化合物は、抗体（モノクローナル、ポリクローナル、ヒト化、キメラ、もしくは完全ヒト）、またはその結合フラグメントといった、タンパク質であり得る。抗体フラグメントは、全長形態以外の抗体の形態であってもよく、操作された抗体フラグメントに加えて、全長抗体内に存在する部分または構成要素を含む。抗体フラグメントには、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、二特異性抗体、Ｆｖ、および（Ｆａｂ′）２、三特異性抗体、Ｆｃ、Ｆａｂ、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、ＣＤＲの組み合わせ、可変領域、四特異性抗体、二機能性ハイブリッド抗体、フレームワーク領域、定常領域等を挙げることができるが、これらに限定されない（Ｍａｙｎａｒｄ ｅｔ ａｌ．，（２０００）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．２：３３９−７６、Ｈｕｄｓｏｎ（１９９８）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．９：３９５−４０２を参照されたい）。抗体は、市販入手するか、特別に生成するか、または当該技術分野で確立された方法に従って目的の抗原に対して合成することができる（Ｊａｎｅｗａｙ ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ，５ｔｈ ｅｄ．，Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ）。
化合物は、ｓｉＲＮＡ、干渉ＲＮＡまたはＲＮＡｉ、ｄｓＲＮＡ、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ転写ＤＮＡ、リボソーム、およびＲＮＡ、ＤＮＡ、または人工核酸であり得るアンチセンス核酸からなる群から選択され得る。アンチセンスＤＮＡ、ＲＮＡ、およびＤＮＡ／ＲＮＡ分子を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的ｍＲＮＡに結合し、タンパク質の翻訳を予防することによって、ｍＲＮＡの転写を直接遮断するように機能する。少なくとも約１５塩基のアンチセンスオリゴヌクレオチドを、例えば、従来的なリン酸ジエステル技術によって、合成することができる（Ｄａｌｌａｓ ｅｔ ａｌ．，（２００６）Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．Ｍｏｎｉｔ．１２（４）：ＲＡ６７−７４、Ｋａｌｏｔａ ｅｔ ａｌ．，（２００６）Ｈａｎｄｂ．Ｅｘｐ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１７３：１７３−９６、Ｌｕｔｚｅｌｂｕｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，（２００６）Ｈａｎｄｂ．Ｅｘｐ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１７３：２４３−５９）。アンチセンスヌクレオチド配列には、モルホリノ、２’−Ｏ−メチルポリヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ等が含まれるが、これらに限定されない。
ｓｉＲＮＡは、約１５〜約５０個の塩基対、例えば、約２１〜約２５個の塩基対を含有し、細胞内で発現される標的遺伝子またはＲＮＡと同一またはほぼ同一のヌクレオチド配列を有する、二本鎖構造を含む。ｓｉＲＮＡは、標準的なワトソンクリック塩基対合相互作用によって一緒にアニーリングされたセンスＲＮＡ鎖と相補的アンチセンスＲＮＡ鎖とを含む。センス鎖は、標的ｍｉＲＮＡ分子内に含有される核酸配列と実質的に同一な核酸配列を含む。標的ｍＲＮＡ内に含まれる標的配列に「実質的に同一」であるとは、標的配列と約３％以下で異なる核酸配列を指す。ｓｉＲＮＡのセンス鎖およびアンチセンス鎖は、２つの相補的な一本鎖ＲＮＡ分子を含み得るか、または２つの相補的部分が、塩基対合し、一本鎖「ヘアピン」領域によって共有結合している、一本鎖分子を含み得る。ＭｃＭｎａｕｓ ａｎｄ Ｓｈａｒｐ（２００２）Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，３：７３７−４７、およびＳｅｎ ａｎｄ Ｂｌａｕ（２００６）ＦＡＳＥＢ Ｊ．，２０：１２９３−９９もまた参照されたく、これらの全開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
ｓｉＲＮＡは、１つ以上のヌクレオチドの付加、欠失、置換、および／または改変が、天然に存在するＲＮＡとは異なる、改変ＲＮＡであってもよい。このような改変には、ｓｉＲＮＡの末端（複数可）またはｓｉＲＮＡの１つ以上の内部ヌクレオチド等への非ヌクレオチド材料の付加、ｓｉＲＮＡをヌクレアーゼ消化に耐性にする修飾、またはｓｉＲＮＡ内の１つ以上のヌクレオチドとデオキシリボヌクレオチドの置換を挙げることができる。ｓｉＲＮＡの１つまたは両方の鎖はまた、３’オーバーハングを含んでもよい。本明細書に使用される際、３’オーバーハングとは、二重ＲＮＡ鎖の３’末端から延在する少なくとも１つの非対合ヌクレオチドを指す。例えば、ｓｉＲＮＡは、１〜約６個のヌクレオチド（リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドを含む）の長さ、または１〜約５個のヌクレオチドの長さ、または１〜約４個のヌクレオチドの長さ、または約２〜約４個のヌクレオチドの長さの少なくとも１つの３’オーバーハングを含み得る。例えば、ｓｉＲＮＡの各鎖は、ジチミジル酸（「ＴＴ」）またはジウルジル酸（「ｕｕ」）の３’オーバーハングを含み得る。
ｓｉＲＮＡは、化学的もしくは生物学的に生成することができるか、または組み換えプラスミドもしくはウイルスベクターから発現させることができる（例えば、米国特許第７，２９４，５０４号および米国特許第７，４２２，８９６号を参照されたく、これらの全開示は、参照により本明細書に組み込まれる）。ｄｓＲＮＡまたはｓｉＲＮＡの生成および試験のための例示的な方法は、Ｇｅｗｉｒｔｚへの米国特許出願公開第２００２／０１７３４７８号、Ｈａｎｎｏｎらへの米国特許出願公開第２００７／００７２２０４号、およびＲｅｉｃｈらへの米国特許出願公開第２００４／００１８１７６号に記載され、これらの全開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ転写ＤＮＡは、Ｕ６プロモーター等のプロモーターを含有する。これらのＤＮＡを転写して、ｓｉＲＮＡとして機能し得る細胞内の小ヘアピンＲＮＡまたはアンチセンスＲＮＡとして機能し得る線形ＲＮＡを生成することができる。化合物は、標的ＲＮＡおよび／または遺伝子が阻害されるように、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、合成ヌクレオチド、または任意の好適な組み合わせを含有し得る。さらに、核酸のこれらの形態は、一本鎖、二本鎖、三本鎖、または四本鎖であり得る。（例えば、Ｂａｓｓ（２００１）Ｎａｔｕｒｅ，４１１，４２８ ４２９、Ｅｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｎａｔｕｒｅ，４１１，４９４ ４９８、およびＰＣＴ公開第ＷＯ００／４４８９５号、同第ＷＯ０１／３６６４６号、同第ＷＯ９９／３２６１９号、同第ＷＯ００／０１８４６号、同第ＷＯ０１／２９０５８号、同第ＷＯ９９／０７４０９号、同第ＷＯ００／４４９１４号を参照されたい）。
化合物は、タンパク質に結合して、その機能を破壊するか、または逆にその機能を強化する、小分子であり得る。小分子は、一般的に低分子量を有する、多様な合成および天然の物質群である。それらは、天然源（例えば、植物、真菌、微生物等）から単離することができる、ライブラリーもしくは収集として市販入手および／もしくは利用可能である、または合成される。候補小分子は、コンビナトリアルライブラリーのインシリコスクリーニングまたは高スループット（ＨＴＰ）スクリーニングを介して識別することができる。アスピリン、ペニシリン、および多数の化学療法剤等、ほとんどの従来的な医薬品は、小分子であり、化学的に得ることができる、化学的に合成することができる、または以下に記載されるランダムもしくはコンビナトリアルライブラリーから得ることができる（Ｗｅｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，（２００６）Ｂｒｉｅｆ Ｆｕｎｃｔ．Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ ５（１）：３２−６）。
目的の分子の一次配列に関する知識、およびその配列と既知の機能のタンパク質との類似性は、アゴニストに加えて、目的のタンパク質の阻害剤またはアンタゴニストに関する情報を提供し得る。アゴニストおよびアンタゴニストの識別およびスクリーニングは、例えば、Ｘ線結晶学、中性子回析、核磁気共鳴分析法、および他の構造決定技術を使用して、タンパク質の構造特性を決定することによって、さらに促進される。これらの技術は、アゴニストおよびアンタゴニストの合理的設計または識別を提供する。
試験化合物は、合成または天然の化合物の大型ライブラリーからスクリーニングすることができる（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，（２００７）Ｃｕｒｒ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ，１４（２）：１３３−５５、Ｍａｎｎｈｏｌｄ（２００６）Ｃｕｒｒ Ｔｏｐ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ，６（１０）：１０３１−４７、およびＨｅｎｓｅｎ（２００６）Ｃｕｒｒ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ １３（４）：３６１−７６を参照されたい）。多数の手段が、現在、糖類、ペプチド、および核酸に基づく化合物のランダムおよび指向性合成に使用されている。合成化合物ライブラリーは、Ｍａｙｂｒｉｄｇｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（Ｔｒｅｖｉｌｌｅｔ，Ｃｏｒｎｗａｌｌ，ＵＫ）、ＡＭＲＩ（Ａｌｂａｎｙ，ＮＹ）、ＣｈｅｍＢｒｉｄｇｅ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、およびＭｉｃｒｏＳｏｕｒｃｅ（Ｇａｙｌｏｒｄｓｖｉｌｌｅ，ＣＴ）から市販入手可能である。希少化学ライブラリーは、Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，Ｗｉｓ．）から入手可能である。あるいは、細菌、真菌、植物、および動物からの抽出物の形態の天然化合物のライブラリーは、例えば、Ｐａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｂｏｔｈｅｌｌ，Ｗａｓｈ．）もしくはＭｙｃｏＳｅａｒｃｈ（Ｎ．Ｃ．）から入手可能であるか、または容易に生成可能である。さらに、天然または合成生成されたライブラリーおよび化合物は、従来的な化学、物理、および生化学手段を通じて容易に主食される（Ｂｌｏｎｄｅｌｌｅ ｅｔ ａｌ．，（１９９６）Ｔｉｂ Ｔｅｃｈ １４：６０）。
分子のライブラリーを調製する方法は、当該技術分野で周知であり、多数のライブラリーが市販入手可能である。本発明の目的のライブラリーには、ペプチドライブラリー、ランダム化オリゴヌクレオチドライブラリー、合成有機コンビナトリアルライブラリー等が挙げられる。変性ペプチドライブラリーは、溶液中、細菌性鞭毛ペプチド提示ライブラリーまたはファージ提示ライブラリーとして固定化形態で、容易に調製することができる。ペプチドリガンドは、少なくとも１つのアミノ酸を含むペプチドのコンビナトリアルライブラリーから選択することができる。ライブラリーは、ペプトイドまたは非ペプチド合成部分から合成されてもよい。このようなライブラリーを、さらに合成してもよく、それは、非ペプチド合成部分を含有し、天然に存在する対応物と比較して、酵素分解を受けにくい、。例えば、ライブラリーにはまた、プラスミド上ペプチドライブラリー、合成小分子ライブラリー、アプタマーライブラリー、インビトロ翻訳系ライブラリー、ポリソームライブラリー、合成ペプチドライブラリー、神経伝達物質ライブラリー、および化学ライブラリーを挙げることができるが、これらに限定されない。
化学合成ライブラリーの例は、Ｆｏｄｏｒ ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５１：７６７−７７３、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ ３５４：８４−８６、Ｌａｍ ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ ３５４：８２−８４、Ｍｅｄｙｎｓｋｉ，（１９９４）ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １２：７０９−７１０、Ｇａｌｌｏｐ ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｊ．Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３７（９）：１２３３−１２５１、Ｏｈｌｍｅｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：１０９２２−１０９２６、Ｅｒｂ ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：１１４２２−１１４２６、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １３：４１２、Ｊａｙａｗｉｃｋｒｅｍｅ ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：１６１４−１６１８、Ｓａｌｍｏｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：１１７０８−１１７１２、１９９３年１０月１４日付のＰＣＴ公開第ＷＯ９３／２０２４２号、およびＢｒｅｎｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：５３８１−５３８３に記載される。ファージ提示ライブラリーの例は、Ｓｃｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：３８６−３９０、Ｄｅｖｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４９：４０４−４０６、Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ，ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：７１１−７１８、Ｌｅｎｓｔｒａ，（１９９２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．１５２：１４９−１５７、Ｋａｙ ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｇｅｎｅ １２８：５９−６５、およびＰＣＴ公開第ＷＯ９４／１８３１８号に記載される。インビトロ翻訳系ライブラリーには、ＰＣＴ公開第ＷＯ９１／０５０５８号およびＭａｔｔｈｅａｋｉｓ ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：９０２２−９０２６に記載されるものが含まれるがこれらに限定されない。
ライブラリーのスクリーニングは、任意の多数の一般に知られている方法によって達成することができる。例えば、次の参考文献を参照されたく、これらは、ペプチドライブラリーのスクリーニングを開示する：Ｐａｒｍｌｅｙ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ，（１９８９）Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．２５１：２１５−２１８、Ｓｃｏｔｔ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ，（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：３８６−３９０、Ｆｏｗｌｋｅｓ ｅｔ ａｌ．，（１９９２）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １３：４２２−４２７、Ｏｌｄｅｎｂｕｒｇ ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：５３９３−５３９７、Ｙｕ ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｃｅｌｌ ７６：９３３−９４５、Ｓｔａｕｄｔ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：５７７−５８０、Ｂｏｃｋ ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ｎａｔｕｒｅ ３５５：５６４−５６６、Ｔｕｅｒｋ ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：６９８８−６９９２、Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ｎａｔｕｒｅ ３５５：８５０−８５２、全てＬａｄｎｅｒらに対する米国特許第５，０９６，８１５号、同第５，２２３，４０９号、および同第５，１９８，３４６号、Ｒｅｂａｒ ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６３：６７１−６７３、ならびにＰＣＴ公開第ＷＯ９４／１８３１８。
小分子コンビナトリアルライブラリーもまた、生成およびスクリーニングすることができる。有機小分子化合物のコンビナトリアルライブラリーは、１点以上の多様性が互いに異なる、密接に関連する類似体の収集であり、多段階プロセスを使用して、有機技術によって合成される。コンビナトリアルライブラリーは、膨大な数の有機小分子化合物を含む。コンビナトリアルライブラリーの１つの種類は、化合物アレイを生成する平行合成方法の手段によって調製される。化合物アレイは、Ｃａｒｔｅｓｉａｎ座標中のそれらの空間アドレスによって識別可能なり化合物の集合であり得、各化合物が、共通の分子心と１つ以上の可変構造多様性要素とを有するように配置され得る。このような化合物アレイ中の化合物は、各化合物がその空間アドレスによって識別および追跡される、別個の反応容器中で並行して生成される。平行合成混合物および平行合成方法の例は、１９９４年１月５日に出願された米国出願第０８／１７７，４９７号および１９９５年７月１３日に発行されたその対応するＰＣＴ公開特許出願Ｗ０９５／１８９７２号、ならびに１９９８年１月２７日に付与された米国特許第５，７１２，１７１号およびその対応するＰＣＴ公開特許出願第Ｗ０９６／２２５２９号に提供され、これらは、参照により本明細書に組み込まれる。
１つの非限定的な例において、ベンゾジアゼピンライブラリー（例えば、Ｂｕｎｉｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：４７０８−４７１２を参照されたい）等の非ペプチドライブラリーを、スクリーニングすることができる。Ｓｉｍｏｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：９３６７−９３７１によって記載されるもの等、ペプトイドライブラリーもまた使用可能である。化学的に形質転換されたコンビナトリアルライブラリーを生成するために、ペプチド中のアミド官能性が完全メチル化されている、使用可能なライブラリーの別の例は、Ｏｓｔｒｅｓｈ ｅｔ ａｌ．（１９９４），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：１１１３８−１１１４２によって記載される。
コンピュータによるモデリングおよび検索の技術は、対象における代謝障害の治療または予防、代謝障害を有する対象における冠動脈疾患の治療または予防、対象における肝臓のグルコース生成の低減、ならびに／あるいはＣａＭＫＩＩ、ＩＰ３Ｒ１、ＩＰ３Ｒ２、ＩＰ３Ｒ３を含むがこれらに限定されないＩＰ３Ｒ、カルシニューリン、ｐ３８、ＭＫ２／３、またはそれらの任意の組み合わせの活性および／または活性化の阻害または低減を行うことができる、化合物の識別または既に識別されている化合物の改善を可能にする。標的に結合するペプチドの調製または識別のための他の方法は、当該技術分野で既知である。例えば、分子インプリンティングは、分子に結合するペプチド等の高分子構造のデノボ構築に使用することができる。例えば、Ｋｅｎｎｅｔｈ Ｊ．Ｓｈｅａ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｐｒｉｎｔｉｎｇ ｏｆ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｎｅｔｗｏｒｋ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ：Ｔｈｅ Ｄｅ Ｎｏｖｏ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｎｄｉｎｇ ａｎｄ Ｃａｔａｌｙｔｉｃ Ｓｉｔｅｓ，ＴＲＩＰ Ｖｏｌ．２，Ｎｏ．５，Ｍａｙ １９９４、Ｍｏｓｂａｃｈ，（１９９４）Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．，１９（９）、およびＷｕｌｆｆ，Ｇ．，ｉｎ Ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ Ｒｅａｇｅｎｔｓ ａｎｄ Ｃａｔａｌｙｓｔｓ（Ｆｏｒｄ，Ｗ．Ｔ．，Ｅｄ．）ＡＣＳ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ Ｎｏ．３０８，ｐｐ１８６−２３０，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ（１９８６）を参照されたい。この様な構造体を調製する１つの方法は、（ｉ）所望の活性を呈する既知の基質（鋳型）の周囲における官能性単量体の重合ステップ、（ｉｉ）鋳型分子の除去ステップ、および続く（ｉｉｉ）鋳型の左側に空隙を残して第２の分類の単量体の重合し、鋳型のものと類似する１つ以上の所望の特性を呈する新しい分子を提供するステップを伴う。この方式でペプチドを調製することに加えて、多糖類、ヌクレオシド、薬物、核タンパク質、リポタンパク質、炭水化物、糖タンパク質、ステロイド、脂質、および他の生物学的に活性な材料等、他の結合分子もまた調製することができる。この方法は、多種多様な生物学的模倣体を設計するのに有用であり、これらは、官能性モノマーのフリーラジカル重合によって調製され、結果として非生分解性骨格を有する化合物をもたらすため、それらの天然の対応物よりも安定である。このような分子を設計するための他の方法は、例えば、構造活性関係に基づく薬物設計を含み、これは、多数の化合物の合成および評価ならびに分子モデリングを必要とする。
スクリーニングアッセイ。試験化合物または薬剤は、２種類のアッセイによって識別することができる：（ａ）細胞に基づくアッセイ、または（ｂ）無細胞アッセイ。アッセイは、試験化合物の結合の直接的または間接的な測定を含む、結合アッセイであってもよい。アッセイはまた、化合物の活性の直接的または間接的な測定を含む、活性アッセイであってもよい。アッセイはまた、目的の遺伝子によってコードされるｍＲＮＡ核酸配列またはタンパク質の発現の直接的または間接的な測定を含む、発現アッセイであってもよい。種々のスクリーニングアッセイを、代謝障害または冠動脈疾患または上昇した肝臓のグルコースの症状への試験化合物の効果を測定することを含む、インビボアッセイと組み合わせてもよい。インビボアッセイはまた、既知の哺乳動物モデルにおける代謝障害または冠動脈疾患または上昇した肝臓のグルコースへの試験化合物の効果を評価することを含み得る。
目的のタンパク質に結合するか、またはその活性を調整する試験化合物をスクリーニングするためのアッセイもまた、実行することができる。試験化合物は、従来的な化合物ライブラリーから等、任意の好適な手段によって得ることができる。試験化合物がタンパク質の膜結合形態に結合する能力の判定は、目的のタンパク質を発現する細胞への試験化合物の結合が、複合体中において標識化された化合物を検出することによって測定することができるように、試験化合物と放射同位体または酵素標識とを結合させることによって達成することができる。例えば、試験化合物を、３Ｈ、１４Ｃ、３５Ｓ、または１２５Ｉで直接的または間接的にのいずれかで標識化することができ、放射同位体を、電波放出の直接計数またはシンチレーション計数によって、検出することができる。あるいは、試験化合物を、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、またはルシフェラーゼで酵素標識してもよく、酵素標識は、生成物への適切な基質の変換の判定によって検出される。
目的のタンパク質または目的のタンパク質の標的を固定化して、タンパク質のうちの１つまたは両方の非複合体形態からの複合体形態の分離を促進することができる。ＣａＭＫＩＩ、ＩＰ３Ｒ１、ＩＰ３Ｒ２、ＩＰ３Ｒ３を含むがこれらに限定されないＩＰ３Ｒ、カルシニューリン、ｐ３８、またはＭＫ２／３、またはそれらの変異体等、目的のタンパク質への試験化合物の結合、または試験化合物の存在下および非存在下における、目的のタンパク質と標的分子との相互作用は、反応物を含有するのに好適な任意の容器中で達成することができる。このような容器の例には、マイクロタイタープレート、試験管、および微小遠心管が挙げられる。一実施形態において、タンパク質のうちの１つまたは両方がマトリックスに結合することを可能にするドメインを付加する融合タンパク質が提供され得る（例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合タンパク質またはグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ融合タンパク質を、グルタチオンセファロースビーズ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ； Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．）またはグルタチオン由来マイクロタイタープレート上に吸収させることができる）。
目的のタンパク質、またはその変異体はまた、固体支持体への結合を介して固定化することができる。固体支持体の非限定的な例には、ガラスまたはプラスチック製のスライド、組織培養プレート、マイクロタイターウェル、チューブ、シリコンチップ、またはビーズ（ラテックス、ポリスチレン、もしくはガラス製ビーズを含むがこれらに限定されない）等の粒子が挙げられる。共有結合および非共有結合、または受動的吸収の使用を含む、当該技術分野で既知の任意の方法を使用して、ポリペプチド（もしくはポリヌクレオチド）またはその変異体、または試験化合物を、固体支持体に結合させることができる。
本発明のスクリーニング方法はまた、ＣａＭＫＩＩ、ＩＰ３Ｒ１、ＩＰ３Ｒ２、ＩＰ３Ｒ３を含むがこれらに限定されないＩＰ３Ｒ、カルシニューリン、ｐ３８、もしくはＭＫ２／３、またはそれらの変異体等、目的のタンパク質の発現を監視することを伴い得る。例えば、目的のタンパク質の発現の調節因子は、細胞を試験化合物と接触させ、細胞内での目的のタンパク質の発現を判定することによって識別することができる。試験化合物の存在下における細胞内での目的のタンパク質の発現レベルを、試験化合物の不在下における目的のタンパク質の発現レベルと比較する。試験化合物は、次いで、この比較に基づいて、目的のタンパク質の発現の調節因子として識別することができる。例えば、細胞内での目的のタンパク質の発現が、試験化合物の存在下において、その不在下よりも統計的または有意に高い場合、試験化合物は、細胞内での目的のタンパク質の発現の刺激因子／エンハンサーとして識別される。あるいは、細胞内での目的のタンパク質の発現が、試験化合物の存在下において、その不在下よりも統計的または有意に低い場合、この化合物は、細胞内での目的のタンパク質の発現の阻害剤として識別される。試験化合物はまた、アンタゴニストとも称され得る。細胞内で目的の遺伝子またはｍＲＮＡによってコードされるタンパク質の発現レベルを判定する方法は、当該技術分野で周知である。
結合アッセイについては、試験化合物は、目的の遺伝子によってコードされるポリペプチド、またはその変異体の結合部分に結合して、それを占有する、小分子であり得る。これによって、通常の生物学的活性が妨げられるように、リガンド結合部位を基質に対してアクセス不可能となり得る。このような小分子には、小ペプチドまたはペプチド様分子が挙げられるが、これらに限定されない。結合アッセイにおいて、目的の遺伝子によってコードされる試験化合物またはポリペプチドのいずれも、蛍光、放射性同位体、化学発光、または酵素標識（例えば、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、もしくはルシフェラーゼ）等の検出可能な標識を含み得る。目的の遺伝子によってコードされるポリペプチドに結合した試験化合物の検出は、次いで、電波放射の直接計数、シンチレーション計数、または適切な基質から検出可能な生成物への変換の判定によって、判定することができる。
試験化合物が目的のタンパク質に結合する能力の判定はまた、ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ Ｂｉａｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＢＩＡ）を用いて達成することができる［ＭｃＣｏｎｎｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５７，１９０６−１９１２、Ｓｊｏｌａｎｄｅｒ，Ｕｒｂａｎｉｃｚｋｙ，１９９１，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６３，２３３８−２３４５］。ＢＩＡは、いずれの相互作用物質も標識することなく、実時間で生体特異性の相互作用を研究するための技術である（例えば、ＢＩＡ−ｃｏｒｅ（商標））。光学現象表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）の変化を、生体分子間の実時間反応を表すものとして使用することができる。
目的のタンパク質に結合して、それと相互作用し、その活性を調整する他のタンパク質を特定するために、目的の遺伝子によってコードされるポリペプチドを、当該技術分野で実施されている方法に従って、２ハイブリッドアッセイまたは３ハイブリッドアッセイにおける釣り餌（ｂａｉｔ）タンパク質として使用することができる（Ｓｚａｂｏ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．５，６９９−７０５、米国特許第５，２８３，３１７号）。２ハイブリッドシステムは、別個のＤＮＡ結合ドメインと活性化ドメインとからなる、ほとんどの転写因子のモジュラー性に基づく。
機能アッセイ。化合物を、ＣａＭＫＩＩ、ＩＰ３Ｒ１、ＩＰ３Ｒ２、ＩＰ３Ｒ３を含むがこれらに限定されないＩＰ３Ｒ、カルシニューリン、ｐ３８、もしくはＭＫ２／３等、目的のタンパク質またはそれらの変異体の活性を増加または減少させる能力について試験することができる。精製した目的のタンパク質、細胞膜調製物、またはインタクトな細胞を、試験化合物と接触させた後に、活性を測定することができる。目的のタンパク質の活性を、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または１００％減少させる試験化合物は、目的のタンパク質の活性を減少させるための潜在的薬剤、例えばアンタゴニストとして識別される。目的のタンパク質の活性を、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または１００％増加させる試験化合物は、目的のタンパク質の活性を増加させるための潜在的薬剤、例えばアゴニストとして識別される。
化合物
本開示は、対象における代謝障害の治療および／または予防のための方法を提供する。本開示はまた、代謝障害を有する対象における冠動脈疾患の治療および／または予防のための方法を提供する。一実施形態において、障害は、肥満によって誘発される。別の実施形態において、障害は、肥満によって誘発されない。本開示はまた、対象における肝臓のグルコース生成を低減させるための方法を提供する。本開示はまた、ＣａＭＫＩＩ、ＩＰ３Ｒ１、ＩＰ３Ｒ２、およびＩＰ３Ｒ３を含むがこれらに限定されないＩＰ３Ｒ、カルシニューリン、ｐ３８、またはＭＫ２／３の活性を低減させるか、または活性を阻害するための方法を提供する。本開示はまた、ＣａＭＫＩＩ、ＩＰ３Ｒ１、ＩＰ３Ｒ２、およびＩＰ３Ｒ３を含むがこれらに限定されないＩＰ３Ｒ、カルシニューリン、ｐ３８、またはＭＫ２／３のリン酸化および／または活性化を低減させるための方法を提供する。
一態様において、本開示は、代謝障害の治療または予防を、それを必要とする対象において行うための方法であって、対象に化合物の治療有効量を投与し、それによって障害を治療または予防することを含む、方法を提供する。
一実施形態において、本化合物は、ＣａｍＫＩＩの阻害剤である。別の実施形態において、本化合物は、ＩＰ３Ｒ１、ＩＰ３Ｒ２、およびＩＰ３Ｒ３を含むがこれらに限定されないＩＰ３Ｒの阻害剤である。一実施形態において、本化合物は、カルシニューリンの阻害剤である。一実施形態において、本化合物は、ｐ３８の阻害剤である。別の実施形態において、本化合物は、ＭＫ２／３の阻害剤である。別の実施形態において、本化合物は、ＣａｍＫＩＩ、ＩＰ３Ｒ１、ＩＰ３Ｒ２、および／もしくはＩＰ３Ｒ３を含むがこれらに限定されないＩＰ３Ｒ、カルシニューリン、ｐ３８、ＭＫ２／３、またはこれらの任意の組み合わせの阻害剤である。
一実施形態において、本化合物は、ＣａｍＫＩＩの活性化剤である。別の実施形態において、本化合物は、ＩＰ３Ｒ１、ＩＰ３Ｒ２、およびＩＰ３Ｒ３を含むがこれらに限定されないＩＰ３Ｒの活性化剤である。一実施形態において、本化合物は、カルシニューリンの活性化剤である。一実施形態において、本化合物は、ｐ３８の活性化剤である。別の実施形態において、本化合物は、ＭＫ２／３の活性化剤である。別の実施形態において、本化合物は、ＣａｍＫＩＩ、ＩＰ３Ｒ１、ＩＰ３Ｒ２、および／もしくはＩＰ３Ｒ３を含むがこれらに限定されないＩＰ３Ｒ、カルシニューリン、ｐ３８、ＭＫ２／３、またはこれらの任意の組み合わせの活性化剤である。
任意の好適な化合物、ＣａＭＫＩＩタンパク質、ＩＰ３Ｒ１、ＩＰ３Ｒ２、およびＩＰ３Ｒ３を含むがこれらに限定されないＩＰ３Ｒ、カルシニューリン、ｐ３８、ならびに／またはＭＫ２／３の阻害剤または活性化剤のいずれかである、任意の好適化合物を、本発明の方法で使用することができる。このような化合物は、例えば、小分子薬、ペプチド剤、ペプチド模倣剤、抗体（限定されないが、モノクローナル、ポリクローナル、ヒトか、および完全ヒト化抗体、ならびに抗体フラグメントを含む）、阻害性ＲＮＡ分子（ｓｉＲＮＡ等）等であり得る。当業者であれば、これらおよび他の種類の薬剤を使用して、ＣａＭＫＩＩ、ＩＰ３Ｒ１、ＩＰ３Ｒ２、およびＩＰ３Ｒ３を含むがこれらに限定されないＩＰ３Ｒ、カルシニューリン、ｐ３８、ＭＫ２／３、またはそれらの任意の組み合わせの活性を阻害または低減または増加させるか、あるいはＣａＭＫＩＩ、ＩＰ３Ｒ１、ＩＰ３Ｒ２、およびＩＰ３Ｒ３を含むがこれらに限定されないＩＰ３Ｒ、カルシニューリン、ｐ３８、ＭＫ２／３、またはそれらの任意の組み合わせのリン酸化ならびに／または活性化を低減または増加させることができることを理解するであろう。
一実施形態において、本発明の化合物は、ＣａＭＫＩＩの小分子阻害剤である。このような阻害剤には、ＫＮ−９３（Ｎ−［２−［［［３−（４−クロロフェニル）−２−プロペニル］メチルアミノ］メチル］フェニル］−Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−４−メトキシベンゼンスルホンアミド）、ラベンダスチンＣ（５−（（２，５−ジヒドロキシベンジル）アミノ）−２−ヒドロキシ安息香酸）、ＣＫ５９（２−（２−ヒドロキシエチルアミノ）−６−アミノヘキシルカルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル−９−イソプロピルプリン）、ＫＮ６２（Ｃｌｙｎｅ ｅｔ ａｌ．，１９９５を参照されたい）、ＤＹ９７６０ｅ（Ｓｕｇｉｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，１９９７を参照されたい）、Ｋ−２５２ａノカルジオプシスｓｐ．（Ｋａｓｅ ｅｔ ａｌ．，１９８７を参照されたい）、Ｈ８９ジヒドロクロリド（Ｎ−［２−［［３−（４−ブロモフェニル）−２−プロペニル］アミノ］エチル］−５−イソキノリンスルホンアミドジヒドロクロリド）、ＰＰ１アナログＩＩ、１ＮＭ−ＰＰ１（突然変異キナーゼ阻害剤ＩＩ、４−アミノ−１−ｔｅｒｔ−ブチル−３−（１′−ナフチルメチル）ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン、ＮＭ）、ｅＥＦ−２キナーゼ阻害剤ＮＨ１２５（１−ベンジル−３−セチル−２−ヨウ化メチルイミダゾリウム、１−セチル−３−ベンジル−２−ヨウ化メチルイミダゾリウム、ＣａＭ−依存性キナーゼＩＩＩ阻害剤、ＮＨ１２５）、およびＳＴＯ−６０９（Ｔｏｋｕｍｉｔｓｕ ｅｔ ａｌ．，２００２を参照されたい）が挙げられるが、これらに限定されない。
別の実施形態において、本発明の化合物は、ＣａＭＫＩＩのペプチドまたはペプチド模倣体阻害剤または活性化剤である。このようなペプチドまたはペプチド模倣体阻害剤または活性化剤には、Ａｎｔ−ＣａＭＫＩＩＮｔｉｄｅ、［Ａｌａ２８６］−Ｃａ２＋／カルモジュリンキナーゼＩＩ阻害剤２８１〜３０１、［Ａｌａ２８６］−Ｃａ２＋／カルモジュリンキナーゼＩＩ阻害剤２８１〜３０９、およびＣａＭキナーゼＩＩ（２９０〜３０９）カルモジュリンアンタゴニストが挙げられるがこれらに限定されない。
別の実施形態において、本発明の化合物は、ＣａＭＫＩＩのタンパク質またはポリペプチド阻害剤または活性化剤である。このようなタンパク質またはポリペプチド阻害剤は、限定されないが、オンコモジュリン／ＭＤＰ１４等の組み換えタンパク質またはポリペプチドであり得る。
別の実施形態において、本発明の化合物は、ＣａＭＫＩＩタンパク質の構成要素の抗体阻害剤または活性化剤である。さらに別の実施形態において、本発明の化合物は、ＣａＭＫＩＩのヌクレオチド系阻害剤または活性化剤である。このような阻害剤は、ＣａＭＫＩＩまたはその変異体の発現または活性を阻害する、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ分子、およびリボザイムを含むが、これらに限定されない。このようなヌクレオチド系阻害剤は、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、または種々の人工的ヌクレオチド誘導体を含み得る。
ＣａＭＫＩＩの活性を阻害し得るか、またはＣａＭＫＩＩの活性化を低減し得る他の化合物は、米国特許第７，２０５，２９８号（Ｋｕｏ ｅｔ ａｌ．，）、米国公開第２００４／００８６９７３（Ｄｕｅｃｋｅｒ Ｋ．）号、米国公開第２０１０−００５６４９４号（Ｗｉｎｚｅｌｅｒ ｅｔ ａｌ．）、米国特許第５，３８６，０１９号（Ｄａｎｉｓｈｅｆｓｋｙ ｅｔ ａｌ．）、および米国特許第６，８２８，３２７（Ｋｕｏ ｅｔ ａｌ．）にさらに記載されている。
一実施形態において、本発明の化合物は、ＩＰ３Ｒ１、ＩＰ３Ｒ２、およびＩＰ３Ｒ３を含むがこれらに限定されないＩＰ３Ｒの小分子阻害剤である。このような阻害剤には、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）ｃａｔ＃６８２１６０からのゼストスポンジンＣが挙げられるがこれに限定されない。ゼストスポンジンＣは、海綿から単離されたオキサキノリジジンアルカロイドであり、ＩＰ３−結合部位と相互作用しないＩＰ３に媒介されるＣａ２＋放出の非常に強力な可逆性の膜透過性遮断薬（ＩＣ５０＝３５８ｎＭ）である。これは、リアノジン受容体１型（ＲｙＲ−１）の骨格アイソフォームに対して高い選択性を提示する。これはまた、可逆様式で、ブラジキニンおよびカルバミルコリン誘発される、小胞体貯蔵からのＣａ２＋流出を遮断する。ＩＰ３Ｒの他の小分子阻害剤には、Ｔｏｃｒｉｓ，Ｂｒｉｓｔｏｌ，ＵＫからのアミノエトキシジフェニルホウ酸塩（２−ＡＰＢとも称される）（参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＳｕｇａｗａｒａ ｅｔ ａｌ．，１９９７，ＥＭＢＯ Ｊ．，１６：３０７８−８８を参照されたい）、およびカフェインが挙げられる。別の実施形態において、本発明の化合物は、ＩＰ３Ｒ１、ＩＰ３Ｒ２、およびＩＰ３Ｒ３を含むがこれらに限定されないＩＰ３Ｒの小分子活性化剤である。
別の実施形態において、本発明の化合物は、ＩＰ３Ｒ１、ＩＰ３Ｒ２、およびＩＰ３Ｒ３を含むがこれらに限定されないＩＰ３Ｒのペプチドまたはペプチド模倣体阻害剤または活性化剤である。別の実施形態において、本発明の化合物は、ＩＰ３Ｒ１、ＩＰ３Ｒ２、およびＩＰ３Ｒ３を含むがこれらに限定されないＩＰ３Ｒのタンパク質またはポリペプチド阻害剤または活性化剤である。このようなタンパク質またはポリペプチド阻害剤は、組み換えタンパク質またはポリペプチドであってもよい。
別の実施形態において、本発明の化合物は、ＩＰ３Ｒ１、ＩＰ３Ｒ２、およびＩＰ３Ｒ３を含むがこれらに限定されないＩＰ３Ｒの抗体阻害剤または活性化剤である。さらに別の実施形態において、本発明の化合物は、ＩＰ３Ｒ１、ＩＰ３Ｒ２、およびＩＰ３Ｒ３を含むがこれらに限定されないＩＰ３Ｒのヌクレオチド系阻害剤または活性化剤である。このような阻害剤は、ＩＰ３Ｒ１、ＩＰ３Ｒ２、およびＩＰ３Ｒ３を含むがこれらに限定されないＩＰ３Ｒ、またはそれらの変異体の発現または活性を阻害する、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ分子、およびリボザイムを含むが、これらに限定されない。このようなヌクレオチド系阻害剤は、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、または種々の人工的ヌクレオチド誘導体を含み得る。
一実施形態において、本発明の化合物は、カルシニューリンの小分子阻害剤である。このような阻害剤には、ピメクロリムスおよびタクロリムスが挙げられるがこれらに限定されない。別の実施形態において、本発明の化合物は、カルシニューリンの小分子活性化剤である。
別の実施形態において、本発明の化合物は、カルシニューリンのペプチドまたはペプチド模倣体阻害剤または活性化剤である。このようなペプチドまたはペプチド模倣体阻害剤には、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）ｃａｔ＃２３９８３５からのカルシニューリン（ＰＰ２Ｂ）阻害剤シクロスポリンＡが挙げられる。この化合物は、ラット胸腺細胞およびマウスＢ細胞のリンパ腫細胞系であるＷＥＨ１−２３１においてアポトーシスを誘発する免疫抑制特性を有する環状オリゴペプチドである。これは、ＢＬＢ細胞系において抗ＩｇＭおよびイオノマイシンに誘発されるアポトーシスを防ぐ。シクロスポリンＡとシクロフィリンとの複合体は、ナノモル親和性を有するタンパク質ホスファターゼ２Ｂを阻害し、インターロイキン−１α、リポ多糖類、およびＴＮＦ−αによって誘発される一酸化窒素合成を阻害する。これはまた、胚幹細胞から心筋細胞を誘発する。
別の実施形態において、本発明の化合物は、カルシニューリンのタンパク質またはポリペプチド阻害剤または活性化剤である。このようなタンパク質またはポリペプチド阻害剤は、組み換えタンパク質またはポリペプチドであり得る。
別の実施形態において、本発明の化合物は、カルシニューリンの抗体阻害剤または活性化剤である。さらに別の実施形態において、本発明の化合物は、カルシニューリンのヌクレオチド系阻害剤または活性化剤である。このような阻害剤は、カルシニューリンまたはその変異体の発現または活性を阻害する、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ分子、およびリボザイムを含むが、これらに限定されない。このようなヌクレオチド系阻害剤は、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、または種々の人工的ヌクレオチド誘導体を含み得る。
一実施形態において、本発明の化合物は、ｐ３８の小分子阻害剤である。このような阻害剤には、ＳＢ２０２１９０、ＳＢ２０３５８０、およびＳＢ２３９０６３が挙げられるがこれらに限定されない。ＳＢ２０３５８０は、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）ｃａｔ＃５５９３８９から入手可能な化合物である。これは、高度に特異的で強力な細胞透過性の選択的、可逆的、ＡＴＰ競合的なｐ３８ＭＡＰキナーゼの阻害剤である（ＩＣ５０＝インビトロ３４ｎＭ、細胞内６００ｎＭ）。これは、１００μＭではＪＮＫおよびｐ４２ＭＡＰキナーゼを有意に阻害しない。エピルビシンに誘発される細胞損傷およびカスパーゼ３／７活性を低減させ、ＬＰＳ刺激に刺激されるヒト単球およびヒト単球細胞系ＴＨＰ−１からのＩＬ−１およびＴＮＦ−α産生を阻害する（ＩＣ５０＝５０〜１００ｎＭ）。これは、ＰＣ１２細胞における骨形成タンパク質２に誘発される神経突起伸長を阻害する。別の実施形態において、本発明の化合物は、ｐ３８の小分子活性化剤である。
別の実施形態において、本発明の化合物は、ｐ３８のペプチドまたはペプチド模倣体阻害剤または活性化剤である。
別の実施形態において、本発明の化合物は、ｐ３８のタンパク質またはポリペプチド阻害剤または活性化剤である。このようなタンパク質またはポリペプチド阻害剤は、組み換えタンパク質またはポリペプチドであってもよい。
別の実施形態において、本発明の化合物は、ｐ３８の抗体阻害剤または活性剤である。さらに別の実施形態において、本発明の化合物は、ｐ３８のヌクレオチド系阻害剤または活性化剤である。このような阻害剤は、ｐ３８またはその変異体の発現または活性を阻害する、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ分子、およびリボザイムを含むが、これらに限定されない。このようなヌクレオチド系阻害剤は、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、または種々の人工的ヌクレオチド誘導体を含み得る。
一実施形態において、本発明の化合物は、ＭＫ２／３の小分子阻害剤である。別の実施形態において、本発明の化合物は、ＭＫ２／３の小分子活性化剤である。このようなＭＫ２／３の小分子阻害剤には、アミノシアノピリジン化合物、ピロロピリジン、およびカルボリン系ＭＫ２阻害剤が挙げられるがこれらに限定されない（Ｆｙｈｒｑｕｉｓｔ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇ，Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，１３０：３４２−３４４を参照されたく、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
別の実施形態において、本発明の化合物は、ＭＫ２／３のペプチドまたはペプチド模倣体阻害剤または活性化剤である。このようなペプチド阻害剤には、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）ｃａｔ＃ ３８５８８０から入手可能なＨｓｐ２５キナーゼ阻害剤が挙げられるがこれに限定されない。この阻害剤は、哺乳動物の熱ショックタンパク質（Ｈｓｐ２５）キナーゼ［マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ活性化タンパク質キナーゼ−２（ＭＡＰＫＡＰキナーゼ−２）とも称される］の強力な選択的阻害剤として機能する、１３残基の細胞透過性ペプチドである。阻害は、基質ペプチドに対しては競合的であり（Ｋｉ＝８．１μＭ）、ＡＴＰに関しては非競合的である（Ｋｉ＝１３４μＭ）。
別の実施形態において、本発明の化合物は、ＭＫ２／３のタンパク質またはポリペプチド阻害剤である。このようなタンパク質またはポリペプチド阻害剤は、組み換えタンパク質またはポリペプチドであってもよい。
別の実施形態において、本発明の化合物は、ＭＫ２／３の抗体阻害剤または活性化剤である。さらに別の実施形態において、本発明の化合物は、ＭＫ２／３のヌクレオチド系阻害剤または活性化剤である。このような阻害剤には、ＭＫ２／３またはそれらの変異体の発現または活性を阻害する、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ分子、リボザイムが挙げられるがこれらに限定されない。このようなヌクレオチド系阻害剤は、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、または種々の人工的ヌクレオチド誘導体を含み得る。
当業者であれば、他の薬剤が、ＣａＭＫＩＩ、ＩＰ３Ｒ１、ＩＰ３Ｒ２、およびＩＰ３Ｒ３を含むがこれらに限定されないＩＰ３Ｒ、カルシニューリン、ｐ３８、ならびに／またはＭＫ２／３の阻害剤または活性化剤として有用であり得、本発明の方法と併せて使用することができることを理解するであろう。
治療のための薬学的組成物および投与
本発明の化合物はまた、対象に１回投与することができる（例えば、単回注射または沈着として）。あるいは、本発明の化合物は、約２〜約２８日間、または約７〜約１０日間の期間、１日に１回または２回、それを必要とする対象に投与することができる。本発明の化合物はまた、１年に１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２回、またはそれらの組み合わせの期間で、１日１回または２回、対象に投与され得る。さらに、本発明の化合物は、他の治療薬と併用投与してもよい。用量レジメンが、複数回の投与を含む場合、対象に投与される化合物（複数可）の有効量は、用量レジメン全体で投与される化合物（複数可）の合計量を含み得る。
化合物は、対象の細胞に化合物を送達するのに好適な任意の手段によって対象に投与され得る。例えば、化合物は、細胞をトランスフェクトするのに好適な方法によって投与してもよい。真核細胞のトランスフェクション方法は、当該技術分野で周知であり、細胞の核または前核への核酸の直接注入を含む。電気穿孔法、リポソーム転移または脂溶性材料によって媒介される転移、受容体に媒介される核酸送達、生体弾道、または粒子加速、リン酸カルシウム沈殿、およびウイルスベクターによって媒介されるトランスフェクションが挙げられる。
本発明の組成物を、製剤化し、活性成分と、ヒトまたは動物（例えば、イヌ、ネコ、もしくはウマ）等の対象の体内における薬剤の作用部位との接触をもたらす任意の手段によって投与して、代謝障害、冠動脈疾患、または上昇した肝臓のグルコース生成と関連する症状を低減させることができる。これらは、個々の治療活性成分または治療活性成分の組み合わせのいずれかとして、医薬品との併用に利用可能な任意の従来的手段によって投与することができる。これらは、単独で投与してもよいが、一般的には、選択された投与経路および標準的な薬学的行為に応じて選択された薬学的担体とともに投与される。
本発明の化合物は、代謝障害または冠動脈疾患の治療もしくは予防、または肝臓のグルコース生成の低減を行うのに効果的な量で、対象に投与することができる。当業者であれば、本化合物が予防的または治療的に使用されるのかを考慮して、さらに対象の年齢、体重、および性別等の他の因子、対象が摂取している可能性のある任意の他の薬物、対象が有し得る任意のアレルギーまたは禁忌等を考慮して、対象に投与されることになる本発明の化合物の有効量がどの程度であるかを容易に判断することができる。例えば、有効量は、インビトロまたはインビボで確立された滴定曲線の分析を含む、既知の手順を使用して、当業者によって決定することができる。さらに、当業者は、好適な動物モデル種において試験的実験を行い、対象の体重等に応じて用量を増減することによって、有効用量を決定することができる。有効量はまた、対象と同じ種の個体において臨床試験を行い、例えば、低用量で開始し、用量を徐々に増加させ、代謝障害または冠動脈疾患への効果を監視することによって、判定することができる。適切な投与レジメンはまた、例えば、薬剤を単回投与または複数回投与で投与するかどうかを判定し、複数回投与の場合には、効果的な投与間隔を判定するために、過度の実験を行うことなく、当業者によって判定することができる。
代謝障害または冠動脈疾患を治療もしくは予防するか、または肝臓のグルコース生成を低減させる化合物の治療有効用量は、当業者に既知の多数の因子に依存し得る。化合物の用量（複数可）は、例えば、対象または処置される試料の固有性、大きさ、および状態に応じて、さらには、組成物が投与される経路、および該当する場合は、専門家が目的の標的に対して化合物が有することを望む効果に応じて、多様であり得る。これらの量は、当業者によって容易に決定することができる。これらの量は、例えば、約０．２５ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ、約４ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ、約６ｍｇ／ｋｇ、約７ｍｇ／ｋｇ、約８ｍｇ／ｋｇ、約９ｍｇ／ｋｇ、もしくは約１０ｍｇ／ｋｇ、または約０．２５ｍｇ／ｋｇ〜約０．５ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ〜２ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ〜３ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ〜４ｍｇ／ｋｇ、４ｍｇ／ｋｇ〜５ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ〜６ｍｇ／ｋｇ、６ｍｇ／ｋｇ〜７ｍｇ／ｋｇ、７ｍｇ／ｋｇ〜８ｍｇ／ｋｇ、８ｍｇ／ｋｇ〜９ｍｇ／ｋｇ、もしくは９ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、またはその間の任意の範囲といった、対象の体重１キログラム（ｋｇ）当たりのｍｇまたはマイクログラム（μｇ）量を含む。これらの量はまた、例えば、少なくとも約０．５ｍｇ、１ｍｇ、２ｍｇ、３ｍｇ、５ｍｇ、１０ｍｇ、２０ｍｇ、３０ｍｇ、４０ｍｇ、５０ｍｇ、６０ｍｇ、７０ｍｇ、８０ｍｇ、９０ｍｇ、１００ｍｇ、１１０ｍｇ、１２０ｍｇ、１３０ｍｇ、１４０ｍｇ、１５０ｍｇ、１６０ｍｇ、１７０ｍｇ、１８０ｍｇ、１９０ｍｇ、２００ｍｇ、２２５ｍｇ、２５０ｍｇ、２７５ｍｇ、３００ｍｇ、３２５ｍｇ、３５０ｍｇ、３７５ｍｇ、４００ｍｇ、４２５ｍｇ、４５０ｍｇ、４７５ｍｇ、５００ｍｇ、５２５ｍｇ、５５０ｍｇ、５７５ｍｇ、６００ｍｇ、６２５ｍｇ、６５０ｍｇ、６７５ｍｇ、７００ｍｇ、７５０ｍｇ、８００ｍｇ、８５０ｍｇ、９００ｍｇ、またはそれ以上である、化合物の単位用量を含む。本明細書に記載される治療適用のいずれも、例えば、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ウサギ、サル、ブタ、ヒツジ、ヤギ、またはヒト等の哺乳動物を含む、このような治療を必要とする任意の対象に適用することができる。
本発明による使用のための薬学的組成物は、１つ以上の生理学的に許容される担体または賦形剤を使用して従来の方式で製剤化することができる。本発明の治療的組成物は、全身および局所または局部投与を含む、種々の投与経路のために製剤化することができる。技術および剤形は、一般に、Ｒｅｍｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍｅａｄｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ（２０ｔｈ Ｅｄ．，２０００）に見出すことができ、その開示の全ては、参照により本明細書に組み込まれる。全身投与については、筋肉内、静脈内、および皮下を含む、注射が有用である。注射については、本発明の治療的組成物を、溶液中、例えば、ハンクス溶液またはリンガー溶液等、生理学的に適合可能な緩衝液中に、製剤化することができる。さらに、治療的組成物は、固体形態に製剤化し、使用の直前に再溶解または懸濁させてもよい。凍結乾燥形態もまた含まれる。本発明の治療的組成物は、少なくとも滅菌かつ発熱物質不含であるとして特徴付けられる。これらの薬学的製剤には、ヒトおよび獣医学的使用のための製剤が含まれる。
本発明によると、薬学的に許容される担体は、薬学的投与と適合性のある、ありとあらゆる溶媒、分散媒、コーティング剤、抗細菌および抗真菌剤、等張化および吸収遅延剤等を含み得る。薬学的に活性な物質のためのこのような媒体および薬剤の使用は、当該技術分野で周知である。活性化合物と適合性のある任意の従来的な媒体または薬剤を、使用することができる。補助的な活性化合物もまた、組成物中に組み込むことができる。
本発明はまた、使用説明書とともにパッケージ化された、薬学的に許容される担体と、本発明のスクリーニングアッセイを使用して識別された化合物とを含む、キットを提供する。
本発明の化合物を含む薬学的組成物は、本明細書に記載される治療効果のいずれかのために、薬学的に許容される担体と併せて投与することができる。このような薬学的組成物は、例えば、目的の遺伝子によってコードされるポリペプチドを対象とする抗体もしくはその変異体、または目的の遺伝子によってコードされるポリペプチドのアゴニストおよびアンタゴニストを含み得る。本組成物は、単独で投与するか、または、安定化化合物等の少なくとも１つの他の薬剤と組み合わせて投与することができ、これは、生理食塩水、緩衝食塩水、デキストロース、および水を含むがこれらに限定されない任意の滅菌で生体適合性の薬学的担体中で投与可能である。本組成物は、単独でか、または他の薬剤、薬物、もしくはホルモンと組み合わせて、患者に投与することができる。
本発明の薬学的組成物は、意図される投与経路と適合性となるように製剤化される。投与経路の例には、非経口、例えば、静脈内、皮内、皮下、経口（例えば、吸入）、経皮（局所）、経粘膜、および直腸投与が挙げられる。非経口、皮内、または皮下適用に使用される溶液または懸濁液は、以下の構成要素を含み得る：注射用水食塩溶液、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、または他の合成溶媒等の滅菌希釈剤；ベンジルアルコールまたはメチルパラベン等の抗細菌剤；アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウム等の酸化防止剤；エチレンジアミン四酢酸等のキレート剤；酢酸、クエン酸、またはリン酸等の緩衝液、および塩化ナトリウムまたはデキストロース等、等張性調節のための薬剤。ｐＨは、塩酸または水酸化ナトリウム等の酸または塩基で調節することができる。非経口製剤は、ガラスまたはプラスチック製のアンプル、使い捨てシリンジ、または複数回投与バイアルに封入することができる。
注射剤での使用に好適な薬学的組成物には、滅菌水溶液（水溶性の場合）または分散液、および滅菌注射溶液または分散液の即時調製のための滅菌粉末が含まれる。静脈内投与については、好適な担体には、生理食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＭ（商標）（ＢＡＳＦ，Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，Ｎ．Ｊ．）、またはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。いずれの場合においても、組成物は滅菌でなければならず、容易な注射針通過性が存在する程度に流体でなければならない。それは、製造および保管の条件下で安定でなければならず、細菌および真菌等の微生物の混入作用から保護される必要がある。担体は、例えば、水、エタノール、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールのような薬学的に許容されるポリオール、およびそれらの好適な混合物を含有する、溶媒または分散媒であり得る。適正な流動性は、例えば、レシチン等のコーティング剤の使用によって、分散液の場合は必要とされる粒径の維持によって、および界面活性剤の使用によって、維持することができる。微生物の作用の予防は、種々の抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサール等によって、達成することができる。多くの場合、等張剤、例えば、糖、マンニトール、ソルビトール等の多価アルコール、塩化ナトリウムを、組成物中に含むことが有用であり得る。注射用組成物の長期吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組み込むことによって、もたらすことができる。
滅菌注射溶液は、適切な溶媒中、必要とされる量で、化合物（例えば、小分子、ペプチド、または抗体）を、本明細書に列挙される成分のうちの１つ、またはそれらの組み合わせとともに組み込み、続いて濾過滅菌することによって調製することができる。一般に、分散液は、塩基性分散媒と本明細書に列挙されるものからの必要な他の成分とを含有する滅菌ビヒクル中に活性化合物を組み込むことによって、調製される。滅菌注射溶液の調製のための滅菌粉末の場合、有用な調製方法の例は、活性成分に加えて、任意の追加の所望される成分の粉末を、事前に滅菌濾過したそれらの溶液からもたらす、真空乾燥および凍結乾燥である。
経口組成物は、一般に、不活性希釈剤または食用担体を含む。それらは、ゼラチンカプセルに封入されるか、または錠剤に圧縮することができる。経口治療投与の目的で、活性化合物を、賦形剤と共に組み込み、錠剤、トローチ、またはカプセルの形態で使用することができる。経口組成物はまた、マウスウォッシュとして使用するために、流体担体を使用して調製することもでき、その場合、流体担体の化合物を、口に適用し、すすいで、吐き出すか、または飲み込む。
薬学的に適合性のある結合剤および／またはアジュバント材料を、組成物の一部として含んでもよい。錠剤、丸剤、カプセル、トローチ等は、以下の成分のいずれか、または類似の性質の化合物を含有し得る：微結晶性セルロース、トラガカントゴム、もしくはゼラチン等の結合剤；デンプンもしくはラクトース等の賦形剤、アルギニン酸、Ｐｒｉｍｏｇｅｌ、もしくはトウモロコシデンプン等の崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムもしくはステロート（ｓｔｅｒｏｔｅ）等の滑沢剤；コロイド状二酸化ケイ素等の流動促進剤（ｇｌｉｄａｎｔ）；スクロースもしくはサッカリン等の甘味剤；またはペパーミント、サリチル酸メチル、もしくはオレンジ風味等の香味剤。
全身投与もまた、経粘膜または経皮手段によって行われ得る。経粘膜または経皮投与については、透過される障壁に適した浸透剤を、製剤に使用する。このような浸透剤は、概して、当該技術分野で既知であり、例えば、経粘膜投与については、界面活性剤、胆汁塩、およびフシジン酸誘導体が含まれる。経粘膜投与は、鼻内スプレーまたは坐剤の使用を通じて達成することができる。経皮投与については、活性化合物は、当該技術分野で一般的に既知のように、軟膏（ｏｉｎｔｍｅｎｔ）、軟膏（ｓａｌｖｅ）、ゲル、またはクリームに製剤化される。いくつかの実施形態において、化合物は、経皮吸収のために活性化合物をゆっくりと放出する、経皮送達系を介して適用することができる。透過促進剤を使用して、条件培地中の活性因子の経皮浸透を促進することができる。経皮パッチは、例えば、米国特許第５，４０７，７１３号、米国特許第５，３５２，４５６号、米国特許第５，３３２，２１３号、米国特許第５，３３６，１６８号、米国特許第５，２９０，５６１号、米国特許第５，２５４，３４６号、米国特許第５，１６４，１８９号、米国特許第５，１６３，８９９号、米国特許第５，０８８，９７７号、米国特許第５，０８７，２４０号、米国特許第５，００８，１１０号、および米国特許第４，９２１，４７５号に記載される。
化合物の投与は、単一の経路に制限されるものではなく、複数の経路による投与を包含し得る。例えば、複数の経路による例示的な投与は、とりわけ、皮内と筋肉内投与、または皮内と皮下投与の組み合わせが挙げられる。複数回投与は、順次または同時であり得る。複数経路による適用の他の形態は、当業者には明らかであろう。
本発明の化合物は、代謝障害もしくは冠動脈疾患の治療および／もしくは予防、または肝臓のグルコース生成の低減のために対象に投与するための組成物に製剤化することができる。このような組成物は、１つ以上の薬学的に許容される希釈剤および／または担体、ならびに任意で１つ以上の他の薬学的に許容される添加剤との混合で、本発明の化合物を含み得る。薬学的に許容される希釈剤および／または担体、ならびに任意の他の添加剤は、組成物の他の成分と適合性があり、本組成物が投与される対象に対して有害でないという点で、「許容される」必要がある。当業者であれば、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ ｅｄ，（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ：Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９９０），ｐｐ．１６３５−３６）等の標準的な文献の教示を使用し、選択された送達経路を考慮して、本発明の化合物を、ヒト対象等の対象への投与に好適な組成物に、容易に製剤化することができる。
使用可能な希釈剤および／もしくは担体、ならびに／または他の添加剤の例には、水、グリコール、油、アルコール、水性溶媒、有機溶媒、ＤＭＳＯ、食塩水溶液、生理緩衝溶液、ペプチド 担体、デンプン、糖類、保存剤、抗酸化剤、着色剤、ｐＨ緩衝剤、造粒剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤、乳化剤、結合剤、賦形剤、増量剤、流動促進剤（ｇｌｉｄａｎｔ）、可溶化剤、安定化剤、界面活性剤、懸濁化剤、等張化剤、粘度変更剤、カルボキシメチルセルロース、結晶性セルロース、グリセリン、アラビアゴム、ラクトース、ステアリン酸マグネシウム、メチルセルロース、粉末、生理食塩水、アルギン酸ナトリウムが挙げられるがこれらに限定されない。使用される希釈剤および／もしくは担体および／または他の添加剤の組み合わせは、使用される活性剤の性質（例えば、活性剤の可用性および安定性）、送達経路（例えば、経口、非経口等）、薬剤が長期にわたって送達されるかどうか（制御放出カプセルによって等）、薬剤が他の薬剤と同時投与されるかどうか、ならびに種々の他の要因を考慮して、多様であり得る。当業者であれば、過度の実験を行うことなく、所望される使用のための化合物を容易に製剤化することができるであろう。
本発明の化合物は、薬剤がインビボで対象に効果を発揮することを可能にする、任意の好適な方法によって、対象投与され得る。例えば、組成物は、経口投与、舌下または口腔投与、非経口投与、経皮投与、吸入を介して、経鼻送達を介して、膣内、直腸内、および筋肉内を含むがこれらに限定されない、既知の手順によって対象に投与され得る。本発明の化合物は、筋膜上、嚢内、皮内（ｉｎｔｒａｃｕｔａｎｅｏｕｓ）、皮下、皮内（ｉｎｔｒａｄｅｒｍａｓ）、髄腔内、筋肉内、腹腔内、胸骨内、血管内、静脈内、実質内、または舌下送達で投与され得る。送達は、注射、注入、カテーテル送達、または錠剤もしくはスプレーによって等、何らかの他の手段によって、行われ得る。一実施形態において、本発明の化合物は、対象の心臓もしくはその近位へのカテーテル挿入等、心臓組織に直接送達する方法によって、または薬物を心臓に標的化することが可能な送達ビヒクルを使用して、対象に投与される。例えば、本発明の化合物は、抗体または抗体フラグメント等、心臓を標的とする薬剤と抱合されるか、またはそれらと併せて投与されてもよい。一実施形態において、本発明の化合物は、対象の目的の筋肉もしくはその近位へのカテーテル挿入等、目的の筋肉組織への直接送達によって、または抗体もしくは抗体フラグメント等、薬物を筋肉に標的化することが可能な送達ビヒクルを使用して、対象に投与される。
経口投与については、本発明の化合物の製剤は、カプセル、錠剤、粉末、顆粒として、または懸濁液もしくは溶液として、提供され得る。製剤は、従来的な添加剤、例えば、ラクトース、マンニトール、トウモロコシデンプンもしくはジャガイモデンプン、結合剤、結晶性セルロース、セルロース誘導体、アカシア、トウモロコシデンプン、ゼラチン、崩壊剤、ジャガイモデンプン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、二塩基性リン酸カルシウム、無水もしくはナトリウムデンプングリコール酸塩、滑沢剤、および／またはステアリン酸マグネシウムを含有し得る。
非経口投与（すなわち、消化管以外の経路を通じた投与）については、本発明の化合物は、対象の血液と等張性の滅菌水溶液と組み合わせることができる。このような製剤は、水溶液を生成するために、塩化ナトリウム、グリシン等の生理学的に適合性のある物質を含有し、生理学的条件と適合性のある緩衝ｐＨを有する水中に、活性成分を溶解し、続いて、その溶液を滅菌にすることによって調製することができる。製剤は、密封アンプルまたはバイアル等、単位用量または複数回用量の容器中に提供することができる。製剤は、注射、注入、または当該技術分野で既知の他の方法によって送達することができる。
経皮投与については、本発明の化合物は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、イソプロパノール、エタノール、オレイン酸、Ｎ−メチルピロリドン等の皮膚浸透促進剤と組み合わせることができ、これらは、本発明の化合物に対する皮膚の透過性を増加させ、本化合物が、皮膚に浸透して血流に入ることを可能にする。本発明の化合物または、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、エチレン／酢酸ビニル、ポリビニルピロリドン等のポリマー物質とさらに組み合わせて、ゲル形態の組成物を提供することができ、これは、塩化メチレン等の溶媒中に溶解され、所望の粘度まで蒸発させ、次いで裏当材に適用してパッチを提供するものである。
いくつかの実施形態において、本発明の化合物は、錠剤、カプセル、または単回注射もしくは注入バイアル等、単位用量で提供される。
組み合わせ療法
本発明の方法に従って、本発明の化合物を、単剤として、または１つ以上の他の薬剤と組み合わせてのいずれかで、投与することができる。一実施形態において、本発明の化合物は、単剤として対象に投与される。一実施形態において、本発明の化合物は、単独で対象に投与される。一実施形態において、本発明の化合物は、１つ以上の他の薬剤と組み合わせて対象に投与される。
ある特定の実施形態において、本発明の化合物は、対象における代謝障害もしくは冠動脈疾患の治療もしくは予防、または肝臓のグルコースの低減に使用される、他の薬剤と組み合わせて使用することができる。ある特定の実施形態において、本発明の化合物は、対象における代謝障害もしくは冠動脈疾患の治療もしくは予防、または肝臓のグルコースの低減に使用されない、他の薬剤と組み合わせて使用することができる。一実施形態において、本発明の化合物は、１つ以上の追加の活性薬剤を含有する、同じ薬学的組成物または製剤の一部として、対象に投与することができる。別の実施形態において、本発明の化合物は、その活性薬剤のみを含有する組成物または製剤で対象に送達され、一方で１つ以上の他の薬剤は、１つ以上の別個の組成物または製剤で対象に投与される。一実施形態において、他の薬剤は、対象における代謝障害もしくは冠動脈疾患の治療もしくは予防、または肝臓のグルコースの低減に使用されない。別の実施形態において、他の薬剤は、対象における代謝障害もしくは冠動脈疾患の治療もしくは予防、または肝臓のグルコースの低減に使用される。
本発明の化合物および対象における代謝障害もしくは冠動脈疾患の治療もしくは予防、または肝臓のグルコースの低減に使用される他の薬剤は、同時または異なる時点で、対象に投与され得る。本発明の化合物および代謝障害もしくは冠動脈疾患の治療もしくは予防、または肝臓のグルコースの低減に使用されない他の薬剤は、同時または異なる時点で、対象に投与され得る。例えば、本発明の化合物および他の薬剤は、例えば、対象の全体的な治療レジメンの一部として、互いに、数分、数時間、数日、数週間、または数か月以内に、投与され得る。いくつかの実施形態において、本発明の化合物は、他の薬剤の投与の前に投与され得る。他の実施形態においては、本発明の化合物は、他の薬剤の投与後に投与され得る。
上述のように、ＣａＭＫＩＩ、ＩＰ３Ｒ１、ＩＰ３Ｒ２、ＩＰ３Ｒ３を含むがこれらに限定されないＩＰ３Ｒ、カルシニューリン、ｐ３８、およびＭＫ２／３の阻害剤を含むがこれらに限定されない、本発明の化合物は、対象における代謝障害もしくは冠動脈疾患の治療もしくは予防、または肝臓のグルコースの低減のために、互いに組み合わせて使用することができる。
いくつかの実施形態において、１つ以上の他の薬剤と組み合わせた本発明の化合物の投与は、本発明の化合物の単独投与、または１つ以上の他の薬剤の単独投与と比較して、追加的効果を有する。他の実施形態において、１つ以上の他の薬剤と組み合わせた本発明の化合物の投与は、本発明の化合物の単独投与、または１つ以上の他の薬剤の単独投与と比較して、相乗効果を有する。いくつかの実施形態において、１つ以上の他の薬剤と組み合わせた本発明の化合物の投与は、本発明の化合物の単独投与、または１つ以上の他の薬剤の単独投与と比較して、副作用の低減を助け得る。
いくつかの実施形態において、本発明の化合物は、アジュバント療法として使用される。他の実施形態において、本発明の化合物は、アジュバント療法と組み合わせて使用される。
対象
本発明の方法に従って、対象または患者は、代謝障害もしくは冠動脈疾患を有するかもしくはそう診断された任意の動物、または上昇した肝臓のグルコースを有するものであり得る。本発明の方法に従って、対象または患者は、代謝障害もしくは冠動脈疾患の発症、または肝臓のグルコースの上昇の傾向にあるか、またはその危険性にある任意の動物であり得る。好ましい実施形態において、対象はヒト対象である。いくつかの実施形態において、対象は、マウス等の齧歯類である。いくつかの実施形態において、対象は、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ネコ、ウマ、イヌ、および／または家畜として使用されるかもしくはペットとして飼われる任意の他の動物種である。
いくつかの実施形態において、対象は、既に、代謝障害、冠動脈疾患、または上昇した肝臓のグルコースを有する疑いがある。他の実施形態において、対象は、本発明の方法に従って治療を受ける前に、代謝障害、冠動脈疾患、または上昇した肝臓のグルコースの治療を受けている。一実施形態において、対象は、本発明の方法に従って治療を受ける前に、代謝障害、冠動脈疾患、または上昇した肝臓のグルコースの治療を受けていない。
以下の実施例は、本発明を例示し、本発明の理解を助けるために記載され、決して、続いて本明細書に記載される特許請求の範囲で定義される本発明の範囲を制限するものと見なされるべきではない。

実施例１：カルシウム感知酵素、ＣａＭＫＩＩによる肝細胞グルコース生成の調節
肝臓のグルコース生成は、グルコース恒常性に極めて重要である。複数の転写因子および活性化補助因子が、このプロセスを調節することが示されているが、しかしながら、根本的な機序は、完全には解明されていない。本明細書に記載されるように、カルシウム感知酵素であるＣａＭＫＩＩは、カルシウムおよびＩＰ３Ｒに依存する様式で、初代肝細胞においてはｃＡＭＰおよびグルカゴンによって、インビボではグルカゴンおよび絶食によって、活性化される。ＣａＭＫＩＩの遺伝的欠損または阻害は、ＦｏｘＯ１の核転座を遮断し、絶食およびグルカゴン／ｃＡＭＰに誘発されるグリコーゲン分解およびグルコース新生を損傷し、血中グルコースレベルを低下させる。対照的に、構造的に活性なＣａＭＫＩＩのアデノウイルス発現は、グルコース新生およびグリコーゲン分解に関与する遺伝子を誘発し、インビトロおよびインビボの両方においてグルコース生成を刺激し、血中グルコースレベルを上昇させる。ＣａＭＫＩＩ欠損がグルコース代謝に及ぼす抑制効果は、構造的に核内のＦｏｘＯ１の形質導入によって無効となり、ＣａＭＫＩＩ欠損の効果が、ＦｏｘＯ１の核排除を必要とすることを示す。これらの結果は、グルカゴンおよび絶食による肝臓のグルコース恒常性の制御における、新たなカルシウム感知分子経路を明らかにする。
実施例２：カルシウム感知酵素、ＣａＭＫＩＩによる肝細胞グルコース生成の調節
肝臓のグルコース生成は、グルコース恒常性に極めて重要である。複数の転写因子および活性化補助因子が、このプロセスを調節することが示されているが、しかしながら、根本的な機序は、完全には解明されていない。本明細書に記載されるように、カルシウム感知酵素であるＣａＭＫＩＩは、カルシウムおよびＩＰ３Ｒに依存する様式で、初代肝細胞においてはｃＡＭＰおよびグルカゴンによって、インビボではグルカゴンおよび絶食によって、活性化される。ＣａＭＫＩＩの遺伝的欠損または阻害は、ＦｏｘＯ１の核転座を遮断し、絶食およびグルカゴン／ｃＡＭＰに誘発されるグリコーゲン分解およびグルコース新生を損傷し、血中グルコースレベルを低下させる。対照的に、構造的に活性なＣａＭＫＩＩのアデノウイルス発現は、グルコース新生およびグリコーゲン分解に関与する遺伝子を誘発し、インビトロおよびインビボの両方においてグルコース生成を刺激し、血中グルコースレベルを上昇させる。重要なことに、ＣａＭＫＩＩ欠損がグルコース代謝に及ぼす抑制効果は、構造的に核内のＦｏｘＯ１の形質導入によって無効となり、ＣａＭＫＩＩ欠損の効果が、ＦｏｘＯ１の核排除を必要とすることを示す。本明細書に記載される結果は、グルカゴンおよび絶食による肝臓のグルコース恒常性の制御における、カルシウム感知分子経路を示す。
実施例３：カルシウム感知酵素、ＣａＭＫＩＩによる肝細胞グルコース生成の調節
肝臓は、栄養枯渇条件下において、正常血糖値の維持を担う主要な器官である。絶食の初期段階では、肝臓は、グリコーゲン貯蔵を使用してグルコースを動員する（Ｒａｄｚｉｕｋ ａｎｄ Ｐｙｅ，２００１）。絶食が進行すると、非炭水化物前駆体からのグルコースのデノボ合成、すなわちグルコース新生は、肝臓のグルコース生成に対する主要な寄与因子となる（Ｋｌｏｖｅｒ ａｎｄ Ｍｏｏｎｅｙ，２００４）。グルコース生成はまた、解糖、グリコーゲン合成、およびグリコーゲン分解を通じた基質流動によって調節される。これらの変化は、直接的なホルモンシグナル伝達に応答して急速に生じる。さらに、インスリンおよびグルカゴンの両方が、それぞれ、グリコーゲン分解酵素およびグルコース新生酵素である、グルコース−６−ホスファターゼ（Ｇ６ｐｃ）およびホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（Ｐｃｋ１）の転写に影響を及ぼす（Ｐｉｌｋｉｓ ａｎｄ Ｇｒａｎｎｅｒ，１９９２）。絶食時に、グルカゴンおよびその下流エフェクターであるｃＡＭＰは、ＦｏｘＯ（１、３、および４）ならびにＣｒｃｔ２等、「グルコース生成」転写因子の細胞内局在性に変化を誘発し、これが、これらの遺伝子の発現を活性化する（Ｌｉｎ ａｎｄ Ａｃｃｉｌｉ，２０１１）。さらに、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体−γ活性化補助因子−１α（ＰＧＣ−１α）およびＣＢＰ等、異なる活性化補助因子は、ＣＲＥＢ、肝臓核因子４α（ＨＮＦ４α）、Ｓｉｒｔ１、および時計遺伝子を含む、ｃＡＭＰ応答の異なる構成要素と相互作用し、グルコース新生遺伝子の転写の増加をもたらすと考えられる（Ｈａｌｌ ｅｔ ａｌ．，１９９５、Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，２００７、Ｐｕｉｇｓｅｒｖｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００３、Ｒｈｅｅ ｅｔ ａｌ．，２００３）。
カルシウム（Ｃａ＋２）は、グルコース新生の調節と関連付けられているが、しかしながら、根本的な機序は完全には解明されていない（Ｆｒｉｅｄｍａｎｎ ａｎｄ Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ，１９７０、Ｋｒａｕｓ−Ｆｒｉｅｄｍａｎｎ ａｎｄ Ｆｅｎｇ，１９９６、Ｍａｒｑｕｅｓ−ｄａ−Ｓｉｌｖａ ｅｔ ａｌ．，１９９７）．証拠は、グルカゴンおよびｃＡＭＰが、肝臓におけるＣａ＋２流出を変化させることを示す。グルカゴンによる刺激は、カルシウムの流入をもたらし、これが、次いで、細胞内貯蔵からＣａ＋２の放出をもたらし、これらの変化の結果として、サイトゾルＣａ＋２濃度が増加する（Ｂｙｇｒａｖｅ ａｎｄ Ｂｅｎｅｄｅｔｔｉ，１９９３、Ｓｔａｄｄｏｎ ａｎｄ Ｈａｎｓｆｏｒｄ，１９８９）。注目すべきことに、細胞内Ｃａ＋２キレート化は、グルカゴンに誘発されたグルコース生成を低減させることを示している（Ｍｉｎｅ ｅｔ ａｌ．，１９９３）。しかしながら、Ｃａ＋２がどのようにこの現象を調節するのかについての機序は知られていない。細胞内Ｃａ＋２の重要性を示すこれらの先行研究に基づいて、本明細書に記載される結果は、その活性がＣａ＋２によって増加されるＣａＭＫＩＩが、グルカゴンに誘発される肝臓のグルコース生成に関与し得ることを示す。
カルシウムカルモジュリン依存性キナーゼＩＩ（ＣａＭＫＩＩ）は、細胞内の細胞Ｃａ＋２シグナル伝達の重要な媒介因子である、セリン−スレオニンキナーゼである。異なるＣａＭＫＩＩアイソフォームに４つの遺伝子が存在する：α、β、γ、およびδ。αおよびβアイソフォームは、ほとんどがニューロン性であるが、ＣａＭＫＩＩγおよびδは、多様な組織で発現する。Ｃａ＋２／カルモジュリン複合体に結合した後、Ｔｈｒ２８７における自己リン酸化は、Ｃａ＋２／カルモジュリン非依存性活性をもたらす（Ｃｏｕｃｈｏｎｎａｌ ａｎｄ Ａｎｄｅｒｓｏｎ，２００８）。ＣａＭＫＩＩについてのほとんどの研究は、ニューロンおよび心筋細胞において行われたものであり、他の組織におけるＣａＭＫＩＩについての理解は限られたものしかなく、代謝におけるＣａＭＫＩＩの特定の役割は、未知のままである。本明細書に記載される結果は、ＣａＭＫＩＩ活性が、ｃＡＭＰおよびグルカゴンによって、また、インビボでは絶食に応じて、増加することを示す。本明細書に記載される結果は、ＣａＭＫＩＩが、グリコーゲン分解およびグルコース新生の調節に関与することを示す。具体的には、これらの結果は、ＣａＭＫＩＩが、インビトロおよびインビボにおいて、２つの重要な酵素であるＧ６ｐｃおよびＰｃｋ１の発現を調節する様式で、ＦｏｘＯ１の核局在化に重大な効果を有することを示す。
結果
摂食から絶食への代謝性切り替えは、肝臓のＣａＭＫＩＩの活性化をもたらす
絶食は、グルカゴンの循環レベルの増加をもたらし、これは、細胞内カルシウムを増加させることが示されている（Ｓｔａｄｄｏｎ ａｎｄ Ｈａｎｓｆｏｒｄ，１９８９）。本明細書に記載される結果は、その活性が細胞内Ｃａ＋２の上昇によって増加されるＣａＭＫＩＩが、絶食によって活性化され得ることを示す。この見解を試験するために、様々な時間で、グルカゴンでチャレンジを行った初代マウス肝細胞によるＣａＭＫＩＩ活性アッセイは、ＣａＭＫＩＩが時間の関数として確実に増加したことを示した（図１Ａ）。抗ｐＴｈｒ２８７−ＣａＭＫＩＩ抗体での免疫ブロット法によるＣａＭＫＩＩの活性化状態。キナーゼアッセイの結果と一致して、Ｔｈｒ２８７におけるリン酸化が、グルカゴン処置によって誘発された（図１Ｂ）。
ＣａＭＫＩＩ活性化に対するサイトゾルＣａ＋２の役割を判定するために、グルカゴンに誘発されるＣａＭＫＩＩリン酸化を著しく減少させた、サイトゾルＣａ＋２キレート化剤、１，２−ビス［２−アミノフェノキシ］エタン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸テトラキス［アセトキシメチルエステル］（ＢＡＰＴＡ−ＡＭ）の効果を試験した。（図１Ｃ）。小胞体（ＥＲ）に位置するイノシトール１，４，５−三リン酸塩受容体（ＩＰ３Ｒ）チャネルは、第２のメッセンジャーであるＩＰ３の結合に応答して、Ｃａ２＋を放出し、細胞内Ｃａ＋２恒常性に重要な役割を果たす。グルカゴンに誘発されるＰＫＡは、ＩＰ３Ｒ活性をリン酸化し、これを活性化し、その上、このイベントは、肝臓のグルコース生成に重要である。グルカゴンに誘発されるＣａＭＫＩＩ活性化におけるＩＰ３Ｒの寄与を調査するために、ＩＰ３Ｒ阻害剤であるゼストスポンジンＣで前処置を行った。ゼストスポンジンＣは、グルカゴンに誘発されるＣａＭＫＩＩリン酸化の有意な減少をもたらし、このプロセスにおけるＩＰ３Ｒの重要な役割を示す（図１Ｄ）。
グルカゴンに応答したｃＡＭＰレベルの増加は、グルコース新生に関与する重要な酵素であるＰＫＡの活性を増加させる。この文脈において、ｃＡＭＰの膜透過性類似体である８−ブロモ−ｃＡＭでの肝細胞の処置は、グルカゴンの効果を模倣し、リン酸化ＣａＭＫＩＩの著しい増加をもたらした（図１Ｅ）。ＣａＭＫＩＩリン酸化が、ＰＫＡ活性化に偶発的に関連するかどうかを調査するために、肝細胞を、グルカゴンを加える前に、ＰＫＡ阻害剤であるＨ８９で処置した。ＰＫＡの阻害は、リン酸化ＣａＭＫＩＩにおけるグルカゴンに媒介される増加を著しく阻害した（図１Ｆ）。これらのデータは、グルカゴンが、ｃＡＭＰ−ＰＫＡに依存する方式で、ＩＰ３Ｒに媒介される細胞内Ｃａ＋２放出に対するその効果を通じて、ＣａＭＫＩＩのリン酸化／活性化を促進する経路の存在を支持する。
ＣａＭＫＩＩが、インビボにおいてグルカゴンによって調節されるかどうかを試験するために、マウスに、グルカゴンの腹腔内（ｉ．ｐ．）ボーラスでチャレンジを行った。培養肝細胞で観察された効果と一致して、肝臓ＣａＭＫＩＩのリン酸化が、グルカゴン処置によって誘発された（図１Ｇ）。１μｇ ｋｇ−１程度に低いグルカゴンの用量は、肝臓においてＣａＭＫＩＩをリン酸化することが可能であった。ＩＰ３Ｒがグルカゴンに媒介されるＣａＭＫＩＩリン酸化の調節に重要であるというインビボでの根拠を得るために、マウスに、４日間、ゼストスポンジンＣで腹腔内処置を行った。マウスを、次いで、グルカゴンでチャレンジし、肝臓抽出物をｐ−ＣａＭＫＩＩについてアッセイした。図１Ｈに示されるように、ゼストスポンジンＣでの処置は、グルカゴンに誘発されるＣａＭＫＩＩリン酸化を低減させた。続いて、給餌状態から絶食状態への移行中の肝臓ＣａＭＫＩＩリン酸化を比較した。肝臓のＣａＭＫＩＩリン酸化は、絶食時に有意に増加されたが、ＣａＭＫＩＩの全体量は、栄養状態によって影響を受けないと見られた（図１Ｉ）。さらに、再給餌時に、肝臓のｐ−ＣａＭＫＩＩのレベルは、低下した（図１Ｊ）。これらのデータは、肝臓ＣａＭＫＩＩの活性が、絶食に誘発される肝臓のグルコース生成におけるその役割と一致する方式で、栄養状態によって調節されることを示す。
ＣａＭＫＩＩは、初代肝細胞において、肝臓のグルコース生成、Ｇ６ｐｃおよびＰｃｋ１の発現、ならびにＦｏｘＯ１核局在化を促進する
インビボでの絶食／再給餌に応答した肝臓ＣａＭＫＩＩ活性の調節は、肝細胞によるグルコース生成におけるその役割の直接的な試験につながる。グルコース生成を、構造的に活性なＣａＭＫＩＩを発現するアデノウイルス（アデノ−ＣＡ−ＣａＭＫＩＩ）、ＣａＭＫＩＩのキナーゼ不活性優性阻害形態（アデノ−Ｋ４３Ａ−ＣａＭＫＩＩ）、または対照アデノ−ＬａｃＺを形質導入した初代肝細胞において、ピルビン酸塩および乳酸塩によって試験した。ＣＡ−ＣａＭＫＩＩ構築物は、Ｔ２８７Ｄにアミノ酸置換を有し、これは、その部位で自己リン酸化を模倣し、結合したＣａ＋２／カルモジュリンの不在下における自律活性をもたらす（Ｐｆｌｅｉｄｅｒｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００４）。細胞を、基礎条件下、ならびにホルスコリン、グルカゴン模倣剤、および強力なアデニル酸シクラーゼ活性化因子での刺激後に、試験した。基礎およびホルスコリン誘発の両方のグルコース放出における増加が、アデノ−ＣＡ−ＣａＭＫＩＩを形質導入した細胞において観察された（図２Ａ）。対照的に、アデノ−Ｋ４３Ａ−ＣａＭＫＩＩでの細胞の感染は、基礎およびホルスコリン誘発の両方のグルコース生成を減少させた（図２Ａ）。これらの結果をさらに裏付けるために、肝細胞におけるグルコース生成を、ＷＴマウスおよびＣａＭＫＩＩγを欠くマウスによってアッセイし、酵素の主要なアイソフォームが肝細胞に発現した。グルコース生成は、ＣａＭＫＩＩγ欠損肝細胞において抑制された（図２Ｂ）。したがって、ＣａＭＫＩＩは、肝細胞におけるグルコース生成のホルモン調節に重要な役割を果たす。
肝臓のグルコース生成に対するＣａＭＫＩＩの役割は、グリコーゲン分解およびグルコース新生における律速酵素をコードする遺伝子に対する転写効果の調査を促した。この目的のために、初代肝細胞に、アデノ−ＬａｃＺ、ＣＡ−ＣａＭＫＩＩ、またはＫ４３Ａ−ＣａＭＫＩＩを形質導入し、ホルスコリンに誘発されるＧ６ｐｃおよびＰｃｋ１遺伝子の発現を測定した。Ｇ６ｐｃおよびＰｃｋ１の両方のｍＲＮＡレベルは、アデノ−ＬａｃＺと比較して、アデノ−ＣＡ−ＣａＭＫＩＩを形質導入した肝細胞では有意に高いが、アデノ−Ｋ４３Ａ−ＣａＭＫＩＩでの形質導入は、これらの２つの遺伝子のｍＲＮＡレベルを減少させた（図２Ｃ）。グルコース新生に対するＣａＭＫＩＩの効果は、ホルスコリンに誘発されるＧ６ｐｃおよびＰｃｋ１ ｍＲＮＡのレベルが、ＷＴ肝細胞よりも、Ｃａｍｋ２ｇ−／−において有意に低かったという観測結果によって、さらに支持される（図２Ｄ）。類似の結果が、グルカゴン処置でも得られた（図２Ｅ）。したがって、ＣａＭＫＩＩは、Ｇ６ＰｃおよびＰｃｋ１の発現に必要である。
Ｇ６ｐｃおよびＰｃｋ１の誘導に関与する主要な転写因子は、ＦｏｘＯ１であり、その活性は、主に、その細胞質対核の局在化における変化によって調節される（Ｇｒｅｅｒ ａｎｄ Ｂｒｕｎｅｔ，２００５）。ＧＦＰタグＦｏｘＯ１の分布を、Ｃａｍｋ２ｇ−／−マウスと対比してＷＴマウスに由来する肝細胞においてアッセイした。ＷＴ肝細胞中、血清飢餓条件下で、ＧＦＰ−ＦｏｘＯ１の大半が、核内に存在した（図３Ａ）。対照的に、Ｃａｍｋ２ｇ−／−肝細胞は、主に、ＧＦＰ−ＦｏｘＯ１のサイトゾル局在化を示した。さらに、肝細胞に構造的に活性なＣａＭＫＩＩを形質導入した場合、ＦｏｘＯ１は、核が優勢となった（図３Ｂ〜Ｃ）。Ｃａｍｋ２ｇ−／−のデータと一致して、ＦｏｘＯ１は、ほとんとが、優性阻害アデノ−Ｋ４３Ａ−ＣａＭＫＩＩを形質導入した細胞質ＷＴ肝細胞内に位置した（図３Ｂ）。これらのデータは、ＣａＭＫＩＩが、血清飢餓肝細胞において、ＦｏｘＯ１の細胞内核局在化を促進することを示す。
ＣａＭＫＩＩγ欠損は、インビボでの肝臓のグルコース生成を損傷し、構造的に活性な肝臓ＣａＭＫＩＩは、それを刺激する
インビボでの肝臓のグルコース代謝におけるＣａＭＫＩＩの機能的役割を評価するために、ＷＴおよびＣａｍｋ２ｇ−／−マウスにおいて絶食時血中グルコースレベルを試験した。インビトロでのデータと一致して、絶食させたＣａｍｋ２ｇ−／−マウスにおいて、ＷＴマウスと対比して、中程度だが統計的に有意な血中グルコースレベルの減少が観察された（図４Ａ）。絶食時グルコース濃度における差異は、ＷＴマウスと対比したノックアウトマウスにおける循環インスリンの増加とは関連しなかった。突然変異マウスはまた、ピルビン酸塩チャレンジ試験に応答して、より低い血漿グルコースを示した（図４Ｂ）。初代肝細胞のデータと一致して、Ｃａｍｋ２ｇ−／−マウスの肝臓において、Ｇ６ｐｃおよびＰｃｋ１ ｍＲＮＡレベルならびに核ＦｏｘＯ１の減少が見られた（図４Ｃ〜Ｄ）。
この重要な結果をさらに実証するために、インビボで肝臓ＣａＭＫＩＩを阻害するアデノウイルスによるアプローチを使用した。アデノ−Ｋ４３Ａ−ＣａＭＫＩＩでのＣ５７ＢＬ／６マウスの処置は、アデノ−ＬａｃＺで処置したマウスと比較して、絶食時血中グルコースレベルの減少をもたらした（図５Ａ）。この所見と合致して、肝臓でのＧ６ｐｃおよびＰｃｋ１ ｍＲＮＡの発現ならびに核内ＦｏｘＯ１レベルは、Ｋ４３Ａ−ＣａＭＫＩＩを注射したマウスにおいて、より低かった（図５Ｂ−Ｃ）。ＦｏｘＯ１の切除は、絶食時グルコース新生およびグリコーゲン分解の両方を損傷し、ＣａＭＫＩＩ阻害は、重要なグリコーゲン分解酵素Ｇ６ｐｃに重大な効果を有するため、肝臓のグリコーゲン含量に対する急性ＣａＭＫＩＩ阻害の効果を試験した。データは、アデノ−Ｋ４３Ａ−ＣａＭＫＩＩで処置したマウスにおいて、肝臓のグリコーゲン含量に６０％の増加を示す（図５Ｄ）。これらの所見をグルカゴンと直接関連付けるために、アデノ−ＬａｃＺまたはアデノ−Ｋ４３Ａ−ＣａＭＫＩＩで処置したマウスに、グルカゴンの腹腔内ボーラス注射を行い、次いで、３０分後に肝臓を分析した。Ｇ６ｐｃは、グルカゴン注射後に、ＬａｃＺ処置マウスの肝臓において著しく誘発されたが、Ｋ４３Ａ−ＣａＭＫＩＩ処置マウスにおいてはそれほど誘発されなかった（図５Ｅ）。さらに、Ｋ４３Ａ−ＣａＭＫＩＩ処置マウスは、過ヨウ素酸シッフ（ＰＡＳ）染色によって可視化される、肝臓グリコーゲンのレベルがより高かった（図５Ｆ）。これらの結果は、肝臓のグルコース生成におけるＣａＭＫＩＩの役割をさらに実証する。
マウスアデノ−ＣＡ−ＣＡＭＫＩＩで処置することによる、マウスにおける構造的に活性な肝臓ＣａＭＫＩＩの効果を、試験した。この処置は、絶食時グルコースレベルの増加をもたらした（図６Ａ）。給餌時の血中グルコースレベルにもわずかな増加がみられたが、統計的有意性には達しなかった。さらに、ＣＡ−ＣａＭＫＩＩを過剰発現するマウスは、ピルビン酸塩投与に応答して、血中グルコースレベルの有意な増加を示した（図６Ｂ）。これらの観測結果と一致して、アデノ−ＣＡ−ＣＡＭＫＩＩで処置したマウスにおいて、Ｇ６ｐｃおよびＰｃｋ１の肝臓ｍＲＮＡレベルならびに核内ＦｏｘＯ１の増加がみられた（図６Ｃ〜Ｄ）。これらの総合したインビボデータは、ＣａＭＫＩＩが、血漿グルコースレベル、ピルビン酸塩のグルコースへの変換、核内ＦｏｘＯ１、および肝臓のグルコース代謝遺伝子の発現に影響を及ぼすことを示す。
Ｃａｍｋ２ｇ−／−肝細胞およびＣａＭＫＩＩ阻害マウスにおけるグルコース代謝の損傷は、構造的に核内のＦｏｘＯ１を形質導入することによって回復される
ＣａＭＫＩＩによる肝臓のグルコース代謝の制御におけるＦｏｘＯ１の重要性を検証するために、核内ＦｏｘＯ１レベルがＷＴ肝細胞のものと類似するように、肝細胞に、Ｃａｍｋ２ｇ−／−マウスから、リン酸化欠損を含有するアデノウイルス、構造的に核内のＦｏｘＯ１突然変異体（ＦｏｘＯ１−ＡＤＡ）を形質導入した（Ｎａｋａｅ ｅｔ ａｌ．，２００１）。ＣａＭＫＩＩγ欠損がＧ６ｐｃおよびＰｃｋ１ ｍＲＮＡに及ぼす抑制効果は、アデノ−ＦｏｘＯ１−ＡＤＡの形質導入によって無効となった（図７Ａ）。アデノ−ＦｏｘＯ１−ＡＤＡアデノウイルスでのマウスの処置は、アデノ−Ｋ４３Ａ−ＣａＭＫＩＩ処置マウスにおけるグルコース恒常性の損傷を回復させた（図７Ｂ〜Ｄ）。総合すると、これらの結果は、ＣａＭＫＩＩ が、ＦｏｘＯ１の核局在化の促進を通じて、肝臓のグルコース生成に貢献するモデルと一致する。
考察
肝臓でのグルコース代謝は、インスリンおよびグルカゴンの対抗する作用によって厳密に調節される。多数のシグナル伝達分子および転写因子が、食物不足期間中のグリコーゲン分解およびグルコース新生の制御に関与している。本明細書のインビトロおよびインビボデータは、このリストにＣａＭＫＩＩを追加し、そうすることによって、肝臓のグルコース代謝における細胞内カルシウムの役割との分子関連性を提供する。具体的には、本明細書のデータは、肝臓ＣａＭＫＩＩが、絶食に応答して活性化され、ＦｏｘＯ１の核転座ならびにグリコーゲン分解およびグルコース新生遺伝子の誘発をもたらす。ＣａＭＫＩＩの作用におけるＦｏｘＯ１の役割は、ＣａＭＫＩＩ欠損がグルコース生成に及ぼす抑制効果が、構造的に核内のＦｏｘＯ１をＣａＭＫＩＩγ欠損肝細胞に導入した場合に無効となるという所見によって支持される。
グルカゴン−ｃＡＭＰ−ＰＫＡ経路は、本明細書に示されるように、ＣａＭＫＩＩ活性化をもたらすだけでなく、Ｓｅｒ１３３上のｃＡＭＰ応答要素結合（ＣＲＥＢ）タンパク質の直接的リン酸化も行う。リン酸化されたＣＲＥＢは、ＰＧＣ１αを転写的に誘発し、これが、ＦｏｘＯ１とともに、Ｇ６ｐｃ１およびＰｃｋ１の転写を促進するように機能する（Ｈｅｒｚｉｇ ｅｔ ａｌ．，２００１）。先行研究は、脳組織からのＣＲＥＢもまた、インビトロで、ＣａＭＫＩＩによってＳｅｒ１３３上でリン酸化され得ること（Ｄａｓｈ ｅｔ ａｌ．，１９９１、Ｓｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９１）、およびＣａＭＫＩＩの阻害剤が、破骨細胞形成の細胞培養モデルにおいて、ＣＲＥＢの転写活性を遮断したこと（Ａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００７）を示している。ＷＴとＣａＭＫＩＩ欠損の肝細胞との対比では、核ＣＲＥＢまたはリン酸−ＣＲＥＢのいずれにおいても差は観測されなかったが、ＣａＭＫＩＩが、ＣＲＥＢの修飾を通じて肝臓のグルコース代謝に対してその作用を発揮する可能性は除く。
ＦｏｘＯ１活性は、主として、リン酸化およびアセチル化を含む、転写後修飾によって調節される（ｖａｎ ｄｅｒ Ｈｏｒｓｔ ａｎｄ Ｂｕｒｇｅｒｉｎｇ，２００７）。ＦｏｘＯ１は、その核の排除を促進するために、Ａｋｔを介して成長因子によってＴｈｒ２４、Ｓｅｒ２５６、およびＳｅｒ３１９でリン酸化されることが、十分に報告されている。ＣａＭＫＩＩは、ＦｏｘＯ１の核局在化を促進する。実際に、ＣａＭＫＩＩγ欠損は、これら３つの残基のリン酸化に影響を及ぼさなかった。ＪＮＫおよびＡＭＰＫ等の他のキナーゼによる非Ａｋｔ部位上のＦｏｘＯのリン酸化は、実際にはその核の保持を促進し得ることが証明される。したがって、ＦｏｘＯ活性のバランスは、刺激性および阻害性のリン酸化イベントの組み合わせから得ることができ、理論に束縛されるものではなく、ＣａＭＫＩＩは、直接的なキナーゼ作用を通じて、またはＦｏｘＯホスファターゼ活性に影響を及ぼすことを通じてのいずれかにより、このバランスに影響を及ぼすことができる。ＦｏｘＯ１の脱アセチル化は、その核局在化を促進し得るが（Ｆｒｅｓｃａｓ ｅｔ ａｌ．，２００５）、ＦｏｘＯ１のアセチル化はまた、ＣａＭＫＩＩ欠損によって影響を受けなかった。あるいは、ＣａＭＫＩＩγは、ＦｏｘＯ１の核転座に関与する移入もしくは移出機序、またはこのプロセスに影響を及ぼし得る細胞質もしくは核におけるＦｏｘＯ１相互作用分子の発現もしくは活性に、何らかの形で影響を及ぼし得る。今後の研究は、この機序の解明を対象とすることになろう。
肝臓のグルコース生成に関与する新しい分子の発見は、絶食時低血糖等に対する生理学的防御に関する見識を提供するだけでなく、インスリン耐性環境下で発生するグルコース代謝異常の新しい治療標的を明らかにし得る。実際に、２型糖尿病において、不均衡な肝臓のグルコース産出およびグルカゴン対インスリンのシグナル伝達の不均衡は、絶食時高血糖に寄与する（Ｓａｌｔｉｅｌ，２００１）。これに関連して、今後の研究は、肝臓ＣａＭＫＩＩの阻害が肥満およびインスリン耐性の代謝異常を緩和するかどうかについて取り組むことになろう。
実施例４：本明細書に記載される方法での使用に好適な実験手順
試薬および抗体
グルカゴン、ピルビン酸塩、ホルスコリン、Ｈ８９、および８−ブロモ−ｃＡＭＰは、Ｓｉｇｍａから入手した。ＢＡＰＴＡ−ＡＭおよび抗ヌクレオホスミン（Ｎｐ）抗体は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手した。ゼストスポンジンＣは、ＥＭＤ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓから入手した。抗リン酸−Ｔｈｒ２８７ ＣａＭＫＩＩ抗体は、Ｉｍｇｅｎｅｘ ａｎｄ Ｎｏｖｕｓから入手し、抗完全ＣａＭＫＩＩ抗体および抗ＦｏｘＯ１抗体は、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃから入手し、抗βアクチン抗体は、Ａｂｃａｍから入手した。
細胞培養
初代マウス肝細胞を、既述のように８〜１２週齢のマウスから単離した（Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，２００２）。細胞を、一晩、血清枯渇させ、次いで、ホルスコリン（１０μｍ）とともに５時間無血清培地中でインキュベートした。
ＣａＭＫＩＩ活性の測定
ＣａＭＫＩＩ活性を、ＰｒｏｍｅｇａからのＣａＭＫＩＩアッセイキットを製造業者の説明に従って使用して、アッセイした。肝細胞を、図の凡例に示されるように処置した後、それらを、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｎａピロリン酸塩、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ ＥＧＴＡ、１ｍＭ Ｎａ３ＶＯ４、５０ｍＭ ＮａＦ、１ｍＭ ＰＭＳＦ、および５μｇ／ｍｌロイペプチン中、１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘへの５分間の暴露によって、溶解した。次に、［γ−３２Ｐ］ＡＴＰおよびＣａＭＫＩＩビオチニル化ペプチド基質を、溶解物に添加し、３０℃で１０分間のインキュベーションの後、［３２Ｐ］−リン酸化基質を、ＳＡＭビオチン捕捉膜を使用して残存［３２Ｐ］ＡＴＰから分離し、シンチレーションカウンタを使用して定量化した。
アデノウイルス感染
ＬａｃＺ、ＣＡ−ＣａＭＫＩＩ、Ｋ４３Ａ−ＣａＭＫＩＩ、およびＧＦＰ−ＦｏｘＯ１をコードするアデノウイルスは、以前に説明されており（Ｐｆｌｅｉｄｅｒｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００４、Ｔａｎａｋａ ｅｔ ａｌ．，２００９）、Ｖｉｒａｑｕｅｓｔ，Ｉｎｃ．（Ｎｏｒｔｈ Ｌｉｂｅｒｔｙ，ＩＡ）によって増幅された。初代肝細胞を、播種の１２時間後に形質導入した。ＲＮＡおよびタンパク質の単離ならびにグルコース生成を、形質導入の２４時間後に実行した。
初代肝細胞におけるグルコース生成
グルコース生成アッセイを、記載される通りに実行した（Ｂａｃｋｓ ｅｔ ａｌ．，２０１０、Ｙｏｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００１）。簡単に言うと、初代マウス肝細胞を、上述のように摘出して培養した後、細胞培養培地を、２０ｍＭ乳酸ナトリウムおよび２ｍＭピルビン酸ナトリウムをグルコースおよびフェノール不含ＤＭＥＭ（ｐＨ７．４）に切り替えた。１６時間の培養後、５００μｌの培地を収集し、グルコース含量を比色分析グルコースアッセイキット（Ａｂｃａｍ）を使用して測定した。次いで、読み取り値を、全細胞溶解物中の総タンパク質量に対して正規化した。
マウス実験
Ｃａｍｋ２ｇ−／−マウスを、以前に記載されたように（Ｂａｃｋｓ ｅｔ ａｌ．，２０１０）生成し、Ｃ５７ＢＬ６／Ｊバックグラウンドと交配した。マウスに、標準の通常食を与え、１２時間の明暗サイクルで維持した。組み換えアデノウイルス（１．５×１０９プラーク形成単位／マウス）を、尾静脈注射によって送達した。絶食時血中グルコースを、水を自由に与えながら、１２〜１４時間絶食させたマウスにおいて、グルコースメーターを使用して測定した（Ｏｎｅ Ｔｏｕｃｈ Ｕｌｔｒａ，Ｌｉｆｅｓｃａｎ）。ピルビン酸塩寛容性試験を、１７時間の絶食後、２ｇ ｋｇ−１（体重）のピルビン酸塩の腹腔内注射により、実行した。血中グルコースレベルを、その後２時間にわたり測定した。ゼストスポンジンＣを、１０ｐｍｏｌ ｇ−１の用量で、１日１回４日間、腹腔内注射によってマウスに投与した。
肝臓グリコーゲンの測定
５０〜１００ｍｇの凍結肝臓を、１ｍＬのＨ２Ｏ中、プロテアーゼおよびホスファターゼの阻害剤で均質化した。試料を、次いで、ＫＯＨと混合し（１：２）、２５分間煮沸し、７０％エタノールで洗浄した。ペレットを乾燥させ、１００μｌのＨ２Ｏ中に溶解し、グリコーゲン含量を、製造業者の説明書に従ってグリコーゲンアッセイキット（Ａｂｃａｍ）を使用して評価した。データは、平均±標準誤差を表す。
マウス肝臓切片のＰＡＳ染色
肝臓試料を、１０％の中性緩衝ホルマリン中に２４時間固定し、パラフィン中に埋め込んだ。切片（５ミクロン）を、製造業者の説明書に従って過ヨウ素酸シッフ（ＰＡＳ）染料（Ｓｉｇｍａ）を使用して、グリコーゲンについて染色した。切片を、次いで、ヘマトキシリンで対比染色し、光学顕微鏡によって試験した。ＰＡＳ染色の定量化については、４つの異なる切片から５つの領域を無作為に選択し、ＰＡＳ陽性細胞の数を計数し、前述のように、全細胞数のパーセンテージとして表した（Ｒａｚａ Ａｓｉｍ ｅｔ ａｌ．，２０１０）。試料の固有性が盲検化された２人の独立した研究員が、分析を行った。
免疫ブロット法および定量的ＲＴ−ＰＣＲ
全ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して肝細胞から抽出した。ｃＤＮＡを、オリゴ（ｄＴ）およびＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、２μｇの全ＲＮＡから合成した。実時間ｑＰＣＲ分析およびウエスタンブロットを、既述のように実行した（Ｔｉｍｍｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，２００９）。肝臓からの核抽出を、Ｐａｎｏｍｉｃｓからの核抽出キットを製造業者の説明書に従って使用して実行した。
統計学的分析
全ての結果は、平均±標準誤差として表す。Ｐ値は、スチューデントｔ検定を使用して計算した。
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Ｔｉｍｍｉｎｓ，Ｊ．Ｍ．，Ｏｚｃａｎ，Ｌ．，Ｓｅｉｍｏｎ，Ｔ．Ａ．，Ｌｉ，Ｇ．，Ｍａｌａｇｅｌａｄａ，Ｃ．，Ｂａｃｋｓ，Ｊ．，Ｂａｃｋｓ，Ｔ．，Ｂａｓｓｅｌ−Ｄｕｂｙ，Ｒ．，Ｏｌｓｏｎ，Ｅ．Ｎ．，Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｍ．Ｅ．，ａｎｄ Ｔａｂａｓ，Ｉ．（２００９）．Ｃａｌｃｉｕｍ／ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ＩＩ ｌｉｎｋｓ ＥＲ ｓｔｒｅｓｓ ｗｉｔｈ Ｆａｓ ａｎｄ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｐａｔｈｗａｙｓ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １１９，２９２５−２９４１．
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Ｙｏｏｎ，Ｊ．Ｃ．，Ｐｕｉｇｓｅｒｖｅｒ，Ｐ．，Ｃｈｅｎ，Ｇ．，Ｄｏｎｏｖａｎ，Ｊ．，Ｗｕ，Ｚ．，Ｒｈｅｅ，Ｊ．，Ａｄｅｌｍａｎｔ，Ｇ．，Ｓｔａｆｆｏｒｄ，Ｊ．，Ｋａｈｎ，Ｃ．Ｒ．，Ｇｒａｎｎｅｒ，Ｄ．Ｋ．，Ｎｅｗｇａｒｄ，Ｃ．Ｂ．，ａｎｄ Ｓｐｉｅｇｅｌｍａｎ，Ｂ．Ｍ．（２００１）．Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｈｅｐａｔｉｃ ｇｌｕｃｏｎｅｏｇｅｎｅｓｉｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｃｏａｃｔｉｖａｔｏｒ ＰＧＣ−１．Ｎａｔｕｒｅ ４１３，１３１−１３８．
実施例５：グルカゴンに媒介される肝臓のグルコース生成（ＨＧＰ）における肝臓ＣａＭＫＩＩの役割
肥満に誘発されるインスリン耐性ならびに肝臓のグルコースおよび脂肪代謝における異常は、心臓疾患、癌、ならびに他の広範囲および深刻な疾患の危険性を増加させる。現在の治療の選択肢は非常に限られており、重大な満たされない臨床的必要性が現在の肥満蔓延における何億もの過体重の人々に影響を及ぼすことにつながっている。過去２年間にわたり、肥満モデルにおける検証を含む、複数の発見が、固有の薬物標的、すなわちＣａＭＫＩＩと称される肝臓酵素の阻害剤が、このニッチにおいて非常に有益であり得ることを示している。したがって、本発明の全体的な目標は、代謝異常、ならびにその結果もたらされる肥満、代謝症候群、および２型糖尿病を改善するための薬物開発の目的で、ＣａＭＫＩＩ阻害剤を開発および試験することである。
ＣａＭＫＩＩが、初代肝細胞においてはグルカゴンによって、インビボではグルカゴンおよび絶食によって、活性化されることが示された（図１）。肝臓ＣａＭＫＩＩの遺伝的欠損または阻害は、血中グルコースレベルを低下させ、ＨＧＰ遺伝子Ｇ６ｐｃおよびＰｃｋ１を抑制し、グリコーゲン枯渇を減少させ、ＨＧＰ転写因子ＦｏｘＯ１の核転座を遮断した（優性阻害ＣａＭＫＩＩでのデータを図５に示す）。対照的に、構造的に活性なＣａＭＫＩＩは、Ｇ６ｐｃおよびＰｃｋ１を誘発し、グルコース生成を刺激し、血中グルコースレベルを上昇させた。重要なことに、ＣａＭＫＩＩ欠損がグルコース代謝に及ぼす抑制効果は、構造的に核内のＦｏｘＯ１によって無効となり、ＣａＭＫＩＩ欠損の効果は、核内のＦｏｘＯ１の排除を必要とすることを示した（図７）。これらの結果は、ＨＧＰの制御においてＣａＭＫＩＩによって調節される新しい分子経路を明らかにする。
インスリンよりも多いグルカゴンのシグナル伝達の不均衡が、肥満における高血糖およびインスリン耐性に寄与するため、肥満を試験した。ＣａＭＫＩＩは、レプチン欠損（ｏｂ／ｏｂ）および食餌誘発型肥満（ＤＩＯ）マウスの肝臓において活性化されるが、痩せたマウスの肝臓では活性化されない（図８Ａ）。ＣａＭＫＩＩはまた、肥満のヒトの肝臓で活性化されるが、痩せたヒトの肝臓では活性化されない（図８Ｂ）。最も重要なことに、肥満マウスの肝臓ＣａＭＫＩＩの遺伝子的または薬理学的阻害は、絶食時血中グルコースを低下させ、インスリン耐性を改善し、ＨＧＰに関与する重要な遺伝子の発現を減少させ、脂肪肝および炎症を減少させ、脂質異常症を改善した（図９−１０）。これらのデータは、ＣａＭＫＩＩの治療的標的化が、肥満対象において高血糖およびインスリン耐性を改善するであろうという概念を支持する。
ＣａＭＫＩＩγアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）を、肥満マウスモデルにおいて試験する
Ｃａｍｋ２ｇを対象とするＡＳＯを、肥満のマウスモデルにおいて試験する。Ｉｓｉｓは、制御ＡＳＯおよび４つの異なるＣａｍｋ２ｇのＡＳＯを有し、これらを使用して、ＤＩＯ肥満マウスに処置を行う（６週間、週１回の腹腔内注射）。肝臓および他の組織におけるＣａｍｋ２ｇ ｍＲＮＡのレベルを測定し、肝臓の重量、肝機能試験、および絶食寛容性を含む、全体的な寛容性を評価する。次のパラメータを改善する有効性を試験する：絶食時および給餌時の血漿グルコースおよびインスリン、ＨＧＰ遺伝子発現およびＦｏｘＯ１核局在化、高インスリン血正常血糖クランプ研究によるＨＧＰおよび末梢インスリン感受性、脂肪肝、ならびに血漿トリグリセリドおよび脂肪酸。
ＣａＭＫＩＩの新規な化学阻害剤のスクリーニングおよび試験
「創薬対象となり得る（ｄｒｕｇｇａｂｌｅ）」化学ライブラリーを、酵素が不活性化された際の蛍光発光比における変化に依存する、ＣａＭＫＩＩ活性の高スループットな蛍光に基づくアッセイを使用してスクリーニングする。構造と活性の関係性を定義し、既に存在し、インビトロおよび前臨床研究のために市販入手可能なＣａＭＫＩＩ阻害剤の有効性および特異性を、最適化する。最も見込みのある的中物を、次に、インスリン耐性初代肝細胞モデルにおいて二次スクリーニングし、これは、肥満マウスの肝臓に見られるグルコース生成およびインスリン耐性の増加を模倣する方式で、細胞を飽和脂肪酸で処置することを伴う。このモデルを使用して、最も有効なＣａＭＫＩＩの阻害剤、グルコース生成、およびインスリン耐性を試験する。グラム量で調製された最も見込みのある薬物を、ＣａＭＫＩＩの活性の監視および非肝臓組織における阻害の影響に警戒しながら、ＡＳＯのものについて上で概説した戦略に従って、インビボで試験する。経口使用可能な薬物を、送達の容易さおよび肝臓への、すなわち門脈循環を介した送達について評価する。薬物は、必要となった場合は経口利用可能性を達成するように改変することができる。
実施例６
肥満／インスリン耐性における冠動脈疾患（ＣＡＤ）の危険性の増加に寄与する２つの主要な因子は、プラーク自体におけるアテローム生成促進プロセス、および全身性危険因子、とりわけ、肝臓由来の脂質異常症の増加である。ヒト糖尿病性プラークは、炎症、プラーク破壊、および急性ＣＡＤを促進する、特に広い壊死範囲によって特徴付けられる。プラーク壊死は、死細胞の不完全なクリアランスの環境下において、マクロファージ（Ｍφ）のアポトーシスの結果として発生する。進行したプラークにおける長期小胞体（ＥＲ）ストレスが、Ｍφの死亡およびプラーク壊死を引き起こす機序を、試験する。これらのプロセスは、欠損したインスリンシグナル伝達を有するＭφにおいて増幅する。長期ＥＲストレスは、細胞質カルシウム（Ｃａ２＋）の上昇を促進し、それが、Ｃａ２＋／カルモジュリン依存性タンパク質キナーゼＩＩ−γ（ＣａＭＫＩＩγ）の活性化を通じてアポトーシスを引き起こす。肥満マウスにおけるＣａＭＫＩＩγの欠失または阻害は、高インスリン血症、グルコース新生、脂質異常症、脂肪肝、およびＥＲストレスを予防するものであった。これらの新しい所見は、１つの酵素が、インスリン耐性の対象においてＣＡＤを促進する２つの相補的プロセスに対して重要な効果を有し得ることを示す（図１１）。したがって、Ｍφ ＣａＭＫＩＩγ欠損は、Ｍφインスリン耐性のマウスモデルにおいて進行病変のＭφのアポトーシスおよびプラーク壊死を軽減し、その肝臓ＣａＭＫＩＩγ欠損が、肥満マウスにおけるアテローム生成性（ａｔｈｅｒｏｇｅｎｉｃ）代謝異常を改善する。
Ｍφ ＣａＭＫＩＩγ欠損は、インスリン耐性マウスにおける進行病変のＭφのアポトーシスおよびプラーク壊死を軽減する
インビトロデータは、ＣａＭＫＩＩγが、ＥＲストレスを受けたＭφにおける多数の重要なアポトーシス経路を編成することを示す。ＰＰＧデータは、インスリン耐性ＭφにおけるＣａ２＋代謝の混乱およびＣａＭＫＩＩγの活性化を示す。したがって、ＣａＭＫＩＩγは、ＥＲストレスを受けたインスリン耐性Ｍφのアポトーシスに、特に重要な役割を果たし得る。まず、欠損したＭφインスリンシグナル伝達の２つの概念実証モデルであるＩｎｓｒ−／−およびｏｂ／ｏｂから単離したＭφの、ｓｉＲＮＡに媒介されるＣａｍｋ２ｇのサイレンシングが、これらの細胞における非常に高いレベルのＥＲストレス誘発性アポトーシスを抑制するかを判定し、次いで、保護の分子／細胞機序を探求する。ＣａＭＫＩＩ活性化の尺度であるｐ−ＣａＭＫＩＩを測定し、これが、ヒトおよびマウスにおけるアテローム性動脈硬化症の進行期と早期とを対比して、病変Ｍφにおいてより高いかどうかを判定する。因果関係を試験するために、Ｃａｍｇ２ｇｆｌ／ｆｌＬｙｓｍｃｒｅ＋／−Ｉｎｓｒ−／−マウス由来の骨髄細胞、ならびにＷＴマウスおよびＭφ ＣａＭＫＩＩγまたはインスリン受容体欠乏マウス由来のものを、Ｌｄｌｒ−／−マウスに別個に移植し、次いで、西洋食で飼育する。Ｉｎｓｒ−／−→Ｌｄｌｒ−／−マウスにおける高レベルの進行病変のＭφのアポトーシスおよびプラーク壊死は、Ｍφ ＣａＭＫＩＩ欠損によって著しく緩和される。
肝臓ＣａＭＫＩＩγ欠損が肥満の代謝異常を改善する機序および肝臓特異的ＣａＭＫＩＩγ欠損は、肥満マウスにおけるアテローム性動脈硬化症を抑制する。
Ｃａｍｋ２ｇｆｌ／ｆｌ Ｘ α１−抗トリプシン−Ｃｒｅマウスを使用して、肝臓特異的ＣａＭＫＩＩγ欠損が、肥満におけるグルコース、脂質、およびリポタンパク質の代謝を改善するかどうかを試験する。肥満が、ＥＲストレスエフェクターＣＨＯＰが関与する機序を通じて肝臓ＣａＭＫＩＩγを活性化するという考えを試験する。ＣａＭＫＩＩγ欠損がグルコースおよび脂質の代謝に及ぼす有益な効果の根底にある１つの機序、すなわち、ＦｏｘＯ１の核排除および肝臓のグルコース生成／グルコース新生の抑制について研究する。肥満と痩せたヒト対象とを対比して、肝臓標本におけるＣａＭＫＩＩ活性化および関連する機序を調べる。ＬｙｓＭＣｒｅモデルを使用して、肝臓ＭφにおけるＣａＭＫＩＩγ欠損が、ＥＲストレスおよび／または炎症を抑制するかどうか、およびそれが肥満における肝臓媒介性代謝異常の抑制にも寄与し得るかどうかを調査する。以下について試験する：（ａ）西洋食を与えたＬｄｌｒ−／−マウスにおける肝臓ＣａＭＫＩＩγ欠損が、アテローム発生を抑制するかどうか、および（ｂ）肝臓およびＭφの複合的ＣａＭＫＩＩγ欠損が、アテローム性動脈硬化症の全段階に対して著しく有益な効果を有するかどうか。
実施例７：プラーク壊死
急性ＣＡＤを引き起こす病変の２〜３％は、それらのより大きな寸法ではなく、プラーク壊死の存在によって区別され１、２、これは、プラーク破壊、急性管腔血栓、および組織閉塞を促進する（３）。プラーク壊死は、Ｍφのアポトーシスと不完全なクリアランス、または死亡したＭφの「貪食除去（ｅｆｆｅｒｏｃｙｔｏｓｉｓ）」との組み合わせによって引き起こされ、アポトーシス後の壊死をもたらす（４〜６）。この概念は、糖尿病対象における進行性のアテローム性動脈硬化の病変が、非糖尿病個体に由来する類似の寸法の病変と比較して、特に大きな壊死性コアを特徴とするため、糖尿病およびインスリン耐性がどのようにしてＣＡＤを促進するかを考慮する際に特に重要である（７〜１２）。ＣＡＤを有する対象の前向き研究により、糖尿病および年齢のみが、確実に壊死性コア寸法に関連することが見出された（１２）。これらのデータは、進行病変のＭφのアポトーシスが、糖尿病環境下において亢進されるかどうかに関する問題を提起する。
進行病変のＭφのアポトーシスの機序としての長期ＥＲストレス
機械的およびインビボでのデータは、進行病変のＭφのアポトーシスおよびプラーク壊死における長期ＥＲストレスの役割を裏付ける｛４９９７、５０８１｝。ＥＲストレスに誘発されるＭφのアポトーシスは、いわゆる小胞体ストレス応答（ＵＰＲ）のＣＨＯＰ分岐経路に大きく依存する（１５、１６）。ヒト冠動脈において、ＣＨＯＰ発現と、アポトーシスと、進行したプラーク段階との間に非常に強い相関性がある（１７）。ＣＨＯＰが欠損したアテローム性動脈硬化症易罹患性マウスは、進行したプラークの発達を抑制し（１６）、これは、続いて、骨髄移植を使用した別の群によってＭφのＣＨＯＰの役割に関与することが確認された（１８）。第３の研究は、ＥＲストレスを緩和すると見られる「化学シャペロン」のアテローム保護効果を示した（１９）。ＣＨＯＰに誘発されるアポトーシスは、培養Ｍφにおいて、（ａ）アテローム性動脈硬化の病変における最も豊富なオキシステロールである（１７）、７−ケトコレステロール等のＥＲストレスの強力な誘発物質（１６、２０）、または（ｂ）アポトーシス促進シグナル伝達を増幅し、細胞生存シグナル伝達を抑制する、よりわずかなＥＲストレスと、アテローム関連の「第２のヒット」、すなわち、修飾されたリポタンパク質または飽和脂肪酸によるパターン認識受容体（ＰＲＲ）活性化との組み合わせ（２１、２２）によって、モデル化することができる。２ヒットの概念はまた、進行病変のＭφの別のモデル、すなわち、リポタンパク質由来の遊離コレステロール（ＦＣ）を充填したＭφにも適用され（２３〜２６）、これは、ＥＲ膜中の過剰なＦＣがＵＰＲを活性化し、一方で、修飾されたリポタンパク質がＰＲＲを活性化するためである。この提案に最も重要なことには、ＰＰＧは、ＥＲストレスに誘発されるアポトーシスが、インスリンシグナル伝達が欠損したＭφにおいて著しく亢進されることを示している。
肥満およびインスリン耐性における肝臓のアテローム生成促進的な役割。肝臓は、インスリン耐性におけるＣＡＤ危険性の増加に主要な役割を果たす（２７、２８）。主要な連結は、増加したＶＬＤＬ ａｐｏＢおよびトリグリセリド（ＴＧ）の分泌を介するものであり、これは、脂肪由来の遊離脂肪酸の肝臓送達の増加、ａｐｏＢ分解の抑制、およびａｐｏＢ翻訳の強化と関連するデノボ脂質生成によって引き起こされる２８。ＳＲＥＢＰ１ｃに媒介される脂質生成およびＶＬＤＬ分泌は、高インスリン血症による「残留」インスリン受容体シグナル伝達経路の活性化によって刺激される（２９〜３３）。インスリン受容体ｍＴＯＲＣ１経路は、ソルチリン１に媒介されるａｐｏＢの分解を抑制する。肥満、インスリン耐性、および代謝異常の間の２つの他の可能性のある関連性は、ＥＲストレスおよび炎症である。肥満における肝臓ＥＲストレスは、ＩＲＥ１−ＪＮＫに媒介されるＳｅｒ３０７３４上のＩＲＳ−１のリン酸化によって、またはｒｉｃｔｏｒに媒介されるＡＫＴ活性化を阻害するＧＳＫ−３βの活性化によって、インスリンシグナル伝達を抑制することができる（３５、３６）。動物モデルにおいて肝臓ＥＲストレスを軽減する操作は、インスリン耐性を改善し（３７、３８）、ヒトにおける研究は、体重の減少が、肝臓ＥＲストレスを減少させることを示している（３９）。肝臓ＥＲストレスは、ＳＲＥＢＰ−１ｃ活性化および脂肪変性を促進するが（３４、３８、４０）、ＶＬＤＬ分泌に対する効果は、本質的には完全に調査されていない（４１〜４３）。炎症に関して、サイトカインは、血液から、または常在クッパー細胞もしくは新たに補充されたマクロファージによる分泌を通じて、肝臓に侵入することができ、これらは、肥満に誘発されるインスリン耐性に関与している（２８、４４、４５）。炎症性サイトカインは、ＪＮＫを活性化し、これは、インスリン受容体シグナル伝達を破壊することによって（上述）、およびキナーゼＰＫＲ４６の活性化を通じて、インスリン耐性と関連している。
ＣａＭＫＩＩ。
ＣａＭＫＩＩは、その活性形態が、４つの遺伝子、α、β、γ、またはδ４７のうちの１つによってコードされる１２〜１４個のサブユニットのホモ多量体である、Ｃａ２＋−活性化Ｓｅｒ／Ｔｈｒキナーゼである。（注：ＣａＭＫＩＩは、ＡＭＰＫを活性化するＣａＭＫＫとは異なる）。αおよびβアイソフォームは、ニューロンのものであるが、ＣａＭＫＩＩγおよびδは、広範な種類の組織で発現する。ＭφおよびＨＣは、γ形態４８を発現する。基礎状態において、調節ドメインは、触媒ドメインと相互作用し、それを阻害する。サイトゾルＣａ２＋が増加すると、Ｃａ２＋カルモジュリン複合体は、この相互作用を破壊し、したがって、自己阻害を軽減し、Ｔｈｒ２８７の自己リン酸化を促進する。このプロセスは、Ｃａ２＋ＣａＭ結合の親和性を増加させ、Ｃａ２＋非依存性キナーゼ活性化をもたらす。ＣａＭＫＩＩのほとんどの研究は、ニューロンおよび心筋細胞において実行された。Ｍφにおいては、インビトロ阻害剤研究が、ファゴリソソームによる細菌の死滅、ＬＰＳ媒介性アデニリルシクラーゼ活性化およびＨＩＦ−１α誘発、ＰＫＲ媒介性ｐ３８活性化、自己免疫誘発性アポトーシス、および炎症遺伝子の抑制解除における役割を報告している（４９〜５４）。肝細胞におけるＣａＭＫＩＩについて公開されているデータは非常に限られている。以下の節で説明されるように、Ｃａｍｋ２ｇの遺伝子標的化を用いて、ＥＲストレスに誘発されるＭφのアポトーシス（４８）および肥満環境下で肝臓に誘起される代謝異常における新しい役割を示した。
アテローム性動脈硬化症におけるＭφ ＣａＭＫＩＩγの役割は、これまで全く研究されておらず、インスリン耐性Ｍφにおける改変された力学のため、インスリン耐性環境でのその重要性は、新しい概念である。新しいｃｒｅ−ｌｏｘモデルを使用して、これらの考えを試験する。肥満の代謝異常における肝細胞ＣａＭＫＩＩγの役割は、この重要な領域においてさらなる新しい原理を明らかにし得る。ｃｒｅ−ｌｏｘモデルはまた、この考えを試験するのにも理想的である。最後に、肥満およびンスリン耐性環境下において、病変のＭφ、肝細胞、および場合によっては肝臓Ｍφへの効果を通じたアテローム性動脈硬化症の媒介におけるこの単一分子の提案された総合的な役割は、重要な治療的関連性を有し得る新規な概念を表す。
肥満およびインスリン耐性の蔓延と関連するＣＡＤ危険因子は、今後数十年間にわたり、ＣＡＤの主要な誘起因子であろう（５５）。この所見は、一方はプラークのＭφのアポトーシスを中心とし、もう一方はＣＡＤ危険性を促進する肝臓における代謝プロセスを中心とした、この領域における２つの重要なプロセスの新しい機序およびインビボでの重要性に取り組む。Ｍφ研究は、進行したプラーク形態、すなわち壊死を焦点とし、これは、実際に急性ＣＡＤを引き起こすごく少数のヒトプラークの最も重要な特性である（５６）。さらに、この所見は、肥満と痩せ型のヒト対象とに由来する、種々の発達段階にあるヒトプラーク標本、および肝臓標本を使用する今後の研究を含む。提案された研究の終了時に、動脈壁および肝臓における共通のアテローム促進性シグナル伝達経路を標的とする肥満／インスリン耐性対象のための新しい治療戦略が得られるであろう。注目すべきことには、ＣａＭＫＩＩ阻害剤は、ＣａＭＫＩＩが疾患の発展に寄与すると見られる他の状況において、動物モデルでの試験が成功している（５７、５８）。本明細書に記載されるように、酵素の部分的阻害は、ＭφおよびＨＣの保護に有意な効果を有し、これは、治療的アプローチの実現可能性をさらに増加させる。特異性は、γアイソフォームの選択的阻害を通じて、また薬物がアテローム性動脈硬化病変部および肝臓を標的とする戦略を使用することによって、得ることができる（５９、６０）。しかしながら、この特異性は、心不全（６１）、高血圧および腎疾患（６２）、ならびに網膜疾患（６３）等、糖尿病の他の態様におけるＣａＭＫＩＩ阻害の利点を考慮すると、必要でない可能性がある。
Ｍφ ＣａＭＫＩＩγ欠損が、インスリン感受性および特にＭφインスリン耐性マウスにおいて、進行病変のＭφのアポトーシスおよびプラーク壊死を軽減するかどうかを試験する。
ＰＲＲシグナル伝達と組み合わせた長期ＥＲストレスが関与する、前述のＭφのアポトーシスの「２ヒット」機序に関して、インビトロおよびインビボでの根拠が存在する（２２、４８、６４〜７２）。重要なＥＲストレス経路は、ＥＲオキシダーゼＥＲＯ１αのＣＨＯＰ媒介性誘発に関与し、これが、次いで、ＥＲ Ｃａ２＋放出チャネルＩＰ３Ｒを活性化する。放出されたＣａ２＋は、ＣａＭＫＩＩγを活性化し、それが、Ｆａｓ死受容体のＪＮＫ媒介性誘発、ミトコンドリア外膜の透過性およびシトクロムｃの放出、ならびにＮＡＤＰＨオキシダーゼ媒介性ＲＯＳの誘発を含む、下流アポトーシス経路を引き起こし、これはまた、ＰＫＲと称される上流キナーゼを通じてＣＨＯＰを増幅させる（図１２）。上述の治療的可能性に関して、ＣａＭＫＩＩγの部分的阻害は、Ｍφを保護するのに適している（図１３）。重要なことに、ＥＲストレスを受けたＣａＭＫＩＩγ欠損マウスは、インビボで、腹膜および脾臓Ｍφおよび腎臓上皮細胞におけるアポトーシスから保護される。しかしながら、進行したアテローム性動脈硬化の病変のＭφのアポトーシスおよびプラーク壊死におけるＭφ−ＣａＭＫＩＩγの役割は、知られていない。
これらの概念のインスリン耐性環境下におけるＭφへの適用は、ＰＰＧの主要な目標となっている。Ｍφは、ＥＲストレスに誘発されるアポトーシスを、（ａ）スカベンジャー受容体の上方調節（７４）、（ｂ）ＡＫＴおよびＮＦ−κＢ細胞生存経路の抑制（６６）、ならびに（ｃ）ＥＲ Ｃａ２＋ポンプＳＥＲＣＡの下方調節７５の少なくとも３つの機序によって亢進する。最も重要なことには、進行病変のＭφのアポトーシスおよびプラーク壊死は、Ｍφがインスリンシグナル伝達の欠損を有する病変部において増加し７６、これは、ヒト糖尿病の病変部の非常に大きな壊死性コアと一致する。別の研究は、混合した遺伝的背景を有する超高コレステロール／コール酸塩（「Ｐａｉｇｅｎ」）食を与えたＡｐｏｅ−／−マウスが、ＭφがＩｎｓｒ−／−またはＩｒｓ２−／−７７であった場合に、病変領域の中程度の減少を有したことを示した。これは、上述のＮＦ−κＢ研究と一致して（６６）、炎症促進性Ｐａｉｇｅｎ食環境下における抗炎症効果と関連し得る（７７〜７９）。最も重要なことに、ＰＰＧの焦点である、進行病変のＭφのアポトーシスおよびプラーク壊死の臨界エンドポイントは含まれていなかった。
理論に束縛されるものではなく、これらの３つの機序と、ＥＲストレス／ＰＲＲ２ヒットモデルとの間の関連性は、これらの機序および新しいデータに基づいて、容易に理解される（図１４）：（ａ）インスリン耐性Ｍφにおいて、サイトゾルへのＥＲ Ｃａ２＋の放出を増加させるＥＲＫ１／２−ＳＥＲＣＡ経路は阻害される（７５）。本明細書に記載される結果は、Ｉｎｓｒ−／−およびｏｂ／ｏｂＭφ、および上述の機序と一致して（７５）、ＥＲＫ阻害性ＷＴ Ｍφにおける、その活性化マーカーであるｐ−ＣａＭＫＩＩの増加を示す（図１５）、（ｂ）ＳＥＲＣＡの阻害は、ＥＲストレスを長期化し（８０）、ＣａＭＫＩＩの活性化は、フィードフォワードサイクルを通じてＥＲストレスを増幅し（図１６）、全てｏｂ／ｏｂマウスから新たに単離したＭφにおけるＣＨＯＰの増加の所見と一致する（６８）。
機構研究。
ＣａＭＫＩＩ活性を、対照と対比してインスリン耐性のＥＲストレスを受けたＭφにおいてアッセイする。有意性を広げるために、異なる源のＭφ、インスリン耐性の誘発物質、ＥＲストレスの活性化剤、およびＣａＭＫＩＩγをサイレンシングする方法を使用する。インスリン耐性ヒト由来の単球を含み（８５、８６）、高インスリン血症によるインスリン受容体の著しい下方調節に基づく（８１〜８４）、Ｉｎｓ−／−マウスからの腹膜Ｍφ（７６）を使用する。これらのＭφとＷＴ Ｍφとを、アテローム関連ＥＲストレス活性化剤でチャレンジする（１３）：ＦＣ充填、７−ケトコレステロール、または低量ＥＲストレスに加えてＰＲＲ活性化剤、例えば、ペルオキシ亜硝酸ドナーＳＩＮ−１に加えて酸化リン脂質（ｏｘＰＬ）７２。ＣＡＤの危険因子であるリポタンパク質Ｌｐ（ａ）（８７〜９１）、ヒトにおけるｏｘＰＬの担体（９２）、およびＥＲストレスを受けたＭφにおける強力なアポトーシス刺激剤（７２）を試験する。ＣａＭＫＩＩ活性化を、ｐＴｈｒ２８７免疫ブロット（図１５）、または直接ＣａＭＫＩＩキナーゼアッセイ（４８）によって、アッセイする。
ＥＲストレスを受けたインスリン耐性Ｍφにおけるアポトーシスのレベルは、「基礎」（すなわち、ＥＲストレスを受けたＷＴ Ｍφに見られるもの）に加えて、インスリン耐性によって得られる増分、の２つの構成要素からなり、それぞれが、最終アポトーシス応答に約５０％寄与する（７６）。ｏｂ／ｏｂＭφにおいて、部分的なＣａＭＫＩＩ阻害は、ＥＲストレスに誘発されたアポトーシスの基礎構成要素の約４０％の減少、およびｏｂ／ｏｂに誘発された増分部分の約６５％の阻害をもたらした、すなわち、総アポトーシスは、ｏｂ／ｏｂにおいては、ＷＴのＥＲストレスを受けたＭφよりも高い程度で阻害剤によって減少された（ＷＴでは５．０±０．４から３．１±０．２％、対してｏｂ／ｏｂでは１１．９±１．１から５．６±０．５％）。これらの実験を、（ａ）ｏｂ／ｏＭφにおけるＣａｍｋ２ｇ ｓｉＲＮＡ、（ｂ）ｏｂ／ｏｂ対ｏｂ／ｏｂＣａｍｋ２ｇ−／−Ｍφ、ならびに（ｃ）以下のアテローム性動脈硬化症研究からのＭφ、すなわち、骨髄ＷＴ、Ｃａｍｋ２ｇＫＯ、ＩｎｓｒＫＯ、またはＣａｍｋ２ｇＩｎｓｒＤＫＯマウスを移植したＬｄｌｒ−／−マウスを使用して、反復する。ＣＡＭＫＩＩγに誘発されるアポトーシス促進性シグナル伝達のエフェクターのどれが、インスリン耐性Ｍφにおいて増加され、ＣａＭＫＩＩγ欠損によって減少されるかを判定することによって、機序を調べる：Ｆａｓ死亡受容体誘発、ＳＴＡＴ１活性化、ミトコンドリアＣａ２＋取り込みおよびシトクロムｃ放出、Ｎｏｘ２誘発／ＲＯＳ４８、ＵＰＲ増幅、ならびにＰＫＲ活性化。対照−ＷＴ、インスリン耐性−ＷＴ、対照−Ｃａｍｋ２ｇ−／−、およびインスリン耐性−Ｃａｍｋ２ｇ−／−の４つの群のＭφを、次のようにアッセイする（４８、６８、９３、９４）：Ｆａｓ ｍＲＮＡのＲＴ−ＱＰＣＲおよびＦａｓ細胞表面発現のＦＡＣＳ分析、ｐ−ＳＴＡＴ１の免疫ブロット、ミトコンドリアＣａ２＋のローダミン−２染色およびｍｔ−ｐｅｒｉｃａｍ蛍光（９５）、ミトコンドリアおよびサイトゾルシトクロムｃの免疫ブロットならびにカスパーゼ９活性アッセイ、Ｎｏｘ２ ｍＲＮＡのＲＴ−ＱＰＣＲおよび細胞過酸化物蓄積のＤＣＦ染色、ｐ−ＰＥＲＫおよびＣＨＯＰの免疫ブロット、ならびにｐ−ＰＫＲの免疫ブロット。これらのエフェクターのエンドポイントは、インスリン感受性のＥＲストレスを受けたＭφと対比して、インスリン耐性では増加し、基礎ＥＲストレス誘発性構成要素およびインスリン耐性Ｍφにおけるさらなる増分の両方が、ＣａＭＫＩＩγの不在下では減少し、Ｃａｍｋ２ｇ−／−Ｍφの全体的な劇的減少をもたらすことになる。しかしながら、インスリン耐性は、特定のエンドポイントにおける選択的な増加を引き起こすか、またはデータが、ＣａＭＫＩＩγ以外の因子がインスリン耐性に誘発される増加に関与し得ることを示す場合には、そのデータにより誘起される機構的実験を計画して実行する。
理論に束縛されるものではないが、インスリン耐性（ＩＲ）は、ＥＲストレスを受けたＭφにおけるＣａＭＫＩＩγのアポトーシス促進効果を強化する（ＩＲ→ＣａＭＫＩＩ）。正帰還サイクルは、しばしば、ＥＲストレスに誘発されるアポトーシスシグナル伝達経路に関与する（９３）（図１６）。したがって、ＣａＭＫＩＩγが、インスリン耐性のフィードバック強化（ＩＲ ⇔ ＣａＭＫＩＩ）を行うことができるかどうかを調べる。できる場合、ＣａＭＫＩＩγ欠損は、先行研究に基づいて、インスリン耐性Ｍφにおいて次の保護効果を有し得る（６６、７２、７４、７５、７５）：（ａ）↓ＳＲＡおよびＣＤ３６、↑ｐ−Ａｋｔ、↑ｐ−ＥＲＫ、↑ＳＥＲＣＡ２ｂ、ならびに↑ｐ−ＦｏｘＯ１（免疫ブロット）；（ｂ）↑Ｓｅｒｃａ２ｂ、↓Ｉｋｂｅ、および↑Ｂｃｌ２（インスリン耐性のＭφにおいて減少するＮＦ−κＢ標的６６）（ＲＴ−ＱＰＣＲ）；（ｃ）↓ＥＲ Ｃａ２＋（Ｆｌｕｏ−３−タプシガルギン蛍光顕微鏡アッセイ）；ならびに（ｄ）↓核内ＦｏｘＯ（アデノ−ＧＦＰ−ＦｏｘＯ１形質導入Ｍφにおける免疫蛍光）。ＣａＭＫＩＩγが、絶食およびインスリン耐性肝細胞におけるＦｏｘＯ１の核局在化に必要であるとすると、後者のアッセイが特に興味深い。総合すると、これらの研究は、ＥＲストレスを受けたＭφにおけるインスリン耐性のアポトーシス促進効果におけるＣａＭＫＩＩγの役割の包括的な見解を提供する。
ヒトアテローム性動脈硬化症。
因果関係についての研究をマウスにおいて行うが（次の節で）、プラークＭφにおけるＣａＭＫＩＩγの活性化を、（ａ）進行したプラークの段階の関数として、および（ｂ）欠損したＭφインスリンシグナル伝達環境下で、試験する。新たに単離した／瞬間凍結した頸動脈プラーク標本を、プラークの中央で、３つの小さな隣接する切片に分割する。中央の切片を、抗−ｐ−ＣａＭＫＩＩ免疫ブロット分析に使用し、全ＣａＭＫＩＩγおよびβ−アクチンを充填した対照との濃度測定比によって定量化する。直接の隣接領域を、ミクロトーム切片に分け、次いで、（ａ）Ｍｏｖａｔペンタクロームで壊死領域測定について染色し（全領域に対するパーセントとして定量化）、（ｂ）Ｍφ、ｐ−ＣａＭＫＩＩ（図１７）の免疫染色、およびアポトーシスのＴＵＮＥＬを行う（陽性であるＭφのパーセントとして定量化）。ｐ−ＣａＭＫＩＩと壊死領域（およびＭφ ＴＵＮＥＬ）との間の相関性が、Ｐ＝０．０５で有意であることを示すことが目的である。さらに、これらの標本を、Ｖｉｒｍａｎｉ−ＡＨＡスキームを使用して、盲検式で５段階に分類する（９６）：１＝拡散した内膜肥厚、２＝線維性プラーク、３＝被膜の厚いアテローム、４＝被膜の薄いアテローム、および５＝破綻プラーク。ｐ−ＣａＭＫＩＩが、段階１＋２と対比して、４＋５で強化されるかどうかを試験することが目的である。ｎ＝１５は、８０％の検出力で、４＋５の病変部と１＋２の病変部との間で、Ｐ＝０．０５で、ｐ−ＣＡＭＫＩＩにおいて少なくとも２倍の差を示すのに十分である。最後に、全てのデータを、２型糖尿病の存在との相関性について分析し、病変段階、ならびにｐ−ＣａＭＫＩＩと、病変段階および２型糖尿病の両方との間の正相関について補正する。
マウスアテローム性動脈硬化症研究。
（ａ）ＣａＭＫＩＩγ活性化およびそのアポトーシス促進効果が、進行したプラーク段階の関数として、およびＭφのインスリン耐性環境下で、増加するかどうかを試験すること、ならびに（ｂ）因果関係研究として、進行病変のＭφのアポトーシスおよびプラーク壊死に対するＣａＭＫＩＩγ欠損の効果および機序を試験すること、の２つを目的とする。前述と同じ全体的な戦略を使用して（７６）、４つの群のマウスを、雄性Ｌｄｌｒ−／−マウスへの骨髄移植（ＢＭＴ）ドナーとして使用する：Ｃａｍｋ２ｇｆｌ／ｆｌＩｎｓｒ＋／＋（ＷＴ→Ｌｄｌｒ−／−）、Ｃａｍｋ２ｇｆｌ／ｆｌＬｙｓｍｃｒｅ＋／−Ｉｎｓｒ＋／＋（Ｍφ−ＣＫ ＫＯ→Ｌｄｌｒ−／−）、Ｃａｍｋ２ｇｆｌ／ｆｌＩｎｓｒ−／−（Ｍφ−ＩｎｓＲ ＫＯ→Ｌｄｌｒ−／−）、およびＣａｍｋ２ｇｆｌ／ｆｌＬｙｓｍｃｒｅ＋／−Ｉｎｓｒ−／−（Ｍφ−ＣＫ／ＩｎｓＲ ＤＫＯ→Ｌｄｌｒ−／−）。全ての遺伝子型は、８世代以上にわたり、Ｃ５７ＢＬ６／Ｊバックグラウンドに戻し交配しており、全ての実験は、同腹子対照を使用する。先行研究は、Ｌｙｓｍｃｒｅ＋／−バックグラウンドの病変のマクロファージにおいてｌｏｘＰが導入された遺伝子のほぼ完全な欠失があることを示している（６７、９７）。ＢＭＴの６週間後、マウスに、８、１２、１６、および２０週間、西洋食（ＷＤ）を与え、これにより、早期、中期、および進行／壊死の病変部の分析が可能となる（１６、６５、６７、７１、９７〜１０２）。類似の戦略および目標を有した以前のアテローム性動脈硬化症の研究は（１６、６５、７１、９７、１０１、１０２）、以前のインビボ研究からの統計と総合して（７６）、１群あたりｎ＝３０の雄性マウスが、４つの群のマウスにおいて、これらのエンドポイントに、３３％の差異を検出する８０％の可能性をもたらすであろうという推測を可能にする。
Ｍφのアポトーシスおよび壊死性コアの定量化を含む、マウスアテローム性動脈硬化症研究の全体的なプロトコルは、この分野の出版物に詳述されている（１６、６５、６７、７１、７２、９７、１０１〜１０３）。簡単に言うと、血漿を、脂質／リポタンパク質分析、絶食時グルコース、およびインスリンのために得る。大動脈基部および腕頭動脈を、病変および壊死領域、アポトーシス（ＴＵＮＥＬおよび活性化カスパーゼ−３）、ならびにインサイツ貪食除去について分析する。病変部のインサイツ貪食除去を、アッセイする（１０３）。壊死領域は、Ｍφの残屑を有する細胞の領域として（細胞の不在下におけるＭφ特異的抗原）およびコラーゲン染色の不在によって、定義される。Ｍφ、ＳＭＣ、ＥＣ、およびＴ細胞を、ＩＨＣによって識別し、線維性被膜を、エラスチンおよびコラーゲンに対するＶｅｒｈｏｅｆｆおよびＭａｓｓｏｎの三重染色を使用して厚さについて定量化する（９７）。後者のアッセイは、記載されるように（１０４）、Ｍφの二次壊死の抑制が、このエンドポイントの原因となり得るＭＭＰの漏れの減少につながり得るため、Ｖｅｒｈｏｅｆｆ染色した試料において、中間の弾性線維の完全な分解（「中間侵食」）について、２０週の病変部を調べることによって、補完される（１０５）。データは、記載されるように、その病変部が内側への侵食を示す、各郡内のマウスの数として定量化する（１０４）。陽性結果に続いて、病変切片を、記載されるように、ＭＭＰゼラチナーゼ（ＭＭＰ２／９）基質を使用して、酵素電気泳動法および近赤外蛍光によって、活性なＭＭＰについてアッセイする（１０６）。プラーク内出血の進行したプラークの特性を（１０７、１０８）、Ｐｅｒｌの鉄染色（１０９）およびＨ＆Ｅ切片の検査、ならびにＲＢＣについての５６０ｎｍの蛍光（１０７、１１０）を使用してアッセイする。抗Ｆ４／８０（Ｍφ）および抗ｐ−ＣａＭＫＩＩを使用したＩＨＣを用いて、ｐ−ＣａＭＫＩＩが、進行プラーク期の関数として、および欠損したＭφのインスリンシグナル伝達環境下で、増加するかどうかを評価する。抗ｐ−ＣａＭＫＩＩ抗体は、Ｃａｍｋ２ｇ−／−マウス由来のＭφにおいて、バックグラウンドを上回るシグナルをもたらさない。ヒトの病変部と同様に（図１７）、ｐ−ＣａＭＫＩＩの存在と一致する染色パターンが、進行病変のＭφにおいて得られており、このシグナルを、Ｍφ−ＣＫ ＫＯ群を使用して検証する。ＩＨＣデータを、病変領域あたりのｐ−ＣａＭＫＩＩ染色の領域、ＭφであるＣａＭＫＩＩγ染色細胞のパーセント、およびｐ−ＣａＭＫＩＩで染色するＭφのパーセントとして定量化する。免疫ブロットを、ｐ−ＣａＭＫＩＩ（および全ＣａＭＫＩＩ）を正確に識別できるように、外膜が除去されている大動脈基部および大動脈弓セグメントにおいて行う。この分析は、動脈壁細胞の寄与を排除するものではないが、ＩＨＣ研究により、これらの他の細胞が、酵素のγアイソフォームをさらに発現するかどうかを評価することを可能にするはずである。炎症促進性（ＴＮＦαおよびＩＬ−６）ならびに抗炎症性（ＴＧＦβおよびＩＬ−１０）サイトカインｍＲＮＡ発現のレーザーキャプチャマイクロダイセクション（ＬＣＭ）−ＲＴ−ＱＰＣＲを、行う。ＭφのアポトーシスおよびＥＲストレスの減少は、プラーク炎症を減少させ（７０、１１１）、ＣａＭＫＩＩγの不在は、ＮＣｏＲコリプレッサー機能を安定化することによって炎症性遺伝子の転写を減少させ得る（５３、５４）。捕捉したＲＮＡをさらに使用して、細胞培養研究によって導かれるインビボ機構の研究を行う。活性化されたＣａＭＫＩＩγのアポトーシス促進性転写標的、すなわち、Ｆａｓ、Ｎｏｘ２、およびＣｈｏｐ（Ｄｄｉｔ３）ｍＲＮＡ４８を評価する。Ｓｅｒｃａ２ｂ、Ｉｋｂｅ、およびＢｃｌ２（インスリン耐性Ｍφにおいて減少するＮＦ−κＢ標的６６）についてのｍＲＮＡもまた、アッセイする。ＦｏｘＯ１標的である（１１２）、Ｍφ Ｔｌｒ４およびＴｌｒ２ ｍＲＮＡの発現を、アッセイする。Ｎｏｘ２および酸化的ストレスに関して（９３）、病変ＲＯＳを、ＤＨＥを使用してアッセイする。これらの結果は、（ａ）進行病変のＭφのアポトーシスおよびプラーク壊死、ならびにＣａＭＫＩＩ−アポトーシス経路のマーカーは、ＷＴ群と対比してＣＫＯにおいて、特にＷＴ群と対比してＣＫ／ＩｎｓＲ ＤＫＯにおいて、低くなり、（ｂ）Ｍφ Ｆａｓ、Ｎｏｘ２、およびＣｈｏｐ ｍＲＮＡ、ならびにＲＯＳは、ＷＴ群と対比してＣＫＯにおいて、特にＷＴと対比してＣＫ／ＩｎｓＲ ＤＫＯにおいて、低くなり、（ｃ）Ｓｅｒｃａ２ｂおよびＢｃｌ２は、ＷＴと対比してインスリン耐性では低くなり、Ｉｋｂｅは高くなることを示し、これらの傾向がＣＫ／ＩｎｓＲ ＤＫＯ群においては逆となるかどうかを調べることは興味深い。
Figure 2014531425
 表１：マウスモデルの概要およびエンドポイントの予測
壊死、およびＣａＭＫＩＩアポトーシス経路のマーカーは、ＷＴ群と対比してＣＫＯにおいて、特にＷＴ群と対比してＣＫ／ＩｎｓＲ ＤＫＯにおいて、より低くなる、（ｂ）Ｍφ Ｆａｓ、Ｎｏｘ２、およびＣｈｏｐ ｍＲＮＡおよびＲＯＳは、ＷＴ群と対比してＣＫＯにおいて、特にＷＴ群と対比してＣＫ／ＩｎｓＲ ＤＫＯにおいて、低くなり、（ｃ）Ｓｅｒｃａ２ｂおよびＢｃｌ２は、ＷＴ群と対比して、インスリン耐性において、低くなり、Ｉｋｂｅは高くなり、これらの傾向が、ＣＫ／ＩｎｓＲ ＤＫＯ群で逆となるかどうかを見出すことは興味深い。
肝臓ＣａＭＫＩＩγ欠損が肥満の代謝異常を改善する機序の特徴付け、および肝臓特異的ＣａＭＫＩＩγ欠損が肥満マウスにおけるアテローム性動脈硬化症を抑制するかどうかのアッセイ。
ＥＲストレスに誘発されるＭφのアポトーシスに重要な役割を果たすものと同じ酵素である、ＨＣ ＣａＭＫＩＩγの欠損が、肥満におけるアテローム生成代謝異常を改善する。ＣａＭＫＩＩγは、マウスおよびヒトの肝臓におけるＣａＭＫＩＩの主要なアイソフォームであり、その活性化状態の尺度であるｐ−ＣａＭＫＩＩγは、ｏｂ／ｏｂマウス、食餌誘発型（ＤＩＯ）マウス（５．２４ｋｃａｌ／ｇ、６０％のカロリーは脂肪分から、×２０週間）、および病的肥満ヒトの肝臓において、痩せた対照と比較して、増加していた（図８Ａ〜Ｂ）。これらのデータ、および肥満が肝臓のＥＲストレスをもたらすという事実と一致して（３４）、アゼチジンまたはパルミチン酸塩によるＥＲストレスの活性化は、ＨＣにおいてｐ−ＣａＭＫＩＩγを増加させ、ＤＩＯマウスにおけるＣａＭＫＩＩγ欠損は、ＵＰＲ活性化を抑制し、ＣａＭＫＩＩγが、ＨＣにおいて、Ｍφにおいてと同様、ＵＰＲの正のフィードバックサイクルに関与する（図１６を参照されたい）。肥満におけるＣａＭＫＩＩγの機能的重要性は、ＣａＭＫＩＩγ欠損ＤＩＯマウスが、血漿インスリンを著しく低下させ、それらは、体重に差がないにもかかわらず、ＤＩＯＷＴマウスよりも、インスリンに媒介されるグルコース低下に対してより応答性であるという所見によって示された（図９Ａ〜Ｄ）。マウスはまた、グルコース寛容性試験の際、血中グルコースの改善を有した。類似の結果が、肝臓ＣａＭＫＩＩを阻害することが検証されたＣａＭＫＩＩのキナーゼ不活性の優性阻害形態である１２３、アデノ−Ｋ４３Ａ−ＣａＭＫＩＩの使用を通じた肝臓ＣａＭＫＩＩの急性阻害を用いて見いだされた（図９Ｅ〜Ｆ）。グルコース新生（ＧＮＧ）遺伝子Ｇ６ＰａｓｅおよびＰＥＰＣＫのｍＲＮＡは、アデノ−Ｋ４３Ａ−ＣａＭＫＩＩ処置ｏｂ／ｏｂマウスの肝臓において減少した（図９Ｇ）。
いずれの遺伝子も、ＦｏｘＯ１の標的であり、Ｉｇｆｂｐ１も同様であり、これもまたＣａＭＫＩＩを阻害した肝臓において減少した。これらのデータは、ＦｏｘＯ１の核局在化を抑制するＣａＭＫＩＩ阻害と一致する（下記を参照されたい）。ＣａＭＫＩＩγ欠損ＤＩＯマウスはまた、（ａ）肝臓トリグリセリド（ＴＧ）含量（図１０Ａ）、（ｂ）ＳＥＲＢＰ−１ｃに誘発される脂質合成ｍＲＮＡであるが、脂肪酸酸化と関連するｍＲＮＡではないもの、ならびに（ｃ）血漿コレステロールおよびＴＧ（図１０Ｂ）が減少した。高脂肪食に誘発される脂質異常症は、残留ヒトインスリン受容体で作用する、高インスリン血症によるｍＴＯＲＣ１−ｐＳ６Ｋ経路の刺激に関与し、ソルチリン１（Ｓｏｒｔ）の抑制をもたらす。Ｓｏｒｔの減少は、ヒト脂質異常症と遺伝的に関連しており、その機序は、おそらくはＳｏｒｔシャペロン媒介性リソソーム分解経路を通じた、ＬＤＬ ａｐｏＢ−１００のＳｏｒｔ媒介性分解を減少させると見られる１２４。この経路は、ＣａＭＫＩＩ阻害によって部分的に阻止される（図１０Ｃ）。最後に、肝臓Ｔｎｆａ ｍＲＮＡは、ＷＴ ＤＩＯ肝臓と対比して、Ｃａｍｋｇ２ｇ−／−では約５０％減少した（図１０Ｄ）。
肝細胞ＣａＭＫＩＩγ欠損は、ＦｏｘＯ１の核排除を伴う機序を介して、グルコース新生（ＧＮＧ）および肝臓のグルコース生成（ＨＧＰ）を減少させることによって、高インスリン血症および後発する脂質異常症を軽減する（図１８）。
この分析は、（ａ）肥満の高インスリン血症を誘起することにおける上昇したＨＧＰの役割、および脂質異常症の進行における高インスリン血症の重要性、（ｂ）肥満マウスにおけるＣａＭＫＩＩ阻害が、ＦｏｘＯ１に誘発されるＧＮＧ遺伝子およびＦｏｘＯ１標的であるＩｇｆｂｐ１を減少させるという所見（図８Ｇ）、ならびに（ｃ）絶食痩せ型マウスにおける肝臓ＣａＭＫＩＩγ、ＦｏｘＯ１、およびＧＮＣの間の関連性に基づくデータに基づく。
ここではα１−抗トリプシンＣｒｅ（Ａ１ａｔｃｒｅ＋／−）マウスと交配してＨＣ中のＣａＭＫＩＩγを欠失させた１２５、本明細書に記載されるＣａｍｋ２ｇマウスを使用する。４つの群の雄性マウスに、ＤＩＯ食を、４週齢で開始して２０週間与える：ＤＩＯ／Ｃａｍｋ２ｇｆｌ／ｆｌ（ＤＩＯ／ＷＴ）および通常食を与えた対照（痩せ型／ＷＴ）、ならびにＤＩＯ／Ｃａｍｋ２ｇｆｌ／ｆｌＡ１ａｔｃｒｅ＋／−（ＤＩＯ／Ｌｉ−ＣＫ ＫＯ）、ならびに通常食を与えた対照（痩せ型／Ｌｉ−ＣＫ ＫＯ）。生殖細胞系ノックアウトの補整効果を無視するために、ＤＩＯ／Ｌｉ−ＣＫ ＫＯマウスのコホートを、アデノ−Ｔ２８７Ｄ−ＣａＭＫＩＩ（対アデノ−ＬａｃＺ対照）で「回復」させ、これは、キナーゼの構造的に活性な形態であり（１２３）ＤＩＯ／Ｌｉ−ＣＫ ＫＯマウスにおいて予測される有益な代謝効果を逆行させるはずである。食物の摂取及び体重を監視し、絶食時血漿グルコースおよびインスリンを、４週間毎に取得する。給餌期間の終了時に、マウスを６時間絶食させ、体重を量り、安楽死させる。概日リズムと代謝との間の関連性を考慮すると（１２６〜１２８）、１２時間の明／暗サイクルに密接性があり、全てのマウスは、同じ時刻に安楽死させる。Ｃａｍｋ２ｇ−／−マウスは、肝臓に関連するものを含む４８、明らかな形態学的または機能的異常なしに生体に成長するが、血漿を、以下に記載される代謝および脂質パラメータのため、ならびにＨＣ機能不全の尺度としてのアラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）およびアスパラギン酸塩トランスアミナーゼ（ＡＳＴ）のために取得する。次いで、肝臓を即座に除去し、液体窒素中で瞬間凍結させ、−８０℃で保管する。ＣａＭＫＩＩγの欠失を、ＲＴ−ＰＣＲおよび免疫ブロットによって確認し、肝臓欠失に対する特異性を、脳、心臓、腎臓、脂肪組織、骨格筋、および腸の瞬間凍結試料における類似の分析によって判定する。肝臓はまた、免疫ブロットによって、ｐ−ＣａＭＫＩＩ、ｐ−ＪＮＫ１３４、およびＵＰＲマーカーについても分析し（３４）、肝臓炎症に関しては、ＱＰＣＲによってＴｎｆａについて分析する。理論に束縛されるものではなく、これらのエンドポイントは、痩せ型−ＷＴと対比して、ＤＩＯ／ＷＴ群においては上昇するが、ＤＩＯ／Ｌｉ−ＣＫ ＫＯ群では抑制される。
ＨＣ ＣａＭＫＩＩγ欠損によるグルコースおよび脂質代謝の改善
各群８匹のマウスに、完全な高インスリン血症−正常血糖クランプ研究を受けさせ、これによって、さらに、インスリン感受性を評価し、基礎およびインスリン刺激による肝臓のグルコース生成（ＨＧＰ）、ならびに末梢組織（例えば、骨格筋、脂肪組織）におけるインスリン刺激によるグルコース取り込み、グリコール分解、ならびにグリコーゲン合成を定量化する（１２９）。ＤＩＯ／ＷＴ群と痩せ型−ＷＴ群との対比は、これらのマウスにおけるインスリン耐性を反映する、グルコース注入の減少、ＨＧＰの増加、および末梢組織グルコース処理の減少を示すはずである。これらのパラメータは、ＤＩＯ／Ｌｉ−ＣＫ ＫＯとＤＩＯ／ＷＴマウスとの対比では、改善される（すなわち、グルコース注入の増加およびＨＧＰの低減）。１群あたり８匹のマウスは、ＤＩＯ／Ｌｉ−ＣＫ ＫＯとＤＩＯ／ＷＴ群との間に統計学的有意差を示す、８０％の検出力を有し得る（Ｐ＜０．０５）。
ＤＩＯ／Ｌｉ−ＣＫ ＫＯマウスは、ＤＩＯ／ＷＴマウスと比較して、血漿ＴＧ、総コレステロール、ＨＤＬ−コレステロール、ＦＰＬＣリポタンパク質プロファイル、およびアテローム発生をアッセイすることによって試験される、アテローム発生脂質プロファイルが低く、インスリン耐性状態が上昇している（１３０）。血漿研究を補足するために、マウス由来の肝臓試料を、ＴＧ含量、ＬＤＬ受容体タンパク質およびｍＲＮＡ、ならびにＳｒｅｂｐ１ｃおよびその転写標的のためのｍＲＮＡについて分析する。ＤＩＯ／Ｌｉ−ＣＫ ＫＯとＤＩＯ／マウスマウスとの対比において、予測される血漿ＴＧが豊富なリポタンパク質の減少は、肝臓分泌の減少または肝臓クリアランスの増加のためであり得る。．ＴＧ分泌をアッセイするために、Ｔｒｉｔｏｎ ＷＲ−１３３９研究を行う（１３１）。簡単にいうと、絶食させたマウスに、［３５Ｓ］−メチオニンを注射してａｐｏＢを代謝標識し、Ｔｒｉｔｏｎ ＷＲ−１３３９を注射してリポタンパク質のクリアランスを遮断する。血漿を、注射後２時間の期間にわたって収集し、ＴＧ含量およびＶＬＤＬについて分析し、ａｐｏＢ１００およびａｐｏＢ４８を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに続いてオートラジオグラフィーによってアッセイする。２時間の期間中の標識されたａｐｏＢ標識リポタンパク質の上昇速度は、分泌速度の尺度である。ＣａＭＫＩＩγ欠損は、インスリン耐性環境下で、肝臓Ｓｏｒｔ発現を増加させる（抑制解除する）（図１０Ｃ）。ＤＩＯ／Ｌｉ−ＣＫ ＫＯマウスにおける肝臓Ｓｏｒｔのサイレンシングが、ＶＬＤＬ分泌を増加させるかどうかを判定することが目的である。ＤＩＯマウスの脂肪肝は、ＣａＭＫＩＩγ欠損によって著しく改善される（図１０Ａ）。ＴＧ含量を測定し、４つの群のマウスの肝臓標本中のＯｉｌ Ｒｅｄ Ｏ陽性脂肪滴について染色する。ＤＩＯ／Ｌｉ−ＣＫ ＫＯマウスが、肝臓ＴＧ蓄積の減少を示した場合、Ｓｒｅｂｆ１、Ｆａｓｎ、Ａｃａｃａ、Ｓｃｄ１を含む脂質合成遺伝子、ＰｐａｒａおよびＡｃｏｘ１を含む脂肪酸酸化に関与する遺伝子、ならびに肝臓ＦｏｘＯＫＯマウスにおける脂肪変性における役割に関してはＮａｍｐｔの発現をアッセイすることによって、機序を調べる（１３２）。追跡研究により、上述の実験の結果によって導かれる、ＣａＭＫＩＩと陽性所見とを関連付ける分子機序を調査する。例えば、予備データは、ＵＰＲエフェクターＡＴＦ３とｍＴＯＲＣ１−ＳＯＲＴ抑制経路との間の関連性を裏付け、したがって、ＣａＭＫＩＩγがＵＰＲを増幅させる能力を考慮する。
肥満は、ＣａＭＫＩＩγリン酸化によって促進される
Ｍφにおいて、ＥＲストレスは、ＥＲ Ｃａ２＋貯蔵のＣＨＯＰに誘発される放出に関与する経路を通じてＣａＭＫＩＩγを活性化する（４８、６８）。肥満における肝臓ＥＲストレスおよびＣＨＯＰｎｏ誘発（３４）（上記）、ならびにＥＲストレスに誘発される肝臓脂肪変性におけるＣＨＯＰの原因としての働き（９４）を考慮して、ＣＨＯＰが、肥満におけるＣａＭＫＩＩγ活性化に必要であるかどうかを試験する。純粋なＣ５７ＢＬ６／Ｊバックグラウンドに対してＣｈｏｐｆｌ／ｆｌマウスを作製した。ＣＨＯＰ欠失は、マウスを欠失体−Ｃｒｅマウスと交配した際に発生する。これらのマウスを、Ａ１ａｔｃｒｅ＋／−マウスと交配させて、これらのマウスが、対照Ｃｈｏｐｆｌ／ｆｌマウスと比較して、ＤＩＯ食での肝臓ｐ−ＣａＭＫＩＩγが低いかどうかを試験する（図８を参照されたい）。低い場合、さらにグルコースおよび脂質の代謝が、上述のアッセイを用いて、これらのマウスにおいて改善された場合、それらに、構造的に活性なアデノ−Ｔ２８７Ｄ−ＣａＭＫＩＩを形質導入して、肝臓ＣＨＯＰ欠損の有益な効果が逆転することを示す。追跡の代謝および機構的実験は、結果を待つ間に行う。
ＧＮＧは、ＣａＭＫＩＩによって促進される。
絶食はＣａＭＫＩＩγのリン酸化を促進し、これは、再給餌によって減少した（図１９Ａ）。これらのデータと一致して、グルカゴン（およびホルスコリン）は、初代ＨＣにおいてＣａＭＫＩＩγのリン酸化を促進した。インビボでの機能的重要性は、絶食Ｃａｍｋ２ｇ−／−マウスまたはアデノ−Ｋ４３Ａ−ＣａＭＫＩＩで処置したＷＴマウスにおいて、絶食およびピルビン酸塩に刺激される血中グルコース、ならびに肝臓Ｇ６ｐｃおよびＰｃｋ１ ｍＲＮＡの減少によって、より早急に肝臓ＣａＭＫＩＩを阻害することが示された（図１９Ｂ〜Ｄ）。絶食時の肝臓または血清飢餓ＨＣにおけるＣａＭＫＩＩγ欠損または阻害はまた、核内ＦｏｘＯ１の劇的な減少をもたらし（図１９Ｅ〜Ｆ）、構造的に活性なＴ２８７Ｄ ＣａＭＫＩＩは、核内ＦｏｘＯ１（図１９Ｆ）、血漿グルコースおよびインスリン、ならびに肝臓Ｇ６ｐｃおよびＰｃｋ１ ｍＲＮＡを増加させた。ＣａＭＫＩＩγ欠損がＧ６ｐｃ ｍＲＮＡに及ぼす抑制効果は、構造的に核内のＦｏｘＯ１−ＡＤＡの形質導入によって無効となり（図１９Ｇ）、ＣａＭＫＩＩ欠損の効果は、ＦｏｘＯ１の核排除を必要とするという考えと一致する。Ａｋｔに誘発されるＴ２４、Ｓ３１６、およびＳ２５３におけるＦｏｘＯ１のリン酸化が、逆のことを行うとすると、キナーゼが核内ＦｏｘＯ１を促進し得ることは、矛盾するように思われ得る（１３３）。実際、ＣａＭＫＩＩγ欠損は、これらの部位でのリン酸化を促進しない。しかしながら、ＬＣ−ＭＳリン酸化ペプチドマッピング研究（１３４）は、Ｓｅｒ２８４および２９５というＦｏｘＯ１の２つの他の部位が、ＷＴマウス由来の血清飢餓ＨＣでリン酸化されていたが、Ｃａｍｋ２ｇ−／−マウス由来のＨＣでは完全に非リン酸化であったことを示した（図１９Ｈ）。したがって、理論に束縛されるものではなく、ＣａＭＫＩＩ欠損ＨＣにおけるｐＳｅｒ２８４／２９５の不在は、ＦｏｘＯ１核排除を促進し、したがって、ＧＮＣを抑制する。
４つの群のマウスにおいて、Ｇ６ｐｃおよびＰｃｋ１ ｍＲＮＡ、ならびに核内ＦｏｘＯ１を、アッセイする。いずれも、ＤＩＯ／ＷＴマウスと対比して、ＤＩＯ／Ｌｉ−ＣＫ ＫＯにおいて抑制される。マウス由来のＦｏｘＯ１に、リン酸化ペプチドマッピングのために免疫沈降を行う。ＣａＭＫＩＩ欠損を、不在ｐＳｅｒ２８４／２９５−ＦｏｘＯ１と関連付ける。Ｓ２８４／２９５Ａ−ＦｏｘＯ１は、ＣａＭＫＩＩγ阻害の効果を模倣し得るが（核内ＦｏｘＯ１ならびにＧ６ｐｃおよびＰｃｋ１ ｍＲＮＡを低減する）、一方でＳ２８４／２９５Ｄ ＦｏｘＯ１は、ＣａＭＫＩＩγ阻害の効果に耐性となるはずである。ＧＮＧを減少させた１２５肝臓特異的ＦｏｘＯ１ＫＯマウスのＨＣに、ＧＦＰタグ付ＷＴまたは突然変異ＦｏｘＯ１構築物、±アデノ−Ｋ４３Ａ−ＣａＭＫＩＩを形質導入して、ＣａＭＫＩＩを阻害し、次いで、ＦｏｘＯ１局在化ならびにＧ６ｐｃおよびＰｃｋ１ ｍＲＮＡをアッセイする。ＣａＭＫＩＩを阻害するためのＫ４３Ａ−ＣａＭＫＩＩの使用を補足するために、Ｌｉ−ＣＫ ＫＯ由来のＨＣに、アデノ−Ｓ２８４／２９５Ｄ−ＦｏｘＯ１と対比して、アデノ−ＷＴ−ＦｏｘＯ１を形質導入する。理論に束縛されるものではなく、この突然変異体は、構造的に核内であり、ＣａＭＫＩＩγ欠損がＧＮＧを抑制する能力に、優性阻害効果を有する。要約：
表２
Figure 2014531425
 ａｄ、アデノウイルス；対照、ａｄ−ＬａｃＺ；Ｋ４３Ａ、優性阻害ＣａＭＫＩＩ；Ｓ→Ａ ＦｏｘＯ１、構造的脱リン酸化モデル；Ｓ→Ｄ ＦｏｘＯ１、構造的「リン酸化」モデル
これらの予測を、上述のアデノウイルス構築物を形質導入したＤＩＯ食を与えたＬ−ＦｏｘＯ１マウスに置き換える。エンドポイントは、肝臓Ｇ６ｐｃおよびＰｃｋ１ ｍＲＮＡ、該当する場合は核内ＦｏｘＯ１、血漿グルコース（ピルビン酸塩チャレンジ後を含む）およびインスリン、ならびに上述の脂質およびリポタンパク質のパラメータである。予測は、表のものと類似であり、ＧＮＧ遺伝子の減少は、グルコースおよび脂質／リポタンパク質の代謝の改善を伴う。ＨＧＰは影響を受けるが、Ｇ６ｐｃおよびＰｃｋ１は影響を受けないという見込みの少ない状況では、ＧＮＧ遺伝子Ｐｄｋ４、Ｆｂｐ１、およびＧｃｋをアッセイする。
肥満のヒトの肝臓におけるＣａＭＫＩＩγの活性化。
肥満手術を受けた肥満対象および一般手術を受けた痩せた対象に由来する、急速凍結した新たな肝臓生検標本を試験する。患者識別子は存在しないが、体重、ウエスト・ヒップ比、年齢、および性別；糖尿病／代謝の薬物； 絶食時血漿グルコース、インスリン、ＨｂＡ１ｃ、および遊離脂肪酸；ならびに組織学的分析に基づいた脂肪変性および脂肪性肝炎の程度（１〜５段階で採点）を含む、各対象についての符号化リストが存在する。標本に、ｐ−および全ＣａＭＫＩＩγ、ならびにＣＨＯＰおよびＳｏｒｔを含むＥＲストレスマーカーについて、免疫ブロットを行う。データを、充填対照に対する濃度測定分析によって定量化する。主要な目的は、ｐ−ＣａＭＫＩＩが、痩せた対象と対比して、肥満対象由来の肝臓においてより高いかどうか、および肥満群の中で、インスリン耐性悪化の勧誘として、ｐ−ＣａＭＫＩＩの増加が存在するかどうかを判定することである。二次目標は、高レベルのｐ−ＣａＭＫＩＩが、高レベルのＣＨＯＰおよび低レベルのＳｏｒｔと相関するかどうかを判定することである。本明細書に記載される結果は（図８Ｂ）、全ての痩せ型の肝臓試料が、全ての肥満試料のものよりも低いｐ−ＣａＭＫＩＩレベルを有することを示し、肥満および痩せ型の肝臓に対する計画したｎ＝２０のサンプルサイズは、痩せ型と肥満とに由来する標本間で、ｐ−ＣａＭＫＩＩのレベルに統計的有意差を示す、９５％を上回る検出力を有するはずである（Ｐ＜０．０５）。ｐ−ＣａＭＫＩＩとインスリン耐性との間、ならびにｐ−ＣａＭＫＩＩとＣＨＯＰおよびＳｏｒｔの発現との間の関係については、２０個の肥満肝臓試料は、０．６の相関係数が統計的に有意であることを見出す、８０％の検出力を提供する。さらなる研究は、機構的研究、例えば、前節におけるＦｏｘＯと関連するものによって、導かれる。
肝臓ＭφにおけるＣａＭＫＩＩγは、肥満環境下でインスリン耐性ならびにグルコースおよび脂質代謝に役割を果たす。
肥満マウスにおけるＨＣは、ケモカインＣＣＬ２（ＭＣＰ−１）を発現し、これは、脂肪酸エステル化およびＴＧ蓄積に関与する遺伝子の転写を促進することによって、後に肝臓脂肪変性に重要な役割を果たすことになる新しい骨髄性細胞を誘引する（４５）。さらに、クッパー細胞を含む、活性化された肝臓のＭφは、パラクリン機序を通じてＨＣの脂肪酸酸化を抑制することができる（４４）。ＨＣ ＣａＭＫＩＩγは、新しいＭφの誘引に有益であり得るが、理論に束縛されることなく、ＭφのＣａＭＫＩＩγは、ＨＣの脂質代謝に対するＭφに媒介される効果において、重要な役割を果たし得る。具体的には、Ｍφが肥満の肝臓において暴露され得る飽和脂肪酸は、ＭφにおいてＵＰＲを活性化し、このＵＰＲ活性化は、Ｍφの炎症と関連する（７２、１１１）。この場合、ＭφにおいてＥＲストレスの媒介および増幅におけるＣａＭＫＩＩγの役割を考慮すると（図１６）、肝臓のＭφのＣａＭＫＩＩγは、肥満環境下において、ＨＣの脂質代謝およびインスリン耐性に重要な効果を有し得る。本明細書に記載のように、ＴＮＦαは、ＣａＭＫＩＩが阻害された肥満の肝臓において減少し（図１０Ｄ）、ＣａＭＫＩＩγ欠損は、Ｍφの炎症の減少と関連する（５３、５４）。ＬｙｓＭＣｒｅマウスをＡ１ａｔ−Ｃｒｅマウスを使用して、同様のＤＩＯ研究を行う。ＭφのＣａＭＫＩＩγ欠損が、肥満環境下で、脂肪変性を含む代謝パラメータを改善する場合、機序を試験する。基本概念は、ＥＲストレスに誘発されるＭφの炎症が、より低くなり得ることであり、そのためＬＣＭ−ＲＴ−ＱＰＣＲによって肝臓のＭφのＵＰＲおよびサイトカインｍＲＮＡを、アッセイする。理論的には、例えば、ＣａＭＫＩＩγ欠損が、単球ケモカイン受容体発現を減少させた場合、肝臓Ｍφの数の減少もまた存在し得る。したがって、肝臓のＭφ含量を、Ｍφ ＩＨＣを使用して定量化する。さらなる機構的研究は、このデータによって誘起される。例えば、ＰＰＡＲδ活性化は、肥満環境下にある肝臓のＭφにおいて緩和プロセスであるという根拠があり（４４）、これは、異なる群のマウスに由来する肝臓のＭφにおけるＣａＭＫＩＩ、ＥＲストレス、炎症、およびＰＰＡＲδ経路の間の関連性を調べる実験を促す。
肝臓ＣａＭＫＩＩγに関連するアテローム性動脈硬化症研究。
肝臓ＣａＭＫＩＩγ欠損は、脂質異常症および場合によっては他のパラメータ、例えば、炎症、循環ＦＦＡ、高インスリン血症の動脈壁効果、および高血糖を改善することによって、インスリン耐性環境下でアテローム性動脈硬化症を軽減する。Ｌｄｌｒ−／−マウスに西洋食（ＷＤ）を与えることが、アテローム発生リポタンパク質表現型に必要である。Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンドで、脂肪含量がＤＩＯ食よりも少し低いだけであるＷＤを与え、インスリン耐性１３５、および図２０に示されるように、肝臓のＣａＭＫＩＩγのリン酸化をもたらす。このモデルを評価するために、マウスを繁殖させて次の２つの群を得る：Ｃａｍｋ２ｇｆｌ／ｆｌＬｄｌｒ−／−（ＬＤＬＲＫＯ）およびＣａｍｋ２ｇｆｌ／ｆｌＡ１ａｔｃｒｅ＋／−Ｌｄｌｒ−／−（Ｌｉ−ＣＫ ＬＤＬＲ ＤＫＯ）。ＷＤを与えて８、１２、１６、および２０週間後に、代謝パラメータ、血漿、および炎症サイトカイン、ならびにＦＦＡをアッセイする。８週間のＷＤは、このモデルにおいてインスリン耐性を発達させるのに十分な時間である（１３５）。これらの因子によって悪化され得る病変エンドポイントに注目する。病変の開始については、内皮活性化（例えば、アセチルコリン依存性血管拡張、ＶＣＡＭ−１発現、ｐ−ｅＮＯＳ、ＲＯＳ、および内皮への単球接着）、ならびにＭφの蓄積をアッセイする。これらは、脂質異常症（１３６）、高血糖（１３７）、ならびに増加したＦＦＡおよびインスリン耐性の内皮への効果（１３０、１３８、１３９）と関連しているプロセスである。プラーク進行については、炎症性サイトカイン発現を、プラーク細胞、特にＭφ２８飽和ＦＡおよびインスリン耐性によって引き起こされ得るＭφのアポトーシス（７２、７３）、肥満における飽和ＦＡ（１４０）によって悪化され得る貪食除去の欠損、糖尿病の脂質異常症と関連している進行したプラークにおけるプラーク内出血（１４１）においてアッセイする。
肝臓ＭφにおけるＣａＭＫＩＩγの不在は、インスリン感受性ならびにグルコースおよび脂質代謝を改善し得る。この事例において、ＬｙｓＭＣｒｅモデルは、アテローム性動脈硬化症の改善のための２つの機序を有し得る。したがって、ＭφおよびＨＣの両方のＣａＭＫＩＩγの欠損が、アテローム性動脈硬化症の全ての段階に対して著しい保護効果を有するかどうかを試験する。この目的で、２つの追加の群を、Ｌｉ−ＣＫ ＬＤＬＲ ＤＫＯマウスにＣａｍｋ２ｇｆｌ／ｆｌＬｙｓｍｃｒｅ＋／−マウスと対比して、ＷＴに由来する骨髄を移植した、本明細書に記載の研究に追加する。これを、アテローム性動脈硬化症および代謝の全ての態様を試験することによって評価する。
表３
マウスモデルの概要およびエンドポイントに対する予測：
Figure 2014531425
ＫＯモデルに関しては、アデノ−Ｔ２８７Ｄ−ＣａＭＫＩＩ→ＤＩＯ／Ｌｉ−ＣＫ ＫＯ群の組み込みを通じて、対照を追加する。ＦｏｘＯ１ Ｓｅｒ２８４／２９５のリン酸化が、ＣａＭＫＩＩの代謝効果の媒介に関与しない場合、１４−３−３部位との相互作用等、ＦｏｘＯ１局在化に関与する核の移入／移出機構に影響を及ぼすもの（１４２）、および肝臓のインスリン受容体シグナル伝達経路に対するＣａＭＫＩＩγの可能性のある効果に関連するものを含む、パラメータを調査する。Ｓｅｒ２８４／２９５リン酸化が重要である場合、今後の研究は、（ａ）ＣａＭＫＩＩγが、直接関与するか、またはそれがこの目的で別のキナーゼを誘発するかどうか（１４３）、ならびに（ｂ）これらの部位の欠損リン酸化が、どのようにしてＦｏｘＯ１の核の移出を促進し得るかについて調査する。ＦｏｘＯ１−Ｓ２８４／２９３Ａマウスを作出して、肝臓のグルコースおよび脂質の代謝におけるこれらのｐ−Ｓｅｒ残基の役割を研究する。ＣａＭＫＩＩγ欠損環境下で、ＥＲストレスの緩和は、急性インスリンに対するＨＣの応答を改善し得る。例えば、ＥＲストレスの抑制は、ＩＲＳ１のＳｅｒ２０７リン酸化を減少させ、これが、インスリンシグナル伝達を改善する（３４）。
実施例８：ＣａＭＫＩＩを通じたカルシウムシグナル伝達は、絶食時および肥満における肝臓のグルコース生成を調節する
肝臓のグルコース生成（ＨＧＰ）は、グルコース恒常性に非常に重要であるが、根本的な機序は、完全に解明されていない。本明細書において、カルシウム感知酵素であるＣａＭＫＩＩが、カルシウムおよびＩＰ３Ｒに依存する様式で、初代ＨＣにおいてはｃＡＭＰおよびグルカゴンによって、インビボではグルカゴンおよび絶食によって活性化されることを示す。ＣａＭＫＩＩの遺伝的欠損または阻害は、そのリン酸化に影響を及ぼすことによってＦｏｘＯ１の核転座を遮断し、絶食およびグルカゴン／ｃＡＭＰに誘発されるグリコーゲン分解およびグルコース新生を損傷し、血中グルコースレベルを低下させるが、構造的に活性なＣａＭＫＩＩは、逆の効果を有する。重要なことに、ＣａＭＫＩＩ欠損がグルコース代謝に及ぼす抑制効果は、構造的に核内のＦｏｘＯ１の形質導入によって無効となり、ＣａＭＫＩＩ欠損の効果が、ＦｏｘＯ１の核排除を必要とすることを示す。この同じ経路はまた、肥満環境下での過剰なＨＧＰにも関与する。これらの結果は、ＦｏｘＯ１の核局在化および肝臓のグルコース恒常性に関与する、カルシウム媒介性シグナル伝達経路を明らかにする。
重要な部分には、次のものが含まれる：
・絶食およびグルカゴンは、ＰＫＡ−ＩＰ３Ｒ１−Ｃａ２＋ｉに依存する様式で肝臓のＣａＭＫＩＩを活性化する
・ＣａＭＫＩＩは、絶食／グルカゴンに誘発される肝臓のグルコース生成（ＨＧＰ）を促進する
・ＣａＭＫＩＩは、ＣａＭＫＩＩに媒介されるＨＧＰの刺激に必要な核内ＦｏｘＯ１を促進する。
・ＣａＭＫＩＩ−ＦｏｘＯ１経路はまた、肥満環境下での過剰なＨＧＰにも関与する。
肝臓は、栄養枯渇条件下において、正常血糖値の維持を担う主要な器官である。絶食の初期段階では、肝臓は、グリコーゲン貯蔵を使用してグルコースを動員する（Ｒａｄｚｉｕｋ ａｎｄ Ｐｙｅ，２００１）。絶食が進行するにつれて、非炭水化物前駆体からのグルコースのデノボ合成、すなわちグルコース新生は、肝臓のグルコース生成（ＨＧＰ）に対する主要な寄与因子となる（Ｌｉｎ ａｎｄ Ａｃｃｉｌｉ，２０１１）。これらの変化は、直接的なホルモンシグナル伝達に応答して急速に生じる。さらに、インスリンおよびグルカゴンの両方が、グルコース新生およびグリコーゲン分解の両方に関与するグルコース−６−ホスファターゼ（Ｇ６ｐｃ）、ならびにこれもまたＨＧＰを調節するホスホエノールピルビン酸キナーゼ（Ｐｃｋ１）の転写に影響を及ぼす（Ｐｉｌｋｉｓ ａｎｄ Ｇｒａｎｎｅｒ，１９９２、Ｂｕｒｇｅｓｓ ｅｔ ａｌ．，２００７）。絶食時に、ＦｏｘＯ（１、３、および４）ならびにＣｒｃｔ２等、「グルコース生成」転写因子の細胞内局在性の変化は、これらの遺伝子の発現を活性化する（Ｌｉｎ ａｎｄ Ａｃｃｉｌｉ，２０１１）。さらに、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体−γ活性化補助因子−１α（ＰＧＣ−１α）およびＣＢＰ等、異なる活性化補助因子は、ＣＲＥＢ、肝臓核因子４α（ＨＮＦ４α）、Ｓｉｒｔ１、および時計遺伝子を含む、ｃＡＭＰ応答の構成要素と相互作用し、グルコース新生遺伝子の転写の増加をもたらすと考えられる（Ｈａｌｌ ｅｔ ａｌ．，１９９５、Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，２００７、Ｐｕｉｇｓｅｒｖｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００３、Ｒｈｅｅ ｅｔ ａｌ．，２００３）。絶食時のＨＧＰ刺激におけるその役割に加えて、過剰なグルカゴンシグナル伝達は、２型糖尿病における高血糖に重要な役割を果たすと見られる（Ｓｏｒｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００６、Ｕｎｇｅｒ ａｎｄ Ｃｈｅｒｒｉｎｇｔｏｎ，２０１２、Ｓａｌｔｉｅｌ，２００１）。
グルカゴンが、ＨＧＰを刺激するために、一般にはＨＧＰ転写因子、および具体的にはＦｏｘＯ１の核転座を刺激する、細胞内シグナル形質導入経路は、よくわかっていない。この状況において、細胞内カルシウム（Ｃａ２＋ ｉ）をグルコース新生の調節と関連付けた先行報告は、興味深い（Ｆｒｉｅｄｍａｎｎ ａｎｄ Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ，１９７０、Ｋｒａｕｓ−Ｆｒｉｅｄｍａｎｎ ａｎｄ Ｆｅｎｇ，１９９６、Ｍａｒｑｕｅｓ−ｄａ−Ｓｉｌｖａ ｅｔ ａｌ．，１９９７）。例えば、グルカゴンおよびｃＡＭＰは、Ｃａ２＋ ｉを増加させることが可能であり、Ｃａ２＋ ｉのキレーションは、グルカゴンに誘発されるＨＧＰ遺伝子の発現およびグルコース生成を低減させることがしめされている（Ｂｙｇｒａｖｅ ａｎｄ Ｂｅｎｅｄｅｔｔｉ，１９９３、Ｓｔａｄｄｏｎ ａｎｄ Ｈａｎｓｆｏｒｄ，１９８９、Ｍｉｎｅ ｅｔ ａｌ．，１９９３）。Ｃａ２＋ ｉと肝臓のグルコース代謝とを関連付ける分子機序を提供しなかったこれらの先行研究に基づいて、理論に束縛されるものではないが、Ｃａ２＋ ｉ感知酵素ＣａＭＫＩＩの役割が関係する。
カルシウムカルモジュリン依存性キナーゼＩＩ（ＣａＭＫＩＩ）は、細胞内のＣａ２＋ ｉシグナル伝達の重要な媒介因子であるセリン−スレオニンキナーゼである（Ｃｏｕｃｈｏｎｎａｌ ａｎｄ Ａｎｄｅｒｓｏｎ，２００８、Ｓｉｎｇｅｒ，２０１１）。４つのＣａＭＫＩＩアイソフォーム、α、β、γ、およびδがあり、それぞれ、別個の遺伝子によってコードされる。αおよびβアイソフォームは、ほとんどがニューロンのものであるが、ＣａＭＫＩＩγおよびδは、広範な種類の組織で発現する。カルシウム／カルモジュリン複合体に結合した後、Ｔｈｒ２８７における自己リン酸化は、カルシウム／カルモジュリン非依存性活性をもたらす（Ｃｏｕｃｈｏｎｎａｌ ａｎｄ Ａｎｄｅｒｓｏｎ，２００８、Ｓｉｎｇｅｒ，２０１１）。ＣａＭＫＩＩについてのほとんどの研究は、ニューロンおよび心筋細胞において行われたものであり、他の組織におけるＣａＭＫＩＩについての理解は限られたものしかなく、グルコース代謝に関連するものこれまでにない。本研究において、ＣａＭＫＩＩ活性が、ｃＡＭＰおよびグルカゴンによって、また、インビボでは絶食に応じて、増加することを示す。ＣａＭＫＩＩが、グリコーゲン分解およびグルコース新生の調節に重要な役割を果たすことをさらに実証する。具体的には、ＣａＭＫＩＩが、インビトロおよびインビボにおいて、２つの重要な酵素であるＧ６ｐｃおよびＰｃｋ１の発現を調節する様式で、ＦｏｘＯ１の核局在化に重大な効果を有するという根拠を提供する。最後に、この同じ経路が、肥満環境下での過剰なＨＧＰに関与することを示す根拠を提示する。
結果
グルカゴンおよび絶食は、ＩＰ３ＲおよびＣａ ２＋ ｉ に依存する様式で、肝臓のＣａＭＫＩＩを活性化する
グルカゴンは、肝細胞（ＨＣ）において細胞内カルシウム（Ｃａ２＋ ｉ）を増加させることがで示されており（Ｓｔａｄｄｏｎ ａｎｄ Ｈａｎｓｆｏｒｄ，１９８９）、これが最近検証された（Ｙ．Ｗａｎｇ、Ｇ．Ｌｉ、Ｊ．Ｇｏｏｄｅ、Ｊ．Ｃ．Ｐａｚ、Ｒ．Ｓｃｒｅａｔｏｎ、Ｗ．Ｈ．Ｆｉｓｃｈｅｒ、Ｉ．Ｔａｂａｓ、およびＭ．Ｍｏｎｔｍｉｎｙ、公開のために原稿を提出）。グルカゴンがＣａ２＋ ｉ感知酵素であるＣａＭＫＩＩを活性化するかどうかを判定するために、初代マウスＨＣを、種々の期間、グルカゴンで処置し、次いで、ＣａＭＫＩＩの酵素活性およびその活性化状態の尺度であるＴｈｒ２８７におけるＣａＭＫＩＩのリン酸化についてアッセイした（Ｃｏｕｃｈｏｎｎａｌ ａｎｄ Ａｎｄｅｒｓｏｎ，２００８、Ｓｉｎｇｅｒ，２０１１）。両方のアッセイの結果は、ＣａＭＫＩＩ活性が、グルカゴン処置の時間の関数として増加することを示す（図１Ａ〜Ｂ）。サイトゾルカルシウムキレート化剤である１，２−ビス［２−アミノフェノキシ］エタン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸テトラキス［アセトキシメチルエステル］（ＢＡＰＴＡ−ＡＭ）を使用して、ＣａＭＫＩＩ活性化に対するＣａ２＋ ｉの役割を判定し、ＢＡＰＴＡ−ＡＭが、グルカゴンに誘発されるＣａＭＫＩＩのリン酸化を著しく減少させたことが見出された（図１Ｃ）。
小胞体（ＥＲ）に位置するイノシトール１，４，５−三リン酸塩受容体（ＩＰ３Ｒ）チャネルは、ＩＰ３結合に応答して、Ｃａ２＋を放出し、細胞内Ｃａ２＋ ｉ恒常性に重要な役割を果たす。さらなる研究により、グルカゴンに誘発されるＰＫＡが、リン酸化し、ＩＰ３Ｒの活性を増加させ、Ｃａ２＋ ｉの増加をもたらすことが明らかとなった（Ｙ．Ｗａｎｇ、Ｇ．Ｌｉ、Ｊ．Ｇｏｏｄｅ、Ｊ．Ｃ．Ｐａｚ、Ｒ．Ｓｃｒｅａｔｏｎ、Ｗ．Ｈ．Ｆｉｓｃｈｅｒ、Ｉ．Ｔａｂａｓ、およびＭ．Ｍｏｎｔｍｉｎｙ、公開のために原稿を提出）。グルカゴンはまた、ホスホリパーゼＣに媒介されるＩＰ３の放出を誘発することが示されている（Ｈａｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９８）。グルカゴンに誘発されるＣａＭＫＩＩの活性化におけるＩＰ３Ｒの寄与を調査するために、ＩＰ３Ｒ阻害剤であるゼストスポンジンＣと、相補的アプローチとして、Ｉｐ３ｒ１ｆｌ／ｆｌマウスに由来するアデノ−Ｃｒｅ処置ＨＣとを使用した。ゼストスポンジンＣ処置およびＣｒｅに媒介されるＩＰ３Ｒ１の欠失のいずれも、グルカゴンに誘発されるＣａＭＫＩＩリン酸化に有意な減少をもたらし、このプロセスにおけるＩＰ３Ｒの重要な役割を示した（図１Ｄ）。
Ｃａ２＋ ｉの増加に関与するものを含む、グルカゴン受容体シグナル伝達は（Ｓｔａｄｄｏｎ ａｎｄ Ｈａｎｓｆｏｒｄ，１９８９）、アデニル酸シクラーゼの活性化によって媒介されて、ｃＡＭＰを生成し、続いて、ＨＧＰに関与する重要な酵素であるタンパク質キナーゼＡ（ＰＫＡ）が活性化される。これに関連して、８−ブロモ−ｃＡＭＰでのＨＣの処置は、グルカゴンの効果を模倣し、リン酸化ＣａＭＫＩＩの著しい増加をもたらしたことがわかった（図１Ｅ）。さらに、ＨＣを、グルカゴンの添加前にＰＫＡ阻害剤Ｈ８９で処置した場合、グルカゴンに媒介されるリン酸化ＣａＭＫＩＩの増加は、著しく阻害された（図１Ｆ）。これらのデータは、グルカゴン−ｃＡＭＰ−ＰＫＡシグナル伝達が、ＣａＭＫＩＩのリン酸化／活性化を、ＩＰ３Ｒに媒介される細胞内Ｃａ２＋放出に対するその効果を通じて促進する、経路の存在を裏付ける。
ＣａＭＫＩＩが、インビボにおいてグルカゴンによって調節されるかどうかを試験するために、マウスに、グルカゴンの腹腔内（ｉ．ｐ．）ボーラスでチャレンジを行った。培養ＨＣで観察された効果と一致して、肝臓ＣａＭＫＩＩのリン酸化が、グルカゴン処置によって誘発された（図１Ｇ）。１μｇ ｋｇ−１程度に低いグルカゴンの用量が、肝臓でＣａＭＫＩＩをリン酸化することができたことが見出された（図２８Ａ）。ＩＰ３Ｒが、グルカゴンに媒介されるＣａＭＫＩＩリン酸化の調節に重要であるというインビボでの根拠を得るために、マウスに、４日間、腹腔内ゼストスポンジンＣで処置を行った。マウスを、次いで、グルカゴンでチャレンジし、肝臓抽出物をｐ−ＣａＭＫＩＩについてアッセイした。図１Ｈに示されるように、ゼストスポンジンＣでの処置は、グルカゴンに誘発されるＣａＭＫＩＩリン酸化を著しく低減させた。次に、肝臓ＣａＭＫＩＩのリン酸化を、血漿グルカゴンを上昇させることが知られている、給餌状態から絶食状態への移行中に比較した（Ｌｉｎ ａｎｄ Ａｃｃｉｌｉ，２０１１）（図２８Ｂ）。データは、肝臓のＣａＭＫＩＩリン酸化が、絶食時に有意に増加されたが、ＣａＭＫＩＩの全体量は、栄養状態によって影響を受けないと見られたことを示す（図１Ｉ）。さらに、再補給時に、肝臓のｐ−ＣａＭＫＩＩのレベルは、低下した（図１Ｊ）。グルカゴン処置のように、絶食に誘発されるＣａＭＫＩＩのリン酸化は、マウスのゼストスポンジンＣ処置によって抑制された（図２８Ｃ）。これらのデータは、肝臓ＣａＭＫＩＩの活性は、絶食に誘発されるＨＧＰにおける潜在的役割と一致する方式で、栄養状態によって調節されることを示す。
ＣａＭＫＩＩは、初代ＨＣにおいてグルコース生成を促進する
ＣａＭＫＩＩγは、ＨＣにおける主要なＣａＭＫＩＩアイソフォームであり、他のアイソフォームは、γアイソフォームを欠くＨＣにおいては誘発されない（図２２Ａ）。インビボにおけるグルカゴンおよび絶食による肝臓ＣａＭＫＩＩ活性の調節を考慮して、グルコース生成について、ＷＴおよびＣａｍｋ２ｇ−／−マウスに由来するＨＣにおいてアッセイした。細胞を、基礎条件下で、ならびにホルスコリン、グルカゴン模倣剤、および強力なアデニル酸シクラーゼ活性化剤での刺激後に試験した（Ｈａｒａｎｏ ｅｔ ａｌ．，１９８５）。データは、基礎およびホルスコリン誘発の両方のグルコース生成が、ＣａＭＫＩＩγ欠損ＨＣにおいて抑制されたことを示す（図２２Ｂ）。次に、グルコース生成を、アデノウイルスを発現する構造的に活性なＣａＭＫＩＩ（アデノ−ＣＡ−ＣａＭＫＩＩ）、「キナーゼデッド」優性阻害ＣａＭＫＩＩ（アデノ−ＫＤ−ＣａＭＫＩＩ）（Ｐｆｌｅｉｄｅｒｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００４）、またはＬａｃＺ対照を形質導入した、ＷＴＨＣにおいて試験した。ＣＡ−ＣａＭＫＩＩは、アミノ酸置換Ｔ２８７Ｄを有し、これは、Ｔ２８７における自己リン酸化を模倣し、結合型カルシウム／カルモジュリンの不在下で自律性活性をもたらすが、ＫＤ−ＣａＭＫＩＩは、キナーゼドメインに無効化突然変異を有する（Ｐｆｌｅｉｄｅｒｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００４）。基礎およびホルスコリン誘発の両方のグルコース放出における増加が、アデノ−ＣＡ−ＣａＭＫＩＩを形質導入した細胞において観察された（図２２Ｃおよび２８Ｄ）。ＣａＭＫＩＩ活性に約４０％の減少をもたらした（図２８Ｅ）アデノ−ＫＤ−ＣａＭＫＩＩを形質導入したＨＣは、ホルスコリンに誘発されるグルコース生成の減少を示した（図２２Ｃ）。
ＨＧＰに対するＣａＭＫＩＩの役割が、ＨＧＰ、グルコース−６−ホスファターゼ、およびホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼを調節する酵素をコードする２つの遺伝子に対する転写効果を調査するように促した。このため、Ｇ６ｐｃおよびＰｃｋ１ ｍＲＮＡのレベルを、上述のモデルにおいてアッセイした（図２２Ｄ〜Ｅ）。全ての事例において、ノックアウトまたはＫＤ−ＣａＭＫＩＩに誘発されるＣａＭＫＩＩの阻害は、ホルスコリンまたはグルカゴンに誘発される遺伝子の発現を低下させたが、一方でＣＡ−ＣａＭＫＩＩは遺伝子の発現を増加させた。ホルスコリンまたはグルカゴンの不在下で、ＷＴ ＨＣにおけるＧ６ｐｃおよびＰｃｋ１ ｍＲＮＡの発現レベルは、ホルモン処置したＷＴ ＨＣにおけるものよりもはるかに低かったが、これらの条件下ですら、ＣａＭＫＩＩγ欠損は、遺伝子発現の低下をもたらした（図２８Ｆ）。さらに、アデノ−ＫＤ−ＣａＭＫＩＩは、ＣａＭＫＩＩγを欠くＨＣにおいて、ホルスコリンに誘発されるＧ６ｐｃ ｍＲＮＡの低いが検出可能なレベルを減少させることはなく（図２８Ｇ）、図２２ＥにおけるＫＤ−ＣａＭＫＩＩがＧ６ｐｃに及ぼす抑制効果は、ＣａＭＫＩＩ阻害に起因するという前提と一致した。
要約すると、ＣａＭＫＩＩの欠損および阻害のデータは、グルコース生成およびＰｃｋ１／Ｇ６ｐｃ遺伝子発現における内因性ＣａＭＫＩＩの重要性を示すが、ＣＡ−ＣａＭＫＩＩでのデータは、酵素が高レベルで発現される場合、それが、ホルモンの不在下でこれらのプロセスを強制するか、またはホルモンの存在下でそれらを増加させ得ることを示す。
インビボでの肝臓のグルコース生成は、ＣａＭＫＩＩγ欠損によって損傷され、構造的に活性なＣａＭＫＩＩによって刺激される
インビボでの肝臓のグルコース代謝におけるＣａＭＫＩＩの機能的役割を評価するために、絶食時血中グルコースレベルを、ＷＴおよびＣａｍｋ２ｇ−／−マウスにおいて試験した。インビトロでのデータと一致して、中程度だが統計的に有意な血中グルコースレベルの減少が、絶食させたＣａｍｋ２ｇ−／−とＷＴマウスとの対比において観察された（図２３Ａ）。絶食時グルコース濃度における差異は、ＷＴマウスと対比したノックアウトマウスにおける循環インスリンの増加またはグルカゴン濃度の減少とは関連しなかった（図２９Ａ、左）。突然変異マウスはまた、ピルビン酸チャレンジ試験に応答して、より低い血漿グルコースを示した（図２３Ｂ）。初代ＨＣのデータと一致して、絶食時Ｃａｍｋ２ｇ−／−マウスの肝臓において、Ｇ６ｐｃおよびＰｃｋ１ ｍＲＮＡレベルの減少が見られた（図２３Ｃ）。類似のデータが、グルカゴンで処置したマウスにおいて得られた（図２３Ｄ）。
これらのデータと一致して、肝臓ＣａＭＫＩＩ活性を約４５％阻害した（図２９Ｂ）アデノ−ＫＤ−ＣａＭＫＩＩでのＣ５７ＢＬ／６マウスの処置は、絶食時血中グルコースを減少させた（図２３Ｅ）。上述のように、血漿グルカゴンおよびインスリンに、対照群と実験群との間で差はなかった（図２９Ａ、右）。血中グルコースデータと一致して、Ｇ６ｐｃおよびＰｃｋ１ ｍＲＮＡの肝臓での発現は、ＫＤ−ＣａＭＫＩＩを注射したマウスにおいて低かった（図２３Ｆ）。ＣａＭＫＩＩ阻害が、主要なグリコーゲン分解酵素であるグルコース−６−ホスファターゼのためのｍＲＮＡのレベルを低下させるため、急性および慢性ＣａＭＫＩＩ阻害が肝臓グリコーゲン含量に及ぼす効果を試験し、グリコーゲンの別の指標として、過ヨウ素酸シッフ（ＰＡＳ）陽性細胞もまた試験した。データは、アデノ−ＫＤ−ＣａＭＫＩＩまたはＣａＭＫＩＩ遺伝子の標的化が、絶食マウスの肝臓グリコーゲンを増加させることを示す（図２３Ｇ）。
次に、構造的に活性な肝臓ＣａＭＫＩＩの効果を、マウスをアデノ−ＣＡ−ＣＡＭＫＩＩで処置することによって、マウスにおいて試験した。ＣＡ−ＣａＭＫＩＩ群は、ピルビン酸塩チャレンジ後に血中グルコースレベルが上昇し、肝臓Ｇ６ｐｃおよびＰｃｋ１ ｍＲＮＡレベルが増加し、肝臓グリコーゲン含量が増加した（図２９Ｃ〜Ｅ）。ＣＡ−ＣａＭＫＩＩの投与は、血漿グルカゴンもインスリンも変化させなかった。これらの総合したインビボデータは、ＣａＭＫＩＩが、血漿グルコースレベル、グルコースへのピルビン酸塩変換、および肝臓のグルコース代謝遺伝子の発現に影響を及ぼすことを示す。
ＣａＭＫＩＩは、ＦｏｘＯ１の核局在化を促進する
ＨＧＰに関与する主要な転写因子は、ＦｏｘＯ１であり、これは、主に、細胞質と核との間のその局在化における変化によって調節される（Ａｃｃｉｌｉ ａｎｄ Ａｒｄｅｎ，２００４）。Ｃａｍｋ２ｇ−／−マウスと対比してＷＴマウスから単離したＨＣに形質導入した、ＧＦＰタグＦｏｘＯ１の分布についてアッセイした。血清飢餓条件下では、ＧＦＰ−ＦｏｘＯ１の大半が、ＷＴＨＣの核内に存在したが、一方でＣａｍｋ２ｇ−／−ＨＣは、主にＧＦＰ−ＦｏｘＯ１のサイトゾル局在化を示した（図２４Ａ）。さらに、ＨＣにアデノ−ＣＡ−ＣａＭＫＩＩを形質導入した場合、ＦｏｘＯ１は、核内が優勢となったが、アデノ−ＫＤ−ＣａＭＫＩＩは、ほとんど細胞質のＦｏｘＯ１をもたらした（図２４Ｂ）。核内ＦｏｘＯ１は、本明細書で使用される「基礎」細胞培養条件下で培養されたＨＣにおいて実質的であり、そのためＣＡ−ＣａＭＫＩＩの倍増が制限されたことに留意した。基礎核内ＦｏｘＯ１は、したがって、インスリンとの短時間のインキュベートによって低下し、これによって、ＣＡ−ＣａＭＫＩＩでの核内ＦｏｘＯ１の著しい増加が明らかとなった（図２４Ｃ）。この実感は、高レベルの全ＣａＭＫＩＩタンパク質発現を用いて行われたが（図２８Ｄを参照されたい）、低いＭＯＩのＣＡ−ＣａＭＫＩＩを使用した類似の実験は、内在性ＣａＭＫＩＩと類似する全ＣａＭＫＩＩタンパク質のレベルで、核内ＦｏｘＯ１の増加を示した（図３０Ａ）。インビボでの関連性を示すために、ＣａＭＫＩＩγ欠損または阻害の効果を、絶食マウスにおいて試験した。肝臓における核内ＦｏｘＯ１は、絶食条件下において顕著であり（図２４Ｄ、上のブロット）、それは、Ｃａｍｋ２ｇ−／−マウスまたはアデノ−ＫＤ−ＣａＭＫＩＩを形質導入したマウスにおいて、著しく低下した（図２４Ｄ、中央の２つのブロット）。給餌は、核内ＦｏｘＯ１を低下させ、核内ＦｏｘＯ１は、これらの条件下において、ＣＡ−ＣａＭＫＩＩおよびグルカゴンの両方によって増加された（図２４Ｄ、下のブロット）。
初代肝細胞におけるＧ６ｐｃ ｍＲＮＡのｃＡＭＰ媒介性誘発は、Ｆｏｘｏ１ ｓｈＲＮＡによって５０％を上回って抑制され、内在性環境におけるＦｏｘＯ１の重要な役割を示す（Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，２００７）。これらのデータと一致して、ヒトＧ６ＰＣプロモーターの下流におけるルシフェラーゼの誘発は、３つのコンセンサスＦｏｘＯ結合部位が突然変異した場合に、鈍くなったことがわかった（Ａｙａｌａ ｅｔ ａｌ．，１９９９、ｖｏｎ Ｇｒｏｏｔｅ−Ｂｉｄｌｉｎｇｍａｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００３）（図３０Ｂ）。しかしながら、この肝癌細胞系−レポーター構築物実験は、ｃＡＭＰとデキサメタゾンとの効果を区別せず、内在性環境を正確に反映することができない。例えば、本明細書におけるレポーター誘発は、初代肝細胞における実際のＧ６ｐｃ ｍＲＮＡ誘発よりもかなり弱く（Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，２００７）、識別されたプロモーター要素は、調節が必要な唯一の部位ではない可能性がある。したがって、ＣａＭＫＩＩに媒介されるＧ６ｐｃ発現におけるＦｏｘＯ１の機能的重要性を評価する手段として、このモデルをさらに追及するのではなく、初代肝細胞において、および最も重要なことには、インビボでの内在性Ｇ６ｐｃの誘発について研究した。開始として、ＣＡ−ＣａＭＫＩＩが、ＷＴと肝臓のＦｏｘＯ１を欠くＬ−Ｆｏｘｏ１ＫＯマウスとに由来するＨＣにおいてＧ６ｐｃを誘発する能力を、比較した（Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，２００７）。先行研究と一致して（Ｐｕｉｇｓｅｒｖｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００３、Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，２００７）、ホルスコリンに誘発されるＧ６ｐｃの発現は、ＦｏｘＯ１の不在下で抑制された（図２５Ａ、右のグラフ）。最も重要なことには、ＣＡ−ＣａＭＫＩＩによるＧ６ｐｃ ｍＲＮＡ発現の増加は、ＦｏｘＯ１の欠損によって著しく鈍化した。ホルスコリンの不在下において、遺伝子の発現は、予測した通りにかなり低かったが（図２５Ａ、左のグラフ；Ｙ軸の目盛りに注意）、この場合ですら、ＣＡ−ＣａＭＫＩＩに誘発される遺伝子発現は、ほぼ完全にＦｏｘＯ１に依存性であった。最後に、ＨＧＰ、ＣＲＥＢ、およびＣｒｔｃ２に関与する２つの他の転写因子の核局在化が、欠損のＣａＭＫＩＩの阻害によって減少しなかったという事実が、実証された（図３０Ｃ〜Ｄ）。これらの総合的なデータは、ＣａＭＫＩＩがＦｏｘＯ１の核局在化を促進し、次いでＧ６ｐｃの誘発をもたらすモデルと一致する。
ＣａＭＫＩＩ欠損または阻害によるＨＧＰの損傷におけるＦｏｘＯ１の重要性をさらに検証するために、Ｃａｍｋ２ｇ−／−マウスに由来するＨＣに、リン酸化が欠損した構造的に核内のＦｏｘＯ１突然変異体を含有するアデノウイルスを形質導入した（ＦｏｘＯ１−ＡＤＡ）（Ｎａｋａｅ ｅｔ ａｌ．，２００１）。ＣａＭＫＩＩγ欠損がホルスコリンに誘発されるＧ６ｐｃおよびＰｃｋ１ ｍＲＮＡの発現に及ぼす抑制効果は、アデノ−ＦｏｘＯ１−ＡＤＡの形質導入によって無効化されたことが観察された（図２５Ｂ）。ここで使用したＦｏｘＯ１−ＡＤＡのレベルは、ホルスコリンで処置したＷＴ ＨＣにおいてＧ６ｐｃまたはＰｃｋ１を増加させないために十分に低いものであり、Ｃａｍｋ２ｇ−／−＋ＡＤＡ群における核内ＦｏｘＯ１のレベルは、ＷＴ＋ＬａｃＺ群における内在性レベルと類似であった（挿入図、図２５Ｂ）。図２５ＢにおけるＰｃｋ１の結果、ならびに図２２〜２３におけるものは、ＦｏｘＯ１の生殖細胞系ノックダウンが、Ｐｃｋ１誘発に影響を及ぼさないという所見を考慮すると、興味深い（Ｎａｋａｅ ｅｔ ａｌ．，２００２、Ｂａｒｔｈｅｌ ｅｔ ａｌ．，２００１）。しかしながら、ＦｏｘＯ１のより急なサイレンシングは、Ｐｃｋ１を確かに抑制し（Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，２００７）、ＣａＭＫＩＩの操作もまた、その環境により類似であり得る。ＨＧＰ遺伝子発現に対するＦｏｘＯ１−ＡＤＡの効果と一致して、アデノ−ＦｏｘＯ１−ＡＤＡアデノウイルスでのマウスの処置は、アデノ−ＫＤ−ＣａＭＫＩＩ処置マウスにおけるグルコース恒常性の損傷を回復させた（図２５Ｃ〜Ｅ）。この結果は、ＡＤＡ群におけるアデノ−ＫＤの不完全な形質導入によって説明することができないことに留意されたい（挿入図、図２５Ｅ）。総合すると、これらの結果は、ＣａＭＫＩＩがＦｏｘＯ１の核局在化の促進を通じてＨＧＰに寄与するモデルと一致する。
ＣａＭＫＩＩγに媒介されるＦｏｘＯ１核局在化における非ＡＫＴ−リン酸化ＦｏｘＯ１部位およびｐ３８ ＭＡＰキナーゼの役割
インスリン／Ａｋｔは、Ｔ２４、Ｓ２５３、およびＳ３１６（マウス残基）のリン酸化を通じてＦｏｘＯ１の核排除を促進する（Ｂｒｕｎｅｔ ｅｔ ａｌ．，１９９９）。ＣａＭＫＩＩはキナーゼであるが、ホスファターゼを活性化し、それによって、これらの部位におけるリン酸化を間接的に減少させることによって、ＦｏｘＯ１の核局在化を促進することができる。しかしながら、これらの３つの部位のリン酸化は、Ｃａｍｋ２ｇ−／−マウス由来の肝臓においては変化しなかったことがわかった（図３１Ａ）。これもまたＨＣにおけるＦｏｘＯ１の局在化および活性に影響を及ぼす（Ａｃｃｉｌｉ ａｎｄ Ａｒｄｅｎ，２００４）、ＦｏｘＯ１のアセチル化もまた、ＣａＭＫＩＩ欠損による影響を受けなかった（図３１Ｂ）。
ＦｏｘＯ１はまた、ｐ３８ ＭＡＰキナーゼ等の他のキナーゼによって、他のＳｅｒ／Ｔｈｒ残基でリン酸化され得（Ａｓａｄａ ｅｔ ａｌ．，２００７）、これらのリン酸化イベントは、ＦｏｘＯ１の核排除ではなく局在化を促進し得る。非Ａｋｔ部位のリン酸化におけるＣａＭＫＩＩの可能性のある役割を評価するために、図２４Ａに示されるモデル、すなわち、これもまたＦＬＡＧタグを有する、ＧＦＰ−ＦｏｘＯ１を形質導入した血清飢餓させたＷＴおよびＣａｍｋ２ｇ−／−（ＫＯ）ＨＣを使用した。ＦｏｘＯ１に、抗ＦＬＡＧを使用して免疫精製を行い、続いて、ＭａｃＣｏｓｓらによって開発されたトリプルプロテアーゼプロトコルを使用して、低減、アルキル化、およびタンパク質分解を行った（ＭａｃＣｏｓｓ ｅｔ ａｌ．，２００２）。リン酸化されたペプチドを、ＴｉＯ２クロマトグラフィーによって強化し、次いで、ＭＳに基づくショットガンプロテオーム法を使用するＬＣ−ＭＳ／ＭＳ（Ｃａｎｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，２００７）、およびスペクトル計数による無標識定量化（Ｃａｎｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，２００７）によって分析した。ＦｏｘＯ１タンパク質を、約７０％の配列対象範囲で識別し、ＷＴについては５７個のリンペプチド、およびＫＯ試料については６３個のリンペプチドを識別した（ｈｔｔｐ：／／ｆｉｅｌｄｓ．ｓｃｒｉｐｐｓ．ｅｄｕ／ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ／ｆｏｘｏ１＿Ｔａｂａｓ＿２０１２／の表Ｓ１およびＳ２、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。ペプチドの偽発見率（ＦＤＲ）は、１パーセント未満であった。全ての識別されたリンペプチドが、高い信頼性を有するように、厳しい選択基準を使用した。
これらの基準は、リンペプチド分析ツールＤｅｂｕｎｋｅｒおよびＡｓｃｏｒｅ（Ｌｕ ｅｔ ａｌ．，２００７、Ｂｅａｕｓｏｌｅｉｌ ｅｔ ａｌ．，２００６）を使用したさらなる検証とともに、次の１１個のリン酸化部位の識別を可能にした：Ｓ２８４、Ｓ２９５、Ｓ３２６、Ｓ４６７、Ｓ４７５、Ｔ２４、Ｓ２４６、Ｓ２５３、Ｓ４１３、Ｓ４１５、およびＴ５５３（マウスＦｏｘＯ１配列については図３１Ｃを参照されたい）。図２６Ａは、ＫＯおよびＷＴ試料からのこれらの１１個のＦｏｘＯ１リンペプチドのそれぞれのスペクトル計数、Ｄｅｂｕｎｋｅｒスコア、Ａｓｃｏｒｅを示す。ほとんどのリン酸化部位は、ＤｅｂｕｎｋｅｒおよびＡｓｃｏｒｅについて、それぞれ、０．５および１２の高信頼性カットオフ値をはるかに上回る。ＤｅｂｕｎｋｅｒまたはＡスコアの値をわずかに下回った５つの部位には手動検証を行い、それらの注釈つきタンデム質量分析は、ＫＯペプチド４および５については図３２Ｄ〜Ｅに、ＷＴペプチド７、１０、および１１については前述のウェブサイトに示す。リン酸部位の特徴的なｂおよび／またはｙイオンは、全て識別された。これらのペプチドのアミノ酸配列の性質のため、より低いスコアは、少量のフラグメントイオンまたはリン酸の中間消失の欠如のためである可能性が高い。
ＫＯおよびＷＴ試料の合計スペクトル計数が１０を上回るペプチドについてのみ計算したＫＯ：ＷＴのスペクトル計数比を使用して、識別されたリン酸化ペプチドの相対的発現の測定値を得た。この分析によって、Ｓ２９５、Ｓ４６７、Ｓ４７５（ペプチド２、４、および５）のリン酸化のみが、０．５未満のカットオフ値に基づいて、ＫＯにおいて有意に低く、ＫＯとＷＴのスペクトル計数比が、それぞれ、０．４５、０．３８、および０．５であった。ｐ−Ｓ２４６を含有するペプチドは、合計スペクトル計数が７であり、したがって、１０を上回るという事前に指定された基準に満たなかったが、ＫＯとＷＴとの対比では、より低い傾向を見せた（２対５、０．４）。対照的に、Ｓ３２６（ペプチド３）は、１．６５の比率を有し、ＫＯとＷＴとの対比において、上方調節を示した。
ＫＯではより低い部位のいくつかに対する機能の初期試験として、Ｓｅｒ２９５および４７５、ならびにＳｅｒ２４６を含む、７つのＳｅｒ残基（７Ａ−ＦｏｘＯ１）にＳ−Ａ突然変異を有するＦｏｘＯ１をコードする入手可能なプラスミドを使用した（Ａｓａｄａ ｅｔ ａｌ．，２００７）。類似のレベルでＦｏｘｏ１−／−ＨＣにトランスフェクトすると、７Ａ−ＦｏｘＯ１は、グルカゴンに応答して、ＷＴ ＦｏｘＯ１よりも著しく低い核局在化を示したが、細胞質ＦｏｘＯ１は、突然変異ＦｏｘＯ１をトランスフェクトした細胞において、より高かった（図２６Ｂ）。７Ａと同じ７つのＳ−Ａ突然変異に加えて、Ｓ３２６およびＳ４６７に２つの追加的Ｓ−Ａ突然変異を有した構築物（突然変異９Ａ）もまた、試験した（Ａｓａｄａ ｅｔ ａｌ．，２００７）。この突然変異は、同様の欠損した核局在化を示した（図３１Ｆ）。さらに、アデノ−ＣＡ−ＣａＭＫＩＩの形質導入は、図２４Ｄのデータと一致して、核内ＷＴ−ＦｏｘＯ１を増加させたが、ＣＡ−ＣａＭＫＩＩは、核内７Ａ−ＦｏｘＯ１を増加させなかった（図２６Ｃ）。これらの総合したデータは、ＣａＭＫＩＩが、その核局在化を促進する様式で、ＦｏｘＯ１におけるある特定のＳｅｒ残基を直接的または間接的に改変するモデルと一致する。
Ａｓａｄａら（Ａｓａｄａ ｅｔ ａｌ．，２００７）は、上流ｐ３８キナーゼＭＫＫ６をトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞において、Ｓｅｒ２８４、２９５、４６７、および４７５を含む、複数の部位でのＦｏｘＯ１のリン酸化の根拠を見出した。ｐ３８は、ＨＧＰの刺激に関係しており（Ｃａｏ ｅｔ ａｌ．，２００５）、ＣａＭＫＩＩは、ニューロンにおいて研究した際、ｐ３８を活性化することができるため（Ｂｌａｎｑｕｅｔ，２０００）、ＨＧＰに関与する、ＣａＭＫＩＩからｐ３８、そしてＦｏｘＯ１へのリン酸化／核局在化経路を考慮した。ｐ３８が、絶食マウスの肝臓においてリン酸化されたこと（これは、その活性化の尺度である）（図３２Ａ）、および高親和性競合的阻害剤ＳＢ２０２１９０によるｐ３８の阻害が、グルカゴンに刺激されたＨＣにおいてＧ６ｐｃおよびＰｃｋ１の発現を遮断したこと（図３２Ｂ、左）を、まず確認した。阻害剤データは、アデノ−Ｃｒｅを形質導入した、Ｐ３８ａｆｌ／ｆｌマウスの肝臓から単離したＨＣを使用して確認した（図３２Ｂ、右）。ＣａＭＫＩＩとｐ３８との間の可能性のある関連性を試験するために、ＷＴおよびＣａｍｋ２ｇ−／−マウスに由来する血清飢餓させたＨＣを、比較し、ＣａＭＫＩＩγ欠損ＨＣにおいてリン酸化ｐ３８の顕著な減少が見られた（図３２Ｃ）。次いで、ｐ３８が、インビボで肝臓のＦｏｘＯ１核局在化に関与したかどうかを、ＳＢ２０２１９０で処置した絶食マウスをビヒクル対照と対比して比較することによって、判定した。各群の７匹のマウスの中で、ｐ３８活性を反映するｐ３８キナーゼ標的であるｐ−ＭＫ２の基礎レベル、およびＳＢ２０２１９０によるＭＫ２リン酸化阻害のレベルの両方に、ある程度の変動性が存在した。したがって、全１４匹のマウスの核内ＦｏｘＯ１を、ｐ−ＭＫ２の関数としてプロットした。データは、ｐ３８阻害の関数として、すなわち、より低いｐ−ＭＫ２によって示されるように、マウスにおける核内ＦｏｘＯ１の明らかな減少を示す（図３２Ｄ）。さらに、ｐ３８阻害剤は、グルカゴンで処置されたＨＣにおいて核内ＧＦＰ−ＦｏｘＯ１を減少させた（図３２Ｅ）。これらの総合したデータは、ＣａＭＫＩＩがｐ３８活性化を通じてＦｏｘＯ１核局在化を促進するモデルと一致する。ｐ３８が、ＦｏｘＯ１における前述のＳｅｒ残基を直接リン酸化することによってＣａＭＫＩＩに誘発されるＦｏｘＯ１核局在化に機能を果たすかどうかは（Ａｓａｄａ ｅｔ ａｌ．，２００７）、まだ判定されていない。
肥満の肝臓のグルコース代謝におけるＣａＭＫＩＩの役割
部分的にグルカゴンとインスリンとのシグナル伝達の不均衡に起因する、ＨＧＰの上昇は、肥満における絶食時高血糖および他のインスリン耐性状態に寄与する（Ｓｏｒｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００６、Ｕｎｇｅｒ ａｎｄ Ｃｈｅｒｒｉｎｇｔｏｎ，２０１２、Ｓａｌｔｉｅｌ，２００１）。肥満環境下で肝臓のグルコース代謝におけるＣａＭＫＩＩγの役割を試験するために、肝臓ＣａＭＫＩＩγ活性化の根拠を、肥満の２つのマウスモデルにおいて探求した。ｐ−ＣａＭＫＩＩのレベルは、２０週間、高脂肪高カロリー食で飼育した（食餌誘発型肥満、ＤＩＯ）ｏｂ／ｏｂマウスおよびＷＴマウスの両方の肝臓において著しく高かったが、全ＣａＭＫＩＩは高くなかったことがわかった（図２７Ａ）。肥満の肝臓における抗ｐ−ＣａＭＫＩＩおよび抗ＣａＭＫＩＩの両方に対する抗体特異性は、肥満Ｃａｍｋ２ｇ−／−マウスにおける免疫ブロットバンドの不在によって示される。次に、機能的重要性を、アデノ−ＫＤ−ＣａＭＫＩＩとアデノ−ＬａｃＺ対照とを形質導入したｏｂ／ｏｂマウスにおいて、絶食時血漿グルコースおよび肝臓ＦｏｘＯ１標的遺伝子発現を比較することによって試験した。アデノ−ＫＤ−ＣａＭＫＩＩで処置したマウスは、より低い絶食時グルコース、ピルビン酸塩チャレンジ後のより低い血中グルコース、ならびにＧ６ｐｃおよびＰｃｋ１を含む、３つのＦｏｘＯ１標的遺伝子のより低い発現（図２７Ｂ〜Ｄ）を有した。これらの変化は、アデノ−ＫＤ−ＣａＭＫＩＩ処置マウスにおける、より高い血漿インスリンとも低い体重とも関連しなかった。したがって、肝臓ＣａＭＫＩＩは、肥満マウスの肝臓において活性化され、肝臓のグルコース代謝およびＦｏｘＯ１標的遺伝子の発現を調節する。
考察
この報告の中のデータは、次のように要約することが可能な経路の一部として、カルシウムに媒介されるＨＧＰの調節の根拠を提供する：グルカゴン／絶食→ｃＡＭＰ／ＰＫＡ→ＩＰ３Ｒ１→Ｃａ２＋ Ｉ→ＣａＭＫＩＩ→核内ＦｏｘＯ１→ＨＧＰ。ＣａＭＫＩＩはまた、肥満マウスにおけるＨＧＰの上昇を媒介し（図２７）、この分野ではさらなる研究が必要ではあるが、ここでの誘起力もまたグルカゴンである可能性がある（Ｓｏｒｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００６、Ｕｎｇｅｒ ａｎｄ Ｃｈｅｒｒｉｎｇｔｏｎ，２０１２、Ｓａｌｔｉｅｌ，２００１）。このように、本所見は、ＨＧＰに関連する３つの基本領域に関連性を有する：グルカゴンおよび絶食、ならびに肥満／インスリン耐性がＨＧＰを刺激する分子機序、細胞内カルシウムとＨＧＰとの間の分子的関連性、ＦｏｘＯ１の核移送の調節。インスリン／ＡＫＴに媒介されるＦｏｘＯ１のリン酸化、ならびにＦｏｘＯ１のアセチル化が、どのようにＦｏｘＯ１の核排除を促進するかについて、多数の報告がなされているにもかかわらず（Ｌｉｎ ａｎｄ Ａｃｃｉｌｉ，２０１１、ｖａｎ ｄｅｒ Ｈｏｒｓｔ ａｎｄ Ｂｕｒｇｅｒｉｎｇ，２００７）、インスリンの不在下、またはインスリン耐性環境下において発生するＦｏｘＯ１の核内移入の調節にほとんど重視されていなかったため、後者の問題が特に興味深い。
ＣａＭＫＩＩ経路は、ｃＡＭＰ／ＰＫＡの下流にあるため、必然的にＨＧＰを刺激する他のグルカゴン−ＰＫＡ経路を補完する。これまでに、本明細書のデータは、これらの他の経路が、ＣａＭＫＩＩの下流にあるのではなく、ＣａＭＫＩＩ経路と平行に発生することを示している。例えば、グルカゴン−ＰＫＡは、ｃＡＭＰ応答配列結合（ＣＲＥＢ）タンパク質を直接リン酸化し、これは、ＦｏｘＯ１の転写補助因子ＰＧＣ１αを転写的に誘発するが（Ｈｅｒｚｉｇ ｅｔ ａｌ．，２００１）、アデノ−ＬａｃＺとＫＤ−ＣａＭＫＩＩマウスとに由来する肝臓において核内ＣＲＥＢに差異はなかった（図３０Ｂ）。これは、ＣａＭＫＩＩが、ある特定の環境下でＣＲＥＢを活性化／リン酸化し得るという、ニューロンおよびＲＡＮＫＬ処置ＲＡＷ２６４．７細胞におけるインビトロデータがあるため、重要な発見であった（Ｄａｓｈ ｅｔ ａｌ．，１９９１、Ｓｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９１、Ａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００７）．また、ＣａＭＫＩＩ欠損が、ＨＧＰに関与する別の転写活性化因子である核内Ｃｒｔｃ２に影響を及ぼさなかったことも見出された（図３０Ｃ）。これらのデータは、肝臓内のＣａＭＫＩＩが、これらの他の経路と平行して機能し、これらは、一緒になって、適正なアレイの転写因子の核局在化をもたらし、ＨＧＰを媒介することを示す。グルカゴン／ＰＫＡに媒介されるＩＰ３Ｒ活性化およびＥＲカルシウム放出が、別のカルシウム感知酵素、カルシニューリンを介してＣｒｔｃ２の核局在化ｗｐ促進するため、Ｃｒｔｃ２での事例が特に興味深い。実際に、ＣａＭＫＩＩおよびカルシニューリンの阻害は、ホルスコリンに誘発されるＧ６ｐｃ ｍＲＮＡを抑制することに関して、付加的であることがわかった。したがって、共通の近位シグナル伝達経路は、異なる遠位機序によって、２つの重要なＨＧＰ転写因子であるＣｒｔｃ２およびＦｏｘＯ１の協調的移入をもたらした。この点に関して、細胞膜を通じてカルシウム移入を促進する薬物がＨＣ中のＰｃｋ１ ｍＲＮＡを実際に減少させたことを示す先行研究に言及することは興味深く（Ｖａｌｅｒａ ｅｔ ａｌ．，１９９３）、これは、細胞質内へのカルシウムの移入の経路が、下流イベントを決定する因子であることを示し得る。
ＦｏｘＯ１は、Ａｋｔを介してインスリン／成長因子によって、Ｔｈｒ２４、Ｓｅｒ２５３、およびＳｅｒ３１６（マウス配列番号）においてリン酸化され、その核排除を促進する。ＣａＭＫＩＩは、ＦｏｘＯ１の核局在化を促進するが、理論に束縛されることなく、ＣａＭＫＩＩは、これらの部位を脱リン酸化するホスファターゼを活性化し得る。しかしながら、ＣａＭＫＩＩγの欠損は、これらの３つの残基のリン酸化に影響を及ぼさず、また、ＦｏｘＯ１のアセチル化にも影響を及ぼさなかった（図３１Ａ〜Ｂ）。それどころか、ＣａＭＫＩＩがＦｏｘＯ１上のＳｅｒ残基のリン酸化を媒介する証拠が見出されており、Ｓｅｒ−Ａｌａ ＦｏｘＯ１突然変異実験は、この作用が、ＣａＭＫＩＩに媒介されるＦｏｘＯ１の核局在化に役割を果たすことを示す。
ＣａＭＫＩＩとＦｏｘＯ１リン酸化との関連性は、直接的または間接的であり得る。間接的な機序、すなわち、ＣａＭＫＩＩが別のキナーゼを活性化することによるものは、他のキナーゼが、非Ａｋｔ部位上のＦｏｘＯを、それらの核保持を促進する方式で、リン酸化し得るという先行所見に関連し得る（Ｅｓｓｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，２００４、Ｃｈｉａｃｃｈｉｅｒａ ａｎｄ Ｓｉｍｏｎｅ，２０１０）。本明細書のｐ３８阻害剤および遺伝子標的化のデータ、ならびにＡｓａｄａらの研究（Ａｓａｄａ ｅｔ ａｌ．，２００７）に基づいて、理論に束縛されるものではなく、ｐ３８ ＭＡＰＫもまた、この機能を実行することが可能であり得、実際に、ＣａＭＫＩＩに誘発されるＦｏｘＯ１の核局在化の媒介因子であり得る。ＣａＭＫＩＩとｐ３８との間、およびｐ３８とＨＧＰとの間の関連性についての報告が、これを支持する（Ｃａｏ ｅｔ ａｌ．，２００５、Ｂｌａｎｑｕｅｔ，２０００）。ｐ３８がリン酸化し、それによって、ＦｏｘＯ１を活性化するという直接的な証拠は依然として存在しないが、グルココルチコイドがラット心筋細胞においてＦｏｘＯ１の核局在化を促進する能力は、核内ｐ３８の活性化／リン酸化と相関し、免疫蛍光顕微鏡検査法およびＩＰ／免疫ブロットのデータは、ｐ−Ｐ３８およびＦｏｘＯ１が、互いに相互作用し得ることを示した（Ｐｕｔｈａｎｖｅｅｔｉｌ ｅｔ ａｌ．，２０１０）。興味深いことに、ＦｏｘＯ１が、ＨＣにおいてｐ３８を活性化することが可能であり得るという証拠があり（Ｎａｉｍｉ ｅｔ ａｌ．，２００７）、そのため、ＦｏｘＯ１−ｐ３８フィードフォワード経路が、ＦｏｘＯ１の核局在化に及ぼす本明細書に示されるＣａＭＫＩＩ−ｐ３８経路の効果を増幅させ得ることは、可能である。しかしながら、ｐ３８の役割を確立し、ＣａＭＫＩＩがＦｏｘＯ１の核局在化を促進する機序をさらに解明するには、さらなる作業が必要である。
ＨＧＰにおけるカルシウム−ＣａＭＫＩＩの役割の発見は、絶食時低血糖に対する生理学的防御についての見識を提供するだけでなく、図２７のデータによって示されるように、インスリン耐性環境下で生じるグルコース代謝異常のための治療標的を明らかにすることも可能である。実際に、２型糖尿病において、不均衡なＨＧＰおよびグルカゴンとインスリンのシグナル伝達の不均衡は、絶食時高血糖に寄与する（Ｓｏｒｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００６、Ｓａｌｔｉｅｌ，２００１）。さらに、グルカゴンシグナル伝達はまた、１型糖尿病に関連している（Ｕｎｇｅｒ ａｎｄ Ｃｈｅｒｒｉｎｇｔｏｎ，２０１２）。これに関して、今後の研究では、肥満、インスリン耐性、および糖尿病における肝臓ＣａＭＫＩＩγの病態生理学的役割（複数可）および機序にさらに取り組み、それによって、これらの障害の治療標的としてのその可能性を評価する。
実験手順
ＣａＭＫＩＩ活性の測定
ＣａＭＫＩＩ活性を、ＰｒｏｍｅｇａからのＣａＭＫＩＩアッセイキットを使用して、製造業者の説明書に従ってアッセイした。ＨＣを、図の凡例に示されるように処置した後、それらを、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｎａピロリン酸塩、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ ＥＧＴＡ、１ｍＭ Ｎａ３ＶＯ４、５０ｍＭ ＮａＦ、１ｍＭ ＰＭＳＦ、および５μgｍｌ−１ロイペプチン中、１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００への５分間の暴露によって、溶解した。次に、［γ−３２Ｐ］ＡＴＰおよびビオチニル化したＣａＭＫＩＩペプチド基質を、溶解物または免疫沈降複合体に添加した（以下を参照されたい）。３０℃で１０分間のインキュベーション後、［３２Ｐ］−リン酸化基質を、ＳＡＭビオチン捕捉膜を使用して残留［３２Ｐ］ＡＴＰから分離し、シンチレーション計数器を使用して定量化した。アッセイを、カルモジュリンありまたはなしで実行し、カルモジュリンの不在下での活性値を、カルモジュリンの存在下で得られたものから差し引いた。
初代ＨＣにおけるグルコース生成
グルコース生成アッセイを、記載されるように実行した（Ｙｏｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００１）。簡単に言うと、初代マウスＨＣを、上述のように摘出して培養し、細胞培養培地を、２０ｍＭ乳酸ナトリウムおよび２ｍＭピルビン酸ナトリウムを補充した、グルコースおよびフェノール不含のＤＭＥＭ（ｐＨ７．４）に置き換えた。１６時間の培養後、５００μｌの培地を収集し、グルコース含量を比色分析グルコースアッセイキット（Ａｂｃａｍ）を使用して測定した。次いで、読み取り値を、全細胞溶解物中の総タンパク質量に対して正規化した。
マウス実験
Ｃａｍｋ２ｇ−／−マウスを、既述のように生成し（Ｂａｃｋｓ ｅｔ ａｌ．，２０１０）、Ｃ５７ＢＬ６／Ｊバックグラウンドと交配した。ｏｂ／ｏｂマウスを、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓから入手した。図２７の実験のために、マウスに、標準的な通常食または６０％のｋｃａｌが脂肪分である高脂肪食を与え、１２時間の明暗サイクルで維持した。組み換えアデノウイルス（１．５×１０９プラーク形成単位／マウス）を、尾静脈注射によって送達し、５日後に実験を開始した。絶食時血中グルコースを、水を自由に与え、１２〜１４時間絶食させたマウスにおいて、グルコース計を使用して測定した（Ｏｎｅ Ｔｏｕｃｈ Ｕｌｔｒａ，Ｌｉｆｅｓｃａｎ）。ピルビン酸塩寛容性試験を、１７時間の絶食後、２ｇｋｇ−１（体重）のピルビン酸塩の腹腔内注射により、実行した。血中グルコースレベルを、その後２時間にわたり測定した。ゼストスポンジンＣを、１０ｐｍｏｌ ｇ−１の用量で、１日１回４日間、腹腔内注射によってマウスに投与した。Ｐ３８ａｆｌ／ｆｌマウスを、既述のように生成した（Ｅｎｇｅｌ ｅｔ ａｌ．，２００５）。
肝臓グリコーゲンの測定
５０〜１００ｍｇの凍結肝臓を、プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤とともに、１ｍｌのＨ２Ｏ中に均質化させた。試料を、次いで、ＫＯＨと混合し（１：２）、２５分間煮沸し、７０％エタノールで洗浄した。ペレットを乾燥させ、１００μｌ Ｈ２Ｏ中に溶解し、グリコーゲン含量を、グリコーゲンアッセイキット（Ａｂｃａｍ）を製造業者の説明に従って使用して評価した。データは、標準±標準誤差を表す。
マウス肝臓切片のＰＡＳ染色
肝臓試料を、１０％の中性緩衝ホルマリン中に２４時間固定し、パラフィン中に埋め込んだ。切片（５ミクロン）を、製造業者の説明書に従って過ヨウ素酸シッフ（ＰＡＳ）染料（Ｓｉｇｍａ）を使用して、グリコーゲンについて染色した。切片を、次いで、ヘマトキシリンで対比染色し、光学顕微鏡によって試験した。ＰＡＳ染色の定量化については、４つの異なる切片から５つの領域を無作為に選択し、ＰＡＳ陽性細胞の数を計数し、全細胞数のパーセンテージとして表した（Ｈａｍｍａｄ ｅｔ ａｌ．，１９８２）。試料の固有性が盲検化された２人の独立した研究員が、分析を行った。
質量分析データの分析
タンパク質およびリンペプチドの識別、定量化、およびリン分析を、ＰｒｏＬｕＣＩＤ、ＤＴＡＳｅｌｅｃｔ２、Ｃｅｎｓｕｓ、ＤｅＢｕｎｋｅｒ、およびＡｓｃｏｒｅを使用して、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ Ｐｉｐｅｌｉｎｅ−ＩＰ２（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ．ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ．ｃｏｍ／）により行った。スペクトルの未加工ファイルを、ＲａｗＥｘｔｒａｃｔ１．９．９（ｈｔｔｐ：／／ｆｉｅｌｄｓ．ｓｃｒｉｐｐｓ．ｅｄｕ／ｄｏｗｎｌｏａｄｓ．ｐｈｐ）を使用して、未加工ファイルから、ｍｓ１およびｍｓ２ファイルに抽出し（ＭｃＤｏｎａｌｄ ｅｔ ａｌ．，２００４）、タンデム質量スペクトルを、ＥＢＩ ＩＰＩマウスタンパク質データベース（２０１０年３月２４日にリリースされたｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ＩＰＩ／ＩＰＩｍｏｕｓｅ．ｈｔｍｌ）に対して検索した。ペプチドの確率および偽陽性率を正確に推測するために、標的データベースに全てのタンパク質の逆配列を含むデコイデータベースを追加したものを使用した（Ｐｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００３）。タンデム質量スペクトルを、ペプチド質量許容差５０ｐｐｍでＰｒｏＬｕＣＩＤ（Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，２００６）アルゴリズムを使用して、配列と整合した。ＰｒｏＬｕＣＩＤ検索を、Ｌｉｎｕｘオペレーティングシステム下で起動するＩｎｔｅｌ Ｘｅｏｎクラスタ上で行った。検索範囲には、質量許容差枠内に含まれる全ての完全および半トリプシンペプチド候補が含まれた。システインのカルバミドメチル化（＋５７．０２１４６Ｄａ）は固定修飾と見なしたが、セリン、スレオニン、およびチロシンにおけるリン酸化（＋７９．９６６３）は、可変修飾と見なした。
ペプチド／スペクトル一致（ＰＳＭ）の有効性を、ＳＥＱＵＥＳＴ（Ｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９４）の定義された２つのパラメータ、相互相関スコア（ＸＣｏｒｒ）、および相互相関スコアの正規化された差（ＤｅｌｔａＣＮ）を使用して、ＤＴＡＳｅｌｅｃｔ（Ｔａｂｂ ｅｔ ａｌ．，２００２、Ｃｏｃｉｏｒｖａ ｅｔ ａｌ．，２００７）において評価した。検索結果を、電荷状態（＋１、＋２、＋３、および＋３を上回る）、ならびにトリプシン状態（完全トリプシン、半トリプシン、および非トリプシン）によって分類し、１２の異なる亜群がもたらされた。これらの亜群のそれぞれ１つにおいて、（ａ）直接および（ｂ）デコイデータベースのＰＳＭについてＸｃｏｒｒ、ＤｅｌｔａＣＮ、およびＤｅｌｔａＭａｓｓ値の分布を得、次いで、直接およびデコイのサブセットを、判別分析によって分離した。直接およびデコイＰＳＭサブセットの完全な分離は、一般的に可能ではなく、そのため、ペプチド一致確率は、直接およびデコイのスコア分布の非パラメータ適合に基づいて計算した。９９．５％のペプチド信頼性を、最小閾値として設定し、デルタ質量が１０ｐｐｍ未満であるリンペプチドのみを許容した。偽陽性率を、９９．５％の信頼性閾値を満たした全てのＰＳＭ中の逆デコイＰＳＭの割合として計算した。この最後の選別ステップの後に、タンパク質およびペプチドの両方の偽陽性率が、いずれも０．１％を下回ったことが推定される。データベース検索およびＤＴＡＳｅｌｅｃｔ２フィルタリングの後、リンペプチドを、Ａｓｃｏｒｅ（Ｂｅａｕｓｏｌｅｉｌ ｅｔ ａｌ．，２００６）およびＤｅｂｕｎｋｅｒ（Ｌｕ ｅｔ ａｌ．，２００７）を使用するＩＰ２リン酸分析ツールによって分析した。ペプチドおよびリンペプチドを、スペクトル計数法（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，２００４）を使用して定量化した。
統計学的分析
全ての結果は、平均±標準誤差として表す。Ｐ値は、正規分布データについてはスチューデントのｔ検定を使用して、および非正規分布データについてはマンホイットニーの順位和検定を使用して、計算した。
補助的実験手順
試薬および抗体
グルカゴン、ピルビン酸塩、ホルスコリン、Ｈ８９、８−ブロモ−ｃＡＭＰ、およびＳＢ２０２１９０を、Ｓｉｇｍａから入手した。ＢＡＰＴＡ−ＡＭおよび抗ヌクレオホスミン（Ｎｐ）抗体は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手した。ゼストスポンジンＣは、ＥＭＤ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓから入手した。抗リン酸−Ｔｈｒ２８７ ＣａＭＫＩＩ抗体は、Ｉｍｇｅｎｅｘ ａｎｄ Ｎｏｖｕｓから入手し、抗完全ＣａＭＫＩＩ、抗ＦｏｘＯ１、および抗Ａｃ−ＦｏｘＯ１抗体は、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃから入手した。抗β−アクチンおよび抗リン酸−Ｓ３１６ ＦｏｘＯ１抗体は、Ａｂｃａｍから入手した。抗リン酸ｐ３８、抗リン酸ＭＫ２、抗リン酸ＣＲＥＢ、抗ｐ３８、抗ＭＫ２、抗ＣＲＥＢ、抗リン酸Ｔ２４ ＦｏｘＯ１、抗リン酸Ｓ２５３ ＦｏｘＯ１、抗ＨＡ、および抗ＦＬＡＧ抗体は、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇから入手した。抗ＣＲＴＣ２抗体は、Ｍａｒｃ Ｍｏｎｔｍｉｎｙ博士から贈与された。ＬａｃＺ、ＣＡ−ＣａＭＫＩＩ、ＫＤ−ＣａＭＫＩＩ、ＧＦＰ−ＦｏｘＯ１、およびＣｒｅをコードするアデノウイルスは、以前に説明されており（Ｐｆｌｅｉｄｅｒｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００４、Ｔａｎａｋａ ｅｔ ａｌ．，２００９、Ａｋａｇｉ ｅｔ ａｌ．，１９９７）、Ｖｉｒａｑｕｅｓｔ，Ｉｎｃ．（Ｎｏｒｔｈ Ｌｉｂｅｒｔｙ，ＩＡ）によって増幅された。ＦｏｘＯ１突然変異体７Ａおよび９Ａをコードするプラスミドを、記載のように構築した（Ａｓａｄａ ｅｔ ａｌ．，２００７）。
初代肝細胞
初代マウスＨＣを、既述のように８〜１２週齢のマウスから単離した（Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，２００２）。ほとんどの実験については、ＨＣを、０．５％ウシ胎児血清を含有する培地中でインキュベートすることによって一晩血清枯渇させ、次いで、血清不含培地中で５時間インキュベートし、図の凡例に記載される個々の処置を行った。播種１２時間後に、ＨＣに、アデノウイルス構築物を形質導入し、形質導入の２４時間後に実験を行った。ＷＴ、７Ａおよび９Ａ−Ｆｏｘｏ１でのトランスフェクションを、ｊｅｔＰＥＩ（商標）−肝細胞ＤＮＡトランスフェクション試薬（Ｐｏｌｙｐｌｕｓ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ，Ｉｎｃ．）を製造業者に説明書に従って使用して実行した。
免疫沈降
細胞を、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｎａピロリン酸塩、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ ＥＧＴＡ、１ｍＭ Ｎａ３ＶＯ４、５０ｍＭ ＮａＦ、１ｍＭ ＰＭＳＦ、および５μｇ／ｍｌのロイペプチン中、１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘへの５分間の暴露によって溶解した。溶解物（５００μｇのタンパク質）を、０．３〜０．６μｇの抗体および８０μｌのセファロースビーズを含有する溶解緩衝液で、総体積１ｍｌにした。混合物を、４℃で１４時間、１．５ｍｌの微量遠心管中で回転させた。免疫複合体を、１６，０００ｇでの遠心分離によって収集し、冷蔵溶解緩衝液で３回洗浄した。
Ｉｐ３ｒ１ ｆｌｏｘ マウスの生成
Ｉｐ３ｒ１ｆｌｏｘマウス系を、次のように作出した：標的構築物を、Ｃ５７Ｂｌ／６Ｊマウス由来のＩＰ３Ｒ１のエクソン１〜９を包含する、染色体６のフラグメントを含有するＢＡＣクローンＲＰ２４−２４５Ｈ１６（ＣＨＯＲＩ）を用いて、組み換え工学によって生成した（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，２００３、Ｗａｒｍｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００５）。プラスミドｐＬ４５１、ｐＬ４５２、およびｐＬ２５３は、Ｎｅａｌ Ｃｏｐｅｌａｎｄ博士（ＮＣＩ、ＮＩＨ）から好意により提供された。簡単に言うと、Ｆｒｔ−Ｎｅｏ−Ｆｒｔ−ｌｏｘＰカセット（プラスミドｐＬ４５１から）を、エクソン４（第２のコーディングエクソン）の上流に挿入し、次いで、Ｎｅｏカセットを、アガロースに誘発されるｆｌｐ組み換えによって除去した。第２および第３のｌｏｘＰ部位を、ｌｏｘＰ−Ｎｅｏ−ｌｏｘＰカセット（ベクターｐＬ４５２から）を挿入することによって、エクソン４の下流に導入した。最後に、チミジンキナーゼを含有するＤＴＡカセット（プラスミドｐＬ２５３から）を、第３のｌｏｘＰ部位のさらに下流に挿入した。全ての中間ＢＡＣ構築物および最終構築物を、ＰＣＲによってスクリーニングし、最終構築物に、Ａｃｃ６５Ｉ消化によって「フィンガープリント」を行って、ｌｏｘＰ機能性について試験した。重要な接合部位は、シークエンシングによって確認した。結果として得られた修飾されたＢＡＣを、キメラＥＳ細胞（１２９Ｓ６／ＳｖＥｖＴａｃマウス系由来のＣＳＬ３細胞系）に電気穿孔した。正しい組み換えＥＳ細胞を、Ｃ５７ＢＬ／６胚盤胞期のマウス胚に注射した。キメラ雄性マウスを、Ｃ５７ＢＬ／６雌性マウスに交配して、ハイブリッド系を確立した。生殖細胞系の移行によりＩｐ３ｒ１３ｘｆｌｏｘマウスを生成し、雌をＥＩＩａ−ｃｒｅの雄と交配して、ｌｏｘｐが導入されたカセットが排除されたＩｐ３ｒ１ｆｌｏｘマウスを作出した。これらのマウスを、続いて、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスと掛け合わせて、ＥＩＩａ−ｃｒｅ対立遺伝子を交配した。最終的なＩｐ３ｒ１ｆｌ／ｆｌ系を、ヘテロ接合交配を通じて誘導した。
免疫ブロットおよびＲＴ−ｑＰＣＲ
免疫ブロットおよびＲＴ−ｑＰＣＲアッセイを、既述のように実行した（Ｔｉｍｍｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，２００９）。全ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してＨＣから抽出した。ｃＤＮＡを、オリゴ（ｄＴ）およびＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、２μｇの全ＲＮＡから合成した。肝臓からの核抽出を、Ｐａｎｏｍｉｃｓからの核抽出キットを製造業者の説明書に従って使用して実行した。抗Ｔｈｒ２８７−ｐおよび全ＣａＭＫＩＩ免疫ブロットに関して、ＣａＭＫＩＩγ欠損ＨＣには存在しなかった２つの帯域および場合によっては３つの帯域が、常に見られた。それらの起源が、選択的スプライシングであるか、または転写後修飾であるかは、依然として判定されていない。
ＦｏｘＯ１リンペプチドの質量分析
ＷＴおよびＣａｍｋ２ｇ−／−マウスに由来するＨＣに、アデノ−ＦＬＡＧ−ＦｏｘＯ１を、２のＭＯＩで形質導入した。細胞を、一晩血清枯渇させ、次いで、血清不含培地で５時間インキュベートした。ＦｏｘＯ１を、抗ＦＬＡＧを使用して免疫精製した。氷冷トリス緩衝食塩水中のＦＬＡＧ−ＦｏｘＯ１を、体積１の試料溶液（低温）を体積１／３の１００％（ｗ／ｖ）ＴＣＡ（６．１Ｎ、Ｓｉｇｍａ）と混合することによって、沈降させた。氷上に３時間置いた後、試料を、４℃で３０分間遠心分離し、ペレットを乱すことのないように約５〜１０μｌを管内に残して、上清を吸引した。ペレットを、氷冷アセトンで２回洗浄した（各５００μｌ）。それぞれの洗浄後、溶液を、１０分間遠心分離した。最終ペレットを、次いで、１〜２分間、Ｓｐｅｅｄ−ｖａｃ上で乾燥させた。
ペプチドを、記載されるように、タンパク質分解によって生成した（Ｄｅｌａｈｕｎｔｙ ａｎｄ Ｙａｔｅｓ，ＩＩＩ，２００５、ＭａｃＣｏｓｓ ｅｔ ａｌ．，２００２）。ＴＣＡペレットを、８Ｍの尿素を含有するｐＨ８．５の１００ｍＭトリス−ＨＣｌ６０μｌ中に可溶化し、次いで、タンパク質を、５００ｍＭトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）の添加によって還元して、最終濃度５ｍＭにした。室温で２０分間のインキュベーションの後、システイン残基を、５００ｍＭヨード酢酸の添加によって、カルボキシメチル化して、最終濃度１０ｍＭを達成した。溶液を、暗所において室温で３０分間インキュベートし、次いで、３つの管に均等に分割した。管のうちの１つは、続いて、同量の１００ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．５の添加によって、尿素の濃度を２倍（４Ｍ）に希釈し、次いで、サブチリシン（Ｐｒｏｍｅｇａ）を、酵素：基質比（ｗｔ：ｗｔ）約１：１００で添加し、暗所において３７℃で４時間インキュベートした。他の２つの試料は、４倍（２Ｍ）に希釈し、エラスターゼおよびトリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ）を、酵素：基質比（ｗｔ：ｗｔ）約１：１００で添加し、次いで、両方の試料を、暗所において３７℃で一晩インキュベートした。３つの消化物から結果として得られたペプチドを、１つの管に合わせ、９０％ギ酸中に溶解して、１０％アセトニトリル中２％の最終濃度にした。試料は、ＴｉＯ２濃縮およびＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析まで−２０℃で保管した。
リンペプチドのＴｉＯ２濃縮を、Ｃａｎｔｉｎら（Ｃａｎｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，２００７）によって記載されるように行った。ＴｉＯ２カラムを、ＴｉＯ２（５μ ｐａｒｔｉｓｐｈｅｒｅ、Ｗｈａｔｍａｎ，Ｃｌｉｆｔｏｎ，ＮＪ）を溶融石英の毛細管（内径２５０μｍ）に長さ５ｃｍまで圧力によるスラリー充填を行うことによって作製し、ペプチド混合物を、カラムに圧力充填した。カラムを、緩衝液ＡおよびＢ（緩衝液組成物については次の節を参照されたい）で連続して洗浄し、次いで、リンペプチドを、２５０ｍＭ重炭酸アンモニウム（ｐＨ９）を使用して、末端にＫａｓｉｌでフリットが作製された内径１００μｍの、５ｃｍの５μｍ逆相が充填されたカラム（Ｇｅｍｉｎｉ Ｃ１８，Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ，Ｔｏｒｒａｎｃｅ，ＣＡ）に直接溶融し、これを、カラム床体積１５ｃｍの同じ逆相を有するプルドチップ（ｐｕｌｌｅｄ−ｔｉｐ）分析カラムに連結させた。この第２のカラムを、質量分析による分析のため、Ａｇｉｌｅｎｔ １２００クォータナリＨＰＬＣポンプ（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）に接続した。
使用したＨＰＬＣ緩衝溶液は、緩衝液Ａとして水／アセトニトリル／ギ酸（９５：５：０．１、ｖ／ｖ／ｖ）、および緩衝液Ｂとして水／アセトニトリル／ギ酸（２０：８０：０．１、ｖ／ｖ／ｖ）であった。溶出勾配は、次の通りである：１００％の緩衝液Ａが１０分間、勾配０から１５％の緩衝液Ｂが５分間、勾配１５から４５％の緩衝液Ｂが６５分間、勾配４５から１００％の緩衝液Ｂが１５分間、および１００％の緩衝液Ｂが５分間。データ依存性タンデム質量分析（ＭＳ／ＭＳ）による分析を、ＬＴＱ−Ｖｅｌｏｓ−Ｏｒｂｉｔｒａｐ質量分析計（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）で行った。ＬＣカラムから溶出されたペプチドを、遠位２．５ｋＶスプレー電圧の印加により、質量分析計に直接エレクトロスプレーした。１つの全スキャンＭＳスペクトル（ｍ／ｚ３００〜１８００）を１サイクル取得した後、３５％の正規化された衝突エネルギーで全ＭＳスペクトルから選択された、１番目から２０番目の最も強力なイオン上に順に生成される２０回のＭＳ／ＭＳイベントを取得した。マイクロスキャンの回数は、ＭＳおよびＭＳ／ＭＳスキャンの両方に対して１回であり、最大イオン注射時間は、それぞれ、２５および５０ミリ秒であった。使用した動的排除の設定は、次の通りであった：反復回数１、反復期間３０秒、排除リストサイズ５００、および排除期間１２０秒。ＭＳスキャン機能およびＨＰＬＣ溶媒勾配は、Ｘｃａｌｉｂｕｒデータシステム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）によって制御した。
Ｇ６ＰＣプロモータールシフェラーゼアッセイ
ＦＡＯ肝細胞に、ルシフェラーゼに融合したヒトＧ６ＰＣプロモーターヌクレオチドの−１２２７から＋５７をコードする構築物（−１２２７ＷＴ）、または突然変異した３つのコンセンサスＦｏｘＯ結合部位を有する同じ構築物（−１２２７Ｍｕｔ）：−１８７〜−１８３（ＧＴＴＴ→ＣＧＡＧ）、−１７１（Ｇ→Ｃ）、および−１６４（Ａ→Ｃ）をトランスフェクトし、Ｇ６ＰＣプロモーター中のコンセンサスＩＲＳ配列Ｔ（Ｇ／Ａ）ＴＴＴを破壊した（Ａｙａｌａ ｅｔ ａｌ．，１９９９、ｖｏｎ Ｇｒｏｏｔｅ−Ｂｉｄｌｉｎｇｍａｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００３）。−１６４位における最終突然変異は、ｃＡＭＰ応答要素（ＣＲＥ、−１６１〜−１５２）の上流であり、ＣＲＥは影響を受けずにとどまる（Ｂａｒｔｈｅｌ ｅｔ ａｌ．，２００１）。肝細胞を、溶解およびルシフェラーゼ活性の分析の前に、１％ＢＳＡを有する血清不含培地中で、０．１ｍＭ ｃＡＭＰおよび１μＭデキサメタゾンで１６時間処置した。ルシフェラーゼ単位（ＲＬＵ）を、各群において未処置細胞に対して正規化した。
実施例９：ＩｎｓＰ３受容体は、絶食および糖尿病における肝臓のグルコース新生を調節する。
絶食状態において、循環グルカゴンの増加は、グルコース新生プログラムの誘発を通じて、肝臓のグルコース生成を促進する。ｃＡＭＰ経路を作動させることによって、ＣＲＥＢ活性化補助因子ＣＲＴＣ２の脱リン酸化を介したグルコース新生遺伝子の発現を増加させる（１）。グルカゴンは、部分的に、ＰＫＡに媒介されるＣＲＴＣ２キナーゼＳＩＫ２の阻害を通じて、ＣＲＴＣ２の脱リン酸化を促進する。多数のＳｅｒ／Ｔｈｒホスファターゼは、ＣＲＴＣ２を脱リン酸化させることが可能であると思われるが（２、３）、ホルモンによる指示がこれらの酵素を調節する機序は、依然としてはっきりしない。本明細書において、グルカゴンが、細胞内カルシウム貯蔵を動員し、カルシウム／カルモジュリン依存性Ｓｅｒ／Ｔｈｒホスファターゼカルシニューリン／ＰＰ２Ｂを活性化することによって、肝細胞におけるＣＲＴＣ２の脱リン酸化を刺激することが示される。グルカゴンは、ＰＫＡに媒介されるイノシトール１，４，５−三リン酸塩受容体（ＩｎｓＰ３Ｒ）のリン酸化を通じて、サイトゾルカルシウムを増加させ、これは、ＣＲＴＣ２と関連することが本明細書に示される。それらの活性化に続いて、ＩｎｓＰ３Ｒは、カルシニューリンに媒介されるＣＲＴＣ２の脱リン酸化を促進することによって、グルコース新生遺伝子の発現を強化した。補給の際、インスリンシグナル伝達の増加は、ＡＫＴに媒介されるＩｎｓＰ３Ｒの不活性化を介して、ＣＲＴＣ２を低減させる。ＩｎｓＰ３Ｒ活性は、糖尿病において増加し、グルコース新生プログラムの上方調節をもたらした。ＩｎｓＰ３Ｒおよびカルシニューリンの肝臓の下方調節がインスリン耐性における循環グルコースレベルを改善したため、これらの結果は、ＩｎｓＰ３受容体のレベルにおけるｃＡＭＰおよびカルシウム経路の間のクロストークが、どのように絶食条件下および糖尿病において肝臓のグルコース生成を調整するかを示す。
結果および考察
一連のＳｅｒ／Ｔｈｒタンパク質ホスファターゼ（ＰＰ）阻害剤を、グルカゴンに応答してＣＲＴＣ２活性化を遮断するそれらの能力について試験した。ＰＰ２Ｂ／カルシニューリン阻害剤シクロスポリンＡ（ＣｓＡ）への暴露は、グルカゴンに誘発されるＣＲＴＣ２の脱リン酸化および核転座を破壊したが、ＰＰ１、ＰＰ２Ａ、およびＰＰ４の阻害剤であるオカダ酸（ＯＡ）は分断しなかった（図３３Ａ、図３７Ａ）。ＣｓＡおよび他のカルシニューリン阻害剤もまた、ＣＲＥルシフェラーゼ（ｌｕｃ）レポーター活性を低減させたが（図３３Ａ、図３７Ｂ）、それらは、リン酸化欠損（Ｓｅｒ１７１、２７５Ａｌａ）を発現する細胞、およびしたがってＣＲＴＣ２の活性形態においては効果を有さなかった（図３７Ｃ〜Ｅ）。
ＣｓＡがＣＲＴＣ２活性化を妨げる能力に基づいて、カルシニューリンが、グルカゴンに応答してＣＲＴＣ２の脱リン酸化を促進し得るかどうか検討した。この考えを支持して、ＣＲＴＣ２は、カルシニューリンとの関係を媒介する２つのコンセンサス（ＰＸＩＸＩＴ）モチーフを含有する（３、４）（図３８Ａ、Ｂ）。さらに、いずれのモチーフの突然変異も、ＣＲＴＣ２のグルカゴン依存性脱リン酸化を破壊し（図３３Ｂ）、その核転座を防ぎ（図３８Ｃ）、それによって、ＣＲＥ−ｌｕｃの活性化を下方調節する（図３３Ｂ）。
これらの結果に基づいて、カルシニューリンが、グルコース新生プログラムの発現を調整するかどうかを試験した。肝細胞におけるカルシニューリン触媒サブユニットのアデノウイルス過剰発現は、グルカゴンに応答して、ＣＲＴＣ２の脱リン酸化、ＣＲＥ−ｌｕｃ活性、およびグルコース分泌を増加させたが、カルシニューリンノックダウンは、逆の効果を有した（図３３Ｃ）。カルシニューリンは、原則として、ｃＡＭＰシグナル伝達への効果を通じて間接的にＣＲＴＣ２を調整し得るが、カルシニューリンの過剰発現またはノックダウンは、グルカゴンに暴露された細胞において、細胞ＰＫＡ基質のリン酸化を変化させなかった（図３８Ｄ）。
次に、カルシニューリンが、インビボで肝臓のグルコース新生を調整するかどうかを、試験した。肝臓における中程度（２倍）のカルシニューリンの過剰発現は、グルコース新生遺伝子発現、肝臓ＣＲＥ−ｌｕｃ活性、および絶食時血中グルコース濃度を増加させた（図３３Ｄ、図３９Ａ）。対照的に、肝臓カルシニューリンのノックダウンは、グルコース新生プログラムの発現を低減し、循環グルコースレベルを低下させ（図３３Ｄ、図３９Ｂ）、このホスファターゼが、肝臓における絶食時適応に寄与することを示した。カルシニューリンは、ＣＲＥＢ経路を介してグルコース新生を刺激すると見られ、ＣＲＴＣ２の枯渇は、この環境下でカルシニューリンの過剰発現効果を遮断した（図４０）。
カルシニューリン活性が細胞内カルシウムの増加に依存性であることを認識した上で、ｃＡＭＰ経路がカルシウム動員を刺激するかどうかを試験した。初代肝細胞のグルカゴンへの暴露は、細胞内遊離カルシウムの急速な増加を引き起こし（図３４Ａ、図４１Ａ）、これらの効果は、ＰＫＡ阻害剤Ｈ８９との併用処置により部分的に逆転された（図４１Ｂ）。細胞内カルシウムの上昇は、カルシウムキレート化剤ＢＡＰＴＡが、グルカゴンに応答してＣＲＴＣ２の脱リン酸化およびＣＲＥ−ｌｕｃ活性化を破壊したため、ＣＲＴＣ２活性化に重要であると考えられる（図３４Ｂ）。ｃＡＭＰシグナル伝達に対するカルシウムの効果と相反して、ＢＡＰＴＡへの暴露は、グルカゴンに応答して、ＰＫＡに媒介されるＣＲＥＢのリン酸化を遮断しなかった。
理論に束縛されるものではなく、ｃＡＭＰは、細胞内カルシウムチャネルのＰＫＡ依存性リン酸化を通じてカルシウム動員を増加させ得る。グルカゴンに応答してＰＫＡによるリン酸化を受けるタンパク質を識別するための質量分析研究において、イノシトール１，４，５−三リン酸塩受容体１（ＩｎｓＰ３Ｒ１）を、リン酸化ＰＫＡ基質抗血清の免疫沈降によって回収した（図４１Ｃ）。ＩｎｓＰ３Ｒ１およびその関連するファミリーメンバー（ＩｎｓＰ３Ｒ２、ＩｎｓＰ３Ｒ３）は、細胞外シグナルに応答したそれらの活性化に続いて、小胞体（ＥＲ）カルシウム貯蔵の動員を促進する、カルシウム放出チャネルである。（５〜９）。さらに、ｃＡＭＰアゴニストもまた、ＰＫＡに媒介されるリン酸化を通じてＩｎｓＰ３Ｒ 受容体活性を強化することを示している。
肝細胞のゼストスポンジンＣ（Ｘｃ）への暴露または全ての３つのＩｎｓＰ３ＲのノックダウンのいずれかによるＩｎｓＰ３Ｒの阻害は、グルカゴンおよびホルスコリンに応答するサイトゾルカルシウム動員およびカルシニューリン活性化を破壊した（図３４Ａ、図４２Ａ）。さらに、Ｘｃ処置およびＩｎｓＰ３Ｒノックダウンはまた、ＣＲＴＣ２脱リン酸化に対するグルカゴンの効果、ＣＲＥ−ｌｕｃ活性化、およびグルコース新生プログラムの誘発を遮断した（図３４Ｃ、図４２Ａ、Ｂ）。これらの細胞における優勢なＩｎｓＰ３ＲアイソフォームであるＩｎｓＰ３Ｒ２のノックアウトによるマウス由来の肝細胞を使用したＩｎｓＰ３Ｒ枯渇の効果を（１０）、確認した（図４２Ｃ〜Ｅ）。
これらの結果に基づいて、理論に束縛されるものではなく、ＩｎｓＰ３Ｒはまた、インビボでの絶食時グルコース生成を調整し得る。肝臓における全ての３つのＩｎｓｐ３ＲのノックダウンまたはＩｎｓＰ３Ｒ２遺伝子を標的とする破壊のいずれかによる肝臓ＩｎｓＰ３Ｒ発現の減少は、絶食時ＣＲＥ−ｌｕｃ活性、グルコース新生遺伝子の発現、および循環グルコース濃度を低減させ、グルコース恒常性におけるこれらの受容体の重要性を示した（図３４Ｄ、図４３）。
グルカゴンが、ＰＫＡに媒介されるリン酸化を通じてＩｎｓＰ３Ｒ活性を調整するかどうかを試験した。グルカゴンへの肝細胞の暴露は、リン酸化ＰＫＡ基質抗血清での免疫ブロットアッセイによって、ＩｎｓＰ３Ｒ１、ならびにＩｎｓＰ３Ｒ２およびＩｎｓＰ３Ｒ３のリン酸化を増加させ、これらの効果は、ＰＫＡ阻害剤Ｈ８９によって遮断された（図３５Ａ、図４４Ａ）。さらに、ＩｎｓＰ３Ｒ１のコンセンサスＰＫＡ部位（Ｓｅｒ１５８９、Ｓｅｒ１７５６）におけるセリン残基の、アラニンへの突然変異は、グルカゴンに応じたＩｎｓＰ３Ｒ１のリン酸化を完全に破壊した（図３５Ｂ）。結果として、ＰＫＡ欠損（Ｓ１５８９、１７５６Ａ）ＩｎｓＰ３Ｒ１の過剰発現は、カルシウム動員およびカルシニューリン活性化を妨害し、それは、ＣＲＥ−ｌｕｃ活性化およびグルカゴンに暴露された肝細胞からのグルコース分泌を低減させた（図３５Ｂ〜Ｄ）。
グルカゴンに類似して、絶食もまた、Ｓｅｒ１５８９およびＳｅｒ１７５６における肝臓ＩｎｓＰ３Ｒ１リン酸化を刺激した（図４４Ｂ）。また、ＰＫＡ欠損ＩｎｓＰ３Ｒ１の過剰発現は、絶食時ＣＲＥ−ｌｕｃ誘発、カルシニューリン活性化、およびグルコース新生遺伝子の発現を低減させ、循環グルコース濃度の低下をもたらした（図３５Ｅ、図４４Ｃ、Ｄ）。総合すると、これらの結果は、肝臓のグルコース新生における、ＰＫＡに媒介されるＩｎｓＰ３Ｒのリン酸化の重要な役割を裏付ける。
理論に束縛されるものではなく、ＣＲＴＣ２とカルシウムシグナル伝達機構との近接性は、その活性化に重要であり得る。この考えを支持して、ＣＲＴＣ２は、共免疫沈降アッセイにおいて、そのＮ末端ＣＲＥＢ結合ドメイン（ＣＢＤ）を介して、ＩｎｓＰ３Ｒ１と関連することが見出された（図３５Ｆ、図４５Ａ〜Ｄ）。さらに、ＣＲＴＣ２は、ＩｎｓＰ３Ｒもまた含有するＥＲ含有高密度ミクロソーム（ＨＤＭ）分画において豊富であった（図４５Ｅ）。ＩｎｓＰ３Ｒ：ＣＲＴＣ２の関係は、ＲＮＡに媒介されるＩｎｓＰ３Ｒのノックダウンが、細胞質内でのＣＲＴＣ２の再分配をもたらしたため、核周囲空間におけるＣＲＴＣ２局在化に非常に重要であると考えられる（図４５Ｆ）。ＣＲＴＣ２中のＣＢＤの欠失、またはＣＲＴＣ２に原形質膜を標的とさせるＮ末端ミリストイル化シグナルの付加によって、ＣＲＴＣ２：ＩｎｓＰ３Ｒの相互作用を破壊することにより、グルカゴンに応じたＣＲＴＣ２脱リン酸化およびＣＲＥ−受容体活性化が遮断された（図４５Ｇ〜Ｉ）。総合すると、これらの結果は、ＣＲＴＣ２とＩｎｓＰ３Ｒとの関係が、絶食シグナルに対するその感受性を強化したことを示す。
摂食条件下では、インスリンは、部分的に、ＣＲＴＣ２リン酸化の増加によって、グルコース新生を阻害する。インスリンが、ＣＲＴＣ２活性化に対するＩｎｓＰ３Ｒ効果を妨害するかどうかについて、試験した。この考えを支持して、ＡＫＴは、Ｓｅｒ２６８２（ＩｎｓＰ３Ｒ１において）におけるＩｎｓＰ３Ｒのリン酸化によって、カルシウム動員を遮断することが示されている（１１）。実際に、インスリンへの肝細胞の暴露は、リン酸化ＡＫＴ基質抗血清での免疫ブロット分析によって、ＩｎｓＰ３Ｒリン酸化を増加させ（図４６Ａ）、Ｓｅｒ２６８２（ＩｎｓＰ３Ｒ１において）のアラニンへの突然変異は、これらの効果を遮断した。インスリン治療はまた、野生型ＩｎｓＰ３Ｒ１を発現する細胞において、グルカゴン依存性のカルシウム動員およびカルシニューリン活性化を低減させたが、それは、ＡＫＴ欠損（Ｓ２６８２Ａ）ＩｎｓＰ３Ｒ１を発現する細胞においては効果を有さなかった（図４６Ｂ）。結果として、ＣＲＴＣ２脱リン酸化、ＣＲＥ−ｌｕｃ活性、およびグルコース産出は、野生型と比較して、（Ｓ２６８２Ａ）−ＩｎｓＰ３Ｒを発現する肝細胞において上昇した（図４６Ｃ）。
次に、ＡＫＴによるＩｎｓＰ３Ｒ１リン酸化が、インビボでの肝臓のグルコース生成の調節に重要であるかどうかについて試験した。給餌は、Ｓｅｒ２６８２における肝臓ＩｎｓＰ３Ｒ１リン酸化を増加させた（図４４Ｂ）。さらに、ＡＫＴ欠損ＩｎｓＰ３Ｒ１の過剰発現は、ＣＲＥ−ｌｕｃ活性およびグルコース新生遺伝子の発現における摂食誘発性減少を部分的に抑制し、循環グルコース濃度の上昇をもたらした（図４６Ｄ）。総合すると、これらの結果は、摂食時のＡＫＴに媒介されるＩｎｓＰ３Ｒのリン酸化が、カルシニューリン遺贈性のＣＲＴＣ２の脱リン酸化を妨害することによって肝臓のグルコース新生を遮断することを示す。
肝臓ＩｎｓＰ３Ｒシグナル伝達が、インスリン耐性環境下でグルコース新生の増加に寄与するかどうかについて、試験した。肝臓カルシニューリン活性は、ｏｂ／ｏｂおよびｄｂ／ｄｂの両方の糖尿病動物において強化され、ＣＲＥ−ｌｕｃ活性の増加をもたらした（図３６Ａ、図４７Ａ、Ｂ）。ＩｎｓＰ３Ｒの役割に注目すると、肝臓内のＰＫＡがリン酸化された活性なＩｎｓＰ３Ｒの量は、これらの糖尿病マウスにおいて増加したが、ＡＫＴがリン酸化された不活性なＩｎｓＰ３Ｒの量は、低減した（図３６Ｂ）。これに応じて、ｄｂ／ｄｂマウスにおけるカルシニューリンまたはＩｎｓＰ３Ｒのいずれかのノックダウンは、ＣＲＥ−ｌｕｃ活性、グルコース新生遺伝子の発現、および肝臓のグルコース新生を低減させた（図３６Ｃ、図４７Ｃ）。
まとめると、本明細書の結果は、グルカゴンが、細胞質カルシウムの増加を引き起こすことによって、絶食時のＣＲＴＣ２の脱リン酸化を促進し、これがカルシニューリン活性化をもたらすことを示す（図４８）。グルカゴンが、ＰＫＡに媒介されるＩｎｓＰ３Ｒのリン酸化を介してカルシウムシグナル伝達を増加させる能力は、肝臓およびおそらくは他のインスリン感受性組織におけるｃＡＭＰおよびカルシウムのシグナル伝達経路間のクロストークのための重要な調節ノードを示す。ＰＫＡ阻害剤Ｈ８９によるカルシウム移入の部分的な阻害もまた、ＰＫＡとともに機能してグルカゴンに応じたＩｎｓＰ３Ｒ活性を増加させ得る、追加の調節入力を示す（１２、１３）。ＣＲＴＣ２はまた、肝臓（１４、１５）および筋肉（１６）において、核内ホルモン受容活性化補助因子ＰＧＣ１αを上方調節することによって、代謝性遺伝子の発現を刺激することがわかっている。ＰＧＣ１α依存性転写におけるカルシウムシグナル伝達の十分に認識された役割に基づいて、ＩｎｓＰ３Ｒはまた、この環境下で重要な機能を果たし得る。
方法
アデノウイルスを、尾静脈注射によって送達した（１７）。肝臓ＣＲＥ−ｌｕｃ活性を、ＩＶＩＳ Ｉｍａｇｉｎｇシステムを使用して視覚化した。マウスを、ＣＲＥ−ｌｕｃアデノウイルスの注射した３〜５日後に撮像した。ピルビン酸塩寛容性試験を、一晩絶食させてピルビン酸塩（２ｇ ｋｇ−１）を腹腔内注射したマウスにおいて行った。Ｉｎｓｐ３ｒ２ノックアウトマウスについては、説明されている（１０）。培養初代マウス肝細胞を、報告されたように調製した（１８）。細胞内分画研究を、初代マウス肝細胞を使用して実行した（１８）。カルシウム撮像実験を、ＣＣＤカメラを使用して、ｆｕｒａ−２染料を充填した初代肝細胞において行った。質量分析研究を、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞から調製したＣＲＴＣ２免疫沈降物、およびグルカゴンに暴露した初代肝細胞から調製したリン酸化ＰＫＡ基質抗血清において行った。抗ＩｎｓＰ３Ｒ１（Ａ３０２−１５８Ａ）およびＩｎｓＰ３Ｒ３（Ａ３０２−１６０Ａ）抗体はＢｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入し、抗ＩｎｓＰ３Ｒ２（ａｂ７７８３８）抗血清はＡｂｃａｍから購入し、抗カルシニューリン（６１０２６０）はＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから入手し、抗ＧＲＰ７８（ＡＤＩＳＰＡ−８２６−Ｆ）はＥｎｚｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓから入手し、抗リン酸化ＰＫＡ基質（ＲＲＸＳ／Ｔ、９６２４）、抗リン酸化ＡＫＴ基質（ＲＸＸＳ／Ｔ、９６１４）、およびＣＲＴＣ２（ｐＳ１７１、２８９２）はＣｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇから入手した。ホスホ（Ｓｅｒ２７５）ＣＲＴＣ２抗体を、記載のように使用した（１９）。詳細は、以下に含まれる。
マウス株およびアデノウイルス
アデノウイルス（１×１０８プラーク形成範囲（ｐｆｕ）ＧＦＰ、カルシニューリン、ＩｎｓＰ３Ｒ１、ＩｎｓＰ３Ｒ１ ＤＭ（Ｓ１５８９Ａ／Ｓ１７５６Ａ）、非特異的（ＵＳ）ＲＮＡｉ、カルシニューリン ＲＮＡｉ、Ｉｎｓｐ３ｒ１ ＲＮＡｉ、Ｉｎｓｐ３ｒ２ ＲＮＡｉ、Ｉｎｓｐ３ｒ３ ＲＮＡｉ、Ｃｒｔｃ２ ＲＮＡｉ、１×１０９ｐｆｕ ＣＲＥ−ｌｕｃレポーター、５×１０７ｐｆｕ ＲＳＶ β−ｇａｌ）を、８〜１０週齢の雄性Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、Ｂ６．Ｖ−ｌｅｐ＜ｏｂ＞／Ｊ、Ｂ６．Ｃｇ−ｍ＋／＋Ｌｅｐｒ＜ｄｂ＞／Ｊに、尾静脈注射によって送達した（１７）。Ｉｎｓｐ３ｒ２ノックアウトマウスは、既述されている（１０）。全てのマウスを、研究の１週間前に環境に適合させ、温度制御環境にある１２時間の明／暗サイクルのコロニーケージに収容した。インビボ撮像実験のために、マウスを、アデノウイルスを送達した３〜５日後に撮像した。野生型ＣＲＴＣ２、ＣＲＴＣ２（Ｓ１７１Ａ）、ＧＦＰ、非特異的ＲＮＡｉ、Ｃｒｔｃ２ ＲＮＡｉ、ＣＲＥ−ｌｕｃ、およびＲＳＶ β−ｇａｌ アデノウイルスは、既述されている（１７、２０）。ラットＩｎｓＰ３Ｒ１、ＩｎｓＰ３Ｒ１ ＤＭ、およびＩｎｓＰ３Ｒ１（Ｓ２６８２Ａ）を含有するアデノウイルスを、ＩｎｓＰ３Ｒ１プラスミドから生成した。カルシニューリンアデノウイルスを、マウスカルシニューリンプラスミド（Ａｄｄｇｅｎｅ）を使用して構築した。ＣＲＴＣ２△ＣＢＤ（５１〜６９２ａａ）、Ｓ２７５Ａ、およびＳ１７１Ａ／Ｓ２７５Ａアデノウイルスは、マウスＣＲＴＣ２から作製した。ミリストイル化−ＣＲＴＣ２（Ｍｙｒ−ＣＲＴＣ２）アデノウイルスは、マウスＣＲＴＣ２をＳｒｃからＮ末端ミリストイル化タグ（ＭＧＳＳＫＳＫＰＫＤＰＳＱＲ）に融合させて生成した。カルシニューリン ＲＮＡｉ、Ｉｎｓｐ３ｒ１ ＲＮＡｉ、Ｉｎｓｐ３ｒ２ ＲＮＡｉ、Ｉｎｓｐ３ｒ３ ＲＮＡｉアデノウイルスを、それぞれ、配列５’−ＧＧＧＴＡＣＣＧＣＡＴＧＴＡＣＡＧＧＡＡＡＡ−３’、５’−ＧＧＧＴＡＣＴＧＧＡＡＴＡＧＣＣＴＣＴＴＣＣ−３’、５’−ＧＧＧＴＡＡＣＡＡＧＣＡＣＣＡＣＣＡＴＣＣＣ−３’、および５’−ＧＧＧＣＡＡＧＣＴＧＣＡＧＧＴＧＴＴＣＣＴＧ−３’を使用して構築した。この研究で使用した全ての発現構築物は、配列によって確認した。
インビボ分析
インビボ撮像のために、マウスを、自由給餌条件下または６時間の絶食後に、記載のように撮像した（１７、２０）。ピルビン酸塩チャレンジ実験のために、マウスを一晩絶食させ、ピルビン酸塩（２ｇ ｋｇ−１）を腹腔内注射した。血中グルコース値を、ＬｉｆｅＳｃａｎ自動グルコース計を使用して判定した。免疫ブロットについては、マウス組織を超音波分解し、遠心分離して、上清を、タンパク質判定およびＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析のために確保した。
細胞培養、細胞の分画、ルシフェラーゼアッセイ、カルシニューリン活性、およびｃＡＭＰ測定
ＨＥＫ２９３Ｔ（ＡＴＣＣ）細胞を、１０％ＦＢＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ）、１００ｍｇ ｍｌ-１ペニシリン−ストレプトマイシンを含有するＤＭＥＭ中で培養した。マウス初代肝細胞を単離し、既述のように培養した（１８）。細胞分画研究を、既報の通りに実行した（１８）。レポーター研究については、Ａｄ−ＣＲＥ−ｌｕｃに感染させた肝細胞（細胞当たり１ｐｆｕ）を、２〜４時間グルカゴン（Ｇｃｇ、１００ｎＭ）に暴露した。シクロスポリンＡ（ＣｓＡ、１０μＭ）またはオカダ酸（ＯＡ、１００ｎＭ）または細胞透過性カルシニューリン自己阻害性ペプチド（１０μＭ）またはＣＮ５８５（１００μＭ）またはカリクリンＡ（１０ｎＭ）またはゼストスポンジンＣ（Ｘｃ、２μＭ）またはＨ８９（３０μＭ）またはＢＡＰＴＡ（５０μＭ）の阻害のために、肝細胞を、阻害剤で１時間、前処置した。ルシフェラーゼ活性を、アデノウイルスにコードされるＲＳＶ β−ｇａｌによるβ−ガラクトシダーゼ活性に対して正規化した。カルシニューリン活性（試験キットはＥｎｚｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓから入手）および細胞内ｃＡＭＰレベル（試験キットはＣａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙから入手）を、製造業者の説明書に従って測定した。
カルシウム撮像
マウス初代肝細胞を、ガラス製カバースリップに播種し、Ｍｅｄｉａ １９９（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ）中、０．０２５％（ｗ／ｖ）プルロニックＦ１２７（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）の存在下で、３０分間、５μＭ Ｆｕｒａ−２アセトキシメチルエステル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）を充填した。カバースリップを、層流灌流チャンバ（Ｗａｒｎｅｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｃｏｒｐ．）上に載置し、Ｍｅｄｉａ １９９、またはＭｅｄｉａ １９９中の１００ｎＭグルカゴンの溶液を灌流させた。Ｆｕｒａ−２を充填した細胞の画像を、励起波長を３４０ｎｍから３８０ｎｍで変化させながら、冷却ＣＣＤカメラで収集した。２つの励起波長における蛍光強度の比を、バックグラウンド蛍光を差し引いた後に計算した。［Ｃａ２＋］Ｉ（サイトゾル内遊離カルシウム濃度）を、Ｆｕｒａ−２カルシウム撮像キャリブレーションキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して計算した。画像を収集し、ＭｅｔａＦｌｕｏｒソフトウェアパッケージ（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｃｏｒｐ．）を使用して分析した。グラフは、代表的な一つ一つの実験による、３０〜４０の個々の細胞の群からの平均応答を表す。棒グラフは、１つの条件当たり１５０〜２００の細胞からの平均応答を表す（平均ベースラインに対する倍数）。全ての実験は、少なくとも３回繰り返し、類似の結果であった。
免疫ブロット、免疫沈降、免疫染色
免疫ブロット、免疫沈降、および免疫染色アッセイを、記載のように行った（１８）。ＣＲＴＣ２、ｐＣＲＥＢ（Ｓｅｒ１３３）、ＣＲＥＢ、ｐＡＫＴ（Ｔｈｒ３０８）、ＡＫＴ、チューブリン、ＨＡ、およびＦＬＡＧ抗体は、以前に記載されている（１８）。抗体は、抗ＩｎｓＰ３Ｒ１（Ａ３０２〜１５８Ａ）およびＩｎｓＰ３Ｒ３（Ａ３０２〜１６０Ａ）をＢｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入し、抗ＩｎｓＰ３Ｒ２（ａｂ７７８３８）をＡｂｃａｍから入手し、抗カルシニューリン（６１０２６０）をＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから入手し、抗ＧＲＰ７８（ＡＤＩ−ＳＰＡ−８２６−Ｆ）をＥｎｚｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓから入手し、抗リン酸化ＰＫＡ基質（ＲＲＸＳ／Ｔ、９６２４）、抗リン酸化ＡＫＴ基質（ＲＸＸＳ／Ｔ、９６１４）から入手し、ＣＲＴＣ２（ｐＳ１７１、２８９２）をＣｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇから入手した。ＣＲＴＣ２（ｐＳ２７５）抗体を、記載のように用いた（１９）。
定量的ＰＣＲ
全肝臓または初代肝細胞からの全細胞ＲＮＡを、Ｒｎｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して抽出し、それを使用してＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩ酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でｃＤＮＡを生成した。ｃＤＮＡを、記載のように定量的ＰＣＲによって分析した（１８）。
質量分析
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞からの内在性ＣＲＴＣ２およびグルカゴンで刺激した肝細胞からのリン酸化ＰＫＡ基質抗血清の免疫沈降物を、既述のように、質量分析研究のために調製し（２１）、Ｔｈｅｒｍｏ ＬＴＱ Ｏｒｂｉｔｒａｐ機器上でのエレクトロスプレーイオン化タンデム質量分析によって分析した。
統計学的分析
全ての研究は、少なくとも３つの独立した時に行った。結果は、平均±標準誤差として報告する。異なる群の比較は、対応のない両側スチューデントｔ検定を使用して実行した。差は、Ｐ＜０．０５で統計的に有意であると見なした。
参考文献
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２０．Ｌｉｕ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．Ａ ｆａｓｔｉｎｇ ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｓｗｉｔｃｈ ｍｏｄｕｌａｔｅｓ ｇｌｕｃｏｎｅｏｇｅｎｅｓｉｓ ｖｉａ ａｃｔｉｖａｔｏｒ／ｃｏａｃｔｉｖａｔｏｒ ｅｘｃｈａｎｇｅ．Ｎａｔｕｒｅ ４５６，２６９−７３（２００８）．
２１．Ｗａｎｇ，Ｂ．ｅｔ ａｌ．Ａ ｈｏｒｍｏｎｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｍｏｄｕｌｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ ｅｎｅｒｇｙ ｂａｌａｎｃｅ．Ｃｅｌｌ １４５，５９６−６０６（２０１１）．
実施例１０：代謝性疾患の治療および予防のためのｐ３８およびＭＫ２／３阻害剤
ＣａＭＫＩＩの逆の効果を媒介し得る、ｐ３８およびＭＫ２の２つのキナーゼが、ＣａＭＫＩＩの下流に存在する（図５１を参照されたい）。ＩＰ３受容体およびＣａＭＫＩＩのようなより上流の標的を遮断する薬物は、より多くの経路を対象とし得るが、それらはまた、より毒性が強い場合がある。対照的に、より下流の媒介物質を標的とすることは、より少ない標的外効果をもたらし得る。ＭＫ２およびＭＫ３は、非常に類似しており、ＭＫ２を遮断する試薬（ＤＮ−ＭＫ２およびＭＫ２阻害剤）は、ＭＫ２およびＭＫ３の両方を遮断する。それらのうちの一方のみを遮断した場合、他方がそれを補うことになる。
したがって、ｐ３８阻害剤およびＭＫ２／３阻害剤はまた、１型糖尿病、２型糖尿病、インスリン耐性、および代謝症候群等、肥満によって誘発される代謝性疾患の治療に使用可能である。
図５２〜５６に記載の研究は、初代マウス肝細胞（ＨＣ）を使用する。ｐ３８実験のために、ｐ３８を、「Ｃｒｅ」または「アデノ−Ｃｒｅ」または「ａｄ−Ｃｒｅ」と分類された試料において欠失させ、これの対照は、アデノ−ＬａｃＺ（ときにａｄ−ＬａｃＺまたはＬａｃＺとして分類される）である。（ＨＣは、アデノウイルスベクターを使用して送達されるＣｒｅリコンビナーゼに暴露すると欠失するｐ３８遺伝子の形態を有する。対照は、ＬａｃＺと称される無関係なタンパク質をコードするアデノウイルスベクターである。）
図５２は、ｐ３８と、ＣａＭＫＩＩの重要な遠位的関係、すなわち、ＦｏｘＯ１の核局在化とを関連付ける：ｐ３８が存在する通常のＨＣ（ＬａｃＺ）において、構造的に活性な（ＣＡ）ＣａＭＫＩＩは、ＦｏｘＯ１を核内に押し進めるが、ｐ３８を欠くＨＣ（Ｃｒｅ）においてはこれを行うことができない。
図５３は、ＭＫ２阻害剤を使用して、核内ＦｏｘＯ１、および肝臓でのグルコース生成に関与する遺伝子の誘発の両方におけるＭＫ２の重要性を示す。ＭＫ−２阻害剤は、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍから入手した（ｃａｔ＃４７５８６４）：２−（２−キノリン−３−イルピリジン−４−イル）−１，５，６，７−テトラヒドロ−４Ｈ−ピロロ−［３，２−ｃ］ピリジン−４−オン。
図５４は、肝臓細胞が小胞体（ＥＲ）ストレスに供される、肥満および２型糖尿病におけるプロセスを模倣する実験的モデル（ツニカマイシンと称されるタンパク質の誤った折り畳みの誘発物質）を使用する。ＥＲストレスは、「ＰＥＲＫ／ＰＫＲ」および「ＡＴＦ４／ＣＨＯＰ」によって表される（右下の分枝）（図５１を参照されたい）。図５４には、ｐ３８がツニカマイシン（ＥＲストレス）に誘発されるｐ−ＰＥＲＫ（その活性形態）およびＣＨＯＰに必要であることを示す。ｐ５８ＩＰＫが、ｐ３８を欠くＨＣ（Ｃｒｅ）において、わずかではあるが一定して上昇していることも理解され、これもまた、図５１の右下の分枝に当てはまる。
図５５は、肥満および糖尿病における肝臓ＥＲストレスを模倣する別の実験モデル（パルミチン酸塩と称される脂肪酸）を使用する。図５４にあるように、ｐ３８は、ＣＨＯＰおよびｐ−ＰＥＲＫの増加に必要である。
図５６、図５１の右下の分枝を見れば、読み取り値はインスリンに対するｐ−Ａｋｔ応答であることがわかる。図５６の全てのＨＣに、インスリンがＡｋｔを活性化（リン酸化）する能力を試験するために、インスリンの急性用量を受容させた。ここで肥満／糖尿病を模倣するために使用したモデルは、図５５で使用したパルミチン酸塩モデルである。通常のｐ３８を有するＨＣ（Ａｄ−ＬａｃＺ）において、インスリンは、強力なｐ−Ａｋｔシグナルをもたらしたが（最初の２レーン）、これは、パルミチン酸塩（「ｐａｌｍ」）によって低下したことを理解することができる。パルミチン酸塩に晒されると、この「インスリン耐性」は、肥満および２型糖尿病で起こることを模倣する。ｐ３８を有さないＨＣ（Ａｄ−Ｃｒｅ）に注目すると、インスリンがＡｋｔ（ｐ−Ａｋｔ）を活性化する能力は、改善されている。これは、図５１に示されたｐ３８−ｐ−Ａｋｔの関連性と一致する。
図８６、８７、および８８は、ＣａＭＫＩＩ、ｐ３８、またはＭＫ２／３の阻害が、どのようにインスリンシグナル伝達の改善をもたらすか、すなわち、これらの阻害剤が、どのようにインスリン耐性を防止するかに関する。図中のデータは、次の機序を裏付ける：ＣａＭＫＩＩ、ｐ３８、またはＭＫ２／３の阻害剤は、Ｔｒｉｂｂｌｅ３（Ｔｒｂ３）を低下させ、これが、次に、インスリンがＡＫＴをリン酸化する能力を改善する（Ｔｒｂ３は、ＡＫＴリン酸化の内在性阻害剤である）。
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Ａｃｃｉｌｉ，Ｄ．ａｎｄ Ａｒｄｅｎ，Ｋ．Ｃ．（２００４）．ＦｏｘＯｓ ａｔ ｔｈｅ ｃｒｏｓｓｒｏａｄｓ ｏｆ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ，ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ，ａｎｄ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ．Ｃｅｌｌ．１１７，４２１−４２６．
Ａｎｇ，Ｅ．Ｓ．，Ｚｈａｎｇ，Ｐ．，Ｓｔｅｅｒ，Ｊ．Ｈ．，Ｔａｎ，Ｊ．Ｗ．，Ｙｉｐ，Ｋ．，Ｚｈｅｎｇ，Ｍ．Ｈ．，Ｊｏｙｃｅ，Ｄ．Ａ．，ａｎｄ Ｘｕ，Ｊ．（２００７）．Ｃａｌｃｉｕｍ／ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｋｉｎａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ａｎｄ ｂｏｎｅ ｒｅｓｏｒｐｔｉｏｎ ｂｙ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｏｆ ｎｕｃｌｅａｒ ｆａｃｔｏｒ ｋａｐｐａ Ｂ ｌｉｇａｎｄ（ＲＡＮＫＬ）．Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．２１２，７８７−７９５．
Ａｓａｄａ，Ｓ．，Ｄａｉｔｏｋｕ，Ｈ．，Ｍａｔｓｕｚａｋｉ，Ｈ．，Ｓａｉｔｏ，Ｔ．，Ｓｕｄｏ，Ｔ．，Ｍｕｋａｉ，Ｈ．，Ｉｗａｓｈｉｔａ，Ｓ．，Ｋａｋｏ，Ｋ．，Ｋｉｓｈｉ，Ｔ．，Ｋａｓｕｙａ，Ｙ．，ａｎｄ Ｆｕｋａｍｉｚｕ，Ａ．（２００７）．Ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅｓ，Ｅｒｋ ａｎｄ ｐ３８，ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅ ａｎｄ ｒｅｇｕｌａｔｅ Ｆｏｘｏ１．Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌ．１９，５１９−５２７．
Ａｙａｌａ，Ｊ．Ｅ．，Ｓｔｒｅｅｐｅｒ，Ｒ．Ｓ．，Ｄｅｓｇｒｏｓｅｌｌｉｅｒ，Ｊ．Ｓ．，Ｄｕｒｈａｍ，Ｓ．Ｋ．，Ｓｕｗａｎｉｃｈｋｕｌ，Ａ．，Ｓｖｉｔｅｋ，Ｃ．Ａ．，Ｇｏｌｄｍａｎ，Ｊ．Ｋ．，Ｂａｒｒ，Ｆ．Ｇ．，Ｐｏｗｅｌｌ，Ｄ．Ｒ．，ａｎｄ Ｏ’Ｂｒｉｅｎ，Ｒ．Ｍ．（１９９９）．Ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ｉｎｓｕｌｉｎ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｕｎｉｔ ｂｅｔｗｅｅｎ ｍｏｕｓｅ ａｎｄ ｈｕｍａｎ ｇｌｕｃｏｓｅ−６−ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ｃａｔａｌｙｔｉｃ ｓｕｂｕｎｉｔ ｇｅｎｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ： ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ＦＫＨＲ ｂｉｎｄｓ ｔｈｅ ｉｎｓｕｌｉｎ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ．４８，１８８５−１８８９．
Ｂａｃｋｓ，Ｊ．，Ｓｔｅｉｎ，Ｐ．，Ｂａｃｋｓ，Ｔ．，Ｄｕｎｃａｎ，Ｆ．Ｅ．，Ｇｒｕｅｔｅｒ，Ｃ．Ｅ．，ＭｃＡｎａｌｌｙ，Ｊ．，Ｑｉ，Ｘ．，Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｒ．Ｍ．，ａｎｄ Ｏｌｓｏｎ，Ｅ．Ｎ．（２０１０）．Ｔｈｅ ｇａｍｍａ ｉｓｏｆｏｒｍ ｏｆ ＣａＭ ｋｉｎａｓｅ ＩＩ ｃｏｎｔｒｏｌｓ ｍｏｕｓｅ ｅｇｇ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｂｙ ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ ｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅ ｒｅｓｕｍｐｔｉｏｎ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ １０７，８１−８６．
Ｂａｒｔｈｅｌ，Ａ．，Ｓｃｈｍｏｌｌ，Ｄ．，Ｋｒｕｇｅｒ，Ｋ．Ｄ．，Ｂａｈｒｅｎｂｅｒｇ，Ｇ．，Ｗａｌｔｈｅｒ，Ｒ．，Ｒｏｔｈ，Ｒ．Ａ．，ａｎｄ Ｊｏｏｓｔ，Ｈ．Ｇ．（２００１）．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｇｌｕｃｏｓｅ−６−ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ａｎｄ ｐｈｏｓｐｈｏｅｎｏｌｐｙｒｕｖａｔｅ ｃａｒｂｏｘｙｋｉｎａｓｅ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｂｙ ｔｈｅ ｆｏｒｋｈｅａｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ＦＫＨＲ ｉｎ Ｈ４ＩＩＥ−ｈｅｐａｔｏｍａ ｃｅｌｌｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２８５，８９７−９０２．
Ｂｅａｕｓｏｌｅｉｌ，Ｓ．Ａ．，Ｖｉｌｌｅｎ，Ｊ．，Ｇｅｒｂｅｒ，Ｓ．Ａ．，Ｒｕｓｈ，Ｊ．，ａｎｄ Ｇｙｇｉ，Ｓ．Ｐ．（２００６）．Ａ ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ−ｂａｓｅｄ ａｐｐｒｏａｃｈ ｆｏｒ ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ ｓｉｔｅ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２４，１２８５−１２９２．
Ｂｌａｎｑｕｅｔ，Ｐ．Ｒ．（２０００）．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｗｏ ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｔｌｙ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｐａｔｈｗａｙｓ ｉｎ ｒａｔ ｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ．９５，７０５−７１９．
Ｂｒｕｎｅｔ，Ａ．，Ｂｏｎｎｉ，Ａ．，Ｚｉｇｍｏｎｄ，Ｍ．Ｊ．，Ｌｉｎ，Ｍ．Ｚ．，Ｊｕｏ，Ｐ．，Ｈｕ，Ｌ．Ｓ．，Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｍ．Ｊ．，Ａｒｄｅｎ，Ｋ．Ｃ．，Ｂｌｅｎｉｓ，Ｊ．，ａｎｄ Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ，Ｍ．Ｅ．（１９９９）．Ａｋｔ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｃｅｌｌ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｂｙ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｎｇ ａｎｄ ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ ａ Ｆｏｒｋｈｅａｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ．Ｃｅｌｌ．％１９；９６，８５７−８６８．
Ｂｕｒｇｅｓｓ，Ｓ．Ｃ．，Ｈｅ，Ｔ．，Ｙａｎ，Ｚ．，Ｌｉｎｄｎｅｒ，Ｊ．，Ｓｈｅｒｒｙ，Ａ．Ｄ．，Ｍａｌｌｏｙ，Ｃ．Ｒ．，Ｂｒｏｗｎｉｎｇ，Ｊ．Ｄ．，ａｎｄ Ｍａｇｎｕｓｏｎ，Ｍ．Ａ．（２００７）．Ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ ｐｈｏｓｐｈｏｅｎｏｌｐｙｒｕｖａｔｅ ｃａｒｂｏｘｙｋｉｎａｓｅ ｄｏｅｓ ｎｏｔ ｓｏｌｅｌｙ ｃｏｎｔｒｏｌ ｔｈｅ ｒａｔｅ ｏｆ ｈｅｐａｔｉｃ ｇｌｕｃｏｎｅｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ ｔｈｅ ｉｎｔａｃｔ ｍｏｕｓｅ ｌｉｖｅｒ．Ｃｅｌｌ Ｍｅｔａｂ．５，３１３−３２０．
Ｂｙｇｒａｖｅ，Ｆ．Ｌ．ａｎｄ Ｂｅｎｅｄｅｔｔｉ，Ａ．（１９９３）．Ｃａｌｃｉｕｍ： ｉｔｓ ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｉｎ ｌｉｖｅｒ ｂｙ ｃｒｏｓｓ−ｔａｌｋ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ ａｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ｇｌｕｃａｇｏｎ ａｎｄ ｃａｌｃｉｕｍ−ｍｏｂｉｌｉｚｉｎｇ ａｇｏｎｉｓｔｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２９６，１−１４．
Ｃａｎｔｉｎ，Ｇ．Ｔ．，Ｓｈｏｃｋ，Ｔ．Ｒ．，Ｐａｒｋ，Ｓ．Ｋ．，Ｍａｄｈａｎｉ，Ｈ．Ｄ．，ａｎｄ Ｙａｔｅｓ，Ｊ．Ｒ．，ＩＩＩ（２００７）．Ｏｐｔｉｍｉｚｉｎｇ ＴｉＯ２−ｂａｓｅｄ ｐｈｏｓｐｈｏｐｅｐｔｉｄｅ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ ｆｏｒ ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｍｕｌｔｉｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｃｏｕｐｌｅｄ ｔｏ ｔａｎｄｅｍ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ．Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７９，４６６６−４６７３．
Ｃａｏ，Ｗ．，Ｃｏｌｌｉｎｓ，Ｑ．Ｆ．，Ｂｅｃｋｅｒ，Ｔ．Ｃ．，Ｒｏｂｉｄｏｕｘ，Ｊ．，Ｌｕｐｏ，Ｅ．Ｇ．，Ｊｒ．，Ｘｉｏｎｇ，Ｙ．，Ｄａｎｉｅｌ，Ｋ．Ｗ．，Ｆｌｏｅｒｉｎｇ，Ｌ．，ａｎｄ Ｃｏｌｌｉｎｓ，Ｓ．（２００５）．ｐ３８ Ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ｐｌａｙｓ ａ ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ ｒｏｌｅ ｉｎ ｈｅｐａｔｉｃ ｇｌｕｃｏｎｅｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ｊ．Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２８０，４２７３１−４２７３７．
Ｃｈｉａｃｃｈｉｅｒａ，Ｆ．ａｎｄ Ｓｉｍｏｎｅ，Ｃ．（２０１０）．Ｔｈｅ ＡＭＰＫ−ＦｏｘＯ３Ａ ａｘｉｓ ａｓ ａ ｔａｒｇｅｔ ｆｏｒ ｃａｎｃｅｒ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ．Ｃｅｌｌ Ｃｙｃｌｅ．９，１０９１−１０９６．
Ｃｏｃｉｏｒｖａ，Ｄ．，Ｔａｂｂ，Ｌ．，ａｎｄ Ｙａｔｅｓ，Ｊ．Ｒ．（２００７）．Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｔａｎｄｅｍ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ｄａｔａｂａｓｅ ｓｅａｒｃｈ ｒｅｓｕｌｔｓ ｕｓｉｎｇ ＤＴＡＳｅｌｅｃｔ．Ｃｕｒｒ．Ｐｒｏｔｏｃ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．Ｃｈａｐｔｅｒ １３：Ｕｎｉｔ １３．４．，Ｕｎｉｔ．
Ｃｏｕｃｈｏｎｎａｌ，Ｌ．Ｆ．ａｎｄ Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｍ．Ｅ．（２００８）．Ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ ｋｉｎａｓｅ ＩＩ ｉｎ ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ．（Ｂｅｔｈｅｓｄａ．）２３，１５１−１５９．
Ｄａｓｈ，Ｐ．Ｋ．，Ｋａｒｌ，Ｋ．Ａ．，Ｃｏｌｉｃｏｓ，Ｍ．Ａ．，Ｐｒｙｗｅｓ，Ｒ．，ａｎｄ Ｋａｎｄｅｌ，Ｅ．Ｒ．（１９９１）．ｃＡＭＰ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｅｌｅｍｅｎｔ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｓ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｂｙ Ｃａ２＋／ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ− ａｓ ｗｅｌｌ ａｓ ｃＡＭＰ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．８８，５０６１−５０６５．
Ｅｎｇ，Ｊ．Ｋ．，ＭｃＣｏｒｍａｃｋ，Ａ．Ｌ．，ａｎｄ Ｙａｔｅｓ，Ｊ．Ｒ．，ＩＩＩ（１９９４）．Ａｎ ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ ｃｏｒｒｅｌａｔｅ ｔａｎｄｅｍ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒａｌ ｄａｔａ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｗｉｔｈ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｉｎ ａ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄａｔａｂａｓｅ．Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ５，９７６−９８９．
Ｅｎｇｅｌ，Ｆ．Ｂ．，Ｓｃｈｅｂｅｓｔａ，Ｍ．，Ｄｕｏｎｇ，Ｍ．Ｔ．，Ｌｕ，Ｇ．，Ｒｅｎ，Ｓ．，Ｍａｄｗｅｄ，Ｊ．Ｂ．，Ｊｉａｎｇ，Ｈ．，Ｗａｎｇ，Ｙ．，ａｎｄ Ｋｅａｔｉｎｇ，Ｍ．Ｔ．（２００５）．ｐ３８ ＭＡＰ ｋｉｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｅｎａｂｌｅｓ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａｄｕｌｔ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ．Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１９，１１７５−１１８７．
Ｅｓｓｅｒｓ，Ｍ．Ａ．，Ｗｅｉｊｚｅｎ，Ｓ．，ｄｅ Ｖｒｉｅｓ−Ｓｍｉｔｓ，Ａ．Ｍ．，Ｓａａｒｌｏｏｓ，Ｉ．，ｄｅ Ｒｕｉｔｅｒ，Ｎ．Ｄ．，Ｂｏｓ，Ｊ．Ｌ．，ａｎｄ Ｂｕｒｇｅｒｉｎｇ，Ｂ．Ｍ．（２００４）．ＦＯＸＯ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｂｙ ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｓｔｒｅｓｓ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｓｍａｌｌ ＧＴＰａｓｅ Ｒａｌ ａｎｄ ＪＮＫ．ＥＭＢＯ Ｊ．２３，４８０２−４８１２．
Ｆｒｉｅｄｍａｎｎ，Ｎ．ａｎｄ Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ，Ｈ．（１９７０）．Ｃａｌｃｉｕｍ，ｍａｎｇａｎｅｓｅ ａｎｄ ｈｅｐａｔｉｃ ｇｌｕｃｏｎｅｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．２２２，４１−５２．
Ｈａｌｌ，Ｒ．Ｋ．，Ｓｌａｄｅｋ，Ｆ．Ｍ．，ａｎｄ Ｇｒａｎｎｅｒ，Ｄ．Ｋ．（１９９５）．Ｔｈｅ ｏｒｐｈａｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ＣＯＵＰ−ＴＦ ａｎｄ ＨＮＦ−４ ｓｅｒｖｅ ａｓ ａｃｃｅｓｓｏｒｙ ｆａｃｔｏｒｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｈｏｓｐｈｏｅｎｏｌｐｙｒｕｖａｔｅ ｃａｒｂｏｘｙｋｉｎａｓｅ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｂｙ ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄｓ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．９２，４１２−４１６．
Ｈａｍｍａｄ，Ｅ．Ｓ．，Ｓｔｒｉｆｆｌｅｒ，Ｊ．Ｓ．，ａｎｄ Ｃａｒｄｅｌｌ，Ｒ．Ｒ．，Ｊｒ．（１９８２）．Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎｓ ｏｎ ｈｅｐａｔｉｃ ｇｌｙｃｏｇｅｎ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｉｎ ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｄｉａｂｅｔｉｃ（ｄｂ／ｄｂ）ｍｉｃｅ．Ｄｉａｂｅｔｅ Ｍｅｔａｂ．８，１４７−１５３．
Ｈａｎｓｅｎ，Ｌ．Ｈ．，Ｇｒｏｍａｄａ，Ｊ．，Ｂｏｕｃｈｅｌｏｕｃｈｅ，Ｐ．，Ｗｈｉｔｍｏｒｅ，Ｔ．，Ｊｅｌｉｎｅｋ，Ｌ．，Ｋｉｎｄｓｖｏｇｅｌ，Ｗ．，ａｎｄ Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ，Ｅ．（１９９８）．Ｇｌｕｃａｇｏｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｃａ２＋ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｉｎ ＢＨＫ ｃｅｌｌｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｃｌｏｎｅｄ ｈｕｍａｎ ｇｌｕｃａｇｏｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２７４，Ｃ１５５２−Ｃ１５６２．
Ｈａｒａｎｏ，Ｙ．，Ｋａｓｈｉｗａｇｉ，Ａ．，Ｋｏｊｉｍａ，Ｈ．，Ｓｕｚｕｋｉ，Ｍ．，Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ，Ｔ．，ａｎｄ Ｓｈｉｇｅｔａ，Ｙ．（１９８５）．Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｒｎｉｔｉｎｅ ｐａｌｍｉｔｏｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ａｎｄ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｂｙ ｇｌｕｃａｇｏｎ ｉｎ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｒａｔ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ．ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．１８８，２６７−２７２．
Ｈｅｒｚｉｇ，Ｓ．，Ｌｏｎｇ，Ｆ．，Ｊｈａｌａ，Ｕ．Ｓ．，Ｈｅｄｒｉｃｋ，Ｓ．，Ｑｕｉｎｎ，Ｒ．，Ｂａｕｅｒ，Ａ．，Ｒｕｄｏｌｐｈ，Ｄ．，Ｓｃｈｕｔｚ，Ｇ．，Ｙｏｏｎ，Ｃ．，Ｐｕｉｇｓｅｒｖｅｒ，Ｐ．，Ｓｐｉｅｇｅｌｍａｎ，Ｂ．，ａｎｄ Ｍｏｎｔｍｉｎｙ，Ｍ．（２００１）．ＣＲＥＢ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｈｅｐａｔｉｃ ｇｌｕｃｏｎｅｏｇｅｎｅｓｉｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｈｅ ｃｏａｃｔｉｖａｔｏｒ ＰＧＣ−１．Ｎａｔｕｒｅ．４１３，１７９−１８３．
Ｋｒａｕｓ−Ｆｒｉｅｄｍａｎｎ，Ｎ．ａｎｄ Ｆｅｎｇ，Ｌ．（１９９６）．Ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｃａ２＋ ｉｎ ｔｈｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｌｕｃｏｎｅｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ．４５，３８９−４０３．
Ｌｉｎ，Ｈ．Ｖ．ａｎｄ Ａｃｃｉｌｉ，Ｄ．（２０１１）．Ｈｏｒｍｏｎａｌ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｅｐａｔｉｃ ｇｌｕｃｏｓｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｃｅｌｌ Ｍｅｔａｂ．１４，９−１９．
Ｌｉｕ，Ｈ．，Ｓａｄｙｇｏｖ，Ｒ．Ｇ．，ａｎｄ Ｙａｔｅｓ，Ｊ．Ｒ．，ＩＩＩ（２００４）．Ａ ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ ｒａｎｄｏｍ ｓａｍｐｌｉｎｇ ａｎｄ ｅｓｔｉｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｌａｔｉｖｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｂｕｎｄａｎｃｅ ｉｎ ｓｈｏｔｇｕｎ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ．Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７６，４１９３−４２０１．
Ｌｕ，Ｂ．，Ｒｕｓｅ，Ｃ．，Ｘｕ，Ｔ．，Ｐａｒｋ，Ｓ．Ｋ．，ａｎｄ Ｙａｔｅｓ，Ｊ．，ＩＩＩ（２００７）．Ａｕｔｏｍａｔｉｃ ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｈｏｓｐｈｏｐｅｐｔｉｄｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｒｏｍ ｔａｎｄｅｍ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒａ．Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７９，１３０１−１３１０．
ＭａｃＣｏｓｓ，Ｍ．Ｊ．，ＭｃＤｏｎａｌｄ，Ｗ．Ｈ．，Ｓａｒａｆ，Ａ．，Ｓａｄｙｇｏｖ，Ｒ．，Ｃｌａｒｋ，Ｊ．Ｍ．，Ｔａｓｔｏ，Ｊ．Ｊ．，Ｇｏｕｌｄ，Ｋ．Ｌ．，Ｗｏｌｔｅｒｓ，Ｄ．，Ｗａｓｈｂｕｒｎ，Ｍ．，Ｗｅｉｓｓ，Ａ．，Ｃｌａｒｋ，Ｊ．Ｉ．，ａｎｄ Ｙａｔｅｓ，Ｊ．Ｒ．，ＩＩＩ（２００２）．Ｓｈｏｔｇｕｎ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｒｏｍ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ａｎｄ ｌｅｎｓ ｔｉｓｓｕｅ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．９９，７９００−７９０５．
Ｍａｒｑｕｅｓ−ｄａ−Ｓｉｌｖａ，Ａ．Ｃ．，Ｄ’Ａｖｉｌａ，Ｒ．Ｂ．，Ｆｅｒｒａｒｉ，Ａ．Ｇ．，Ｋｅｌｍｅｒ−Ｂｒａｃｈｔ，Ａ．Ｍ．，Ｃｏｎｓｔａｎｔｉｎ，Ｊ．，Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｎ．Ｓ．，ａｎｄ Ｂｒａｃｈｔ，Ａ．（１９９７）．Ｃａ２＋ ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ ｏｆ ｇｌｕｃｏｎｅｏｇｅｎｅｓｉｓ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｂｙ ｇｌｕｃａｇｏｎ ａｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ ＮＡＤ（＋）−ＮＡＤＨ ｒｅｄｏｘ ｐｏｔｅｎｔｉａｌｓ．Ｂｒａｚ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ Ｒｅｓ．３０，８２７−８３６．
Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ，Ｍ．，Ｐｏｃａｉ，Ａ．，Ｒｏｓｓｅｔｔｉ，Ｌ．，Ｄｅｐｉｎｈｏ，Ｒ．Ａ．，ａｎｄ Ａｃｃｉｌｉ，Ｄ．（２００７）．Ｉｍｐａｉｒｅｄ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｅｐａｔｉｃ ｇｌｕｃｏｓｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ ｍｉｃｅ ｌａｃｋｉｎｇ ｔｈｅ ｆｏｒｋｈｅａｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ Ｆｏｘｏ１ ｉｎ ｌｉｖｅｒ．Ｃｅｌｌ Ｍｅｔａｂ ６，２０８−２１６．
ＭｃＤｏｎａｌｄ，Ｗ．Ｈ．，Ｔａｂｂ，Ｄ．Ｌ．，Ｓａｄｙｇｏｖ，Ｒ．Ｇ．，ＭａｃＣｏｓｓ，Ｍ．Ｊ．，Ｖｅｎａｂｌｅ，Ｊ．，Ｇｒａｕｍａｎｎ，Ｊ．，Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｊ．Ｒ．，Ｃｏｃｉｏｒｖａ，Ｄ．，ａｎｄ Ｙａｔｅｓ，Ｊ．Ｒ．，ＩＩＩ（２００４）．ＭＳ１，ＭＳ２，ａｎｄ ＳＱＴ−ｔｈｒｅｅ ｕｎｉｆｉｅｄ，ｃｏｍｐａｃｔ，ａｎｄ ｅａｓｉｌｙ ｐａｒｓｅｄ ｆｉｌｅ ｆｏｒｍａｔｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｓｔｏｒａｇｅ ｏｆ ｓｈｏｔｇｕｎ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ ｓｐｅｃｔｒａ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｒａｐｉｄ Ｃｏｍｍｕｎ．Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．１８，２１６２−２１６８．
Ｍｉｎｅ，Ｔ．，Ｋｏｊｉｍａ，Ｉ．，ａｎｄ Ｏｇａｔａ，Ｅ．（１９９３）．Ｒｏｌｅ ｏｆ ｃａｌｃｉｕｍ ｆｌｕｘｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｇｌｕｃａｇｏｎ ｏｎ ｇｌｕｃｏｓｅ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｉｎ ｒａｔ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ．Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２６５，Ｇ３５−Ｇ４２．
Ｎａｉｍｉ，Ｍ．，Ｇａｕｔｉｅｒ，Ｎ．，Ｃｈａｕｓｓａｄｅ，Ｃ．，Ｖａｌｖｅｒｄｅ，Ａ．Ｍ．，Ａｃｃｉｌｉ，Ｄ．，ａｎｄ Ｖａｎ，Ｏ．Ｅ．（２００７）．Ｎｕｃｌｅａｒ ｆｏｒｋｈｅａｄ ｂｏｘ Ｏ１ ｃｏｎｔｒｏｌｓ ａｎｄ ｉｎｔｅｇｒａｔｅｓ ｋｅｙ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙｓ ｉｎ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ．１４８，２４２４−２４３４．
Ｎａｋａｅ，Ｊ．，Ｂｉｇｇｓ，Ｗ．Ｈ．，ＩＩＩ，Ｋｉｔａｍｕｒａ，Ｔ．，Ｃａｖｅｎｅｅ，Ｗ．Ｋ．，Ｗｒｉｇｈｔ，Ｃ．Ｖ．，Ａｒｄｅｎ，Ｋ．Ｃ．，ａｎｄ Ａｃｃｉｌｉ，Ｄ．（２００２）．Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｓｕｌｉｎ ａｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｂｅｔａ−ｃｅｌｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｂｙ ｍｕｔａｔｅｄ ａｌｌｅｌｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｇｅｎｅ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｆｏｒｋｈｅａｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ Ｆｏｘｏ１．Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．３２，２４５−２５３．
Ｎａｋａｅ，Ｊ．，Ｋｉｔａｍｕｒａ，Ｔ．，Ｓｉｌｖｅｒ，Ｄ．Ｌ．，ａｎｄ Ａｃｃｉｌｉ，Ｄ．（２００１）．Ｔｈｅ ｆｏｒｋｈｅａｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ Ｆｏｘｏ１（Ｆｋｈｒ）ｃｏｎｆｅｒｓ ｉｎｓｕｌｉｎ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｏｎｔｏ ｇｌｕｃｏｓｅ−６−ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０８，１３５９−１３６７．
Ｐｅｎｇ，Ｊ．，Ｅｌｉａｓ，Ｊ．Ｅ．，Ｔｈｏｒｅｅｎ，Ｃ．Ｃ．，Ｌｉｃｋｌｉｄｅｒ，Ｌ．Ｊ．，ａｎｄ Ｇｙｇｉ，Ｓ．Ｐ．（２００３）．Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｌｔｉｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｃｏｕｐｌｅｄ ｗｉｔｈ ｔａｎｄｅｍ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ（ＬＣ／ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）ｆｏｒ ｌａｒｇｅ−ｓｃａｌｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎａｌｙｓｉｓ：ｔｈｅ ｙｅａｓｔ ｐｒｏｔｅｏｍｅ．Ｊ．Ｐｒｏｔｅｏｍｅ．Ｒｅｓ．２，４３−５０．
Ｐｆｌｅｉｄｅｒｅｒ，Ｐ．Ｊ．，Ｌｕ，Ｋ．Ｋ．，Ｃｒｏｗ，Ｍ．Ｔ．，Ｋｅｌｌｅｒ，Ｒ．Ｓ．，ａｎｄ Ｓｉｎｇｅｒ，Ｈ．Ａ．（２００４）．Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｖａｓｃｕｌａｒ ｓｍｏｏｔｈ ｍｕｓｃｌｅ ｃｅｌｌ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ ｂｙ ｃａｌｃｉｕｍ／ ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ＩＩ−ｄｅｌｔａ ２．Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ ２８６，Ｃ１２３８−Ｃ１２４５．
Ｐｉｌｋｉｓ，Ｓ．Ｊ．ａｎｄ Ｇｒａｎｎｅｒ，Ｄ．Ｋ．（１９９２）．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｅｐａｔｉｃ ｇｌｕｃｏｎｅｏｇｅｎｅｓｉｓ ａｎｄ ｇｌｙｃｏｌｙｓｉｓ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．５４：８８５−９０９．，８８５−９０９．
Ｐｕｉｇｓｅｒｖｅｒ，Ｐ．，Ｒｈｅｅ，Ｊ．，Ｄｏｎｏｖａｎ，Ｊ．，Ｗａｌｋｅｙ，Ｃ．Ｊ．，Ｙｏｏｎ，Ｊ．Ｃ．，Ｏｒｉｅｎｔｅ，Ｆ．，Ｋｉｔａｍｕｒａ，Ｙ．，Ａｌｔｏｍｏｎｔｅ，Ｊ．，Ｄｏｎｇ，Ｈ．，Ａｃｃｉｌｉ，Ｄ．，ａｎｄ Ｓｐｉｅｇｅｌｍａｎ，Ｂ．Ｍ．（２００３）．Ｉｎｓｕｌｉｎ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｈｅｐａｔｉｃ ｇｌｕｃｏｎｅｏｇｅｎｅｓｉｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ＦＯＸＯ１−ＰＧＣ−１ａｌｐｈａ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ．４２３，５５０−５５５．
Ｐｕｔｈａｎｖｅｅｔｉｌ，Ｐ．，Ｗａｎｇ，Ｙ．，Ｗａｎｇ，Ｆ．，Ｋｉｍ，Ｍ．Ｓ．，Ａｂｒａｈａｎｉ，Ａ．，ａｎｄ Ｒｏｄｒｉｇｕｅｓ，Ｂ．（２０１０）．Ｔｈｅ ｉｎｃｒｅａｓｅ ｉｎ ｃａｒｄｉａｃ ｐｙｒｕｖａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ｋｉｎａｓｅ−４ ａｆｔｅｒ ｓｈｏｒｔ−ｔｅｒｍ ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ ｉｓ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｂｙ ａｎ Ａｋｔ−ｐ３８−ｆｏｒｋｈｅａｄ ｂｏｘ ｏｔｈｅｒ ｆａｃｔｏｒ−１ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ａｘｉｓ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ．１５１，２３０６−２３１８．
Ｒａｄｚｉｕｋ，Ｊ．ａｎｄ Ｐｙｅ，Ｓ．（２００１）．Ｈｅｐａｔｉｃ ｇｌｕｃｏｓｅ ｕｐｔａｋｅ，ｇｌｕｃｏｎｅｏｇｅｎｅｓｉｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｌｙｃｏｇｅｎ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｍｅｔａｂ Ｒｅｓ．Ｒｅｖ．１７，２５０−２７２．
Ｒｈｅｅ，Ｊ．，Ｉｎｏｕｅ，Ｙ．，Ｙｏｏｎ，Ｊ．Ｃ．，Ｐｕｉｇｓｅｒｖｅｒ，Ｐ．，Ｆａｎ，Ｍ．，Ｇｏｎｚａｌｅｚ，Ｆ．Ｊ．，ａｎｄ Ｓｐｉｅｇｅｌｍａｎ，Ｂ．Ｍ．（２００３）．Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｅｐａｔｉｃ ｆａｓｔｉｎｇ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｂｙ ＰＰＡＲｇａｍｍａ ｃｏａｃｔｉｖａｔｏｒ−１ａｌｐｈａ（ＰＧＣ−１）： ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔ ｆｏｒ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ ｎｕｃｌｅａｒ ｆａｃｔｏｒ ４ａｌｐｈａ ｉｎ ｇｌｕｃｏｎｅｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．１００，４０１２−４０１７．
Ｓａｌｔｉｅｌ，Ａ．Ｒ．（２００１）．Ｎｅｗ ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ａｎｄ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｔｙｐｅ ２ ｄｉａｂｅｔｅｓ．Ｃｅｌｌ．１０４，５１７−５２９．
Ｓｈｅｎｇ，Ｍ．，Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｍ．Ａ．，ａｎｄ Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ，Ｍ．Ｅ．（１９９１）．ＣＲＥＢ： ａ Ｃａ（２＋）−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ ｂｙ ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｋｉｎａｓｅｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２５２，１４２７−１４３０．
Ｓｉｎｇｅｒ，Ｈ．Ａ．（２０１１）．Ｃａ２＋／ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ＩＩ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．
Ｓｏｒｅｎｓｅｎ，Ｈ．，Ｂｒａｎｄ，Ｃ．Ｌ．，Ｎｅｓｃｈｅｎ，Ｓ．，Ｈｏｌｓｔ，Ｊ．Ｊ．，Ｆｏｓｇｅｒａｕ，Ｋ．，Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ，Ｅ．，ａｎｄ Ｓｈｕｌｍａｎ，Ｇ．Ｉ．（２００６）．Ｉｍｍｕｎｏｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｇｌｕｃａｇｏｎ ｒｅｄｕｃｅｓ ｈｅｐａｔｉｃ ｇｌｕｃｏｓｅ ｏｕｔｐｕｔ ａｎｄ ｉｍｐｒｏｖｅｓ ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ ｇｌｙｃｅｍｉｃ ｃｏｎｔｒｏｌ ｉｎ ｄｉａｂｅｔｉｃ ｏｂ／ｏｂ ｍｉｃｅ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ．５５，２８４３−２８４８．
Ｓｔａｄｄｏｎ，Ｊ．Ｍ．ａｎｄ Ｈａｎｓｆｏｒｄ，Ｒ．Ｇ．（１９８９）．Ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｉｎｄｉｃａｔｉｎｇ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｇｌｕｃａｇｏｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｉｎｃｒｅａｓｅ ｉｎ ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ｆｒｅｅ Ｃａ２＋ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｉｎ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ ｉｓ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ ａｎ ｉｎｃｒｅａｓｅ ｉｎ ｃｙｃｌｉｃ ＡＭＰ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１７９，４７−５２．
Ｔａｂｂ，Ｄ．Ｌ．，ＭｃＤｏｎａｌｄ，Ｗ．Ｈ．，ａｎｄ Ｙａｔｅｓ，Ｊ．Ｒ．，ＩＩＩ（２００２）．ＤＴＡＳｅｌｅｃｔ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒａｓｔ： ｔｏｏｌｓ ｆｏｒ ａｓｓｅｍｂｌｉｎｇ ａｎｄ ｃｏｍｐａｒｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｒｏｍ ｓｈｏｔｇｕｎ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ．Ｊ．Ｐｒｏｔｅｏｍｅ．Ｒｅｓ．１，２１−２６．
Ｕｎｇｅｒ，Ｒ．Ｈ．ａｎｄ Ｃｈｅｒｒｉｎｇｔｏｎ，Ａ．Ｄ．（２０１２）．Ｇｌｕｃａｇｏｎｏｃｅｎｔｒｉｃ ｒｅｓｔｒｕｃｔｕｒｉｎｇ ｏｆ ｄｉａｂｅｔｅｓ： ａ ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃ ａｎｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｍａｋｅｏｖｅｒ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１２２，４−１２．
Ｖａｌｅｒａ，Ａ．，Ｓｏｌａｎｅｓ，Ｇ．，ａｎｄ Ｂｏｓｃｈ，Ｆ．（１９９３）．Ｃａｌｃｉｕｍ−ｍｏｂｉｌｉｚｉｎｇ ｅｆｆｅｃｔｏｒｓ ｉｎｈｉｂｉｔ Ｐ−ｅｎｏｌｐｙｒｕｖａｔｅ ｃａｒｂｏｘｙｋｉｎａｓｅ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｒａｔ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ．ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．３３３，３１９−３２４．
ｖａｎ ｄｅｒ Ｈｏｒｓｔ，Ａ．ａｎｄ Ｂｕｒｇｅｒｉｎｇ，Ｂ．Ｍ．（２００７）．Ｓｔｒｅｓｓｉｎｇ ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ＦｏｘＯ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｌｉｆｅｓｐａｎ ａｎｄ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．８，４４０−４５０．
ｖｏｎ Ｇｒｏｏｔｅ−Ｂｉｄｌｉｎｇｍａｉｅｒ，Ｆ．，Ｓｃｈｍｏｌｌ，Ｄ．，Ｏｒｔｈ，Ｈ．Ｍ．，Ｊｏｏｓｔ，Ｈ．Ｇ．，Ｂｅｃｋｅｒ，Ｗ．，ａｎｄ Ｂａｒｔｈｅｌ，Ａ．（２００３）．ＤＹＲＫ１ ｉｓ ａ ｃｏ−ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｏｆ ＦＫＨＲ（ＦＯＸＯ１ａ）−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｇｌｕｃｏｓｅ−６−ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．３００，７６４−７６９．
Ｘｕ，Ｔ．，Ｖｅｎａｂｌｅ，Ｊ．Ｄ．，Ｐａｒｋ，Ｓ．Ｋ．，Ｃｏｃｉｏｒｖａ，Ｄ．，Ｌｕ，Ｂ．，Ｌｉａｏ，Ｌ．，Ｗｏｈｌｓｃｈｌｅｇｅｌ，Ｊ．，Ｈｅｗｅｌ，Ｊ．，ａｎｄ Ｙａｔｅｓ，Ｊ．Ｒ．（２００６）．ＰｒｏＬｕＣＩＤ，ａ ｆａｓｔ ａｎｄ ｓｅｎｓｔｉｖｅ ｔａｎｄｅｍ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒａ−ｂａｓｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｐｒｏｇｒａｍ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ５，Ｓ１７４．
Ｙｏｏｎ，Ｊ．Ｃ．，Ｐｕｉｇｓｅｒｖｅｒ，Ｐ．，Ｃｈｅｎ，Ｇ．，Ｄｏｎｏｖａｎ，Ｊ．，Ｗｕ，Ｚ．，Ｒｈｅｅ，Ｊ．，Ａｄｅｌｍａｎｔ，Ｇ．，Ｓｔａｆｆｏｒｄ，Ｊ．，Ｋａｈｎ，Ｃ．Ｒ．，Ｇｒａｎｎｅｒ，Ｄ．Ｋ．，Ｎｅｗｇａｒｄ，Ｃ．Ｂ．，ａｎｄ Ｓｐｉｅｇｅｌｍａｎ，Ｂ．Ｍ．（２００１）．Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｈｅｐａｔｉｃ ｇｌｕｃｏｎｅｏｇｅｎｅｓｉｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｃｏａｃｔｉｖａｔｏｒ ＰＧＣ−１．Ｎａｔｕｒｅ．４１３，１３１−１３８
Ａｋａｇｉ，Ｋ．，Ｓａｎｄｉｇ，Ｖ．，Ｖｏｏｉｊｓ，Ｍ．，ｖａｎ，ｄ．，Ｖ，Ｇｉｏｖａｎｎｉｎｉ，Ｍ．，Ｓｔｒａｕｓｓ，Ｍ．，ａｎｄ Ｂｅｒｎｓ，Ａ．（１９９７）．
Ｃｒｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｓｏｍａｔｉｃ ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｉｎ ｍｉｃｅ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５，１７６６−１７７３．
Ａｓａｄａ，Ｓ．，Ｄａｉｔｏｋｕ，Ｈ．，Ｍａｔｓｕｚａｋｉ，Ｈ．，Ｓａｉｔｏ，Ｔ．，Ｓｕｄｏ，Ｔ．，Ｍｕｋａｉ，Ｈ．，Ｉｗａｓｈｉｔａ，Ｓ．，Ｋａｋｏ，Ｋ．，Ｋｉｓｈｉ，Ｔ．，Ｋａｓｕｙａ，Ｙ．，ａｎｄ Ｆｕｋａｍｉｚｕ，Ａ．（２００７）．Ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅｓ，Ｅｒｋ ａｎｄ ｐ３８，ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅ ａｎｄ ｒｅｇｕｌａｔｅ Ｆｏｘｏ１．Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌ．１９，５１９−５２７．
Ａｙａｌａ，Ｊ．Ｅ．，Ｓｔｒｅｅｐｅｒ，Ｒ．Ｓ．，Ｄｅｓｇｒｏｓｅｌｌｉｅｒ，Ｊ．Ｓ．，Ｄｕｒｈａｍ，Ｓ．Ｋ．，Ｓｕｗａｎｉｃｈｋｕｌ，Ａ．，Ｓｖｉｔｅｋ，Ｃ．Ａ．，Ｇｏｌｄｍａｎ，Ｊ．Ｋ．，Ｂａｒｒ，Ｆ．Ｇ．，Ｐｏｗｅｌｌ，Ｄ．Ｒ．，ａｎｄ Ｏ’Ｂｒｉｅｎ，Ｒ．Ｍ．（１９９９）．Ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ｉｎｓｕｌｉｎ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｕｎｉｔ ｂｅｔｗｅｅｎ ｍｏｕｓｅ ａｎｄ ｈｕｍａｎ ｇｌｕｃｏｓｅ−６−ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ｃａｔａｌｙｔｉｃ ｓｕｂｕｎｉｔ ｇｅｎｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ： ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ＦＫＨＲ ｂｉｎｄｓ ｔｈｅ ｉｎｓｕｌｉｎ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ．４８，１８８５−１８８９．
Ｂａｒｔｈｅｌ，Ａ．，Ｓｃｈｍｏｌｌ，Ｄ．，Ｋｒｕｇｅｒ，Ｋ．Ｄ．，Ｂａｈｒｅｎｂｅｒｇ，Ｇ．，Ｗａｌｔｈｅｒ，Ｒ．，Ｒｏｔｈ，Ｒ．Ａ．，ａｎｄ Ｊｏｏｓｔ，Ｈ．Ｇ．（２００１）．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｇｌｕｃｏｓｅ−６−ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ａｎｄ ｐｈｏｓｐｈｏｅｎｏｌｐｙｒｕｖａｔｅ ｃａｒｂｏｘｙｋｉｎａｓｅ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｂｙ ｔｈｅ ｆｏｒｋｈｅａｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ＦＫＨＲ ｉｎ Ｈ４ＩＩＥ−ｈｅｐａｔｏｍａ ｃｅｌｌｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２８５，８９７−９０２．
Ｃａｎｔｉｎ，Ｇ．Ｔ．，Ｓｈｏｃｋ，Ｔ．Ｒ．，Ｐａｒｋ，Ｓ．Ｋ．，Ｍａｄｈａｎｉ，Ｈ．Ｄ．，ａｎｄ Ｙａｔｅｓ，Ｊ．Ｒ．，ＩＩＩ（２００７）．Ｏｐｔｉｍｉｚｉｎｇ ＴｉＯ２−ｂａｓｅｄ ｐｈｏｓｐｈｏｐｅｐｔｉｄｅ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ ｆｏｒ ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｍｕｌｔｉｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｃｏｕｐｌｅｄ ｔｏ ｔａｎｄｅｍ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ．Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７９，４６６６−４６７３．
Ｄｅｌａｈｕｎｔｙ，Ｃ．ａｎｄ Ｙａｔｅｓ，Ｊ．Ｒ．，ＩＩＩ（２００５）．Ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ２Ｄ−ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．３５，２４８−２５５．
Ｌｉｕ，Ｐ．，Ｊｅｎｋｉｎｓ，Ｎ．Ａ．，ａｎｄ Ｃｏｐｅｌａｎｄ，Ｎ．Ｇ．（２００３）．Ａ ｈｉｇｈｌｙ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｒｅｃｏｍｂｉｎｅｅｒｉｎｇ−ｂａｓｅｄ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ．Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．１３，４７６−４８４．
ＭａｃＣｏｓｓ，Ｍ．Ｊ．，ＭｃＤｏｎａｌｄ，Ｗ．Ｈ．，Ｓａｒａｆ，Ａ．，Ｓａｄｙｇｏｖ，Ｒ．，Ｃｌａｒｋ，Ｊ．Ｍ．，Ｔａｓｔｏ，Ｊ．Ｊ．，Ｇｏｕｌｄ，Ｋ．Ｌ．，Ｗｏｌｔｅｒｓ，Ｄ．，Ｗａｓｈｂｕｒｎ，Ｍ．，Ｗｅｉｓｓ，Ａ．，Ｃｌａｒｋ，Ｊ．Ｉ．，ａｎｄ Ｙａｔｅｓ，Ｊ．Ｒ．，ＩＩＩ（２００２）．Ｓｈｏｔｇｕｎ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｒｏｍ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ａｎｄ ｌｅｎｓ ｔｉｓｓｕｅ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．９９，７９００−７９０５．
Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ，Ｍ．，Ｏｇａｗａ，Ｗ．，Ｔｅｓｈｉｇａｗａｒａ，Ｋ．，Ｉｎｏｕｅ，Ｈ．，Ｍｉｙａｋｅ，Ｋ．，Ｓａｋａｕｅ，Ｈ．，ａｎｄ Ｋａｓｕｇａ，Ｍ．（２００２）．Ｒｏｌｅ ｏｆ ｔｈｅ ｉｎｓｕｌｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ １ ａｎｄ ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ ３−ｋｉｎａｓｅ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙ ｉｎ ｉｎｓｕｌｉｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｓｔｅｒｏｌ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｅｌｅｍｅｎｔ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ １ｃ ａｎｄ ｇｌｕｃｏｋｉｎａｓｅ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｒａｔ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ．５１，１６７２−１６８０．
Ｐｆｌｅｉｄｅｒｅｒ，Ｐ．Ｊ．，Ｌｕ，Ｋ．Ｋ．，Ｃｒｏｗ，Ｍ．Ｔ．，Ｋｅｌｌｅｒ，Ｒ．Ｓ．，ａｎｄ Ｓｉｎｇｅｒ，Ｈ．Ａ．（２００４）．Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｖａｓｃｕｌａｒ ｓｍｏｏｔｈ ｍｕｓｃｌｅ ｃｅｌｌ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ ｂｙ ｃａｌｃｉｕｍ／ ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ＩＩ−ｄｅｌｔａ ２．Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ ２８６，Ｃ１２３８−Ｃ１２４５．
Ｔａｎａｋａ，Ｊ．，Ｌｉ，Ｑ．，Ｂａｎｋｓ，Ａ．Ｓ．，Ｗｅｌｃｈ，Ｃ．Ｌ．，Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ，Ｍ．，Ｋｉｔａｍｕｒａ，Ｔ．，Ｉｄｏ−Ｋｉｔａｍｕｒａ，Ｙ．，Ｄｅｐｉｎｈｏ，Ｒ．Ａ．，ａｎｄ Ａｃｃｉｌｉ，Ｄ．（２００９）．Ｆｏｘｏ１ ｌｉｎｋｓ ｈｙｐｅｒｇｌｙｃｅｍｉａ ｔｏ ＬＤＬ ｏｘｉｄａｔｉｏｎ ａｎｄ ｅＮＯＳ ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ．
Ｔｉｍｍｉｎｓ，Ｊ．Ｍ．，Ｏｚｃａｎ，Ｌ．，Ｓｅｉｍｏｎ，Ｔ．Ａ．，Ｌｉ，Ｇ．，Ｍａｌａｇｅｌａｄａ，Ｃ．，Ｂａｃｋｓ，Ｊ．，Ｂａｃｋｓ，Ｔ．，Ｂａｓｓｅｌ−Ｄｕｂｙ，Ｒ．，Ｏｌｓｏｎ，Ｅ．Ｎ．，Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｍ．Ｅ．，ａｎｄ Ｔａｂａｓ，Ｉ．（２００９）．Ｃａｌｃｉｕｍ／ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ＩＩ ｌｉｎｋｓ ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ ｓｔｒｅｓｓ ｗｉｔｈ Ｆａｓ ａｎｄ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｐａｔｈｗａｙｓ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１９，２９２５−２９４１．
ｖｏｎ Ｇｒｏｏｔｅ−Ｂｉｄｌｉｎｇｍａｉｅｒ，Ｆ．，Ｓｃｈｍｏｌｌ，Ｄ．，Ｏｒｔｈ，Ｈ．Ｍ．，Ｊｏｏｓｔ，Ｈ．Ｇ．，Ｂｅｃｋｅｒ，Ｗ．，ａｎｄ Ｂａｒｔｈｅｌ，Ａ．（２００３）．ＤＹＲＫ１ ｉｓ ａ ｃｏ−ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｏｆ ＦＫＨＲ（ＦＯＸＯ１ａ）−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｇｌｕｃｏｓｅ−６−ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．３００，７６４−７６９．
Ｗａｒｍｉｎｇ，Ｓ．，Ｃｏｓｔａｎｔｉｎｏ，Ｎ．，Ｃｏｕｒｔ ＤＬ，Ｊｅｎｋｉｎｓ，Ｎ．Ａ．，ａｎｄ Ｃｏｐｅｌａｎｄ，Ｎ．Ｇ．（２００５）．Ｓｉｍｐｌｅ ａｎｄ ｈｉｇｈｌｙ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ＢＡＣ ｒｅｃｏｍｂｉｎｅｅｒｉｎｇ ｕｓｉｎｇ ｇａｌＫ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３３，ｅ３６．
Ｃｌｙｎｅ ＣＤ，Ｎｇｕｙｅｎ Ａ，Ｒａｉｎｅｙ ＷＥ，（１９９５）Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ＫＮ６２，ａ Ｃａ２＋／ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ＩＩ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ，ｏｎ ａｄｒｅｎｏｃｏｒｔｉｃａｌ ｃｅｌｌ ａｌｄｏｓｔｅｒｏｎｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．Ｅｎｄｏｃｒ Ｒｅｓ．，２１（１−２）：２５９−６５．
Ｔａｋａｏ Ｋ．，ｅｔ ａｌ．，（２００５），Ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｙｎａｐｔｉｃ Ｃａ２＋ ／ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ＩＩ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ｌｉｖｉｎｇ ｎｅｕｒｏｎｓ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，２５（１２）： ３１０７−３１１２．
Ｋｗｏｋ ｅｔ ａｌ．，（２００８），Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｅｎｃｏｄｅｄ ｐｒｏｂｅ ｆｏｒ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｌｉｆｅｔｉｍｅ ｉｍａｇｉｎｇ ｏｆ ＣａＭＫＩＩ ａｃｔｉｖｉｔｙ，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ．，３６９（２）：５１９−２５．
Ｔｏｋｕｍｉｔｓｕ ｅｔ ａｌ．，２００２，ＳＴＯ−６０９，ａ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ｔｈｅ Ｃａ２＋／Ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｋｉｎａｓｅ Ｋｉｎａｓｅ，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．，２７７（１８）：１５８１３−１５８１８．
Ｓｕｇｉｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，１９９７，ＤＹ−９７６０ｅ，ａ ｎｏｖｅｌ ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ ｗｉｔｈ ｃｙｔｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ａｃｔｉｏｎ，Ｅｕｒ Ｊ．Ｐｈａｒｍ．，３３６：９９−１０６．
Ｋａｓｅ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｋ−２５２ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ，ｎｏｖｅｌ ａｎｄ ｐｏｔｅｎｔ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ Ｃ ａｎｄ ｃｙｃｌｉｃ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅｓ，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ．，１４２：４３６−４４０．

Claims (82)

  1. 対象における代謝障害を治療または予防する方法であって、前記障害は、肥満によって誘発され、前記方法は、ＣａＭＫＩＩの活性を低減させ、それによって前記障害を治療または予防することを含む、方法。
  2. 代謝障害を有する対象における冠動脈疾患を治療または予防する方法であって、前記対象におけるＣａＭＫＩＩの活性を低減させ、それによって前記冠動脈疾患を治療または予防することを含む、方法。
  3. 対象における肝臓のグルコース生成を低減させる方法であって、ＣａＭＫＩＩの活性を低減させ、それによって前記対象における肝臓のグルコースの前記低減をもたらすことを含む、方法。
  4. 前記治療または予防は、前記対象のマクロファージにおけるＣａＭＫＩＩ活性を低減させることを含む、請求項２に記載の方法。
  5. 前記障害は、１型糖尿病、２型糖尿病、インスリン耐性、および代謝症候群からなる群から選択される、請求項１または２に記載の方法。
  6. 前記治療または予防は、前記対象におけるグリコーゲン分解またはグルコース新生に影響を及ぼす、請求項１または２に記載の方法。
  7. 前記治療または予防は、前記対象において、肝臓のグルコース生成、高血糖、脂肪肝、インスリン耐性、インスリン耐性に関連する炎症、インスリン耐性に関連する脂質異常症、またはそれらの組み合わせを低減させる、請求項１または２に記載の方法。
  8. 前記治療または予防は、ＣａＭＫＩＩのリン酸化および／または活性化を低減させる、請求項１または２に記載の方法。
  9. 前記ＣａＭＫＩＩの活性は、グルカゴンに誘発される活性である、請求項１または２に記載の方法。
  10. 前記治療または予防は、前記対象の細胞におけるＧ６ｐｃおよび／またはＰｃｋ１の発現を低減させる、請求項１または２に記載の方法。
  11. 前記治療または予防は、前記対象の細胞核におけるＦｏｘＯ１タンパク質レベルの量を低減させる、請求項１または２に記載の方法。
  12. 前記治療または予防は、前記ＦｏｘＯ１タンパク質のアミノ酸Ｓ２８４、Ｓ２９５、Ｓ３２６、Ｓ４６７、Ｓ４７５、Ｓ２４６、Ｓ２５３、Ｓ４１３、もしくはＳ４１５、またはそれらの組み合わせのリン酸化を低減させる、請求項１または２に記載の方法。
  13. 前記治療または予防は、前記対象に、前記ＣａＭＫＩＩタンパク質をコードする遺伝子の発現を低減させるアンチセンスＲＮＡを投与するステップを含む、請求項１または２に記載の方法。
  14. 前記治療または予防は、前記対象に、前記ＣａＭＫＩＩタンパク質に特異的に結合するペプチドまたはポリペプチドを投与するステップを含む、請求項１または２に記載の方法。
  15. 前記治療または予防は、前記対象に小分子を投与するステップを含む、請求項１または２に記載の方法。
  16. 前記小分子は、ＫＮ−９３、ラベンダスチンＣ、ＣＫ５９、Ａｎｔ−ＣａＭＫＩＩＮｔｉｄｅ、ＫＮ６２、ＤＹ９７６０ｅ、Ｋ−２５２ａノカルジオプシスｓｐ．、Ｈ８９ジヒドロクロリド、ＰＰ１アナログＩＩ、１ＮＭ−ＰＰ１、ｅＥＦ−２キナーゼ阻害剤ＮＨ１２５、およびＳＴＯ−６０９からなる群から選択されるＣａＭＫＩＩ阻害剤である、請求項１５に記載の方法。
  17. 前記冠動脈疾患は、アテローム発生および／またはアテローム性動脈硬化症と関連する、請求項２に記載の方法。
  18. 心不全、高血圧、および／または腎疾患を治療または予防することをさらに含む、請求項２に記載の方法。
  19. 前記障害は、進行病変のマクロファージのアポトーシスと関連する、請求項２に記載の方法。
  20. 前記障害は、プラーク壊死と関連する、請求項２に記載の方法。
  21. 前記代謝障害を有する対象における冠動脈疾患の治療または予防は、高インスリン血症および／または脂質異常症の低下をもたらす、請求項２に記載の方法。
  22. 前記代謝障害を有する対象における冠動脈疾患の治療または予防は、アテローム発生および／またはアテローム性動脈硬化症の低下をもたらす、請求項２に記載の方法。
  23. 前記肝臓のグルコース生成の低減は、ＣａＭＫＩＩのリン酸化および／または活性化を低減する、請求項３に記載の方法。
  24. 前記ＣａＭＫＩＩの活性は、グルカゴンに誘発される活性である、請求項３に記載の方法。
  25. 前記肝臓のグルコース生成の低減は、前記対象の細胞におけるＧ６ｐｃおよび／またはＰｃｋ１の発現を低減させる、請求項３に記載の方法。
  26. 前記肝臓のグルコース生成の低減は、前記対象において、高血糖、脂肪肝、インスリン耐性、インスリン耐性に関連する炎症、インスリン耐性に関連する脂質異常症、またはそれらの組み合わせを低減させる、請求項３に記載の方法。
  27. 前記肝臓のグルコース生成の低減は、前記対象の細胞核におけるＦｏｘＯ１タンパク質レベルの量を低減させる、請求項３に記載の方法。
  28. 前記肝臓のグルコース生成の低減は、前記ＦｏｘＯ１タンパク質のアミノ酸Ｓ２８４、Ｓ２９５、Ｓ３２６、Ｓ４６７、Ｓ４７５、Ｓ２４６、Ｓ２５３、Ｓ４１３、もしくはＳ４１５、またはそれらの組み合わせのリン酸化を低減させる、請求項３に記載の方法。
  29. 前記肝臓のグルコース生成の低減は、前記対象に、前記ＣａＭＫＩＩタンパク質をコードする遺伝子の発現を低減させるアンチセンスＲＮＡを投与するステップを含む、請求項３に記載の方法。
  30. 前記肝臓のグルコース生成の低減は、前記対象に、前記ＣａＭＫＩＩタンパク質に特異的に結合するペプチドまたはポリペプチドを投与するステップを含む、請求項３に記載の方法。
  31. 前記肝臓のグルコース生成の低減は、前記対象に小分子を投与するステップを含む、請求項３に記載の方法。
  32. 前記小分子は、ＫＮ−９３、ラベンダスチンＣ、ＣＫ５９、Ａｎｔ−ＣａＭＫＩＩＮｔｉｄｅ、ＫＮ６２、ＤＹ９７６０ｅ、Ｋ−２５２ａノカルジオプシスｓｐ．、Ｈ８９ジヒドロクロリド、ＰＰ１アナログＩＩ、１ＮＭ−ＰＰ１、ｅＥＦ−２キナーゼ阻害剤ＮＨ１２５、およびＳＴＯ−６０９からなる群から選択されるＣａＭＫＩＩ阻害剤である、請求項３１に記載の方法。
  33. ＣａＭＫＩＩの活性を阻害する化合物を識別する方法であって、
    ａ）細胞をＣａＭＫＩＩ融合タンパク質と接触させる工程であって、前記ＣａＭＫＩＩ融合タンパク質が、一端にアクセプターフルオロフォアタンパク質と、他端にドナーフルオロフォアタンパク質とを含む工程と、
    ｂ）試験化合物の不在下および存在下においてＦＲＥＴ効率を測定する工程であって、前記試験化合物の不在下における前記ＦＲＥＴ効率と比較して高い前記試験化合物の存在下のＦＲＥＴ効率が、前記試験化合物が前記ＣａＭＫＩＩの活性を阻害することを示す工程と
    を含む、方法。
  34. 前記アクセプターフルオロフォアタンパク質は、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、Ｖｅｎｕｓ、黄色蛍光タンパク質、シアン蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、および緑色蛍光タンパク質からなる群から選択される、請求項３３に記載の方法。
  35. 前記細胞は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、肝細胞、Ｕ２ＯＳ細胞、ＨｅＬａ細胞、マウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）、またはマクロファージである、請求項３３または３４に記載の方法。
  36. 前記細胞は、Ｉｎｓｒ−／−マウス、Ｃａｍｋ２ｇ−／−マウス、Ｆｏｘｏ１−／−マウス、ｄｂ／ｄｂマウス、ｏｂ／ｏｂマウス、ｐ３８−／−マウス、非肥満糖尿病（ＮＯＤ）マウス、高脂肪食を与えたマウス、またはストレプトゾトシン処置マウスに由来する、請求項３３〜３５のいずれか１項に記載の方法。
  37. 前記細胞は、突然変異ＦｏｘＯ１タンパク質を発現するマウスに由来する、請求項３３〜３５のいずれか１項に記載の方法。
  38. 前記突然変異ＦｏｘＯ１タンパク質は、Ｓ２８４、Ｓ２９５、Ｓ３２６、Ｓ４６７、Ｓ４７５、Ｓ２４６、Ｓ２５３、Ｓ４１３、もしくはＳ４１５にアラニン置換、またはＳ２８４、Ｓ２９５、Ｓ３２６、Ｓ４６７、Ｓ４７５、Ｓ２４６、Ｓ２５３、Ｓ４１３、もしくはＳ４１５にアスパラギン酸置換、またはそれらの組み合わせを含む、請求項３７に記載の方法。
  39. 前記細胞は、ＥＲストレスに供される、請求項３３〜３８のいずれか１項に記載の方法。
  40. 前記細胞は、グルカゴン、８−ブロモｃＡＭＰ、Ｈ８９ジヒドロクロリド、ゼストスポンジンＣ、ホルスコリン、飽和脂肪酸、またはそれらの組み合わせで処置される、請求項３３〜３９のいずれか１項に記載の方法。
  41. 対象における代謝障害を治療または予防する方法であって、前記障害は、肥満によって誘発され、前記方法は、ＩＰ３Ｒ１、ＩＰ３Ｒ２、またはＩＰ３Ｒ３の活性を低減させ、それによって前記障害を治療または予防することを含む、方法。
  42. 対象における代謝障害を治療または予防する方法であって、前記障害は、肥満によって誘発され、前記方法は、カルシニューリンの活性を低減させ、それによって前記障害を治療または予防することを含む、方法。
  43. 前記障害は、１型糖尿病、２型糖尿病、インスリン耐性、肥満、および代謝症候群からなる群から選択される、請求項４１または４２に記載の方法。
  44. 前記治療または予防は、前記対象におけるグリコーゲン分解またはグルコース新生に影響を及ぼす、請求項４１または４２に記載の方法。
  45. 前記治療または予防は、前記対象において、肝臓のグルコース生成、高血糖、脂肪肝、インスリン耐性、インスリン耐性に関連する炎症、インスリン耐性に関連する脂質異常症、またはそれらの組み合わせを低減させる、請求項４１または４２に記載の方法。
  46. 前記治療または予防は、前記対象に、前記ＩＰ３Ｒ１タンパク質、ＩＰ３Ｒ２タンパク質、またはＩＰ３Ｒ３タンパク質をコードする遺伝子の発現を低減させるアンチセンスＲＮＡを投与するステップを含む、請求項４１に記載の方法。
  47. 前記治療および予防は、前記対象に、前記ＩＰ３Ｒ１タンパク質、ＩＰ３Ｒ２タンパク質、またはＩＰ３Ｒ３タンパク質に特異的に結合するペプチドまたはポリペプチドを投与するステップを含む、請求項４１に記載の方法。
  48. 前記治療または予防は、前記対象に小分子を投与するステップを含む、請求項４１に記載の方法。
  49. 前記小分子は、ＩＰ３Ｒ１タンパク質阻害剤、ＩＰ３Ｒ２タンパク質阻害剤、またはＩＰ３Ｒ３タンパク質阻害剤である、請求項４８に記載の方法。
  50. 前記治療または予防は、前記対象に、前記カルシニューリンタンパク質をコードする遺伝子の発現を低減させるアンチセンスＲＮＡを投与するステップを含む、請求項４２に記載の方法。
  51. 前記治療または予防は、前記対象に、前記カルシニューリンタンパク質に特異的に結合するペプチドまたはポリペプチドを投与するステップを含む、請求項４２に記載の方法。
  52. 前記治療または予防は、前記対象に小分子を投与するステップを含む、請求項４２に記載の方法。
  53. 前記小分子は、カルシニューリン阻害剤である、請求項５２に記載の方法。
  54. ＩＰ３Ｒ１、ＩＰ３Ｒ２、またはＩＰ３Ｒ３の活性を阻害する化合物を識別する方法であって、
    ａ）細胞を試験化合物と接触させる工程と、
    ｂ）ＩＰ３Ｒ１、ＩＰ３Ｒ２、またはＩＰ３Ｒ３活性を測定する工程であって、前記化合物の不在下における前記ＩＰ３Ｒ１、ＩＰ３Ｒ２、またはＩＰ３Ｒ３の活性と比較した、前記化合物の存在下における前記ＩＰ３Ｒ１、ＩＰ３Ｒ２、またはＩＰ３Ｒ３の活性の低減が、前記化合物がそれぞれＩＰ３Ｒ１、ＩＰ３Ｒ２、またはＩＰ３Ｒ３の阻害剤であることを示す工程と
    を含む、方法。
  55. 前記活性は、ＩＰ３の誘発物質での刺激後、前記細胞のサイトゾルへのカルシウム放出によって測定される、請求項５４に記載の方法。
  56. カルシウム放出は、サイトゾルカルシウム染料の蛍光の増加によって測定される、請求項５５に記載の方法。
  57. 前記サイトゾルカルシウム染料は、Ｆｌｕｏ−３である、請求項５６に記載の方法。
  58. カルシニューリンの活性を阻害する化合物を識別する方法であって、
    ａ）細胞を試験化合物と接触させる工程と、
    ｂ）カルシニューリン活性を測定する工程であって、前記化合物の不在下における前記カルシニューリンの活性と比較した、前記化合物の存在下における前記カルシニューリンの活性の低減が、前記化合物がカルシニューリンの阻害剤であることを示す工程と
    を含む、方法。
  59. 前記カルシニューリンの活性は、カルシニューリン基質ペプチドを使用して、ホスファターゼ活性の検出を通じて測定される、請求項５８に記載の方法。
  60. 前記細胞は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、肝細胞、Ｕ２ＯＳ細胞、ＨｅＬａ細胞、またはマウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）である、請求項５４〜５９のいずれか１項に記載の方法。
  61. 前記細胞は、ｄｂ／ｄｂマウス、ｏｂ／ｏｂマウス、非肥満糖尿病（ＮＯＤ）マウス、高脂肪食を与えたマウス、またはストレプトゾトシン処置マウスに由来する、請求項５４〜６０のいずれか１項に記載の方法。
  62. 前記細胞は、グルカゴン、Ｈ８９ジヒドロクロリド、インスリン、ホルスコリン、ＥＲストレスの誘発物質、ツニカマイシン、飽和脂肪酸、またはそれらの組み合わせで処置される、請求項５４〜６１のいずれか１項に記載の方法。
  63. 対象における代謝障害を治療または予防する方法であって、前記障害は、肥満によって誘発され、前記方法は、ｐ３８の活性を低減させ、それによって前記障害を治療または予防することを含む、方法。
  64. 対象における代謝障害を治療または予防する方法であって、前記障害は、肥満によって誘発され、前記方法は、ＭＫ２／３の活性を低減させ、それによって前記障害を治療または予防することを含む、方法。
  65. 前記障害は、１型糖尿病、２型糖尿病、インスリン耐性、肥満、および代謝症候群からなる群から選択される、請求項６３または６４に記載の方法。
  66. 前記治療または予防は、前記対象におけるグリコーゲン分解またはグルコース新生に影響を及ぼす、請求項６３または６４に記載の方法。
  67. 前記治療または予防は、前記対象において、肝臓のグルコース生成、高血糖、脂肪肝、インスリン耐性、インスリン耐性に関連する炎症、インスリン耐性に関連する脂質異常症、またはそれらの組み合わせを低減させる、請求項６３または６４に記載の方法。
  68. 前記治療または予防は、前記対象に、前記ｐ３８タンパク質をコードする遺伝子の発現を低減させるアンチセンスＲＮＡを投与するステップを含む、請求項６３に記載の方法。
  69. 前記治療または予防は、前記対象に、前記ｐ３８タンパク質に特異的に結合するペプチドまたはポリペプチドを投与するステップを含む、請求項６３に記載の方法。
  70. 前記治療または予防は、前記対象に小分子を投与するステップを含む、請求項６３に記載の方法。
  71. 前記小分子は、ｐ３８阻害剤である、請求項７０に記載の方法。
  72. 前記治療または予防は、前記対象に、前記ＭＫ２／３タンパク質をコードする遺伝子の発現を低減させるアンチセンスＲＮＡを投与するステップを含む、請求項６４に記載の方法。
  73. 前記治療または予防は、前記対象に、前記ＭＫ２／３タンパク質に特異的に結合するペプチドまたはポリペプチドを投与するステップを含む、請求項６４に記載の方法。
  74. 前記治療または予防は、前記対象に小分子を投与するステップを含む、請求項６４に記載の方法。
  75. 前記小分子は、ＭＫ２／３阻害剤である、請求項７４に記載の方法。
  76. ｐ３８の活性を阻害する化合物を識別する方法であって、
    ａ）細胞を試験化合物と接触させる工程と、
    ｂ）ｐ３８キナーゼ活性を測定する工程であって、前記化合物の不在下における前記ｐ３８のキナーゼ活性と比較した、前記化合物の存在下における前記ｐ３８のキナーゼ活性の低減が、前記化合物がｐ３８の阻害剤であることを示す工程と
    を含む、方法。
  77. ＭＫ２／３の活性を阻害する化合物を識別する方法であって、
    ａ）細胞を試験化合物と接触させる工程と、
    ｂ）ＭＫ２／３キナーゼ活性を測定する工程であって、前記化合物の不在下における前記ＭＫ２／３のキナーゼ活性と比較した、前記化合物の存在下における前記ＭＫ２／３のキナーゼ活性の低減が、前記化合物がＭＫ２／３の阻害剤であることを示す工程と
    を含む、方法。
  78. ｐ３８キナーゼ活性は、ｐ３８特異的ペプチドを使用して測定される、請求項７６に記載の方法。
  79. ＭＫ２／３キナーゼ活性は、ＭＫ２／３特異的ペプチドを使用して測定される、請求項７７に記載の方法。
  80. 前記細胞は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、肝細胞、Ｕ２ＯＳ細胞、ＨｅＬａ細胞、マクロファージ、またはマウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）である、請求項７６〜７９のいずれか１項に記載の方法。
  81. 前記細胞は、Ｉｎｓｒ−／−マウス、ｄｂ／ｄｂマウス、ｏｂ／ｏｂマウス、非肥満糖尿病（ＮＯＤ）マウス、高脂肪食を与えたマウス、またはストレプトゾトシン処置マウスに由来する、請求項７６〜８０のいずれか１項に記載の方法。
  82. 前記細胞は、グルカゴン、８−ブロモｃＡＭＰ、Ｈ８９ジヒドロクロリド、ホルスコリン、飽和脂肪酸、またはそれらの組み合わせで処置される、請求項７６〜８１のいずれか１項に記載の方法。
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