JP3039685B2 - 穀粉軟塊の特性を改良する方法、穀粉軟塊を改良する組成物、および改良された食品 - Google Patents

穀粉軟塊の特性を改良する方法、穀粉軟塊を改良する組成物、および改良された食品

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Description

【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明は、改良された流動学的特性を有する穀粉軟塊
食料、および、改良された性質を特徴とする穀粉食品に
関し、また、成分として軟塊に添加されたとき軟塊およ
びそれから製造された完成食品に改良された性質を付与
することができる、マルトースを酸化する酸化還元酵素
を含む組成物、ならびに、改良された軟塊および穀粉食
品を調製する方法を提供する。
技術的背景および従来技術 本発明は、特に、流動学的特性が改良された穀粉軟塊
（flour doughs）を提供する方法、ならびに、改良され
た生地、食用に適した品質、および形状特性を有する、
該穀粉軟塊から製造される焼いた、または乾燥させた完
成食品に関する。
ここで、軟塊の「強度」または「弱さ」は、焼固な
ど、軟塊から穀粉完成品を製造する際の重要な局面であ
る。軟塊の「強度」又は「弱さ」は、主に、その蛋白質
含量によって決定され、特に、これに関して、グルテン
蛋白質の含量および性質が重要な要因である。蛋白質含
量の低い穀粉は、一般的に「弱い」と特徴づけられる。
したがって、水と弱力粉とを混合することにより形成さ
れる、粘性、伸展性、弾力のある塊りは、通常、力を加
えるとよく伸展するが、力を抜いても元の形状に復帰し
ない。
高い蛋白質含量を有する穀粉は、一般的に「強力」粉
として特徴づけられ、このような穀粉と水を混合するこ
とにより形成される塊りは、弱力粉からできる塊りより
も延びにくく、混合するとき力をかけても、弱力粉から
作られた穀粉塊の場合のように大きく形を変えることな
く元に戻る。軟塊の優れた流動性と取り扱い性、およ
び、強力粉軟塊から製造される、焼くか、または乾燥さ
せた完成食品の優れた形状と生地特性から、焼く場合に
はたいてい、強力粉が一般的に好まれる。
強力粉から作られる軟塊の方が、一般的に安定的であ
る。軟塊の安定性は、穀粉軟塊の最も重要な特徴の一つ
である。米国穀物化学者協会（American Association o
f Cereal Chemists）（AACC）法36−01Aによれば、「安
定性」という語は、「陽性の反応が得られる軟塊時間の
範囲、および、その経過時間にわたって、それ自身の重
量によって平らにならないよう丸い形状を保つという特
性」と定義されている。同じ法によれば、「反応」とい
う語は、「通常、対照との比較において、それを焼くこ
とによって決定される、既知の特定の刺激、基質、また
は条件に対する軟塊の反応」と定義されている。
製パン、および製粉産業においては、軟塊を強化する
ために、軟塊「調節剤」を用いることが知られている。
このような軟塊調節剤は、通常は、例えば、ヨウ素酸
塩、過酸化物、アスコルビン酸、Ｋ−臭素酸塩、または
アゾジカルボンアミド（azodicarbonamide）などの非特
異的な酸化剤であり、伸縮性を改良して、望ましい強度
および安定性を有する軟塊を作り出すために、穀粉の焼
固性を向上させる目的で軟塊に添加される。この酸化剤
の効果の背景となる機作は、穀粉蛋白質、特にグルテン
がチオール基を含んでおり、それが酸化されるとジスル
フィド結合を形成することによって、蛋白質がより安定
な基質を形成し、よりよい軟塊品質ならびに焼固製品の
容量および芯構造の改良をもたらすことである。
さらに、アスコルビン酸／アスコルビン酸塩は、その
酸化能による上記の軟塊調節剤としての有用性に加え
て、EP 0 682 116 Alで開示されている酸化還元酵素で
あるアスコルビン酸オキシダーゼに対する基質として作
用する可能性がある。基質の存在下で、この酵素は、ア
スコルビン酸／アスコルビン酸塩をデヒドロアスコルビ
ン酸およびH2O2に変換する。この従来技術は、アスコル
ビン酸／アスコルビン酸塩の存在下で、アスコルビン酸
オキシダーゼが軟塊調節効果を有することを示唆してい
ないが、おそらくそうなると考えられる。
しかし、現在利用可能な酸化剤のいくつかの使用に対
しては、消費者からの反対があり、また、規制団体によ
っても許可されていないため、これらの従来の穀粉およ
び軟塊添加物の代替物を見出そうとする試みがなされて
おり、これらがまだ見つからないときに、従来技術によ
って、この目的のためにグルコースオキシダーゼを使用
することが提案されていた。
そして、US 2,783,150が、軟塊の強度および質感、な
らびに焼いたパンの外観を改良するために、グルコース
オキシダーゼを穀粉へ添加することを開示している。
CA 2,012,723は、キシラナーゼおよびグルコースオキ
シダーゼなどのセルロース分解酵素を含む、パンを改良
するための組成物を開示している。後者の酵素は、セル
ロース分解酵素のある不都合な効果（軟塊の強度および
粘性を低減させる）を抑制するために添加される。ま
た、十分なグルコースオキシダーゼ活性を得るために
は、グルコースを軟塊に添加する必要があることも開示
している。
JP−Ａ−92−084848は、グルコースオキシダーゼおよ
びリパーゼを含む、パン改良組成物の使用を提案してい
る。
EP−B1−321 811は、軟塊の流動学的性質を改良する
ために、スルフヒドリルオキシダーゼおよびグルコース
オキシダーゼを含む酵素組成物を使用することを開示し
ている。この従来技術書類においては、グルコースオキ
シダーゼだけを使用しても成功しなかったことが述べら
れている。
EP−B1−338 452は、セルラーゼ／ヘミセルラーゼ、
グルコースオキシダーゼ、および、選択的にはスルフヒ
ドリルオキシダーゼの混合物を含む、軟塊の安定性を改
良するための酵素組成物を開示している。
しかし、軟塊改良用添加剤としてグルコースオキシダ
ーゼを使用することには、この酵素が、軟塊系において
有効であるためには、基質として十分量のグルコースが
存在することが必要であるのに、一般的に、穀類の粉の
中のグルコース含量は低いという限界があった。このた
め、軟塊の中にグルコースが存在しない、または、その
含量が低いということが、軟塊改良剤としてのグルコー
スオキシダーゼの有効性に対する制限因子となると考え
られる。
これに対し、穀物粉には、一般的に、グルコース含量
よりもマルトース含量の方が有意に高いため、調製した
ばかりの軟塊には、通常、グルコースよりもマルトース
の方が多く含まれている。このため、小麦粉の懸濁液か
ら採った上清、および小麦粉から調製された軟塊で、さ
らに水、酵母、塩、およびスクロースを含むものの中の
糖含量を（下記の実施例2.3で説明されているようにし
て）解析する実験において、以下のような値（穀粉につ
いて計算された重量％）が明らかとなった。
さらに、酵母は主にグルコースを利用するため、マル
トース含量は酵母で膨らませた軟塊においても相対的に
高いままであり、また、例えば、本来穀粉の中に存在す
るかまたは軟塊に添加された、例えば、β−アミラーゼ
などのデンプン分解酵素の活性を利用した加工の過程に
おいて、さらに増加する。
従来技術では、パンの軟塊の流動学的特質、およびそ
れに対応する焼固製品の品質に対するグルコースオキシ
ダーゼの有用な改良効果が認められていた一方で、この
酵素の使用には、いくつかの短所があることも認められ
ていた。つまり、十分な効果を得るためには、基質とし
て、軟塊にスクロースまたはグルコースを添加すること
が必要であるため、グルコースオキシダーゼを、他の酵
素を添加しないで用いると、望ましい軟塊またはパンの
改良効果が定常的には提供されない。
しかし、マルトースを酸化できる酸化還元酵素を、単
独の軟塊調節剤として添加すると、すなわち、添加され
る酵素の基質、またはその他の酵素を同時に穀粉軟塊に
添加することなく添加すると、軟塊を引き延ばしたとき
に、変形に対する抵抗性が増す結果になる。すなわち、
この酵素自体が、軟塊の強度を増強し機械的な変形を受
けにくくすることが今では明らかになっている。この、
ヘキソースオキシダーゼの軟塊への添加の効果は、酵素
によって生成されたH2O2と、それによって酸化されるチ
オール基とが軟塊の中で反応するきに生じる架橋が、小
麦のグルテンの中の、硫黄含有アミノ酸のチオール基の
間で形成される結果であると考えられている。
ヘキソースオキシダーゼ（Ｄ−ヘキソース:O2酸化還
元酵素、EC 1.1.3.5）は、酸素の存在下で、Ｄ−グルコ
ース、ならびに、マルトース、グルコース、ラクトー
ス、ガラクトース、キシロース、アラビノース、および
セロビオースなど、他のいくつかの還元糖を、対応する
アクトンへと酸化し、さらに、それぞれのアルドビオン
酸（aldobionic acids）へと加水分解する酵素である。
したがって、ヘキソースオキシダーゼは、より広い範囲
の糖基質を利用できる点で、Ｄ−グルコースだけを転化
できるグルコースオキシダーゼとは異なっている。酵素
によって触媒される酸化は、以下のように図示すること
ができる。
Ｄ−グルコース＋O2−−−→δ−Ｄ−グルコノラクト
ン＋H2O2、または Ｄ−ガラクトース＋O2−−−→γ−Ｄ−ガラクトガラ
クトン＋H2O2 イリドフィカスア・フラシダム（Iridophycus flacci
dum）（ビーン（Bean）およびハシッド（Hassid）、195
6、J.Biol.Chem.,218:425−436）、およびコンドラス・
クリスパス（Chondrus crispus）（イカワ（Ikawa）、1
982,Methods Enzymol.,89:145−149）などの、いくつか
の紅藻生物種からヘキソースオキシダーゼ（以下、HOX
とも云う）が単離されている。さらに、藻類種、ユーソ
ラ・クリスタータ（Euthora cristata）（サリバン（Su
llivan）ら、1973、Biochemica et Biophysica Acta,30
9:11−22）が、HOXを産生することが示されている。
この他に、本発明に係るヘキソースオキシダーゼの起
源となりうるものには、微生物種、または陸生植物種が
含まれる。したがって、このような植物源の例として、
ビーン（Bean）ら（Journal of Biological Chemistry
（1961）236:1235〜1240）は、Ｄ−グルコース、Ｄ−ガ
ラクトース、セロビオース、ラクトース、マルトース、
Ｄ−２−デオキシグルコース、Ｄ−マンノース、Ｄ−グ
ルコサミン、およびＤ−キシロースを含む広範囲の糖を
酸化することができる、柑橘類の果実から採った酸化還
元酵素を開示している。ヘキソースオキシダーゼを有す
る別の酵素例は、ドーリング（Dowling）ら（Journal o
f Bacteriology（1956）72:555〜560）によって開示さ
れているマレオマイセス・マレイ（Malleomyces malle
i）の酵素系である。
上記の天然の起源から単離されるヘキソースオキシダ
ーゼを、一定の食品製造業において利用できる可能性が
報告されている。このように、イリドフィカス・フラシ
ウム（Iridophycus flaccium）から単離されたヘキソー
スオキシダーゼは、対応するアルドビオン酸（aldobion
ic acids）の産生とともに、ミルクの中のカツトースを
転化させることができることが示されており、ミルクに
おける酸性化剤として、例えば、この目的のために酸性
化微生物培養液を交換するなど、興味の対象となりうる
ことが示されている（ランド（Rand）、1972,Journal o
f Food Science,37:698−701）。この点に関して、ヘキ
ソースオキシダーゼは、グルコースオキシダーゼよりも
興味深い酵素であると指摘されてきた。なぜなら、この
グルコースオキシダーゼは、グルコースを含んでいない
か低含量のグルコースしか含んでいないミルクまたはそ
の他の食品では、グルコース、またはラクトースをグル
コースおよびガラクトースに転化するラクトース分解酵
素のラクターゼが添加された場合にしか、酵素的に有効
となりえないためである。
また、JP−Ｂ−73/016612に開示されているように、
チーズ、バター、および果汁を含む一定の食品の貯蔵安
定性を改良するために、ヘキソースオキシダーゼの過酸
化水素を生成する能力などの酸化還元酵素の能力も利用
されてきた。酸化還元酵素は、また、食品におけるの抗
酸化剤として有用となりうることが示唆されている。
しかし、本発明により、パン製品だけでなく、麺、お
よび食用ペーストのように、穀粉軟塊から作られる他の
製品を含む穀粉軟塊製品においても、ヘキソースオキシ
ダーゼが、軟塊調節剤として非常に有用であることが示
された。
発明の概要 したがって、第一の局面において、本発明は、軟塊成
分、軟塊添加剤、または軟塊に、例えばヘキソースオキ
シダーゼなど、少なくともマルトースを酸化することが
できる酸化還元酵素を効果的な用量添加することを含
む、穀粉軟塊の流動学的特性、および軟塊から製造され
る完成品の品質を改良する方法に関する。
別の局面において、少なくともマルトースを酸化する
ことができる酸化還元酵素と、さらに少なくとも一つの
軟塊成分または軟塊添加剤を含む、軟塊焼固製品を改良
するための組成物も提供される。
さらに別の局面において、本発明は、少なくともマル
トースを酸化することができる酸化還元酵素を効果的な
量添加することを含む、穀粉軟塊を調製する工程、およ
び軟塊を焼く工程を含む、焼固製品を調製する方法に関
し、また、マルトースを酸化する酸化還元酵素の効果的
な量を軟塊に添加する工程を含む、軟塊に基づく食品を
調製する方法に関する。
発明の詳細な開示 一つの局面において、本方法は、穀粉軟塊の流動学的
特性を改良する方法を提供する。本方法は、上記のよう
に、マルトースを酸化する酸化還元酵素を、軟塊の配合
成分、または、軟塊の構成成分のすべてを混合してでき
た軟塊のいずれかに、効果的な量添加することを含んで
いる。ここで、「効果的な量」とは、軟塊および／また
は完成品に、本発明書において定義されているような改
良された特質を付与するのに十分な量であることを示
す。
本発明に係る方法の有用な態様の一つにおいて、酸化
還元酵素は、ヘキソースオキシダーゼである。ヘキソー
スオキシダーゼは、本明細書において詳細に説明されて
いるように、この酵素を天然に産生する海洋性藻類種か
ら単離することができる。このような生物種は、ギガル
チナリス（Gigartinales）目に属するギガルチナセアエ
（Gigartinaceae）科に見られる。ヘキソースオキシダ
ーゼを産生するギガルチナセアエ（Gigartinaceae）科
に属する藻類種の例は、コンドラス・クリスパス（Chon
drus crispus）およびイリドフィカス・フラシダム（Ir
idophycus flaccidum）である。また、ユーソラ・クリ
スタータ（Euthora cristata）を含むクリプトメニアリ
ス（Cryptomeniales）目の藻類種も、ヘキソースオキシ
ダーゼの起源となりうる。
ヘキソースオキシダーゼに関して、このような天然の
起源を用いる場合、酵素は、典型的には、水性抽出溶媒
を用いた抽出によって、藻類の出発物質から単離され
る。出発物質として、それらが生息する海洋域から採集
された新鮮な状態にある藻類を用いるか、または葉状体
を、例えば、室温で風乾させるか、または、循環式の熱
風、または、凍結乾燥などの適当な工業的な乾燥方法に
よって乾燥させた後、ヘキソースオキシダーゼの抽出に
用いることができる。その後の抽出工程を容易にするた
めに、新鮮な、または乾燥した出発物質を、例えば、挽
くか混合するかして、都合よく粉砕しておくことができ
る。
水性抽出溶媒として、例えば、0.1Mリン酸ナトリウム
緩衝液、20mMトリエタノールアミン緩衝液、または、20
mMトリス塩酸緩衝液などの、５〜８のpHの範囲にある緩
衝溶液が適当である。ヘキソースオキシダーゼは、典型
的には、出発物質を緩衝液に懸濁し、この懸濁液を、例
えば、約５℃など、０〜20℃の範囲にある室温に、好ま
しくは、振とうしながら、１日〜５日間おくことによっ
て藻類材料から抽出される。
そして、懸濁した藻類材料を、濾過、篩過、または遠
心分離などの適当な分離方法によって水性溶媒から分離
した後、この濾液または上清からヘキソースオキシダー
ゼを回収する。選択的には、分離した藻類の材料に対し
て、さらに一つまたは複数の抽出工程が行なわれる。
いくつかの海洋性藻類はフィコシアニンなどの着色色
素を含むため、これらの色素を除去する精製工程を、濾
液または上清に対してさらに行う必要がある。例えば、
色素を溶かすことができる有機溶媒で濾液またな上清を
処理し、その後、溶解した色素を含む溶媒を水性溶媒か
ら分離することにより、色素を除くことができる。また
は、濾液または上清に対して、疎水性相互作用クロマト
グラフィーの工程を行なって、色素を除くこともでき
る。
水性溶媒からの蛋白質の分離を可能にする従来からの
適当な方法によって、水性抽出溶媒からヘキソースオキ
シダーゼを回収する。このような方法は、その実施例
が、以下で詳細に説明されるが、イオン交換クロマトグ
ラフィーなどの蛋白質を単離するための常法を含み、選
択的には、この後、限外濾過のような濃縮工程が行なわ
れる。また、例えば、（NH4）2SO4のような基質、また
は、蛋白質を沈澱させるポリエチレングリコール（PE
G）を添加し、その後、沈殿物を分離し、選択的には、
蛋白質を溶解できる条件において、酵素を回収すること
も可能である。
ヘキソースオキシダーゼの一定の応用にとって、例え
ば、本質的に、他の蛋白質または非蛋白質による混入が
ない調製物のように、酵素を実質的に純粋な状態で提供
することが望ましい。したがって、下記の実施例によっ
て説明もなされているように、上記の抽出および単離工
程から得られた比較的純粋でない酵素調製物をさらにク
ロマトグラフィー工程、ゲル濾過、または等電点クロマ
トグラフィーなどの精製工程に供してもよい。
本発明に係る方法の好ましい態様において、穀粉軟塊
は、穀粉を水、酵母のような発酵剤、または通常の化学
発酵剤、および効果的な量のヘキソースオキシダーゼ
と、軟塊形成条件下で混合することにより調製される。
しかし、さらに別の成分を軟塊混合物に添加すること
も、本発明の範囲内にある。
典型的には、このようなさらに別の軟塊成分には、
塩、砂糖、シロップ、または人工甘味料などの甘味料、
ショートニング、マーガリン、バター、または動物また
は植物性油脂を含む脂肪基質などの通常使用される軟塊
添加成分、ならびに乳化剤、デンプン分解酵素、セルロ
ースまたはヘミセルロース分解酵素、プロテアーゼ、リ
パーゼ、上記したような非特異的酸化剤、香料、培養乳
酸菌、ビタミン、無機物、アルギン酸などの親水コロイ
ド、カラゲニン、ペクチン、例えばグアールガムおよび
イナゴマメガムのような植物性ゴム、および植物繊維質
などの軟塊添加剤が一つまたは複数含まれる。
穀粉軟塊製品を製造するときに用いられる通常の乳化
剤には、例えばモノグリセリド、脂肪酸のモノグリセリ
ドおよびジグリセリドのジアセチル酒石酸エステル、お
よび例えばダイズから得られるレシチンが含まれる。デ
ンプンの分解酵素の中で、アミラーゼは、軟塊改良添加
剤として特に有用である。α−アミラーゼは、デンプン
をデキストランに分解し、デキストランはβ−アミラー
ゼによってさらにマルトースに分解される。軟塊組成物
に添加される、その他の有用なデンプン分解酵素には、
グルコアミラーゼとプルラナーゼが含まれる。これに関
連して、他の重要な酵素は、キシラナーゼ、ならびに、
グルコースオキシダーゼ、ピラノースオキシダーゼ、お
よびスルフヒドリルオキシダーゼのような、その他の酸
化還元酵素である。
好ましい穀粉は小麦粉であるが、イネ、トウモロコ
シ、大麦、ライ麦、およびアズキモロコシなど、その他
の穀物種に由来する穀粉を含む軟塊も本発明に含まれ
る。
軟塊は、穀粉、水、本発明に係る酸化還元酵素、およ
び、その他考えられる成分および添加剤を混合して調製
される。酸化還元酵素は、水、または軟塊成分混合物を
含むいずれかの軟塊成分に混合して添加することもで
き、または、添加剤または添加剤混合物に混合して添加
することもできる。軟塊は、製パン工業、または、その
他、穀粉軟塊をもとにする製品を作る産業において周知
の、通常の軟塊調製法によって調製することができる。
酸化還元酵素は、単独の有効成分としてこの酵素を含む
か、または一つ以上の軟塊成分もしくは添加剤との混合
物の中にこの酵素を含む、液体調製物として、または乾
燥粉末組成物の形状で添加することができる。通常添加
される高酵素成分の量は、穀粉1kgあたり１〜10,000ユ
ニット、好ましくは５〜5000ユニット、例えば10〜1000
ユニットが最終的な軟塊の中に存在するような量であ
る。有用な態様において、その量は穀粉1kgあたり20〜5
00ユニットの範囲内である。ここで、酸化還元酵素１ユ
ニットは、特定の条件において、１分間あたり１μモル
のグルコースの転化が起きる量に相当する。活性は、酵
素調製物1gあたりのユニット数で表される。
軟塊の流動学的特性に対する酸化還元酵素の効果は、
アミログラフ（amylograph）法（ICC 126）、ファリノ
グラク（farinograph）法（AACC 54−21）、およびエク
ステンシグラフ（extensigraph）法（AACC 54−10）な
ど、国際穀物化学会（ICC）、および米国穀物化学会（A
ACC）による標準的な方法によって測定することができ
る。エクステンシグラフ法は、例えば、軟塊が、酵母に
よって放出されたガスを保持する能力と、加工に耐える
能力を測定する。要するに、エクステンシグラフ法は、
軟塊の相対的な強度を測定するのである。強い軟塊は、
弱い軟塊に比べて、高く、また、ある場合には、より長
いエクステンシグラフ曲線を示す。AACC法54−10は、以
下のようにエクステンシグラフを定義している。「エク
ステンシグラフは、試験用軟塊片に関し、それがちぎれ
るまでの負荷−伸展曲線を記録する。負荷−伸展曲線、
またはエクステンシングラムの特徴が、穀粉の一般的な
品質と、その改良剤に対する反応を評価するために用い
られる。」 本発明に係る方法の好ましい態様において、軟塊の伸
展に対する抵抗性は、伸長抵抗性（曲線の高さＢ）と伸
長可能性（曲線の長さＣ）の間の比率、すなわち、AACC
法54−10によって測定されるB/C比から見ると、酸化還
元酵素を含んでいない点以外は同じ軟塊の比率に対し
て、少なくとも10％は増加する。より好ましい態様にお
いて、伸展に対する抵抗性は、少なくとも20％、例え
ば、少なくとも50％、特に、少なくとも100％増加す
る。
本発明に係る方法は、軟塊の流動学的特性、および、
特定のタイプの軟塊から作られる完成品の品質を改良す
る目的で、あらゆる穀粉軟塊に用いることができる。し
たがって、この方法は、食パンおよびロールパンなど、
小麦粉をもとにしたパン製品を含む、イースト発酵させ
た従来の型のパン製品を作るのに非常に適している。し
かし、また、この方法は、例えば、パウンドケーキおよ
びマフィン、またはスコーンを含むケーキ製品などの菓
子パン製品など、化学的な膨張剤の転化によって膨張を
起こさせる軟塊の特性を改良することもできると考えら
れる。
一つの重要な局面において、本発明は、「白麺」およ
び「中華麺」を含む麺製品に用いるための軟塊の流動学
的特性を改良し、完成した麺製品の肌理の質を改良する
ために用いられる。麺を製造するための、典型的な基本
的配合は、以下の成分を含む。小麦粉100に対して、塩
0.5、および水33である。典型的には、麺は、この成分
を適当な混合装置で混合し、その後、麺を糸状にする適
当な製麺機を用いて麺軟塊を繰り出し、さらに風乾して
調製される。
完成した麺の品質は、色、調理したときの品質、およ
び肌理の質によって評価される。麺は、できるだけ速く
調理し、調理後も固いままにしておかなければならず、
好ましくは、調理用の湯の中にいかなる固形物も残らな
いようにしなければならない。配膳するにあたっては、
好ましくは、麺は、粘りを見せることなく、滑らかで固
い表面をもち、固い「歯ごたえ」と良好な食感を提供し
なければならない。さらにまた、麺の色が薄いのも重要
である。
望ましい質感と食質を有する麺を提供するために適当
な小麦粉は、年度および生育地域によってさまざまであ
るため、小麦粉が最適でなかったときには、それを補う
ために麺改良剤を軟塊に添加するのが普通である。典型
的には、このような改良剤には、食物繊維質、植物性蛋
白質、例えば、アルギン酸などの乳化剤および親水コロ
イド、カラゲニン、ペクチン、グアールガムおよびイナ
ゴマメガムなどの植物性ゴム、およびアミラーゼが含ま
れる。
グルコースオキシダーゼを麺改良剤として用いること
が試みられたことがある。しかし、上述したように、小
麦粉のグルコース含量は非常に低いため、この酵素は効
果的ではないだろう。
したがって、本発明に係る酸化還元酵素が、麺の改良
剤として有用であること、選択的には、麺の品質を向上
させるために現在用いられている成分と組み合わせても
有用であることは、本発明の重要な局面である。このよ
うに、上記の方法によって調製された麺は、色、こしが
あり柔軟性があり粘りのない生地などの調理特性および
食質、ならびに堅さに関して、改良された特性を有する
と考えられる。
さらに有用な態様において、本発明に係る方法によっ
て調製された軟塊は、食用ペースト製品を調製するため
の軟塊である。例えば、スパゲッティおよびマカロニを
含むこのような製品は、典型的には、主な成分として小
麦粉と卵とを含む軟塊から調製される。成分を混合した
後、望ましいタイプのペースト製品に軟塊を成形し、風
乾させる。ペースト軟塊への添加は、それの伸展性およ
び安定性にかなりの改良効果を与え、改良された生地お
よび食質を有する完成されたペースト製品を作り出すと
考えられる。
本発明のさらに別の局面において、本発明に係る酸化
還元酵素、および、少なくとも一つのさらに別の軟塊成
分または軟塊添加剤を含む、軟塊改良組成物が提供され
る。
好ましい態様において、酸化還元酵素は、ヘキソース
オキシダーゼである。さらに別の成分または添加剤は、
上述した成分または添加剤の何れでもよい。この組成物
は、都合がよければ、酸化還元酵素を含む液体調製物で
もよい。また、この組成物は、都合がよければ、乾燥し
た組成物の形状である。組成物中の酸化還元酵素活性量
は、さらに別の成分または添加剤の型および量により変
化すると考えられる。しかし、酸化還元酵素活性量は、
好ましくは10〜100,000ユニット、好ましくは100〜50,0
00ユニット、1,000〜10,000ユニット、例えば2,000〜5,
000ユニットの範囲である。
選択的には、この組成物は、特定の完成品を作るため
の、軟塊に対する乾燥成分、および添加剤のすべてを含
む、完全な軟塊添加剤混合物、または前混合物の形状に
あるかも知れない。特別な態様において、組成物は、焼
固節品を調製するのに特に有用な組成物、または、麺製
品または食用ペースト製品を製造するのに有用な組成物
であるかもしれない。
上記のように、本発明は、例えば、へキソースオキシ
ダーゼなどの酸化還元酵素を軟塊に添加することを含
む、焼固製品を調製するための方法を提供する。特に、
この方法は、酸化還元酵素を含まない点以外は同じよう
な軟塊から調製された焼固製品に比べて、特異的な容量
が増加した、上記製品などの焼固製品をもたらす。ここ
で、「特異的な容量」という表現は、製品の容量と重量
の間の比率を示すために用いられている。驚いたこと
に、上記の方法によれば、特異的な容量を増加でき、例
えば、少なくとも10％、好ましくは20％、例えば30％、
好ましくは少なくとも40％、さらに好ましくは少なくと
も50％増加できることが明らかとなった。
上記の方法の有利な態様の一つにおいて、少なくとも
一つの、さらに別の酵素が軟塊に添加される。これの適
当な実施例には、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、キシラ
ナーゼ、デンプン分解酵素、グルコースオキシダーゼ、
リパーゼ、およびプロテアーゼが含まれる。
ここで、以下の実施例により本発明を説明するが、本
実施例は本発明を制限するものではない。
実施例１ 1.1.コンドラス・クリスパス（Chondrus crispus）から
のヘキソースオキシダーゼの精製 後に述べる抽出および精製法を用いて、精製されたヘ
キソースオキシダーゼ調製物を得た。これらの処理過
程、およびその後の精製酵素の特徴解析において、ヘキ
ソースオキシダーゼの活性を測定するために以下のアッ
セイ法を用いた。
1.1.1.ヘキソースオキシダーゼの活性測定 このアッセイ法は、サリバン（Sulliva）およびイカ
ワ（Ikawa）によって説明された方法（Biochimica et B
iophysica Acta,1973,309:11−22）に基づいているが、
微量滴定用プレートの操作に変更を加えた。アッセイ用
混合液には、150μｌのβ−Ｄ−グルコース（0.1Mリン
酸ナトリウム緩衝液、pH6.3中に0.1M）、120μｌの0.1M
リン酸ナトリウム緩衝液、pH6.3、10μｌのｏ−ジアニ
シジン−ジヒドロクロライド（シグマ社、Ｐ−2352、水
溶液中、3.0mg/ml）、10μｌのペルオキシダーゼ（PO
D）（シグマ社、Ｐ−8125、0.1Mリン酸ナトリウム緩衝
液、pH6.3中の0.1ml）、および、10μｌの酵素（HOX）
溶液が含まれていた。酵素溶液の代わりに緩衝液を添加
することによりブランクを作成した。
グルコースを添加することによりインキュベーション
を開始した。25℃で15分間インキュベートしてから、EL
ISA読み取り器で、405nmでの吸光度を測定した。酵素溶
液の代わりに、さまざまな濃度のH2O2を用いて標準曲線
を作成した。
反応は、以下の式で説明される。
1.1.2.抽出 新鮮なコンドラス・クリスパス（Chondrus crispus）
の葉状体を、フランスのブルターニュの沿岸から採集し
た。この新鮮な材料をピン型破砕器（pin mill）（Alpi
ne社）で磨砕した。この結果できた磨砕した葉状体材料
サンプル100gに対して、300mlの0.1Mリン酸ナトリウム
緩衝液、pH6.8を添加した。次に、この混合液を、超音
波槽の中で５分間、超音波処理してから、４日間、５℃
で定常的に回転させ抽出した後、この混合液を47,000×
ｇで20分間遠心分離した。
この結果得られた300mlの透明でピンクの上清を、オ
メガ限外濾過膜（10kD排除、フィルトロン社）を装備し
たアミコン限外濾過ユニットを用いた限外濾過によって
脱塩した。
1.1.3.陰イオン交換工程 1.1.2から得られた保留分を、20mMのトリエタノール
アミン、pH7.3で平衡化した200mlのＱ−セファロースFF
を含む５×10cmのカラムにかけた。このカラムを平衡化
緩衝液で洗滌してから、０から1MのNaClの勾配をつけた
450mlの平衡化緩衝液で、ヘキソースオキシダーゼを溶
出した。カラムは、6ml/分の速度で溶出し、14mlの分画
を収集した。画分９〜17（全量125ml）を集め、オメガ
限外濾過膜（10kD排除、フィルトロン社）を装備したア
ミコン8400ユニットを用いた限外濾過によって、7.5ml
まで濃縮した。
1.1.4.ゲル濾過 上記の7.5mlの保留分を、50mMのリン酸ナトリウム緩
衝液、pH6.4で平衡化した、スーパーデックス200（Supe
rdex 200）の2.6×60cmのゲル濾過カラムにかけ、1ml/
分の流速で溶出した。4mlの分画を集めた。ヘキソース
オキシダーゼ活性を有する画分17〜28（全量50ml）を集
めた。
1.1.5.疎水性相互作用クロマトグラフィー ゲル濾過工程の1.1.4で得られた収集画分に、最終濃
度が2Mになるように、硫酸アンモニウムを添加した。そ
して、この混合液を、20mMリン酸ナトリウム緩衝液、pH
6.3、および2Mの（NH4）2SO4で平衡化した。32mlのフェ
ニルセファロースを含む1.6×16cmのカラムにかけた。
このカラムを、平衡化緩衝液で洗滌し、その後、2Mから
0Mまでの（NH4）2SO4の直線勾配をつけた140mlの20mMの
リン酸ナトリウム緩衝液を用いて、2ml/分の流速でヘキ
ソースオキシダーゼを溶出した。4mlの分画を収集し
て、ヘキソースオキシダーゼ活性を有する画分24〜33を
集めた。
上記のピンク色は、酵素に随伴しているが、この精製
段階でヘキソースオキシダーゼから分離される。
1.1.6.モノＱ陰イオン交換 上記のフェニルセファロース・クロマトグラフィー工
程で得られた上記の収集画分を、上記で説明したよう
に、限外濾過によって脱塩した。この収集画分2mlを、2
0mMのトリエタノールアミン、pH7.3で平衡化したモノQ
HR（Mono Q HR）5/5カラムにかけた。次に、0Mから0.65
MまでのNaClの直線勾配をつけた平衡化緩衝液45mlを用
いて、1.5ml/分の流速でこのカラムを溶出した。1.5ml
の画分を集めて、画分14〜24を集めた。
1.1.7.モノＰ陰イオン交換 上記の工程1.1.6で得られた、ヘキソースオキシダー
ゼを含む収集画分を、20mMのビス−トリス緩衝液、pH6.
5で平衡化したモノP HR（Mono P HR）5/5カラムにかけ
た。0Mから0.65MまでのNaClの直線勾配をつけた平衡化
緩衝液45mlを用いて、1.5ml/分の流速で酵素を溶出し、
0.75mlの分画を集めた。最も高いヘキソースオキシダー
ゼ活性は、画分12で見られた。
1.2.精製ヘキソースオキシダーゼの特徴 上記工程1.1.6および1.1.7から得られた、ヘキソース
オキシダーゼを含む収集画分を、下記の特徴解析実験に
用いた。
1.2.1.分子量の判定 精製された天然のヘキソースオキシダーゼの大きさ
を、50mMのリン酸ナトリウム緩衝液、pH6.4中、0.5ml/
分の流速で、スパロース（Superose）6HR 10/30のカラ
ムを用いたゲル浸透クロマトグラフィーによって判定し
た。フェリチン（440kD）、カタラーゼ（232kD）、アル
ドラーゼ（158kD）、ウシ血清アルブミン（67kD）、お
よびキモトリプシノーゲン（25kD）をサイズ基準として
用いた。精製ヘキソースオキシダーゼの分子量は、120
±10kDであると判定された。
1.2.2.至適pHの決定 pH至適値を決定するためのアッセイ用混合液（最終容
量300μｌ）は、さまざまなpH値のリン酸ナトリウム／
クエン酸緩衝液の0.1M保存液を120μｌ含んでいた。こ
の他のアッセイ用混合液成分はすべて、H2Oに溶解させ
た。pHは、希釈した保存液において、25℃で測定され
た。
ヘキソースオキシダーゼは、pH3〜pH8で酵素活性を示
したが、3.5から5.5の範囲で至適であった。
1.2.3.グルコースおよびマルトースそれぞれに対する、
ヘキソースオキシダーゼのKm値 動力学データは、ｖ＝VmaxS/（Km＋Ｓ）に適合した。
ここで、Vmaxは最大速度、Ｓは基質濃度、また、Kmは最
大速度（ミカエリス定数）の50％を与える濃度である。
適合には、EZ−FIT曲線適合マイクロコンピュータプロ
グラム（ペレラ（Perrella）,F.W.、1988、Analytical
Biochemistry 174:437−447）を用いた。
グルコースおよびマルトースそれぞれの関数として、
酵素活性に関する典型的な双曲線的飽和曲線が得られ
た。グルコースに関するKmは、2.7mM±0.7mMと計算さ
れ、マルトースに関するKmは、43.7mM±5.6mMであるこ
とが明らかとなった。
実施例２ コンドラス・クリスパス（Chondrus crispus）から抽出
されたヘキソースオキシダーゼの軟塊改良効果 2.1.コンドラス・クリスパス（Chondrus crispus）から
のヘキソースオキシダーゼの精製 本実験のために、以下のようにして、ヘキソースオキ
シダーゼを調製した。
新鮮なコンドラス・クリスパス（Chondrus crispus）
の葉状体を、フランスのブルターニュの沿岸から採取し
た。この材料を凍結乾燥してから磨砕した。この磨砕し
た材料40gを、1000mlの20mMトリエタノールアミン（TE
A）緩衝液、pH7.3に懸濁してから、約64時間、ゆっくり
と振とうしながら５℃に置き、次に、2,000×ｇで10分
間遠心分離した。上清を、GF/Aガラスフィルターおよび
GF/Cガラスフィルターで濾過した後、45μｍの孔径の濾
紙で濾過して、調製物1g当たり0.44ユニットのグルコー
スオキシダーゼ活性に当たるヘキソースオキシダーゼ活
性を有する、800mlの濾過調製物を得た。この活性は、
次の方法を用いて測定した。
この上清を、陰イオン交換Ｑセファロース大ビーズ
（Q Sepharose Big Beads）を含む330mlのベッドボリュ
ームのクロマトグラフィー用カラムにかけた（空容量12
0ml）。0Mから0.5MまでのNaClの勾配をつけた20mMのTEA
緩衝液、pH7.3を用いて、180分間にわたって、結合した
蛋白質を溶出した後、20mMのTEA緩衝液中、1M NaClで溶
出し、9mlの分画を集めて、下記の解析処理法を用い
て、ヘキソースオキシダーゼ活性について解析した。
ヘキソースオキシダーゼ活性を有する画分60〜83を集
め（約250ml）、限外濾過によって、約25mlまで濃縮
し、脱塩した。この工程は、100mlの0.05mM TEAを添加
した保留分について２回繰り返された。この結果得られ
た25mlの保留分には、1g当たり0.95ユニットのグルコー
スオキシダーゼ活性が含まれていた。
2.2.グルコースオキシダーゼ活性の決定 定義:1グルコースオキシダーゼ（GOD）ユニットは、特
定の条件下で、１分間あたり１μmoleのグルコースを転
化させる酵素量に相当する。活性は、酵素調製物1g当た
りのユニットで示される。
試薬：（ｉ）緩衝液:20gのNa2HPO4−2H2Oを、900mlの蒸
留水に溶解して、pHを6.5に調整する；（ii）染色試薬
（貯蔵液）:200mgの2,6−ジクロロ−フェノール−イン
ドフェノール、シグマ社商品番号Ｄ−1878を、1000mlの
蒸留水に入れ、１時間激しく振とうして溶解する；（ii
i）ペルオキシダーゼ（貯蔵液）：ベーリンガー・マン
ハイム社、商品番号127 361を10,000ユニット、10mlの
蒸留水に溶解し、4.2gの硫酸アンモニウムを添加する；
（iv）基質：緩衝液中10％w/vのＤ−グルコース溶液；
（ｖ）標準酵素：アマノ（Amano）社からのヒドラー
ゼ、＃1423。
解析原理と方法：グルコースは、グルコン酸とH2O2に転
化され、続いて、H2O2は、ペルオキシダーゼによってH2
OとO2に転化される。精製された酸素が、青色染色試薬
2,6−ジクロロ−フェノール−ドフェノールを酸化し、
それによって、試薬の色が紫に変化する。酸化された色
を、分光光度計によって590nmで測定し、標準に対する
相対値で酵素活性値を計算する。
2.3.小麦粉をもとにした軟塊における、チオール基間の
架橋に対する、ヘキソースオキシダーゼ調製物の効果 1500gの小麦粉、400ブラベンダーユニット（Brabende
r Unit）（BU）の水、90gの酵母、20gのスクロース、お
よび20gの塩から調製され、上記ヘキソースオキシダー
ゼ調製物をそれぞれ、小麦粉1kgあたり０、100、250、8
75、および1250ユニット添加した軟塊の中の、遊離チオ
ール基の含量を測定して、チオール基の架橋形成に対す
るヘキソースオキシダーゼの効果を調べた。測定は、本
質的には、「Cereal Chemistry、1983、70、22−26」で
も説明されている、エルマン（Ellman）の比色法（195
8）によって行われた。この方法は、5.5′−ジチオ−ビ
ス（２−ニトロ安息香酸）（DTNB）が、軟塊中のチオー
ル基と反応して、２−ニトロ−５−メルカプト−安息香
酸の強く着色した陰イオンを形成し、412nmで、分光光
度計的に測定されるという原理に基づいている。
軟塊中のチオール基の量の相対的な変化は、軟塊の中
のチオール基とDTNBの間の相互作用から生じる吸光度
（OD）の変化として反映されると仮定して、以下の結果
を得た。
ヘキソースオキシダーゼ GODユニット/kg穀粉 OD412 0 0.297 100 0.285 250 0.265 875 0.187 1250 0.138 このように、この実験は、ODの有意な減少を示した
が、これは、添加されたヘキソースオキシダーゼ活性の
量に比例する遊離のチオール基含量の減少を示してい
る。
2.4.ヘキソースオキシダーゼの添加による軟塊の流動学
的特性の改良 上記の軟塊に、小麦粉1kg当たり100ユニットのヘキソ
ースオキシダーゼ活性に相当する量のヘキソースオキシ
ダーゼ調製物を添加するか、添加しないかして、AACC法
54−10によるエクステンシグラフ測定を行なった。酵素
を添加しない軟塊を対照として用いた。
上記の方法の原理は、成形後の軟塊を、それぞれ、30
℃で、45、90、135、および180分間寝かせた後に、延ば
されたときの物理的な変形に対する軟塊の抵抗性を示
す、負荷−伸展曲線（エクステンシグラム）を記録する
ことができるエクステンシグラフを用いて、負荷−伸展
試験を行なうというものである。この曲線から、伸展に
対する抵抗性Ｂ（曲線の高さ）および伸展性Ｃ（曲線の
全長）を計算することができる。B/C比（Ｄ）は、小麦
粉軟塊の焼固強度を示す。
本実験の結果を、下の表2.1にまとめた。
この表から、ヘキソースオキシダーゼ（HOX）の添加
には、Ｂ値の増加によって示されているように、軟塊の
伸展に対する抵抗性を改良する効果があることが明らか
である。これは、小麦粉の焼固強度が、ヘキソースオキ
シダーゼの添加によって、有意に上昇していることを明
確に示すものとして、B/C比がほぼ２倍になったことに
反映されている。
同様の実験において、市販のグルコースオキシダーゼ
製品を、小麦粉1kg当たり100ユニット添加し、酵素を添
加しない軟塊を対照に用いて、同じようにして上記のパ
ラメータを測定した。この実験の結果を、下の表2.2に
示す。
上記２つの実験を、対照用軟塊と、ヘキソースオキシ
ダーゼ、またはグルコースオキシダーゼを添加した軟塊
との違いに関して比較してみると、ヘキソースオキシダ
ーゼの方が、グルコースオキシダーゼよりも高い強化効
果を有することが分かる。さらに、B/C比は、グルコー
スオキシダーゼに比べて、ヘキソースオキシダーゼで急
速に増加しており、このことは、焼固強度の促進は、グ
ルコースオキシダーゼよりもヘキソースオキシダーゼに
よって、より効率的に付与されることを明確に示してい
る（図１）。
実施例３ コンドラス・クリスパス（Chondrus crispus）から抽出
されたヘキソースオキシダーゼの軟塊改良効果 この実験のため、新鮮な海藻コンドラス・クリスパス
（Chondrus crispus）の葉状体を、デンマークのHirsho
lmeneの沿岸から採集した。２つの異なる抽出法を用い
てヘキソースオキシダーゼを分離し、下記の軟塊改良実
験のために２つの方法から得た材料をまとめた。
3.1.コンドラス・クリスパス（Chondrus crispus）Ｉか
らのヘキソースオキシダーゼの精製 954gの新鮮な葉状体を蒸留水で濯いで、タオルを乾か
し、液体窒素の中で保存した。この海藻を、ワーリング
ブレンダー（Waring blender）を用いて混合し、1908ml
の0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液、1M NaCl、pH6.8を混合
した海藻に添加した。混合液を、５℃で５日間、定常的
に撹拌して抽出し、その後20,000×ｇで30分間遠心分離
した。
この結果得られた1910mlの上清（351.1U/ml）を、40
℃で、ビューキロータベイパー（Buechi Rotavapor）R1
10の中で、440mlになるまで濃縮した。この濃縮液を、
硫酸アンモニウムで25％まで分画した。この混合液を30
分間撹拌し、47,000×ｇで20分間遠心分離した。上清
（395ml）を20の10mMトリエタノールアミン（TEA）緩
衝液、pH7.3に対して、一晩透析し、最終容量を610mlに
した（367.1U/ml）。
上記の610mlを、20mMのTEA緩衝液、pH7.3で平衡化し
た130mlのＱ−セファロースFFを含む2.6×25cmのカラム
に２回かけた。このカラムを平衡化緩衝液で洗滌してか
ら、０から0.8MのNaClの勾配をつけた800mlの平衡化緩
衝液で、結合蛋白質を溶出した。カラムは、4ml/分で溶
出し、12mlの分画を採集した。ヘキソースオキシダーゼ
活性を含む画文を集めて、最終容量545mlにまとめた（2
41.4U/ml）。
3.2.コンドラス・クリスパス（Chondrus crispus）IIか
らのヘキソースオキシダーゼの精製 1250gの新鮮な葉状体を蒸留水で濯いで、タオルで乾
かし、液体窒素の中で保存した。この海藻を、ワーリン
グブレンダーを用いて混合し、2500mlの0.1Mリン酸ナト
リウム緩衝液、1M NaCl、pH6.8を添加した。５℃で４日
間、継続的に撹拌して抽出し、その後、20,000×ｇで30
分間遠心分離した。
この結果得られた2200mlの上清（332.8U/ml）を、40
℃で、ビューキロータベイパー（Buechi Rotavapor）R1
10を用いて445mlになるまで濃縮した。この結果得られ
た濃縮液を、硫酸アンモニウムで25％まで分画した。こ
の混合液を30分間撹拌して、47,000×ｇで20分間遠心分
離した。沈殿物は捨てた。380mlの上清を、20の10mM
TEA緩衝液、pH7.3に対して、一晩透析し、最終容量を85
0mlにした（319.2U/ml）。
上記の850mlを、20mMのTEA緩衝液、pH7.3で平衡化し
た130mlのＱ−セファロースFFを含む2.6×25cmのカラム
にかけた。このカラムを平衡化緩衝液で洗滌してから、
０から0.8MのNaClの勾配をつけた800mlの平衡化緩衝液
を用いて、結合蛋白質を溶出した。カラムは、4ml/分で
抽出し、12mlの分画を採集した。ヘキソースオキシダー
ゼ活性を含む画分を集めて、最終容量288mlにまとめ
た。
上記の工程で得られた保留分を、50mMのリン酸ナトリ
ウム、1M NaCl、pH7.4で平衡化した、Ni2+入りの金属キ
レート用セファロースFFを185ml含む2.6×31cmのカラム
にかけた。この結合蛋白質を、０から35mMのイミダゾー
ル、pH4.7の勾配をつけた平衡化緩衝液740mlで溶出し
た。カラムは、2ml/分で溶出し、11mlの分画を採集し
た。画分41〜54（140ml、352.3U/ml）を集めた。いくら
かのヘキソースオキシダーゼが、カラムから流出した。
3.3.抽出物の収集および濃縮 流出分、ならびに精製IIからの140ml、および精製Ｉ
からの545mlを集めたところ、採集容量が1120ml（303.6
U/ml）となあった。この1120mlを回転させながら蒸発さ
せて210mlの容量にして、その後、20の10mM TEA緩衝
液、pH7.3に対して、一晩透析し、最終容量を207mlにし
た（1200.4U/ml）。
3.3.1.陰イオン交換工程 上記の工程から得られた保留分を、20mMのトリエタノ
ールアミン、pH7.3で平衡化した130mlのＱ−セファロー
スFFを含む2.6×25cmのカラムにかけた。このカラムを
平衡化緩衝液で洗滌してから、０から0.8MのNaClの勾配
をつけた800mlの平衡化緩衝液で、結合蛋白質を溶出し
た。カラムは、4ml/分の速度で溶出し、12mlの分画を採
集した。ヘキソースオキシダーゼ活性を含む画分30〜50
（260ml、764.1U/ml）を収集してまとめた。
3.3.2.その他の酵素活性 上記で集めた溶液に、カラターゼ、プロテアーゼ、キ
シラナーゼ、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、および
リパーゼの副活性がないかを調べた。この溶液中には、
これらの活性のいずれも見られなかった。
3.4.ヘキソースオキシダーゼの添加による軟塊の流動学
的特徴の改良 小麦粉、水、及び塩から軟塊を調製し、これらに対し
て、上記のヘキソースオキシダーゼ調製物を、小麦粉1k
g当たり、それぞれ、０、72、216、および360ユニット
添加した。酵素を添加していない軟塊を対照として用い
た。さらに、デンマークのノボ・ノルディスクA/S（Nov
o nordisk A/S）から購入可能なグルコースオキシダー
ゼであるグルザイム（Gluzyme）を、小麦粉1kg当たり、
それぞれ216および360ユニット添加した軟塊を２個調製
した。
これらの軟塊について、上記のAACC法54−10の修正法
により、エクステンシグラフ測定を行なった。この実験
の結果を、下の表3.1に要約した。
上記の表により、ヘキソースオキシダーゼ（HOX）ま
たはグルコースオキシダーゼの添加に、Ｂ値の増加によ
って示されるように、伸展に対する軟塊の抵抗性を改良
する効果があったことは明らかである。このことは、酵
素の添加によって、小麦粉の焼固強度が有意に向上した
ことを明確に示すものとしてのB/C比の増加に反映され
ている。
ヘキソースオキシダーゼの方が、グルコースオキシダ
ーゼよりも強化効果が高いことも明らかである。さら
に、グルコースオキシダーゼに較べて、ヘキソースオキ
シダーゼでB/C比が急速に増加しており、このことは、
焼固強度の向上が、グルコースオキシダーゼよりもヘキ
ソースオキシダーゼによってより効率的に付与されるこ
とを明確に示している。
実施例４ コンドラス・クリスパス（Chondrus crispus）から抽出
されたヘキソースオキシダーゼの軟塊改良効果 4.1.コンドラス・クリスパス（Chondrus crispus）から
のヘキソースオキシダーゼの精製 新鮮なコンドラス・クリスパス（Chondrus crispus）
の葉状体を、フランスのブルターニュの沿岸から採集し
た。この新鮮な葉状体2285gを、蒸留水で濯いで、タオ
ルで乾かし、液体窒素の中で保存した。この海藻を、ワ
ーリングブレンダーを用いて混合した後、4570mlの0.1M
リン酸ナトリウム緩衝液、1M NaCl、pH6.8を添加した。
この混合液を、５℃で４日間、継続的にマグネチックス
ターラーで継続的に撹拌して抽出し、その後、20,000×
ｇで30分間遠心分離した。
この結果得られた4930mlの上清（624.4U/ml）を、ビ
ュキロータベイパー（Buechi Rotavapor）R110を用い、
40℃で、1508mlになるまで濃縮した。この結果得られた
濃縮液を、ポリエチレングリコールで３％（w/v）まで
分画した。この混合液を30分間撹拌して、47,000×ｇで
30分間遠心分離した。沈殿物は捨てた。1470mlの上清
（2118.7U/ml）を、24％までPEG分画した。この混合液
を30分間撹拌して、47,000×ｇで30分間遠心分離した。
上清を捨て、414.15gの沈澱を200mlの20mM TEA緩衝液、
pH7.3に懸濁してから、20の10mM TEA緩衝液、pH7.3に
対して、５℃で一晩透析した。
透析後、容量は、650mlになった（2968.6U/ml）。こ
の懸濁液を、20,000×ｇで30分間遠心分離した。この沈
澱は捨てて、上清を、蒸留水で希釈して、3200mlにし
た。
上記の3200ml（829.9U/ml）を、20mMのTEA緩衝液、pH
7.3で平衡化した1100mlのＱ−セファロースFFを含む10
×14cmのカラムにかけた。このカラムを平衡化緩衝液で
洗滌してから、０から0.8MのNaClの勾配をつけた15,000
mlの平衡化緩衝液を用いて、結合蛋白質を溶出した。カ
ラムは、50ml/分で溶出した。ヘキソースオキシダーゼ
が、カラムを通過したので、この840mlを集めた。
この840mlの懸濁液をキーゼルグール（kieselguhr）
で処理して、335ml（2693.3U/ml）まで濃縮した。
上記の335muを、３のセファデックス（Sephadex）G
25C脱塩カラム10×40cmにかけた。このカラムは、20mM
のTEA緩衝液、pH7.3で平衡化して、100ml/分の流速で溶
出し、970mlの溶出液を集めた。この溶出液を、20mMのT
EA緩衝液、pH7.3で平衡化した1100mlのＱ−セファロー
スFFを含む10×14cmのカラムにかけた。このカラムを平
衡化緩衝液で洗滌してから、０から0.8MのNaClの勾配を
つけた15,000mlの平衡化緩衝液を用いて、結合蛋白質を
溶出した。アラムは、50ml/分で溶出した。ヘキソース
オキシダーゼが、カラムを通過したので、この1035mlを
集めた。
上記の溶出液（1035ml）に、最終濃度が2Mになるよう
に、硫酸アンモニウムを添加した。そして、この混合液
を、25mMのリン酸ナトリウム緩衝液、pH6.3、および2M
の（NH4）2SO4で平衡化した、200mlのフェニルセファロ
ースHPを含む５×10cmのカラムに２回通した。このカラ
ムを、平衡化緩衝液で洗滌し、その後、2Mから0Mまでの
（NH4）2SO4の勾配をつけた25mMのリン酸ナトリウム緩
衝液5,000mlを用いて、50ml/分の速度で結合蛋白質を溶
出した。50mlおよび29mlの分画を、それぞれ１回目の操
作と２回目の操作から収集した。ヘキソースオキシダー
ゼ活性を含む、１回目の操作の画分５と２回目の操作の
画分27〜42をまとめて全部で1050ml（563.9U/ml）とし
た。
上記の収集液を、３のセファデックス（Sephadex）
G25Cゲル濾過カラムにかけて脱塩した。このカラムは、
20mMのTEA緩衝液、pH7.3で平衡化して、100ml/分の流速
で溶出し、1,000mlの溶出液を集めた。
この1,000ml溶出液を202ml（2310.2U/ml）に濃縮し、
この調製物を次の流動学試験に用いた。
4.2.ヘキソースオキシダーゼの添加による軟塊の流動学
的特徴の改良 小麦粉、水、および塩から軟塊を調製し、これらに、
小麦粉1kg当たり、それぞれ、０、288、504、および720
酸化還元酵素ユニットの上記ヘキソースオキシダーゼ調
製物を添加した。酵素を添加していない軟塊を対照とし
て用いた。さらに、デンマークのノボ・ノルディスクA/
S（Novo Nordisk A/S）から購入可能なグルコースオキ
シダーゼであるグルザイム（Gluzyme）を、小麦粉1kg当
たり、それぞれ288および504酸化還元酵素ユニット添加
して、２個の軟塊を調製した。
これらの軟塊について、上記のAACC法54−10の修正法
により、エクステンシグラフ測定を行なった。
この実験の結果を、下の表4.1に要約した。
上記の結果より、ヘキソースオキシダーゼ（HOX）ま
たはグルコースオキシダーゼの添加に、Ｂ値の増加によ
って示されるように、伸展に対する軟塊の抵抗性を改良
する効果があったことは明らかである。このことは、B/
C比の増加に反映されている。
ヘキソースオキシダーゼの方が、グルコースオキシダ
ーゼよりも強化効果が高く、両酵素の強化効果は、添加
した酵素の量に比例していることも明らかである。さら
に、グルコースオキシダーゼに較べて、ヘキソースオキ
シダーゼでB/C比が急速に増加しており、このことは、
焼固強度の向上が、グルコースオキシダーゼよりもヘキ
ソースオキシダーゼによってより効率的に付与されるこ
とを明確に示している。
実施例５ コンドラス・クリスパス（Chondrus crispus）から抽出
されたヘキソースオキシダーゼのパンの特異的容量に対
する改良効果 5.1.コンドラス・クリスパス（Chondrus crispus）から
のヘキソースオキシダーゼの精製 新鮮なコンドラス・クリスパス（Chondrus crispus）
の葉状体を、フランスのブルターニュの沿岸から採集し
た。この新鮮な葉状体2191gを蒸留水で濯いで、タオル
で乾かし、液体窒素の中で保存した。この海藻を、ワー
リングブレンダーで混合した後、4382mlの0.1Mリン酸ナ
トリウム緩衝液、および1M NaCl、pH6.8を添加した。こ
の混合液を、５℃で４日間、継続的にマグネチックスタ
ーラーで継続的に撹拌して抽出し、その後、20,000×ｇ
で20分間遠心分離した。
この結果得られた4600mlの上清（746.1U/ml）を、ビ
ュキロータベイパー（Buechi Rotavapor）R110で、40℃
で850mlになるまで濃縮した。この濃縮液（3626.9U/m
l）を、ポリエチレングリコールで３％（w/v）まで分画
した。この混合液を30分間撹拌して、20,000×ｇで30分
間遠心分離した。沈殿物は捨てた。705mlの上清（2489.
8U/ml）を25％までPEG分画した。この混合液を30分間撹
拌して、20,000×ｇで30分間遠心分離した。上清を捨
て、341gの沈澱を225mlの20mM TEA緩衝液、pH7.3に懸濁
した。この懸濁液（500ml）を、３のセファデックス
（Sephadex）G25C脱塩カラム10×40cmにかけて脱塩し
た。カラムは、20mMのTEA緩衝液、pH7.3で平衡化して、
10ml/分の流速で溶出した。1605mlの溶出液を集めた。
上記の溶出液（687.5U/ml）に、採集濃度が2Mになる
ように、硫酸アンモニウムを添加した。そして、この混
合液を、25mMのリン酸ナトリウム緩衝液、pH6.3、およ
び2Mの（NH4）2SO4で平衡化した、200mlのフェニルセフ
ァロースHPを含む５×10cmのカラムに２回通した。この
カラムを、平衡化緩衝液で洗滌し、その後、2Mから0Mま
での（NH4）2SO4の勾配をつけた25mMのリン酸ナトリウ
ム緩衝液中5,000mlを用いて、50ml/分の速度で結合蛋白
質を溶出した。29mlの分画を収集した。ヘキソースオキ
シダーゼ活性を含む、１回目の操作における画分85〜10
5と２回目の操作における画分36〜69をまとめて全部で1
485ml（194.7U/ml）とした。
上記の収集画分を、4.1.で用いたのと同じ、３のセ
ファデックス（Sephadex）G25Cゲル濾過カラムにかけて
脱塩した。このカラムは、20mMのTEA緩衝液、pH7.3で平
衡化して、100ml/分の流速で溶出した。1,200mlの溶出
液を収集した。
この1,200mlの溶出液を、685ml（726.2U/ml）に濃縮
して、焼固実験に用いた。
5.2.ヘキソースオキシダーゼを軟塊に添加することによ
るパンの特異的容量の改良 1500gの穀粉、90gの酵母、24gの塩、24gの砂糖、およ
び400BUの水から軟塊を調製し、これに、穀粉1kgについ
て108ユニットの上記の精製ヘキソースオキシダーゼ、
および、108ユニットのグルザイム（デンマークのNovo
Nordisk A/Sから購入可能なグルコースオキシダーゼ）
をそれぞれ添加した。この軟塊は、ホバート（Hobart）
ミキサーで、２＋９分間、26℃で混合し、２つの部分に
分けた後、30℃で10分間保温装置の中で静置し、フォー
ツナ（Fortuna）3/17/7で成形し、85％RHと34℃で45分
間加工した。このように加工された軟塊を、バゴ（Bag
o）オーブンで、12秒スチーム、220℃で17分間焼いた。
実験の結果は、下の表5.1に示されている。
上の表から、ヘキソースオキシダーゼまたはグルコー
スオキシダーゼの添加に、全容量を増加させる効果があ
り、重量についても、本質的に同じであることが明らか
である。このことは、酵素を添加せずに焼いたパンと比
較したときの特異的な容量の増加に反映されている。
また、ヘキソースオキシダーゼが、同じ用量のグルコ
ースオキシダーゼよりも、特異的用量の増加に有意に大
きな効果を有することも明らかである。
実施例６ 精製ヘキソースオキシダーゼの特徴 上記の精製からの調製物を、ヘキソースオキシダーゼ
の特徴解析に用いた。
6.1.非変性PAGE後のヘキソース活性に対する染色 製造業者の指示（ノベックス（Novex）社、米国、サ
ンディエゴ）に従い、予め成形されている８〜16％のト
リス−グリシンノベックス（Novex）ゲルを用いた非変
性PAGEによって、ヘキソースオキシダーゼ活性を解析し
た。電気泳動後、ウィッテビーン（Witteveen）、C.F.
B.（1993）による学位論文「アスペルギルス・ニゲル
（Aspergillus niger）におけるグルコン酸形成とポリ
オール代謝」で説明されているように、50mMリン酸ナト
リウム緩衝液、pH6.0、100mMグルコース、50mg/フェ
ナジンメトスルフェート（シグマ（sigma）社、P962
5），および50mg/ニトロブルーテトラゾリウム（シグ
マ、N6876）を含む溶液中でゲルをインキュベートし
て、ヘキソースオキシダーゼ活性に関する染色を行なっ
た。約30分後、ヘキソースオキシダーゼ活性は、互いに
非常に近接した２本のバンドとして出現した。ヘキソー
スオキシダーゼの非変性PAGEを銀染色したときにも、同
じ２本のバンドが見られた。精製されたヘキソースオキ
シダーゼの分子量は、非変性PAGEによって144kDと判定
された。ゲルの半分を銀染色し、残りの半分を活性染色
した。標準マーカーとして、ウシ血清アルブミン（67k
D）、乳酸デヒドロゲナーゼ（140kD），カタラーゼ（23
2kD）、フェリチン（440kD）、およびチログロブリン
（669kD）が用いられた。
6.2.SDS−PAGEによる分子量の決定 上記で説明された非変性PAGEを最初に行った材料につ
いて、分子量も決定し、活性染色後、ゲルからヘキソー
スオキシダーゼのバンドを切り出し、次に、エレクトロ
−エルーター（Electro−Eluter）（モデル422、バイオ
ラド（Bio−Rad）社、米国カリフォルニア州）を、製造
業者が推奨するところにしたがって電気溶出した。電気
溶出した蛋白質についてSDS−PAGEおよび銀染色を行な
った。この材料は、SDS−PAGEゲルで、約70kDの「一
つ」の２本バンドを示した。したがって、電気溶出され
たヘキソースオキシダーゼは、２つのサブユニットから
なる２量体である。
6.3.ヘキソースオキシダーゼのpIの決定 製造業者（ノベックス（Novex）社、米国、サンディ
エゴ）の推奨するところに従い、予め成形されている３
〜10IEFゲルを用いた等電点電気泳動（IEF）によって、
ヘキソースオキシダーゼ活性を含むサンプルを解析し
た。電気泳動後、ゲルの半分を銀染色し、残りの半分
は、6.1.で説明されたように、ニトロブルーテトラゾリ
ウムで染色した。
ヘキソースオキシダーゼは、２本のバンドとして染色
された。第一のバンドのpIは、4.79で、第二のバンドの
pIは、4.64であった。標準マーカーとして用いられたの
は、トリプシノーゲン（9.30）、レンズマメレクチンの
塩基性バンド（8.65）、メンズマメレクチンの中間バン
ド（8.45）、レンズマメレクチンの酸性バンド（8.1
5）、ウマ・ミオグロブリン酸性バンド（6.85）、ヒト
・カルボニックアンヒドラーゼＢ（5.85）、β−ラクト
グロブリンＡ（5.20）、ダイズ・トリプシンインヒビタ
ー（4.55）、およびアミログルコシダーゼ（3.50）であ
る。
6.4.異なる糖類に関するヘキソースオキシダーゼのKmの
決定 1.2.3で説明されているように、７種の異なる糖につ
いて、ヘキソースオキシダーゼのKmを決定した。結果
は、下の表6.1に要約されている。
6.5 ヘキソースオキシダーゼのペプチド配列の決定 6.2における電気溶出された混合液からの50μｌを、4
50μｌの0.1％トリフルオロ酢酸（TFA）で懸濁した。
トリス、グリシン、およびSDSを除くために、上記の
混合液を逆相HPLCでクロマトグラフィーにかけた。その
結果得られた溶液を、0.1％TFAで平衡化した、4.6×30c
mのブラウンリー（Brownlee）C2カラムに９回かけた。
このカラムを平衡化緩衝液で洗滌してから、10から80％
のアセトニトリル勾配をつけた14mlの0.1％TFAを用い
て、流速0.7ml/分で結合ペプチドを溶出した。酵素を含
む最大のピークからの画分を集めて、凍結乾燥した。
6.5.1 エンドプロティナーゼLys−Ｃ消化 この結果得られた凍結乾燥酵素を、50μｌの8M尿素、
04M NH4HCO3、pH8.4に溶解させた。５μｌの45mMジチオ
スレイトールを添加し、50℃で15分間、N2雰囲気覆で、
蛋白質の変性と還元を行なった。溶液を室温まで冷却し
て、５μｌの100mMヨードアセトアミドを添加し、N2下
暗所で、15分間、室温でシステインを誘導した。その
後、この溶液を135μｌの水に懸濁し、５μｌの水に溶
解した５μｇのエンドプロテイナーゼLys−Ｃを添加す
ることにより、N2下37℃で、24時間消化を行なった。反
応混合液を−20℃で凍らせて、反応を終結させた。
6.5.2 ペプチドの逆相HPLC分離 溶媒Ａとして、水に溶かした0.1％TFAを用い、溶媒Ｂ
として、アセトニトリルに溶かした0.1％TFAを用いて、
0.46×15cmのVYDAC C18カラム（The Separation Grou
p、米国カリフォルニア州）での逆相HPLCによって、上
の結果得られたペプチドを分離した。
6.5.3 ペプチド配列決定 シークエンシングは、製造業者の指示にしたがい、パ
ルス−リキッドファストサイクル（Pulsed−liquid fas
t cycles）を用いて、アプライドバイオシステムズ476A
シークエンサー（アプライドバイオシステムズ社、米
国、カリフォルニア州）で行なった。下記のアミノ酸配
列を有するペプチドが同定された。
DPGYIVIDVNAGTPDKPDP
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ホストラップ パーナイル バック デンマーク国 アルハス シー ディー ケー−8000 ５．ティーブイ エフ．ベ スターガーズ ゲイド 30 (56)参考文献 特開 平４−84848（ＪＰ，Ａ) 特開 平４−200339（ＪＰ，Ａ) 特開 平６−319431（ＪＰ，Ａ) 特開 平５−207838（ＪＰ，Ａ) 特開 平５−111347（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) A21D 8/04 A23L 1/16 ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (27)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】小麦粉軟塊の流動学的特性、および軟塊か
    ら製造された完成品の品質を改良する方法であって、軟
    塊成分、軟塊添加剤、または軟塊に、少なくともマルト
    ースを酸化することができる酸化還元酵素を有効量添加
    することを含む、方法。
  2. 【請求項２】酸化還元酵素がヘキソースオキシダーゼで
    ある、請求項１記載の方法。
  3. 【請求項３】ヘキソースオキシダーゼが、藻類種、植物
    種、および微生物種から選択された起源に由来するもの
    である、請求項２記載の方法。
  4. 【請求項４】ヘキソースオキシダーゼが、コンドラス・
    クリスパス（Chondrus crispus）に由来するものであ
    る、請求項３記載の方法。
  5. 【請求項５】ヘキソースオキシダーゼが、穀粉1kg当た
    り１から10,000ユニットの範囲の量添加される、請求項
    ２記載の方法。
  6. 【請求項６】ヘキソースオキシダーゼが、穀粉1kg当た
    り10から1,000ユニットの範囲の量添加される、請求項
    ５記載の方法。
  7. 【請求項７】AACC法54−10によって測定される伸展に対
    する抵抗性（曲線の高さ、Ｂ）と伸展性（曲線の長さ、
    Ｃ）との間の比率、すなわちB/C比に関して、伸展に対
    する軟塊の抵抗性が、酸化還元酵素が含まれていない点
    のみが異なる同様の軟塊の抵抗性と較べて、少なくとも
    10％増加する、請求項１または２記載の方法。
  8. 【請求項８】完成品がパンである、請求項１記載の方
    法。
  9. 【請求項９】完成品が麺製品である、請求項１記載の方
    法。
  10. 【請求項１０】完成品が食用ペースト製品である、請求
    項１記載の方法。
  11. 【請求項１１】少なくとも一つのさらに別の酵素が軟塊
    成分、軟塊添加剤、または軟塊に添加される、請求項１
    記載の方法。
  12. 【請求項１２】さらに別の酵素が、セルラーゼ、ヘミセ
    ルラーゼ、キシラナーゼ、デンプン分解酵素、グルコー
    スオキシダーゼ、リパーゼ、およびプロテアーゼからな
    る群より選択される、請求項11記載の方法。
  13. 【請求項１３】少なくともマルトースを酸化することが
    できる酸化還元酵素と、少なくとも一つのさらに別の軟
    塊成分または軟塊添加剤とを含む、軟塊改良用組成物。
  14. 【請求項１４】酸化還元酵素が、藻類種、植物種、およ
    び微生物種から選択される起源に由来するものである、
    請求項13記載の組成物。
  15. 【請求項１５】酸化還元酵素がヘキソースオキシダーゼ
    である、請求項14記載の組成物。
  16. 【請求項１６】ヘキソースオキシダーゼが、コンドラス
    ・クリスパス（Chondrus crispus）に由来するものであ
    る、請求項15記載の組成物。
  17. 【請求項１７】焼固製品を調製するために、または麺製
    品もしくは食用ペースト製品を作成するために有用な、
    予め調製されている混合物である、請求項13記載の組成
    物。
  18. 【請求項１８】乳化剤および親水コロイドからなる群よ
    り選択される添加剤を含む、請求項13記載の組成物。
  19. 【請求項１９】親水コロイドが、アルギン酸、カラゲニ
    ン、ペクチン、および植物性ガムからなる群より選択さ
    れるものである、請求項18記載の組成物。
  20. 【請求項２０】焼固製品を調製する方法であって、少な
    くともマルトースを酸化することができる酸化還元酵素
    が有効量添加された穀粉軟塊を調製すること、および軟
    塊を焼くことを含む方法。
  21. 【請求項２１】酸化還元酵素が含まれていない軟塊から
    調製されたという点のみが異なる同様の焼固製品に比べ
    て、焼固製品の特異的容量が増加する、請求項20記載の
    方法。
  22. 【請求項２２】特異的容量が少なくとも20％増加する、
    請求項21記載の方法。
  23. 【請求項２３】少なくとも一つのさらに別の酵素が軟塊
    に加えられる、請求項20記載の方法。
  24. 【請求項２４】さらに別の酵素が、セルラーゼ、ヘミセ
    ルラーゼ、キシラナーゼ、デンプン分解酵素、グルコー
    スオキシダーゼ、リパーゼ、およびプロテアーゼからな
    る群より選択されるものである、請求項20記載の方法。
  25. 【請求項２５】酸化還元酵素がヘキソースオキシダーゼ
    である、請求項20記載の方法。
  26. 【請求項２６】軟塊にマルトースを酸化する酸化還元酵
    素を有効量添加することを含む、穀粉軟塊をもとにした
    食品を調製する方法。
  27. 【請求項２７】酸化還元酵素がヘキソースオキシダーゼ
    である、請求項26記載の方法。
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