JP7366518B2 - 前立腺特異的膜抗原結合フィブロネクチンiii型ドメイン - Google Patents
前立腺特異的膜抗原結合フィブロネクチンiii型ドメイン Download PDFInfo
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Description
本発明は、ヒトPSMAに結合するFN3ドメイン、及び毒素又は検出可能な標識と結合させたPSMAに結合するFN3ドメインを提供する。本発明は、本発明のFN3ドメインをコードするポリヌクレオチド又はその相補的核酸、ベクター、宿主細胞、並びにそれらを作製及び使用する方法を提供する。
本発明は、必要に応じて毒素又は検出可能な標識と結合させたヒト前立腺特異的膜抗原(PSMA)に特異的に結合するフィブロネクチンIII型(FN3)ドメインを提供する。これらの分子は、治療及び診断用とで幅広く使用することができる。本発明は、本発明のFN3ドメインをコードしたポリヌクレオチド又はその相補的核酸、ベクター、宿主細胞、並びにそれらを作製及び使用する方法を提供する。
テンコン(配列番号1)は、ヒトテネイシンC由来の15個のFN3ドメインのコンセンサス配列から設計された、天然に存在しないフィブロネクチンIII型(FN3)ドメインである(Jacobs et al.,Protein Engineering,Design,and Selection,25:107~117,2012;米国特許出願公開第2010/0216708号)。テンコンの結晶構造は、FN3ドメインの特徴である7本のβ鎖をつなぐ6回表面露出ループを示し、各β鎖は、A、B、C、D、E、F、及びGと呼ばれ、各ループは、AB、BC、CD、DE、EF、及びFGループと呼ばれる(Bork and Doolittle,Proc Natl Acad Sci USA 89:8990~8992,1992;米国特許第6,673,901号)。これらのループ又は各ループ内の選択された残基を、フィブロネクチンIII型(FN3)ドメインのライブラリを構築するためにランダム化することができ、これらを用いてPSMAに結合する新規分子を選択することができる。表1は、テンコン(配列番号1)の各ループ及びβ鎖の位置及び配列を示す。
本発明のヒトPSMAに特異的に結合するFN3ドメインには、例えば共有結合を介して他のサブユニットを組み込むことができる。本発明の一態様では、本発明のFN3ドメインは、半減期延長部分を更に含む。代表的な半減期延長部分としては、アルブミン、アルブミン変異体、アルブミン結合タンパク質及び/又はドメイン、トランスフェリン、並びにそのフラグメント及び類似体、並びにFc領域がある。代表的なアルブミン変異体の1つに、配列番号155に示されるものがある。ヒトFc領域のアミノ酸配列は周知のものであり、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA及びIgE Fc領域を含んでいる。
本発明は、本発明のヒトPSMAに特異的に結合するFN3ドメインをコードした核酸を、インビトロ転写/翻訳のために使用される直鎖DNA配列、その組成物の真核生物、原核生物、又はフィラメントファージでの発現、分泌、及び/又は提示と適合するベクター、又はその標的化突然変異源を含む、単離ポリヌクレオチドとして、又は発現ベクターの一部として、又は直鎖DNA配列の一部として、提供する。特定のポリヌクレオチドの例が本明細書に開示されているが、遺伝コードの縮重又は特定の発現系におけるコドンの選択性を考慮すると、本発明のFN3ドメインをコードする他のポリヌクレオチドも本発明の範囲内に含まれる。
本発明のヒトPSMAに特異的に結合するFN3ドメインは、ヒト疾患の症状、又は細胞、組織、臓器、体液若しくは一般に宿主中の特定の病態を、診断、監視、調節、治療、緩和、発症の予防、又は低減するために使用することができる。本発明の方法を用いて、任意の分類に属する動物被験体を治療することができる。このような動物の例としては、ヒト、齧歯類、イヌ、ネコ、及び家畜などの哺乳動物が挙げられる。
本発明は、必要に応じて本発明の第2の分子と結合させた、ヒトPSMAに特異的に結合するFN3ドメイン及び薬学的に許容される担体からなる医薬組成物を提供する。治療的使用では、本発明のFN3ドメインは、薬学的に許容される担体中の活性成分として有効量のドメイン又は分子を含有する医薬組成物として調製することができる。「担体」なる用語は、活性化合物と共に投与される希釈剤、補助剤、賦形剤、又はビヒクルを指す。そのようなビヒクルは、落花生油、大豆油、鉱油、ゴマ油等の、石油、動物、植物、又は合成起源のものを含む、水及び油などの液体であってよい。例えば、0.4%生理食塩水及び0.3%グリシンを用いることができる。これらの溶液は滅菌され、一般には粒子状物質を含まない。これらは、通常の周知の滅菌技術(例えば、濾過)によって滅菌することができる。組成物は、生理的条件に近づけるために必要とされる薬学的に許容される補助物質、例えばpH調整剤及び緩衝剤、安定化剤、増粘剤、滑剤、並びに着色剤等を含むことができる。そのような医薬製剤中の本発明の分子の濃度は幅広く変化してよく、すなわち約0.5重量%未満、通常は少なくとも約1重量%から最大で15又は20重量%まで変化してもよく、また、選択される特定の投与様式に従って、主として必要とされる用量、液体の体積、粘度等に基づいて選択される。好適なビヒクル及び製剤(他のヒトタンパク質、例えばヒト血清アルブミンを含む)は、例えば、Remington:The Science and Practice of Pharmacy,21st Edition,Troy,D.B.ed.,Lipincott Williams and Wilkins,Philadelphia,PA 2006,Part 5,Pharmaceutical Manufacturing pp 691~1092に記載され、特にpp.958~989を参照されたい。
カニクイザル(cynoタンパク質データベースの参照番号EHH56646.1、配列番号32)及びチンパンジー(Uniprot、参照番号H2Q3K5、配列番号33)PSMAの細胞外ドメインを、pUnder発現ベクターに6His及びAviタグと共にクローニングした。タンパク質を、293HEK-expi細胞で一過性に発現させた。上清を回収し、遠心して清澄化した。タンパク質は、1)HisTrap HPカラムによるIMAC精製、及び2)溶出バッファーとしてPSMAの二量体化を安定化するためにMg2+、Ca2+、及び0.5mM ZnCl2を含んだDPBSを用いたサイズ排除精製(Superdex 200)の2工程の精製プロセスを用いて精製した。対象とするタンパク質を含む画分をプールし、タンパク質濃度をA280によって測定した。
テンコン(Tencon)(配列番号1)は、ヒトテネイシンCからの15個のFN3ドメインのコンセンサス配列から設計された、免疫グロブリン様足場構造のフィブロネクチンIII型(FN3)ドメインである(Jacobs et al.,Protein Engineering,Design,and Selection,25:107~117,2012;米国特許第8,278,419号)。テンコンの結晶構造は、7個のβ鎖を連結する6個の表面露出ループを示す。これらのループ又は各ループ内の選択された残基をランダム化することでフィブロネクチンIII型(FN3)ドメインのライブラリを構築することができ、このライブラリを用いて特異的標的に結合する新規分子を選択することができる。
LPAPKNLVVSEVTEDSLRLSWTAPDAAFDSFLIQYQESEKVGEAINLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVKGGHRSNPLSAEFTT(配列番号1)
cisディスプレイシステムで用いるため、テンコン(配列番号1)のFGループのみをランダム化するように設計されたライブラリTCL1を構築した(Jacobs et al.,Protein Engineering,Design,and Selection,25:107~117,2012)。このシステムでは、Tacプロモーター、テンコンライブラリコード配列、RepAコード配列、cisエレメント、及びoriエレメントの配列を組み込んだ一本鎖DNAを作製する。インビトロ転写/翻訳系で発現させると、それがコードされたDNAに対してcisで結合したテンコン-RepA融合タンパク質の複合体が産生される。次に、標的分子に結合する複合体を単離して、以下に述べるようにポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により増幅する。
LPAPKNLVVSEVTEDSLRLSWTAPDAAFDSFLIQYQESEKVGEAINLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVX7~12PLSAEFTT;
ただし、
X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7は、任意のアミノ酸であり、
X8、X9、X10、X11及びX12は、任意のアミノ酸又は欠失である。
テンコンのBC及びFGループの両方がランダム化され、それぞれの位置のアミノ酸の分布が厳密に制御されたTCL2ライブラリを構築した。表3は、TCL2ライブラリの所望のループ位置のアミノ酸分布を示す。設計されたアミノ酸分布には2つの狙いがある。第1に、ライブラリを、テンコン結晶構造の解析及び/又はホモロジーモデリングに基づいて、テンコンのフォールディング及び安定性にとって構造的に重要となると予想された残基に偏らせた。例えば、29番目の位置は、テンコンが折り畳まれる際に疎水性コアの中に埋もれることから、疎水性アミノ酸のサブセットのみとなるように固定した。第2の層の設計としては、高アフィニティーの結合分子を効率よく生成するため、抗体の重鎖HCDR3に選択的に見出される残基の分布に近くなるようにアミノ酸分布を偏らせた((Birtalan et al.,J Mol Biol 377:1518~28,2008;Olson et al.,Protein Sci 16:476~84,2007)。この目標のため、表2の「設計された分布」は、以下の分布を指す。すなわち、6%アラニン、6%アルギニン、3.9%アスパラギン、7.5%アスパラギン酸、2.5%グルタミン酸、1.5%グルタミン、15%グリシン、2.3%ヒスチジン、2.5%イソロイシン、5%ロイシン、1.5%リジン、2.5%フェニルアラニン、4%プロリン、10%セリン、4.5%トレオニン、4%トリプトファン、17.3%チロシン、及び4%バリン。この分布には、メチオニン、システイン、及び終止コドンは含まれない。
LPAPKNLVVSEVTEDSLRLSWX1X2X3X4X5X6X7X8SFLIQYQESEKVGEAINLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVX9X10X11X12X13SX14X15LSAEFTT;ただし、
X1は、Ala、Arg、Asn、Asp、Glu、Gln、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、又はValであり、
X2は、Ala、Arg、Asn、Asp、Glu、Gln、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、又はValであり、
X3は、Ala、Arg、Asn、Asp、Glu、Gln、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、又はValであり、
X4は、Ala、Arg、Asn、Asp、Glu、Gln、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、又はValであり、
X5は、Ala、Arg、Asn、Asp、Glu、Gln、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、又はValであり、
X6は、Ala、Arg、Asn、Asp、Glu、Gln、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、又はValであり、
X7は、Phe、Ile、Leu、Val、又はTyrであり、
X8は、Asp、Glu、又はThrであり、
X9は、Ala、Arg、Asn、Asp、Glu、Gln、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、又はValであり、
X10は、Ala、Arg、Asn、Asp、Glu、Gln、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、又はValであり、
X11は、Ala、Arg、Asn、Asp、Glu、Gln、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、又はValであり、
X12は、Ala、Arg、Asn、Asp、Glu、Gln、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、又はValであり、
X13は、Ala、Arg、Asn、Asp、Glu、Gln、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、又はValであり、
X14は、Ala、Arg、Asn、Asp、Glu、Gln、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、又はValであり、
X15は、Ala、Arg、Asn、Asp、Glu、Gln、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、又はValである。
LPAPKNLVVSRVTEDSARLSWTAPDAAFDSFLIQYQESEKVGEAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVKGGHRSNPLSAIFTT
LPAPKNLVVSRVTEDSARLSWX1X2X3X4X5X6X7X8X9FDSFLIQYQESEKVGEAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVX10X11X12X13X14X15X16X17X18X19SNPLSAIFTT;
ただし、
X1、X2、X3、X4、X5、X6、X10、X11、X12、X13、X14、X15及びX16は、A、D、E、F、G、H、I、K、L、N、P、Q、R、S、T、V、W又はYであり、
X7、X8、X9、X17、X18及びX19は、A、D、E、F、G、H、I、K、L、N、P、Q、R、S、T、V、W、Y、又は欠失である。
LPAPKNLVVSRVTEDSARLSWTAPDAAFDSFLIQYQESEKVGEAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGV X1X2X3X4X5X6X7X8X9 X10X11X12SNPLSAIFTT;
X1、X2、X3、X4、X5、X6、及びX7は、A、D、E、F、G、H、I、K、L、N、P、Q、R、S、T、V、W、又はYであり、
X8、X9、X10、X11、及びX12は、A、D、E、F、G、H、I、K、L、N、P、Q、R、S、T、V、W、Y、又は欠失である。
5’末端のTacプロモーターに、FGループ内のコドンをランダム化した以外は、テンコンの完全な遺伝子配列が続くものとして構成される合成DNA分子のセットを作製した(配列番号26~31)。FGループのランダム化を行うため、システイン及びメチオニンを除くすべてのアミノ酸を同比率でコードした。多様化させる部分の長さは、これらの部分がFGループ内の7、8、9、10、11、又は12個のアミノ酸をコードするようなものとした。それぞれの長さの変異体のサブライブラリを2μgのスケールで個々に合成し、次いで、オリゴヌクレオチドSloning-FOR(配列番号9)及びSloning-Rev(配列番号10)を使用したPCRによって増幅した。
TCL7ライブラリは、ランダム化されたテンコンのBC及びFGループを有するライブラリを与えるものである。このライブラリでは、アミノ酸6~9個の長さのBCループを、アミノ酸7~12個の長さのランダム化されたFGループとコンビナトリアルに混合した。合成テンコンフラグメントBC6、BC7、BC8、及びBC9(配列番号13~16)を、BCループが6、7、8、又は9個のランダム化されたアミノ酸で置換されるように、残基VXまでの、かつ残基VXを含むタンパク質のN末端部分をコードしたテンコン遺伝子を含むように作製した。これらのフラグメントは、L17A、N46V及びE83I突然変異の発見よりも前に合成されたものであるが(CEN5243)、これらの突然変異は下記に述べる分子生物学的ステップにより導入した。このフラグメントを、ランダム化したFGループをコードしたフラグメントと結合するため、以下のステップを行った。
特定のライブラリ設計においてランダム化しようとする残基の選択によって、形成される相互作用表面の全体の形状が決まる。BC、DE、及びFGループがランダム化されたライブラリからマルトース結合タンパク質(MBP)に結合するように選択された足場タンパク質を含むFN3ドメインのX線結晶解析により、MBPの活性部位に嵌まり込む大きく湾曲した界面を有していることが示されている(Koide et al.,Proc Natl Acad Sci USA 104:6632~6637,2007)。これに対して、MBPに結合するように選択されたアンキリン繰り返し足場タンパク質は、より平坦な相互作用表面を有し、活性部位から離れたMBPの外表面に結合することが見出されている(Binz et al.,Nat Biotechnol 22:575~582,2004)。これらの結果は、足場分子の結合表面の形状(湾曲と平坦)が、どの標的タンパク質又はそれらの標的タンパク質上の特定のエピトープが足場によって効果的に結合されるかを決定しうることを示唆するものである。タンパク質結合用のFN3ドメインを含んだタンパク質足場の設計に関する、これまでに発表されている研究は、標的に結合するための隣接したループを設計し、これにより、湾曲した結合表面を生じさせることに頼っている。このアプローチは、こうした足場によってアクセス可能な標的及びエピトープの数を制限しうる。
LPAPKNLVVSRVTEDSARLSWTAPDAAFDSFX1IX2YX3EX4X5X6X7GEAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYX8VX9IX10GVKGGX11X12SX13PLSAIFTT;
ただし、
X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8、X9、X10、X11、X12、及びX13は、A、D、E、F、G、H、I、K、L、N、P、Q、R、S、T、V、W、Y、C、又はMである。
LPAPKNLVVSRVTEDSARLSWTAPDAAFDSFX1IX2YX3EX4X5X6X7GEAIX8LX9VPGSERSYDLTGLKPGTEYX10VX11IX12GVKGGX13X14SX15PLX16AX17FTT;
ただし、
X1、X2、X3、X4、X5、X6、X10、X11、X12、X13、X14、X15、X16、及びX17は、A、D、E、F、G、H、I、K、L、N、P、Q、R、S、T、V、Y、又はWである。
アミノ酸分布を制御するため、Colibraライブラリ技術(アイソジェニカ社(Isogenica))を使用してTCL21ライブラリを作製した。アミノ酸分布を制御するため、Slonomics技術(モルフォシス社(Morphosys))を使用してTCL19、TCL23、及びTCL24遺伝子フラグメントを作製した。最初の合成の後、PCRを用いて各ライブラリを増幅した後、ループライブラリに関して上記に述べたCISディスプレイシステム(Odegrip et al.,Proc Natl Acad Sci USA 101:2806~2810,2004))を用いた選択に用いるために、RepAの遺伝子とライゲートした。
プレートに基づく選択
CISディスプレイを用いて、TCL7、TCL9、TCL19、及びTCL21ライブラリからPSMA結合センチリン(Centyrin)を選択した。インビトロ転写及び翻訳(ITT)を行うため、3μgのライブラリDNAを30℃で、0.1mMの完全アミノ酸、1XS30プレミクス成分、及び15μLのS30エクストラクト(プロメガ社(Promega))と50μLの全体積中でインキュベートした。1時間後、375μLのブロッキング溶液(1×TBS(pH7.4)、0.01% I-block(ライフ・テクノロジーズ社(Life Technologies)、#T2015)、100μg/mlニシン***DNA)を加え、反応混合物を氷上で15分間インキュベートした。ITT反応液を、抗ヒトPSMA抗体(ライフスパン・バイオサイエンス社(Lifespan Bioscience)、カタログ番号LC-C150527)でコーティングした96ウェルMaxisorbプレート上に固定化した組換えタンパク質であるチンパンジーPSMA(pan 229)若しくはカニクイザルPSMA(pan 230)、又はカニクイザルPSMA-FC融合タンパク質(pan 231)と共にインキュベートした。未結合のライブラリ成分をTBST及びTBSで順に洗浄して除去した。洗浄後、DNAを、85℃に10分間加熱することにより標的タンパク質から溶出し、更なるパニングのラウンドを行うためにPCRにより増幅した。各ラウンドにおける標的PSMAの濃度を400nMから100nMに連続的に低下させ、洗浄のストリンジェンシーを高くしていくことによって、高いアフィニティーで結合する結合分子を単離した。
センチリンを、更に、ビーズに基づいた捕捉セットアップを用いて選択した。上記に述べたようにしてITT反応混合物を調製し、次いで、ビオチン化組換えタンパク質であるチンパンジー又はカニクイザルPSMAとインキュベートした。ビオチン化組換えタンパク質及び結合したライブラリ成分を、ニュートラアビジン又はストレプトアビジンでコーティングした磁気ビーズ上に捕捉した。未結合のライブラリ成分を、TBST及びTBSで順に洗浄して除去した。洗浄後、DNAを、85℃に10分間加熱することにより標的タンパク質から溶出し、更なるパニングのラウンドを行うためにPCRにより増幅した。各ラウンドにおける標的PSMAの濃度を400nMから100nMに連続的に低下させ、洗浄のストリンジェンシーを高くしていくことによって、高いアフィニティーで結合する結合分子を単離した。
ビーズに基づく選択の5回目のラウンドからの生成物に、4ラウンドのオフレート選択を行った。ITT反応混合物をビオチン化組換えチンパンジー又はカニクイザルタンパク質とインキュベートした後、タンパク質と結合ライブラリ成分をニュートラアビジン又はストレプトアビジンでコーティングした磁気ビーズ上に捕捉し、TBSTでよく洗浄し、結合した複合体を5μMの低温の組換えPSMAタンパク質中で1時間洗浄した。次いで、ビーズに結合したITTをTBST及びTBS中でよく洗浄した後、溶出した。ビオチン化した標的抗原濃度を、ラウンド6及び7の25nMからラウンド8及び9の2.5nMに段階的に下げた。ラウンド7及び9からの選択生成物を、発現及びスクリーニングを行うために改変pET15ベクターにサブクローニングした。
BCループの位置23~30及びFGループの位置78~83をランダム化した、クローンP229CR9P819-H11(配列番号40)の配列に基づいたアフィニティー成熟ライブラリ(TCL25)を、モルフォシス社(ドイツ、ミュンヘン)のSlonomics技術を用いて作製した。ライブラリ内の標的結合の維持は、各ランダム化した位置に65%の標的頻度で親アミノ酸(P229CR9P819-H11からの)をコードしたヌクレオチドをドープすることによって行った。ヌクレオチドの残りの35%は、含まれていなかったシステイン及びメチオニンを除く、すべての他の20種類の天然アミノ酸を同じ確率でコードしたコドンの混合物を含むように設計した。表4は、TCL25の成熟ライブラリの設計を示す。表中、括弧内の数値は、各位置に対応するアミノ酸を含むように設計されたライブラリ内の分子の比率(%)を表す。このドーピング手法(14個の位置で65%の親分子)により、親分子と比較して大部分が3、4、5、6、又は7個の変化を含む理論上の分子の分布が得られる。
ニュートラアビジンでコーティングしたプレートを、Starting Block T20(ピアース社(Pierce))で1時間ブロッキングした後、ビオチン化PSMA(パニングと同じ抗原を使用したもの)又はネガティブコントロールで1時間コーティングした。プレートをTBSTですすぎ、希釈したライセートをプレートに1時間加えた。更なるすすぎの後、各ウェルをHRP結合抗センチリン抗体(PAB25)で1時間処理し、次いでPOD(ロシュ社(Roche))によりアッセイした。バックグラウンドよりも少なくとも10倍高いシグナルを有するセンチリンを、更なる分析を行うために選択した。
サイズ排除クロマトグラフィーを用いて、PSMAに結合するセンチリンの凝集状態を測定した。各精製センチリンのアリコート(10μL)をSuperdex 75 5/150カラム(ジーイー・ヘルスケア社(GE Healthcare))に流速0.3mL/分でPBS(pH7.4)を移動相として注入した。カラムからの溶出液を、280nmの吸光度によってモニターした。各ランに、コントロールとして野生型テンコンを含ませた。アジレント社(Agilent)のChemStationソフトウェア(Rev.B.04.02)を使用して溶出プロファイルを分析した。同じランの野生型タンパク質の溶出プロファイルと同様の溶出プロファイルを示したタンパク質のみを、更なる特性評価を行うための考慮対象とした。
生化学的結合ELISAによって同定された固有のヒットから単離したクローンを、96ウェルブロックプレートで増殖させるためにシングルヒットプレートで加え合わせた。クローンを、振盪しながら37℃で一晩、1mLの培養物(選択用にカナマイシンを添加したLB培地)中で増殖させた。96ブロックプレートでタンパク質発現を行うため、カナマイシンを添加した1mLのTB培地に50μLの一晩培養物を接種し、OD600=0.6~1となるまで300rpmで連続的に振盪しながら37℃で増殖させた。目標ODに達した時点で、IPTGを1mMにまで加えることにより、タンパク質発現を誘導し、プレートを30℃(300rpm)に移行して一晩増殖させた。一晩培養物を遠心して細胞を回収し、細菌ペレットを使用できる状態となるまで-80℃で保存した。ポジティブコントロール及びネガティブコントロールの両方を、各プレート上の重複実験に含めた。
96ウェル黒色組織培養コーティングプレート(ビーディー/コーニング社(BD/Corning)社カタログ番号353219)に、アッセイ培地(5%ウシ胎児血清を添加した無フェノールレッドRPMI(ライフ・テクノロジーズ社(Life Technologies)カタログ番号11835-030))中、10,000細胞/ウェルの密度でLNCaP FGC細胞(ATCC,カタログ番号CRL-1740)を播種した。播種したプレートを、5%CO2下、37℃で一晩インキュベートして細胞を付着させた。24時間後、CDCをアッセイ培地中に希釈し(1:100、1:300、1:1000、又は1:3000)、LNCaP細胞に直接加えた。この後、LNCaP細胞を、5%CO2下、37℃で66~72時間インキュベートした。細胞毒性を、CellTiter-Glo試薬(プロメガ社(Promega)カタログ番号G7571)を使用して評価し、調製した試薬100μLを、処理したウェルに直接加え、光から保護して静かに振盪しながら10分間インキュベートした。発光量を、SpectraMax M5プレートリーダーを使用して測定した。値を非処理のコントロールに対して正規化し、50%よりも高い毒性が得られた場合に更なる分析を行うために選択した。
大規模発現及び精製
センチリン突然変異体をコードした遺伝子配列をパニングによって見つけ、これをT7プロモーターの制御下で発現させるためにpET15bベクターにクローニングするか、又はDNA2.0社によって作製されたものをT5プロモーターの制御下で発現させるためにpJexpress401ベクター(DNA2.0社)にサブクローニングした。この得られたプラスミドを、発現させるためにE.coli BL21 Gold(アジレント社(Agilent))又はBL21DE3 Gold(アジレント社(Agilent))に形質転換した。シングルコロニーをピックし、カナマイシンを添加したLuria Broth(テクノバ社(Teknova))中で増殖させ、37℃、250RPMで18時間インキュベートした。カナマイシンを添加した1LのTerrific Broth(テクノバ社(Teknova))に、これらの継代培養物から接種し、37℃で振盪しながら4時間増殖させた。目標600nmの吸光度における光学密度が1.0に達した時点で、1mMのIPTGによりタンパク質発現を誘導した。タンパク質を37℃で4時間、又は30℃で18時間発現させた。細胞を6000Gで遠心して回収し、精製を行うまで-20℃で保存した。凍結した細胞ペレット(約15~25g)を室温で30分、解凍し、0.2mg/mLの組換えライソザイム(シグマ社(Sigma))を添加したBugBusterHTタンパク質抽出試薬(イーエムディー・ミリポア社(EMD Millipore))に細胞ペースト1g当たり5mLで懸濁し、室温にてシェーカー上で1時間インキュベートした。ライセートを74600Gで25分間遠心して清澄化した。上清を、AKTA AVANTクロマトグラフィーシステムを使用し、氷中に浸漬した5mlのQiagen Ni-NTAカートリッジ上に4mL/分の流速で加えた。他のすべてのNi-NTAクロマトグラフィーのステップは、流速5ml/分で行った。Ni-NTAカラムを、0.5M NaCl及び10mMイミダゾールを含んだ25.0mLの50mM Tris-HClバッファー(pH7.0)(バッファーA)中で平衡化した。ローディング後、カラムを100mLのバッファーA、次いで10mM イミダゾール、1%CHAPS及び1%n-オクチル-β-D-グルコピラノシド洗剤を含んだ100mlの50mM Tris-HClバッファー(pH7.0)、及び100mlのバッファーAで洗浄した。タンパク質を250mMイミダゾールを添加したバッファーAで溶出し、PBS(ギブコ社(Gibco))中で平衡化した分取用ゲル濾過カラムTSK Gel G3000SW(21.5×600mm)(東ソー株式会社)にロードした。ゲル濾過クロマトグラフィーを、AKTA-AVANTクロマトグラフィーシステムを使用し、室温で、流速10mL/分にてPBSで行った。
熱安定性をキャピラリーDSCによって測定した。各試料を、1mg/mlの濃度にPBS(pH7.4)に希釈した。オートサンプラー(マイクロカル社(MicroCal,LLC))を備えたVP-DSC機器を使用して、これらの試料の融解温度を測定した。試料を10℃から95℃又は100℃まで毎分1℃の速度で加熱した。各試料の走査の間にバッファーのみの走査を完結して、積分用のベースラインを計算した。バッファーのみのシグナルを引いた後、データを2状態アンフォールディングモデルに当てはめた。セルから試料を取り出さずに各試料について走査を繰り返すことによって、熱変性の可逆性を測定した。
センチリンを、システイン/マレイミド化学反応(Brinkley,Bioconjugate Chemistry 3:2~13,1992)又は上記に述べたソルターゼ反応を用いて、vc-MMAFと結合させた。センチリン-vcMMAF複合体の細胞毒性を、インビトロでLNCaP、VCAP、MDA-PC-2B、及びPC3細胞で評価した。細胞を96ウェル黒色プレートに24時間置いた後、異なる用量のセンチリン-vcMMAF複合体で処理した。細胞をセンチリン薬剤複合体(CDC)と66~72時間インキュベートした。CellTiterGloを使用し、上記に述べたようにして毒性を評価した。発光量の値をExcelにインポートし、ここからPrismにコピーアンドペーストしてグラフによる分析を行った。データをX=Log(x)を用いて変換した後、非線形回帰を用いて分析し、3パラメータモデルを適用してIC50を決定した。
大規模発現及び精製
センチリン突然変異体をコードした遺伝子配列をパニングによって見つけ、これをT7プロモーターの制御下で発現させるためにpET15bベクターにクローニングするか、又はDNA2.0社によって作製されたものをT5プロモーターの制御下で発現させるためにpJexpress 401ベクター(DNA2.0社)にサブクローニングした。この得られたプラスミドを、発現させるためにE.coli BL21 Gold(アジレント社(Agilent))又はBL21DE3 Gold(アジレント社(Agilent))に形質転換した。シングルコロニーをピックし、カナマイシンを添加したLuria Broth(テクノバ社(Teknova))中で増殖させ、37℃、250RPMで18時間インキュベートした。カナマイシンを添加した1LのTerrific Broth(テクノバ社(Teknova))に、これらの継代培養物から接種し、37℃で振盪しながら4時間増殖させた。目標600nmの吸光度における光学密度が1.0に達した時点で、1mMのIPTGによりタンパク質発現を誘導した。タンパク質を37℃で4時間、又は30℃で18時間発現させた。細胞を6000Gで遠心して回収し、精製を行うまで-20℃で保存した。凍結した細胞ペレット(約15~25g)を室温で30分、解凍し、0.2mg/mlの組換えライソザイム(シグマ社(Sigma))を添加したBugBusterHTタンパク質抽出試薬(イーエムディー・ミリポア社(EMD Millipore))に細胞ペースト1g当たり5mlで懸濁し、室温にてシェーカー上で1時間インキュベートした。ライセートを74600Gで25分間遠心して清澄化した。上清を、AKTA AVANTクロマトグラフィーシステムを使用し、氷中に浸漬した5mlのQiagen Ni-NTAカートリッジ上に4mL/分の流速で加えた。他のすべてのNi-NTAクロマトグラフィーのステップは、流速5ml/分で行った。Ni-NTAカラムを、0.5M NaCl及び10mMイミダゾールを含んだ25.0mlの50mM Tris-HClバッファー(pH7.0)(バッファーA)中で平衡化した。ローディング後、カラムを100mLのバッファーA、次いで10mMイミダゾール、1% CHAPS及び1%n-オクチル-β-D-グルコピラノシド洗剤を含んだ100mlの50mM Tris-HClバッファー(pH7.0)、及び100mlのバッファーAで洗浄した。タンパク質を250mMイミダゾールを添加したバッファーAで溶出し、PBS(ギブコ社(Gibco))中で平衡化した分取用ゲル濾過カラムTSK Gel G3000SW(21.5×600mm)(東ソー株式会社)にロードした。ゲル濾過クロマトグラフィーを、AKTA-AVANTクロマトグラフィーシステムを使用し、室温で、流速10mL/分にてPBSで行った。
熱安定性をキャピラリーDSCによって測定した。各試料を、1mg/mlの濃度にPBS(pH7.4)に希釈した。オートサンプラー(マイクロカル社(MicroCal, LLC))を備えたVP-DSC機器を使用して、これらの試料の融解温度を測定した。試料を10℃から95℃又は100℃まで毎分1℃の速度で加熱した。各試料の走査の間にバッファーのみの走査を完結して、積分用のベースラインを計算した。バッファーのみのシグナルを引いた後、データを2状態アンフォールディングモデルに当てはめた。セルから試料を取り出さずに各試料について走査を繰り返すことによって、熱変性の可逆性を測定した。
センチリンを、システイン/マレイミド化学反応(Brinkley,Bioconjugate Chemistry 3:2~13,1992)又は上記に述べたソルターゼ反応を用いて、vc-MMAFと結合させた。センチリン-vcMMAF複合体の細胞毒性を、インビトロでLNCaP、VCAP、MDA-PC-2B、及びPC3細胞で評価した。細胞を96ウェル黒色プレートに24時間置いた後、異なる用量のセンチリン-vcMMAF複合体で処理した。細胞をセンチリン薬剤複合体(CDC)と66~72時間インキュベートした。CellTiterGloを使用し、上記に述べたようにして毒性を評価した。発光量の値をExcelにインポートし、ここからPrismにコピーアンドペーストしてグラフによる分析を行った。データをX=Log(x)を用いて変換した後、非線形回帰を用いて分析し、3パラメータモデルを適用してIC50を決定した。
システイン走査
タンパク質の異なる位置にシステイン残基が導入された抗PSMAセンチリンP233FR9_10をコードした遺伝子をDNA2.0社より入手し、これを使用して上記に述べたようにタンパク質を発現させて精製した。得られたセンチリンを、上記に述べたように、熱安定性(vcMMAF複合体のある場合とない場合)及びLNCaP細胞毒性について評価した。結果を表11に要約する。
アイソ・セラピューティクス・グループ社(IsoTherapeutics Group, LLC)(テキサス州アングルトン)において、位置62にシステインを有するように操作された標的抗原に対して特異的結合を示さないセンチリンを、DOTAと結合させ、次いでジルコニウム89放射性同位体と結合させた。去勢した雄NSGマウス(ジャクソン・ラボラトリーズ社(Jackson laboratories))を1.5%イソフルランで麻酔し、シーメンス社(Siemens)のInveon microPET/CTでイメージングした。マウスに尾静脈注射により約0.2mCi[89Zr]のセンチリン(配列番号51)を投与し(低温のセンチリンを1mg/kg用量となるように)、最初の60分間にわたって連続的にイメージングし、その後、センチリン注射の3、6、及び24時間後にイメージングした。
Hisタグを付加したP233FR9-H10センチリン(本明細書でH10センチリンと呼ぶ)を大腸菌で発現させ、アフィニティー及びサイズ排除クロマトグラフィーを用いて精製した。センチリンはdPBS(pH7.2)中に受けた。
結合部位の外側の異なるH10センチリン残基は、小分子(毒性弾頭分子)と結合させるために、PSMAの結合又はセンチリンのフォールディングを妨げることなく改変することができる。システインは、これまでにC末端(Hisタグの後)並びに位置R11、E53、及びK62に配置され、これらの位置で弾頭分子と結合させられているが、これらの変異体のすべてが同様に強力な細胞毒性を示している。更に、BCループ内の残基T22、D25、及びA26、並びにDEループ内の末端残基N6、及びS52は、突然変異誘発後に化学的複合体化を行うには潜在的によい部位である(図5)。これらの溶媒に露出した残基は、センチリン/PSMA界面から離れており、構造的に柔軟な領域に位置している。
H10センチリンは、センチリン/PSMA複合体が内在化されることから、前立腺癌細胞内に弾頭分子(毒性小分子、核酸など)を標的化によって送達させるための候補物質である。更に、H10センチリンは、多重特異性型とされる場合に、前立腺癌細胞に免疫細胞を再び方向付けるための候補物質である。
選択した抗PSMAセンチリンを、親センチリンの特性を改良するために更に操作した。PSMAに結合するFN3ドメインを、上記に述べたライブラリを用いて作製し、そのPSMAとの結合について試験した。
本実施例は、蛍光色素と結合させた抗PSMAセンチリンによる、細胞上に存在するPSMAの検出を示すものである。アミノ酸53に遊離システインを有する、C末端にHisタグを付加した抗PSMAセンチリンP233FR9_H10(配列番号49)を、R-フィコエリトリン(PE)(プロザイム社(Prozyme)、カタログ番号PB31)と結合させた。PEをsulfo-SMCC(ピアース社(Pierce)、カタログ番号22122)を用いて60分間活性化させ、活性化したPEを遊離sulfo-SMCCから、Sephadex G25及びPBS/EDTAバッファーを使用したゲル濾過クロマトグラフィーにより分離した。センチリンをTCEP(シグマ社(Sigma)、カタログ番号646547)を用いて30分間還元した。還元したセンチリンを遊離TCEPから、Sephadex G25及びPBS/EDTAバッファーを使用したゲル濾過クロマトグラフィーにより分離した。活性化したR-PEを還元センチリンと90分間共有結合させた後、N-エチルマレイミド(シグマ社(Sigma)、カタログ番号04260)で20分間、クエンチした。「PE結合センチリン」を、AKTA explorer FPLC(ゼネラル・エレクトリック社(General Electric))上で、東ソー株式会社製TSKゲルG3000SWカラムを使用し、100mMリン酸ナトリウム、100mM硫酸ナトリウム、0.05%アジ化ナトリウム(pH6.5)中でサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)により精製した。
標準的な細胞培養手順により前立腺癌細胞株を収穫した。細胞(約30,000個)を、1%ウシ血清アルブミン(BSA)を含んだ0.1mLのPBS中で、PE結合センチリンと20分間染色した。バイオレジェンド社(Biolegend)(クローンLNI-17、カタログ番号342504)より入手した抗PSMA抗体-PE複合体を、ポジティブコントロールとして使用した。インキュベーション後、3mLのPBS/BSAバッファーを加え、未結合のPE複合体を800Gで5分間遠心して除去した。上清を吸引して、0.3mlのPBS/BSA中に、細胞を再懸濁した。ビーディー・バイオサイエンシーズ社(BD Biosciences)のFACSCaliburにより試料を分析した。各細胞株からのPSMA染色の平均蛍光強度(MFI)を測定し、抗PSMA抗体によるMFIと比較した。MFIは、PSMAの発現レベルと直接的な関係を示し、高PSMA発現細胞株からは高いMFIが得られる。図6は、抗PSMA抗体-PEによるMFI値と比較した、PE結合センチリンにより検出された異なる細胞株からのMFI値を示している。
上記の結果を、CELLSEARCHアッセイによりPE結合センチリンを試験し、7.5mLの血液から循環腫瘍細胞(CTC)を検出し、計数することによって更に確認した。循環腫瘍細胞の計数は、CELLSEARCH(ベリデックス社(Veridex LLC)、米国、ニュージャージー州、ラリタン)を使用し、製造者のプロトコール及びトレーニングに従って行った。CELLSEARCHアッセイでは、磁性流体磁気粒子と結合させた抗EpCAMを使用して、フルオロセインと結合させたサイトケラチン8、18及び19に特異的な抗サイトケラチンを捕捉することによりCTCを可視化する。CELLSEARCHアッセイは、試料の調製にCELLSEARCH AutoPrepを使用し、分析にはCELLTRACKS Analyzer II(登録商標)(CTA II)を使用する。CTA IIは、4色の半自動化蛍光顕微鏡であり、CTCを特定及び計数するために3色を使用する。CTA IIの第4の色は、更なる対象とするマーカーによってCTCの表現型を決定するために使用することができる。この例では、組織培養した腫瘍細胞を正常血液に加えることによって血液中のCTCを再現した。約500個の腫瘍細胞(LNCaP、22Rv1、PC3~9又はSKBR3細胞)を、CELLSAVEチューブ(ジャンセン・ダイアグノスティクス社(Janssen Diagnostics))中に採取した7.5mlの正常なドナー血液中に加えた。また、乳癌細胞株(SKBR3)もPSMA陰性細胞株として使用した。各試料を、CELLSEARCH CXCキット及びマーカーとしてPE結合センチリンを使用し、AutoPrep上で処理した。AutoPrep試料調製システムは、抗EpCAM磁性流体を使用して腫瘍細胞を捕捉することによって腫瘍細胞を濃縮するものである。CTCを濃縮した試料を、有核細胞を識別するための核酸色素(DAPI)、腫瘍細胞を識別するためのフルオレセインイソチオシアナート(FITC)と結合させた抗サイトケラチン抗体、及び白血球を識別するためのアロフィコシアニン(APC)と結合させた抗白血球抗体により染色した。試料を0.32mlの最終体積にまで処理し、MagNest(登録商標)細胞提示装置内に入れたまま、試料チャンバに移した。MagNest(登録商標)装置は、CELLTRACKS Analyzer II(登録商標)による分析用に磁気標識した細胞を提示するものである。CTAIIを用いて試料を分析してCTCを計数し、CTC上のPSMAを検出した。この分析装置は自動的に試料を分析し、DAPI及びサイトケラチンについて陽性の候補腫瘍細胞をレビュー用のサムネイル画像として提示するものである。CellSearchアッセイにおいてPE結合センチリンで染色した腫瘍細胞から得られた結果を、図7に示す。PT結合センチリンで染色したCTCの画像を、PSMA-PEとして示した列に示す。
以下の態様を包含し得る。
[1] 配列番号144のヒト前立腺特異的膜抗原(PSMA)に特異的に結合する、単離FN3ドメイン。
[2] 前記FN3ドメインが、配列番号32のマカカ・ファシキュラリス(Macaca Fascicularis)(カニクイザル)PSMA、又は配列番号33のパン・トログロダイテス(Pan troglodytes)(チンパンジー)PSMAと交差反応する、上記[1]に記載の単離FN3ドメイン。
[3] a)前記FN3ドメインが、配列番号1のテンコン配列又は配列番号4のテンコン27の配列に基づいたものであり、前記配列番号1又は配列番号4が、場合により、残基位置11、14、17、37、46、73、及び/又は86に置換を有するか、あるいは、
b)前記FN3ドメインが、配列番号2、3、5、6、7又は8の配列を含むライブラリから単離される、上記[2]に記載の単離FN3ドメイン。
[4] 第2の分子と結合させた、上記[1]~[3]のいずれかに記載の単離FN3ドメイン。
[5] 前記第2の分子が、細胞毒性物質、検出可能な標識、ポリエチレングリコール、又は核酸である、上記[4]に記載の単離FN3ドメイン。
[6] 前記細胞毒性物質が、アウリスタチン、モノメチルアウリスタチンフェニルアラニン、ドラスタチン(dolostatin)、化学療法剤、薬剤、増殖阻害剤、毒素、又は放射性同位体である、上記[5]に記載の単離FN3ドメイン。
[7] 前記検出可能な標識が、放射性同位体、磁気ビーズ、金属ビーズ、コロイド粒子、蛍光色素、高電子密度試薬、酵素、ビオチン、ジゴキシゲニン、又はハプテンである、上記[5]に記載の単離FN3ドメイン。
[8] 前記FN3ドメインが、配列番号1の残基位置6、11、22、25、26、52、53、62に対応する少なくとも1つの残基位置、又はC末端にシステイン残基を有する、上記[1]~[7]のいずれかに記載の単離FN3ドメイン。
[9] 前記FN3ドメインが、ヒトPSMAの酵素活性を阻害する、上記[1]~[8]のいずれかに記載の単離FN3ドメイン。
[10] 前記FN3ドメインが、ヒトPSMAとの結合について配列番号41のFN3ドメインと競合する、上記[1]~[9]のいずれかに記載の単離FN3ドメイン。
[11] 前記FN3ドメインが、ヒトPSMAの領域KKSPSPEFSGMPRISK(配列番号159)及びNWETNKF(配列番号160)に結合する、上記[1]~[10]のいずれかに記載の単離FN3ドメイン。
[12] 前記FN3ドメインが、配列番号41のアミノ酸配列と89%同一であるか、又は配列番号41のアミノ酸配列と比較した場合に1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、又は11個の置換を有する、アミノ酸配列を有する、上記[1]~[11]のいずれかに記載の単離FN3ドメイン。
[13] 前記FN3ドメインが、配列番号35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、又は140のアミノ酸配列を有する、上記[1]~[12]のいずれかに記載の単離FN3ドメイン。
[14] 前記FN3ドメインのN末端にメチオニンを更に有する、上記[13]に記載の単離FN3ドメイン。
[15] 半減期延長部分と結合された、上記[1]~[14]のいずれかに記載の単離FN3ドメイン。
[16] 前記半減期延長部分が、アルブミン結合分子、ポリエチレングリコール(PEG)、アルブミン、アルブミン変異体、又は免疫グロブリンのFc領域の少なくとも一部である、上記[15]に記載の単離FN3ドメイン。
[17] 上記[1]~[16]のいずれかに記載のFN3ドメインをコードする、単離ポリヌクレオチド。
[18] 配列番号156、157、又は158のポリヌクレオチド配列を有する、単離ポリヌクレオチド。
[19] 上記[17]又は[18]に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
[20] 上記[19]に記載のベクターを含む、単離宿主細胞。
[21] 上記[1]~[16]のいずれかに記載のFN3ドメインを生成する方法であって、上記[20]に記載の単離宿主細胞を、前記FN3ドメインが発現されるような条件下で培養することと、前記FN3ドメインを精製することと、を含む、方法。
[22] 上記[1]~[16]のいずれかに記載のFN3ドメイン及び薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
[23] PSMAの過剰発現によって特徴付けられる癌を有する対象を治療する方法であって、細胞毒性物質と結合させた上記[1]~[16]のいずれかに記載のFN3ドメインの治療有効量を、前記癌を治療するうえで充分な時間にわたって、治療を要する患者に投与することを含む、方法。
[24] 前記癌が、固形腫瘍、前立腺癌、大腸直腸癌、胃癌、腎明細胞癌、膀胱癌、肺癌、又は腎臓癌である、上記[23]に記載の方法。
[25] 上記[5]~[16]のいずれかに記載のFN3ドメインを含む、診断用キット。
[26] 上記[1]~[16]のいずれかに記載のFN3ドメインを含む、癌診断又は捕捉剤。
[27] 前記FN3ドメインが、配列番号49の位置6、11、22、25、26、52、53、54、又は62に対応する少なくとも1つの残基位置にシステイン残基を配置することによって改変された、配列番号49の配列を有する、上記[26]に記載の診断又は捕捉剤。
[28] 前記改変されたシステインが、R-フィコエリトリン(PE)と結合させられる、上記[26]に記載の診断剤。
[29] 生体試料中のPSMA発現細胞を検出する方法であって、前記生体試料を上記[26]~28]のいずれかに記載の診断試薬で処理することと、前記生体試料の、前記診断剤の前記FN3ドメインとの結合を評価することと、を含む、方法。
[30] 前記診断剤が、上記[28]に記載の剤である、上記[29]に記載の方法。
[31] 生体試料中のPSMA発現細胞を単離する方法であって、前記生体試料を上記[26]又は[27]に記載の捕捉剤で処理することを含む、方法。
[32] 対象内のPSMA発現腫瘍細胞を検出する方法であって、前記対象に上記[4]~[16]のいずれかに記載のFN3ドメインを投与することと、前記対象内における、前記FN3ドメインのPSMA発現腫瘍細胞との結合を検出することと、を含む、方法。
[33] PSMA発現腫瘍細胞に治療分子を送達する方法であって、上記[5]~[16]のいずれかに記載のFN3ドメインを、PSMA発現腫瘍を有する対象に投与することを含む、方法。
配列番号1=元のテンコン配列
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LPAPKNLVVSEVTEDSLRLSWTAPDAAFDSFLIQYQESEKVGEAINLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGV(X)7~12PLSAEFTT;
ただし、
X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7は、任意のアミノ酸であり、
X8、X9、X10、X11及びX12は、任意のアミノ酸又は欠失である。
LPAPKNLVVSEVTEDSLRLSWX1X2X3X4X5X6X7X8SFLIQYQESEKVGEAINLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVX9X10X11X12X13SX14X15LSAEFTT;
ただし、
X1は、Ala、Arg、Asn、Asp、Glu、Gln、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、又はValであり、
X2は、Ala、Arg、Asn、Asp、Glu、Gln、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、又はValであり、
X3は、Ala、Arg、Asn、Asp、Glu、Gln、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、又はValであり、
X4は、Ala、Arg、Asn、Asp、Glu、Gln、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、又はValであり、
X5は、Ala、Arg、Asn、Asp、Glu、Gln、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、又はValであり、
X6は、Ala、Arg、Asn、Asp、Glu、Gln、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、又はValであり、
X7は、Phe、Ile、Leu、Val、又はTyrであり、
X8は、Asp、Glu、又はThrであり、
X9は、Ala、Arg、Asn、Asp、Glu、Gln、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、又はValであり、
X10は、Ala、Arg、Asn、Asp、Glu、Gln、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、又はValであり、
X11は、Ala、Arg、Asn、Asp、Glu、Gln、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、又はValであり、
X12は、Ala、Arg、Asn、Asp、Glu、Gln、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、又はValであり、
X13は、Ala、Arg、Asn、Asp、Glu、Gln、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、又はValであり、
X14は、Ala、Arg、Asn、Asp、Glu、Gln、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、又はValであり、
X15は、Ala、Arg、Asn、Asp、Glu、Gln、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、又はValである。
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LPAPKNLVVSRVTEDSARLSWX1X2X3X4X5X6X7X8X9FDSFLIQYQESEKVGEAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVX10X11X12X13X14X15X16X17X18X19SNPLSAIFTT;
ただし、
X1、X2、X3、X4、X5、X6、X10、X11、X12、X13、X14、X15及びX16は、A、D、E、F、G、H、I、K、L、N、P、Q、R、S、T、V、W又はYであり、
X7、X8、X9、X17、X18及びX19は、A、D、E、F、G、H、I、K、L、N、P、Q、R、S、T、V、W、Y、又は欠失である。
LPAPKNLVVSRVTEDSARLSWTAPDAAFDSFLIQYQESEKVGEAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGV X1X2X3X4X5X6X7X8X9 X10X11X12SNPLSAIFTT;
ただし、
X1、X2、X3、X4、X5、X6、及びX7は、A、D、E、F、G、H、I、K、L、N、P、Q、R、S、T、V、W、又はYであり、
X8、X9、X10、X11、及びX12は、A、D、E、F、G、H、I、K、L、N、P、Q、R、S、T、V、W、Y、又は欠失である。
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ただし、
X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8、X9、X10、X11、X12、及びX13は、A、D、E、F、G、H、I、K、L、N、P、Q、R、S、T、V、W、Y、C、又はMである。
LPAPKNLVVSRVTEDSARLSWTAPDAAFDSFX1IX2YX3EX4X5X6X7GEAIX8LX9VPGSERSYDLTGLKPGTEYX10VX11IX12GVKGGX13X14SX15PLX16AX17FTT;
ただし、
X1、X2、X3、X4、X5、X6、X10、X11、X12、X13、X14、X15、X16、及びX17は、A、D、E、F、G、H、I、K、L、N、P、Q、R、S、T、V、Y、又はWである。
GTGACACGGCGGTTAGAAC
GCCTTTGGGAAGCTTCTAAG
CGGCGGTTAGAACGCGGCTACAATTAATAC
CATGATTACGCCAAGCTCAGAA
GTGACACGGCGGTTAGAACGCGGCTACAATTAATACATAACCCCATCCCCCTGTTGACAATTAATCATCGGCTCGTATAATGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGGATCTACCATGCTGCCGGCGCCGAAAAACCTGGTTGTTTCTGAAGTTACCGAAGACTCTCTGCGTCTGTCTTGGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTTYGACTCTTTCCTGATCCAGTACCAGGAATCTGAAAAAGTTGGTGAAGCGATCAACCTGACCGTTCCGGGTTCTGAACGTTCTTACGACCTGACCGGTCTGAAACCGGGTACCGAATACACCGTTTCTATCTACGGTGTTCTTAGAAGCTTCCCAAAGGC
GTGACACGGCGGTTAGAACGCGGCTACAATTAATACATAACCCCATCCCCCTGTTGACAATTAATCATCGGCTCGTATAATGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGGATCTACCATGCTGCCGGCGCCGAAAAACCTGGTTGTTTCTGAAGTTACCGAAGACTCTCTGCGTCTGTCTTGGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTTYGACTCTTTCCTGATCCAGTACCAGGAATCTGAAAAAGTTGGTGAAGCGATCAACCTGACCGTTCCGGGTTCTGAACGTTCTTACGACCTGACCGGTCTGAAACCGGGTACCGAATACACCGTTTCTATCTACGGTGTTCTTAGAAGCTTCCCAAAGGC
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CGG CGG TTA GAA CGC GGC TAC AAT TAA TAC
CCA AGA CAG ACG GGC AGA GTC TTC GGT AAC GCG AGA AAC AAC CAG GTT TTT CGG CGC CGG CAG CAT GGT AGA TCC TGT TTC
CCG AAG ACT CTG CCC GTC TGT CTT GG
CAG TGG TCT CAC GGA TTC CTG GTA CTG GAT CAG GAA AGA GTC GAA
CATGCGGTCTCTTCCGAAAAAGTTGGTGAAGCGATCGTCCTGACCGTTCCGGGT
GGTGGTGAAGATCGCAGACAGCGGGTTAG
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GTGACACGGCGGTTAGAACGCGGCTACAATTAATACATAACCCCATCCCCCTGTTGACAATTAATCATCGGCTCGTATAATGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGGATCTACCATGCTGCCGGCGCCGAAAAACCTGGTTGTTTCTCGCGTTACCGAAGACTCTGCGCGTCTGTCTTGGACCGCGCCGGACGCGGCGTTCGACTCTTTCCTGATCCAGTACCAGGAATCTGAAAAAGTTGGTGAAGCGATCGTGCTGACCGTTCCGGGTTCTGAACGTTCTTACGACCTGACCGGTCTGAAACCGGGTACCGAATACACCGTTTCTATCTACGGTGTTNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTCTAACCCGCTGTCTGCGATCTTCACCACCGGCGGTCACCATCACCATCACCATGGCAGCGGTTCTAGTCTAGCGGCCGCAACTGATCTTGGC
KSSSEATNITPKHNMKAFLDELKAENIKKFLHNFTQIPHLAGTEQNFQLAKQIQSQWKEFGLDSVELTHYDVLLSYPNKTHPNYISIINEDGNEIFNTSLFEPPPAGYENVSDIVPPFSAFSPQGMPEGDLVYVNYARTEDFFKLERDMKINCSGKIVIARYGKVFRGNKVKNAQLAGATGVILYSDPDDYFAPGVKSYPDGWNLPGGGVQRGNILNLNGAGDPLTPGYPANEYAYRRGMAEAVGLPSIPVHPIGYYDAQKLLEKMGGSASPDSSWRGSLKVPYNVGPGFTGNFSTQKVKMHIHSTSEVTRIYNVIGTLRGAVEPDRYVILGGHRDSWVFGGIDPQSGAAVVHEIVRSFGMLKKEGWRPRRTILFASWDAEEFGLLGSTEWAEENSRLLQERGVAYINADSSIEGNYTLRVDCTPLMYSLVYNLTKELESPDEGFEGKSLYESWTKKSPSPEFSGMPRISKLGSGNDFEVFFQRLGIASGRARYTKNWETNKFSSYPLYHSVYETYELVEKFYDPMFKYHLTVAQVRGGMVFELANSVVLPFDCRDYAVVLRKYADKIYNISMKHPQEMKTYSVSFDSLFSAVKNFTEIASKFSERLRDFDKSNPILLRMMNDQLMFLERAFIDPLGLPDRPFYRHVIYAPSSHNKYAGESFPGIYDALFDIESKVDPSQAWGEVKRQISIATFTVQAAAETLSEVA
KSSNEATNITPKHNMKAFLDELKAENIKKFLYNFTQIPHLAGTEQNFQLAKQIQSQWKEFGLDSVELAHYDVLLSYPNKTHPNYISIINEDGNEIFNTSLFEPPPPGYENVLDIVPPFSAFSPQGMPEGDLVYVNYARTEDFFKLERDMKINCSGKIVIARYGKVFRGNKVKNAQLAGAKGVILYSDPADYFAPGVKSYPDGWNLPGGGVQRGNILNLNGAGDPLTPGYPANEYAYRHGIAEAVGLPSIPVHPIGYYDAQKLLEKMGGSAPPDSSWRGSLKVPYNVGPGFTGNFSTQKVKMHIHSTNEVTRIYNVIGTLRGAVEPDRYVILGGHRDSWVFGGIDPQSGAAVVHEIVRSFGTLKKEGWRPRRTILFASWDAEEFGLLGSTEWAEENSRLLQERGVAYINADSSIEGNYTLRVDCTPLMYSLVYNLTKELKSPDEGFEGKSLYESWTKKSPSPEFSGMPRISKLGSGNDFEVFFQRLGIASGRARYTKNWETNKFSGYPLYHSVYETYELVEKFYDPMFKYHLTVAQVRGGMVFELANSIVLPFDCRDYAVVLRKYADKIYNISMKHPQEMKTYSVSFDSLFSAVKNFTEIASKFTERLQDFDKSNPILLRMMNDQLMFLERAFIDPLGLPDRPFYRHVIYAPSSHNKYAGESFPGIYDALFDIESKVDPSKAWGDVKRQISVAAFTVQAAAETLSEVA
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>142リンカー
AEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAAA
>143ヒトPSMA ECD
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>144シグナル配列を有するヒトFL PSMA
MWNLLHETDSAVATARRPRWLCAGALVLAGGFFLLGFLFGWFIKSSNEATNITPKHNMKAFLDELKAENIKKFLYNFTQIPHLAGTEQNFQLAKQIQSQWKEFGLDSVELAHYDVLLSYPNKTHPNYISIINEDGNEIFNTSLFEPPPPGYENVSDIVPPFSAFSPQGMPEGDLVYVNYARTEDFFKLERDMKINCSGKIVIARYGKVFRGNKVKNAQLAGAKGVILYSDPADYFAPGVKSYPDGWNLPGGGVQRGNILNLNGAGDPLTPGYPANEYAYRRGIAEAVGLPSIPVHPIGYYDAQKLLEKMGGSAPPDSSWRGSLKVPYNVGPGFTGNFSTQKVKMHIHSTNEVTRIYNVIGTLRGAVEPDRYVILGGHRDSWVFGGIDPQSGAAVVHEIVRSFGTLKKEGWRPRRTILFASWDAEEFGLLGSTEWAEENSRLLQERGVAYINADSSIEGNYTLRVDCTPLMYSLVHNLTKELKSPDEGFEGKSLYESWTKKSPSPEFSGMPRISKLGSGNDFEVFFQRLGIASGRARYTKNWETNKFSGYPLYHSVYETYELVEKFYDPMFKYHLTVAQVRGGMVFELANSIVLPFDCRDYAVVLRKYADKIYSISMKHPQEMKTYSVSFDSLFSAVKNFTEIASKFSERLQDFDKSNPIVLRMMNDQLMFLERAFIDPLGLPDRPFYRHVIYAPSSHNKYAGESFPGIYDALFDIESKVDPSKAWGEVKRQIYVAAFTVQAAAETLSEVA
>145テネイシンCの3番目のFN3ドメイン
DAPSQIEVKDVTDTTALITWFKPLAEIDGIELTYGIKDVPGDRTTIDLTEDENQYSIGNLKPDTEYEVSLISRRGDMSSNPAKETFTT
>146フィブコン
Ldaptdlqvtnvtdtsitvswtppsatitgyritytpsngpgepkeltvppsstsvtitgltpgveyvvslyalkdnqespplvgtqtt
>147フィブロネクチンの10番目のFN3ドメイン
VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAVTGRGDSPASSKPISINYRT
>148
GSGS
>149
GGGSGGGS
>150
GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
>151
APAP
>152
APAPAPAPAP
>153
APAPAPAPAPAPAPAPAPAP
>154
APAPAPAPAPAPAPAPAPAPAPAPAPAPAPAPAPAPAPAP
>155アルブミン変異体
DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQSPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGL
>156 cDNA H10
CTGCCAGCCCCGAAGAATTTGGTCGTTTCCCGTGTCACTGAGGACTCTGCACGTCTGAGCTGGACCGCACCGGACGCGGCGTTCGACAGCTTTGCAATCGGCTACTGGGAGTGGGATGATGACGGCGAGGCCATTGTGCTGACCGTTCCGGGTAGCGAGCGCAGCTACGATCTGACCGGTCTGAAGCCGGGTACGGAATATCCGGTGTATATTGCGGGCGTGAAGGGTGGCCAGTGGAGCTTCCCGCTGAGCGCGATCTTTACCACC
>157 cDNA P258AR6P1071_D02
CTGCCGGCTCCGAAAAACCTGGTCGTTTCCCGTGTCACTGAAGATTCTGCACGCTTGAGCTGGGCGATCGACGAGCAGCGTGACTGGTTTGAGAGCTTCCTGATTCAGTATCAAGAATCGGAAAAAGTTGGCGAGGCCATCGTGCTGACCGTTCCGGGTAGCGAGCGCAGCTATGATCTGACGGGTCTGAAGCCAGGCACCGAGTATACGGTGAGCATTTACGGTGTCTACCATGTGTACCGTAGCAATCCGCTGAGCGCGATCTTCACCACC
>158 cDNA
P233FR9P1001_H3-1
CTGCCAGCCCCGAAAAACTTAGTTGTCTCCCGCGTGACCGAAGATTCTGCTCGTCTGAGCTGGACTGCACCGGACGCGGCGTTCGACAGCTTTCCGATTGGCTACTGGGAGTGGGATGATGACGGTGAAGCGATCGTGCTGACCGTTCCGGGTAGCGAGCGTAGCTATGACCTGACGGGTTTGAAACCTGGTACCGAGTATCACGTTTACATTGCGGGCGTCAAGGGTGGCCAGTGGTCGTTCCCGCTGAGCGCAATCTTTACGACC
>159 PSMAエピトープ
KKSPSPEFSGMPRISK
>160 PSMAエピトープ
NWETNKF
Claims (27)
- 配列番号41と少なくとも89%同一であるアミノ酸配列を含み、前記配列が、配列番号41の、残基位置6、11、22、25、26、52、53、62に対応する少なくとも1つの残基位置、又はC末端にシステイン残基を有する、単離ヒト前立腺特異的膜抗原(PSMA)結合ドメイン。
- PSMA結合に関与するA32、G34、W36、W38、D39、D40、D41、E43、A44、V46、G64、P68、Y70、A72、W79、F81、P82、S84、A85、I86、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも1つの残基を含む、請求項1に記載の単離PSMA結合ドメイン。
- 第2の分子と結合させた、請求項1または2に記載の単離PSMA結合ドメイン。
- 前記第2の分子が、細胞毒性物質、検出可能な標識、ポリエチレングリコール、又は核酸である、請求項3に記載の単離PSMA結合ドメイン。
- 前記細胞毒性物質が、アウリスタチン、モノメチルアウリスタチンフェニルアラニン、ドラスタチン(dolostatin)、化学療法剤、薬剤、増殖阻害剤、毒素、又は放射性同位体である、請求項4に記載の単離PSMA結合ドメイン。
- 前記検出可能な標識が、放射性同位体、磁気ビーズ、金属ビーズ、コロイド粒子、蛍光色素、高電子密度試薬、酵素、ビオチン、ジゴキシゲニン、又はハプテンである、請求項4に記載の単離PSMA結合ドメイン。
- 前記PSMA結合ドメインが、配列番号41、42、43、44、47、48、49、50、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、又は140のアミノ酸配列を有する、請求項1~6のいずれかに記載の単離PSMA結合ドメイン。
- 前記PSMA結合ドメインのN末端にメチオニンを更に有する、請求項7に記載の単離PSMA結合ドメイン。
- 半減期延長部分と結合された、請求項1~6または7~8のいずれかに記載の単離PSMA結合ドメイン。
- 前記半減期延長部分が、アルブミン結合分子、ポリエチレングリコール(PEG)、アルブミン、アルブミン変異体、又は免疫グロブリンのFc領域の少なくとも一部である、請求項9に記載の単離PSMA結合ドメイン。
- 請求項1~10のいずれかに記載のPSMA結合ドメインをコードする、単離ポリヌクレオチド。
- 配列番号156、157、又は158のポリヌクレオチド配列を有する、単離ポリヌクレオチド。
- 請求項11または12に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
- 請求項13に記載のベクターを含む、単離宿主細胞。
- 請求項1~10のいずれかに記載のPSMA結合ドメインを生成する方法であって、請求項14に記載の単離宿主細胞を、前記PSMA結合ドメインが発現されるような条件下で培養することと、前記PSMA結合ドメインを精製することと、を含む、方法。
- 請求項1~10のいずれかに記載のPSMA結合ドメイン及び薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
- PSMAの過剰発現によって特徴付けられる癌を有する対象を治療する方法で用いるための組成物であって、請求項1~10のいずれかに記載のPSMA結合ドメインを含み、前記方法が、細胞毒性物質と結合させた前記PSMA結合ドメインの治療有効量を、前記癌を治療するうえで充分な時間にわたって、治療を要する患者に投与することを含む、組成物。
- 前記癌が、固形腫瘍、前立腺癌、大腸直腸癌、胃癌、腎明細胞癌、膀胱癌、肺癌、又は腎臓癌である、請求項17に記載の組成物。
- 請求項4~6または9~10のいずれかに記載のPSMA結合ドメインを含む、診断用キット。
- 請求項1~10のいずれかに記載のPSMA結合ドメインを含む、癌診断又は捕捉剤。
- 前記PSMA結合ドメインが、配列番号49の位置6、11、22、25、26、52、53、54、又は62に対応する少なくとも1つの残基位置にシステイン残基を配置することによって改変された、配列番号49の配列を有する、請求項20に記載の診断又は捕捉剤。
- 前記改変されたシステインが、R-フィコエリトリン(PE)と結合させられる、請求項21に記載の診断剤。
- 生体試料中のPSMA発現細胞を検出する方法であって、前記生体試料を請求項20~22のいずれかに記載の診断剤で処理することと、前記生体試料の、前記診断剤の前記PSMA結合ドメインとの結合を評価することと、を含む、方法。
- 前記診断剤が、請求項22に記載の剤である、請求項23に記載の方法。
- 生体試料中のPSMA発現細胞を単離する方法であって、前記生体試料を請求項20または21に記載の捕捉剤で処理することを含む、方法。
- 対象内のPSMA発現腫瘍細胞を検出する方法で用いるための組成物であって、請求項3~6または9~10のいずれかに記載のPSMA結合ドメインを含み、前記方法が、前記対象に前記PSMA結合ドメインを投与することと、前記対象内における、前記PSMA結合ドメインのPSMA発現腫瘍細胞との結合を検出することと、を含む、組成物。
- PSMA発現腫瘍細胞に治療分子を送達する方法で用いるための組成物であって、請求項3~6または9~10のいずれかに記載のPSMA結合ドメインを含み、前記方法が、前記PSMA結合ドメインを、PSMA発現腫瘍を有する対象に投与することを含む、組成物。
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