JP2749083B2 - 活性化されたヒトプロテインｃの直接発現のためのベクターおよび化合物 - Google Patents

活性化されたヒトプロテインｃの直接発現のためのベクターおよび化合物

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Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、ヒドロプロテインＣ活性をコードしている
新規DNA化合物および組換えDNAクローニングベクターを
提供するものである。これらベクターは、ヒトプロテイ
ンＣをその活性型で発現させる簡単かつ効率的な手段を
与える。プロテインＣを得るための従来法は、高レベル
のトロンビン、またはトロンビンとトロンボモジュリ
ン、または他の活性化用の高価な酵素による処理を必要
とする不活性型のプロテインＣ（酵素前駆体）を製造す
ることからなっていた。本発明は、タンパク質加水分解
切断部位をコードしているDNAをプロテインＣの暗号配
列中に導入することにより、組換え宿主細胞中で活性化
プロテインＣを直接発現させるベクターを提供すること
によって上記のめんどうな活性化工程を回避する活性化
プロテインＣの製造方法を提供するものである。
発明の背景および従来技術 ビタミンＫ依存性の血漿タンパク質であるプロテイン
Ｃは、主として止血のコントロールにおいて生理学的な
重要性を有する。プロテインＣは不活性分子として合成
される（本明細書では形成期プロテインＣと呼ぶ）。こ
の形成期プロテインＣは複雑なプロセッシングを経て、
以下さらに詳しく説明する多数の別種不活性分子を生成
する。不活性な、分泌された形のプロテインＣを本明細
書では酵素前駆体プロテインＣと呼ぶ。プロテインＣの
活性化は、トロボモジュリン−トロビンコンプレックス
が関与する反応により血液中で起こる。活性化されたプ
ロテインＣは、その補助因子プロテインＳとともに、生
理学的に重要な抗議固剤である。活性化されたプロテイ
ンＣは、血管内の血栓症を防止することができ、既存の
血餅の拡大を抑制することができる。活性型プロテイン
Ｃの作用機序、および不活性酵素前駆体の活性プロテア
ーゼへの活性化機序はこの数年の間に明らかされている
［J.E.Gardiner and J.H.Griffin,Progress in Hematol
ogr,Vol.XIII,265−278頁,Elmer B.Brown編,Grune and
Stratton,Inc.,1983を参照］。
プロテインＣの活性化には、トロンビン、凝固カスケ
ードの最後のセリンプロテアーゼ、およびトロンボモジ
ュリンと呼ばれる内皮細胞膜関連の糖タンパク質が関与
している。トロンボモジュリンはトロンビンと強固かつ
化学量論的なコンプレックスを形成する。トロンビンと
コンプレックス化したときのトロンボモジュリンはトロ
ンビンの機能的な性質を完全に変化させる。通常、トロ
ンビンはフェブリノーゲンを凝固させ、血小板を活性化
し、血餅形成の補助因子ＶおよびVIIIをその活性型であ
るV aおよびVIII aに変換する。最後に、トロンビンは
プロテインＣを活性化するが、それは極めてゆっくりで
あり、非効率的なものでしかない。対照的に、トロンボ
モジュリとコンプレックス化したトロンビンはフィブリ
ノーゲンを凝固させず、血小板を活性化せず、あるいは
血餅形成の補助因子ＶおよびVIIIをその活性型であるV
aおよびVIII aに変換しないが、極めて効率のよいプロ
テインＣの活性化因子となる。トロンボモジュリン−ト
ロンビンによるプロテインＣ活性化の速度定数はトロン
ビン単独の速度定数の1000倍以上である。
活性化されたプロテインＣがどのようにして血液凝固
を下方調節するのかを理解するため、凝固酵素系の簡単
な説明を以下に挙げる。凝固系は、酵素前駆体の活性セ
リンプロテアーゼへの逐次活性化からなる連鎖反応と考
えるのが最もよい。この連鎖反応により最後には酵素ト
ロンビンが生成し、これが限定されたタンパク質加水分
解により血漿のフィブリノーゲンを不容性ゲルのフィブ
リンに変換する。この凝固カスケードにおける２つの鍵
となる現象は、凝固形成因子IX aによる凝固形成因子Ｘ
のX aへの変換、および凝固形成因子X aによるプロトロ
ンビンのトロンビンへの変換である。この両者反応は、
細胞表面、とりわけ血小板表面で起こり、両反応は補助
因子を必要とする。系中の主補助因子、即ち因子Ｖおよ
びVIIIは、比較不活性な前駆体として循環しているが、
トロンビンの最初の数分子が生成すると、トロンビンが
輪（ループ）を後戻りし、限定されたタンパク質加水分
解により補助因子を活性化する。活性化された補助因子
V aおよびVIII aは、プロトロンビンのトロンビンへの
変換、および因子Ｘの因子X aへの変換の両方を約５オ
ーダー促進する。活性化されたプロテインＣは優先して
凝固形成補助因子V aおよびVIII a（不活性な凝固形成
因子ＶおよびVIIIの活性型）をタンパク質加水分解によ
り減成し、加水分解し、そして付可逆的に破壊するよう
に作用する。対照的に、凝固形成因子ＶおよびVIIIは活
性化されたプロテインＣの基質となることが極めて少な
い。
活性化プロテインＣ用の重要な補助因子は、別のビタ
ミンＫ依存性の血漿タンパク質であるプロテインＳであ
る。プロテインＳは、活性化プロテインＣが介する因子
V aおよびVIII aの加水分解を実質的に25倍増加させ
る。
プロテインＣは有用な治療剤であると認識されている
［例えば、欧州特許公開No.0215548およびNo.0191606を
参照］。活性化されたプロテインＣは、現在利用可能な
抗凝固剤（ヘパリンや経口のヒドロキシクマリン型の抗
凝固剤）よりも広い治療インデックスを有する新規な抗
血栓症剤である。凝固形成因子ＶをV aに、そしてVIII
をVIII aに変換するのにトロンビンが必要とされるの
で、酵素前駆体のプロテインＣも活性化されたプロテイ
ンＣもトロンビンが生成するまでは有効ではない；活性
型のこれら２種類の補助因子は活性化プロテインＣの好
ましい基質である。また、トロンボモジュリン−トロン
ビンのコンプレックスがないとプロテインＣ酵素前駆体
がその活性型に変換されないので、酵素前駆体のプロテ
インＣを活性化するのにトロンビンが必要とされる。
活性化プロテインＣは補助因子V aおよびVIII aを不
活性化することによって作動するので、活性化プロテイ
ンＣは要求があって働く抗凝固剤である。因子Ｖおよび
VIIIをその活性型のV aおよびVIII aに変換するのにト
ロンビンが必要とされるので、プロテインＣはトロンビ
ンが生成した後にだけ抗凝固剤として作用する。活性化
プロテインＣとは対照的に、通常の抗凝固剤はそれが患
者に投与されて循環している間はずっと一定の抗凝固状
態を維持するので、出血合併症の危険がプロテインＣあ
るいは活性化プロテインＣのときより実質的に増加す
る。このように、活性化プロテインＣは要求があって作
動する抗凝固剤であり、ヘパリンやヒドロキシクマリン
類に代わるものとして広い臨床用用途を有している。
遺伝性のプロテインＣ欠損などのある疾患状態では、
プロテインＣ酵素前駆体は大きな治療上の重要性を有す
る。先天的なホモ接合のプロテインＣ欠損では、その患
者は極めて幼い時に、致死型の播種性血管内凝固を伴う
ことが多い電撃性柴班病で死んでしまう。ヘテロ接合の
プロテインＣ欠損では、その患者は重篤な、再発生の血
栓塞栓に苦しむ。血友病Ｂあるいは因子IX欠損を治療す
るために設計した血漿タンパク質濃縮物（不純物として
プロテインＣを含んでいる）はヘテロ接合性をプロテイ
ンＣ欠損での血管内凝固の防止および治療に有効である
ことが臨床的に十分確立されている。また、播種性の血
管内凝固などの血栓状態では、ならびに大けが、大手
術、および癌などの血栓症になりやすい疾患状態では、
プロテインＣのレベルが異常に低いことがわかってい
る。
酵素前駆体型のプロテインＣは治療用に極めて有用で
あるが、ある種の疾患状態については患者に活性型のプ
ロテインＣを投与することによりさらに効果的に治療を
行うことが可能となる。例えば、心筋梗塞あるいは深静
脈血栓症（特に手術後に下肢に発生するようなもの）な
どの疾患状態では、患者の正常なレベルのプロテインＣ
酵素前駆体を有しているが、血栓の生成を防止し、既存
の血栓の除去を維持するに十分な活性代プロテインＣを
有していない。十分な量の活性化プロテインＣを生成で
きないのは不十分なトロンボモジュリンレベルによって
いるのかもしれないが、その原因が何であれ、これら疾
患状態の治療を有効に行うためには酵素前駆体ではなく
活性化プロテインＣを投与する必要がある。本発明は、
組換えDNA法を用いて活性化ヒトプロテインＣを得るた
めの新規化合物および方法を提供するものである。
本発明およびプロテインＣ活性化の理解を容易にする
ため、形成期ヒトプロテインＣの暗号配列、および対応
するアミノ酸残基配列を以下に示す： ［配列中、Ａはデオキシアデニル、Ｇはデオキシグアニ
ル、Ｃはデオキシシチジル、Ｔはチミジル、ALAはアラ
ニン、ARGはアルギニン、ASNはアスパラギン、ASPはア
スパラギン酸、CYSはシステイン、GLNはグルタミン、GL
Uはグルタミン酸、GLYはグリシン、HISはヒスチジン、I
LEはイソロイシン、LEUはロイシン、LYSはリジン、MET
はメチオニン、PHEはフェニルアラニン、PROはプロリ
ン、SERはセリン、THRはトレオニン、TRPはトリプトフ
ァン、TYRはチロシン、そしてVALはバリンである］。
上に挙げたDNA配列は、ヒトプロテインＣをコードし
ているヒト肝臓mRNAから調製したcDNAクローンから得
た。遺伝コードの縮重性により同一のアミノ酸残基配列
をコードしている多数の別種DNA配列を組み立てること
ができることは当業者の理解するところである。従っ
て、上記の形成基ヒトプロテインＣのcDNA配列は、可能
性のある多数の形成期ヒトプロテインＣ−コード化配列
の１つであるにすぎない。cDNAクローンの組み立てにお
いて、５′ポリＧ配列、３′ポリＣ配列、ならびに両
５′および３′のPst I制限酵素認識配列を、プロテイ
ンＣのコードしているcDNAの両末端に構築した。これら
cDNAクローンの２つを操作して、形成期ヒトプロテイン
Ｃの暗号配列、なわびに暗号領域の５′および３′末端
の非翻訳化mRNAをコードしているDNA部分の両方を含むD
NA分子を構築した。このDNA分子をプラスミドpBR322のP
st I部位に挿入してプラスミドpHC7を構築した。従っ
て、プラスミドpHC7は上記の暗号配列を含んでおり、ま
た、形成期ヒトプロテインＣの暗号配列の解読鎖の５′
および３′末端のそれぞれに以下の付加的な配列を含ん
でいる（分子の１本の鎖だけを示す）： および DNA塩基が対になる相補性の性質により、２本鎖DNA分子
のうち１本鎖の配列はもう一方の鎖の配列を決めるのに
十分である。プラスミドpHC7は、ノーザン・リージョナ
ル・リサーチ・ラボラトリー［Northern Regional Rese
arch Laboratory（NRRL）,Peoria,Illinos］に寄託さ
れ、その永久保存培養物コレクションの一部をなしてい
る菌株である大腸菌（E.coli）K12 RR1/pHC7から常法に
より単離することができる。大腸菌K12 RR1/pHC7の培養
物はNRRLから取得番号NRRL B−15926のもとで入手する
ことができる。プラスミドpHC7の制限部位および機能地
図を添付の第２図に示す。
また、形成期のプロテインＣを次のように図示するこ
ともできる： プレ−プロ：形成期ヒトプロテインＣのアミノ酸残基１
〜42であり、プロテインＣの分泌およびγ−カルボキシ
ル化に重要なヒトプロテインＣのシグナルペンプチドお
よびプロペプチドをコードしている。
LC ：形成期プロテインＣのアミノ酸残基43〜19
7であり、翻訳後に修飾されると２本鎖の酵素前駆体（K
Rジペプチドの除去により１本鎖の酵素前駆体から生成
する；後に説明する）および活性化形のプロテインＣの
両者の軽鎖（LC）を構成する。
KR ：形成期ヒトプロテインＣのアミノ酸残基19
8〜199であり、これらの残基は、おそらく最初の切断
（残基197−198あるいは199−200の間）とそれに続くカ
ルボキシペプチダーゼであるいはアミノペプチダーゼの
作用からなる２ステップの工程で除去されて２本鎖のプ
ロテインＣを生成するものと考えられている（ウシプロ
テインＣとの相同性に基づいて）。
AP ：形成期プロテインＣのアミノ酸残基200〜2
11であり、酵素前駆体形のプロテインＣから除去されて
活性化プロテインＣを与える活性化ペプチドを構成して
いる。
AHC ：形成期プロテインＣのアミノ酸残基212〜4
61であり、翻訳後に修飾されると活性プロテインＣの活
性化された重鎖（AHC）を構成する。
HC ：アミノ酸残基200〜461、即ちAPおよびAHC
からなる、翻訳後に修飾された後の、２本鎖形のプロテ
インＣ酵素前駆体の重鎖。
ヒトプロテインＣ酵素前駆体は、肝臓で合成され、血
液中に存在するセリンプロテアーゼ前駆体である。完全
な生物学的活性を現すためには、プロテインＣは翻訳後
の修飾を必要とし、これにビタミンＫが必要となる。成
熟した、２本鎖の、ジスフィド結合したプロテインＣ酵
素前駆体が、部分的なタンパク質加水分解によって１本
鎖の前駆体から生成する。この部分的なタンパク質加水
分解には、細胞内プロセッシングおよび細胞からの形成
期ポリペプチドの分泌の間の、アミノ酸残基１〜42から
なるプレ−プロペプチドの切断および除去、ならびに酵
素前駆体で観察される２本鎖を生成するためのアミノ酸
残基198および199の除去が含まれるものと考えられてい
る。この酵素前駆体の活性なセリンプロテアーゼへの活
性化にはARG−LEUペプチド結合（残基211および212）の
タンパク質加水分解による切断が関与している。この後
者の切断は、２本鎖酵素前駆体分子の大きい方の鎖（重
鎖）のアミノ末端を構成しているドデカペプチド（残基
200〜211）を放出する。プロテインＣは相当にグリコシ
ル化されている；成熟酵素は〜23％の炭水化物を含んで
いる。また、プロテインＣは、γ−カルボキシグルタミ
ン酸およびβ−ヒドロキシアスパラギン酸（エリスロ−
Ｌ−β−ヒドロキシ アスパルテート）を含む多数の普
通ではないアミノ酸を含有している。γ−カルボキシグ
ルタミン酸（gla）は、補助因子としてビタミンＫを必
要とする肝ミクロソームのカルボキシラーゼの働きによ
り、グルタミン酸残基からγ−グルタミル カルボキシ
ル化によって生成する。
また、ヒトプロテインＣの活性化を以下のように図示
することもできる。図に示した各ステップの順序が必ず
しもインビボでの経路を反映したものではないことは当
業者の認めるところである。
発明の目的および構成 本発明は組換え活性化プロテインＣの直接発現のため
の新規化合物、ベクター、形質転換体、および方法を提
供するものである。
本明細書中で用いる用語を以下に定義する。
Ad2LP:アデノウイルス２型の主後期プロモーター。
タンパク質またはペプチド中のアミノ酸残基は次の短
縮形で示した： ApR:アンピシリン耐性の表現型またはそれを付与する遺
伝子。
BK:BKウィルス由来のDNA。
CAT:クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ
遺伝子。
Enhまたはエンハンサー:BKウィルスのエンハンサー。
epまたはSV40ep:SV40のＴ−抗原遺伝子の初期プロモー
ター、Ｔ−抗原結合部位、SV40のエンハンサー、および
SV40の複製起源を含有するDNAセグメント。
γ−カルボキシル化：グルタミン酸のγ−炭素にカルボ
キシル基を付加する反応。
γ−カルボキシル化されたタンパク質：グルタミン酸残
基のいくつかがγ−カルボキシル化を受けたタンパク
質。
IVS:イントロンをコードしているDNAであり、介在配列
とも呼ばれる。
MMTpro:マウスのメタロチオネイン−Ｉ遺伝子のプロモ
ーター。
形成期タンパク質:mRNA転写体の翻訳によって生成した
ポリペプチドであり、翻訳後の修飾を全く受けていない
もの。しかし、mRNA転写体からタンパク質が完全に翻訳
される前に、グルタミン酸残基のγ−カルボキシル化お
よびアスパラギン酸残基のヒドロキシル化などの翻訳後
修飾を受けることもある。
NeoR:ネオマイシン耐性を付与する遺伝子である、この
遺伝子を用いて抗生物質G418に対する耐性を付与するこ
ともできる。
pA:ポリアデニル化シグナルをコードしているDNA配列。
プロモーター:DNAをRNAに転写されるDNA配列。
プロテインＣ活性：タンパク質加水分解活性、アミド分
解活性、エステル分解活性、および生物学的活性（抗凝
固あるいはプロフィブリン分解活性）の原因であるヒト
プロテインＣのすべての性質。タンパク質の抗凝固活性
の試験方法は当分野でよく知られている［Grinnell et
al.,1987,Biotechnology 5:1189を参照］。
組換えDNAクローニングベクター:1またはそれ以上の別
のDNAセグメントを付加したか、または付加することが
できるDNA分子を含有するあらゆる媒体であり、染色体
に組込まれる媒体、自律的に複製するプラスミド、およ
びファージが含まれるがこれらに限定はされない。
組換えDNA発現ベクター：プロモーターが導入されたあ
らゆる組換えDNAクローニングベクター。
組換えDNAベクター：あらゆる組換えDNAクローニングベ
クターまたは発現ベクター。
レプリコン：プラスミドまたは他のベクターの自律的な
複製を支配し、それを可能にするDNA配列。
制限フラグメント:1またはそれ以上の制限エンドヌクレ
アーゼ酵素の作用によって生成したあらゆる直線状のDN
A配列。
感受性宿主細胞：ある抗生物質またはその他の毒性化合
物の存在下では、それらに対する耐性を付与するDNAセ
グメントがないと生育することができない宿主細胞。
構造遺伝子：翻訳開始および停止シグナルを含めた機能
的なポリペプチドをコードしているあらゆるDNA配列。
TcR:テトラサイクリン耐性の表現型またはそれを付与す
る遺伝子。
形質転換：受容宿主細胞にDNAを導入することであり、
これにより受容宿主細胞にDNAを導入することであり、
これにより受容宿主細胞の遺伝型が変化する。
形質転換体：形質転換を経た受容宿主細胞。
翻訳活性換配列:mRNA転写体をペプチドまたはポリペプ
チドに翻訳させる、５′−ATC−３′などの翻訳開始コ
ドンおよびリボソームの結合部位をコードしてい配列を
含めたあらゆるDNA配列。
酸素前駆体：タンパク質加水分解酵素の酵素的に不活性
な前駆体。本明細書中で用いるプロテインＣ酵素前駆体
とは、それが１本鎖であっても２本鎖であっても、分泌
された不活性型のプロテインＣを指す。
第１図は４つの部分からなり、本発明のプラスミドpL
APCの構築に用いる出発物質であるプラスミドpLAPの構
築プロトコールを示すものである。
第1A図は、BKウィルスおよびプラスミドpdBPV−MMTne
oからプラスミドpBKneo1の構築を示す工程図である。
第1B図は、アデノウィルス２およびプラスミドpSV2ca
tからのプラスミドpLPcatの構築を示す工程図である。
第1C図は、プラスミドpBKneo1およびプラスミドpLPca
tのからのプラスミドpBLcatの構築を示す工程図であ
る。
第1D図は、プラスミドpBLcatおよびプラスミドpL133
からのプラスミドpLPCの構築を示す工程図である。
第２図は、プラスミドpLPCの構築に用いる出発物質で
あるプラスミドpL133の構築を示す工程図である。
本発明は、活性化されたヒトプロテインＣの発現をコ
ードしているDNA化合物に関する。ヒトプロテインＣ酵
素前駆体および形成期ヒトプロテインＣを製造するため
の方法がいくつか開示されているが（欧州特許公開No.2
15548およびNo.191606を参照）、これらの方法は活性化
されたヒトプロテインＣの直接発言を提供するものでは
ない。活性化されたプロテインＣを得るためには、これ
らの方法によって得たプロテインＣ酵素前駆体を、α−
トロンビン、トリプシン、ラッセル（Russell）のヘビ
毒因子Ｘ活性化因子、あるいはトロンビンとトロンボモ
ジュリンの混合物などの物質で処理しなければならな
い。これらの活性化法のすべては、組換え法による活性
化ヒトプロテインＣの製造に非効率、汚染の危険、およ
びより高いコストを与える。さらに、ある種の活性化反
応は、タンパク質加水分解が活性化ペプチドのタンパク
質加水分解切断の後に停止するよう厳密にモニターしな
ければならない（そうしないと、生成した活性化プロテ
インＣが切断され、不活性になる）。本発明は、組換え
活性換ヒトプロテインＣの直接発現のためのDNA化合
物、組換えDNA発現ベクター、形質転換セルライン、お
よび方法を提供するものである。
本発明は、 （Ａ）以下の（ｉ）および（ii）を含有する組換えDNA
ベクターで宿主細胞を形質転換し： （ｉ）アミノ末端からカルボキシ末端にかけて、 ａ）γ−カルボキシル化され、分泌されるタンパク質の
シグナルペプチドおよびプロペプチド； ｂ）ヒトプロテインＣの軽鎖； ｃ）リジン−アルギニン、リジン−リジン、またはアル
ギニン−アルギニンから選ばれるジペプチド； ｄ）細胞に随伴するプロテアーゼのための切断配列；お
よび ｅ）活性化されたヒトプロテインＣの重鎖； ［ただし、該切断配列はヒトプロテインＣ酵素前駆体の
活性化ペプチドではない］ を含んでいるアミノ酸残基配列をコードしているDNA配
列； （ii）該DNA配列を発現させるように設置したプロモー
ター； （Ｂ）工程（Ａ）で軽質転換した宿主細胞を、該DNA配
列を発現させる条件下で培養すること、 を特徴とする真核宿主細胞からの分泌時に組換え活性化
プロテインＣを直接産生させる方法を提供するものであ
る。
本発明は、活性化プロテインＣを製造するための方法
に用いる新規DNA化合物を提供する。これらの新規化合
物はすべて、分泌されるためのシグナルペプチドおよび
γ−カルボキシル化される（ビタミンＫ依存性のカルボ
キシラーゼの作用によって）タンパク質由来のプロペプ
チドからなるプレ−プロペプチドをコードしている。こ
のようなプロペプチド配列は当分野でよく知られてい
る。例えば、サッティー等［Suttie et al.,1987,Proc.
Natl.Alad.Sci.84:634−637］を参照。好ましくは、そ
して構築を容易にするため、シグナルペプチドの暗号配
列およびプロペプチドの暗号配列の両者はγ−カルボキ
シル化されるタンパク質のプレ−プロペプチドのアミノ
酸残基配列から得る。そのようなγ−カルボキシル化さ
れたタンパク質の例には、因子VII、因子IX、因子Ｘ、
プロトロンビン、プロテインＳ、プロテインＺ、そして
最も好ましくはプロテインＣが含まれるが、これらに限
定はされない。
また、本発明のDNA化合物は、プレ−プロペプチドの
暗号配列の下流にすぐ隣接して、そして該配列を含む翻
訳リーディングフレーム内に配置されたヒトプロテイン
Ｃの軽鎖の暗号配列を含有している。ヒトプロテインＣ
の軽鎖は、前記のように、形成期プロテインＣのアミノ
酸残基43〜197を含んでいる。プロテインＣの軽鎖のア
ミノ末端部分などのビタミンＫ依存性の血漿タンパク質
のアミノ末端部分は、これらタンパク質のカルシウム結
合活性の原因である。これら血漿タンパク質、例えば因
子VII、因子IX、因子Ｘ、プロトロンビン、およびプロ
テインＳなどのカルシウム結合領域は交換可能であり
（欧州特許公開No.0215548A1、第12および13頁を参
照）、ヒトプロテインＣの軽鎖のカルシウム結合領域と
等価である。
さらに、本発明のDNA化合物は、軽鎖の暗号配列の下
流にすぐ隣接して、そして該配列を含む翻訳リーディン
グフレーム内に設置されたジペプチドLYS−ARG（KR）の
暗号配列を含有している。LYS−ARGなどの二塩基性ジペ
プチドは、形成期タンパク質中の、軽鎖のカルボキシ末
端部と、細胞に随伴するプロテアーゼのための切断配列
のアミノ末端部の間に位置している。発現されたタンパ
ク質中のLYS−ARGジペプチドの配向は本発明の目的には
関係しない。LYS−LYSあるいはARG−ARGなどの二塩基性
ジペプチドは、本発明においてはLYS−ARGジペプチドと
等価である。
LYS−ARGジペプチドのコドンのすぐ下流は、タンパク
質加水分解の切断配列の暗号配列である。天然では、ヒ
トロプロテインＣのLYS−ARGジペプチドのカルボキシ末
端の位置に12アミノ酸残基のペプチド（活性化ペプチ
ド；タンパク質加水分解による切断によって除去され
る）が存在している。しかし、本発明のDNA化合物の鍵
となる特徴は、活性化ペプチドの暗号配列の存在が必要
ではないというところにある。本発明の好ましいDNA化
合物は活性化ペプチドの暗号配列を含有していない。そ
の代わりに、好ましい化合物では、AP暗号配列が、細胞
に随伴するプロテアーゼ用のタンパク質加水分解の切断
配列の暗号配列で置き換えられている。
本発明の目的は活性化プロテインＣを組換え細胞から
直接産生させることにあるので、プロテインＣの活性換
重鎖からのプロテインＣの軽鎖の切断は細胞内または分
泌時の細胞表面のいずれかで起こらなければならない。
本発明の目的のためには、細胞に随伴するプロテアーゼ
とは、細胞質あるいは細胞オルガネラに存在するプロテ
アーゼだけでなく、分泌中あるいは分泌してすぐタンパ
ク質を切断することができる細胞膜に存在するプロテア
ーゼをも含んでいる。即ち、本発明は、ヒトプロテイン
Ｃの活性化重鎖と軽鎖を分離するための、細胞随伴のプ
ロテアーゼ用のタンパク質加水分解の切断配列をコード
しているDNA化合物を提供するものである。
細胞随伴プロテアーゼ用の多種のタンパク質加水分解
の切断配列が当分野で知られている。切断配列とは、細
胞随伴のプロテアーゼの切断部位に隣接するアミノ酸配
列である。以下の第１表に、本発明の方法および化合物
において細胞随伴のプロテアーゼ用の切断配列として用
いるのに適した切断配列を挙げる。この表に挙げたもの
は例示であって、本発明を限定するものではない。
本発明で用いるのに適した細胞随伴のプロテアーゼの
ための別の切断配列をシュワルツ［Schwartz,1986,FEBS
200（１）:1］が例示している。さらに、Ｃ−末端に二
塩基性ジペプチドを含んでいる天然の、または合成の、
ペプチドをコードしているあらゆる配列が細胞随伴のプ
ロテアーゼのための切断配列を構成するであろう。第１
表に挙げた切断配列のうち、２本鎖のインスリン受容体
分子を生成するように切断される切断配列が本発明で最
も好ましい。
切断配列中のアミノ酸残基の数がいくらか変わってい
てもよいことは当業者の理解するところであろう。活性
化されたプロテインＣを得るための本発明の方法におい
ては、形成期タンパク質は軽鎖のカルボキシ末端のとこ
ろで切断され（KRジペプチドのところで）、また、活性
化された重鎖のアミノ末端のところで切断される。従っ
て、KRジペプチドとタンパク質加水分解切断部位（活性
化された重鎖のアミノ末端に位置する）の間にある残基
はポリペプチドのプロセッシングの間に除去されるであ
ろう。これら２つのタンパク質加水分解切断反応は軽鎖
のカルボキシ末端と重鎖のアミノ末端の間のすべてを除
去するであろうから、タンパク質加水分解の切断配列は
目的産物である活性化プロテインＣの性質に影響するこ
となく付加的な残基を含むことができる。このように、
第１表に示したものより長い切断配列を本発明の方法お
よび化合物に用いることができる。さらに、上記の切断
配列はすべて８個の残基を含んでいるが、すべて８個の
残基が必要とされるわけではなく、それより短い配列も
本発明の方法および化合物に用いることができる。
本発明のDNA配列において、タンパク質加水分解の切
断配列の暗号配列の下流にすぐ隣接し、そして該暗号配
列を含む翻訳リーディングフレーム内にあるのは、ヒト
プロテインＣの活性化重鎖の暗号配列である。前記のよ
うに、ヒトプロテインＣの活性化重鎖は形成期ヒトプロ
テインＣの残基212〜461からなっている。
以下に示すのは、本発明の好ましいDNA暗号配列から
生成したmRNA複写体から翻訳された、プロセッシングさ
れていない形成期ポリペプチドのアミノ酸残基配列であ
る。このポリペプチドは、ヒトプロテインＣのプレ−プ
ロペプチドから始まり、次にヒトプロテインＣの軽鎖、
その次にLYS−ARGジペプチド、これにインスリン受容体
の切断配列（IRS）が続き、そしてさらにヒトプロテイ
ンＣの活性化重鎖へと続く。図で示すと、このポリペプ
チドは次のようである： このポリペプチドのアミノ酸残基配列は次のようであ
る： 遺伝コードの縮重により多種のDNA化合物が上記のポリ
ペプチドをコードすることができることは当業者の認識
するところであろう。従って、後記で説明する構築、な
らびに本発明の好ましいDNA化合物、ベクター、および
形質転換体についての実施例で説明する構築は単なる例
示であって、本発明を限定するものではない。
活性化されたヒトプロテインＣを直接発現させるため
の最初の試みは、部位特異的な突然変異誘発によってAP
領域を削除しておいた形成期ヒトプロテインＣの暗号配
列を使用することからなっていた。図で示すと、この暗
号配列は次の構造を有していた： 後記実施例で説明するように、この暗号配列を組換えDN
A発現ベクターに挿入し、得られたベクター（pLAPCと命
名）を真核宿主細胞に導入した。得られた形質転換体
は、抗−プロテインＣ抗体との反応性で調べると正常な
量の２本鎖プロテインＣを産生していたが、この物質は
プロテインＣ活性が極めて低かった。プラスミドpLAPC
構築の根拠は、KR領域を切断して２本鎖の酵素前駆体を
生成させる原因であるどのようなタンパク質加水分解活
性も、たぶんAP領域を欠いたプロテインＣ分子を切断す
るように作用するであろうというものであった。APを欠
いたプロテインＣ暗号配列を発現する細胞から２本鎖の
物質が得られることが観察されたが、この物質は低レベ
ルの活性化ヒトプロテインＣのアミド分解活性を有して
いるにすぎなかった。しかし、活性化されたプロテイン
Ｃ活性を発現させる際のその有用性に加えて、プラスミ
ドpLAPCは、活性化ヒトプロテインＣを高レベルで直接
組換え発現させる本発明の他のベクターを構築するため
の有用な出発物質としても用いられる。出発プラスミド
pHC7からプラスミドpLAPCの構築のプロトコールを実施
例１で説明する。プラスミドpHC7は、ノーザン・リージ
ョナル・リサーチ・センター（NRRL;Peoria,IL 61604）
から、取得番号NRRL B−15926のもと、大腸菌K12 RR1/p
HC7で入手できる。
活性化プロテインＣを直接発現させる別の試みは、タ
ンパク質加水分解切断配列がプロテインＣ暗号配列中、
AP暗号配列とAHC暗号配列の間に挿入された暗号配列を
創製することからなっていた。タンパク質加水分解切断
部位を、インスリン受容体由来のタンパク質加水分解切
断配列とともに導入した。従って、この暗号配列は図で
示すと次の構造を有していた： この暗号配列をプラスミドpLAPCに類似するベクター中
に挿入してプラスミドpLAPC−IRSを得た。しかし、プラ
スミドpLAPC−IRSを真核宿主細胞中に導入しても、検出
しうるプロテインＣ活性または抗原を産生する形質転換
体は得られなかった。
活性化プロテインＣを直接発現させる本発明方法は、
AP暗号配列をIRS暗号配列に置き換えた後にだけ達成さ
れた。得られた暗号配列例は図で示すと次の構造を有し
ていた： AP暗号配列がIRS配列で置き換えられているこの暗号配
列の構築を実施例３で説明する。重要なことは、この構
築がプロテインＣ暗号配列の部位特異的な突然変異誘発
を含んでいるということである。活性化ペプチドをコー
ドしているDNAを含有するプロテインＣ暗号配列の一部
をプラスミドpHC7から単離し、ファージM13mp18に挿入
し、次いで部位特異的な突然変異誘発によって変えた。
次に、この突然変異暗号配列を真核生物性のクローニン
グベクター中にクローニングして、KRおよびAHC暗号配
列の間にIRS暗号配列を挿入したこと以外はプラスミドp
LAPCと同一である、pLAPC−IRSと命名したプラスミドを
得た。プラスミドpLAPC−IRSは、AP暗号配列の削除がプ
ラスミドpLAPC−IRSと異なっているだけである。プラス
ミドpLAPC−IRS構築のプロトコールを実施例３で詳細に
説明する。
後記実施例に記載した部位特異的な突然変異誘発の方
法は例示であって、この方法を用いて、IRS暗号配列が
細胞随伴のプロテアーゼのタンパク質加水分解切断部位
のための別の暗号配列で置き換えられている本発明の他
の化合物を得ることができる。また、本発明のDNA化合
物を、化学的に、あるいは制限フラグメントの組合せに
よって、あるいは当分野で既知の方法を組合せることに
よって合成することができる。さらに、DNA合成機も使
用することができ、これを用いて本発明の化合物を構築
することができる。
本発明の例示ベクターであるプラスミドpLAPC−IRS
は、本発明の新規活性化プロテインＣ暗号配列のアデノ
ウィルス主後期プロモーターによる転写を刺激するよう
に設置されたBKエンハンサーを含有している。極めて多
数の真核性のプロモーター、エンハンサー、および発現
ベクターが当分野で知られていること、ならびにこれら
を本発明方法で用いることができることは当業者の認識
するところである。また、当業者は、真核性の発現ベク
ターがエンハンサー要素なしで機能しうることも認識し
ている。本発明の鍵となる点は、活性化プロテインＣを
発現させるために用いる特定のエンハンサーあるいはプ
ロモーターにあるのではなく、むしろ、プロテインＣの
暗号配列中のタンパク質加水分解切断配列を用いて組換
え細胞から活性換プロテインＣを直接産生させることに
ある。
しかし、プロモーター、エンハンサー、および選択マ
ーカーなどのベクター要素の選択は、真核宿主細胞が産
生する活性化プロテインＣの最終レベルに大きな影響を
与える。米国特許出願No.849,999（1986年４月９日出
願）は、ヒトプロテインＣを発現させるように設置した
真核性のプロモーターを刺激するためにBKエンハンサー
を利用している、酵素前駆体プロテインＣ用の多数の発
現ベクターを開示している。これらのベクターは、真核
細胞に導入したとき特に高いレベルで発現をし、また大
きいDNAウィルスの即時型遺伝子産物、例えばアデノウ
ィルスのE1A遺伝子産物なども発現させる。本明細書中
に記載した例示ベクターpLAPC−IRSから明らかなよう
に、No.849,999のBKエンハンサーE1A遺伝子産物の発現
方法は本発明のベクターで用いるのに特に好ましい。
本発明は特定の真核宿主細胞の使用に限定されるもの
ではない。多種の真核宿主細胞が寄託所、例えばアメリ
カン・タイプ・カルチャー・コレクション［American T
ype Culture Collection（ATCC）,Rockville,MD 2085
2］などから入手可能であり、本発明のベクターととも
に用いるのに適している。特定の宿主細胞の選択は、あ
る程度は本発明の活性化プロテインＣをコードしている
DNA化合物を発現させるために用いる特定の発現ベクタ
ーに依存している。しかし、プロテインＣ酵素前駆体は
実質適な翻訳後修飾を受けるので、ある種の宿主細胞が
本発明のベクターとともに用いるのにより好ましい。米
国特許出願No.849,999およびグリンネル等（Grinnell e
t al.,1987,Bio/Technology 5:1189）には、アデノウィ
ルスで形質転換したヒト胚腎細胞が、ヒトプロテインＣ
などのγ−カルボキシル化されたタンパク質の組換え製
造において用いるのに特に好ましいことが記載されてい
る。このようなアデノウィルスで形質転換したヒト胚腎
セルラインの１つは、ATCCから取得番号CRL 1573のもと
で入手可能な293セルラインである。この293セルライン
は本発明のベクターとともに用いるのにも好ましい。
しかし、アデノウィルスで形質転換されたセルライン
中でγ−カルボキシル化されたタンパク質（例えば、ヒ
トプロテインＣなど）を産生させることの利点は、アデ
ノウィルスで形質転換されたヒト胚腎細胞に限定される
ものではない。実際のところ、アデノウィルスで形質転
換された細胞はγ−カルボキシル化されたヒトプロテイ
ンＣの産生用としては一般的には例外的な宿主である。
この型の特に好ましいセルラインの１つは、ATCCから取
得番号CRL 9595のもとで入手可能なAV12−664（以下、A
V12という）セルラインである。ヒトアデノウィルス12
をゴールデンハムスターの首筋に注射し、生じた腫瘍か
ら細胞を単離することによって、このAV12セルラインを
作成し、後記実施例４は、例示ベクターpLAPC−IRSによ
る293およびAV12の両セルラインの形質転換を記載する
ものである。
本発明のベクターを、多種の真核宿主細胞、特に哺乳
動物宿主細胞に導入し、発現させることができる。安定
な真核細胞形質転換体を単離し、同定するための選択マ
ーカーを全く持っていない本発明のベクターは、一時的
な検定用にだけでなく、米国特許No.4,399,216（1983年
８月26日発行）に記載されている方法である同時形質転
換用にも有用である。また、本発明のベクターは、大腸
菌中での複製を可能にする配列を含むことができる（一
般に、大腸菌中でプラスミドDNAを調製する方が他の宿
主微生物中で調製するより効率的であるので）。
本発明のベクターに含まれる活性化ヒトプロテインＣ
の構造遺伝子の直接発現は、この構造遺伝子に関連する
特定のプロモーターが機能する宿主細胞で起こる。本発
明で用いるのに適した宿主細胞の例を、適切な注ととも
に第２表に挙げる。
第２表に示したように、多数の哺乳動物宿主細胞が、
本発明の化合物上のタンパク質加水分解切断部位および
サグナルペプチドを認識して適切にプロセッシングする
ために必要な細胞機構を備えており、血漿中に依存する
ヒトプロテインＣで観察されるようなグルコシル化、γ
−カルボキシル化、およびβ−ヒドロキシ化などの翻訳
後修飾を付与する。後記のような多種多様のベクターが
このような真核宿主細胞の形質転換用に依存している
が、以下に例示する特定のベクターは本発明の範囲を限
定しようとするものではない。
pSV2型のベクターは、明確な真核性の転写単位−−プ
ロモーター（ep）、介在配列（IVS）、およびポリアデ
ニル化（pA）部位−−を構成しているSV40ゲノムのセグ
メントを含有している。SV40のＴ−抗原のないところで
は、プラスミドpSV2型のベクターは宿主細胞の染色体DN
A中に組込まれることによって哺乳動物宿主細胞および
その他の真核宿主細胞を形質転換する。SV40プロモータ
ーが挿入遺伝子を転写させる、プラスミドpSV2−gpt、p
SV2−neo、pSV2−dhfr、pSV2−hyg、およびpSV2−β−
グロビンなどの多種のプラスミドpSV2型のベクターが構
築されている［「Eukaryotic Viral Vectors」、グルズ
マン（Gluzman）編、コールド・スプリング・ハーバー
・ラボラトリーズ（Cold Spring Harbor Laboratories,
Cold Spring Harbor,New York,1982）版を参照］。これ
らのベクターは本発明の暗号配列とともに用いるのに適
しており、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクシ
ョン（ATCC）（American Type Culture Collection,Roc
kville,Maryland）またはノーザン・リージョナル・リ
サーチ・ラボラリー（NRRL）（Northern Regional Rese
arch Laboratory,Peoria,Illinois）から入手すること
ができる。
プラスミドpSV2−dhfr（ATCC 37146）は、SV40初期プ
ロモーターの支配下にあるネズミのジヒドロ葉酸還元酵
素（dhfr）遺伝子を含有している。適当な条件下では、
このdhfr遺伝子は宿主の染色体中で増幅されるか、また
はコピーされることが知られている。シムケの総説（Sc
himke,1984,Cell 37:705−713）に記載されているこの
増幅は、dhfr遺伝子に密に隣接しているDNA配列（例え
ば、本発明の活性化ヒトプロテインＣをコードしている
配列など）を包含することができ、従ってこれを用いて
活性化プロテインＣの産生を増加させることができる。
哺乳動物宿主細胞およびその他の真核宿主細胞中で活
性化プロテインＣ活性を発現させるために構築した本発
明のプラスミドは、多種多様のプロモーターを利用する
ことができる。本発明は、本明細書中に例示した特定の
真核生物性プロモーターを用いることに限定されるもの
ではない。ブッチャー等［Bucher et al.,1986,Nuc.Aci
ds Res.14（24）:1009］が開示している真核生物性プロ
モーターあるいはSV40後期プロモーターなどのプロモー
ター、または、例えばエストロゲン誘導が可能なニワト
リ卵アルブミン遺伝子、インターフェロン遺伝子、グル
ココルチコイド誘導が可能なチロシン アミノトランス
フェラーゼ遺伝子、チミジンキナーゼ遺伝子などの真核
生物性遺伝子、および主初期および後期アデノウィルス
遺伝子からのプロモーターを容易に単離することがで
き、そして真核宿主細胞においてプロテインＣを産生す
るように設計した組換えDNA発現ベクターで用いるよう
に修飾することができる。また、真核生物性プロモータ
ーを直列で用いてプロテインＣを発現させることもでき
る。さらに、多数のレトロウィルスが、広範囲の真核宿
主細胞に感染することが知られている。レトロウィルス
DNA中の長末端反復はプロモーター活性をコードしてい
ることが多く、従って活性換ヒトプロテインＣを発現さ
せるのに用いることができる。
プラスミドpRSVcat（ATCC 37152）は、ラウス肉腫ウ
ィルス（RSV;ニワトリおよびその他の宿主細胞を感染さ
せることが知られているウィルス）の長末端反復の部分
を含有している。RSVの長末端反復配列をプラスミドpRS
Vcatの〜0.7kb Nde I−Hind III制限フラグメントで単
離することができる。RSVの長末端反復中のプロモータ
ー［ゴーマン等（Gorman et al.,1982,P.N.A.S.79:677
7）］は本発明のベクターで用いるのに適している。プ
ラスミドpMSVi（NRRL B−15929）は、ネズミ肉腫ウィル
ス（MSV;マウスおよびその他の宿主細胞を感染させるこ
とが知られているウィルス）の長末端反復を含有してい
る。これらの反復配列は本発明のベクター中のプロモー
ターとして用いるのに適している。また、マウスのメタ
ロチオネイン（MMT）プロモーターは、真核宿主細胞で
の使用用にその特徴がやく調べられており、本発明のベ
クターで用いるのに適している。このMMTプロモーター
は15kbのプラスミドpdBPV−MMTneo（ATCC 37224）中に
存在しており、本発明の他のプラスミドを構築するため
の出発物質として用いることができる。
本発明の例示DNA配列およびプラスミドには多数の修
飾および変異が可能である。例えば、遺伝子コードの縮
重は、コードされているポリペプチドの暗号配列を変え
ることなく、ポリペプチド暗号領域中の、ならびに翻訳
停止シグナル中のヌクレオチドを置換することを可能に
する。このような置換しうる配列はヒトプロテインＣの
既知のアミノ酸およびDNA配列から推定することがで
き、次の一般的な合成法あるいは部位特異的な突然変異
誘発法によって構築することができる。合成法は、実質
的にイタクラ等（Itakura et al.,1977,Science 198:10
56）およびクレア等（Crea et al.,1978,Proc.Nat.Aca
d.Sci.USA 75:5765）の方法に従って行うことができ
る。従って、本発明は具体的に例示したDNA配列および
プラスミドに限定されるものではない。
本発明のベクターを真核宿主細胞に導入した後、選択
しうる表現型に基づいて形質転換体を選択することがで
きる。この選択しうる表現型は、発現ベクターに存在す
る選択マーカーによって、または宿主細胞に発現ベクタ
ーと同時導入される別のベクターに存在する選択マーカ
ーによって付与することができる。形質転換体が選択さ
れたら、どの形質転換体が発現ベクターにコードされて
いる所望のタンパク質を最高レベルで発現しているかを
同定するのが望ましい。このような同定は、選択マーカ
ーを含むプラスミドだけを含有し、発現ベクターを含有
していない形質転換体を多数生成する同時形質転換法の
後では特に重要である。
従って、本発明は、所望のタンパク質を発現し、分泌
する細胞の新規同定方法だけでなく、この方法を用いて
試験した他の細胞との比較においてタンパク質分泌量を
定量するための新規方法を提供するものである。また、
この方法は、所望のタンパク質を分泌している細胞を生
存している状態で単離することを可能にする。この方法
はあらゆる分泌タンパク質に一般液に適用することがで
きるが、本明細書中では特に活性化プロテインＣについ
て説明した。さらに、この方法は、真核生物性であって
も原核生物性であっても、また形質転換されたものであ
っても天然のものであっても、あらゆる細胞に適用する
ことができるが、本明細書中では真核生物性形質転換体
への適用によって説明した。
タンパク質を発現し分泌する細胞を同定し分離するた
めの本方法、および本方法で試験した他の細胞との関連
において産生タンパク質量を定量するための本方法は、
（ａ）適当な固体基質上に細胞集団を得；（ｂ）該細胞
に滅菌寒天のフィルムをかぶせ；（ｃ）該フィルム上に
ニトロセルロースのシートを置き；そして（ｄ）該シー
トを取り、該タンパク質に対する抗体を用いて該シート
に結合した該タンパク質を検出することからなる。タン
パク質と結合するあらゆる膜をニトロセルロースに代え
て用いることができ、これにはナイロン、DBM、あるい
は酢酸セルロースが含まれる。また、ゼラチンを寒天に
代えて用いることができる。高レベルタンパク質の分泌
細胞を同定するための本方法を後記実施例５でさらに詳
しく説明する。
以下に実施例を挙げて本発明の方法、ならびに代表的
な化合物、ベクターおよび形質転換体の構築（作成）プ
ロトコールを説明するが、これらな本発明を限定しよう
とするものではない。
実施例１ プラスミドpLAPCの構築 本実施例はプラスミドpLAPC構築の詳細なプロトコー
ルを提供するものである。簡単に説明すると、実施例1A
は、活性化ペプチドを含むプロテインＣ分子の一部をコ
ードしているDNAフラグメントのプラスミドpHC7からの
単離を説明するものであり、実施例1Bは、このDNAフラ
グメントのファージM13mp18へのクローニング、および
部位特異的な突然変異誘発による、得られた組換えファ
ージからの活性化ペプチドをコードしているDNAの除去
を説明するものであり、実施例1Cは、プラスミドpLAPC
構築の最後の工程、さらに詳しくは、この突然変異フラ
グメントを単離し、プラスミドpLPC由来の２つのフラグ
メントとライゲートしてプラスミドpLAPCを得ることを
説明するものである。プラスミドpLPC構築のプロトコー
ルは実施例２で説明する。
A.ヒトプロプロテインＣの活性化ペプチドの暗号配列を
含むDNAフラグメントの単離 プラスミドpHC7は形成期ヒトプロテインＣの完全な暗
号配列を含でいる。15μg/mlのテトラサイクリンを含む
１のＬブロス（10gペプトン、10g NaCl、および5g酵
母抽出物）に大腸菌K12 RR1/pHC7（NRRL B−15926）の
培養物を接種し、590nmでの光学密度（O.D.）が〜１吸
収単位となるまで空気−振盪インキュベーター中、37℃
でインキュベートし、この時点でクロラムフェニコール
（150mg）を培養物に加えた。約16時間インキュベート
を続けた。クロラムフェニコールの添加はタンパク質の
合成を阻害し、従ってさらに細胞***するのを阻害する
が、プラスミドの複製は継続させる。
この培養物を、Sorvall GSA ローター（Dupont Co.,
Instrument Products,Biomedical Division,Newtown,CN
06470）中、6000rpm、４℃で５分間遠心した。この上
清を捨て、細胞ペレットをTES緩衝液［10mMトリス−HC
l、pH＝7.5;10mM NaCl;および1mM EDTA］（40ml）で洗
浄し、再ペレット化した。もう一度上清を捨て、細胞ペ
レットをドライアスス−エタノール浴で凍結させ、そし
て解凍した。解凍した細胞ペレットを25％スクロース/5
0mM EDTA溶液（10ml）に再懸濁した。5mg/mlのリソチー
ム溶液（約1ml）;0.25MのEDTA、pH＝8.0（3ml）；およ
び10mg/mlのRNアーゼＡ（100μ）をこの溶液に加え、
次いでこれを氷上で15分間インキュベートした。このリ
ソチーム処理した細胞に3mlの溶菌溶液［10％トリトン
−X100（3ml）;0.25M EDTA、pH＝8.0（75ml）;1M トリ
ス−HCl,pH＝8.0（15ml）；および水（7ml）を混合して
調製］を加え、混合し、得られた溶液を氷上でさらに15
分間インキュベートした。この溶解した細胞をドライア
イス−エタノール浴で凍結させ、次いで解凍した。
SW27 ローター（Beckman,7360 N.Lincoln Ave.,Linc
olnwood,IL 60646）中、25,000rpmで40分間遠心するこ
とによってこの溶液から細胞の残骸を除去した。この溶
液にCsCl（約30.44g）および5mg/ml臭化エチジウム溶液
（〜1ml）を加え、その容量を40mlに調節した。この溶
液をVti50超遠心管（Beckman）にデカンテーションし
た。この管を密封し、Vti50ローター中、42,000rpmで〜
16時間遠心した。紫外光で見えるようにしてプラスミド
のバンドを単離し、ti75管およびローター（Beckman）
に入れ、55,000rpmで16時間遠心した。必要な容量の調
節はすべて0.761g/mlのCsClを含むTESを用いて行った。
プラスミドのバンドをもう一度単離し、臭化エチジウム
を塩−飽和のイソプロパノールで抽出し、最後にTES緩
衝液で1:3に希釈した。次いで、この溶液に２容量のエ
タノールを加え、得られた混合液を−20℃で一晩インキ
ュベートした。この溶液を、SS34ローター（DuPont C
o.）中、10,000rpmで15分間遠心することによってプラ
スミドDNAをペレット化した。
この方法によって得られたプラスミドpHC7DNA（〜1m
g）をTE緩衝液［10mM トリス−HCl、pH＝7.6、および
0.1mM EDTA］（1ml）に懸濁し、−20℃で保存した。プ
ラスミドpHC7の制限部位および機能地図を添付の第２図
に示す。
プラスミドpHC7DNA（約７μg;7μを、10X Core緩衝
液TM（25μ）［Core緩衝液TM（BRL）は500mMトリス−
HCl、pH＝8.0;500mM NaCl;および10mM MgCl2である］、
水（198μ）、制限酵素Sst I（12μ；〜60単位）
［BRL（Bethesda Research Laboratories,Gaithersbur
g,MD 20877）；実施例中で言及する酵素のすべては、他
に記載がなければ、BRLから、またはNEB（New England
Biolabs,Beverly,MA 01915−9990）から入手可能であ
り、これらを実質的に製造元の推奨に従って用いた］、
および制限酵素Sal I（８μ;80単位）に加えた。この
反応混合物を37℃で４時間インキュベートし、次いでSs
t I−Ssl I消化したプラスミドpHC7 DNAを始めフェノー
ルで、次にクロロホルムで抽出し、エタノール沈澱およ
び遠心によって集め、最後にTE/10緩衝液［10mMトリス
−塩基、pH＝7.6;および0.1mM EDTA］（15μ）に懸濁
した。
次に、この反応混合物を、トリス−酢酸塩緩衝液中、
〜130Vおよび〜65mAで２〜３時間、〜0.6％低ゲル化温
度アガロース（FMC Corporation,Marine Colloids Divi
sion,Rockland,Maine 04841）ゲルで電気泳動にかけ
た。このゲルを臭化エチジウムの希釈溶液で染色し、長
波長のUV光で見えるようにし、〜0.7kb Sst I−Sal I制
限フラグメントを含むDNAのバンドを小さな切片でゲル
から切り取った。この切片の体積を切片の密度と重量か
ら求め、切片を入れた試験管に４容量の0.25M NaCl含有
のTEを加えた。次いで、この切片を72℃でインキュベー
トして溶解した。約400μ中に、プラスミドpHC7の〜
0.7kb Sst I−Sal I制限フラグメントが約0.5μｇ得ら
れた。このDNA溶液を製造元の推奨に従いNACS−prepacR
カラム（BRL）に通すとさらに精製されたDNAが得られ
た。この精製フラグメントを脱イオン水（15μ）に再
懸濁した。
B.組換えファージの構築および活性換ペプチドをコード
しているDNAの部位特異的な突然変異誘発による除去 約１μｇのファージM13mp18（New England Biolabsか
ら入手）のRF（複製型）DNAを、実質的に実施例1A記載
の方法に従って、制限酵素Sst IおよびSsl Iで消化し
た。この反応混合液をフェノールで、次いでクロロホル
ムで抽出することによって反応を止め、そしてDNAを沈
澱させ、遠心して集め、約15μのTE緩衝液に再懸濁し
た。この消化によって得られた２種類のフラグメントを
〜0.6％の低ゲル化温度アガロースゲルで分離し、大き
い方のフラグメントをゲルから切り出し、実施例1Aの記
載のようにして精製した。
このSst I−Ssl I消化したM13mp18 RF DNA（５μ）
に、プラスミドpHC7〜0.7kb Sst I−Sal I制限フラグメ
ント（約0.1μg;水７μ中）を、10X リガーゼ緩衝液
［0.5Mトリス−HCl、pH＝7.8;60mM MgCl2;および0.2Mジ
チオトレイトール（DTT）］（２μ）、1mg/ml BSA
（２μ）、25mM ATP（１μ）、T4 DNAリガーゼ（NE
B）（１μ；〜400単位）、および水（２μ）ととも
に加えた。このライゲート反応液を25℃で一晩インキュ
ベートした。ライゲートしたDNAは２本鎖形の所望のフ
ァージM13mp18−HE1 DNAからなっていた。
大腸菌 K12 JM101（New England Biolabs）の一晩培
養物（約300μ）を2X TYブロス［TYブロスは10g/ト
リプトン、10g/ NaCl、および5g/酵母抽出物であ
る］（30ml）に接種し、この培養物を、O.D.600が〜0.5
になるまで曝気しながら37℃でインキュベートした。培
養物を氷水浴で10分間冷却し、遠心して集め、冷10mM N
aCl（15ml）に再懸濁した。細胞をもう一度遠心して集
め、冷却した30mMのCaCl2（15ml）に再懸濁した。この
細胞を氷上に20分間置き、遠心して集めた。細胞を冷30
mM CaCl2（1.5ml）に再懸濁し、その200μを取り、上
記調製のライゲートDNA（９μ）に加え、氷上で約30
分間インキュベートした。次いで、この細胞−DNA混合
物を42℃で２分間インキュベートし、トップ寒天［45℃
で溶融するように保たれた0.5％寒天含有のTYブロスで
あり、２％Ｘ−ガル（５−ブロモ−４−クロロ−３−イ
ンドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド）（50μ）、
100mM IPTG（イソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノ
シド）（50μ）、および対数増殖期の大腸菌K12 JM10
1（100μ）をを含んでいる］（3ml）に加えた。次い
で、この細胞−トップ寒天の混合物をTY−寒天プレート
に蒔き、このプレートを37℃で一晩インキュベートし
た。
翌朝、４つの透明なプラークを2X TYブロス（2ml）に
別々に接種し、この培養物を曝気しながら37℃で６時間
インキュベートした。次に、培養物を遠心し、得られた
上清（細胞ペレットは制限酵素分析用のファージDNAの
調製に用いた）（500μ）を大腸菌K12 JM101の培養物
（500μ;O.D.550＝0.5）および2X TYブロス（50ml）
に加えた。これらの培養物を37℃で一晩インキュベート
した。この細胞ペレットから、培養培地に抗生物質を全
く用いなかったことと超遠心の工程をフェノールおよび
クロロホルム抽出に置き換えたこと以外は実施例1A記載
の方法のスケールを小さくした方法を用いて、ファージ
RF DNAを単離した。ファージM13mp18−HE1 DNAを含む形
質転換体をそのファージDNAの制限酵素分析によって同
定した。
一晩培養物を遠心し、上清5mlあたりに20％ポリエチ
レングリコール（PEG）6000と2.5mM NaClからなる溶液
約1mlを加え、次いで室温で10分間インキュベートし
た。この混合物を10,000rpmで10分間遠心し、得られた
ペレット（１本鎖のファージM13mp18−HE1 DNAを含んで
いる）をTES緩衝液［20mMトリス−HCl、pH＝7.5;0.1M E
DTA;および10mM NaCl］（500μ）に再懸濁した。この
DNA溶液を、始めクロロホルムで、次いでTE飽和のフェ
ノールで２回、さらにもう一度クロロホルムで抽出し
た。次いで、エタノールおよびNaOAcを用いて１本鎖のD
NAを沈澱させ、遠心し、そしてペレットを70％エタノー
ルで洗浄し、乾燥した後、得られたペレットを水（80μ
）に溶解した。このファージ調製物を次の工程（部位
特異的な突然変異誘発）で用い、活性換ペプチドをコー
ドしているDNAを除去した。
活性化ペプチドをコードしているDNAを除去するため
の突然変異誘発に用いる１本鎖のDNAフラグメントは自
動DNA合成機で合成したが、これは次の配列を有してい
る： この１本鎖のDNAフラグメント（「突然変異誘発オリゴ
ヌクレオチド」）（約30pモル;1μ）、およびM13普遍
プライマー［Boehringer−Mannhein Biochemicals（BM
S）,7941 Castleway Drive,P.D.Box 50816,Indianapoli
s,IN 46250から市販されている］（7.5pモル;15.5μ
）を、1mMのATP（１μ）を含む1Xキナーゼ緩衝液
［100mMトリス−HCl、pH＝8.3;100mM DDT;および100mM
MgCl2］（10μ）中、T4ポリヌクレオチドキナーゼ５
単位［Pharmacia,P−L Biochemicals,Inc.,800 Centenn
ial Avenue,Piscataway,NJ 08854］を用いて、37℃で30
分間別々に処理し、次いで65℃で10分間インキュベート
し、そして凍結させた。このキナーゼ処理したDNAを以
下に記載の突然変異誘発に用いた。
突然変異誘発の最初の工程では、突然変異誘発オリゴ
ヌクレオチドとM13普遍プライマーを１本鎖のファージD
NAにアニーリングした。普遍プライマー（1pモル;1.2μ
）、突然変異誘発オリゴヌクレオチド（1pモル;0.3μ
）、10Xアニーリング緩衝液［100mMトリス−HCl、pH
＝7.5;1mM EDTA;および500mM NaCl］（２μ）、およ
び水（16μ）に１本鎖のファーゼM13mp18−HE1（300n
g;0.5μ）を加え、この混合物を80℃で２分間、次い
で50℃で５分間インキュベートし、最後に混合物を室温
まで冷却してアニーリング反応を行った。
オリグヌクレオチドがアニーリングされたなら、DNA
ポリメラーゼでプライマーを延長することによりファー
ジDNAを２本鎖にした。この延長反応は、アニーリング
したDNAの混合物に10Xの延長緩衝液［500mMトリス−HC
l、pH＝8;1mM EDTA;および120mM MgCl2］（３μ）、1
0Xのトリガーゼ緩衝液（３μ）、0.2mM DTT（1.5μ
）、dNTP混合物［各dNTPが0.5mM］（３μ）、25mM
ATP（1.2μ）、クレノウ酵素［5U/μ;BMB］（0.5μ
）、T4 DNAリガーゼ［400U;NEB］（１μ）、および
水（19.8μ）を加えることによって行った。この延長
反応液を、室温で30分間、次いで37℃で４時間、さらに
４℃で一晩インキュベートした。
この反応を、フェノール−クロロホルム抽出、および
エタノールと酢酸ナトリウム（NaOAc）によるDNA沈澱に
よって停止させた。DNAを遠心して集め、S1緩衝液［0.3
M NaCl;0.03M NaOAc、pH＝4.5;および0.3mM ZnCl2］（4
0μ）に再懸濁し、次いでDNAの溶液に加えた。以下に
記載するS1処理は、部位特異的な突然変異誘発法に有用
であると報告されている。しかし、本発明等はS1処理に
有意の利点を全く見い出すことができず、本発明書の後
記実施例で説明する構築プロトコールではこのS1処理を
完全に削除した。
DNAを溶液を２本の試験管に均等に分け、この試験管
の１本のS1ヌクレアーゼ（100単位;BMB）を加えた。こ
のS1反応液を室温で５分間インキュベートし、反応混合
物をTE飽和のフェノール−クロロホルム（50:50）で１
回抽出することによって反応を停止させた。エタノール
とNaOAcを用いてこの反応混合物から、およびS1処理し
ていない試料からDNAを沈澱させた。
このDNAペレットを水（60μ）に再懸濁し、これを
用い、IPTGまたはＸガルをプレートに全く加えなかった
こと以外はファージM13mp18−HE1の構築に用いた方法に
従って大腸菌K12 JM101を形質転換した。ドット−ブロ
ット ハイブリダイゼーションおよびプラークのプロー
ブとして突然変異誘発オリゴヌクレオチドの小部分５′
−TGAAACGACTCATTGA−３′（放射性活性にラベルした）
を用いることによって突然変異体をスクリーニングし
た。ハイブリダイゼーションにより陽性と見られたいく
つかのプラークを取り、対数増殖期の同調菌K12 JM101
の培養物（2ml）に別々に接種した。これらの培相物を
曝気しながら37℃で約６時間インキュベートし、次いで
これらを用い、ファージM13mp18−HE1について上記した
ようにして１本鎖のDNAを調製した。
ジデオキシ−配列決定法［J.H.Smith,1980,Methods i
n Enzymology 65:560−580］を用いて１本鎖DNAの配列
決定を行った。いくつかのファージが所望の突然変異体
であると同定された。活性化ペプチドの暗号配列が削除
されているファージをファージM13mp18−HE2と命名し
た。ファージM13mp18−HE2中の突然変異は、天然の暗号
配列に対して36bpの大きさの減少をもたらし、この差異
を、突然変異した領域を含むDNAの同定を容易にするの
に用いることができる。後の構築に用いるためRF型のフ
ァージM13mp18−HE2を調製した。
C.ファージM13mp18−HE2およびプラスミドpLPCからのプ
ラスミドpLAPCの最終的な構築 実質的に実施例1Aの方法に従い、RF型のファージM13m
p18−HF2の突然変異誘発されたSst I−Sal I（〜0.7k
b）制限フラグメントをファージから切り取り、単離し
た。しかし、1:2希釈の低ゲル化アガロース中、〜0.1μ
ｇの所望の〜0.7kbフラグメントを含む〜100μの溶液
をいかなる精製カラムにもかけず、直接、下記のプラス
ミドpLAPCを得るためのライゲートに用いた。
３種のDNAフラグメント、即ち、上記のファージM13mp
18−HF2の〜0.7kb Sst I−Sal I制限フラグメント、お
よびプラスミドpLPC由来の２種類のDNAフラグメントを
いっしょにしてライゲートし、プラスミドpLPCを得た。
プラスミドpLPC構築のプロトコールは実施例２で説明す
る。プラスミドpLPCを制限部位および機能地図を添付の
第１図に示す。プラスミドpLPC上のSal I、Sst Iおよび
EcoR I制限酵素認識部位の設置により、所望のEcoR I−
Sal IおよびEcoR I−Sal I制限フラグメントは２種類の
別々の消化で調製しなければならなかった。
EcoR I−Sal Iフラグメントを調製するため、水（25
μ）中のプラスミドpLPC（約40μｇ）を、1mg/lmのBS
A（10μ）、10XのCore緩衝液TM（10μ;BRL）、制限
酵素EcoR I（５μ;50U;BRL）、制限酵素Sat I（５μ
;25U;BRL）、および水（45μ）に加え、得られた反
応液を37℃で1.5時間インキュベートした。エタノール
で沈澱させ、遠心することによってSst I−EcoR I消化
したプラスミドpLPCのDNAを集めた。このSst I−EcoR I
消化したDNAを水に再懸濁し、次いで〜0.6％の低ゲル化
温度のアガロースゲルにかけ電気泳動でDNAフラグメン
トを分離した。
EcoR I−Sal Iフラグメントを調製するため、水（９
μ）中のプラスミドpLPC（約15μｇ）を始めに制限酵
素Apa Iで処理して似た大きさの制限フラグメントによ
る汚染がないようにした。10XのApa I緩衝液［60mM NaC
l;60mMトリス−HCl、pH＝7.4;60mM MgCl2;および60mM D
TT］（約10μ）、1mg/mlのBSA（10μ）、水（69μ
）、および制限酵素Apa I（２μ;50U;NEB）をプラ
スミドpLPC DNAの溶液に加え、得られた反応液を37℃で
１時間インキュベートした。次に、2M NaCl（15μ
）、水（69μ）、制限酵素Sal I（８μ;NEB）、
および制限酵素EcoR I（８μ;NEB）をApa I消化した
プラスミドpLPC DNAの溶液に加え、この反応液を37℃で
１時間インキュベートした。このApa I−Sal I−EcoR I
消化したプラスミドpLPC DNAを、始めフェノールで、次
いでクロロホルムで抽出し、続いてエタノールで沈澱と
遠心によって集め、最後に水（25μ）に再懸濁した。
次に、このDNAを〜0.6％の低ゲル化温度のアガロースゲ
ルにかけ、DNAフラグメントを電気泳動で分離した。
〜3.76kbのEcoR I−Sal I制限フラグメントおよび〜
2.0kbのEcoR I−Sat I制限フラグメントをゲルから切り
出し、実施例1A記載のように、等量の10mMトリス−HC
l、pH＝7.6を加えた後、ゲル フラグメントを溶融し
た。プラスミドpLPCの〜3.76kb EcoR I−Sal I制限フラ
グメント（約２μｇ）がこのようにして10mMトリス−HC
l、pH＝7.6（〜200μ）中に得られた（この液は溶融
したアガロースをも含んでいた）。プラスミドpLPCの〜
2.0kb EcoR I−Sal I制限フラグメント（約２μｇ）
は、アガロースを含む別の10mMトリス−HCl、pH＝7.6
（〜200μ）中に得られた。
２種類の精製制限フラグメント（プラスミドpLPCの〜
3.76kb EcoR I−Sal I制限フラグメント、およびプラス
ミドpLPCの〜2.0kb EcoR I−Sta I制限フラグメント）
を溶液（それぞれ約12.5μ）を、ファージM13mp18−H
E2の〜0.7kb Sta I制限フラグメント（20μ）、1mg/m
l BSA（10μ）、10mM ATP（10μ）、10Xリガーゼ緩
衝液（10μ）、T4 DNAリガーゼ（２μ；〜800U;NE
B）、および水（23μ）に加え、得られたライゲート
反応液を15℃で一晩インキュベートした。このライゲー
トしたDNAは所望のプラスミドpLAPCを構成していた。プ
ラスミドpLAPCは、活性化ペプチドをコードしているDNA
が欠失していることがプラスミドpLPCと異なるだけであ
る（第１図）。
プラスミドの構造を調べ、真核細胞の形質転換および
さらに構築を行うための大量のプラスミドpLAPCを得る
ため、プラスミドpLAPCを含むライゲートDNAを用いて大
腸菌K12 RV 308（NRRLから取得番号NRRL B−15624のも
とで入手可能）を形質転換した。
Ｌブロス中の大腸菌K12 RV308の培養物（50ml）を、5
90nmで光学密度（O.D.）が〜0.6になるまで増殖させ
た。この培養物を氷上で10分間冷却し、細胞を遠心して
集めた。この細胞ペレットを冷10mM NaCl（25ml）に再
懸濁した。もう一度細胞を遠心してペレット化し、この
ペレットを冷30mM CaCl2（25ml）に再懸濁し、氷上で30
分間インキュベートした。細胞を再度遠心して集め、冷
30mM CaCl2（2.5ml）に再懸濁した。
この細胞懸濁液（200μ）をプラスミドpLAPC含有の
ライゲートDNAと混合し、氷上で60分間インキュベート
した。次いで、この混合物を42℃で２分間、続いて室温
で10分間インキュベートした。この細胞−DNA混合物に2
XのTYブロス（約10ml）を加え、次いで細胞を125mlのフ
ラスコに入れ、空気−振盪インキュベーター中、37℃で
２時間インキュベートした。
細胞混合物の一部を100μg/mlアンピシリン含有のTY
−寒天（15g/寒天のTYブロス）プレートに蒔き、この
プレートを37℃で一晩インキュベートした。大腸菌K12
RV308/pLAPC形質転換体をそのプラスミドDNAの制限酵素
分析によって確認した。選択剤としてテトラサイクリン
グではなくアンピシリン（50μg/ml）を用いること以外
は実質的に実施例1Aの教示に従い、大腸菌K12 RV308/pL
APC形質転換体からプラスミドDNAを得た。
実施例２ プラスミドpLPCの構築 プラスミドpLPCをプラスミドpLAPC構築の中間体ベク
ターとして用いた（実施例1C参照）。プラスミドpLPC
は、ヒトプロテインＣを発現させるように配置されたア
デノウィルス２の後期プロモーターおよびBKウィルスの
エンハンサーをコードしているDNAセグメントを含有し
ている。プラスミドpLAPC構築のプロトコールは、本質
的に、プラスミドpLPC上のヒトプロテインＣの暗号配列
を、活性化ペプチドをコードしているDNAが除去された
別のプロテインＣ暗号配列に置き換えることになる。
プラスミドpLPCおよびpLAPC上のBKエンハンサー／ア
デノウィルス後期プロモーターの発現コントロール配列
は、米国特許出願No.06/849,999（1986年４月９日出
願）の対象物である。米国特許出願No.06/849,999に
は、プラスミドpLPC（従ってpLAPC）の発現コントロー
ル配列は大きいDNAウィルスの即時型遺伝子産物、即ち
アデノウィルスのE1A遺伝子産物の存在によってその活
性が大きく刺激されることが開示されている。
プラスミドpLPC構築のプロトコールを以下に説明す
る。プラスミドpLPCの全構築プロトコールを添付の第１
図に図示する。簡単に説明すると、実施例2AはBKウィル
スDNAの単離を記載するものであり、これからBKエンハ
ンサーを得ることができる。実施例2Bは、BKエンハンサ
ーをプラスミドpdBPV−MMTneoに挿入することによって
得られるプラスミドである、プラスミドpBKneo1構築の
プロトコールを記載するものである。実施例2Cは、アデ
ノウィルス２後期プロモーターをプラスミドpSV2catに
挿入することによって得られるプラスミドである、プラ
スミドpLPcat構築のプロトコールを記載するものであ
る。実施例2Dは、アデノウィルス後期プロモーターの活
性を刺激するように設置されたBKエンハンサーを含むプ
ラスミドである、プラスミドpBLcat構築のプロトコール
を記載するものである。実施例2Eは、プロテインＣ発現
ベクターであるプラスミドpLP133構築のプロトコールを
記載するものであり、出発プラスミドpHC7から始め、中
間体プラスミドpSV2−HPC8の構築を経て、最後にプラス
ミドpLP133を構築する。最後に、実施例2Fは、ヒトプロ
テインＣを発現するようプラスミドpLP133に挿入され
た、プラスミドpBLcatのBKエンハンサー／アデノウィル
ス後期プロモーター発現コントロール配列を含有するプ
ラスミドpLPCの構築プロトコールを記載するものであ
る。
A.BKウィルスDNAの調製 BKウィルスはアメリカン・タイプ・カルチャー・コレ
クションから取得番号ATCC VR−837のもとで入手する。
このウィルスは凍結乾燥形で供給され、これをハンク
（Hank）のバランス塩［Gibco,3175 Staley Roaley Roa
d,Grand Island,NY 14072］に再懸濁して約105プラーク
形成単位（pfu）/mlの力価にした。BKウィルスDNAの調
製用に選択した宿主は一次ヒト胚腎（PHEK）細胞であ
り、この細胞はFlow Laboratories,Inc.（7655Old Spri
nghouse Road,McLean,VA 22101）からカタログ番号０−
100のもとで、またはM.A.Bioproductsからカタログ番号
70−151のもとで入手することができる。
全面単層の約106のPHEK細胞を入れた約５個の75mm2ポ
リスチレン製フラスコをウィルスの調製に用いた。各フ
ラスコに105pfu/mlの力価のBKウィルス（約1ml）を入
れ、これを37℃で１時間インキュベートし、次いで新鮮
な培養培地［ダルベッコの改良イーグル培地（Gibco,Gr
and Island,NY 14072）;10％ウシ胎児血清を追加］を加
え、感染した細胞を37℃で10〜14日間、またはウィルス
の完全な細胞変性効果が現れるまでインキュベートし
た。この細胞変性効果は、セルラインの種類によって、
およびウィルスの種類によって異なるが、通常は培養デ
ィスクを集合させ、凝集させ、そして脱落する細胞から
なる。
凍結−解凍を３回繰り返すことによって細胞からウィ
ルスを放出させ、5000Xgで遠心して細胞の残骸を除い
た。PEG−6000（100g）を加え、溶液を４℃で24時間イ
ンキュベートし、そして5000Xgで20分間遠心することに
よって、上清液（１）中のウィルスを沈澱させ、集め
た。このペレットを、初めの容量の1/100で0.1XのSSC緩
衝液［1X SSC＝0.15M NaClおよび0.015Mクエン酸ナトリ
ウム、pH＝７］に溶解した。このウィルス懸濁液を試験
管中の飽和KBr溶液（15ml）の上に層状に入れ、これを7
5,000Xgで３時間遠心した。遠心後、２本のバンドがKBr
溶液中に現れた。完全なビリオンを含む下方のバンドを
集め、TE［10mMトリス−Hcl、pH＝7.8;および1mM EDT
A］を溶離緩衝液として用いるSephadexRG−50カラム［S
igma Chemical Co.,St.Louis,MO 63178］で脱塩した。
このカラムから得た精製ビリオンの溶液にドデシル硫
酸ナトリウム（SDS）を１％の濃度になるまで加え、pro
naseR（Sigma）プロテアーゼを100μg/ml濃度になるよ
う加え、そしてこの溶液を37℃２時間インキュベートし
た。次いで、この溶液に塩化セシウムを1.56g/mlの密度
になるよう加え、臭化エチジウムを最終濃度100μg/ml
になるよう加えた。この溶液をSorvall 865ローター［D
uPont Co.,Newton,CT 06470］または同様の垂直ロータ
ー中、260,000Xgで24時間遠心した。遠心後、ウィルスD
NAのバンドを単離し、100mMのトリス−HCl、pH＝7.8で
飽和したイソアルミルアルコールにより５回抽出した。
次いで、BKウィルスDNAの溶液を、DNAの260nm/280nm吸
収比が1.75〜1.90になるまでTE緩衝液に対して透析し
た。NaCl濃度を0.15Mに調節し、２容量のエタノールを
加え、この溶液を−70℃で少なくとも２時間インキュベ
ートし、そして12,000Xgで10分間遠心することによって
DNAを沈澱させた。得られたBKウィルスDNAのペレットを
1mg/mlの濃度でTE緩衝液に懸濁させた。BKウィルスの制
限部位および機能地図を添付の第１図に示す。
B.プラスミドpBKneo1の構築 大腸菌K12 HB101/pdBPV−MMTneo細胞を、アメリカン
・タイプ・カルチャー・コレクションから取得番号ATCC
37224のもと、凍結乾燥形で入手する。この凍結乾燥細
胞を100μg/mlアンピシリン含有のＬ寒天プレートに蒔
き、37℃でインキュベートして１個のコロニー単離体を
得た。
50μg/mlアンピシリン含有のＬブロス［１あたりト
リプトン10g、NaCl 10g、および酵母抽出物5g］（１
）に大腸菌K12 HB101/pdBPV−MMTneoのコロニーを接
種し、空気−振盪器中、O.D.590が〜１吸収単位になる
まで37℃でインキュベートし、この時点で培養物にクロ
ラムフェニコール（150mg）を加えた。約16時間インキ
ュベートを続けた。クロラムフェニコールの添加はタン
パク質の合成を阻害し、従ってさらに細胞***するのを
抑制するが、プラスミドの複製は継続させる。次いで、
実質的に実施例1A記載の方法に従って、培養物からプラ
スミドpdBPV−MMTneoDNAを調製した。
この方法によって得たプラスミドpdBPV−MMTneoDNA
（〜1mg）をTE緩衝液（1ml）に懸濁させ、−20℃で保存
した。通常、実施例1A記載のプラスミド単離法は、大量
の高精製度プラスミドDNAが所望であるときに用いられ
る。この方法を少し変え、培養細胞を約5mlだけ用い、
この細胞を適切にスケールダウンした量の溶菌緩衝液中
で溶菌し、遠心工程をフェノールおよびクロロホルム抽
出に置き換えることによって、比較的小量の、やや精製
度の低いDNA（例えば、あるプラスミドの存在について
形質転換体をスクリーニングするときに必要とされるよ
うなDNA）を早く得ることができる。
上記のようにして調製したプラスミドpdBPV−MMTneoD
NA（約５μg;5μ）、および前記のようにして調製し
たBKウィルスDNA（５μg;5μ）のそれぞれを、10XのB
amH I緩衝液［1.5M NaCl;60mMトリス−HCl、pH＝7.9;60
mM MgCl2;および1mg/ml BSA］（２μ）、制限酵素Bam
H I（１μ；〜10単位）、および水（７μ）を含む
溶液中、37℃で２時間消化した。等量のフェノールで抽
出し、続いてクロロホルムで２回抽出することによって
反応を停止させた。次いで、BamH I消化したDNAのそれ
ぞれを沈澱させ、遠心して集め、水（５μ）に再懸濁
した。
BamH I消化したプラスミドpdBPV−MMTneo（１μ）
とBamH I消化したBKウィルスDNA（１μ）の混合物に1
0Xのリガーゼ緩衝液（約１μ）を加えた。このDNA混
合物にT4 DNAリガーゼ（１μ；〜５単位）および水
（６μ）を加えた後、得られた反応液を16℃で一晩イ
ンキュベートした。ライゲートしたDNAは所望のプラス
ミドpBKneo1およびpBKneo2からなり、これらはBKウィル
スDNAの配向だけが異なっていた。プラスミドpBKneo1の
制限部位および機能地図を添付の第１図に示す。
大腸菌K12 HB101細胞はノーザン・リージョナル・リ
サーチ・ラボラトリーから取得番号NRRL B−15626のも
と凍結乾燥形で入手可能である。Ｌブロス中の大腸菌K1
2 HB101の培養物（50ml）を、650nmでの光学密度（O.D.
650）が約0.4吸収単位になるまで増殖させた。この培養
物を氷上で10分間冷却し、細胞を遠心して集めた。この
細胞ペレットを冷100mM MgCl2（25ml）に再懸濁し、氷
上で25分間インキュベートした。細胞を再度遠心してペ
レット化し、ペレットを冷100mM CaCl2（2.5ml）に再懸
濁し、氷上で30分間インキュベートした。インキュベー
トした後には、この細胞は形質転換溶DNAの取込みに対
してコンピテントであった。
この細胞懸濁液（200μ）を上記調製のライゲート
化DNAと混合し、氷上で30分間インキュベートした。こ
の時間が経過した時点で、細胞を42℃の水浴中に２分間
入れ、次いでさらに10分間氷上に戻した。細胞を遠心し
て集め、Ｌブロス（1ml）に再懸濁し、37℃で１時間イ
ンキュベートした。形質転換した細胞を100μg/mlアン
ピシリン含有のＬ寒天プレートに蒔いた。大腸菌K12 HB
101/pBKneo1および大腸菌K12/pBKneo2形質転換体は、そ
のアンピシリン耐性の表現型、およびそのプラスミドDN
Aの制限酵素分析によって同定した。プラスミドpBKneo1
の制限部位および機能地図を添付の第1A図に示す。
C.プラスミドpBLcatの構築に用いる中間体プラスミドで
あるプラスミドpLPcatの構築 アデノウィルス２（Ad2）のビリオンDNAは、大きさが
約35.94kbの２本鎖の直線状分子である。Ad2の後期プロ
モーターをAd2ゲノムの〜0.32kb Acc I−Pvu II制限フ
ラグメントで単離することができる；この〜0.32kb制限
フラグメントはAd2ゲノムヌクレオチド位置5755と6071
の間の配列に対応している。所望の〜0.32kb Acc I−Pv
u II制限フラグメントを単離するため、初めにAd2 DNA
を制限酵素Bal Iで消化し、〜0.32kb Acc I−Pvu II制
限フラグメントの全配列を含有している〜2.4kb Bal I
制限フラグメントを単離した。次に、この〜2.4kb Bal
I制限フラグメントをAcc IおよびPvi IIで消化して所望
のフラグメントを得た。
Ad2 DNA（約50μg;BRLから入手可能）を水（80μ）
および10XのBal I緩衝液［100mMトリス−HCl、pH＝7.6;
120mM MgCl2;100mM DTT;および1mg/ml BSA］（10μ）
に溶解した。このAd2 DNAの溶液に制限酵素Bal I（約10
μ；〜20単位）を加え、得られた反応液を37℃で４時
間インキュベートした。
このBal I消化したDNAをアガロースゲルにかけ、制限
フラグメントが十分に分離するまで電気泳動を行った。
ゲルを臭化エチジウムの希釈溶液（0.5μ/ml）中で染
色し、染色したゲルを長波長の紫外（UV）光にあてるこ
とによって電気泳動したDNAを見えるようにした。アガ
ロースからDNAを単離する方法の１つは次のようであ
る。ゲルの所望のフラグメントの前に小さな切れ目を入
れ、NA−45 DEAEメンブラン（Schleicher and Schuell,
Keene,NH 03431）の小片をそれぞれの切れ目に入れる。
さらに電気泳動を続けると、DNAが非共有結合でDEAEメ
ンブランに結合する。所望のフラグメントがDEAEメンブ
ランに結合した後、このメンブランを取り、低塩の緩衝
液［100mM KCl;0.1mM EDTA;および20mMトリス−HCl、pH
＝８］ですすぐ。次に、このメンブランを小さい試験管
に入れ、高塩の緩衝液［1M NaCl;0.1mM EDTA;および20m
Mトリス−HCl、pH＝８］に浸漬し、そして65℃で１時間
インキュベートしてDEAE紙からDNAを浸出させる。この6
5℃のインキュベートの後、インキュベート緩衝液を集
め、メンブランを高塩の緩衝液ですすぐ。この高塩のす
すぎ液を高塩のインキュベート緩衝液とともに集めた。
NaCl濃度が0.25Mになるように高塩のDNA溶液の容量を
調節し、次いでこの溶液に３容量の冷、無水エタノール
を加えた。得られた溶液を混合し、10〜20分間、−70℃
にした。次に、この溶液を15,000rpmで15分間遠心し
た。さらに沈澱を行って残留する塩を除去した後、DNA
ペレットをエタノールですすぎ、乾燥し、TE緩衝液（20
μ）に再懸濁した；このペレットは目的のAd2の制限
フラグメント（約３μｇ）からなっていた。得られた精
製フラグメントをTE緩衝液（10μ）に溶解した。
水（約６μ）および10XのAcc I緩衝液［60mM NaCl;
60mM トリス−HCl、pH＝75;60mM MgCl;60mM DTT;およ
び1mg/ml BSA］（２μ）を、Ad2の〜2.4kb Bal I制限
フラグメントの溶液に加えた。このDNA溶液に制限酵素A
cc I（約２μ；〜10単位）を加えた後、反応液を37℃
で２時間インキュベートした。Acc I消化した後、DNAを
エタノール沈澱によって集め、水（16μ）および10X
のPvul I緩衝液［600mM NaCl;60mM トリス−HCl、pH＝
7.5;60mM MgCl2;60mM DTT;および1mg/ml BSA］（２μ
）に再懸濁した。このDNA溶液に制限酵素Pvu II（約
２μ；約10単位）を加えた後、反応液を37℃で２時間
インキュベートした。
Acc I−Pvu II消化した、Ad2の〜2.4kb Bal I制限フ
ラグメントを〜６％ポリアクリルアミドゲルにかけ、Ad
2の後期プロモーターを含有する〜0.32kbのAcc I−Pvu
II制限フラグメントが他の消化産物から分離するまで電
気泳動を行った。このゲルを臭化エチジウムで染色し、
UV光を用いて観察し、〜0.32kbのAcc I−Pvu II制限フ
ラグメントを含んでいるゲル部分をゲルから切り出し、
これをつぶし、そして室温で一晩、抽出緩衝液［500mM
NH4OAc;10mM MgOAc;1mM EDTA;および0.1％SDS］（〜250
μ）中に浸した。翌朝、この混合物を遠心し、ペレッ
トを捨てた。上清中のDNAをエタノールで沈澱させた;tR
NA（約２μｇ）を加えて所望のフラグメントの沈澱を確
実なものにした。〜0.32kb Acc I−Pvu II制限フラグメ
ントが約0.2μｇ得られ、これを水（７μ）に懸濁さ
せた。
このAcc I−Pvi II制限フラグメントをAcc I−Bcl I
制限フラグメントに変換するため、〜0.32kb Acc I−Pv
u II制限フラグメントにBcl Iリンカーをライゲートし
た。Bcl Iリンカーは平滑末端であるので、このリンカ
ーは制限フラグメントのPvu II末端にだけ結合した。以
下の配列を有するBcl Iリンカー（New England Biolab
s）を、次の方法によりライゲート用にキナーゼ処理
し、用意した： リンカー（４μ；〜２μｇ）を水（20.15μ）およ
び10Xのキナーゼ緩衝液［500mM トリス−HCl、pH＝7.
6;および100mM MgCl2］（５μ）に溶解し、90℃で２
分間インキュベートし、次いで室温まで冷却した。この
混合物にγ−32P−ATP（５μ；〜20μCi）、1M DTT
（2.5μ）、およびポリヌクレオチドキナーゼ（５μ
；〜10単位）を加え、37℃で30分間インキュベートし
た。次に、0.01M ATP（3.35μ）およびキナーゼ（５
μ）を加え、この反応液をさらに30分間、37℃に保っ
た。放射活性のATPは、リンカーが標的DNAにライゲート
したかどうかを調べる際の助けとなる。
キナーゼ処理したBcl Iリンカー（約0.25μg:0.5μ
中）を〜0.32kb Acc I−Pvu II制限フラグメントを溶液
に加え、次に、このDNA溶液にT4 DNAリガーゼ（１μ
；〜1000単位）および10Xのリガーゼ緩衝液（１μ
）を加え、得られた反応液を16℃で一晩インキュベー
トした。Bcl IリンカーはAcc I−Pvu II制限フラグメン
トのPvu II末端にだけライゲートすることができた。後
のDNA配列決定により、Acc I−Pvu II制限フラグメント
のPvu II末端には４個のBcl Iリンカーが結合している
ことがわかった。これら余分のBcl IリンカーはBcl I消
化とライゲートによって除くことができるが、これらリ
ンカーは余分のリンカーを含んでいるベクターが適切に
機能するのを妨げないので、余分のBcl Iは除去しなか
った。
大腸菌K12 HB101/pSV2cat細胞をATCCから取得番号ATC
C 37155のもと凍結乾燥形で入手し、テトラサイクリン
の代わりに50μg/mlのアンピシリンを用いること以外は
実質的に実施例1Aの方法に従って、この細胞からプラス
ミドpSV2cat DNAを単離した。このプラスミドpSV2catの
制限部位および機能地図を添付の第1B図に示す。約1mg
のプラスミドpSV2cat DNAを得、これをTE緩衝液（1ml）
に溶解した。プラスミドpSV2cat DNA（約３μg;3μ）
を10XのAcc I緩衝液（２μ）および水（16μ）に加
え、次いでこのpSV2cat DNAの溶液に制限酵素Acc I（３
μ；約９単位）を加え、得られた反応液を37℃で２時
間インキュベートした。次に、このAcc I消化したプラ
スミドpSV2cat DNAを、10XのStu I緩衝液［1.0M NaCl;1
00mM トリス−HCl、pH＝8.0;100mM MgCl2;60mM DTT;お
よび1mg/ml BSA］（３μ）、水（５μ）、および制
限酵素Stu I（約２μ；約10単位）を加えることによ
り制限酵素Stu Iで消化した。得られた反応液を37℃で
２時間インキュベートした。この反応混合物をフェノー
ルで１回、次いでクロロホルムで２回抽出することによ
って反応を停止させた。約0.5μｇの目的フラグメント
が得られ、これをTE緩衝液（20μ）に溶解した。
Acc I−Stu I消化したプラスミドpSV2catDNA（約４μ
）をAd2の0.32kb Acc I−Pvu II（Bcl Iリンカーが結
合している）制限フラグメント（約７μ）と混合し、
10Xのリガーゼ緩衝液（３μ）、水（15μ）、およ
びT4 DNAリガーゼ（２μ；約100単位）を加えた後、
このライゲート反応液を16℃で一晩インキュベートし
た。ライゲートしたDNAは、クロラムフェニコール ア
セチルトランスフェラーゼ遺伝子を転写させ、従ってこ
れを発現させるように設置されたAd2後期プロモーター
を含有するプラスミドである、目的をプラスミドpLPcat
を構成していた。プラスミドpLPcatの制限部位および機
能地図を添付を第1B図に示す。
このライゲートしたDNAを用い、実質的に実施例2Bの
方法に従って大腸菌12 HB101細胞を形質転換した。形質
転換細胞を50μg/mlアンピシリン含有のＬ寒天プレート
に蒔いた。プラスミドDNAの制限酵素分析により大腸菌K
12 HB101/pL Pcat形質転換体を同定した。選択剤として
テトラサイクリンの代わりにアンピシリンを用いること
以外は実質的に実施例1A記載のプラスミド単離法に従っ
て、後の構築で用いるためのプラスミドpLPcat DNAを形
質転換体から単離した。
D.プラスミドpBLcatの構築 TE緩衝液（50μ）中のプラスミドpBKneo1 DNA（約8
8μｇ）を、10XのAcc I緩衝液（7.5μ）、水（30μ
）、および制限酵素Acc I（15μ；約75単位）に加
え、得られた反応液を37℃で２時間インキュベートし
た。このAcc I消化したプラスミドpBKneo1 DNAをアガロ
ースゲルにかけ、BKエンハンサーを含む〜1.4kbフラグ
メントを他の消化産物から分離した。次いで、この〜1.
4kb Acc I制限フラグメントをゲルから単離し、精製し
た。このフラグメント（約５μｇ）を、10XのPvu II緩
衝液（５μ）、水（45μ）、および制限酵素Pvu II
（５μ；約25単位）に再懸濁し、得られた反応液を37
℃で２時間インキュベートした。次いで、このPvu II消
化したDNAを単離し、精製し、そしてライゲート用に調
製した。約２μｇの所望の〜1.28kb Acc I−Pvu IIフラ
グメントが得られ、これをTE緩衝液（５μ）に溶解し
た。
プラスミドpLPcat DNA（約１μｇ）を10XのAcc I緩衝
液（５μ）および水（40μ）に溶解した。このプラ
スミドpLPcat DNAの溶液に制限酵素Acc I（約５μ；
〜25単位）を加え、得られた反応液を37℃でインキュベ
ートした。このAcc I消化したプラスミドpLPcat DNAを
エタノールで沈澱させ、10XのStu I緩衝液（５μ）、
水（40μ）、および制限酵素Stu I（５μ；約25単
位）に再懸濁し、得られた反応液を37℃で２時間インキ
ュベートした。このAcc I−Stu I消化したプラスミトpL
PcatDNAをエタノールで数回沈澱させ、大きさが約16bp
の制限フラグメントである他の消化産物からAd2後期プ
ロモーターおよび大腸菌の複製起源を含有する〜4.81kb
のAcc I−Stu I制限フラグメントを精製した。目的の〜
4.81kb制限フラグメントが約１μｇ得られ、これをTE緩
衝液（20μ）に溶解した。
プラスミドpLPcatの〜4.81kb Acc I−Stu I制限フラ
グメント（５μ）を、プラスミドpBKneo1の〜1.28kb
Acc I−Pvu II制限フラグメント（５μ）に加えた。
このDNA混合物に10Xのリガーゼ緩衝液（３μ）、水
（15μ）、およびT4 DNAリガーゼ（２μ；約10単
位）を加えた後、得られたライゲート反応液を16℃で一
晩インキュベートした。ライゲートしたDNAは目的のプ
ラスミドpBLcatを構成していた。プラスミドpBLcatの制
限部位および機能地図を添付の第1C図に示す。
ライゲートしたDNAを用い、実質的に実施例2B記載の
方法に従って大腸菌K12 HB101細胞を形質転換した。大
腸菌K12 HB101/pBLcat形質転換体はそのプラスミドDNA
の制限酸素分析によって同定した。後の構築に用いるた
め、選択剤としてテトラサイクリンの代わりにアンピシ
リンを用いること以外は実質的に実施例1Aの方法に従っ
て、プラスミドpBLcat DNAを調製した。
E.プラスミドpL133の構築 プラスミドpL133は、米国特許出願No.06/699,967（19
85年２月８日出願）に記載されているヒトプロテインＣ
発現ベクターである。下記のように、プラスミドpL133
は、出発ベクタープラスミドpSV2gptおよびpHC7（プラ
スミドpHC7の調製は前記実施例1Aに記載）を用いて中間
体ベクタープラスミドpSV2−HPC8を構築し、次いでこれ
をプラスミドpSV2−β−グロビンと組合せて構築するこ
とができる。プラスミドpL133構築のプロトコールを以
下で詳細に説明し、添付の第２図に図示する。
プラスミドpHC7 DNA（50μ；〜50μｇ）を、制限酵
素Ban I（５μ；〜50単位）、10XのBan I反応緩衝液
［1.5M NaCl;60mlM トリス−HCl、pH＝7.9;60mM MgC
l2;および1mg/ml BSA］（10μ）、および水（35μ
）と混合し、消化が完結するまでインキュベートし
た。次いで、このBan I消化したプラスミドpHC7 DNA
を、〜1.25kb Ban I制限フラグメントが他の消化産物か
ら分離するまで、3.5％ポリアクリルアミドゲル（29:
1、アクリルアミド：ビス−アクリルアミド）電気泳動
にかけた。
〜1.25kbのBan I制限フラグメントを含んでいるゲル
の領域をゲルから切り出し、試験管に入れ、小さくつぶ
した。このフラグメントの入った試験管を抽出緩衝液
［500mM NH4OAc、10mM MgOAc、1mM EDTA、１％ SDS、お
よび10mg/mltRNA］（1ml）を加え、この試験管を一晩、
37℃に保った。遠心して残骸をペレット化し、上清を新
しい試験管に移した。残骸を抽出緩衝液（200μ）で
１回洗浄し、洗浄上清を一晩抽出物の最初の上清と合わ
せた。この上清をガラスウールのプラグに通した後、上
清に２容量のエタノールを加え、混合した。得られた溶
液をドライアイス−エタノール浴に〜10分間入れ、次い
で遠心することによりDNAをペレット化した。
この方法により約８μｇの〜1.25kb Ban I制限フラグ
メントが得られた。精製したフラグメントをTE緩衝液
（10μ）に懸濁し、−20℃で保存した。プラスミドpS
V2−HPC8を構築するためには、リンカーを加えることに
よりBan I制限フラグメントを修飾しなければならなか
った。このリンカーの構築に用いるDNAフラグメント
は、Systec 1450A DNA合成機（Systec Inc.,3816 Chand
ler Drive,Minneapolis,MN）、またはABS DNA合成機（A
pplied Biosystems,Inc.,850 Lincoln Centre Drive,Fo
ster City,CA 94404）のどちらかを用いて合成した。当
分野では多数のDNA合成装置が知られており、フラグメ
ントの調製に用いることができる。さらに、実質的にイ
タクラ等（Itakura et al.,1977,Science,198:1056）、
およびクレア等（Crea et al.,1978,Proc.Nat.Acad.Sc
i.USA,75:5765）の方法に従ってフラグメントを普通に
調製することもできる。
１本鎖のリンカーそれぞれ（500pモル）を、T4ポリヌ
クレオチドナーゼ（15単位；〜0.5μ）、10Xのリガー
ゼ緩衝液（２μ）、500μＭのATP（10μ）、および
水（7.5μ）を含む反応緩衝液（20μ）中でキナー
ゼ処理した。このキナーゼ反応液を37℃で30分間インキ
ュベートし、そして100℃で10分間インキュベートする
ことにより反応を停止させた。キナーゼ処理（kinatio
n）を確実にするため、反応液を氷上で冷却し、これに
0.2Mジチオトレイトール（２μ）、5mM ATP（2.5μ
）、およびT4ポリヌクレオチドキナーゼ（15単位）を
加えて混合し、37℃でさらに30分間インキュベートし
た。100℃でさらに10分間インキュベートすることによ
って反応を停止させ、次いで氷上で冷却した。
キナーゼ処理は別々に行ったが、キナーゼ反応後に２
本の１本鎖DNAリンカーをいっしょにして混合した。鎖
をアニーリングするため、キナーゼ反応混合物を、水
（〜150ml）を入れた水浴中、100℃で10分間インキュベ
ートした。このインキュベートの後、水浴の加熱をや
め、室温まで冷却させた。この操作に約３時間を要し
た。次いで、キナーゼ処理したDNAの試験管が入ったま
まの水浴を４℃で一晩インキュベートした。この操作に
より１本鎖がアニーリングした。作成したリンアーは次
の構造を有していた： このリンカーを使用時まで−20℃で保存した。
このリンカー（〜50μ；〜500pモルア、T4DNAリガ
ーゼ（１μ；〜５単位）、10Xのリガーゼ緩衝液（10
μ）、および水（29μ）に、〜1.25kb Ban Iフラグ
メント（〜８μｇ）を加えて混合し、得られたライゲー
ト反応液を４℃で一晩インキュベートした。65℃で10分
間インキュベートすることによってこのライゲート反応
を停止させた。最終濃度0.3MになるまでNaOAcを加え、
２容量のエタノールを加え、ドライアイス−エタノール
浴で冷却し、次いでこの溶液を遠心することによってDN
Aをペレット化した。
このDNAペレットを10XのApa I反応緩衝液［60mM NaC
l;60mMトリス−HCl、pH＝7.4;60mM MgCl2;および60mM2
−メルカプトエタノール］（10μ）、制限酵素Apa I
（５μ；〜50単位）、水（85μ）に溶解し、反応液
を２時間、37℃に保った。次いで、上記のようにして反
応を停止させ、DNAをペレット化した。このDNAペレット
を10XのHind III反応緩衝液（10μ）、制限酵素Hind
III（５μ；〜50単位）、水（85μ）に溶解し、反
応液を２時間、37℃に保った、このHind III消化の後、
反応混合物を3.5％ポリアクリルアミドゲルにかけ、所
望の〜1.23kb Hind III−Apa I制限フラグメントをゲル
から単離し、精製した。約５μｇの目的フラグメントが
得られ、これをTE緩衝液（10μ）に懸濁し、−20℃で
保存した。
プラスミドpHC7 DNA（50μ；〜50μｇ）を、制限酵
素Pst I（５μ；〜50単位）、10XのPat I反応緩衝液
［1.0M NaCl;100mMトリス−HCl、pH＝7.5;100mM MgCl2;
および1mg/ml BSA］（10μ）、および水（35μ）と
混合し、37℃で２時間インキュベートした。次いで、実
質的に上記方法に従い、Pst I消化したプラスミドpHC7
DNAを3.5％ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ、目
的の〜0.88kbフラグメントを精製した。約５μｇの目的
フラグメントが得られ、これをTE緩衝液（10μ）に懸
濁し、−20℃で保存した。
この〜0.88kb Pst Iフラグメント（〜５μｇ）を、自
動DNA合成機で作成した以下のリンカー（〜50μ）に
加え、混合した： このDNA混合物にT4 DNAリガーゼ（約１μ；〜10単
位）、10Xリガーゼ緩衝液（10μ）、および水（29μ
）を加え、得られたライゲート反応液を４℃で一晩イ
ンキュベートした。
このライゲート反応を65℃で10分間インキュベートす
ることにより停止させた。ライゲートしたDNAを沈澱さ
せた後、このDNAペレットを、10XのApa I反応緩衝液（1
0μ）、制限酵素Apa I（５μ；〜50単位）、および
水（85μ）に溶解し、反応液を２時間、37℃に保っ
た。次いで、反応を止め、もう一度DNAをペレット化し
た。このDNAペレットを、10XのBgl II反応緩衝液［1M N
aCl;100mMトリス−HCl、pH＝7.4;100mM MgCl2;100mM2−
メルカプトエタノール；および1mg/ml BSA］（10μ
）、制限酵素Bgl II（５μ；〜50単位）、および水
（85μ）に溶解し、反応液を２時間、37℃に保った。
このBgl II消化の後、実質的に上記方法に従い、反応混
合物を3.5％ポリアクリルアミドゲルにかけ、目的の〜
0.19kb Apa I−Bgl II制限フラグメントを単離した。約
１μｇの目的フラグメントが得られ、これをTE緩衝液
（10μ）に懸濁し、−20℃で保存した。
約10μｇのプラスミドpSV2gpt DNA（ATCC 37145）
を、10XのHind III反応緩衝液（10μ）、制限酵素Hin
d III（５μ；〜50単位）、および水（85μ）に溶
解し、この反応液を２時間、37℃に保った。次に、この
反応混合物を1.25MのNaOAcとし、そして２容量のエタノ
ールを加え、ドライアイス−エタノール浴でインキュベ
ートした後、遠心してDNAをペレット化した。このDNAペ
レットを10XのBgl II緩衝液（10μ）、制限酵素Bgl I
I（５μ；〜50単位）、および水（85μ）に溶解
し、この反応液を２時間、37℃に保った。このBgl II消
化の後、この反応混合物を１％アガロースゲルにかけ、
電気泳動フラグメントを分離した。このゲルを臭化エチ
ジウムで染色し、紫外光のもとで観察し、目的の〜5.1k
b Hind III−Bgl IIフラグメントを含んでいるバンドを
ゲルから切り出し、透析管に入れ、DNAがアガロースか
ら出てしまうまで電気泳動を続けた。この透析管からの
DNA含有緩衝液をフェノールおよびクロロホルムで抽出
し、次いでDNAを沈澱させた。このペレットはプラスミ
ドpSV2gptの所望の〜5.1kb Hind III−Bgl II制限フラ
グメント（〜５μｇ）からなり、これをTE緩衝液（10μ
）に再懸濁した。
〜1.23kb Hind III−Apa I制限フラグメント（２μ
）、〜0.19kb Apa I−Bgl IIフラグメント（３μ
）、および〜5.1kb Hind III−Bgl IIフラグメント
（２μ）を混合し、次いで、10Xのリガーゼ緩衝液（1
0μ）、T4 DNAリガーゼ（１μ；〜500単位）、およ
び水（82μ）とともに16℃で一晩インキュベートし
た。このライゲートしたDNAは目的のプラスミドpSV2−H
PC8を構成していた。このプラスミドの制限部位および
機能地図を添付の第２図に示す。
実質的に、実施例2Bで大腸菌K12 HB101について記載
した方法に従い、大腸菌K12 RR1（NRRL B−15210）細胞
を形質転換に対してコンピテントにした。上記調製のラ
イゲートしたDNAを用いてこの細胞を形質転換し、形質
転換混合物の一部を100μg/mlアンピシリン含有のＬ寒
天プレートに蒔いた。次いで、このプレートを37℃でイ
ンキュベートした。大腸菌K12 RR1/pSV2−HPC8形質転換
体をそのプラスミドDNAの制限酵素分析によって確認し
た。細胞培養中の選択剤としてテトラサイクリンではな
くアンピシリンを用いることを除き、実質的に実施例1A
の方法に従って形質転換体からプラスミドpSV2−HPC8 D
NAを調製した。
プラスミドpSV2−HPC8（50μｇ）を、10XのHind III
反応緩衝液（10μ）、制限酵素Hind III（５μ；〜
50単位）、および水（85μ）に溶解し、この反応液を
37℃で２時間インキュベートした。このHind III消化の
後、DNAを沈澱させ、DNAペレットを10XのSal I反応緩衝
液［1.5M NaCl;60mM トリス−HCl、pH＝7.9;60mM MgCl
2;60mM 2−メルカプトエタノール；および1mg/ml BSA］
（10μ）、制限酵素Sal I（５μ；〜50単位）、お
よび水（85μ）に溶解した。得られたSal I反応混合
物を37℃で２時間インキュベートした。このHind III−
Sal I消化したプラスミドpSV2−HPC8を3.5％ポリアクリ
ルアミドゲルにかけ、所望の〜0.29kb Hind III−Sal I
制限フラグメントが他の反応生成物から分離するまで電
気泳動を行った。目的のフラグメントをゲルから単離し
た。約２μｇのフラグメントが得られ、これをTE緩衝液
（10μ）に懸濁した。
プラスミドpSV2−HPC8（50μｇ）を10XのBgl II反応
緩衝液（10μ）、制限酵素Bgl II（５μ;50単
位）、および水（85μ）に溶解し、この反応液を37℃
で２時間インキュベートした。このBgl II消化の後、DN
Aを沈澱させ、DNAペレットを10XのSal I反応緩衝液（10
μ）、制限酵素Sal I（５μ；〜50単位）、および
水（85μ）に溶解した。得られたSal I反応混合物を3
7℃で２時間インキュベートした。このSal I−Bgl II消
化したプラスミドpSV2−HPC8を3.5％ポリアクリルアミ
ドゲルにかけ、所望の〜1.15kb Sal I−Bgl II制限フラ
グメントが他の反応生成物から分離するまで電気泳動を
行った。〜1.15kbのSal I−Bgl II制限フラグメントを
ゲルから単離した。約８μｇのフラグメントを得、これ
をTE緩衝液（10μ）に懸濁した。
約10μｇのプラスミドpSV2−β−グロビンDNA（NRRL
B−15928）を、10XのHind III反応緩衝液（10μ）、
制限酵素Hind III（５μ；〜50単位）、および水（85
μ）に溶解し、この反応液を２時間、37℃に保った。
次に、この反応混合物を0.25MのNaOAcとし、そして２容
量のエタノールを加え、ドライアイス−エタノール浴で
インキュベートした後、遠心してDNAをペレット化し
た。このHind III消化したプラスミドpSV2−β−グロビ
ンを10XのBgl II緩衝液（10μ）、制限酵素Bgl II
（５μ；〜50単位）、および水（85μ）に溶解し、
この反応液を２時間、37℃に保った。このBgl II消化の
後、この反応混合物を１％アガロースゲルにかけ、電気
泳動でフラグメントを分離した。目的の〜4.2kb Hind I
II−Bgl II制限フラグメントをゲルから単離した。約５
μｇの目的フラグメントが得られ、これをTE緩衝液（10
μ）に再懸濁した。
プラスミドpSV2−HPC8の〜0.29kb Hind III−Sal Iフ
ラグメント（２μ）、プラスミドpSV2−HPC8の〜1.15
kb Sal I−Bgl IIフラグメント（２μ）、およびプラ
スミドpSV2−β−グロビンの〜4.2kb Hind III−Bgl II
フラグメント（２μ）を混合し、T4 DNAリガーゼでラ
イゲートした。ライゲートしたDNAは目的のプラスミドp
L133を構成していた。プラスミドpL133の制限部位およ
び機能地図を添付の第２図に示す。このライゲートした
DNAを用いて大腸菌K12 RR1を形質転換し、目的の大腸菌
K12RR1/pL133形質転換体を、そのアンピシリン耐性の表
現型によって、およびそのプラスミドDNAの制限酵素分
析によって同定した。
F.プラスミドpL133およびpBLcatからのプラスミドpLPC
の構築 約20μｇのプラスミドpBLcat DNAを、10XのHind III
緩衝液（10μ）および水（80μ）に溶解した。制限
酵素Hind III（約10μ；〜100単位）をこのプラスミ
ドpBLcat DNAの溶液に加え、得られた反応液を37℃で２
時間インキュベートした。このHind III消化したプラス
ミドpBLcat DNAをアガロースゲルにかけ、BKエンハンサ
ーとAd2後期プロモーターを含有する〜0.87kbのHind II
I制限フラグメントが他の消化産物から分離するまで電
気泳動を行った。次いで、〜0.87kbフラグメントを単離
し、精製し、ライゲート用に準備した。約２μｇの目的
フラグメントが得られ、これをTE緩衝液（５μ）に溶
解した。
約1.5μｇのプラスミドpL133 DNAを、10XのHind III
緩衝液（２μ）および水（16μ）に溶解した。この
DNA溶液に制限酵素Hind III（約１μ；〜10単位）を
加え、得られた反応液を37℃で２時間インキュベートし
た。次に、DNAをTE緩衝液で100μに希釈し、〜0.06単
位のウシ腸アルカリホスファターゼで処理し、この反応
液を37℃で30分間インキュベートした。この溶液を、1X
のSET［5mM トリス−HCl、pH＝7.8;5mM EDTA;および15
0mM NaCl］、0.3M NaOAc、および0.5％SDSを含むように
調節し、次いで65℃で45分間インキュベートした。次
に、Hind III消化したプラスミドpL133DNAをフェノール
で２回、そしてクロロホルムで１回抽出し、エタノール
で沈澱させ、TE緩衝液（10μ）に再懸濁した。
プラスミドpBLcatの〜0.8kb Hind III制限フラグメン
ト（約５μ）をHind III消化したプラスミドpL133
（1.5μg;10μ）に加え、次いで、このDNA溶液に10X
のリガーゼ緩衝液（２μ）、T4 DNAリガーゼ（１μ
；〜10単位）、および水（２μ）を加え、得られた
反応液を16℃で一晩インキュベートした。ライゲートし
たDAは目的のプラスミドpLPCを構成していた。
実質的に実施例2Bの方法に従い、ライゲートしたDNA
を用いて大腸菌K12 HB101を形質転換した。形質転換細
胞をアンピシリン含有のＬ寒天プレートに蒔き、アンピ
シリン耐性性質転換体のプラスミドDNAを制限酵素分析
によって試験して大腸菌K12 HB101/pLPC形質転換体を同
定した。BKエンハンサーとAd2後期プロモーターをコー
ドしている〜0.87kb Hind III制限フラグメントは、Hin
d III消化したプラスミドpL133に２つの配向のうちのい
ずれかで挿入することができるが、そのうちの１つだけ
がプラスミドpLPCを生成した。プラスミドpLPCの制限部
位および機能地図を添付の第1D図に示す。
実施例３ プラスミドpLAPC−IRSの構築 実質的に、実施例１で説明した、プラスミドpLAPCの
構築の際に用いる部位特異的な突然変異誘発およびその
他の構築プロトコールに従い、プラスミドpLAPC−IRSを
構築した。しかし、プラスミドpLAPC−IRSを構築した。
しかし、プラスミドpLAPC−IRSの構築の際に用いる緩衝
液およびアニーリング条件は、ゾラーおよびスミス（Zo
ller and Smith,1984,DNA 3:479−489）が開示したもの
によった。
プラスミドpLAPC−IRSの構築においては、以下に示す
突然変異誘発オリゴヌクレオチドを用いて、ファージM1
3mp18−HE1（実施例1B参照）を部位特異的な突然変異誘
発にかけた： この部位特異的な突然変異誘発によって得られる突然変
異ファージをM13mp18−HE3と命名した。
プラスミドpLAPC−IRSの最後の構築は、実施例1Cに記
載したプラスミドpLAPCの構築に類似する方法で行っ
た。しかし、プラスミドpLAPCは、プラスミドpLPCから
得た２つの制限フラグメントを用いて構築した。プラス
ミドpLAPC−IRSの構築では、代わりに、これら同一の２
つのフラグメントをプラスミドpLAPCから得た。プラス
ミドpLPCの代わりにフラグメントの供給源としてプラス
ドpLAPCを用いた理由は、プラスミドpLAPC−IRS形質転
換体を同定する際の制限分析を容易にするためである。
プラスミドpLPCとpLAPC−IRSはその大きさが極めて接近
しているので、プラスミドpLAPC−IRSと「親」（プラス
ミドpLPC）を区別するのは困難である。しかし、プラス
ミドpLAPCはプラスミドpLAPC−IRSより小さいので、プ
ラスミドpLAPCから２つのフラグメントを得ることによ
り、目的のプラスミドpLAPC−IRSと親（プラスミドpLAP
C）を容易に区別することができる。即ち、プラスミドp
LAPC−IRSを構築するため、ファージM13mp18−HE3の〜
0.7kb Sst I−Sal I制限フラグメントを、プラスミドpL
APCの〜3.76kb EcoR I−Sal I制限フラグメント、およ
びプラスミドpLAPCの〜2.0kb EcoR I−Sal I制限フラグ
メントにライゲートした。ライゲートしたDNAは目的の
プラスミドpLAPC−IRSを構成しており、これを大腸菌12
RV308に導入した。得られた大腸菌K12 RV308/pLAPC−I
RS形質転換体を用いて、真核細胞の形質転換を用いるた
めの、プラスミドpLAPC−IRS DNAの大スケール調製物を
得た。
実施例４ アデノウィルスで形質転換したヒト胚腎セル
ライン293/pLAPC−IRSおよびアデノウィルスで形質転換
したゴールデンハムスター セルラインAV12/pLAPC−IR
S形質転換体の作成 ヒト胚腎セルライン293は、アメリカン・タイプ・カ
ルチャー・コレクションから、取得番号ATCC CRL 1573
のもとで入手できる。また、アデノウィルスで形質転換
したゴールデンハムスター セルラインAV12は、アメリ
カン・タイプ・カルチャー・コレクションから、取得番
号ATCC CRL 9595のもとで入手できる。以下に記載する
形質転換法は宿主セルラインとして293細胞について言
及するものであるが、この方法は、AV12セルラインを含
むほとんどの真核セルラインに、ならびに本発明の発現
ベクターに一般的に適用可能である。
ATCCから取得番号CRL 1573のもと、10％の熱−不活性
化ウマ血清を含むイーグル（Eagle）の最少必須培地（G
ibco）中に、全面単層の約5.5x106の細胞を含む25mm2フ
ラスコで293細胞を入手した。このフラスコを37℃でイ
ンキュベートし、培地を週２回交換した。培地は、10％
ウシ胎児血清、50μg/mlゲルタマイシン、および10μg/
ml AquaMEPHYTOONRフィトナジオン ビタミンK1（Merck
Sharp and Dohme,Merck and Co.,Inc.,West Point,PA
19486）を追加したDMEM（Gibco）であった。培地を除
き、ハンク（Hank）のバランス塩溶液（Gibco）ですす
ぎ、0.25％トリプシン（0.2g/ EDTAを含む）を１〜２
分間加え、新鮮な培地ですすぎ、アスピレーター処理を
行い、そして継代培養比1:5または1:10で新しいフラス
コに分けることにより、細胞を継代培養した。
形質転換の１日前に、細胞を100mm皿あたり0.7x106細
胞の割合で蒔いた。TE緩衝液に溶解した、滅菌の、エタ
ノール沈澱したプラスミドDNAを用いて、25μg/mlの形
質転換用プラスミドDNA（プラスミドpLAPC−IRSの形質
転換に対しては、通常、以下で説明するように、プラス
ミドpLAPC−IRSおよび選択マーカーを含んでいるプラス
ミドの２種類のプラスミドを用いる）および250mM CaCl
2を含む、2XのDNA−CaCl2溶液を調製した。7.05〜7.15
に調節したpHを有し、280mM NaCl、50mMヘペス（Hepe
s）、および1.5mMリン酸ナトリウムを含む2XのHBSSを調
製した。2XのDNA−CaCl2溶液を等量の滅菌2X HBSSに滴
下した。2XのHBSSを入れた混合管に綿栓付きの1mlの滅
菌プラスチックピペットを挿入し、DNAを加えながら、
気泡を吹き込んだ。撹拌することなく室温で30〜45分
間、カルシウム−リン酸塩−DNA沈澱物を形成させた。
次に、プラスチックピペットで穏やかにピペッティン
グすることによって沈澱を混合し、受容細胞を覆う増殖
培地（10ml）にプレートあたり1mlの沈澱を直接加え
た。37℃で４時間インキュベートした後、培地を新鮮な
培地に代え、選択圧をかける前に細胞をさらに72時間イ
ンキュベートした。プラスミドpLAPC−IRSなどのように
真核細胞で機能する選択マーカーを含んでいないプラス
ミドに対しては、プラスミドの混合物、即ち、選択マー
カーを欠いている本発明の発現ベクターおよび真核細胞
で機能する選択マーカーを含んでいる発現ベクターを形
質転換法に用いる。このような同時形質転換系で用いる
ためには多種のベクターが使え、これらにはプラスミド
pSV2−dhfr（ATCC 37146）、psV2−neo（ATCC 3714
9）、pSV−gpt（ATCC 37145）、およびpSV2−hyg（NRRL
B−18039）が含まれる。プラスミドpSV2−hygは真核宿
主細胞にハイグロマイシンＢ耐性を付与する。この同時
形質転換法は、選択マーカーを持つプラスミドを含んで
いる細胞の選択を可能にする。これらの細胞をさらに試
験して形質転換用プラスミドの両方を含んでいる細胞を
同定する。真核細胞用の選択マーカーを含んでおり、従
って同時形質転換法の使用を必要としない発現ベクター
を本発明が包含していることはもちろんである。
ハイグロマイシン耐性を付与する遺伝子を含んでいる
プラスミドでトランスフェクションされた細胞に対して
は、最終濃度約200μg/mlとなるようにハイグロマイシ
ンＢを増殖培地に加える。次いで、３〜４日毎に培地を
交換しながら、２〜４週間、37℃で細胞をインキュベー
トした。得られたハイグロマイシン耐性のコロニーを、
その特徴を調べるため別々の培養フラスコに移した。プ
ラスミドpSV2−neoはネオマイシン（G418をネオマイシ
ンの代わりに用いることもできる）に対する耐性を付与
し、G418を最終濃度400μg/mlで加えること以外は実質
的にハイグロマイシン耐性細胞の選択方法に従って、ネ
オマイシン耐性コロニーの選択を行った。
ジヒドロ葉酸還元酵素（dhfr）遺伝子あるいはメトト
レキセイト耐性を付与するdhfr遺伝子の誘導体（dhfr−
mtx）を、dhfr−欠損のセルラインに遺伝子あるいはプ
ラスミドを導入するための選択マーカーとして用いるこ
と、ならびに、次にプラスミドのコピー数を増幅するた
めにメトトレキセイトを用いることは、文献において十
分に確立されている。293細胞はdhfr陽性であるので、d
hfr遺伝子を含むプラスミドを含有している293の形質転
換体は、dhfr陽性の表現型（ヒポキサンチンとチミジン
を欠く培地で増殖する能力）に基づいてのみでは選択さ
れない。機能的なdhfr遺伝子を欠き、dhfrを含有するプ
ラスミドで形質転換されるセルラインは、dhfr＋の表現
型に基づいて選択することができる。dhfrを産生する細
胞において選択および増幅マーカーとしてdhfrを用いる
ことは十分に研究されてはいないが、文献中の証拠によ
り、dhfr産生細胞中での遺伝子増幅用に、および選択マ
ーカーとしてdhfrを用いうることが示唆される。本発明
は、発現ベクターに用いる選択マーカーによって限定さ
れるものではない。さらに、メタロチオネイン遺伝子、
アデノシン デアミナーゼ遺伝子、あるいはＰ−糖タン
パク質遺伝子で例示される多遺伝子耐性族の一員などの
増幅マーカーを用いることもできる。
プラスミドpLAPC−IRSとハイグロマイシン耐性を付与
するベクターの混合物で293およびAV12セルラインを形
質転換し、次いでハイグロマイシン耐性の細胞を選択す
ると、多数の形質転換体が得られた（他の形質転換体は
同時形質転換用ベクターとしてプラスミドpSV2−neoを
用い、G418耐性細胞を選択することによって得た）。こ
れら形質転換体を実施例５記載のようにして分析し、ど
のハイグロマイシン耐性の細胞がプラスミドpLAPC−IRS
を含んでいるかを調べた。
実施例５ 組換えタンパク質を分泌する細胞の同定方法 実施例４で得られたハイグロマイシン耐性の形質転換
体を、組織培養皿あたり数百細胞クローンの密度で、10
0mm2組織培養皿で増殖させた。この培地をデカンテーシ
ョンし、細胞をハンクのバランス塩溶液（Gibco）5mlず
つで２回すすいだ。滅菌した0.45％寒天（Sigma Type 4
アガロース；カタログ＃A3643;Sigma Chemical Co.,P.
O.Box 14508,St.Louis,MO 63178）の溶液を、1.8％寒天
（47℃;1ml）をダルベッコの改良イーグル（DME）塩（G
ibco）（37℃;3ml）と混合することによって調製し、こ
の0.45％寒天溶液（2ml）を細胞上に層状に入れた。
ニトロセルロースフィルター（Schleicher and Schue
ll,Ine.,Keene,NH 03431）を煮沸し、次いで２時間オー
トクレーブ処理し、細胞に毒性である浸潤剤を除去し
た。次に、このフィルターを寒天層の上に置き、気泡を
除去した後、このプレートを37℃で１〜３時間インキュ
ベートした。次いで、後に行うコロニーの同定を容易に
するため、皿上のフィルターの最初の方向がわかるよう
に、あらかじめ印をつけておいたこのフィルターを取
り、PBS（50mMトリス−HCl、pH＝7.2および150mM NaC
l）中に入れた。
フィルターの分析の間、皿上の細胞を生きたままに保
つため、1.8％寒天（47℃;2ml）、DME塩（37℃;2ml）、
および20％ウシ胎児血清を含むDME塩（37℃;4ml）から
なる混合物（8ml）を細胞に重ねた。次に、この細胞を3
7℃のインキュベーター内に入れた。
フィルターで行うすべての洗浄および反応は、フィル
ターを振動台の上に置いて行った。始めにこのフィルタ
ーを、５％の乳を含むPBS中、室温でインキュベートす
ることによってブロックした。次に、このフィルターを
PBS中で４回すすいだ（１回のすすぎは５分間）。2.5％
ウシ血清アルブミン中の10μg/mlビオチン化ヤギ抗−ヒ
トプロテインＣポリクローナル抗体を、フィルターを覆
うに十分な量でフィルターに加え、次いでこれを37℃で
１時間インキュベートした。
プロテインＣに対する抗体を調製するために後に使用
するプロテインＣの精製は、キジール［Kisiel,1979,J.
Clin.Invest.67:761］の記載のようにして行うことがで
きる。ポリクローナル抗体は、キャバット［E.A.Kabat,
“Strutural Concepts in Immunology and Immunochemi
stry",Hold,Rhinehart,およびWinston編（1968）］が開
示した方法で調製することができる。また、本検定で用
いるのに適したモノクローナル抗体は、コーラーおよび
ミルシュタイン［Kohler and Milstein,1975,Nature,25
6:495］の記載のようにして、または米国特許No,4,696,
895;EPO Pub.No.205046;ラウレル等［Laurell et al.,1
985,FEBS 191（１）:75］；スズキ等［Suzuki et al.,1
985,J.Biochem.97:127−138］；およびEPO Pub.No.1382
22の記載のようにして調製することができる。本検定で
用いるアビジンＤおよびビオチン化した西洋ワサビペル
オキシダーゼ（HRP）はVectastainTMキット［Vector La
boratories,Inc.,30 Ingold Road,Burlingame,CA 9401
0］で入手することができる。また、ビオチンもVector
Laboratories,Ine.から得られる。
フィルターを４℃のPBSで４回すすいだ。次に、Vecta
stainTM（Vector Laboratories）キット中の製造元の指
示に従って、アビジンＤおよびビオチン化した西洋ワサ
ビペルオキシダーゼを調製し、加えた。HRPとコンジュ
ゲートしたアビジンＤとともに４℃で１時間（タンパク
質が少量分泌されているときには、もっと長いインキュ
ベート時間、例えば一晩を用いることができる）、フィ
ルターをインキュベートし、次いで、このフィルターを
４℃のPBSで４回すすいだ。
フィルターの指示色を発色させるため、氷冷の100％
メタノールに溶解したHRPカラー発色剤（４−クロロ−
１−ナフトール;Sigma）（約30mg）をPBS（50ml）およ
び30％H2O2（30μ）に加えた。この混合物をニトロセ
ルロースフィルターに加え、これを発色するまで室温で
インキュベートした。最大のヒトプロテインＣを分泌し
ているコロニーは、最も早い発色によってだけでなく、
フィルターの一段と暗いスポットによっても示される。
フィルターを発色させた後、もう一度このフィルター
を最初のプレートと並べ、どのコロニーがフィルターの
どのスポットと関係しているかを調べた。次いで、最大
のヒトプロテインＣを分泌しているコロニーを選び、こ
れを活性化ヒトプロテインＣの製造に用いた。
上記の検定が高分泌セルラインを同定する方法の単な
る例示であるにすぎないことは当業者の理解するところ
であろう。この方法において多種の検定法を成功裏に用
いることができる。例えば、ビオチン化したヤギ抗プロ
テインＣ抗体が、ヤギ抗−プロテインＣ抗体（IgG）お
よびビオチン化した抗−ヤギIgG抗体に置き換えられて
いる、２重−抗体反応を用いることができる。この方法
は、あらゆる細胞由来のあらゆる分泌タンパク質につい
て成功裏に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
第1A図は、BKウィルスおよびプラスミドpdBPV−MMTneo
からのプラスミドpBKneo1の構築を示す工程図であり、 第1B図は、アデノウィルス２およびプラスミドpSV2cat
からのプラスミドpLPcatの構築を示す工程図であり、 第1C図は、プラスミドpBKneo1およびプラスミドpLPcat
からのプラスミドpBLcatの構築を示す工程図であり、 第1D図は、プラスミドpBLcatおよびプラスミドpL133か
らのプラスミドpLPCの構築を示す工程図であり、 第２図は、プラスミドpLPCの構築に用いる出発物質であ
るプラスミドpL133の構築を示す工程図である。
フロントページの続き (72)発明者 ブライアン・ウイリアム・グリネル アメリカ合衆国46250 インディアナ、 インディアナポリス、ヘインズ・コート 5038番 (72)発明者 スタンレイ・リチヤード・ジヤスクナ ス・ジュニア アメリカ合衆国46220 インディアナ、 インディアナポリス、ノース・タキシー ド・ストリート 6910番 (56)参考文献 特開 昭64−85084（ＪＰ，Ａ)

Claims (9)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】アミノ末端からカルボキシ末端にかけて、 ａ）γ−カルボキシル化され、分泌されるタンパク質の
    シグナルペプチドおよびプロペプチド； ｂ）ヒトプロテインＣの軽鎖； ｃ）リジン−アルギニン、リジン−リジン、またはアル
    ギニン−アルギニンから選ばれるジペプチド； ｄ）以下の配列： PRPSRKRR、KKRSHLKR、 QTLERRKR、LEGSLQKR、 FYTPKTRR、MLVQGSWQ、 QVLRIRKR、KILNRPKR、 NILARVTR、ARFRRGAR、 DQMNEDKR、QWLMNTKR、 NRDDIAKR、LVKGRGRR、 およびIVEELGRR ［配列中、Ｆはフェニルアラニン、Ｌはロイシン、Ｉは
    イソロイシン、Ｍはメチオニン、Ｖはバリン、Ｓはセリ
    ン、Ｐはプロリン、Ｔはトレオニン、Ａはアラニン、Ｙ
    はチロシン、Ｈはヒスチジン、Ｑはグルタミン、Ｎはア
    スパラギン、Ｋはリジン、Ｄはアスパラギン酸、Ｅはグ
    ルタミン酸、Ｗはトリプトファン、Ｒはアルギニン、そ
    してＧはグリシンである］。 よりなる群から選択される、細胞に随伴するプロテアー
    ゼのための切断配列；および ｅ）活性化されたヒトプロテインＣの重鎖； ［ただし、該切断配列はヒトプロテインＣ酵素前駆体の
    活性化ペプチドではない］ を含んでいるタンパク質の暗号配列を含有するDNA化合
    物。
  2. 【請求項２】シグナルペプチドおよびプロペプチドが形
    成期ヒトプロテインＣのシグナルペプチドおよびプロペ
    プチドである請求項１記載のDNA化合物。
  3. 【請求項３】切断配列がPRPSRKRRである請求項２記載の
    DNA化合物。
  4. 【請求項４】DNAによってコードされているポリペプチ
    ドが次のアミノ酸残基配列で示される請求項３記載のDN
    A化合物： ［配列中、ALAはアラニン、ARGはアルギニン、ASNはア
    スパラギン、ASPはアスパラギン酸、−COOHはカルボキ
    シ末端、CYSはシステイン、GLNはグルタミン、GLUはグ
    ルタミン酸、GLYはグリシン、H2N−はアミノ末端、HIS
    はヒスチジン、ILEはイソロイシン、LEUはロイシン、LY
    Sはリジン、METはメチオニン、PHEはフェニルアラニ
    ン、PROはプロリン、SERはセリン、THRはトレオニン、T
    RPはトリプトファン、TYRはチロシン、そしてVALはバリ
    ンである］。
  5. 【請求項５】請求項１、２、３または４のいずれかに記
    載のDNA化合物を含有する組換えDNA発現ベクター。
  6. 【請求項６】請求項５記載のベクターで形質転換した真
    核宿主細胞。
  7. 【請求項７】（Ａ）以下の（ｉ）および（ii）を含有す
    る組換えDNAベクターで宿主細胞を形質転換し： （ｉ）アミノ末端からカルボキシ末端にかけて、 ａ）γ−カルボキシル化され、分泌されるタンパク質の
    シグナルペプチドおよびプロペプチド； ｂ）ヒトプロテインＣの軽鎖； ｃ）リジン−アルギニン、リジン−リジン、またはアル
    ギニン−アルギニンから選ばれるジペプチド； ｄ）以下の配列： PRPSRKRR、KKRSHLKR、 QTLERRKR、LEGSLQKR、 FYTPKTRR、MLVQGSWQ、 QVLRIRKR、KILNRPKR、 NILARVTR、ARFRRGAR、 DQMNEDKR、QWLMNTKR、 NRDDIAKR、LVKGRGRR、 およびIVEELGRR ［配列中、Ｆはフェニルアラニン、Ｌはロイシン、Ｉは
    イソロイシン、Ｍはメチオニン、Ｖはバリン、Ｓはセリ
    ン、Ｐはプロリン、Ｔはトレオニン、Ａはアラニン、Ｙ
    はチロシン、Ｈはヒスチジン、Ｑはグルタミン、Ｎはア
    スパラギン、Ｋはリジン、Ｄはアスパラギン酸、Ｅはグ
    ルタミン酸、Ｗはトリプトファン、Ｒはアルギニン、そ
    してＧはグリシンである］。 よりなる群から選択される、細胞に随伴するプロテアー
    ゼのための切断配列；および ｅ）活性化されたヒトプロテインＣの重鎖； ［ただし、該切断配列はヒトプロテインＣ酵素前駆体の
    活性化ペプチドではない］ を含んでいるアミノ酸残基配列をコードしているDNA配
    列； （ii）該DNA配列を発現させるように配置したプロモー
    ター； （Ｂ）工程（Ａ）で形質転換した宿主細胞を、該DNA配
    列を発現させる条件下で培養すること、 を特徴とする真核宿主細胞からの分泌時に組換え活性化
    プロテインＣを直接産生させる方法。
  8. 【請求項８】切断配列がPRPSRKRRである請求項７記載の
    方法。
  9. 【請求項９】DNA配列が次のアミノ酸残基配列をコード
    している請求項７記載の方法： ［配列中、ALAはアラニン、ARGはアルギニン、ASNはア
    スパラギン、ASPはアスパラギン酸、−COOHはカルボキ
    シ末端、CYSはシステイン、GLNはグルタミン、GLUはグ
    ルタミン酸、GLYはグリシン、H2N−はアミノ末端、HIS
    はヒスチジン、ILEはイソロイシン、LEUはロイシン、LY
    Sはリジン、METはメチオニン、PHEはフェニルアラニ
    ン、PROはプロリン、SERはセリン、THRはトレオニン、T
    RPはトリプトファン、TYRはチロシン、そしてVALはバリ
    ンである］。
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Families Citing this family (58)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS6437298A (en) * 1987-08-04 1989-02-07 Hiroshi Okamoto Production of c-terminal amidated peptide
JP3045307B2 (ja) * 1989-08-11 2000-05-29 ザイモジェネティクス，インコーポレイティド 活性化プロテインｃを生成するための細胞培養法
WO1991009960A1 (en) * 1989-12-29 1991-07-11 Zymogenetics, Inc. Hybrid protein c
IL97312A (en) * 1990-02-23 1999-01-26 Lilly Co Eli A method of generating a polypeptide in an eukaryotic vector AND recombinant surrogate cell containing an enhanced transcriptional control unit based on the primary late adenovirus coefficient
IL97311A0 (en) * 1990-02-23 1992-05-25 Lilly Co Eli Vectors and compounds for expression of glycosylation mutants of human protein c
US5270178A (en) * 1990-02-23 1993-12-14 Eli Lilly And Company Vectors and compounds for expression of zymogen forms of human protein C
US5326700A (en) * 1990-11-06 1994-07-05 Eli Lilly And Company DNA sequences encoding t-PA derivatives with cleavable sites
JP4236698B2 (ja) * 1990-11-26 2009-03-11 ジェネティックス インスティチュート，リミテッド ライアビリティ カンパニー 宿主細胞でのｐａｃｅの発現およびその使用法
ATE211177T1 (de) * 1991-01-11 2002-01-15 American Nat Red Cross Expression von aktivem menschlichem protein c im milchdrüsengewebe transgener tiere
US5831141A (en) * 1991-01-11 1998-11-03 United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Expression of a heterologous polypeptide in mammary tissue of transgenic non-human mammals using a long whey acidic protein promoter
US5965789A (en) * 1991-01-11 1999-10-12 American Red Cross Engineering protein posttranslational modification by PACE/furin in transgenic non-human mammals
US6262336B1 (en) 1991-01-11 2001-07-17 American Red Cross Expression of a heterologous protein C in mammary tissue of transgenic animals using a long whey acidic protein promoter
MY110664A (en) * 1992-05-21 1999-01-30 Lilly Co Eli Protein c derivatives
US5464934A (en) * 1993-05-14 1995-11-07 Mallinckrodt Medical, Inc. Metal chelates as spacer compounds in biologically active peptides
US5618714A (en) * 1993-12-15 1997-04-08 Eli Lilly And Company Methods for producing protein C
US5698444A (en) * 1993-12-23 1997-12-16 Eli Lilly And Company Serotonin receptor protein and related nucleic acid compounds
US6017697A (en) 1994-11-14 2000-01-25 Eli Lilly And Company Excitatory amino acid receptor protein and related nucleic acid compounds
US5723755A (en) * 1995-05-16 1998-03-03 Francis E. Lefaivre Large scale production of human or animal proteins using plant bioreactors
US5905185A (en) * 1995-11-30 1999-05-18 Ppl Therapeutics Protein C production in non-human transgenic mammals
WO1997020043A1 (en) * 1995-11-30 1997-06-05 Zymogenetics, Inc. Protein c production in transgenic animals
US6630137B1 (en) 1997-04-28 2003-10-07 Eli Lilly And Company Activated protein C formulations
CA2288143C (en) * 1997-04-28 2012-08-21 Eli Lilly And Company Activated protein c formulations
ID23908A (id) * 1997-06-05 2000-05-25 Lilly Co Eli Metode pengobatan dari penyakit trombosis
HUP0001237A3 (en) 1997-10-20 2002-01-28 Lilly Co Eli Methods for treating vascular disorders
US6103524A (en) * 1998-07-30 2000-08-15 Eli Lilly And Company Metabotropic glutamate receptor protein and nucleic acid
US6815533B1 (en) 1998-07-31 2004-11-09 Eli Lilly And Company Cryogranulation of activated protein C
IL142248A0 (en) 1998-10-22 2002-03-10 Lilly Co Eli Methods for treating sepsis
ES2259248T3 (es) 1998-11-13 2006-09-16 Eli Lilly And Company Uso de la proteina c humana para la preparacion de un medicamento para el tratamiento de trombocitopenia inducida por heparina.
ES2195655T3 (es) 1998-11-20 2003-12-01 Lilly Co Eli Procedimiento para tratar fiebre hemorragica virica con proteina c.
BR9915572A (pt) 1998-11-23 2001-08-14 Lilly Co Eli Processo de tratamento de doença de célula falciforme e talassemia
EP1173590A4 (en) * 1999-04-30 2003-01-15 Ortho Mcneil Pharm Inc ZYMOGEN ACTIVATION SYSTEM
US6998122B1 (en) 1999-04-30 2006-02-14 Eli Lilly And Company Protein C derivatives
US6420157B1 (en) * 1999-04-30 2002-07-16 Ortho-Mcneil Pharmaceutical, Inc. Zymogen activation system
CA2391651A1 (en) * 1999-11-19 2001-05-25 Eli Lilly And Company Protein c derivatives
AU2001232736A1 (en) 2000-02-02 2001-08-14 Eli Lilly And Company Protein c derivatives
EP1263943A1 (en) 2000-02-11 2002-12-11 Eli Lilly & Company Protein c derivatives
US7204981B2 (en) * 2000-03-28 2007-04-17 Eli Lilly And Company Methods of treating diseases with activated protein C
AU2001262939A1 (en) 2000-05-24 2001-12-03 Eli Lilly And Company Formulations and use of activated protein c and protein c zymogen for treating hypercoagulable states
US6933367B2 (en) * 2000-10-18 2005-08-23 Maxygen Aps Protein C or activated protein C-like molecules
MXPA03003388A (es) * 2000-10-18 2005-03-07 Maxygen Aps Moleculas de proteina c o similares a las de proteina c activadas.
US20040198652A1 (en) * 2001-04-24 2004-10-07 Carter J. Paul Methods and compositions for preventing and treating septic shock and endotoxemia
AU2002327649A1 (en) 2001-09-19 2003-04-01 Mcmaster University Treatment of sepsis with tafi
US20030073636A1 (en) * 2001-09-19 2003-04-17 Oklahoma Medical Research Foundation Method of treating diabetes
FR2831170B1 (fr) 2001-10-19 2004-03-19 Inst Nat Sante Rech Med Proteines c modifiees activables directement par la thrombine
EP1485121A4 (en) * 2002-03-08 2007-11-07 Lilly Co Eli ACTIVE C PROTEIN FORMULATIONS
US20070142272A1 (en) * 2003-01-24 2007-06-21 Zlokovic Berislav V Neuroprotective activity of activated protein c independent of its anticoagulant activity
JP2008507561A (ja) * 2004-07-23 2008-03-13 ザ ユニバーシティ オブ ロチェスター 活性化プロテインｃによる、脳内のプラスミノゲン活性化因子の不都合な作用の阻害
JP2009502118A (ja) * 2005-05-24 2009-01-29 アベスタゲン リミテッド 敗血症治療のための組み換え活性化ヒトタンパク質ｃを生成する方法
AU2006261555A1 (en) * 2005-06-23 2006-12-28 The University Of British Columbia Coagulation factor lll polymorphisms associated with prediction of subject outcome and response to therapy
AU2006260599A1 (en) * 2005-06-24 2006-12-28 Drugrecure Aps Airway administration of tissue factor pathway inhibitor in inflammatory conditons affecting the respiratory tract
CA2654761A1 (en) * 2006-06-09 2007-12-13 The University Of British Columbia Interferon gamma polymorphisms as indicators of subject outcome in critically ill subjects
WO2009089620A1 (en) * 2008-01-15 2009-07-23 The Universityof British Columbia Protein c rs2069915 as a response predictor to survival and administration of activated protein c or protein c-like compound
EP2199387A1 (en) 2008-12-19 2010-06-23 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Serine protease derivatives and uses for the prevention and/or the treatment of blood coagulation disorders
CA2747065A1 (en) 2008-12-19 2010-06-24 Inserm (Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale) Serine protease derivatives and uses in the prevention or the treatment of blood coagulation disorders
RU2469093C2 (ru) * 2008-12-19 2012-12-10 Общество с ограниченной ответственностью "Лаборатория медицинской биотехнологии" (ООО "ЛМБТ") ЭКСПРЕССИОННАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pCID-PROC, КОДИРУЮЩАЯ ПРОТЕИН С ЧЕЛОВЕКА, И КЛЕТОЧНАЯ ЛИНИЯ DG-CID-PROC-1, ПРОДУЦИРУЮЩАЯ РЕКОМБИНАНТНЫЙ ПРОТЕИН С ЧЕЛОВЕКА
WO2012068519A2 (en) 2010-11-19 2012-05-24 Sirius Genomics Inc. Markers associated with response to activated protein c administration, and uses thereof
EP3811777B1 (en) * 2019-10-27 2024-07-31 Shanghai RAAS Blood Products Co., Ltd. Genetically modified non-human animals humanised for protein c
WO2023171719A1 (ja) * 2022-03-08 2023-09-14 学校法人自治医科大学 活性化プロテインｃ配列

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4769326A (en) * 1980-02-29 1988-09-06 The Regents Of The University Of California Expression linkers
US4603105A (en) * 1982-05-27 1986-07-29 Kaplan Donald A Efficient screening methods for low probability variants
GB8327860D0 (en) * 1983-10-18 1983-11-16 Fujisawa Pharmaceutical Co Monoclonal antiprotein c antibody
US4617265A (en) * 1984-09-19 1986-10-14 Board Of Regents, University Of Texas System Colony blot assay for enterotoxigenic bacteria
US4775624A (en) * 1985-02-08 1988-10-04 Eli Lilly And Company Vectors and compounds for expression of human protein C
US4959318A (en) * 1985-06-27 1990-09-25 Zymogenetics, Inc. Expression of protein C
CA1341228C (en) * 1985-06-27 2001-05-15 Mark J. Murray Expression of protein c
GB8728837D0 (en) * 1987-12-10 1988-01-27 Eaton Corp Semi-automatic mechanical transmission control and control and control method
ZA889497B (en) * 1987-12-28 1990-08-29 Lilly Co Eli Vectors and compounds for expression of zymogen forms of human protein c

Also Published As

Publication number Publication date
AU2650988A (en) 1989-06-08
EP0319312B1 (en) 1993-11-03
IE61627B1 (en) 1994-11-16
CA1339938C (en) 1998-07-07
US4992373A (en) 1991-02-12
EP0319312A3 (en) 1990-09-19
NZ227177A (en) 1990-07-26
MX166847B (es) 1993-02-09
KR890010199A (ko) 1989-08-07
ES2059538T3 (es) 1994-11-16
PT89135A (pt) 1989-12-29
IL88559A0 (en) 1989-07-31
DE3885419D1 (de) 1993-12-09
KR970009081B1 (en) 1997-06-05
AU610301B2 (en) 1991-05-16
CN1035527A (zh) 1989-09-13
ZA889033B (en) 1990-08-29
HU209587B (en) 1994-08-29
DK672788A (da) 1989-07-28
ATE96840T1 (de) 1993-11-15
RU1830081C (ru) 1993-07-23
DK672788D0 (da) 1988-12-02
PT89135B (pt) 1994-04-29
IE883612L (en) 1989-06-04
EP0319312A2 (en) 1989-06-07
JPH022372A (ja) 1990-01-08
AR245217A1 (es) 1993-12-30
DE3885419T2 (de) 1994-03-31
IL88559A (en) 1994-02-27
HUT50497A (en) 1990-02-28

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