NO316023B1 - Fremgangsmåte for fremstilling av et terapeutisk aktivt antistoff eller etterapeutisk aktivt fragment derav som er selektive for TAG-72 - Google Patents

Description

Denne oppfinnelse vedrører området immunoglobulinproduksjon og modifikasjoner av naturlig forekommende antistoff-aminosyresekvenser Spesifikt vedrører oppfinnelsen en fremgangsmåte for fremstilling av et terapeutisk aktivt antistoff eller et terapeutisk aktivt fragment derav som er selektive for TAG-72

Antistoffer er spesifikke tmmunoglobulin-(lg)-polypeptider produsert av virveldyrimmunsystemet som reaksjon på smitte av fremmede proteiner, glykoproteiner, celler eller andre antigene fremmede stoffer Rekkefølgen av reaksjoner som tillater at organismen overvinner invasjon av fremmede celler eller for systemet å kvitte seg med fremmede stoffer, er i det minste delvis forstått En viktig del av denne prosessen er fremstillingen av antistoffer som binder seg spesifikt til et spesielt fremmed stoff Bindingsspesifisiteten av slike polypeptider til et spesielt antigen er meget raffinert, og hovedmengden av spesifisiteter istand til å dannes av det enkelte virveldyr er bemerkelsesverdig i sin kompleksitet og variabilitet Millioner av antigener er istand til å frembnnge antistoffresponser, idet hvert antistoff nesten utelukkende er rettet mot det spesielle antigen som frembragte det

To hovedkilder av virveldyr-antistoffer blir for øyeblikket anvendt - dannelse in situ av pattedyr B-lymfocyttene, og dannelse i cellekultur av B-cellehybrider Antistoffer dannes in situ som et resultat av differensieringen av umodne B-lymfocytter til plasmaceller, som forekommer som respons på stimulering ved spesifikke antigener I de udifferensierte B-celler blir delene av DNA som koder for de forskjellige områder på immunoglobuhn-kjedene, separert i det genomiske DNA Sekvensene samles sekvensielt før ekspresjon En gjennomgang av denne prosess er blitt gitt av Gough, Trends in Biochem Sei 6,203(1981)

Det resulterende omordnete gen er istand til ekspresjon i den modne B-lymfocytt for å produsere det ønskede antistoff Imidlertid, selv når et spesielt pattedyr blir eksponert for bare ett enkelt antigen, dannes ikke noen uniform populasjon av antistoffer In situ immunreaksjonen overfor et hvilket som helst spesielt antigen er definert ved mosaikken av responser overfor de forskjellige determinanter som er tilstede på antigenet Hvert undersett av homologe antistoffer bidras til av en enkelt populasjon av B-celler - således er in situ dannelse av antistoffer "polyklonal"

Denne begrensede, men iboende heterogenitet er blitt overvunnet i tallrike spesielle tilfeller ved anvendelse av hybndom-teknologi for å danne "monoklonale" antistoffer i cellekulturer ved B-celle hybndomer (Se Kohler og Milstein, C , Nature 256. 495-497(1975)

I denne fremgangsmåte blir splinocyttene eller lymfocyttene som har relativt korte levetider eller er dødelige, fra et pattedyr som er blitt injisert med antigen, sammenføyd med en udødelig tumorcellehnje, som således produserer hybnd-celler eller "hybndomer" som er både udødelige og istand til å produsere det genetisk kodede antistoff i B-cellen De således dannede hybrider blir isolert inn i enkeltvise genetiske stammer ved seleksjon, fortynning og gjenvekst, og hver stamme representerer således en enkelt genetisk linje De produserer derfor antistoffer som er forsikret å være homogene mot et ønsket antigen Disse antistoffer, som overfører sin rene genetiske foreldrearv, kalles "monoklonale"

Monoklonale antistoffer med monospesifisitet har påvirket immumologi sterkt, og deres anvendbarhet er allerede blitt vist på slike vitenskapelige områder som biologi, farmakologi, kjemi og andre Slike monoklonale antistoffer har fått utstrakt anvendelse ikke bare som diagnostiske reagenser [(se for eksempel, Immunology for the 80's, Eds Voller, A , Bartlett, A , og Bidwell, D , MTP Press, Lancaster, (1981), men også terapi (se for eksempel Ritz, J og Schlossman, S F , Blood 59,1-11, (1982)]

Monoklonale antistoffer produsert av hybndomer, mens de er teoretisk effektive som diskutert ovenfor og klart foretrukne i forhold til polyklonale antistoffer på grunn av deres spesifisitet, lider av en viktig ulempe I mange anvendelser er bruken av monoklonale antistoffer produsert i ikke-humane dyr begrenset på alvorlig måte, der hvor de monoklonale antistoffer skal anvendes i mennesker Gjentatte injeksjoner av et "fremmed" antistoff i mennesker, slik som et museantistoff, kan føre til skadelige hypersensitivitets-reaksjoner Et slikt ikke-humant derivert monoklonalt antistoff, forårsaker når det injiseres i mennesker, en anti-ikke-human antistoff (ANHA) reaksjon For en diskusjon av en spesifikk ANHA reaksjon forårsaket av anvendelse av muse-d en verte antistoffer, human-anti-museantistoff (HAMA) reaksjon, se Shawler et al, Journal of Immunology 135, 1530-1535(1985)

Det er antatt at dyreimmunoglobulinet som har humane konstante områder vil danne mindre ANHA reaksjon når de injiseres i mennesker enn dyreimmunoglobulinet som har ikke-humane konstante områder Som således er monoklonale anti-stoffer som har gode bmdingsaffiniteter for selekterte antigener og som har humane konstante områder, tenkt å ha stor potensiell anvendbarhet i immunologisk diagnostikk og terapi for humane pasienter med kreft

Forskjellige forsøk er så langt blitt gjort for å fremstille human-denverte monoklonale antistoffer ved å anvende humane hybndomer For eksempel er human-human-hybridomer [Olsson, L et al, Proe Nati Acad Sei (USA), 77, 5429 (1980)], human-musehybndomer [(Schlom, J , et al (ibid) 77. 6841 (1980)] og flere andre xenogene hybnd-kombinasjoner blitt fremstilt Humane monoklonale antistoffer er også blitt produsert ved transformasjon av lymfocytter ved å anvende Epstein-Barr virus Imidlertid kan slike hybndomer potensielt inneha patogen humane viruser Alternativt er primære antistoff-produserende B-celler blitt immortalisert in vitro ved transformasjon med virus DNA Dessverre er utbytter av monoklonale antistoffer fra humane hybridomcellehnjer relativt lave (Vg/ml i mennesket sammenlignet med 100 //g/ml i musehybndomer), og produksjonsomkostninger er høye

Mens humane immunglobuliner er høyst ønskelige i immunologisk diagnostikk og terapi for humane kreftpasienter, har humane hydbndomteknikker ikke ennå nådd stadiet hvor humane monoklonale antistoffer med påkrevde antigen spesifisiteter lett kan oppnås I tillegg, av åpenbart etiske grunner, kan forskere ikke immunisere humane individer med selekterte toksiske eller på annen måte skadelige antigener for å danne antistoffer mot det spesifikke antigen Dette gir store restnksjoner på immunologisk diagnostikk og terapi av humane pasienter

Produksjon av human-denverte monoklonale antistoffer er sikkert mulig,

men den er fortsatt ineffektiv i lys av dens lave reproduserbarhet og de andre problemer nevnt ovenfor [Se også, Nature 300. 316-317 (1982)] Følgelig er de fleste monoklonale antistoffer dannet fra ikke-humane dyr

Et monoklonalt antistoff som reagerer med høy bindmgsaffinitet overfor humane tumor-antigener, men som ikke gjenkjennes som et fremmed stoff av mennesker, er høyt ønskelig En fremgangsmåte for å overvinne denne vanskelighet er på kunstig måte å danne et antistoff som er veldig likt med et humant antistoff og som ikke gjenkjennes som et fremmed stoff i det humane legemet, dvs et et chimensk eller "humanisert" antistoff

Typisk i chimenske antistoffer etterligner det variable området i både lette og tunge kjeder, de variable områder i antistoffer dannet fra en art av pattedyr, mens de konstante områder er homologe med sekvensene i antistoffer dannet fra mennesker En klar fordel med slike chimenske former er at f eks de variable områder på passende måte kan dannes fra for øyeblikket kjente kilder ved å anvende lett tilgjengelige hybndomer av B-celler fra tkke-humane vertsorganismer i kombinasjon med konstante områder dannet fra f eks humane cellepreparater Mens spesifisiteten av det variable området ikke påvirkes av dets kilde, er det mindre sannsynlig at det konstante området som er humant, utøver noen immunreaksjon fra et humant individ når antistoffene injiseres, enn det konstante området fra en ikke-human kilde ville det

Et kjent humant tumor-antigen er tumor-assosiert glykoprotein (TAG 72) TAG72 er forbundet med overflaten av visse tumor-celler med human opprinnelse, spesifikt LS174T tumor-cellelinjen LS174T [American Type Culture Collection (her ATCC) Nr CL 188] er en variant av LS180 (ATCC nr CL 187) kolon adenocarcinom-Unjen

Karyotypen til LS174T er lik karyotypen til LS 180 med et manglende X-kromosom i en majoritet av cellene Data er blitt presentert som beskrevet i Johnson, V G et alt, Cancer Res 46 850-857 (1986), for å karakterisere TAG72-molekylet som et mucin Denne konklusjonen er basert på følgende observas-joner

(a) TAG72 har høy molekylvekt (>1 x 10<6>) som vist ved dets eksklusjon fra en Sepharose™ CL-4B-kolonne, (b) tettheten av TAG72 bestemt ved likevektssentrifugenng i CsCI var 1,45gm/ml, hvilket indikerte et sterk glykosylert glykoprotein (c) TAG72 viser en forandring i migrering etter neuraminidasespaltingen, hvilket indikerer at det er et tungt sialylert molekyl med rikelig av 0-glykosidbundede ohgosakkarider karakteristiske for muciner, (d) blodgruppeantigener som vanligvis finnes på muciner, finnes på affinitets-renset TAG72, og (e) Kondroitinase ABC-spalting hadde ingen virkning på TAG72, hvilket således viser at TAG72-epitopen ikke uttrykkes på et kondroitmsulfat proteoglykan

Det er blitt utviklet tallrike musemonoklonale antistoffer som har bindmgsspesifisitet for TAG72 Ett av disse monoklonale antistoffer betegnet B72,3, er et mus IgGI, produsert av hybndom B72.3 (ATCC nr HB-8108) B72.3 er et førstegenerasjons monoklonalt antistoff utviklet ved å anvende et humant brystkarsinomekstrakt som immunogen (se Colcher, D et al, Proe Nati Acad Sei (USA) 78, 3199-3203 (1981), og US patenter 4 522 918 og 4 612 282) Som anvendt her, betyr uttrykket "første generasjons monoklonalt antistoff et monoklonalt antistoff produsert ved som immunogen å anvende et råcelle-ekstrakt

Andre monoklonale antistoffer rettet mot TAG72 er betegnet "CC" (colon cancer) CC-monoklonale antistoffer er en familie av annen generasjons musemonoklonale antistoffer Som anvendt her betyr uttrykket "annen generasjons monoklonalt antistoff' et monoklonalt antistoff produsert ved som immunogen å anvende et antigen renset med et første generasjons monoklonalt antistoff CC-monoklonale antistoffer ble fremstilt ved å anvende TAG72 renset med B72.3 En diskusjon av fremgangsmåten for å produsere CC-antistoffene er fremsatt i US patentsøknad nr 7-073 685 (USPA 7-073 685), idet søknaden ble inngitt av Schlom et al 15 juli 1987 og er tilgjengelig for publikum fra the National Technical Information Service På grunn av deres relativt gode bindingsaffiniteter til TAG72, er de følgende CC-antistoffer blitt deponert på ATCC, med krav om begrenset adgang CC49 (ATCC Nr HB 9459), CC83 (ATCC Nr HB 9453), CC46 (ATCC Nr HB 9458), CC92 (ATCC Nr HB 9454), CC30 (ATCC Nr HB 9457), CC11 (ATCC Nr 9455), og CC15 (ATCC Nr HB 9460)

På det kjente fagområdet er det ikke blitt isolert noe humant antistoff som binder seg relativt sterkt til TAG72 Følgelig må egnede antistoffer fremstilles genteknisk

Det er kjent at virkningen av et lg molekyl er avhengig av dets tredimensjonale struktur, som videre er avhengig av dets primære ammosyresekvens Således kan forandring av aminosyresekvensen av et lg påvirke dets aktivitet i motsatt retning Videre kan en forandring i DNA-sekvensen som koder for lg, påvirke evnen til cellen som inneholder DNA-sekvensen, til å uttrykke, sekretere eller samle lg

USPA 7-073 685 besknver at CC-antistoffene kan forandres til sin chimenske form ved å substituere, f eks humane konstante områder (Fc) domener istedet for musekonstante områder ved rekombinant DNA-teknikker kjent på fagområdet Det er trodd at forslag fremsatt i USPA 7-073 685 ikke førte til et faktisk forsøk på å uttrykke noen chimenske lg polypeptid-kjeder, heller ikke til å produsere lg aktivitet, heller ikke til å sekretere og samle lg kjeder til de ønskede chimenske lg'er

Det er derfor ikke i det hele tatt klart fra fagområdet at kjente rekombinant DNA-teknikker rutinemessig vil produsere et chimensk animalt-humant antistoff fra selekterte DNA-kilder som danner funksjonelle chimenske antistoffer som binder seg spesifikt til selekterte humane karcinomer og som reduserer starten av ANHA-bivirkninger når de injiseres til mennesker

Overraskende nok er den foreliggende oppfinnelse istand til å møte mange av disse ovenfor nevnte behov og gir en fremgangsmåte for å fremstille de ønskede antistoffer For eksempel gir den foreliggende oppfinnelse en fremgangsmåte ved fremstilling av et terapeutisk aktivt antistoff, eller et terapeutisk aktivt antistoff-fragment derav, hvor antistoffet eller antistoff-fragmentet er i stand til å selektivt reagere med TAG-72-antigen og er oppnådd fra en av cellelinjene CH44-1 (ATCC HB 9884), CH44-2 (ATCC HB 9880),CH44-4 (ATCC HB 9877), CH88-1 (ATCC HB 9882), CH88-2 (ATCC HB 9881), CH88-3 (ATCC HB 9876), CH88-4 (ATCC HB 9874), CH 84-1 (ATCC HB 9883), CH84-2 (ATCC HB 9879), CH84-3 (ATCC HB 9878), eller CH84-4 (ATCC HB 9875), kjennetegnet ved at en av de nevnte cellelinjene dyrkes i et egnet medium, hvoretter antistoffet eller et antistoff-fragment derav isoleres

Den foreliggende oppfinnelse gir en fremgangsmåte for fremstilling av nye antistoffer til anvendelse i in vivo diagnostiske målinger og radioimmunostyrt kirurgi

Følgelig vedrører denne oppfinnelse fremstilling av et antistoff eller antistoff-fragment som omfatter et variabelt område som har en tung kjede (VH), idet nevnte VH blir kodet for av en DNA-sekvens som er effektiv homolog med Vh<g>tTAG kimlinjegenet (VHaTAG), hvori det variable området binder seg til TAG72 i det minste 25% mer enn det variable området i B72.3 binder seg til TAG72, og bindmgsaffinitetene til antistoffet og B72,3 måles ved den samme teknikk

Det beskrives en DNA-sekvens som koder for i det minste en del av en antistoff-tung kjede, idet nevnte sekvens omfatter et DNA-sekvens segment som er effektivt homologt med VHaTAG kimlmje-genet (VHaTAG), hvor DNA-sekvenssegmentet koder for i det minste en del av et tung-kjede variabelt område (VH)

Videre beskrives en DNA-sekvens som omfatter

(A) et sekvenssegment som koder for en tung kjede, idet nevnte sekvens-segment har

(1) et sekvensundersegment som er effektivt homologt til VHaTAG kimlinjegenet (VHarTAG), hvor DNA-sekvenssegmentet koder for idet minste en del av en Vh, og (2) et sekvensundersegment som koder for i det minste en del av en CH, og (B) et sekvenssegment som koder for en lett kjede, idet nevnte sekvenssegment har (1) et sekvensundersegment som koder for i det minste en del av et animalsk lettkjedevariabelt område (VL), og (2) et sekvensundersegment som koder for i det minste en del av et humant lettkjedekonstant område (Cl),

hvor antistoffet kodet for av DNA-sekvensen, binder seg til TAG72 i det minste 25% mer enn det variable området i B72.3 binder seg til TAG72, og bindingsaffinitetene til antistoffet og B72.3 måles ved samme teknikk

Oppfinnelsen inkluderer videre fremstilling av det foran nevnte antistoff alene eller konjugert til en avbildningsmarkør eller et terapeutisk middel Oppfinnelsen inkluderer også fremstilling av en blanding som omfatter det foran nevnte antistoff i ikke-konjugert eller konjugert form i en farmasøytisk akseptabel, ikke-toksisk, steril bærer

Beskrivelse av tegningene

Figur 1 illustrerer en grunnleggende immunoglobulinstruktur hvor de enzymatiske spaltningsseter er angitt Figur 2 illustrerer nukleotidsekvensene til VHoTAG VH, CC46 VH, CC49 VH, CC83 VH og CC92 VH Figur 3 illustrerer aminosyresekvensene til VHaTAG VH, CC46 VH, CC49 VH. CC83 VH og CC92 VH Figur 4a illustrerer nukleotidsekvensen og figur 4 b illustrerer den tilsvarende ammosyresekvens til CC49 VL Figur 5 illustrerer nukleotidsekvensen og figur 5b illustrerer den tilsvarende ammosyresekvens til CC83 VL Figur 6a illustrerer nukleotidsekvensen og figure 6b illustrerer den tilsvarende ammosyresekvens til CC92 VL

Figur 7 illustrerer nukleotidsekvensen til Hind Ill-Pst

l-fragmentet isolert fra plasmid pGD1

Figur 8 illustrerer plasmidkartet til pBLUESCRIPT SK(-)

Figur 9 illustrerer plasmidkartet til pRL101

Figur 10 illustrerer et restnksjonsenzymkart til CC49

L-kjede genom DNA-innskuddet i pRL101

Figur 11 illustrerer plasmidkartet til pRL200

Figur 12 illustrerer et restnksjonsenzymkart til CC83 L-kjede-genom DNA-innskuddet i pRL200 Figur 13 illustrerer nukleotidsekvensen til Eco Rl-Bam Hl-fragmentet isolert fra plasmid pNP9

Figur 14 illustrerer plasmidkartet til pHH49

Figur 15 illustrerer plasmidkartet til pHS83

Figur 16 viser nukleotidsekvensen til CC49 VH, hvor de understrekede segmenter viser sekvensene som blir dannet ved å anvende oligonuklotid-polymerer på mRNA Figur 17 viser nukleotidsekvensen til CC83 Vh, hvor de understrekede segmenter viser sekvensene som dannes ved å anvende oligonukleotidprimerer på mRNA Figur 18 viser aminosyresekvensen til CC49 VH, hvor de understrekede segmenter viser sekvensene bestemt ved proteinsekvensering Figur 19 viser aminosyresekvensen til CC83 Vh, hvor de understrekede segmenter viser sekvensene bestemt ved proteinsekvensering Figur 20 viser resultatene fra en SDS polyakrylamidgel, med resultatene fra PNGase F-behandling av CC83 antistoff Figur 21 illustrerer restriksjonenzymkartet til human y1, y2, y3 og yA

Figur 22 illustrerer plasmidkartet til pSV2gpt/R/B

Figur 23 illustrerer plasmidkartet til pSV2gpt-y 1-7,8

Figur 24 illustrerer plasmidkartet til pSV2gpt-y 1-2,3

Figur 25 illustrerer plasmidkartet til pSV2gpt-y2

Figur 26 illustrerer plasmidkartet til pSV2gpt-y3

Figur 27 illustrerer plasmidkartet til pSV2gpt-y4

Figur 28 illustrerer plasmidkartet til p49y1-7,8

Figur 29 illustrerer plasmidkartet til p49y1-2,3

Figur 30 illustrerer plasmidkartet til p49-y2

Figur 31 illustrerer plasmidkartet til p49-y3

Figur 32 illustrerer plasmidkaratet til p49-y4

Figur 33 illustrerer plasmidkartet til p83y1-7,8

Figur 34 illustrerer plasmidkartet til p83y 1-2,3

Figur 35 illustrerer plasmidkartet till p83-y2

Figur 36 illustrerer plasmidkartet til p83-y3

Figur 37 illustrerer plasmidkartet til p83-y4

Figur 38 illustrerer hele reaksjonen for den gentekniske fremstilling av hybndgener basert på fremgangsmåten til Horton et al, Gene 77, 61 (1989) Figurer 39A, 39B og 39C viser den biologiske fordeling og tilbakeholdelse av CH44-1 i hele kroppen Figur 40A og 40B viser den biologiske fordeling og tilbakeholdelse av CH-84-1 i hele kroppen

Immunoglobuhnet fremstilt i henhold til denne oppfinnelse er blitt utviklet for å møte problemene med mus-monoklonale antistoffer beskrevet i den tidligere fagkunnskap Det er karakterisert ved at det har en chimensk struktur sammensatt av et tungkjede-variabelt område kodet for av DNA dannet fra VhoTAG

Definispner

Som anvendt her referer "immunoglobulm" til en tetramer eller aggregat av denne enten spesifikk immunoreaktiv aktivitet er en egenskap eller ikke "Antistoffer" refererer til slike samlinger som har signifikant spesifikk immunoreaktiv aktivitet overfor et antigen, som omfatter lette og tunge kjeder, med eller uten kovalent binding mellom seg, "ikke-spesifikt immunoglobulm" ("NSI") betyr de immunoglobuhner som ikke har kjent spesifisitet overfor et antigen

Den grunnleggende immunoglobuhnstrukturelle enhet i virveldyrsystemer er relativt godt forstått [Edelman, G M , Ann N Y Acad Sei, 190, 5 (1971)] Som sett i figur 1, er enhetene sammensatt av to identiske, lette polypeptidkjeder med molekylvekt omtrent 23 000 dalton og to identiske, tunge kjeder med molekylvekt 53 000-70 000 De fire kjeder er forenet ved disulfidbindinger i en "Y" konfigurasjon hvor de lette kjeder er sammenstilt med de tunge kjeder og starter ved åpningen av Y og fortsetter gjennom diversitetsområdet

Tunge kjeder er klassifisert som y, fj, a, 6, eller e, med noen underklasser blant dem Naturen av denne kjede, da den har et langt, konstant område, bestemmer "klassen" av antistoffer for IgA, IgD, IgE, IgG eller IgM

Lette kjeder er klassifisert som enten k (k) eller X (lambda) Hver tungkjedeklasse kan være bundet med enten en k eller X lett kjede Hovedsakelig er de lette og tunge kjeder kovalent bundet til hverandre, og "hale"-delene av de to tunge kjeder er bundet til hverandre ved kovalente disulfidbindinger når immunoglobulinene er dannet enten ved hybndomer eller ved B-celler Imidlertid, hvis ikke-kovalent forbindelse mellom kjedene kan utføres med korrekt geometri, vil samlingen av ikke-disulfidbundede kjeder fortsatt være istand til å reagere med antigen

Aminosyresekvensene løper fra en N-terminus i de gaffel-formete kanter av Y til C-terminus i bunnen av hver kjede I N-terminus er et variabelt område, og i C-terminus er et konstant område

Begrepene "konstant" og "variabel" er anvendt funksjonelt De variable områder i både lette (Vl) og tunge (VH) kjeder bestemmer bindingsgjenkjennelse og spesifisitet overfor antigenet Konstantområdedomenene i lette (Cl) og tunge (Ch) kjeder overfører viktige biologiske egenskaper slik som antistoffkjede-forbindelse, sekresjon, transplasental mobilitet, og komplementbinding

Det variable området er bundet i hver kjede til det konstante området ved en binding som binder sammen i V-gen sekvensen og C-gen sekvensen Bindingen forekommer på genomnivå, og kombinerer nukleotidsekvenser via rekombinasjonsseter Bindings-sekvensen er kjent vanligvis som en "J" sekvens i lett-kjede genet, som koder for omtrent 12 aminosyrer, og som er en kombinasjon av en "D" sekvens og en "J" sekvens i tungkjedegenet, som sammen koder for omtrent 25 aminosyrer

"Chimerisk antistoff" for formål for denne oppfinnelsen refererer til et antistoff som i den tunge kjede har en variabel-område ammosyresekvens kodet for av en nukleotidsekvens dannet fra et musekimlmjegen og en konstant områdeammosyresekvens kodet for av en nukleotidsekvens dannet fra et humant gen

Imidlertid er den foreliggende oppfinnelse ikke ment å være snevert begrenset til bare substitusjon av humane C-gen sekvenser som koder for immunoglobulmkonstante områder for muse-C-gen sekvenser som koder for immunoglobulmkonstante områder Således er den foreliggende oppfinnelse ikke begrenset til hvorvidt fusjonspunktet er i den variable/konstante grense eller ikke

Gjennom forskjellige teknikker er det nå mulig å produsere forandrete chimenske antistoffer, sammensatte chimenske anti-stoffer og fragmenterte chimenske antistoffer kodet for av nukleotidsekvenser beskrevet her

"Sammensatte" immunoglobuliner omfatter polypeptidvariable områder som ikke inntil nå er funnet forbundet med hverandre i naturen Det er ikke vesentlig hvorvidt noen av de ovenfor nevnte er kovalent eller ikke kovalent samlet, så lenge som samlingen er istand til selektivt å reagere med et spesielt antigen eller en antigen familie

"Forandrete antistoffer" betyr antistoffer hvor ammosyresekvensene, spesielt i det variable området, er blitt variert På grunn av rekombinant DNA-teknikkers relevans i denne oppfinnelse, trenger man ikke å være begrenset til ammosyresekvensene for antistoffer valgt fra naturlige kilder, aminosyresekvenser for antistoffene kan omformes til å oppnå ønskede karakteristika De mulige variasjoner er mange og varierer fra forandring av bare en eller noen få aminosyrer til den fullstendige omforming av et antistoff variabelt og/eller konstant område

Forandringer i det variable området vil gjøres for å forbedre de antigen-bindende karakteristika Forandringer i det konstante området vil hovedsakelig gjøres for å forbedre celleprosesskarakteristikaene, slik som komplementfiksenng, interaksjon med membraner og andre effektor-funksjoner Forandringer kan utføres ved standard rekombinant-teknikker og også ved oligonukleotidstyrte mutageneseteknikker [Dalbadie-McFarland, et al Proe Nati Acad Sei (USA) 79, 6409 (1982)]

"Fragmenter" av immunoglobuliner inkluderer segmenter av proteolytisk spaltede eller rekombinant fremstilte deler av et antistoffmolekyl som er istand til selektivt å reagere med et spesielt antigen eller en antigenfamilie Ikke-begrensende eksempler på slike proteolytiske og/eller rekombinante fragmenter inkluderer "Fab", "F(ab')2", og "Fab"', og deres proteolytiske spaltningsseter er vist i Figur 1, så vel som "Fv" og "VH" Med et "Fv" fragment er det ment at deler av lett-kjede variable og tung-kjede variable områder er bundet sammen, hovedsakelig i deres karboksytermmi Rekombinant teknikker for å produsere Fv fragmenter er fremsatt i WO 88/01649, WO 88/06630, WO 88/07085, WO 88/07086 og WO 88/09344 Med et "VH fragment er det ment at det variable området har i det minste en del av et tung-kjede variabelt område som er istand til å anvendes som en antigenbmdende funksjonalitet Fremstillingen og anvendelsen av et lettkjede-variabelt område (VL) som antigenbmdende funksjonalitet er fremsatt i en artikkel med tittel "Development of biologically active peptides based on antibody structure" av Williams et al, Proe Nati Acad Sei (USA) 86, 5537-5541 (1989)

I denne oppfinnelse er "dyr" ment å inkludere storfe, svin, gnagere og primater, inkludert mennesker og andre

"Ekspresjonsvektor" er gitt en funksjonell definisjon av enhver DNA-sekvens som er istand til å utføre ekspresjon av en spesifisert DNA-kode i en egnet vert som inkludert i dette begrep For øyeblikket er slike vektorer ofte i form av plasmider, således blir "plasmid" og "ekspresjonsvektor" ofte anvendt om hverandre Imidlertid er oppfinnelsen ment å inkludere slike andre former for ekspresjonsvektorer som tjener ekvivalente funksjoner og som nå og da blir kjent på fagområdet

Ved "transformasjon" er det ment innføringen av DNA i en mottagerverts-celle som forandrer genotypen og følgelig resulterer i en forandring i mottaker-cellen

"Vertsceller" refererer til celler som er blitt rekombinant transformert med vektorer konstruert ved å anvende rekombinant DNA-teknikker Som definert her, er antistoffet eller modifikasjonen av dette produsert av en vertscelle, i lys av denne transformasjon

I beskrivelser av fremgangsmåter for isolasjon av antistoffer fra rekombinante verter blir begrepene "celle" og "cellekultur" anvendt om hverandre for å betegne kilden for antistoff med mindre det er klart spesifisert på annen måte Med andre ord, kan utvinning av antistoff fra "cellene" bety enten fra nedsentrifugerte, hele celler eller fra cellekulturen som inneholder både mediet og de suspenderte celler

Forkortelser

Nukleinsyrer, aminosyrer, peptider, beskyttende grupper, aktive grupper og lignende deler, når forkortet, forkortes i henhold til IUPAC IUB (Commission on Biological Nomenclature) eller praksisen på de gjeldende områder Det følgende er eksempler

Reagenser

EDTA Etylendiamintetraeddiksyre

SDS Natnumdodekylsulfat

Nukleinsyrer

RNA Ribonuklemsyre

DNA Deoksynbonukleinsyre

Nitroqenholdiqe baser

Både DNA og RNA inneholder lange kjeder av fosforsyre, et sukker og nitrogenholdige baser DNA er en dobbeltstrenget spiral, hvor sukkeret er 2-deoksynbose, mens RNA er enkeltstrenget, mens sukkeret er D-nbose De fire nitrogenholdige baser som karakteriserer DNA-nukleotider, er bundet sammen i komplementære par ved hydrogenbindinger så de danner dobbeltspiralen i DNA adenin er bundet tii tymin, guanin er bundet til cytosin I RNA blir uracil substituert for tymin i de oppsatte DNA-par

Aminosyrer

Variabelt område

DNA som koder for den tunge kjede, består av en Vh gensekvens, en Dh gensekvens og en JH gensekvens DNA som koder for den lette kjede, består av en V|_ gensekvens og en JL gensekvens

Vh gensekvens

Den foreliggende oppfinnelse er rettet mot fremstilling av selekterte chimenske antistoffer hvori VH-området er kodet for av en DNA-sekvens dannet fra et kimlinjegen som er spesifikt reaktivt mot TAG72 (VHarTAG), hvis sekvens er fremsatt i Figur 2 De chimenske antistoffer selekteres på grunnlag av deres evne til å binde TAG72, nemlig hvor det variable området binder seg til TAG72 i det minste 25% mer enn det variable området i B72.3 binder seg til TAG72 Hovedsakelig måles bindingsaffinitetene for det chimenske antistoff og B72.3 ved den samme teknikk

Eksempler på teknikker for måling av antistoffbindingsaffinitet er fremsatt i

følgende referanser Scatchard G , Annals of the N Y Acad of Sciences 5_1, 660

(1949), Steward, M W , og Petty, R E , Immunology 23, 881 (1972), Muraro, R , et al , Cancer Research 48, 4588 (1988), og Heyman.B , J of Immunol Methods 68, 193-204 (1984)

En dyktig fagmann vil forstå at nukleotidsekvensen til (og ammosyresekvensene kodet for av) VhøTAG som kan benyttes i den foreliggende oppfinnelse er ment å inkludere effektivt homologe nukleotidsekvenser og tilsvarende aminosyresekvenser "Effektivt homologe" refererer til identitet eller nær identitet av nukleotid- eller aminosyresekvenser Således, i denne beskrivelse, vil det være forstått at en liten se kven sva nasjon kan eksistere innen homologe sekvenser og at alle sekvenser som viser minst 80% homologi, er ansett som ekvivalente

Homologi uttrykkes ved fraksjonen eller prosenten av "matchende" baser (eller aminosyrer) etter at to sekvenser (muligens av ulik lengde) er blitt oppstilt Begrepet oppstilling anvendes i betydningen definert av Sankoff og Kruskal i kapittel 1 i deres bok, The Time Warps. Stnnq Edits. and Macromolecules The Theorv and Practice of Sequence Companson, Addison-Wesley, Reading, MA,

(1983) I korte trekk oppstilles de to sekvenser ved å maksimalisere antall matchende baser (eller aminosyrer) mellom de to sekvenser med innskudd av et minimalt antall "blanke" eller "null" baser inn i hver sekvens for å frembnnge den maksimale overlapping

Som det er forstått på fagområdet, kan nukleotidmistilpasninger forekomme i den tredje eller den usikre base i kodon uten å forårsake aminosyresubstitusjoner i den endelige polypeptidsekvens Også små nukleotidmodifikasjoner (f eks substitusjoner, innskudd eller relesjoner) i visse områder i gensekvensen kan tolereres og betraktes insignifikant når som helst slike modifikasjoner resulterer i forandringer i ammosyresekvens som ikke forandrer funksjonaliteten av sluttpro-duktet

Det er blitt vist at kjemisk syntetiserte kopier av hele eller deler av gensekvenser kan erstatte de tilsvarende områder i det naturlige gen uten tap av genfunksjon

Homologe av spesifikke DNA-sekvenser kan identifiseres av fagmenn på området ved å anvende en test med krysshybndisering av nukleinsyrer under strenghetsbetingelser som er vel forstått på fagområdet [som beskrevet i Nucleic Acid Hybridization, Hames og Higgens (eds ), IRL Press, Oxford, UK (1985)] Gitt to sekvenser, er algoritmer tilgjengelige for å beregne deres homologi f eks Needleham og Wunsch, J Mol Biol ,48, 443-453 (1970), og Sankoff og Kruskal (nevnt ovenfor) s 23-29 Også kommersielle tjenester er tilgjengelige for å utføre slike sammenligninger, f eks Intelligenetics, Inc (Palo Alto, CA)

Dh og Jh gensekvenser

DH og JH gensegmentene eksisterer i forskjellige typer, selv om typen av valgt D eller J gensegment ikke er vesentlig for oppfinnelsen Det vil si DH og Jh kan dannes fra et hvilket som helst dyr Foretrukne dyr inkluderer mus og mennesker Åpenbart er humane Dh og/eller JH gensegmenter spesielt foretrukne, men oppfinnelsen er ikke begrenset på denne måte hvis et D- eller J-gensegment fra en annen dyreart gir en viktig egenskap, dvs økt binding til TAG72

Eksempler på mus DH og Jh sekvenser er fremsatt i "Organization, Stnjcture, and Assembly of Immunoglobulm Heavy Chain Diversity DNA Segments", Kurosawa og Tonegawa, J Exp Med 155, 201 (1982), og "Sequences of the Joining Region Genes for Immunoglobulm Heavy Chams and Their Role in Generation of Antibody Diversity", Gough og Bernard, Proe Nati Acad Sei (USA), 78, 509 (1981)

Eksempler på humane DH og Jh sekvenser er fremsatt i en artikkel med tittel "Human Immunoglobulm D Segments encoded in Tandem Multigenic Families" av Siebenlist et al i Nature 294, 631 (1981), og eksempler på humane JH sekvenser er fremsatt i "Structure of the Human Immunoglobulm // Locus Charactenzation of Embryonic and Rearranged J and D Genes" av Ravetch et al, Cell,27, 583(1981)

\ A og J \ gensekvenser

Hovedsakelig kan en hvilken som helst VL og JL gensekvens anvendes, som koder for en del av en VL som er komplementær med VH kodet for av en nukleotidsekvens som er effektivt homolog med VhctTAG Ved "komplementær" menes det en VL som binder seg til VH og som gir et antistoff variabelt område som har bmdingsaffinitet på minst 25% mer enn B72.3, som målt ved en hvilken som helst standardteknikk for måling av bindingsaffmitetskonstanter

Typen av VL og JL gensegment som velges, er ikke vesentlig for oppfinnelsen Det vil si VL og JL kan dannes fra et hvilket som helst dyr Foretrukne dyr inkluderer mus og mennesker Åpenbart er humane VL og/eller JL gensegmenter spesielt foretrukne, men oppfinnelsen er ikke begrenset til dette hvis et JL gensegment fra en annen art gir en viktig egenskap, dvs økt binding til TAG72

Mus-Jl sekvenser er fremsatt i en artikkel med tittel "The nucleotide Sequence of a 5,5-kilobase DNA Segment Containing the Mouse Kappa Immunoglobulm J and C Region Genes" av Max, et al i J Biol Chem 256. 5116-5120 (1981) Humane JL sekvenser er fremsatt i en artikkel med tittel "Evolution of Human Immunoglobulm K J Region Genes" av Heiter et al i The Journal of Biological Chemistry 357 (2), 1516-1522 (1982)

Dannelse av variable områder

Gitt beskrivelsen ovenfor, blir det nå mulig å danne tallrike spesifikke utførelsesformer av antistoffvariable områder innen rekkevidde av den foreliggende oppfinnelse, dvs som har effektivt homologe VH sekvenser med VnaTAG og som binder seg til TAG72 i det minste 25% mer enn det vanable området i B72,3 binder seg til TAG72, og bindingsaffinitetene til antistoffet og B72.3 måles ved samme teknikk Flere mulige teknikker er fremsatt nedenfor

Naturliq- produserte variable områder

Som reaksjon på et immunogen, TAG72, vil et immunisert dyr forøke selekterte antistoffproduserende B-celler Det variable området i antistoffer produsert av B-cellene, vil kodes for av rearrangert kimlinje tung- og lettkjede DNA For eksempel vil den rearrangerte kimlinje tunge kjede inkludere V, D og J-gensegmentene, inkludert ledersekvensen, så vel som alle mtroner som videre kan fjernes Det lettkjede kodende DNA vil inkludere V og J gensegmenter, inkludert ledersekvensen, så vel som alle mtroner som videre kan fjernes

Variabiliteten kan være et resultat av somatiske mutasjoner som forekommer i en B-celle under produktivt rearrangement av VhoTAG Disse somatiske mutasjoner er nukleotidforandnnger som kan eller ikke kan resultere i en aminosyre-forandrmg som forandrer aktiviteten mot TAG72 i den produktivt rearrangerte VH

Kartleggingsteknikker

Monoklonale eller polyklonale antistoffer kan kartlegges for å bestemme hvilke av nevnte antistoffer som selektivt binder seg til TAG72 Slik kartlegging kan utføres ved en hvilken som helst av en rekke velkjente fremgangsmåter, slik som fastfase radioimmunoassey, enzymbundet immunosorbent assays, rosetteringsassays og blokkenngsassays De ovenfor beskrevne fremgangsmåter er vel kjent på fagområdet

Nukleotidsekvensen for kodende variable områder av antistoffer produsert fra den produktive rearrangenng av VhøTAG, er nå blitt oppnådd I tillegg til nukleotidsekvensen til VHoTAG viser Figur 2 også nukleotidsekvensene som koder for de tungkjede variable områder i henholdsvis CC46, CC49, CC83 og CC92 antistoffer Figur 3 viser ammosyresekvensene til VhctTAG Vh, CC46 VH, CC49 VH, CC83 VH og CC92 VH, som tilsvarer nukleotidsekvensene fremsatt i Figur 2 En sammenligning av nukleotidet og ammosyresekvensene til VhctTAG VH, CC46 VH, CC49 VH, CC83 VH og CC92 VH viser en meget slående egenskap, nemlig at kjedene har meget stor likhet

Den relative likhet av DNA som koder for CC46 VH> CC49 VH, CC83 VH og CC92 Vh områdene, spesielt i det 5' flankerende segment, beviser at disse DNA sekvenser er dannet fra VHaTAG Somatiske mutasjoner som forekommer under produktivt rearrangement av VH områdegenet som skal uttrykkes i en B-celle, gir opphav til noen nukleotidforandnnger som kan eller ikke kan resultere i en homolog aminosyreforandrmg mellom to produktivt rearrangerte VHaTAG produserende hybndomer

Nukleotidsekvensene og de tilsvarende aminosyresekvenser for CC49 VL er vist i henholdsvis Figurer 4a og 4b Nukleotidsekvensene og de tilsvarende aminosyresekvenser for CC83 VL er vist i henholdsvis Figurer 5a og 5b Nukleotidsekvensene og de tilsvarende aminosyresekvenser for CC92 VL er vist i henholdsvis figurer 6a og 6b

Probeteknikker

Andre antistoffer kodet for av DNA dannet fra VhctTAG kan dannes ved å anvende VhctTAG som hybndiseringsprobe Hovedsakelig bør en probe laget fra DNA eller RNA fra VHaTAG eller rearraangerte gener som inneholder det rekombmerte VHaTAG, anvendes av fagmenn på området for å finne homologe gener i ukjente hybndomer Slike homologe antistoffer vil ha en DNA-sekvens hvis mRNA hybndiserer med proben i hele eller en del av VhctTAG kimlmjegenet og dets flankerende område Ved "flankerende" områder menes det å inkludere de DNA-sekvenser fra 5'-enden i VHaTAG til 3'-enden av genet i oppstrømsret-nmg, og fra 3-enden i VhctTAG til 5'-enden av genet i nedstrømsretnmg

Rasionelt syntetiserte variable områder

En enda videre tilnærming er den rasjonelle syntese av forandrete variable områder i antistoffene beskrevet her, såvel som antistoffer oppdaget via probing En slik tilnærming har flere potensielle fordeler Nemlig bør en forsker ikke måtte kartlegge immuniserte vertsdyr ved å forsøke først å velge ut de antistoffer som binder seg til TAG og deretter å velge ut de antistoffer som spesifikt har Vh-områder kodet for av DNA dannet fra VHaTAG

Mutagene teknikker

VH og/eller VL gensegmentene kan "forandres" ved mutagenese Eksempler på teknikker inkluderer tilsetning, delesjon eller ikke-konservativ substitusjon av et begrenset antall forskjellige nukleotider eller den konservative substitusjon av mange nukleotider, forutsatt at den nktige leseramme opprettholdes

Substitusjoner, delesjoner, innskudd eller enhver underkombinasjon kan kombineres for å ende opp med en endelig konstruksjon Siden det er 64 mulige kodon-sekvenser men bare 20 kjente aminosyrer, er den genetiske kode degenerert i den betydning at forskjellige kodon kan gi den samme aminosyre Imidlertid er koden nøyaktig for hver aminosyre, således er det minst ett kodon for hver aminosyre, dvs hver kodon gir en enkelt aminosyre og ingen annen Det vil være tydelig at i løpet av translasjon må den riktige leseramme opprettholdes for å oppnå den riktige ammosyresekvens i det endelig produserte polypeptid

Teknikker for tilsetninger på forutbestemte ammosyreseter som har en kjent sekvens, er vel kjente Eksempler på teknikker inkluderer oligonukleotidformidlet, setedingert mutagenese og polymerasekjedereaksjon

Teknikker på delesjoner på forutbestemte ammosyreseter, som har en kjent sekvens, er vel kjente Eksempler på teknikker som inkluderer oligonukleotidformidlet setedingert mutagenese og polymerasekjedereaksjonen

Teknikker for substitusjoner på forutbestemte ammosyreseter som har en kjent sekvens, er vel kjente

Eksempler på teknikker inkluderer sete-mutagenese og polymerasekjede-reaksjonsteknikken

Oligonukleotidsetedirigert mutagenese involverer i hovedsak hybridisering av et ohgonukleotid som koder for en ønsket mutasjon med en enkelt streng av DNA som inneholder områder som skal muteres og ved å anvende enkeltstrengen som templat for ekstensjon av oligonukleotidet for å produsere en streng som inneholder mutasjonen Denne teknikk er i forskjellige former beskrevet av Zoller, MJ og Smith, M , Nuc Acids Res 10, 6487-6500 (1982), Norns, K , Norns, F , Christiansen,!, og Fm, N , Nuc Acids Res H, 5103-5112 (1983), Zoller.M J og Smith.M , DNA 3, 479-488 (1984), Kramer.W , Schughart.K og Fntz.W J , Nuc Acids Res 10,6475-6485(1982)

Polymerasekjedereaksjon (PCR) involverer hovedsakelig eksponensielt amplifisering av DNA in vrtro ved å anvende sekvensspesifiserte oligonukleotider Oligonukleotidene kan inkorporere sekvensforandnnger om ønsket Polymerase-reaksjonsteknikken er beskrevet i Mullis og Faloona, Meth Enz 155, 335-350

(1987) Eksempler på mutagenese hvor man anvender PCR, er beskrevet i Higuchi et al, Nucl Acids Res 16, 7351-7367 (1988), Ho et al, Genes 77, 51-59

(1989) og "Engineering Hybrid Restnction Genes Withoutthe Use of Restnction Enzymes Gene Splicing by Overlap Extension", Horton et al, Gene 77, 61 (1989)

Forandring av de antistoffvanable områder kan være av spesiell anvendelse i den terapeutiske anvendelse av monoklonale antistoffer For øyeblikket, når et chimensk antistoff som omfatter et komplett musevanabelt område, injiseres i et menneske, gjenkjenner menneskekroppens immunsystem det mus-vanable området, om enn mindre enn et komplett museantistoff, som fremmed og produserer en immunreaksjon mot dette Således, ved videre injeksjoner av museantistoffet eller det chimenske antistoff i mennesker, er dets effektivitet betraktelig redusert ved virkning av kroppens immunsystem mot det fremmede antistoff Følgelig kan forandringer i de mus VH og VL områder redusere den humane immunreaksjon overfor det forandrede antistoff

Rekombinant teknikker

Antistoffene kan konstrueres ved rekombinant-teknikker Med andre ord, fordi nukleotidsekvensene for forskjellige VH- og V[_-kodende områder nå er gitt, kan en dyktig fagmann in vitro produsere et komplett gen som koder for de tunge og lett-kjede variable områder

Det konstruerte gen kan produseres genteknisk hvori selekterte Dg og JH gensegmenter er i funksjonell kombinasjon med et selektert Vh gensegment, dvs VHaTAG segmentet, eller VH gensegmentet i CC49 eller CC83

For eksempel vil det konstruerte tungkjede kodende DNA inkludere Dh og JH gensekvenser som er sammenhengende med 3'-enden i kimlinje VHcrTAG gensegmentet, for derved å fullføre CDR3 og rammen (FR) 4 for VH-området En ledersekvens kan være tilstede, men kan senere fjernes

Avhengig av den anvendte lette kjede, kan det også være nødvendig å gi et konstruert lettkjede kodende DNA Således vil et DNA gen omfatte et VL gensegment i funksjonell kombinasjon, f eks sammenhengende med et JL gensegment, inkludert ledersekvensen som videre kan fjernes JL gensegmentet vil vanere avhengig av om hvorvidt den lette kjede er av lambda eller kappa systemet J-områdesekvensen er sammenhengende med enden av VL eksonet for å fullføre FR4 i VL området En slik konstruksjon kan utføres ved teknikkene anvendt til å konstruere Vh genet

Det konstruerte gen kan fremstilles ved konvensjonelle rekombinant-teknikker f eks for å gi et geninnskudd i et plasmid istand til ekspresjon Deretter kan plasmidene uttrykkes i vertsceller Eksempler på rekombinant biologiske teknikker er fremsatt nedenfor

Når man gir et fragment som koder for enten det lett-kjede eller tung-kjede variable området, vil det vanhgsvis være ønskelig å inkludere alle eller en del av intronet i ned-strømsretning fra J-området, spesielt der hvor det vanable området er dannet fra verten hvori det sammenføyde gen skal uttrykkes Der hvor intronet er bevart, vil det være nødvendig at det er funksjonelle spleiseakseptor og donorsekvenser t introntermini Intronet mellom J og det konstante området i det sammenføyde gen kan være primært intronsekvensen forbundet med (1) det konstante området, (2) J-området, eller (3) deler av hver Det sistnevnte kan være av bekvemmelighetsgrunner der hvor det er et passende restnksjonssete i intronene fra de to kilder Det kan være nødvendig å gi adaptere for å forene intronet med det konstante området I noen tilfeller kan hele eller en del av intronet modifiseres ved delesjon, nukleotidsubstitusjon(er) eller innskudd for å gjøre håndtering, ekspresjon eller lignende lettere Fortrinnsvis bør det være tilstede en effektiv mengde av intronet for å inneholde en forbedrer som er funksjonelt aktivt sammen med den naturlig forekommende promotor

Alternativt kan det være ønskelig at det sammenføyde gen er fritt fra intronet mellom J-genet og C-genet Således vil 3' terminus i J-genet være tilstøtende til 5' terminus i C-genet Man kan anvende en eksonuklease og ved å anvende forskjellige digestionspenoder, kan man sørge for varierende 3' termini som så kan anvendes til binding til det konstante området og seleksjon kan gjøres for et funksjonelt produkt på en rekke måter, eller ved spleising med overlapp-ekstensjon ved å anvende polymerasekjedereaksjonsteknologi, se Horton et al, supra I dette tilfellet vil en kunstig promotor, som ikke trenger å være funksjonelt aktiv sammen med forbedrer, hovedsakelig bh anvendt

l en foretrukket utførelsesform kan genene som koder for VH og VL områdene, forandres ved å erstatte i det minste deler av de komplementære bestemmende områder (CDR) i de lett- eller tungkjedevanable områder i antistoffet med analoge deler av CDR'r fra et antistoff med forskjellig spesifisitet Eksempel på en teknikk som erstatter CDR'r, er beskrevet i europeisk publisert patentsøknad 0 239 400, av Gregory Winter, og i PCT søknad WO 88/09344 av Huston et al I et forandret antistoff i henhold til den foreliggende oppfinnelse, vil bare CDR'ene i antistoffet være fremmede for en human kropp, og dette bør minimalisere bivirkninger hvis anvendt til human terapi Imidlertid har humane og muserammeområder karakteristiske trekk som atskiller humane- fra muserammeområder Således kan et antistoff omfattet av muse-CDR'er i en human ramme godt ikke være noe mer fremmed for kroppen enn et genuint humant antistoff

Nukleotidsekvensene som tilsvarer VH ammosyresekvensene i VHaTAG, CC46, CC49, CC83 og CC92, såvel som i CC49, CC83 og CC92 VL gensegmentene, er gitt Følgelig er det forutsatt at CDR'ene fra antistoffene fremstilt i henhold til den foreliggende oppfinnelse, kan podes mn i rammeområdene i det humane antistoff Hovedsakelig kan CDR-områdene fra et humant VH- eller VL-område erstattes av CDR'er fra VH- eller VL-områdene i antistoffer i henhold til den foreliggende oppfinnelse Eksempler på humane antistoffer hvorfra rammedelene kan anvendes, inkluderer humant plasmacytom NEWN, [Jones et al, "Replacing the complementarity-determining regions in a human antibody with those from a mouse", Nature 321, 522-525 (1986)], offentlig tilgjengelig fra Dr Greg Winter, og forskjellige andre humane VH og VL-gener tilgjengelige fra Dr Terrence Rabbitts, begge forskere som er fra the Medical Research Council, 20 Park Crescent, London W1N4AL

Bestemmelsen når det gjelder hva som utgjør en CDR og hva som utgjør et rammeområde, kan gjøres på grunnlag av ammosyresekvensene i et selektert lg som angitt i Kabat et al, Sequences of Proteins of Immunoloqical Interest. 4 utg

(1987), US Dept of Health and Human Services, NI H

De fire rammeområdene adopterer i store trekk en fi-platekonformasjon og CDR'ene danner sløyfer som forbinder og i noen tilfeller danner en del av fi-platestrukturen

Videre er ikke alle aminosyrerestene i sløyfeområdene tilgjengelige for oppløsningsmiddel, og i et tilfelle er aminosyrerestene i rammeområdene involvert i antigenbmdig [Amit, A G , Manuzza, R A , Phillips, S E V , og Poljak, R J , Science 233, 747-753, (1986)]

Det er også kjent at de variable områder i de to deler av et antigenbmdende sete holdes i nktig orientering av mterkjede, ikke-kovalente interaksjoner Disse kan involvere ammosyrerester i CDR'ene

Således, for å overføre den antigenbmdende evne i et variabelt område til et annet, behøver det ikke alltid være nødvendig å erstatte alle CDR'ene med de komplette CDR'er fra det donorvariable området Det kan være nødvendig bare å overføre de rester som er nødvendige for antigenbindmgssetet, og dette kan involvere overføring av rammeområderester såvel som CDR-rester

Det er således klart at bare ved å erstatte en eller flere CDR'er med komplementære CDR'er, ikke alltid behøver å resultere i et funksjonelt forandret antistoff Imidlertid, gitt forklaringene fremsatt i europeisk publisert patentsøknad nr 0 239 400, vil det være vel innen kompetansen til fagmenn på området, enten ved å utføre rutineekspenmentering, eller ved prøving og feiling testing for å oppnå et funksjonelt forandret antistoff

Fortrinnsvis blir de variable områder i både de tunge og lette kjeder forandret ved i det minste delvis CDR-utbyttmg og om nødvendig, ved delvis rammeområdeutbyttmg og sekvensforandnng Selv om CDR'ene kan dannes fra et antistoff fra samme klasse eller til og med underklasse som antistoffet hvonfra rammeområdene er dannet, har man forestilt seg at CDR'ene vil dannes fra et antistoff fra forskjellig klasse og fortrinnsvis fra et antistoff av en forskjellig art

Sammensatte variable områder

Hovedsakelig er V-genet som koder for V det samme V-gen som koder for VL naturlig kombinert med VH etter valg For eksempel blir VH-genet som koder for VL-områdene i CC49 og CC83 anvendt på fordelaktig måte når man anvender V-genet som koder for Vh i henholdsvis CC49 og CC83

Overraskende nok, fordi VH-områdene i antistoffene fremstilt i henhold til den foreliggende oppfinnelse, kodes for av VH-gener dannet fra VHaTAG, kan sammensatte antistoffer dannes med fordel Med andre ord, kan VH-området i et antistoff fremstilt i henhold til den foreliggende oppfinnelse, på passende måte kombineres med VL-området i et annet antistoff fremstilt i henhold til den foreliggende oppfinnelse Selv om ammosyresekvensene i de CC49 og CC83 tunge kjeder overfladisk sett er nær, vil det være forventet at en forandring på noen få eller til og med en aminosyre på drastisk måte vil påvirke bindmgsfunksjonen til antistoffet, dvs de resulterende antistoffer er hovedsakelig antatt å være et ikke-spesifikt immunoglobulm (NSI), dvs — som mangler antistoffkarakter, (se europeisk publisert patentsøknad nr 0 125 023)

Nokså overraskende er det nå blitt funnet at et antistoff som har den nødvendige VH i henhold til denne oppfinnelse, ikke trenger å rekombmeres bare med en VL fra det samme naturhg-forekommende dyreantistoff F eks , som fremsatt i eksemplene, er det mulig å produsere et chimerisk antistoff som har en tung kjede fra en VH fra CC83 og en lett kjede fra en VL fra CC49, mens det sammensatte antistoff dannet på denne måte har en bindmgsspesifisitet som er 25% større enn bindingsaffimteten til B72.3 til TAG72

Konstante områder

Tunqkiede ( Ch) område

Cn-områdene kan være av forskjellige humane isotyper, dvs IgG (dvs , IgGi, lgG2, lgG3 og lgG4), IgA, IgD, IgM, såvel som de forskjellige subtyper av de individuelle grupper

For en diskusjon av det humane y1, se Ellison et al, "The nucleotide sequence of a human immunoglobulm C-gamma-1-gene", Nucl Acid Res 10, 4071-4079 (1982), Takahashi et al, "Structure of human immunoglobulm gamma genes Implications for evolution of a gene family", Cell 29, 671-679 (1982) For en diskusjon av det humane gamma 2 (y2), se Krawmkel et al, "Companson of the hinge-coding segments in human immunoglobulm gamma heavy genes and the linkage of the gamma 2 and gamma 4 subclass genes, EMBO J1,403-407 (1982), Ellison et al, "Linkage and sequence homology of two human immunoglobulm gamma heavy cham constant region genes, Proe Nat Acad Sei (USA) 79, 1984-1988 (1982), Takahashi et al, mfra For en diskusjon av humant gamma 3 (y3), se Krawmkel et al mfra og Takahashi et al, mfra For en diskusjon av humant gamma 4 (y4) se Ellison et al "Nucleotide sequence of a human immunoglobulm C-gamma-4 gene, DNA i, 11-18 (1981), Krawmkel et al mfra, og Takahasi et al, mfra

For en diskusjon av det humane mu, se Rabbitts et al, Human Immunogobuhn Heavy Chain Genes Evolutionary Comparisons of C/ j, Cd, and Cy genes and Associated Switch Sequences", Nucl Acid Res 9,4509-4524

For en diskusjon av det humane alfa, se Flanagan et al, "Mechanisms of Divergence and Convergence of the Human Immunoglobulm alpha 1 and alpha 2 Constant Region Gene Sequences", Cell 36,681-688 (1984)

For en diskusjon av det humane delta, se White et al, "Human Immunoglobulm D Genomic Sequences of the Delta Heavy Chain", Science 228.

733-737(1985)

For en diskusjon av det humane epsilon, se Max et al, "Duplication and Deletion in the Human Immunoglobulm e Genes", Cell 29, 691-699 (1982)

Lettkiede ( COområde

CL-området kan være human kappa (k) eller human lambda (X)

For en diskusjon av det humane k, se "Cloned Human and Mouse Kappa Immunoglobulm Constant and J Region Genes Conserve Homology in Functional Segments", Heiter et al, Cell 22, 197-207, November (1980)

For en diskusjon av det humane X, se "Processed Genes A Dispersed Human Immunoglobulm Gene Beanng Evidence of RNA-Type Processing", Hollis et al, Nature 296, 321-325 (1982)

CH og/eller Ci_-gensegmentene kan "forandres" ved mutagenese Eksempler på teknikker inkluderer tilsetning, delesjon eller ikke-konservativ substitusjon av et begrenset antall av forskjellige nukleotider eller den konservative substitusjon av mange nukleotider, forutsatt at den riktige leseramme opprettholdes I tillegg kan hele områder i proteinet forandres, f eks ved å substituere CH2 med CH3 Denne substitusjon kan gjøres på DNA-nivå ved innskudd, delesjon eller substitusjon av hele sekvenseksoner

Konstruksion av antistoffer

Immunisennger

Den første teknikk for produksjon av antistoffer, enten monoklonale eller polyklonale, som har Vh områder som kodes for av DNA dannet fra VHaTAG, er å immunisere et vertsdyr med renset TAG72 Eksempler på fremgangsmåter for å immunisere et vertsdyr med TAG72 er fremsatt i US patenter 4 522 918 og 4 612 282, ved å anvende et humant brystkarsmomekstrakt som immunogen, og US patentsøknad 7-073 685 (som er offentlig tilgjengelig), ved å anvende TAG72 renset med B72,3 som immunogen

Deretter blir monoklonale eller polyklonale antistoffer produsert fra immunisenngskjemaet kartlagt for å bestemme hvilket av nevnte antistoffer som selektivt binder seg til TAG72 Slik kartlegging kan utføres ved et hvilket som helst antall av en rekke velkjente fremgangsmåter, slik som fastfase radioimmunoassay, enzymbundet immunosorbent assays, rosetterende assays og blokkerende assays De ovenfor beskrevne fremgangsmåter er vel kjent på fagområdet

Syntese av aminosyresekvenser

Immunoglobuliner fremstilt i henhold til den foreliggende oppfinnelse, kan syntetiseres fra deres aminosyrer Egnete teknikker er Mernfield fastfase metoden som beskrevet i J Amer Chem Soc 85, 2149-2154 (1963) Denne fastfase metode for syntetisering av sekvenser av aminosyrer er også beskrevet på side 1-4 i en bok av Stewart og Young, Solid Phase Peptide Synthesis (W H Freeman og Co , San Fransisco, 1969)

Konstruksion av DNA

DNA som koder for Vh og Vi_

DNA som koder for antistoff tung- og lettkjedene kan oppnås fra en rekke kilder kjent for de med vanlig fagkunnskap, f eks genom DNA, cDNA, syntetisk DNA eller en kombinasjon av disse

Celler som koder for den ønskede sekvens, kan isoleres, og genom DNA fragmenteres ved ett eller flere restriksjonsenzymer Genom DNA kan eller kan ikke inkludere naturlig forekommende mtroner De resulterende fragmenter kan så klones og kartlegges ved å anvende en tungkjede J-område (Jh) probe for tilstedeværelse av DNA-sekvensen som koder for polypeptidsekvensen av interesse DNA-fragmenter isolert ved preparativ agarose gel elektroforese ligeres Rekombinante plaque fra samlingene kartlegges med en mus-Jn probe

DNA kan også oppnås fra en cDNA-samlmg Budbnnger-RNA som koder for tung eller lett kjede isoleres fra en egnet kilde, enten modne B-celler eller en hybndomkultur, ved å anvende standardteknikker for RNA isolering, og ved å anvende oligo-dT cellulosekromatografering for å segregere poly-A mRNA Poly-A mRNA kan videre fraksjoneres for å oppnå sekvenser med tilstrekkelig størrelse til å kode for ammosyresekvensene i den lette eller tunge kjede i det ønskede antistoff som nødvendig

En cDNA-samlmg blir så fremstilt fra blandingen fra mRNA ved å anvende en egnet primer, fortrinnsvis en nuklemsyresekvens som er karakteristisk for det ønskede cDNA En slik primer kan syntetiseres basert på aminosyresekvensen til antistoffet I alternativer kan cDNA fra ufraksjonert poly-A mRNA fra en cellelinje som produserer det ønskede antistoff eller poly-dT, også anvendes Det resulterende cDNA blir eventuelt størrelsesfraksjonert på polyakrylamidgel og så utvidet med f eks dC rester for basepartilpasnmg med pBR322 eller en annen egnet kloningsvektor som er blitt spaltet med et egnet restnksjonsenzym slik som Pst I, og utvidet med dG rester Alternative måter å danne kloningsvektorer som inneholder cDNA ved å anvende andre haler og en annen klonmgsvektor-rest på, kan f eks også anvendes, men det foregående er en standard og et foretrukket valg En egnet vertscellestamme, typisk Eschenchia coli (E coli), transformeres de basepartilpassede kloningsvektorer, og de vellykkede transformanter identifiseres ved hjelp av f eks ampicillin eller tetracyklmresistens eller andre fenotype karakteristika som ligger på klonmgsvektorplasmidet

Vellykkede transformanter plukkes opp og overføres til mikrotiterplater eller annen bærer for videre vekst og bevaring Nitrocellulosefilteravtrekk av disse voksne kulturer blir så probet med egnede nukleotidsekvenser som inneholder baser kjent for å være komplementære med ønskede sekvenser i cDNA Flere typer av probe kan anvendes, fortrinnsvis syntetiske enkelt-strengede DNA-sekvenser merket ved å chinasere med y-<32>P ATP Cellene fiksert til nitrocellulose filteret, ble lysert, DNA denaturert, og så fiksert før reaksjon med kinasebehandlet probe Kloner som hybndiserer på vellykket måte, påvises ved kontakt med en fotoplate, så isoleres og sekvensdannes plasmider fra de voksne kolonier ved hjelp av måter kjent på fagområdet for å verifisere at de ønskede deler av genet er tilstede

De ønskede genfragmenter skjæres ut og tilpasses for å sikre passende leseramme med kontrollsegmentene når de innskytes i egnede ekspresjonsvektorer Typisk blir nukleotider tilsatt til 5'-enden for å inkludere et startsignal og et passende plassert restriksjonsendonukleasesete

Fordi oppfinnerne har gitt nukleotidsekvensene i VHcrTAG, kan DNA også syntetiseres syntetisk, f eks ved å anvende en Applied Biosystems™ Model 380A DNA Synthesizer, og konstrueres ved standard teknikker

Til slutt er et eksempel på en teknikk for å anvende en kombinasjon av de ovenfor nevnte teknikker å spleise med over-lappende ekstensjon ved å anvende polymerasekjedereaksjonsteknologi, se Horton et al, supra Hovedsakelig kan en syntetisk syntetisert primer, som har en såkalt "viftende hale" innskytes sammen med en selektert sekvens, f eks genom DNA Deretter blir sekvensene amplifisert og spleiset sammen

DNA som koder for CH og Ci

DNA-fragmentet som koder for aminosyresekvensen for det humane konstante området, kan oppnås ved å kartlegge det kromosomale DNA i celler som produserer humant immunoglobulm

Vektorer

Det ønskede DNA-fragment kan plasseres i en biologisk funksjonell ekspresjonsbærer som kan inneholde passende kontrollsekvenser ikke tilstede i det valgte DNA-fragment Ved "biologisk funksjonell" er det ment at ekspresjonsbæreren sørger for replikasjon og/eller ekspresjon i en egnet vert, enten ved opprettholdelse som et ekstrakromosomalt element, eller ved integrering mn i vertsgenomet Et stort antall vektorer er tilgjengelige eller kan lett fremstilles, og er velkjente for dyktige fagmenn

Det er blitt beskrevet en rekke plasmider, slik som de beskrevet i europeisk publiserte patentsøknader 0036776, 0048970 og 0051873, som allerede inneholder en promotor i leseramme med genet og forenlig med den foreslåtte vertscelle

Vektorene og fremgangsmåtene beskrevet her er egnet til anvendelse over et vidt område av mikroorganismer, enten prokaryote eller eukaryote, som er mottagelige for transformasjon Plasmidet vil være istand til å replisere i mikroor-ganismen, spesielt en bakterie

Hovedsakelig inneholder plasmidvektorer som inneholder de passende promotorer, som kan anvendes av den mikrobielle organisme til ekspresjon av dets eget protein, også kontroll-sekvenser, nbosombindende seter, og transknpsjonstermineringsseter Hovedsakelig blir replikonen og kontroll-sekvensene som er dannet fra arter forenlige med vertscellen, anvendt i forbindelse med disse verter

Mindre eller større SV40 fragmenter kan også anvendes, forutsatt at det er inkludert den omtrentlige 250 basepar (bp) sekvens som strekker seg fra Hind III setet mot Pvu II setet lokaliert på replikasjonsutgangspunktet for viruset Videre er det også mulig og ofte ønskelig å anvende promotor eller kontrollsekvenser normalt forbundet med den ønskede gensekvens, forutsatt at slike kontroll-sekvenser er forenlige med vertscellesystemene

Til slutt bør plasmidet ønskelig ha et gen, et markørgen, som er istand til å gi en fenotypisk egenskap som muliggjør seleksjon av vertsceller som inneholder ekspresjonsvektoren Spesielt anvendbart er et gen som gir overlevelsesseleksjon Overlevelsesseleksjon kan oppnås ved å gi resistens mot et vekt-inhiberende stoff eller ved å gi en vekstfaktorevne til en bakterie som mangler slik evne

Hovedsakelig er prokaryoter foretrukket For eksempel, er pBR322 et plasmid dannet fra en E coli art, se [Bolivar, et al, Gene 2, 95 (1977)] spesielt anvendbart pBR322 inneholder gener for ampicillin og tetracychn resistens og gir således en lett måte å identifisere transformerte celler på

Mens disse prokaryoter er de mest vanlig anvendte, inkluderer andre mikrobestammer som kan anvendes, E coli stammer slik som E coli B, E coli K12 stamme 294 (ATCC Nr 31466) og E coli X1776 (ATCC Nr 31537), E coli W3110 (F"' r prototropt, ATTC Nr 27325), bacilh slik som Baallus subtitus, og andre enterobactenaceae slik som Salmonella typhimunum eller Serratia marcescens, og forskjellige Pseudbmonas-arter kan anvendes Disse eksempler er ment å være bare illustrative

I tillegg til prokaryoter kan også eukaryote mikrober anvendes Saccharomyces ceævisiae, eller vanlig bakegjær er den mest vanlig anvendte blant eukaryote mikroorganismer, selv om en rekke andre stammer er vanlig tilgjengelige

For ekspresjon i Saccharomyces, blir plasmid YRp7, for eksempel [ Stinchcomb, et al, Nature 282, 39 (1979), Kingsman et al, Gene 7, 141 (1979), Tschemper, et al, Gene 10, 157 (1980)] vanligvis anvendt Dette plasmid inneholder allerede trpl genet som gir en seleksjonsmarkør for en mutant stamme av gjærcelle som mangler evnen til å vokse i tryptofan, for eksempel ATCC Nr 44076 eller PEP4-1 [Jones, Genetics 85,12 (1977)] Tilstedeværelse av trpl lesjonen som et karakteristikum for gjærvertscellegenomet, gir så et effektivt miljø for påvisning av transformasjon ved vekst i fravær av tryptofan

Enhver plasmidvektor som inneholder en gjærcelleforenlig promotor, replikasjonsutgangspunkt og terminenngssekvens er egnet til anvendelse t gjærceller Egnede promotorsekvenser i gjærcellevektorer inkluderer promotorene for 3-fosforglycerat-chinase [Hitzeman, et al, J Biol Chem 225, 2073 (1980)] eller andre glykolytiske enzymer [Hess, et al, J Adv Enzyme Reg 7, 149 (1968) Holland et al, Biochemistry 17, 4900 (1978)]

Til anvendelse i pattedyrceller blir kontrollfunksjonene på ekspresjons-vektorene ofte gitt ved virusmateriale For eksempel dannes vanlig anvendte promotorer fra polyoma, Adenovirus 2, og oftest Simian Virus 40 (SV40) De tidligere og sene promotorer for SV40 virus er spesielt anvendbare fordi begge oppnås lett fra viruset som et fragment som også inneholder SV40 virus replikasjonsutgangspunktet [Fiers, et al, Nature 273, 113 (1978)]

For eksempel inneholder pSV2neo et gen både for ampicillinresistens og for neomycinresistens, som er under kontroll av en SV40 promotor Således gir pSV2neo en lett måte å identifisere celler transformert med gener for både det dyrevanable området og det humankonstante området

Fremstilling av chimensk DNA

Gener som koder for den tunge kjede eller den lette kjede, vil konstrueres ved å forene 5-enden av et DNA-fragment som koder for det konstante området til 3'-enden av et DNA fragment som koder for det variable området DNA sekvensen som koder for antistoff-aminosyresekvensen, kan oppnås i forbindelse med promotoren og replikasjonssetet fra genom DNA I den grad at vertcellene gjenkjenner de transkripsjonsregulatonske og translasjonsinitienngssignalene forbundet med de heterologe gener, så kan området 5' og 3' i den variable områdekodende sekvens holdes tilbake med den variable områdekodende sekvens og anvendes til transkripsjons- og translasjonsinitienngsregulenng Det ikke-kodende området 3' til det konstante området kan bevares for sine transknp-sjonstenminenngsregulatoriske sekvenser, slik som terminering og polyadenylenng Idet man referer til 5'eller 3' for en dobbeltstreng, er det ment å bety retningen av transkripsjon, idet 5' er i oppstrømsretning fra 3'

Intronsekvensen mellom det variable området for hver henholdsvise kjede kan forenes med det tilsvarende humane konstante DNA-fragment i et hvilket som helst passende restriksjonssete Når man gir et fragment som koder for det variable området, vil det vanligvis være ønskelig å inkludere en del av intronet i nedstrømsretning fra J-området Der hvor intronet er bevart, vil det være nødvendig at det er funksjonelle spleiseakseptor og donorsekvenser i mtronter-mini Det tilstøtende, ikke-kodende området 5' til det variable området vil normalt inkludere de sekvenser som er involvert med initiering av transkripsjon og . translasjon, slik som TATA-boksen, dekkesekvensen og CAAT sekvensen Vanligvis overstiger ikke den 5'-ikkekodende sekvens omtrent 1-2 kilobaser (kb)

Det bør eksistere en forbedrer-sekvens mellom J-området og det konstante området Den anvendte forbedrer kan være forbedreren til enten (1) det animalske V-området eller (2) det humane konstante området

Ved å bevare 3"-området naturlig tilstøtende til DNA-sekvensen som koder for det konstante området, kan transknpsjonstermineringssignalene bli gitt for genet Der hvor transknpsjonsterminenngssignalene ikke er tilfredsstillende funksjonelle i ekspresjonsvertscellen, kan et 3' område funksjonelt i vertscellen substitueres Passende kan det ikke-kodende 3'-området oppnås fra et ikke-kodende tilstøtende 3'-område i et konstant område fra ekspresjonsverten Det 3-ikke kodende området kan forenes med det konstante området på en hvilken som helst av måtene beskrevet tidligere for håndtering og glygenng av DNA-fragmenter Dette området kan så anvendes som en byggesten i fremstilling av genet

Fremstilling av ekspresionsbærere

Konstruksjon av egnede ekspresjonsbærere som inneholder de ønskede kodende og kontrollsekvenser, kan produseres som følger Termini av vektorene og DNA-fragmentene kan så religeres for å danne de ønskede ekspresjonsbærere De anvendte fremgangsmåter er ikke avhengig av DNA-kilde eller tilsiktet vert

DNA-fragmenter som koder for den lette kjede og tunge kjede kan innskytes inn i separat ekspresjonsbærer eller inn i den samme vektor Fortrinnsvis blir de sammenføyde gener som koder for de lette og tunge chimenske kjeder, samlet i to forskjellige ekspresjonsvektorer som kan anvendes til å kotransformere en mottagercelle, enten samtidig eller sekvensielt

Metodene for innskudd av DNA-fragmentene som inneholder de chimenske gener, inn i ekspresjonsvektorer, inkluderer anvendelse av restnksjonsendo-nukleaser "Restriksjonsendonukleaser" (eller "restnksjonsenzymer") er hydrolytiske enzymer istand til å katalysere setespesifikk spalting av DNA-molekyler Lokus for restriksjonsendonukleasevirkning er bestemt ved eksistensen av en spesifikk nukleotidsekvens En slik sekvens en kalt gjenkjennelsessete for restnksjonsendonukleasen Mange restriksjonsendonukleaser fra en rekke bakteriearter er blitt isolert og karakterisert ved hjelp av nukleotidsekvensen i deres gjenkjennelsesseter Noen restriksjonsendonukleaser hydrolyserer fosfodiesterbindingene på begge strenger på samme punkt, og produserer butte ender Andre katalyserer hydrolyse av bindinger separert ved noen få nukleotider fra hverandre, og produserer fne enkeltstrengede områder i hver ende av det spaltede molekyl Slike enkeltstrengede ender er selv-komplementære, således kohesive og kan anvendes til å gjenforene det hydrolyserte DNA Eksempler på restnksjonsenzymer inkluderer Aat II, Barn Hl, Eco RI, Hind III, Nde I, Spe I, Xba I, Sac I, Bgl II, Pst I, Sal I og Pvu II

I tillegg kan ekspresjonsvektoren ha en innskudd polylinker som har en mengde unike restriksjonsseter Ved digestion av ekspresjonsvektoren med de passende restnksjonsenzymer vil polyhnkeren bli spaltet slik at i det minste ett DNA fragment som inneholder genet, kan innskytes Der hvor polylinkeren tillater atskillbare termini, kan DNA-fragmentet innskytes i en enkelt orientering, der hvor termini er de samme, vil innskudd av DNA fragmentet resultere i plasmider som har to forskjellige orienteringer

Spalting utføres ved å behandle plasmidet med restriksjonsenzym(er) Hovedsakelig anvendes omtrent 10 //g plasmid eller DN A-f rag menter med omtrent 10 enheter enzym i omtrent 100 jj\ bufferløsning Endonukleasedigestion vil normalt utføres ved temperaturer som varierer fra 37°C til 65°C, ved en pH på fra

7 til 9

(Passende buffere og substratmengder for spesielle restnksjonsenzymer er spesifisert av produsentene) Tiden for reaksjonen vil være fra 1 til 18 timer

Det kan være anvendbart å forhindre religenng av den spaltede vektor ved forbehandling med alkalisk fosfatase Spesifikke betingelser er foreskrevet av produsenten

Etter at restriksjonsenzymspaltingen er fullstendig, blir proteinet fjernet ved ekstraksjon med fenol og kloroform Nukleinsyren fjernes fra den vandige fraksjon (som inneholder omtrent 0,3M natriumacetat) ved presipitenng med omtrent 2,5 volumer etanol

Beskrivelser av fremgangsmåter for spalting med restnksjonsenzymer kan finnes i følgende artikler Greene et al, Methods in Molecular Biolo<q>v. Vol 9, utg Wickner, R B , Marcel Dekker, Inc , New York, "DNA Replication and Biosyn-thesis" Mertz og Davis, Proe Nat Acad Sei, (USA), 69, 3370 (1972)

Størrelses-separasjon av de spaltede fragmenter ved agarosegelelektro-forese utføres lett for å følge forløpet av reaksjonen Så snart spaltingen har gått til den ønskede grad, kan endonukleasen inaktiveres ved oppvarming over 65°C i omtrent 10 minutter eller organisk ekstrahenng

Det ønskede fragment blir så renset fra spaltingen Egnede rensings-teknikker inkluderer gel elektroforese eller sukrose gradientsentrifugenng

Plasmidbæreren og fremmede DNA-fragmenter blir så ligert med DNA-ligase for å resirkulere Denne prosess referes til som basepartilpasning og DNA-ligenng

Et passende buffret medium som inneholder DNA-fragmentene, DNA-hgase og passende kofaktorer anvendes Temperaturen som anvendes vil være mellom 25°C til 4°C Når DNA-segmentene er hydrogenbundet, vil DNA-ligasen være istand til å innføre en kovalent binding mellom de to segmenter Tiden anvendt for basepartilpasningen vil variere med den anvendte temperatur, naturen av saltløsningen såvel som naturen av de klebnge ender eller kohesive termini Hovedsakelig kan tiden for ligenng være fra 5 til 18 timer Se Maniatis T , Molecular Cloning, Cold Spring Harbor, supra

Vertsceller

Deretter kan ekspresjonsbærerkonstruksjonene anvendes til å transformere en passende vertscelle Egnede vertsceller inkluderer celler dannet fra unicellulære såvel som multicellulære organismer

De chimenske immunoglobulingener kan uttrykkes i ikke-lymfoide celler slik som baktener eller gjærceller

Forskjellige unicellulære mikroorganismer kan transformeres, slik som baktener Det vil si, de unicellulære organismer som er istand til å dyrkes t kulturer eller fermentering Siden bakterier hovedsakelig er de mest egnede organismer å arbeide med, vil bakterier heretter referes til som eksempler på de andre unicellulære organismer Bakterier som er mottagelige for transformasjon, inkluderer medlemmer av Enterobactenaceae, slik som stammer av Eschenchia coli, Salmonella, Bacillaceae, slik som Bacillus subtilis, Pneumococcus, Streptococcus, og Haemophilus mfluenzae

Når uttrykt i bakterier, blir de immunoglobulm tunge kjeder og lette kjeder en del av inklusjonslegemer Kjedene må så isoleres, renses og så samles i funksjonelle immunoglobulinmolekyler

I tillegg til prokaryoter, kan eukaryote mikrober slik som gjærcellekulturer også anvendes Saccharomyces cerevisae eller vanlig bakegjær er de mest vanlig anvendte blant eukaryote mikroorganismer, selv om en rekke andre stammer er vanlig tilgjengelige Tilstedeværelse av trpl lesjonen som et karakteristikum for gjærvertscellegenomet gir et effektivt miljø for påvisning av transformasjon ved vekst i fravær av tryptofan

I tillegg til mikroorganismer, kan kulturer av celler dannet fra multicellulære organismer også anvendes som verter I prinsipp er enhver slik cellekultur lett å arbeide med, enten fra kultur fra virveldyr eller virvelløse dyr, forutsatt at cellelinjen er en som i det minste opprinnelig produserte antistoffer Propagenng av celler fra virveldyr i kultur er blitt en rutmeprosedyre i senere år [Tissue Culture, Academic Press, Kruse og Patterson, utgivere, (1973)] Eksempler på slike anvendbare vertscellelinjer er Sp2/0, VERO og HeLa celler, kinesisk hamster ovarie (CHO) cellelinjer, og W138, BHK, COS-7 og MDCK cellelinjer

Den foretrukne resipient-cellelinje er en plasmacytomcelle eller slik som B-lymfocytter eller hybndomceller Plasmacytomceller kan syntetisere, samle og sekretere immunoglobuliner kodet for av transformerte immunoglobulingener Videre har de mekanismen for glykosylering av immunoglobuhnet Sp2/0 er en foretrukket resipientcelle fordi den er en immunoglobuhn-ikke-produserende plasmacytomcelle Cellen produserer bare immunoglobulm kodet for av de transformerte immunoglobulingener Plasmacytomceller kan dyrkes i kultur eller i pentoneum fra mus, hvor sekretert immunoglobulm kan oppnås fra ascites fluid

Transformasjon av vertsceller

Transformasjon av vertsceller utføres som følger Ekspresjonsbæreren blir linearisert, og DNA blir innskutt i vertceller for produksjon av antistoffet Eksempler på fremgangsmåter for innskudd av DNA mn i vertsceller inkluderer elektroporermg, protoplastfusjon, kalsiumfosfat-presipitenng, eller andre konvensjonelle teknikker, som anvender dekstransulfat og PEG

Hvis celler uten enorme celleveggbarnerer anvendes som vertsceller, kan transformering utføres ved kalsiumfosfat-presipitenngsmetoden som beskrevet av Graham og Van der Eb, Virology, 52,546 (1978)

Hvis prokaryote celler eller celler som inneholder vesentlige cellevegg-konstruksjoner, anvendes, er den foretrukne metode for transformenng kalsiumbehanding ved å anvende kalsiumklond som beskrevet av Cohen, F N et al, Proe Nati Acad Sei (USA) 69, 2110 (1972)

Vertscellene kan transformeres enten via ko-transformering eller målrettet transformering

For ko-transformering kan genene som koder for den lette kjede og tunge kjede, anvendes til å transformere separate cellekulturer, enten fra den samme eller fra forskjellige arter, separate plasmider for lett og tung kjede kan anvendes til å ko-transformere en enkeltcellekultur, eller til slutt kan et enkelt ekspresjonsplasmid som inneholder begge gener og er istand til å uttrykke genene for både lett og tung kjede, transformeres mn i en enkeltcellekultur

I den målrettede transformasjonsteknikk blir vertscellene transformert med gener som koder for den lette kjede, og cellene som inneholder den lette kjedemarkør, selekteres Den lette kjede finnes ved å anvende cytofarging eller muligens ved påvisning av den lette kjede i supernatanten hvis den er blitt sekretert Celler selektert til å ha den lette kjede, transformeres med den tunge kjedekonstruksjon, og resulterende celler som i tillegg inneholder den tunge kjedemarkør, selekteres

Det er kjent at noen udødeliggjorte lymfoidcellelinjer, slik som plasmacytom-cellelinjer, i deres normale tilstand sekreterer isolerte lg lette eller tunge kjeder Følgelig, hvis en slik cellelinje transformeres med vektoren som inneholder den chimenske tunge eller lette kjede i henhold til den foreliggende oppfinnelse, vil det ikke være nødvendig å transformere cellelinjen eller en annen cellelinje med den andre lg kjede, forutsatt at den normalt sekreterte kjede er komplementær med det variable området i lg kjeden kodet for av vektoren i utgangspunktet anvendt til å transformere cellelinjen

Seleksion og ekspresion av transformerte vertsceller

Hovedsakelig, etter transformering av vertscellene, kan cellene dyrkes i omtrent 48 timer for å tillate ekspresjon av markørgener Cellene blir så plassert i et selektivt medium, hvor utransformerte celler drepes, idet de etterlater bare celler transformert med DNA-konstruksjonene

Tunge og lette kjeder eller deler av disse, kan produseres i isolasjon fra hverandre og antistoffer og fragmenter av disse kan oppnås Slike preparater krever anvendelse av teknikker for å gjensamle isolerte kjeder

Evnen til fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen til å produsere tunge og lette kjeder eller deler av disse, i isolasjon fra hverandre, gir mulighet til å oppnå unike ansamlinger av immunoglobuliner, Fab-områder og univalente antistoffer Det er mulig å rekombinere de tunge og lette kjeder in vitro, avbrutt av spalting av bare interkjededisulfidene, og gjenvinne antistoffaktivitet selv uten gjenopprettelse av interkjededisulfidene [se Edelman, G M , et al, Proe Nati Acad Sei (USA) 50, 753 (1963)]

De transformerte celler dyrkes under tilstander passende for produksjon av de lette kjeder og/eller tunge kjeder, og måles for tung og/eller lett-kjedeprotein-syntese Eksempler på målingsteknikker inkluderer enzymbundet immunosorbent assay (ELISA), radioimmunoassay (RIA), eller fluorescensaktivert cellesorterer-analyse (FACS), immunohistokjemi og lignende

Bindingsaffiniteten til monoklonale antistoffer for TAG72 bestemmes ved hjelp av måter vel kjent på fagområdet (se Heyman, B et al, J Immunol Methods 68, 193-204 (1984) og som beskrevet i detalj i eksemplene gitt heretter)

Selekterte positive kulturer subklones for å isolere rene transformerte kolonier En egnet teknikk for å oppnå subkloner er via den begrensede fortynningsmetode beskrevet av McKeara i Monoclonal Antibodies, Plenum Press, NY (1980)

Hybndomer som produserer slike chimenske antistoffer, kan dyrkes ved å anvende kjente fremgangsmåter De transformerte celler kan sekretere store mengder av de lette kjeder og/eller tunge kjeder ved kultur in vitro, slik som ved hulfibersystemet, spinnerkultur, statisk kultur eller in vivo, slik som ascites produksjon

De chimenske antistoffer kan produseres i store mengder ved å injisere et hybnbom inn i pentonealhulen i pnstanutløste mus, og etter en passende tid (omtrent 1-2 uker) innhøsting av ascites fluid fra musene, hvilket gir en veldig høyt titer av homogent monoklonalt antistoff, og isolasjon av de monoklonale antistoffer derfra ved fremgangsmåter vel kjent på fagområdet [se Stramignoni, P et al,

Intl J Cancer 3J[, 543-552 (1983)] Hybndomene dyrkes opp in vivo, som tumorer i dyr, fra hvilke serum eller ascites fluid kan gi opptil omtrent 50mg/ml av monoklonale antistoffer Vanligvis vil injeksjon (fortrinnsvis intrapentoneal) av omtrent 10<6> til 107 histologisk forenlige hybridomceller i mus eller rotter resulterer i tumordannelse etter noen få uker Antistoffene kan så oppsamles og frembringes ved velkjente fremgangsmåter (Se hovedsakelig Immunoloqical Methods, Vol I & II, utg Lefkovits, I og Perms, B (1979 & 1981) Academis Press, New York, N Y , og Handbook of Expenmental Immunology. utg Weir, D , (1978) Blackwell Scientific Publications, St Louis MO

Antistoffene kan så lagres i forskjellige bufferløsninger slik som fosfatbuffret saltvann (PBS), som gir en hovedsakelig stabil antistoffløsning videre anvendelse

De chimenske antistoffer i henhold til den foreliggende oppfinnelse kan fragmenteres ved å anvende kjente protease-enzymer, f eks papain og pepsin, for å oppnå høyt immunoreaktive F(ab')2, F(ab') og Fab fragmenter I tillegg kan aktive fragmenter av lg dannet ved proteolyse (omtrent 50 000 MW) splittes til deres fullt ut reduserte tungkjede og lettkjede komponenter og nokså effektivt rekonstrueres for å gi et aktivt antistoff [Haber, E , Proe Nati Acad Sei (USA) 52, 1099 (1064), Whitney.P L , et al, Proe Nati Acad Sei (USA) 52, 524 (1965)] Reaktiviteten av de resulterende F(ab')2, F(ab') og Fab fragmenter bestemmes ved fremgangsmåter som beskrevet ovenfor for det komplette monoklonale antistoffmolekyl

Anvendelsområder for antistoffene

Antistoffene fremstilt ved fremgangsmåten i henhold til den foreliggende oppfinnelse, såvel som immunoreaktive fragmenter eller rekombinanter av disse, gir unike fordeler for anvendelse i en rekke kreftbehandlinger I tillegg til deres evne til å binde seg spesifikt til ondartede celler, og til å lokalisere tumorer, har antistoffene konstant vanable områder som ikke binder seg påvisbart til normale celler slik som fibroblaster, endotelceller eller epitelceller i hovedorganene

Spesifikt er antistoffene, de immunoreaktive fragmenter eller rekombinanter av disse, anvendbare til, men ikke begrenset til, de følgende typer av kreftbehandling (1) in vivo diagnostiske målinger konjugert til en avbildingsmarkør, for in situ påvisning av carcinomlesjoner som videre beskrevet nedenfor, (2) in vivo terapi, ved å anvende antistoffene fremstilt i henhold til fremgangsmåten av den foreliggende oppfinnelse, alene eller konjugert til et terapeutisk middel slik som et radionuklid, toksin, effektorceller, andre antistoffer eller via en komplement-mekanisme som beskrevet nedenfor, og (3) radioimmunostyrt kirurgi, som beskrevet nedenfor

Videre er en farmasøytisk blanding som omfatter antistoffene fremstilt ved fremgangsmåten i henhold til den foreliggende oppfinnelse i en farmasøytisk akseptabel, ikke-toksisk, steril bærer slik som fysiologisk saltvann, ikke-toksiske buffere og lignende også nå mulig

Injiserbare blandinger fremstilt ved fremgangsmåten i henhold til den foreliggende oppfinnelse, kan være enten i suspensjons eller løsningsform I løsningsform blir komplekset (eller når ønsket de separate komponenter) løst i en farmasøytisk akseptabel bærer Slike bærere omfatter et egnet løsningsmiddel, konserveringsmidler slik som benzylalkohol, om det trengs, og buffere Anvendbare løsningsmidler inkluderer f eks vann, vandige alkoholer, glykoler og fosfonat eller karbonatestere Slike vandige løsninger inneholder ikke mer enn 50% av det organiske løsningsmiddel i volum

Injiserbare suspensjoner som blandinger fremstilt ved fremgangsmåten i henhold til den foreliggende oppfinnelse, krever et væskesuspensjonsmedium, med eller uten adjuvanser som bærer Suspensjonsmediet kan f eks være vandig polyvinylpyrrolidon, inerte oljer slike som vegetabilske oljer eller høyt raffinerte mineraloljer eller vandig karboksymetylcellulose Egnede fysiologisk akseptable adjuvanser, om nødvendig for å bevare komplekset i suspensjon, kan velges fra fortykningsmidler slik som karboksymetylcellulose, poplyvinylpyrrolidon, gelatin og alginater Mange overflate aktive midler er også anvendbare som suspendenngs-midler, f eks lecitin, alkylfenol, polyetylenoksyd, tilsetningsprodukter, naftalen-sulfonater, alkylbenzensulfonater og polyoksy-etylensorbitanesterene Mange stoffer som gir hydrofobisitet, tetthet og overflatespenning i væskesuspensjons-mediet, kan hjelpe til i fremstilling av de injiserbare suspensjoner i individuelle tilfeller F eks er silikon antiskummende midler, sorbitol og sukker alle anvendbare suspensjonsmidler

Fordi kreftceller er heterogene, og følgelig kan et enkelt monospesifikt chimerisk antistoff ikke være istand til å gjenkjenne alle celler som uttrykker forskjellige epitoper i en tumor

Således kan det være ønskelig å administrere flere forskjellige chimenske antistoffer fremstilt ved fremgangsmåten i henhold til den foreliggende oppfinnelse Den sekvensielle anvendelse av disse forskjellige antistoffer bør i det vesentlige redusere de anti-ideotypiske reaksjoner i humane pasienter når sammenlignet med qientatt anvendelse av et enkelt antistoff F eks kan CH92, CH88 og CH44 administreres sekvensielt til en pasient Siden disse antistoffer har forskjellige lette kjeder og faktisk forskjellige CDR3-områder, bør anti-idiotypiske reaksjoner minimaliseres

In vivo diagnostiske målinger

In vivo diagnostiske målinger av humane tumorer eller metastaser av disse ved å anvende antistoffene, immunoreaktive fragmenter eller rekombinanter av disse, konjugeres til en markør, administeres til en pasient og så påvises tilstedeværelsen av avbildningsmarkøren i pasienten ved å eksponere pasienten for et passende påvisningsmiddel

Administrering og påvisning av antistoff-avbildningsmarkørkonjugatet såvel som fremgangsmåter for konjugering av antistoffet til avbildmgsmarkøren, utføres ved fremgangsmåter som lett kan kjennes eller lett bestemmes, som beskrevet f eks i Goldenber, DM et al , New England J Med , 298, 1384-1388 (1978), Goldenberg, D M et al, J Amer Med Assoc 280, 630-635 (1983), Goldenberg, DM et al .Gastroenterol 84,524-532 (1983), Siccardi.G G et al, Cancer Res 46, 4817^822 (1986), Epeneetos, A A et al, Cancer 55, 984-987 (1985), Philben,

V J et al, Cancer 57, 571-576 (1986), Chiou, R et al, Cancer Inst 76, 849-855

(1986), Colcher, E et al, Cancer Res , 43, 736-742 (1983), Colcher, E et al, Laboratorv Research Methods in Biologyand Medicine Immunodiaqnostics, New York, Alan R Liss, s 215-258 (1983), Keenan, AM et al, J Nucl Med 25, 1197-1203 (1984), Colcher, D et al, Cancer Res 47, 1185-1189(1987), Estaban, J M et al, Intl J Cancer 39, 50-59 (1987), Martin.D T et al, Curr Surg 41., 193-194

(1984), Martin, E W Jr et al, Hybndoma 5, S97-S108 (1986), Martin.D T et al, Am J Surg 150, 672-675 (1985), Meares et al , Anal Biochem 142, 68-78 (1984), og Krejcarek et al, Biochem and Biophys Res Comm 77. 581-585 (1977)

Doseringen vil vanere avhengig av alderen og vekten til pasienten Hovedakelig bør doseringen utføres for å visualisere eller påvise tumorseter, atskilt fra normale vev Fortrinnsvis vil en engangsdosenng være mellom 0,1-200 mg av et antistoff-markørkonjugat pr pasient

Eksempler på avbildingsmarkører som kan konjugeres til antistoffet, er vel kjent for fagmenn på området, og inkluderer stoffer som kan påvises ved diagnostisk avbilding ved å anvende en gamma-scanner eller håndstyrt gamma-probe eller Positron Emisjonstomografi eller lignende som beskrevet i referansene nevnt ovenfor, og stoffer som kan påvises ved nukleærmagnetisk resonans-avbilding ved å anvende et nukleærmagnetisk resonans-spektrometer eller lignende, som beskrevet i referansene nevnt ovenfor

Egnede eksempler på stoffer som kan påvises ved å anvende en gamma-scanner eller lignende, inkluderer f eks radio-isotoper slik som 125|, 1311, 123|, 111m, 105Rh, 153Sm, 67Cu, 67Ga, 166Ho, 177Lu, 186Re, 188Re, og 99mTc 125,, 123,, 153sm og 99nriTc er foretrukne på grunn av dere lave energi og egnethet til påvisning over et langt område

Et eksempel på et stoff som kan påvises ved å anvende et nukleærmagnetisk resonansspektrometer eller lignende, er gadolinium (Gd)

In vivo kreftbehandling

I denne fremgangsmåte kan det antistoff-terapeutiske middelkonjugat avleveres til carcinomsetet for derved direkte å eksponere carcinomvevet overfor det terapeutiske middel

Antistoffene fremstilt ved fremgangsmåten i henhold til den foreliggende oppfinnelse, immunoreaktive fragmenter eller rekombinanter av disse, kan administreres i en farmasøytisk effektiv mengde for in vivo behandling av humane carcinomer eller metastaser av disse En "farmasøytisk effektiv mengde av antistoffet" et immunoreaktivt fragment eller en rekombinant av dette, konjugert eller ukonjugert til et terapeutisk middel, betyr at mengden av nevnte antistoffer i den farmasøytiske blanding bør være tilstrekkelig til å oppnå effektiv binding med antigenene, mot hvilke nevnte antistoffer har spesifikk affinitet Den farmasøytiske blanding kan administreres i en enkelt eller multippel dosering

Fremgangsmåter for fremstilling og administrering av konjugater av antistoffet, immunoreaktive fragmenter eller rekombinanter av disse og et terapeutisk middel er vel kjent eller kan lett bestemmes av fagmenn på området Videre vil egnede doseringer avhenge av alderen og vekten til pasienten og det anvendte terapeutiske middel og er vel kjent eller kan lett bestemmes av fagmenn på området Representative fremgangsmåter er beskrevet i referansene nevnt nedenfor

Eksempler på de antistoff-terapeutiske middelkonjugater som kan anvendes i terapi, inkluderer følgende (1) antistoffer bundet til radionuklider, slik som 1311, 90y, 105Rh, 47sc. 67cu, 212B,,211At, 67Ga, 125i. 186Re, 188Re, 177Lu, 99mTc, 153Sm, 123, og111lnsom beskrevet f eks i Goldenberg, DM et al, Cancer Res 4J., 4354-4360 (1981), Carrasquillo.J A et al, Cancer Treat Rep 68, 317-328 (1984), Zalcberg.J R et al, J Nati Cancer Inst 72,697-704 (1984), Jones, DH et al, Int J Cancer 35, 715-720 (1985), Lange.P H et al, Surgery 98, 143-150 (1985), Kaltovich.F A et al,

J Nucl Med 27, 897 (1986), Order, S E , et al, Int J Radiother Oncol Biol Phys 8, 259-261 (1982), Courtenay-Luck, N et al, Lancet 1, 1441-1443 (1984) og Ernnger, Ds et al, Cancer Treat Rep 66, 289-297 (1982),

(2) antistoffer bundet til medikamenter eller biologiske reaksjonmodifiserende midler slik som metotreksat, adrimyacin, og lymfokiner slik som interferon, som beskrevet i f eks Chabner.B et al, Cancer, Pnnciples and Practice of Oncoloqv. Philadelphia, PA, J B Lippincott Co Vol 1, s 290 328 (1985), Oldham.R K et al, Cancer, Pnnciples and Practice of Oncoloqv. Philadelphia, PA, J B Lippincott Co , Vol 2, s 2223-2245 (1985), Deguchi.T et al, Cancer Res 46, 3751-3755 (1986), Deguchi.T et al ,Fed Proc_44,1684 (1985), Embleton.M J et al , Br J Cancer 49, 559-565 (1984 og Pimm.M V et al, Cancer Immunol Immunother 12,125-135

(1982), (3) antistoffer bundet til toksiner som beskrevet i f eks Uhr, J W et al, Monoclonal Antibodies and Cancer. Academic Press, Inc , s 85-98 (1983), Vitetta, ES et al, Biotechnoloqy and Bio Frontiers. utg P H Abelson, s 644-650 (1983) og Vitetta.E S et al, Sei, 219, 644-650 (1983), (4) heterofunksjonelle antistoffer, f eks antistoffer bundet til eller kombinert med et annet antistoff slik at komplekset binder seg både til karsinomet og effektorcellene, f eks dreper-celler slik som T-celler, som beskrevet f eks i Perez, P et al, J Exper Med 163,166-178 (1986) og Lau.M A et al

Proe Nati Acad Sei (USA) 82, 8648-8652 (1985), og

(5) naturlige, dvs ikke-konjugerte eller ikke-kompleksdannede antistoffer, som beskrevet i f eks Herlyn.D et al , Proe Nati Acad Sei (USA) 79, 4761-4765

(1982), Schulz.G et al, Proe Nati Acad Sei (USA) 80, 5407-5411 (1983), Capone.P M et al ,Proc Nati Acad Sei (USA) 80, 7328-7332 (1983), Sears.H F , et al, Cancer Res 45, 5910-5913 (1985), Nepom GT et al, Proe Nati Acad Sei (USA) 81, 2864-2867 (1984), Koprowski, H et al, Proe ,Natl Acad Sei (USA) 81., 216-219 (1984), og Houghton,A N et al, Proe Nati Acad Sei (USA) 82,1242-1246 (1985)

Fremgangsmåtene for kombinenng av antistoffet eller antistoff-fragmentet til et ønsket terapeutisk middel som beskrevet ovenfor, er konvensjonelle og vel kjent på fagområdet F eks fremgangsmåtene gitt i referansene ovenfor

Radioimmunostvrt kirurgi

Antistoffer, immunoreaktive fragmenter eller rekombinanter av disse er viktige for radioimmunostvrt kirurgi (RIGS) I RIGS, en intraoperativ terapi, blir tumorer lokalisert og skåret ut Et antistoff merket med en avbildingsmarkør blir injisert i pasienten, og bundet antistoff lokalisert ved en håndstyrt gamma-påvisnmgsprobe (GDP) og skåret ut Et eksempel på GDP er Neoprobe™, kommersielt tilgjengelig fra Neoprobe ™ Corporation, Tampa, Fl Se Martin et al, "Radioimmunoguided surgery a new approach to the intraoperative detection of tumor usmg antibody B72.3" Amer J Surg 156, 386-392 (1988), Martin et la "Radioimmunoguided surgery intraoperative use of antibody 17-1A in colorectal cancer", Hybridoma 5, 597-S108 (1986)

Administrering og påvisning av antistoff-avbildingsmarkør-konjugatet såvel som fremgangsgåter for konjugenng av antistoffet til avbildingsmarkøren, utføres ved fremgangsmåter som lett kan kjennes eller lett bestemmes av en fagmann på området, som beskrevet f eks ovenfor

Doseringen vil variere avhengig av alderen og vekten til pasienten, men hovedsakelig er en tidsdosenng på 0,1 til 200 mg antistoff-markørkonjugat pr pasient tilstrekkelig

De følgende eksempler er bare for illustrasjon av konstruksjonen og ekspresjon av chimenske DNA-sekvenser som koder for antistoffene fremstilt ved fremgangsmåten i henhold til denne oppfinnelse Alle temperaturer ikke angitt på annen måte er i °C Alle prosenter ikke angitt på annen måte er i vekt

EKSEMPLER

Utbytting av musekonstante områder

CC-antistoffer ble dannet fra mus, og er signifikant mindre istand til å utføre effektorfunksjonene innehatt av de humane konstante områder

Følgelig, i de følgende eksempler, blir selekterte antistoffer, "humanisert" ved genetisk å fjerne de konstante områder i de tunge og lette kjeder og erstatte dem med deres humane ekvivalenter

De muse lettkjede konstantområdegener ble erstattet med det humane kappa (k) gen, og de muse tungkjede gener ble erstattet med hver av de fire

humane gamma isotyper (y1, y2, y3 og y4) Hver av disse fire gammaisotyper har unike biologiske egenskaper For en generell gjennomgang, se "The Human IgG subclasses", Hamilton, R G (1989)Docnr CB0051-289 Calbiochem Corporation

Fremstilling av tung og lett kiede variabelt område

Isolering av CC49 lett kiede

CC49 hybndomceller sekreterer et antistoff som har en IgGi isotype tung kjede og en kappa lett kjede

Total DNA fra CC49 hybndomceller, Galb/C musenyreceller og NSI plasmacytomceller ble isolert i henhold til fremgangsmåtene fremsatt i Cell, 24, 353-356(1981)

Hovedsakelig ble omtrent 10-20 /vg av det ekstraherte DNA fra hver cellelinje spaltet fullstendig med 80 enheter Barn Hl, Eco RI, Hind III, Spe I, Xba I, Sac I, Bgl II og Pst 11 50-100 mikroliter av en reaksjonsblanding som inneholdt den passende reaksjonsbuffer ved 37°C over natten

Deretter ble det totale ekstraherte DNA fra hver cellelinje underkastet Southern Hybndiseringsteknikk, utviklet av E M Southern, [J Mol Biol 98, 503-517

(1975)] DNA-fragmentene ble fraksjonert på grunnlag av deres størrelse ved hjelp av elektroforese på en 0,8% agarosegel De dobbeltstrengede DNA-fragmenter ble modifisert til enkeltstrengede DNA-fragmenter i en alkalisk løsning, og så ble et nitrocellulosefilter plassert i nær kontakt med gelen for å overføre de modifiserte DNA-segmenter på filterer i nærvær av en løsning med høy salt-konsentrasjon

Hybridisering ble utført ved å anvende som probe en tilfeldig utløst < 32P >-merket L kjede

Mer spesifikt var proben et 1,71 kilo basepar (kbp) Hind Ill-Pst I fragment som inneholdt de kodende eksoner for muse Jl områdene (J1-J5) og ble isolert fra plasmid pGD1 En nukleotidsekvens av probefragmentet er gitt i Figur 7 Dette plasmid er beskrevet i "Site Directed Cleavage of Immunoglobulm Gene Segments by Lymphoid Cell Extracts", Agostaro et al, Can J Biochem Cell Biol 63, 969-976

(1985) Plasmidet ble gitt av Nobumichi Hozumi og John Roder, Mt Sinai Research Institute, Toronto, Ontario, Canada

For å radiomerke proben ble alpha < 32P > dCTP oppnådd fra Amersham, Arlmgton Heights, IL, USA, og det tilfeldige utløsningstestsett ble oppnådd fra Pharmacia, Piscataway, NJ, USA

Signalene i Southern overføringer ble visualisert ved autoradiografi ved å anvende Kodak X-OMAT™ AR film Ingen åpenbart rearrangerte bånd ble observert Således, i forhold til standardene, ble det ikke påvist noe unikt bånd på autoradiogrammet for CC49 DNA spaltet med Hind III Det kunne imidlertid ikke avsløres fra Southern data at det rearrangerte bånd for L-kjeden var maskert av et bånd som vandret i CC49 Hind III spaltet DNA parallelt med båndet som resulterte fra en Hind III spalting av musenyrecelle DNA (som representerer kimlinje DNA) Dette viste seg faktisk å være tilfellet

Fremstilling av plasmid som inneholder Muse V\ gener

LSAMBDA-ZAP™, en lambda-basert innskuddskloningsvektor istand til å kutte seg selv, ble kjøpt fra Stratagene Co , La Jolla, CA, USA LAMBDA-ZAP™ er beskrevet på sidene 20-21 11987 Stratagene-katalogen De kohesive (cos) ender av LAMBDA-ZAP™ ble ligert over natten ved å følge produsentens fremgangsmåte

Tyve mikrogram av det ligerte LAMBDA-ZAP™ ble spaltet med 5 mikroliter (15 enheter) Spe I, kjøpt fra New England Biolabs, Inc Det totale volum av spaltingen var 100 mikroliter Etter 55 minutters spalting, ble 6 enheter til av Spe I tilsatt Etter 70 minutter ble reaksjonen stoppet ved fenol-ekstraksjon og etanolpresipitenng utført som via Stratagene's fremgangsmåte

Spalting med Spe I restnksjonsenzym resulterer i produksjon av "klebrige ender" i begge termini Disse klebnge ender ble modifiset rmed T4 DNA-polymerase for å danne halveis utfylte Spe I klebrige ender, f eks 5'ACT/3TCATG For å utføre den halve utfyllmgsreaksjon ble DNA-pelleten oppnådd i etanolpresipitenngen ovenfor, løst i 8 mikroliter vann Til dette ble det tilsatt 2 mikroliter av 10 millimolar dTTP, 2 mikroliter av 10 millimolar dCTP, 2 mikroliter av Stratagene's 10X hgasebuffer, 4 mikroliter reionisert, destillert vann, og 2 mikroliter av et Klenow fragment fra Bethesda Research Laboratories (BRL) Reaksjonen ble utført ved romtemperatur i 30 minutter Reaksjonen ble stoppet ved å inaktivere DNA polymerase ved 65°C 110 minutter

160 mikrogram av totalt CC49 hybndom DNA (som inneholdt muselett-kjedepromotoren ogLog VJ eksonene), ble spaltet fullstendig med Hind III Fragmenter mellom omtrent 1 kb to omtrent 20 kb ble kuttet ut av 0 8% av agarosegeler DNA ble renset ved å anvende GENECLEAN™, som er kommersielt tilgjengelig fra BIO 101 (La Jolla, CA, USA)

De totale CC49 hybndom DNA Hind III spaltede fragmenter var halvfyllte, hk LAMBDA-ZAP™'s Spel fragmentene med det unntak at dATP og dGTP ble anvendt De halvfyllte Hind III spaltede fragmenter produserte STXGCTrøGAA klebnge ender, som er forenlige med det Spe I halvfyllte LAMBDA-ZAP™ fragment ovenfor

Etter fenolekstraksjon og etanolpresipitenng i henhold til beskrivelsene til Maniatis, ble de totale CC49 hybndom Hind III modifiserte og LAMBDA-ZAP™ Spe I modifiserte DNA fragamenter ligert ved hjelp av T4 DNA hgase Ligerings-reaksjonen ble satt ved å anvende en 6,1 mikroliter ligeringsblanding som inneholdt følgende omtrent 0,2 mikrogram av det totale CC49 hybndom Hind III modifiserte DNA i en 3 mikroliters løsning, omtrent 1 mikrogram LAMBDA-ZAP™ Spe I modifisert DNA i en 1 mikroliters løsning, 0,6 mikroliter Stratagene's 10X hgasebuffer, 0,5 mikroliter 10 millimolar ATP og 1 mikroliter Stratagenes ligase Dette ble inkubert over natten i vannbad, og temperaturen senket i små trinn fra omtrent 18°C til omtrent 4°C Denne ligenng eliminerte både Hind III og Spe I setene

En genomisk samling av ligert blanding ble laget i henhold til Stratgene's fremgangsmåte I korte trekk ble 2 mikroliter av ligenngsblandingen produsert ovenfor, anvendt i Stratagene's Gigapck Gold pakkingssystem, idet man fulgte retningslinjene til produsenten 15 150 mm plater som hadde en tetthet på 50 000 plaque pr plate, ble kartlagt, som ved produsentens retningslinjer, for positive kloner ved hybridisering til nitrocellulosefilteret, oppnådd fra Schleicher-Schuell, Keene, NH, USA Den < 32P > vilkårlig merkede probe dannet fra pGD1, som ble beskrevet ovenfor, ble anvendt til hybridisering To positive kloner ble oppnådd

Hver klon ble plaque-renset, og rekombinante plasmider (phagemids) av LAMBDA-ZAP™ som inneholdt det CC49 L kjedevanable området, ble oppnådd ved å anvende Stratagene's automatiske utskjænngsfremgangsmåte Vektordelen av det resulterende rekombinerte plasmid er kalt pBLUESCRIPT SK(-) og består av 2964 bp som beskrevet i Stratagene's katalog 1987 Et plasmidkart over pBLUESCRIPT SK(-) er vist i Figur 8

DNA fra de to positive kloner ble delvis sekvensert, og begge var identiske En av klonene, som ble kalt pRL 101, ble anvendt til videre studier

Restriksionskartlegging av CC49 lett k| ede

pRL101 var 7,61 kb, og størrelsen av DNA innskuddet ble bestemt ved restriksjonsenzymkartlegging til å være 4,65 kb Et plasmidkart over pRL101 er vist i Figur 9 Et restnksjonsenzymkart over CC49 L kjedegenom DNA-innskuddet i pRL101 er vist i Figur 10

Isolasion av CC83 lettkiede variabelt område

Fremgangsmåtene anvendt til å isolere den CC83 lette kjede, var i det vesentlige de anvendt til å isolere den CC49 lette kjede, med følgende unntak

Genomsamhng som inneholdt 7 x 10<5> plaque ble kartlagt ved som probe å anvende < 32P > vilkårlig merkede 1,71 Hind Ill-Pst I fragment dannet fra pGD1 som beskrevet ovenfor En positiv klon ble oppnådd Den positive klon ble kalt pRL200

Restriksionskartleqqinq av CC83 lett kiede

pRL200 var 7,44 kb, og størrelsen av DNA-innskuddet ble bestemt ved restriksjonsenzymkartlegging til å være 4,48 kb Et plasmidkart over pRL200 er vist i Figur 11 Et restriksjons-enzymkart over CC83 L kjedegenom DNA-innskuddet i pRL200 er vist i Figur 12

Isolasion av CC49 tunqkiede variabelt område

Fremgangsmåtene anvendt til å isolere den CC49 tunge kjede, var i det vesentlige de som ble anvendt til å isolere CC49 lett kjede, inkludert kartlegging av det samme CC49 Hind III modifiserte DNA

Hybridiseringsproben anvendt til å kartlegge samlingen, ble dannet fra pNP9, som inneholder et 1,98 kbp Eco Rl-Bam Hl fragment som inneholdt de kodende eksoner for JH3 og Jh4 i den CC49 immunoglobulm tunge kjede Nukleotidsekvensen for probe-fragmentet er gitt i Figur 13 Plasmidet ble gitt av Dr Nobumichi Hozume og Dr John Roder, Mt Sinai Research Institute, Toronto, Ontario, Canada

En genomsamhng som inneholdt 9,5 x 10<5> plaque, ble kartlagt, hvorfra det ble oppnådd en positiv klon den positive klon ble kalt pHH49

Restriksionskartleqqinq av CC49 tung kiede

pHH49 var omtrent 7,0 kg, og størrelsen av DNA-innskuddet ble bestemt ved restriksjonsenzymkartlegging til å være omtrent 4,0 kb Et plasmidkart over pHH49 er vist i Figur 14

Isolering av CC83 tung kied eva ria belt område

Fremgangsmåtene anvendt til å isolere den CC83 tunge kjede var i det vesentlige de som ble anvendt til å isolere CC49 tung kjede, med følgende unntak

Omtrent 13 mikrogram ligert LAMBDA-ZAP™ vektor DNA ble spaltet med 12 enheter Spe I, kjøpt fra New England Biolabs, Inc , i en total mengde på 100 mikroliter av en passende buffer LAMBDA-ZAP™ ble spaltet ved 37°C i en time Reaksjonsblandmgen ble fenolekstrahert og etanolpresipitert som ved Stratagene's fremgangsmåte Det Spe I spaltede LAMBDA-ZAP™ ble defosforylsert i henhold til fremgangsmåte fremsatt i Maniatis med unntak av at 40 gangers overskudd av kalvetarm-alkalisk fosfatase (Boehnnger Mannheim, Indianapolis, IN, USA) ble anvendt

DNA fra CC83 ble spaltet fullstendig med Spe I Fragmenter mellom omtrent 3 kb til montrent 40 kb ble isolert fra en 0,8% agarose gelskive bed elektroeluenng som beskrevet av Maniatis, og ligert med den defosforylerte Spe-I-beskårne LAMBDA-ZAP™ vektor

En genomsamhng som inneholdt 5 x 10<5> plaque, ble kartlagt ved å anvende proben dannet fra nNP9, hvis sekvens er gitt i Figur 13 En positiv klon ble oppnådd Den positive klon ble kalt pHS83

Restriksionskartlegginq av CC83 tung kiede

pHS83 var 7,95 kb, og størrelsen av DNA-innskuddet ble bestemt ved restriksjonsenzymkartlegging til å være omtrent 5 kb Et plasmidkart over pHS83 er vist i Figur 15

Sekvensering av CC46. CC49. CC83 og CC92 mRNA

Total RNA fra omtrent 1 x 10<7> CC49 celler frosset ved -70°C ble ekstrahert i det vesentlige som rapportert av Maniatis, med følgende unntak

Fire molar guanidium isotyanat og 2,5 molar natnumsitrat, pH 7,0 og en SW40Ti rotor sentrifugert ved 31 000 rpm ble anvendt

En total mengde på 2,7mg CC49 ble isolert Etter sentnfugering, ble poly A+ mRNA renset fra omtrent 1,68 mg RNA ved ohgo(dT)-cellulosekromato-grafenng ved å anvende Type 3 ohgo(dT)-cellulose oppnådd fra Collaborative Research, Inc , Bedford, MA, USA Fremgangsmåten var som beskrevet av AViv og Leder, Proe Nat'1 Acad Sei (USA) 69, 1408 (1972) En total mengde på 50,24 mikrogram poly A+ mRNA ble oppnådd fra 1,68 milligram of mRNA

En total mengde på 3,82 mg CC83 ble isolert fra omtrent 1 x 10<7> celler En total mengde på 54,6 //g poly A+ mRNA ble isolert fra 1,91 milligram total RNA

En total mengde på 0,814 mg CC92 RNA ble isolert fra omtrent 2,6 x 10<8 >celler En total mengde på 41,88 mikrogram poly A+ RNA ble isolert fra 0,814 mg total RNA

En total mengde på 1,7 mg CC46 RNA ble isolert fra omtrent 2,89 x 10<8 >celler En total mengde på 68,88 mikrogram poly A+ RNA ble isolert fra 1,7 mg total RNA

Syntetiske oligonukleotidprimerer ble syntetisert ved å anvende en Applied Biosystems' (Applied Biosystems (ABI), Foster City, CA, USA) Modell 380A DNA synthesizer, ved fosforamaditt-basert kjemi som beskrevet av ABI Oligonukleotidene ble renset, som beskrevet av produsenten, etter elektroforese på en 20% polyakrylamid gel som innehold 7M urea

Oligonukleotidkonsentrasjoner ble bestemt elektrofotometrisk ved en optisk tetthet på 260 nm, hvor 1 OD 260 nm enhet er hk 33 fjglml enkeltstrenget DNA

De følgende oligonukleotidprimerer ble laget for mRNA sekvensering (1) For CC49, CC83 og CC92 lette kjeder, KL(-), en 22-mer

5-GGAAGATGGATACAGTTGGTGC-3'

komplementær med den kodende sekvens i 5' i det konstante omådet for museimmunoglobuhnkappakjeder, anvendes til å bestemme mRNA sekvensen i 3' i det lettkjede variable området

I tillegg, for CC49 lett kjede, ble 49FR1(-), en 17-mer

5-GGAAGATGGATACAGTTGGTGC-3'

anvendt til å bestemme den gjenværende sekvens

I tillegg, for CC83 lett kjede, ble J4(-), en 24-mer

5'-CCAACTTTGTCCCCGAGCCGAACG-3'

og også 83L CDR2(-), en 17-mer

5-CAGGGACTCCAGTGTGC-3'

anvendt til å bestemme den gjenværende sekvens

I tillegg, for CC92 lett kjede, ble J5(-)

5'-CGTTTCAGCTCCAGCTTGGTCCC-3'

anvendt til å bestemme den gjenværende sekvens

For de CC46, CC49, CC83 og CC92 y*\ tunge kjeder, CH1(-), en 24-mer

5'-ATGGAGTTAGTTTGGGCAGCAGAT-3'

komplementær med den kodende sekvens i 5" enden i det muse-

y1 tungkjedekonstante området CH1(-) 24-meren anvendes for å bestemme mMRA sekvensen i 3'enden i de tungkjedevanable områder

I tillegg, for den CC49 tunge kjede, ble JH4(-)-20-meren

5-GGTGACTGAGGTTCCTTGAC-3'

anvendt til å bestemme den gjenværende sekvens

I tillegg, forden CC83 tunge kjede, ble JH2(-)-16-mer

5'-CTGAGGAGACTGTGAG-3'

anvendt til å bestemme den gjenværende sekvens

I tillegg, for den CC92 tunge kjede og den B72.3 tunge kjede, ble B72.3/CC92 HC-20 mer

5'-CCTTGAACTTCTCATTGTAC-3'

anvendt til å bestemme den gjenværende sekvens

De følgende fremgangsmåter ble utført som beskrevet av Jan Gelliebter i BRL FOCUS9,1 (1987)

Oligonukleotidprimerene ble endemerket som følger 100 ng oligonukleotid ble kombinert i 50 mM Tris HCL (pH 8), 10 mM MgCI2, 5mM ditiotreitol og 1mM spermidin, 100 /yCi (y-<32>P) ATP (Amersham, 5000 Ci/mMol) og 7 enheter T4 polynukleotidkinase i et volum på 13 //I Reaksjonen ble tillatt å pågå ved 37°C i 30 minutter, så oppvarmet i 5 minutter ved 65°C for å inaktivere kinasen, og så ble 7//I vann tilsatt for å gjøre konsentrasjonen 5 ng///l De merkede pnmerer ble lagret ved -20°C inntil de trengtes

Separate prøver, som hver inneholdt omtrent 13 mikrogram poly(A)+ mRNA av henholdsvis CC49, CC83, CC92 eller CC46 ble resuspendert 110//I basepartilpasningsbuffer [10mM Tris HCI (pH 8,3), og 250 mM CKI]

En 5 ng prøve av endemerket oligonukleotidpnmer ble tilsatt til hver mRNA prøve, oppvarmet til 80°C i 3 minutter og basepartilpasset 145 minutter ved 61°C, for KL(-) og 65°C for CH1 (-) oligonukleotidene AMV revers transkriptase (Boehnnger Mannheim) ble anvendt på et nivå på 6 enheter for her mRNA sekvenseringsreaksjon Resten av sekvensenngen ble utført som fremsatt i BRL FOCUS9, 1 (1987)

Initielle sekvensdata viste at de tunge og lette kjeder ble rearrangert som følger CC49 kappa lett kjede anvendte en J5, CC49 y1 tung kjede anvendte en JH4 Den CC83 lette kjede anvendte en J4, den CC83 gamma 1 anvendte en JH2 Den CC46 kappa lette kjede anvendte en J2, den CC46 tunge kjede anvendte en JH3 Den CC92 lette kjede anvendte en J5, den CC92 gamma 1 anvendte en JH2 Figur 16 viser nukleotidsekvensen til CC49 VH, og de understrekte segmenter viser sekvensene dannet ved å anvende oligonukleotidprimerer på mRNA Figur 17 viser nukleotidsekvensen til CC83 VH, og de understrekte segmenter viser sekvensene dannet ved å anvende oligonukleotidprimerer på mRNA Hele nukleotidsekvensene til CC46 VH og CC92 VH, vist i Figur 2, ble dannet ved å anvende oligonukleotidprimerer på mRNA Figur 4a viser nukleotidsekvensen til CC49 VL, og de understrekte segmenter viser sekvensene dannet ved å anvende oligonukleotidprimerer på mRNA Figur 5a viser nukleotidsekvensen til CC83 VL, og de understrekte segmenter viser sekvensene dannet ved å anvende oligonukleotidprimerer på mRNA

Hele nukleotidsekvensen til CC92 VL, vist i Figur 6, ble dannet ved å anvende oligonukleotidprimerer på mRNA

Proteinsekvens

Renset muse CC49 og CC83 immunoglobuhnmolekyler ble sendt til Dr George Tarr på the University of Michigan Protein Sequencing utstyr for NH2-terminal aminosyresekvensanalyse Dr Tarr anvendte Edman-nedbrytnmgs-metoden, som modifisert av Tarr, G E , i "Manual Edman Sequencing System", Microcharacterization of Polypeptides A Practical Manual 91 John E Shively, utg , Humana Press, Inc , Clifton, N J , s 155-194 (1986)] l korte trekk reduserte Dr Tarr og alkylerte immunoglobulinmolekylene De lette og tunge kjeder i immunoglobulinmolekylene ble separert ved revers fase HPLC

Figur 4b viser aminosyresekvensen for CC49 VL, og resultatene av aminosyresekvensbestemmelsen for de første 24 aminosyrer i den modne CC49

VL er understreket Figur 5b viser aminosyresekvensen for CC83 VL, og resultatene fra aminosyresekvensbestemmelsen for de første 51 aminosyrer i den modne CC83 VL er understreket ASN-20 kunne ikke bestemmes i den CC83 lette kjede, på grunn av tilstedeværelse av N-bundede karbohydratrester i denne posisjon, som er vist i PNGase F forsøket nedenfor Sekvensen Asn-lle-Thr tilsvarer den samsvarende sekvens Asn-X-The/Ser for karbohydrat-tilhefting til Asn

Siden de tunge kjeder av immunoglobuhner CC49 og CC83 er blokkert i N-terminus og utilgjengelig for aminosyresekvens-bestemmelse, ble det naturlige glykopeptid behandlet med cyanogenbromid (CNBr) for å spaltes ved metioninrestene Spaltingen resulterte i fragmenter som ble renset ved revers fase HPLC N-terminal aminosyresekvensenng ble utført på CNBr fragmentene

Resultatene av aminosyrebestemmelsen av et av CC49 Vh CNBr peptidfragmentene er angitt som understrekte rester i Figur 18 Resultatene av aminosyrebestemmelsen av et av CC83 VH CNBr peptidfragmentene er angitt som understrekte rester i Figur 19 Som med CC49 tilsvarer alle andre peptidsekvenser CNBr fragmenter dannet fra det konstante området i musy 1

Bestemmelse av N- bundet karbohydrat på CC83 L- kiede

Dette forsøk ble gjort for å verifisere at det er et N-bundet karbohydrat festet til den CC83 lette kjede, antageligvis ved Asn-20 (se Figur 5b) Enzymet glykopeptidase F (PNGase F), som isoleres fra kulturfiltratet fra Flavobactenum meningosepticum [Tarentino, AL et al, Biochemistry 24, 4665-4671 (1985)], vil spalte høy mannose og/eller biantennære komplekse sukkere N-bundet til Asn for å danne en fri karbohydratstruktur og en ASP rest fra ASN hvortil den var festet Forskjellen i molekylvekt mellom den glykosylerte og ikke-glykosylerte form av det samme peptid kan bestemmes ved SDS-PAGE

Tolv mikrogram reaksjoner med og uten PNGase F (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN, USA) for de rensede museantistoffer CC49, CC83 og CC11 F(ab')2 (en positiv kontroll) ble utført i et endelig vandig reaksjonsvolum på 40 mikroliter Fire mikroliter 10 x buffer (1M kaliumfosfat, 0,1 M dinatnum EDTA pH 7,4) ble tilsatt til hver reaksjonsblanding Til de rør som var betegnet "med PNGase F", ble 7,5 mikroliter PNGase F også tilsatt, og alle rør ble inkubert ved 37°C 11 time Til reaksjonsrørene ble det tilsatt 40 mikroliter Laemmli 2X prøve-fortynmngsbuffer som inneholdt fi-merkaptoetanol En 10% SDS polyakrylamid gel ble kjørt elektroforese, gelen ble farget med Coomassie bnlliantblått R-250 og avfarget Figur 20 viser resultatene Som vist i felt 2, fremkommer det et nytt bånd (<*>) i PNGase F behandlet CC83 prøve men ikke i den ubehandlede CC83 prøve (felt 3) Det nye bånd er omtrent 2000-3000 mole-kylvekt mindre enn det naturlige lette kjedebånd, som representerer fjerningen av en N-bundet karbohydratdel Det eneste samsvarende glykosylenngssete for den CC83 lette kjede er ved ASN 20, så ved interferens er det antatt at dette er det faktiske sete for glykosylenng, og hvorfor det ikke viste seg ved den N-terminale sekvensanalyse av de CC83 lette kjeder som ASN Den CC49 lette kjede forandrer ikke mobilitet når den behandles med PNGase F (felt 6), men det er observert et nytt bånd for det tunge kjedefragment fra CC11 F(ab')2 (felt 4<*>) som tjener som positiv kontroll mRNA sekvens data for CC11 tung kjede indikerer et samsvarende glykosylenngssete i V-området (data ikke vist) Standardene (felt 1) er okseserum albumin (BSA), MW 68 000 og soyabønnetrypsin inhibitor (STI), MW 21 500

DNA sekvens

Plasmid DNA ble sekvensert direkte ved å anvende Sequenase DNA-sekvenseringstestsettet, oppnådd fra United States Biochemical (USB), Cleveland, OH, USA USB's protokoll ble fulgt for å sekvensere dobbeltstrenget DNA DNA fra hvert variabelt område ble sekvensert ved å anvende JH eller JL oligo bestemt fra mRNA sekvens informasjonen til å være spesifikk for hvert produktivt rearrangert henholdsvis tungkjede- eller lettkjedegen

Etter at de initielle sekvenser var bestemt, ble sekvensen utvidet videre ved å anvende tilleggspnmerer Tilleggsprimerene ble syntetisert ved å anvende informasjon samlet fra sekvensene dannet tidligere

Ved å anvende teknikken ovenfor, ble DNA-sekvensene for hele de tungkjede variabeltområdeeksoner og lettkjede vanabelt-områdeeksoner for CC49 og CC83 oppnådd DNA-sekvensen ble samlet of analysert ved å anvende Hitachfs DNA-sekvensanalyse datamaskinprogram DNASIS™

De følgende oligonukleotidprimerer ble laget for DNA-sekvensenng

(1) for begge lette kjeder, C« intron (-)

5'-GAAAACCTGTGTCTTACAC 3'

(2) For den CC49 lette kjede, CC49 FRI(+)

De komplette nukleotidsekvenser for CC49 VL og CC83 VL er vist i Figurene henholdsvis 4a og 5a Deretter ble sekvenseringen av hver tunge kjede utvidet med følgende sekvenser CC49/83 HC/5'(+)

De komplette nukleotidsekvenser for CC49 VH og CC83 VH er vist i Figur 2

Det ble gjort sammenligninger mellom den karakteriserte mRNA-sekvens og den karakteriserte DNA-sekvens, og mellom den karakteriserte ammosyresekvens og aminosyresekvensen forutsagt fra DNA-sekvensen Basert på disse sammenligninger, ble plasmidklonene identifisert til å inneholde den korrekte DNA-sekvens for å kode for de CC49 og CC83 tung- og lett-kjede variable områder

De forutsagte aminosyresekvenser fra nukleotidsekvensene i de tungkjede variable områder i CC49 og CC83, som vist i Figur 2, viser utstrakt sekvenslikhet gjennom hele rammeområdene og de hypervariable områder 1 og 2 Hyper-variabelt område 3 er nokså forskjellig mellom de to på grunn av rekombinasjonen av VH området med forskjellige D og JH sekvenser, nemlig at den CC49 y1 tunge kjede anvendte en Jh4, og den CC83 y1 anvendte en JH2

Den utstrakte DNA-sekvenshomologi 5' til de kodende områder i de CC49 og CC83 tungkjede variable områdegener viser at de to tungkjede variable områdegener var dannet fra de samme kimlinjeeksoner

Isolasion av VHaTAG, kimlinie forløpergen til det tunge gen til CC46. CC49. CC83 og CC92

Fremgangsmåten anvendt for å isolere kimlinjeforløpergenet til de tungkjede variable områder i CC 46, CC49, CC83 og CC92 var i det vesentlige de som ble anvendt til å isolere det CC49 tungkjede variable området med unntak av at DNA anvendt til å danne LMABDA-ZAP™ samlingen kom fra en irrelevant hydndomcellelinje, (dvs en cellelinje som produserer antistoffer som ikke binder seg tilfredsstillende til TAG72) En genomsamhng som inneholdt omtrent 900 000 plaque, ble kartlagt, hvonfra det ble isolert en positiv klon Den positive klon ble kalt pVHaTAG pVHoTAG var omtrent 5,2 kb, og størrelsen av DNA-innskuddet ble bestemt ved restriksjonsenzymkartlegging til å være omtrent 2,2 kb

DNA- sekvens av VhøTAG

De følgende ohgonukleotidpnmerer ble anvendt for å bestemme DNA-sekvensen til VhgtTAG

Den komplette nukleotidsekvens til VoTAG er vist i Figur 2

Isolasion av humane tunge konstante gener

Plasmidkonstruksjoner som inneholdt de forskjellige tung-kjede humane konstante områder (py1, py2, py3 og py4) ble gitt av Dr lian R Kirsch i the National Cancer Institute, Betseda, Maryland

Restriksjonsenzymkartlegging ble utført på disse gener for å bekrefte deres identitet Restnksjonskart for de humane konstante områder er beskrevet i Figur 21

Kimensk lett kiede

Muse CC49 V område

Hind III setet i det CC49 lettkjede genomiske DNA lokalisert på museintron området mellom J5 og Ck (se Max, Edward E et al, J Biol Chem 256, 5116

(1981), gikk tapt i kloningsprosedyren der hvor halvutfylt i Hind III setet ble ligert til halvutfylt i Spe I seter i LamBDA-ZAP vektoren Plasmid pRL101 (Figur 9) bar denne modifikasjon Intron Hind III setet ble regenerert som beskrevet i trinnene nedenfor for å muliggjøre at et Hind lll-Bam Hl humant kimlinje kappa lettkjede DNA-fragment (se Hieter, P et al, J Bio Chem 257, 1516 (1982) kunne ligeres direkte til det musevanable området Alle trinnene ble utført ved å anvende standard molekylærbiologiteknikker kjent for fagmenn og som kan finnes en håndbok slik som Manatis

Et 1,69 kb Barn Hl-Pst I fragment isoleres fra pRL101, beskrevet supra Et 2,96 kb Barn Hl-Pst I fragment isoleres fra pBluescnpt SK(-) (kjøpt fra Stratagene), beskrevet supra De to fragmenter blir så ligert og pRL103 nedenfor blir isolert

Plasmid pGB1 (beskrevet supra), ble digestert med Pst I og Hind III restnksjonsenzymer for å gi det nødvendige 1,03 kb intron-inneholdende fragment, og pRL103 ble også spaltet med Pst I og Hind III restnksjonsenzymer for å fjerne det lille fragmentet av DNA i polylinkeren

De resulterende fragmenter ble ligert med T4 DNA-ligase for å produsere et 5,68 kg plasmid, kalt pRL 104 Et delvis restnksjonskart over pGD1 og pRL 104 er vist nedenfor

Humant Ck område

Plasmid phum Ck ble oppnådd fra Dr John Roder, Mt Sinai Research Institute, Toronto, Ontario, Canada Plasmidet er dannet fra pBR322, med et 12 kb Barn Hl fragment som inneholder det humane Ck ekson innskutt i dette pBR322 er beskrevet på side 171 i Stratagenes 1987 katalog 12 kb Barn Hl fragment restriksjonskartet er vist nedenfor [fra Heiter, P et al, J Viol Chem 257, 1516(1982)]

Plasmid phum Ck ble spaltet med Hind III og Barn Hl restnksjonsenzymer for å gi et 5,0 kg fragment som inneholdt det humane Ck ekson pRL104 ble spaltet med Fsp I og Hind III restnksjonsenzymer for å gi et 4,2 kb fragment, som inneholdt de muse-lettkjede variable eksoner fra CC49

De to resulterende fragmenter ble forenet med T4 DNA-ligase for å produsere et 9,2 kb fragment blant blandingen av resulterende fragmenter Denne blanding ble spaltet med Barn I for å gi en 7,7 kb Barn Hl CC49 L kjede chimerisk konstruksjon med Barn I klebrige ender, som inneholder både de musevanable områdeeksoner og det humane konstantområdet (k) ekson Disse konstruksjoner anvender de humane forbedrersekvenser og musepromotorsekvensene

Det chimenske Barn Hl fragment som inneholder både de muse-lettkjede variabelt områdeeksoner (L og VJ) og det humane konstantområdet kappa (k) ekson, ble ligert inn i Barn I setet med plasmid pSV2neo (5,6 kb), et pBR322-denvert plasmid som inneholder det selekterbare markørgen neo (oppnådd fra ATCC) Tilstedeværelsen av det aktive neogen gjør en celle resistent overfor vekstinhibenng ved Geneticin, et neymycinlignende medikament også kalt G418

Det chimenske Gam Hl fragment ble innskutt inn i pSV2neo i begge orienteringer som vist nedenfor Begge transkripsjons-onenteringer i det chimenske lettkjede gen, i forhold til neo-genet, ble konstruert Plasmid pSV2neo ble hneansert i Barn Hl setet, defosforylert (i henhold til fremgangsmåten fremsatt i Aniatis) ved å anvende kalvetarm alkalisk fosfatase (for å forhindre selv-ligenng) og ligert med chimerisk CC49 L kjede Barn Hl fragmenter ovenfra

Transknpsjonsorientenngene til neo-genet og den CC49 chimenske lette kjede er angitt ved piler i pRL150 og pRL105 Delene dannet fra pSV2neo er angitt Disse plasmider ble renset i stor skala fra preparativ skala (1,0 I) ved ferm-entenng av E coli kloner som repliserte hvert av plasmidene De rensede plasmider ble anvendt til å innfør den chimenske CC49 lette kjede i SP2/0 plasmacytomceller som diskutert nedenfor

Muse CC83 \ A område og humant Ck område

Hind III setet i pRL200 som gikk tapt i klonmgsprosessen av den CC83 lette kjede, ble gjendannet av den samme grunn som for den CC49 lett-kjede chimenske konstruksjon Gjendannelsen ble utført som følger Plasmid pRL200 ble hneansert i et unikt Nhe I sete, og begge dets klebrige ender ble omdannet til butt-ender ved å utfylle med dNTP'er er DNA-polymerase I En Barn Hl fosforylert linker (kjøpt fra New England Biolabs) ble ligert til det utfylte setet Det nye plasmid er kalt pRL201 og er vist nedenfor

2 5 kb Barn Hl-Pst I fragmentet fra pRL201 som inneholdt det CC83 lettkjedevanabelt område genomiske DNA ble på passende måte ligert til 4kb Barn Hl-Pst I vektorfragmentet fra pRL104 som ble beskrevet tidligere i CC49 lett-kjede konstruksjonene og som allerede hadde det Hind lll-bærende intronfragment Det nye plasmid er kalt pRL202 og er vist nedenfor Det omtrentlig 5,05 kb Fsp l-Hind III fragment fra pRL202 ble isolert og ligert med det humane cK-inneholdende 5,0 kb Hind lll-Bam Hl fragment allerede beskrevet for den CC49 lett-kjede chimenske konstruksjon Dannelsen av den CC83 lett-kjedevektor ble utført fra dette punkt på en identisk måte som utført for den CC49 lette kjede Den resulterende 8,5 kb Barn Hl CC83 lettkjede chimenske konstruksjon ble også ligert til pSV2neo-Bam Hl (fosfatasebehandlet), og plasmider med begge mulige orienteringer av innskuddet ble oppnådd som vist i diagram nedenfor

Transknpsjonsorienteringene av neo-genet og den CC83 chimenske lette kjede er angitt ved piler i pRL203 og pRL 230 Disse plasmider ble renset i stor skala fra preparativ skala (1,0 I) fermentering i en kommersiell inkubator av E coli kloner som repliserte hvert av plasmidene De rensede plasmider ble anvendt for å innføre den chimenske CC83 lette kjede i SpP2/0 plasmacytomceller, som diskutert senere

Alle fire av de chimenske lettkjedeplasmidkonstruksjoner (pRL105, pRL150, pRL203 og pRL 230) kan lineanseres med å digestere med restriksjonsenzymet Aat II Aat II setet i plasmidene er i et område som ikke er vesentlig for ekspres-jonen av det chimenske lettkjedegen eller det selekterbare markørgen, neo

Chimenske tunge kieder

Humane Gamma konstant geneeksoner

Plasmidvektoren som blir anvendt til å utføre de chimenske tungkjedekonstruksjoner, er betegnet pSV2gpt, fremsatt i Mulligan og Berg, "Selection of animal cells that express the E coli gene coding for zanthine guanine phosphonbosyltransferase", Proe Nati Acad Sei (USA) 78,(4), 2072-2076 (1982) pSV2gpt er et pBR322 derivert plasmid som inneholder det selekterbare markørgen, guanin fosfonbosyl transferase (gpt), som kan anvendes til selektiv vekst i medier som inneholder mycifenolsyre For å fremstillt pSVgpt som mottaker for de humane C-> 1, Cy2, Cy3, Cy4 eksoner, ble det spaltet med Eco RI og Barn Hl Det spaltede DNA ble fraksjonert på en 4% polyakrylamidgel, og 4,5 kb vektorfragmentet ble utvunnet fra gelen ved elektroeluering som beskrevet i Maniatis Dette lineanserte plasmid ble betegnet pSV2gpt/R/B, et plasmidkart er vist i Figur 22 Det er istand til å motta fragmenter med Eco Rl-Bam Hl-ender

5' Hind III setene, tilstede på de humane Igd konstant-områdefragmenter, ble omdannet til Eco RI seter for dirigert kloning inn i Eco RI setet i pSV2-gpt For y1, y2, y3 og y4 ble Eco Rl-setet i vektor pBR322 anvendt

Cy1

Fragmentet som inneholder de humane Cy1 eksoner, ble oppnådd ved å spalte og lineansere py1 med Hind III fulgt av utfylling av de Hind III klebrige ender ved å anvende alle fire dNTP'er og Klenow fragmentet fra DNA-polymerase for å gjøre Hind III endene butte En Eco RI linker ble ligert til de butte ender for å erstatte Hind III setet med et Eco RI sete Denne konstruksjonen ble så spaltet med Eco RI og Barn I for å frigjøre et 7,8 kb fragment som inneholdt Cy1 eksonene Dette fragmentet ble kalt Cy1-7,8 kb

Fragmentet ble ligert inn i Eco Rl-Bam Hl setene i pSV2-gpt/R/B Denne vektors (pSV2-gpt-y1-7,2) utforming gjør det mulig for oss å innskyte et hvert muse tungkjede variabelt områdegen (med Eco RI ender) inn i Eco RI setet i de humane IgG tungkjede vektorer Mere spesifikt ble 125 ng av det humane Cy1-7,8 kg fragment ligert til 100 ng til den lineanserte pSV2-gpt-R/B vektor på 10 /il ved å anvende 400 enheter T4 DNA-hgase (oppnådd fra New England Biolabs) Frosne kompetente E coli DH1 celler fra Invitrogen (San Diego, CA) ble transformert med en ligenngsreaksjon i henhold ti lnvitrogen's fremgangsmåte Det resulterende plasmid ble betegnet pSV2gpty1-7,8 Et plasmidkart over pSV2gpty 1-7,8 er vist i Figur 23

I tillegg ble det dannet et annet kortere fragment som inneholdt Cy1 eksonene Bekymringer angående den totale størrelse av den chimenske tungkjedevektor, med et 7,8 kb Cy1 fragment, en 4,5 kb pSV2-gpt/R/B vektor og et CC49 vanabelt område på 1,9 kb (totalt = 14,2 kb) tilskyndet behovet for å redusere den store størrelse av 7,8 kb Cy1 Eco Rl-Bam Hl fragmentet Det kodende området på 7,8 kb Cy1 okkuperer bare den første 1/3 av 5" enden av fragmentet

Størrelsesreduksjon ble utført ved å omdanne et Pvu II sete i nedstrøms-retnmg til Barn Hl sete ved butt-ende tilsetning av en Barn Hl linker Hind III setet i py-1 ble omdannet til et Eco RI sete ved spalting av py-1 med Hind III, utfylling i 3'-enden for å danne en butt-ende og tilsetning av Eco RI linkere som ovenfor Pvu II setet 2,3 kb i nedstrømsretning ble omdannet til et Barn Hl sete ved påfølgende spalting med Pvu II og ligenng av Barn Hl linkere direkte til de butte Pvu II ender Denne konstruksjon ble så spaltet med Eco RI og Barn Hl for å frigjøre et 2,3 kb fragment som inneholdt Cy1-eksonene Det forkortede EcoRI-BamHI fragment (2,3 kb) inneholder fortsatt y1 eksonene og 3' polyadenylenngssekvensen Dette reduserer den totale vektorstørrelse med 5,5 kb, hvilket gjør den totale konstruksjon lettere å håndtere (totalt = 8,7 kb)

Omtrent 200 ng av det humane Cy1 2s,3 kb fragment ble ligert til 100 ng av den lineanserte plasmid pSV2pgt/R/B vektor i et volum på 10 /vi ved å anvende 400 enheter T4 DNA-ligase (New England Biolabs) Frosne kompetente £ coli celler, oppnådd fra Invitrogen, ble transformert med ligenngsreaksjonen i henhold til lnvitrogen's fremgangsmåte Det resulterende plasmid ble betegnet pSV2pgty1-2,3 Et plasmidkart over pSV2pgty1 -2,3 er vist i Figur 24

DNA-fragmenter som inneholder de andre tre humane IgG konstant områdeeksoner ble også isolert Cy2 eksonene ble utvunnet fra p lasmid py2 som et 4,0 kb Eco Rl-Bam Hl fragment Cy3 eksonene ble utvunnet fra plasmid py3 som et 8,0 kb Eco Rl-Bam Hl fragment Cy4 eksonene ble utvunnet fra plasmid Cy4 som et 7,6 kb Eco Rl-Bam Hl fragment Fragmentene ble ligert separat inn ipSV2gpt/R/B som beskrevet for Cy1-7,8 og Cy1-2,3 Plasmidkart over de resulterende plasmider er vist i Figur 25, pSV2gpt-y2, Figur 26, pSV2gpt-y3, og

Figur 27, pSV2gpt-y4

Tungkiede chimenske konstruksjoner

De fullstendige tungkjedevanabelt område humant y1 konstant område chimenske konstruksjoner ble dannet ved å innskyte et fragment som inneholdt muse tungkjedevanabelt områdeeksonene inn i plasmidene som inneholdt de humane y1 konstant område eksoner beskrevet som følger

Eco RI fragmenter som inneholdt de muse tungkjede variabelt områdegener fra CC49 og CC83 hybndomceller, ble så legert inn i hver av de y1-y4-inneholdende pSV2-gpt vektorer (pSV2gpt-y1, pSV2gpt-y2, pSV2gpt-y3, pSV2gpt-y4) som følger

CC49

Et fragment som inneholdt de tungkjede variabelt område eksoner som koder for det CC49 tungkjede variable området, ble fremstilt ved å spalte 14/vg pHH49 med 50 enheter Eco RI (oppnådd fra BRL) ved 37°C i 2 timer Den spaltede fraksjonen ble fraksjonert på en 4% polyakrylamidgel, og 1,9 kb Eco RI fragmentet som inneholdt de tungkjede variabelt område eksoner for CC49, ble utvunnet ved elektroeulenng som beskrevet av Maniatis Dette fragment ble betegnet f49R

Et fragment som inneholder 7,8 kb sekvensen som koder for y1 ble fremstilt som følger

Omtrent 50 fjg av vektoren pSV2gpt y1-7,8 ble spaltet med Eco RI Det resulterende fragment ble defosforylert (for å forhindre celleligenng) ved å anvende kalvetarm alkalisk fosfatase som beskrevet av Maniatis Fragmentet ble renset fra den 0,8% agorosegel ved elektroeluering Denne vektor ble betegnet pSV2gpty1-7,8/R

Eco RI setet er lokalisert 245 bp i oppstrømsretning fra transkripsjons-initienngssetene, og inneholder promotoren og de nødvendige vevs-spesifikke sekvenser for effektiv ekspresjon Intron-områdene 3' i de variabel områdegener inneholder muse-tungkjedeforbedrer sekvensene som er fraværende på de humane IgG tungkjede vektorer Derfor anvender de tungkjedechimenske vektorer både musepromotor og forbedrersekvenser

Omtrent 325 ng hneansert pVS2gpty1-7,8/R ble ligert med 188 ng f49R i et volum på 10 / j\ med 1 enhet T4 DNA-hgase (BRL) Frosne kompetente E coli AG-1 celler fra Stratagene ble transformert med ligenngsreaksjonen i henhold till deres fremgangsmåte Det resulterende plasmid ble betegnet p49y1-7,8 Figur 28 illustrerer er plasmidkart for p49y1-7,8

Omtrent 50 / jq av vektoren pSV2gpty1-2,3 ble digestert som for SV2gpty1-7,8 med Eco RI Det resulterende fragment ble defosforylert ved å anvende kalvetarm alkalisk fosfatase som beskrevet av Maniatis Fragmentet ble renset fra en 0,8% agarosegel ved elektroeluering Dette lineanserte plasmid ble betegnet pSV2gpty1-2,3/R

Omtrent 300 ng av det lineanserte plasmid pSV2pgty1-2,3/R ble ligert med 188 ng av f49R i et volum på 10//I med 1 enhet T4 DNA-hgase (BRL) Frosne kompetente E coli AG-1 celler fra Stratagene (La Jolla, CA) ble transformert med ligenngsreaksjonen i henhold til deres fremgangsmåte Det resulterende plasmid ble betegnet p49y1 -2,3 Figur 29 illustrerer et plasmidkart for p49y1 -2,3

Plasmider pSV2gpt-y2, pSV2gpt-y3 og pSV2gpt-y4 ble spaltet separat med Eco RI for å produsere de lineære plasmidvektorer henholdsvis pSV2gpt-y2/R, pSV2gpt-y3/R og pSV2gpt-y4/R Hver av disse tre lineære plasmidvektorer ble ligert separat med f49R Plasmidkart over de resulterende plasmider er vist i Figur 30, p49-y2, Figur 31, p49-y3, og Figur 32, p49-y4

CC83

Chimenske konstruksjoner som inneholder det tungkjede variable området CC83, ble dannet på lik måte som de chimenske konstruksjoner for CC49 Et fragment som inneholder de tungkjede variabelt områdeeksoner som koder for det CC83 tung kjedeområdet, ble fremstilt ved å spalte 19//g pHS83 med 50 enheter Eco RI (oppnådd fra BRL) ved 37°C i 2 timer Den spaltede fraksjon ble fraksjonert på en 4% polyakrylamidgel, og 2,9 kb Eco RI fragmentet som inneholdt de tungkjede variabelt område eksoner fra CC83, ble utvunnet ved elektroeluering som beskrevet i Maniatis Dette fragment ble betegnet f83R

Omtrent 300 ng av det lineanserte plasmid pSV2gpty1-7,8/R, oppnådd som ovenfor, ble ligert med 270 ng f83R ei et volum på 10 //I med en enhet T4 DNA - igase (oppnådd fra BRL) Frosne kompetente E coli AG-1 celler, oppnådd fra Stratagene, ble transformert med ligenngsreaksjonen i henhold til Stratagenes fremgangsmåte Det resulterende plasmid ble betegnet p83y1-7,8 Figur 33 illustrerer plasmidkartet til p83y1-7,8

Omtrent 90 ng lineansert plasmid pSV2gpty1-2,3/R, oppnådd som ovenfor, ble ligert med 270 ng f83R i et volum på 10//I med 1 enhet T4 DNA-ltgase (BRL) Frosne kompetente E co//-AG-1 celler fra Stratagene ble transformert med ligenngsreaksjonen i henhold til deres fremgangsmåte Det resulterende plasmid ble betegnet p83y1,2,3 Figur 34 illustrerer plasmidkartet til p83y1 -2,3

Plasmider pSV2gpt-y2, pSV2gpt-y3 og pSV2gpt-y4 ble spaltet separat som ovenfor for pSV2gpt-y2/R, pSV2gpt-y3/R og pSV2gpt-y4/R med Eco RI for å produsere de lineære plasmidvektorer henholdsvis pSV2gpt-y2/R, pSV2gpt-y3/R og pSV2gpt-y4/R Hver av disse 3 lineære plasmidvektorer ble ligert separat med f83R Plasmidkart for de resulterende plasmider er vist i Figur 35, p83-y2, Figur 36, p83-y3 og Figur 37, p83-y4

Alle ti av de sirkulære plasmidkonstruksjoner (p49y1-7,8, p49y1-2,3, p83y1-7,8, p83y1-2,3. p49y2, p83-y2, p49-y3, p49-y4 og p83-y4) ble så lineansert for transformasjon ved spalting med restriksjonsenzym Nde I Nde I setet i plasmidene er i et område som ikke er vesentlig for ekspresjon av det chimenske immunoglobulingen eller det selekterbare markørgen pgt Plasmidene trenger å være i en lineær form før transformasjon inn i en mottagercelle for å forbedre selektert integrering av DNA inn i vertscellegenom DNA anvendelse av ammopterin og tymidin (for videre å stenge guaninveien) funnet å være unødvendig

Dannelse av kloner som produserer chimensk 44 antistoff

CH44-1

49K-13-13 celler ble anvendt som target for chimenske tungkjedekonstruksjoner Cellene ble transformert med 20 fjg chimensk tungkjede DNA-vektor (p49y1-7,8 eller p49y1-2,3) hneansert ved Nde I spalting Transformasjon ved elektroporenng ble utført som ovenfor for chimenske lette kjeder

Seleksjon etter 48 timer ble imidlertid utført ved å erstatte det Geneticin-inneholdende medium med medium som inneholdt Geneticin og 0,3/<y>g/ml mykofenolsyre, 250 //g/ml xantin og 10//g/ml hypoxantm

Transformerte celler vokste til makroskopisk synlige kolonier på 14 dager På det tidspunktet ble 50 / j\ supematant fjernet og målt ved ELISA metoder for å binde seg til TAG og ekspresjon av humant IgG konstant område Brønner som inneholdt celler med positivt TAG-binding, ble ekspandert til 24-brønns plater med ferskt medikamentseleksjonsmedium og tillatt å vokse i 3-7 dager

Subkloning ble utført som følger Levende celletall ble bestemt, og cellene ble platet ut i to 96-brønns plater En plate mottok 50 levende celler, og den andre mottok 250 levende celler De ikke-subklonete celler ble ekspandert til 6-brønns plater inntil celletettheten var tilstrekkelig til å tillate lagring i nitrogen i væskefomn i tilfellet re-subkloning ville være nødvendig

Etter subkloning ble de klonene som utøvet den høyeste chimenske antistoffproduksjon, selektert for chimensk antistoffproduksjon i bioreaktorer

CH44-2

Fremgangsmåtene anvendt til sekvensielt å transformere Sp2/0-plasmacytomcellene i konstruksjonen i CH44-1, ble gjentatt med det unntak at 20 fjg P49-y2 ble anvendt som den chimenske tungkjedevektor

CH44-3

Fremgangsmåtene anvendt til sekvensielt å transformere Sp2/0 plasmacytomcellene i konstruksjonen i CH44-1 ble gjentatt med det unntak at 20 fjg p49-y3 ble anvendt som tungkjedevektoren

CH44-4

Fremgangsmåtene anvendt til sekvensielt å transformere Sp2/0 plasmacytomcellene i konstruksjonen i CH44-1 ble gjentatt med det unntak av 20 fig p49-y4 ble anvendt som tungkjedevektoren

Dannelse av kloner som produserer chimensk 88 antistoff

CH88-1

Fremgangsmåtene anvendt til sekvensielt å transformere Sp2/0 plasmacytomcellene i konstruksjonen i CH44-1 ble gjentatt med følgende unntak

83K-26-5, 83K-34-10 og 83K-42-2 celler som viste produksjon av chimensk CC83 lett kjede, ble transformert som beskrevet i transformasjonen av CH44-1, med det unntak at 20 fjg (p83y1-7,8 eller p83y1-2,3, pSV2gpt vektoren som inneholder det CC83 tung-kjedegen, ble anvendt som tungkjedevektor

CH88-2

Fremgangsmåtene anvendt til sekvensielt å transformere Sp2/0 plasmacytomcellene i konstruksjonen av CH88-1, ble gjentatt med det unntak at 20 fjg p83-y2 ble anvendt som tungkjedevektor

CH88-3

Fremgangsmåtene anvendt til sekvensielt å transformere Sp2/0 plasmacytomcellene i konstruksjonen i CH88-1, ble gjentatt med det unntak at 20 fjg p83-y3 ble anvendt som tungkjedevektor

CH88-4

Fremgangsmåtene anvendt til sekvensielt å transformere Sp2/0 plasma-cytocellene i konstruksjonen i CH88-1, ble gjentatt med det unntatt at 20 fjg p83-y4 ble anvendt som tungkjedevektor

Det lineanserte DNA ble etanolpresipitert og videre løst 110-20 mikroliter PBS Etter 15 minutter på is, ble elektroporenng utført ved å anvende et Gen Pulser elektroporenngsapparat med tilsatt kapasitansforøker (BioRad) ved 0,2 kilovolt og 960 /yF Tidskonstanten ( r) var hovedsakelig omtrent 26 millisek

Etter transformasjon ble celler tillatt å gjenvinne seg på is 115 minutter for å tillatte avslapning av urolige membraner Etterpå ble cellene suspendert 14 ml RPMI 1640 medium som inneholdt 5% føtalt kalveserum (RPMI+) og overført til en 96 eller 24 brønns plate For å minste sannsynligheten for mer enn en medikamentresistent celle pr brønn, ble cellene også fortynnet 10 ganger i medium (RPMI+) og platet ut på en annen 96-brønns (eller 24-brønns) plate Cellesuspensjonen ble inkubert ved 37°C og 5% CO2 atmosfære

Etter 48 timer (for å tillate ekspresjon av medikament-resistens), ble mediet fjernet og erstattet med medium som inneholdt 1 mg/ml Geneticin

Etter 7-10 dager ble Geneticin-resistente kloner sub-kultivert, og cellene kartlagt for chimenske lette kjeder ved cytofarging

Cytofarging

Små prøvemengder av celler ble pelletert på en glassplate ved å anvende en cytospin-2 sentrifuge (Shandon, Inc ) Etter lufttørking ble cellene fiksert i eddiksyre/etanol (5 deler eddiksyre/95 deler etanol) Etter skylling 3 ganger med PBS (uten CA<+2> og Mg<+2>), ble platene plassert i et fuktig kammer (100% RH) og farget t 20 minutter med 20 //I geiteanti- human Kappa-FITC, et fluorescerende fargekonjugert antistoff som er spesifikt for humane kappa lette kjeder Det konjugerte antistoff ble fortynnet 1 3 med 1% BSA i PBS Etter vasking over natten med PBS, ble platene montert med fluoromont-G, histologisk monterings-medium (oppnådd fra Southern Biotech) under et dekke Platene ble observert med en Olympus model BH-2 mikroskop utstyrt med en epi-opplysnings UV til-heftnmg

Basert på intensiteten av fluorescens, ble konstruksjonene med orienteringen av den lette kjede i motsatt transknpsjonsonentering i forhold til transknpsjonsretningen av neo<r->genet i vektoren, funnet å gi den høyeste L-kjede ekspresjon Derfor var pRL 105 den foretrukne CC49L kjede konstruksjon og pRL230 var den favoriserte CC83L kjede konstruksjon Som et resultat av disse forsøk ble de følgende chimenske lettkjede-inneholdende cellelinjer (dannet fra Sp2/0) anvendt til de målrettede transformasjoner

For den CC49 chimenske L-kjede ble det oppnådd en cellelinje (49K-13-13) som uttrykte den chimenske lette kjede dannet fra CC49 Denne cellelinje ble anvendt til alle videre målrettede transformasjoner med chimenske tungkjede-vektorertil konstruksjoner hvor man anvendte den chimenske CC49 lette kjede

For den CC83 chimenske lette kjede ble det oppnådd 3 cellelinjer (83K-26-5, 83K-34-10 og 83K-42-2) som uttrykte den chimenske lette kjede dannet fra CC83 En cellelinje (83K-26-5) farget sterkere enn de andre og hadde lokaliserte områder med cytoplasmatisk immunofluorescens Alle tre cellelinjer ble sammenlignet for deres relative evne til å produsere høye nivåer av chimensk antistoff etter transformasjon med den chimenske CC83 g1 tungkjede vektor Det ble dannet flere kloner som uttrykte chimenske antistoffer fra elektroporenng av 83K-34-10 target enn fra hver av de to andre chimenske lettkjede target cellelinjer Derfor ble den 83K-34-10 lett-kjedecellelinje anvendt som target for videre elektroporennger med chimenske tungkjede vektorer til konstruksjoner som inneholdt det CC83 lettkjede variable området

Dannelse av gpt- resistente kloner som bærer CC49 og CC83 chimenske H- kiede konstruksioner

Før transformasjon med pSV2-gpt-vektorer som inneholder chimenske tungkjedekonstruksjoner, ble det opprettet medikament-seleksjon for inhibering av vekst av utransformerte Sp2/0 plasma-cytomceller [oppnådd fra den Amerikanske Type Kultur Kolleksjon (ATCC)] Betingelser for medikamentseleksjon av celler transformert med pSV2-gpt vektorer var vanskeligere å opprette E coli gpt genet, som koder for enzymet guanosin fosfonbosyl transferase, overfører evnen til å anvende xantin og hypoxantin som substrater for biosyntese av guanin når guaninmetabohseringsveien i pattedyr inhiberes av mykofenolsyre (MPA)

Publiserte verdier for konsentrasjonene av PMA som tillater vekst av andre lymfoidcellelinjer transformert med pSV2-gpt vektorer, ble funnet å være nesten to størrelsesordener for høye til å tillate vekst av Sp2/0-celler transformert med pSV2-gpt vektorer i vårt vevskulturmiljø Videre ble en konsentrasjon på 0,1 //g/ml av MPA funnet å være optimal for seleksjon av gpt resistens I tillegg ble

Verifisering av konstruksion

Siden EcoRI fragmentene kan ligeres i begge orienteringer, ble den korrekte orientering bestemt ved spalting med Nco I I konstruksjonene fremsatt ovenfor blir korrekte ligennger for plasmidkonstruksjon bekreftet ved å utføre restriksjonsenzymsetekartlegging på plasmidet Restriksjonsenzymkartet dannet fra restriksjonsenzymspalting og gelelektroforese blir sammenlignet med den som kan dannes teoretisk fra de enkeltvise startfragmenter På grunn av erfaring med transknpsjonsorientenngen i lettkjede vektorene, ble tungkjede vektorene konstruert bare i den motsatte transkripsjonsonentering i forhold til gpt-genet

Transformasion av plasmider inn i museplasmacvtomceller

Når både de lettkjede og tungkjede chimenske gener ble transformert inn i samme celle, blir tetramere (H2L2) immuno-globuliner oppnådd Syntese og sekresjon av disse "chimenske" antistoffproteiner ble utført ved å innføre de chimenske (muse V humant C område) gener inn i museplasmacvtomceller

(Sp2/0)

Transformasjon ble oppnådd ved elektroporering [Sahagan, B G et al,

J Immunology 137,1066 (1986)]

Ekspresjon av chimenske (muse V humant C område) gener i transformerte museplasmacvtomceller (Sp2/0) oppnås ved å anvende to forskjellige teknikker I en måte kan forskjellige forhold mellom lettkjedegener og tungkjedegener innføres sammen Dette er referert til som kotransformasjon Alternativt kan stabile kloner som bærer det chimenske lettkjedegen, oppnås og videre anvendes i en annen måte referert til som målrettet transformasion I hver fremgangsmåte er målet å oppnå kloner som inneholder gener for både H-kjeden og L-kjeden som produserer intakt H2L2 immunoglobulm nevnt ovenfor

A_ Kotransformasioner

Kotransformasjon involverer transformasjon av celler med begge medikamentresistensmarkører på samme tid og videre seleksjon med ett eller begge medikamenter Kotransformasjon av tungkjede og lettkjede vektorer (i forhold på henholdsvis 1 1 og 1 10) ble opprinnelig utført ved å anvende bare neo-seleksjon Det ble oppnådd neo-resistente cellelinjer som uttrykte de første chimenske lgG1 antistoffer med demonstrerbar TAG72 bindingsaktivitet Kotransformasjon ble utført i overensstemmelse med fremgangsmåtene fremsatt i Corneha Gorman, "High Efficiency Gene Transfer into Mammalian Cells", DNA Clonin<q>, Vol II, D M Glover utg IRL Press, Oxford, England (1985)

B_ Målrettede transformasjoner

Konstruksjoner som inneholder lette og tunge chimenske immunoglobulingener ble sekvensielt transformert inn i Sp2/0 museplasmacvtomceller Målrettet transformasjon involverer transformasjon og seleksjon med en vektor som inneholder et første medikamentresistensgen (dvs Geneticin for den chimenske lettkjedegenvektor), fulgt av transformasjon og seleksjon med en vektor som inneholder et annet medikamentresistensgen (dvs mycofenolsyre for den chimenske tungkjedegenvektor)

Neo- seleksion

Før transformasjon med pSV2-neo vektorer som inneholder chimenske lettkjede konstruksjoner, ble medikamentseleksjonsbetingelserfor inhibenng av vekst av ikke-transformerte Sp2/0 plasmacytomceller [oppnådd fra den Amerikanske Type kultur kolleksjon (ATCC)], etablert ved titrenng av det neomycin-lignende medikament, Geneticin (GIBCO) Publiserte verdier for konsentrasjoner av Geneticin anvendt til medikamentseleksjon vanerte fra 100-1 000 //g/ml Konsentrasjoner over 400 //g/ml ble funnet å forhindre vekst av Sp2/o-celler i våre vevskultur-omgivelser

Konstruksion av lettkiede- inneholdende celler

Sp2/0 museplasmacvtomceller ble i utgangspunktet transformert med lettkjede-inneholdende pSV2-neovektorer som følger Celler ble dyrket i RPMI

1640 medium med 5% føtalt kalveserum Celler ble vasket i PBS og suspendert til en konsentrasjon av 1 x 10<7> levende celler/ml PBS 0,8 ml celler ble overført til en elektoporeringskuvette (på is) som inneholdt 20 //g lettkjede-inneholdende pSV2-neovektor (pRL105 og pRL150 for CC49 chimensk lettkjede og pRL 203 og pRL230 for CC83 chimensk L-kjede) hneansert med Aat II restnksjonsendo-nuklease Aatll ble inaktivert ved å oppvarme prøvene til 65°C 110 minutter

Det lineanserte DNA ble etanolpresipitert og videre løst 110-20 mikroliter PBS Etter 15 minutter på is, ble elektroporering utført ved å anvende et Gen Pulser elektroporenngsapparat med tilsatt kapasitansforøker (BioRad) ved 0,2 kilovolt og 960 jjF Tidskonstanten (r) var hovedsakelig omtrent 26 millisek

Etter transformasjon ble celler tillatt å gjenvinne seg på is 115 minutter for å tillatte avslapning av urolige membraner Etterpå ble cellene suspendert 14 ml RPMI 1640 medium som inneholdt 5% føtalt kalveserum (RPMI+) og overført til en 96 eller 24 brønns plate For å minste sannsynligheten for mer enn en medikamentresistent celle pr brønn, ble cellene også fortynnet 10 ganger i medium (RPMI+) og platet ut på en annen 96-brønns (eller 24-brønns) plate Cellesuspensjonen ble inkubert ved 37°C og 5% CO2 atmosfære

Etter 48 timer (for å tillate ekspresjon av medikament-resistens), ble mediet fjernet og erstattet med medium som inneholdt 1 mg/ml Geneticin

Etter 7-10 dager ble Geneticin-resistente kloner sub-kultivert, og cellene kartlagt for chimenske lette kjeder ved cytofarging

Cytofarging

Små prøvemengder av celler ble pelletert på en glassplate ved å anvende en cytospin-2 sentrifuge (Shandon, Inc ) Etter lufttørking ble cellene fiksert i eddiksyre/etanol (5 deler eddiksyre/95 deler etanol) Etter skylling 3 ganger med PBS (uten CA+2 og Mg<+2>), ble platene plassert 1 et fuktig kammer (100% RH) og farget 120 minutter med 20 /<y>l geiteanti- human Kappa-FITC, et fluorescerende fargekonjugert antistoff som er spesifikt for humane kappa lette kjeder Det konjugerte antistoff ble fortynnet 1 3 med 1% BSA i PBS Etter vasking over natten med PBS, ble platene montert med fluoromont-G, histologisk monterings-medium (oppnådd fra Southern Biotech) under et dekke Platene ble observert med en Olympus model BH-2 mikroskop utstyrt med en epi-opplysnings UV til— heftning

Basert på intensiteten av fluorescens, ble konstruksjonene med orienteringen av den lette kjede i motsatt transknpsjonsonentering i forhold til transknpsjonsretningen av neo<r->genet i vektoren, funnet å gi den høyeste L-kjede ekspresjon Derfor var pRL 105 den foretrukne CC49L kjede konstruksjon og pRL230 var den favoriserte CC83L kjede konstruksjon Som et resultat av disse forsøk ble de følgende chimenske lettkjede-inneholdende cellelinjer (dannet fra Sp2/0) anvendt til de målrettede transformasjoner

For den CC49 chimenske L-kjede ble det oppnådd en cellelinje (49K-13-13) som uttrykte den chimenske lette kjede dannet fra CC49 Denne cellelinje ble anvendt til alle videre målrettede transformasjoner med chimenske tungkjede-vektorer til konstruksjoner hvor man anvendte den chimenske CC49 lette kjede

For den CC83 chimenske lette kjede ble det oppnådd 3 cellelinjer (83K-26-5, 83K-34-10 og 83K-42-2) som uttrykte den chimenske lette kjede dannet fra CC83 En cellelinje (83K-26-5) farget sterkere enn de andre og hadde lokaliserte områder med cytoplasmatisk immunofluorescens Alle tre cellelinjer ble sammenlignet for deres relative evne til å produsere høye nivåer av chimensk antistoff etter transformasjon med den chimenske CC83 g1 tungkjede vektor Det ble dannet flere kloner som uttrykte chimenske antistoffer fra elektroporering av 83K-34-10 target enn fra hver av de to andre chimenske lettkjede target cellelinjer Derfor ble den 83K-34-10 lett-kjedecellelinje anvendt som target for videre elektroporennger med chimenske tungkjede vektorer til konstruksjoner som inneholdt det CC83 lettkjede variable området

Dannelse av qpt- resistente kloner som bærer CC49 og CC83 chimenske H- kiede konstruksjoner

Før transformasjon med pSV2-gpt-vektorer som inneholder chimenske tungkjedekonstruksjoner, ble det opprettet medikament-seleksjon for inhibenng av vekst av utransformerte Sp2/0 plasma-cytomceller [oppnådd fra den Amerikanske Type Kultur Kolleksjon (ATCC)] Betingelser for medikamentseleksjon av celler transformert med pSV2-gpt vektorer var vanskeligere å opprette E coli gpt genet, som koder for enzymet guanosin fosfonbosyl transferase, overfører evnen til å anvende xantin og hypoxantin som substrater for biosyntese av guanin når guaninmetabohseringsveien i pattedyr inhiberes av mykofenolsyre (MPA)

Publiserte verdier for konsentrasjonene av PMA som tillater vekst av andre lymfoidcellelinjer transformert med pSV2-gpt vektorer, ble funnet å være nesten to størrelsesordener for høye til å tillate vekst av Sp2/0-celler transformert med pSV2-gpt vektorer i vårt vevskulturmiljø Videre ble en konsentrasjon på 0,1 //g/ml av MPA funnet å være optimal for seleksjon av gpt resistens l tillegg ble anvendelse av aminoptenn og tymidin (for videre å stenge guaninveien) funnet å være unødvendig

Dannelse av kloner som produserer chimensk 44 antistoff

CH44-1

49K-13-13 celler ble anvendt som target for chimenske tungkjedekonstruksjoner Cellene ble transformert med 20 //g chimensk tungkjede DNA-vektor (p49y1-7,8 eller p49y1-2,3) lineansert ved Nde I spalting Transformasjon ved elektroporenng ble utført som ovenfor for chimenske lette kjeder

Seleksjon etter 48 timer ble imidlertid utført ved å erstatte det Genettcin-mneholdende medium med medium som inneholdt Geneticin og 0,3//g/ml mykofenolsyre, 250 / jgjm\ xantin og 10//g/ml hypoxantm

Transformerte celler vokste til makroskopisk synlige kolonier på 14 dager På det tidspunktet ble 50 //I supematant fjernet og målt ved ELISA metoder for å binde seg til TAG og ekspresjon av humant IgG konstant område Brønner som inneholdt celler med positivt TAG-bmding, ble ekspandert til 24-brønns plater med ferskt medikamentseleksjonsmedium og tillatt å vokse i 3-7 dager

Subkloning ble utført som følger Levende celletall ble bestemt, og cellene ble platet ut i to 96-brønns plater En plate mottok 50 levende celler, og den andre mottok 250 levende celler De ikke-subklonete celler ble ekspandert til 6-brønns plater inntil celletettheten var tilstrekkelig til å tillate lagring i nitrogen i væskeform i tilfellet re-subkloning ville være nødvendig

Etter subkloning ble de klonene som utøvet den høyeste chimenske antistoffproduksjon, selektert for chimensk antistoffproduksjon i bioreaktorer

CH44-2

Fremgangsmåtene anvendt til sekvensielt å transformere Sp2/0-plasmacytomcellene i konstruksjonen i CH44-1, ble gjentatt med det unntak at 20 //g P49-y2 ble anvendt som den chimenske tungkjedevektor

CH44-3

Fremgangsmåtene anvendt til sekvensielt å transformere Sp2/0 plasmacytomcellene i konstruksjonen i CH44-1 ble gjentatt med det unntak at 20 fjg p49-y3 ble anvendt som tungkjedevektoren

CH44-4

Fremgangsmåtene anvendt til sekvensielt å transformere Sp2/0 plasmacytomcellene i konstruksjonen i CH44-1 ble gjentatt med det unntak av 20 jjg p49-y4 ble anvendt som tungkjedevektoren

Dannelse av kloner som produserer chimensk 88 antistoff

CH88-1

Fremgangsmåtene anvendt til sekvensielt å transformere Sp2/0 plasmacytomcellene i konstruksjonen i CH44-1 ble gjentatt med følgende unntak

83K-26-5, 83K-34-10 og 83K-42-2 celler som viste produksjon av chimensk CC83 lett kjede, ble transformert som beskrevet i transformasjonen av CH44-1, med det unntak at 20 fjg (p83y1-7,8 etler p83y1-2,3, pSV2gpt vektoren som inneholder det CC83 tung-kjedegen, ble anvendt som tungkjedevektor

CH88-2

Fremgangsmåtene anvendt til sekvensielt å transformere Sp2/0 plasmacytomcellene i konstruksjonen av CH88-1, ble gjentatt med det unntak at 20 fjg p83-y2 ble anvendt som tungkjedevektor

CH88-3

Fremgangsmåtene anvendt til sekvensielt å transformere Sp2/0 plasmacytomcellene i konstruksjonen i CH88-1, ble gjentatt med det unntak at 20 fjg p83-y3 ble anvendt som tungkjedevektor

CH88-4

Fremgangsmåtene anvendt til sekvensielt å transformere Sp2/0 plasma-cytocellene i konstruksjonen i CH88-1, ble gjentatt med det unntatt at 20 fjg p83-y4 ble anvendt som tungkjedevektor

Dannelse av kloner som produserer chimensk 84 antistoff

På grunn av den høye grad av sekvenslikhet mellom de tungkjede variable områder i CC49 og CC83, ble det dannet chimenske antistoffer hvis lette og tunge kjeder var dannet fra forskjellige foreldre ved blandede målrettede transformasjoner For å danne begge "blandede" kombinasjoner, ble de chimenske tungkjede y1 isotype vektorer i CC49 og CC83 elektroporert inn i de chimenske lettkjedetargets henholdsvis 83K34-10 og 49K-13-13 De resulterende cellelinjer ble betegnet CH48-1 og CH84-1, hvor den første numeriske betegnelse representerer henholdsvis tungkjede- og lettkjede-foreldrene For eksempel representerer CH48-1 y1 isotypen med den tunge kjede dannet fra CC49 og den lette kjede dannet fra CC83

Det CH48-1 sammensatte antistoff bandt seg ikke til TAG72 Dette var ikke forårsaket av den manglende evne til å lage ekte chimensk antistoff, siden de fleste medikamentresistente cellelinjer produserte chimensk IgG (som bestemt ved ELISA analyse ved å anvende geite anti-human IgG felle med geite anti-human IgG-alkalisk fosfatase som probe) Hvis noen bindingsaffinitet var tilstede, var den signifikant mindre enn det som ble observert for første generasjons antistoffet B72.3, som hadde omtrent en størrelsesorden mindre affinitet for TAG72 enn både CC49 og CC83

Overraskende nok, bandt CH84-1 seg til TAG72 med affinitet hk begge foreldre Dette nye antistoff ble dannet nytt i vårt laboratorium og er ennå ikke blitt påvist i naturen

Konkurransestudier ble foretatt for å bestemme spesifisiteten av dette nye, blandede antistoff, CH84-1 Det bør bemerkes at både CC49 og CC83 utøver noen grad av kompetitiv gjenkjennelse for TAG72 antigenet Det ble funnet at CH84-1 konkurrerte mer med CC49 for binding til TAG72 enn det gjorde med CC83 Dette ville indikere at spesifisiteten for binding til TAG72 ligger i den lette kjede

Humane y2, -3, og -4 isotyper ble også dannet med dette blandede antistoff, og produserte CH84-2, CH84-3, CH84-4 kloner

CH84-1

Fremgangsmåten anvendt til sekvensielt å transformere Sp2/0 plasmacytomcellene i konsentrasjonen i HC44-1, ble gjentatt med følgende unntak

49K-13-13 celler, som viste produksjon av CH44 lett kjede ved cytofarging, ble så transformert som beskrevet i det transformerte i CH44-1, med det unntak at 20 fjg p83y1-2,3, pSV2gpt vektoren som inneholder CH83 tungkjedegenet, ble substituert for p49y1-2,3, pSV2gpt vektoren som inneholder CH44 tungkjedegenet

CH84-2

Fremgangsmåtene anvendt til sekvensielt å transformere Sp2/0 plasmacytomcellene i konstruksjonen i CH84-1, ble gjentatt med det unntak av 20 fjg p83-y2, ble substituert for p83y-2,3

CH84-3

Fremgangsmåtene anvendt til sekvensielt å transformere Sp2/0 plasmacytomcellene i konstruksjonen i CH84-1, ble gentatt med det unntak at 20 fjg p83-y3 ble substituert for p83y1-2,3

CH84-4

Fremgangsmåtene anvendt til sekvensielt å transformere

Sp2/0 plasmacytomcellene i konstruksjonen i CH84-1, ble gentatt med det unntak at 20 fjg p83-y4 ble substituert for p83y1-2,3

Rensing av rekombinante antistoffer

Celler som uttrykte de chimenske antistoffer ble fjernet ved sentrifugenng fra kulturmediet, og mediet ble filtrert gjennom et 0,2 fim filter Chimenske antistoffer ble renset i to trinn fra kultursupernatanter I det første trinn av rensingen ble det anvendt en protein A affimtetspatron (Nygene Corporation, Yonkers, NY) i henhold til produsentens beskrivelser Opp til 1,0 I kultur-supematant ble passert gjennom en patron med kapasitet på 1 mg ved 5 ml/min Patronen ble vasket med fosfatbufret saltvann (PBS) for å fjerne spor av albumin Det chimenske antistoff ble utvunnet ved eluering med 0.5M natnumnitratbuffer, pH 3,0 pH i fraksjonene som inneholdt det chimenske antistoff, ble umiddelbart justert til nøytralitet med en 1M løsning av Trizma base Sluttrensing ble oppnådd fra denne løsning etter konsentrasjon på en Amicon centncon 30 enhet, ved gelfiltrenng ved å anvende en Pharmacia Superose 12 HR 16/5 kolonne som beskrevet av produsenten (Pharmacia, Piscataway, NJ)

EKSEMPEL Dannelse av et immunoglobulm som inneholder det muse vVjaTAq kimlmie variable området

De følgende eksempler er fremsatt for å gi til den dyktige fagmann en reproduserbar teknikk for fremstilling av et antistoff som har et VH område kodet for av en DNA-sekvens dannet fra VHaTAG

Komponenter for et VHaTAG tungkiedegen som kan uttrykkes

Det kan dannes et muse-humant chimensk antistoff som inneholder det muse VHaTAG kimlinje tungkjedevariable området, et lettkjedevariabelt område som er komplementært med VnaTAG VH, slik som enten det CC49 eller CC83 muse lettkjedevanable området, og human konstante områder

2,2 kb Hind Ili kimlinje DNA-fragmentet som inneholder VHaTAG VH eksonsekvensen, anvendes som templat for å oppnå et funksjonelt rearrangert VnaTAg variabelt område Det muse-genomiske J-C/j mtron området anvendes som kilde for muse-tungkjedeforbedrersekvensene Dette sistnevnte området oppnås fra plasmid pNP9 (se eksempel ovenfor på "Isolation of CC49 Heavy Chain Variable Region") Figur 38 viser hele reaksjonen for fremstillingen av hybridgenet basert på fremgangsmåten til Horton et al, (1989), supra Fire oligonukleotider (oligoer) er utformet for å anvendes i en enzymatisk amplifisering og modifisering av target DNA Oligo 1 basepartilpasses til 5' enden av VHaTAG som spenner over EcoRI setet som er 249bp 5' i forhold til ATG initienngskodon Oligo 2 basepartilpasses til sekvenser komplenentære til 3'-enden i VhoTAG eksonet og inneholder også sekvenser som koder for et D-segment D-segment sekvensene i Oligo 2 basepartilpasses ikke med noen VHaTAG sekvenser Oligo 3 inneholder sekvenser komplementære med 5'-enden i musegenom J- C/ j området og inkorporerer sekvenser som koder for D-segmentet (samme som i Oligo 2) og J-segmentet Oligo 4 basepartilpasses til 3'-enden i J-C/ j området og inneholder sekvenser komplementære med EcopRI setet lokalisert 1219 pb 3' i forhold til JH4 Sekvensene for disse oligoer følger

I dette eksempel er D-sekvensen SP2.3 tatt fra den publiserte sekvens til Kurosawa og Tonegawa J Exp Med , 155 201 (1982) D-sekvensen er vist i fremhevet type i oligoer 2 og 3 Ethvert annet karakterisert muse- eller humant D-segment kan anvendes ved å substituere deres sekvens i disse posisjoner i Oligo 2 og 3

J-segmentet i Oligo 3 er understreket Det er muse Jh4 tatt fra den publiserte sekvensen til Gough og Bernard Proe Nati Acad Sei (USA), 78 509

(1981) Inklusjonen av et hvilket som helst annet muse- eller humant J-segment kan gjøres ved substitusjon av deres sekvenser for sekvensen til Jh4 i Oligo 3

I Oligo 1 og 4 er EcoRI setene (GAATTC) vist i kursiv

Samling av intakte VH aTAG gener

To separate DNA-amplifikasjonsreaksjoner utføres ved å anvende komponentene beskrevet ovenfor DNA-amplifisenngsreaksjon #1 kopierer VnaTAG sekvensen og tilføyer et D-segment til dens 3'-ende DNA-amplifisenngsreaksjon #2 kopierer muse-intronsekvensene som inneholder tungkjedeforbedrersekvensene og tilføyer D og J-segmentene kodet for i oligo 3 De amplifiserte produkter fra reaksjon 1 og 2 blir gelrenset, kombinert, og oligoer 1 og 4 tilsettes for å starte reaksjon #3 I reaksjon 3, basepartilpasses produktene fra reaksjon 1 og 2 over deres felles D-sekvenser Videre DNA-amplifisenng fra oligoer 1 og 4 gir produktet vist i bunnen av Figur 38 Dette fragment blir digestert med EcoRI og gelrenset Det modifiserte VnaTAG fragment ligeres inn i EcoRI setet i pSV2gpty 1(2,3) som beskrevet i eksemplet ovenfor, "tungkjedechimeriske konstruksjoner" Hele det VHaTAG-D-J-forbedrer inneholdende fragment blir sekvensert fullstendig for å sikre at ingen mutasjoner er blitt innført under DNA-amplifiseringsreaksjonene De andre tre tungkjede y isotyper kan dannes ved å ligere det samme modifiserte VhoTAG fragment inn i de andre tre y inneholdende pSV2gpt vektorer (pSV2gpt-y2, pSV2gpt-y3, pSV2gpt-y4)

Ekspresion av det modifiserte VhctTAG gen

Det modifiserte VhoTAG gen som inneholder plasmider, kan lineanseres med Ndel og innføres via elektroporenng inn i de chimenske CC49 eller CC83 lettkjede uttrykkende cellelinjer se eksempel ovenfor, "C Targeted Transformations" De transformerte celler blir selektert for vekst i nærvær av Geniticin og mykofenolsyre som beskrevet ovenfor i "C Målrettede transformasjoner" Tilstedeværelse av uttrykt antistoff blir målt ved TAG72 ELISA (se avsnitt i RESULTATER, Enzymbundede immunoassays (ELISA) Det uttrykte antistoff fra disse celler vil inneholde human lg y1, k konstante områder med det CC49 eller CC83 lettkjedevanable området og et tungkjedevanabelt område fra de modifiserte VhoTAG kimlinje VH eksoner

Fire eksempler på modifisert VHcrTAG tungkjedevanabelt område-konstruksjoner som har en vanatet av D og J-segmenter, er vist nedenfor,

Sekvensen for den humane D-sekvens D1 oppnås fra Siebenlist et al, Nature, 294,63 (1981) Sekvensen for den humane Jh1 oppnås fra Ravetch et al, Cell 27, 583 (1981)

Dannelsen av VHaTAG #i er beskrevet med oligo 1 til 4 i diagram ovenfor For å danne VhoTAG #m til - iv trenger de tilsvarende D og J-segmenter å forandres i oligoer 2 og 3 De følgende oligoer opplinjerer disse forandringer Substitusjon av disse oligoer i reaksjon #1 og reaksjon #2 vil resultere i dannelse av VGaTAG #n til - iv

Resultater

A_ Chimensk antistoff - Produserende cellehnier

Samtidig påvisning av tunge og lette kjeder ble utført ved å anvende to probe antistoffer 1) Geite anti-human kappa merket med den fluorescerende farge FITC og, 2) Geite anti-human IgG merket med den fluorescerende farge TRITC

Cellelinjer som er positive reaksjoner for både tunge og lette kjeder, ble testet videre for assosiert chimensk immuno-globuhnproduksjon og biologisk aktivitet, nemlig binding til TAG72

Enzvmbundede Immunoassavs ( ELISA)

For å selektere en transformert celle som produserer et chimensk monoklonalt antistoff, ble ELISA teknikken anvendt Klonene som inneholdt tungkjede- og lettkjede-medikament seleksjonskonstruksjonene, ble selektert ved deres vekt i selektivt kulturmedium De følgende cellelinjer ble testet (1) CH44-1 en cellelinje som hadde CC49VH, CC49 VL, og konstant område IgGi, (2) CH44-2 en cellelinje som hadde CC49 VH, CC49 VL, og konstant område lgG2, (3) CH44-4 en cellelinje som hadde CC49 VH, CC49 VL, og kontant område lgG4,

(4) CH88-1 en cellelinje som hadde VH, CC83 VL, konstant område IgGi,

(5) CH88-2 en cellelinje som hadde CC83 VH, CC83 VL og konstant område lgG2, (6) CH88-3 en cellelinje som hadde CC83 VH, CC83 VL, og konstant område lgG3, (7) CH88-4 en cellelinje som hadde CC83 VH, CC83 VL og konstant område lgG4, (8) CH84-1 en cellelinje som hadde CC83 VH, CC49 VL, og konstant område IgGi, (9) CH84-2 en cellelinje som hadde CC83 VH, CC49 VL, og konstant område lgG2, (10) CH84-3 en cellelinje som hadde CC83 VH, CC49 VL, og konstant område lgG3, og (11) CH84-4 en cellelinje som hadde CC83 VH, CC49 VL og konstant område lgG4

Supernatanter og disse kulturer ble underkastet ELISA Tilstedeværelse av chimensk anti-TAG72 antistoff ble målt direkte ved reaksjon med et overskudd av geite anti-humant IgG antistoff merket med et enzym slik som alkalisk fosfatase, etter at man tillot det chimenske anti-TAG72 antistoff å binde seg til mikrotiter brønner belagt med antigen (TAG72) Anti-TAG72 aktivitet ble bestemt som et kriterium for vellykket rekombinasjon

Etter vekst 114 dager, ble 50 jj\ supernatant fjernet fra brønnene til de subklonete celler og gjenmålt for TAG-binding ved ELISA Prøver av supernatanter (50 / j\) fra medikamentresistente cellelinjer ble tilført til brønner av Nunc Immulon 96-brønnplater som på forhånd var blitt belagt med TAG antigen

(1 50 fortynning) Etter vasking for å fjerne ubundet materiale ble brønnene inkubert med geite anti-humane IgG antistoffer konjugert med alkalisk fosfatase (GAHIgG-AP) som probe for å påvise de humane konstante områder i de chimenske antistoffer som hadde bundet seg til TAG antigenet immobilisert på platen En vasking til for å fjerne ubundet probe (GAHIgG-AP) fulgt av tilsetning av et kromogent alkalisk fosfatase-substrat, tillot farge å utvikles i de brønner som hadde TAG-binding forbundet med human konstante områder (dvs chimenske anti-TAG72 antistoffer) Absorbans-avlesninger ved 405 nm angir den relative mengde av chimensk antistoff produsert av de medikamentresistente cellelinjer

CH44- 1

Anti-TAG72 aktivitet ble anvendt som er kriterium for vellykket rekombinasjon Brønner av mikrotiterplater ble belagt med TAG ved å inkubere 50 jj\ av en 1 75 fortynning av renset TAG72 [Muraro, R , et al, Cancer Research 48, 4588^596 (1988)] 118 timer ved romtemperatur Brønnene ble så vasket 4 ganger med fosfatbuffret saltvann (PBS), og så blokkert med BSA ved å inkubere 50 fj\ o,5% BSA i PBS i 2 timer ved 37°C, fulgt av vasking 4 ganger med PBS Disse plater er stabile hvis de holdes fuktige ved 4°C 50 mikroliter prøve ble så påført til hver brønn En blindprøve som inneholder ferskt medium, anvendes som kontroll Alle prøvene ble inkubert enten i platen i 90 minutter ved 37°C eller over natten ved 4°C i en lukket beholder

Platene ble så vasket 4 ganger med PBS, og geite anti-human IgG-alkalisk fosfat (Southern Biotech Assoc ) ble påført til hver brønn ved å tilsette 50 mikroliter av en 1 250 fortynning Løsningen ble inkubert ved 37°C i 90 minutter Fargeutvikling ble kontrollert etter vasking av platene 4 ganger med PBS for å fjerne proben

Substratet ble inkubert i 200 / j\ løsning av substrat p-nitrofenylfosfat (Kirkegaard & Perry) i etanolaminbuffret saltvann 16 minutter ved romtemperatur for fargeutvikling Den optiske tetthet ved 450 nm i hver brønn ble avlest ved hjelp av en Dynatech mikroplate-avleser (Dynatech Inc )

Sp2/0-koloniene med brønner med supernatanter som hadde TAG72-bindende chimensk antistoffaktivitet, ble subklonet ved begrenset fortynning Enkeltvise subkloner ble valgt på grunnlag av relativt høy produksjon av chimensk antistoff

CH44- 2

TAG-ELISA prosedyren anvendt med CH44-1 ble gjentatt med det unntak at antistoffet var CH44-2

CH44- 3

TAG-ELISA prosedyren anvendt med CH44-1 ble gjentatt med det unntak at antistoffet var CH44-3

CH44- 4

TAG-ELISA prosedyren anvendt med CH44-1 ble gjentatt med det unntak at antistoffet var CH44-4

CH88- 1

TAG-ELISA prosedyren anvendt med CH44-1 ble gjentatt med et unntak at antistoffet var CH88-1

CH88- 2

TAG-ELISA prosedyren anvendt med CH44-1 ble gjentatt med det unntak at antistoffet var CH88-2

CH88- 3

TAG-ELISA prosedyren anvendt med CH44-1 ble gjentatt med det unntak at antistoffet var CH88-3

CH88- 4

TAG-ELISA prosedyren anvendt med CH44-1 ble gjentatt med det unntak at antistoffet var CH88-4

CH84- 1

TAG-ELISA prosedyren anvendt med CH44-1 ble gjentatt med det unntak at antistoffet var C84-1

CH84- 2

TAG-ELISA prosedyren anvendt med CH44-1 ble gjentatt med det unntak at antistoffet var CH84-2

CH84- 3

TAG-ELISA prosedyren anvendt med CH44-1 ble gjentatt med det unntak at antistoffet var CH84-3

CH84- 4

TAG-ELISA prosedyren anvendt med CH44-1 ble gjentatt med det unntak at antistoffet var CH84-4

CH48- 1

TAG-ELISA prosedyren anvendt med CH44-1 ble gjentatt med det unntak at antistoffet var CH48-1

B In vivo Carcinom- målrettinq

De chimenske monoklonale antistoffer anvendt i animalske studier og vist i tabeller 1-4 nedenfor ble merket med Na<125>l ved å anvende lodogen (Pierce Chemical, Rockford, IL) Mer spesifikt ble fra omtrent 0,5-2 mg rensete chimenske monoklonale antistoffer justert til 0,5 ml 0,1 M natnumfosfat buffer (pH 7,2) og så tilsatt til et 12 cm x 75 cm glassrør belagt med 50 fjg lodogen fulgt av tilsetning av fra 0,1-0,5 mCi Na<125>l (New England Nuclear, Boston, MA) Etter en 2 minutters inkubenng ved romtemperatur ble proteinet fjernet fra det uløselige lodogen, og det ikke-inkorporerte <125>l ble separert fra antistoffet ved gelfiltrering gjennom en 10 ml kolonne Sephadex™ G-25 ved å anvende PBS som buffer lodenngs-fremgangsmåten ga merket IgG chimensk antistoff med en spesifikk aktivitet på 0,05 til 0,2 /jCi//yg

Hunn-atymisk mus (nu/nu) på en CD1 bakgrunn ble oppnådd fra Charles River ved omtrent 4 ukers alder Ni dager senere ble mus inokulert subkutant (0,1 ml/mus) med LS174T celler (1 x 10<6> celler/dyr)

Atymiske mus som bar carcinomer på 70 til 400 mg i vekt, omtrent 12 til 13 dager etter inokulering av cellene, ble gitt injeksjoner intravenøst på fra 0,5 til 2,0 fjC\ (10-50 fjg protein) i PBS av de chimenske monoklonale antistoffer som var blitt lodert som beskrevet ovenfor Grupper på fem mus avlivet ved varierende tider ved avblødning, carcinome og normale vev ble skåret ut og veidd, og cpm ble målt i en gammateller cpm/mg i hvert vev ble så bestemt og sammenlignet med det som ble funnet i carcmomet

Resultatene for CH44-1 er vist i Tabeller 1-2 og Figurer 39A, 39B og 39C Resultatene for CH84-1 er vist i Tabeller 3-4, og Figurer 40A og 40B

Prosentinnsert dose pr gram 125l- merket antistoff

Som vist i Tabell 1, ved omtrent 122 timer etter injeksjon, var prosent injisert dose til tumor for CC44-1 44,16 prosent CH44-1 var derfor effektiv i målretting av den humane tumor in situ Dette viser at de chimenske monoklonale antistoffer fremstilt ved fremgangsmåten i henhold til den foreliggende oppfinnelse, var effektive til in vivo carcinom målretting og således er anvendbare til in vivo behandling av kreft

Prosent innsert dose pr organ av 12<5>l merket antistoff

Som vist i Tabell 2, ved 122 timer etter injeksjon, var prosent injisert dose i tumor for CH44-1 4,55% CH44-1 var derfor effektiv når det gjaldt å målrette den humane tumor in situ Dette viser at de chimenske monoklonale antistoffer fremstilt ved fremgangsmåten i henhold til den foreliggende oppfinnelse var effektive til in vivo carcinom-målretting og således var anvendbare til in vivo behandling av kreft

Prosent innsert dose pr gram 125l- merket antistoff

Som vist i Tabell 3, ved omtrent 118 timer etter injeksjon, var prosent injisert dose til tumor for CH84-1 30,27% CH84-1 var derfor effektiv i målretting av den humane tumor in situ Dette viser at de chimenske monoklonale antistoffer fremstilt ved fremgangsmåten i henhold til den foreliggende oppfinnelse, var effektive til in vivo carcinom-målretting og således var anvendbare til in vivo behandling av kreft

Prosent innsert dose pr organ 125l- merket antistoff

Som vist i Tabell 4, ved omtrent 118 timer etter injeksjon, var prosenten av injisert dose til tumor for CH84-1 7,02% CH84-1 var derfor effektiv for målretting av den humane tumor in situ Dette viser at de chimenske monoklonale antistoffer fremstilt ved fremgangsmåten i henhold til den foreliggende oppfinnelse, var effektive til in vivo carcinom-målretting og således var anvendbare til in vivo behandling av kreft

Deponering av cellelmier som produserer chimenske antistoffer

Elleve illustrative cellelinjer som sekreterer chimenske antistoffer, som alle har kappa lette kjeder, laget ved de ovenfor nevnte eksempler, ble deponert ved den Amerikanske Type Kultur Kolleksjon (ATCC) 19 oktober 1988 Spesifikt er de følgende cellelinjer blitt deponert

(1) CH44-1 en cellelinje som har CC49VH, CC49 VL, og konstant område lgG1 (ATCC Nr 9884), (2) CH88-2 en cellelinje som har CC83VH, CC83VL og konstant område lgG2 (ATCC Nr HB9880), (3) CH44-4 en cellelinje som har CC49 VH, CC49 VL, og konstant område lgG4 (ATCC nr 9877), (4) CH88-1 en cellelinje som har CC83 VH, CC83 VL, og konstant område IgG-i (ATCC nr 9882), (5) CH44-2 en cellelinje som har CC49 VH, CC49 VL, og konstant område lgG2 (ATCC nr 9881), (6) CH88-3 en cellelinje som har CH83 VH, CC83 VL, og konstant område lgG3 (ATCC nr 9876), (7) CH88-4 en cellelinje som har CC83 VH, CC83 VL, og konstant område lgG4 (ATCC nr 9874), (8) CH84-1 en cellelinje som har CC83 VH, CC49 VL, og konstant område Igd (ATCC nr 9883), (9) CH84-2 en cellelinje som har CC83 VH, CC49 VL, og konstant område lgG2 (ATCC nr 9879), (10) CH84-3 en cellelinje som har CC83 VH> CC49 VL, og konstant område lgG3 (ATCC nr 9878), og (11) CH84-4 en cellelinje som har CC83 VH, CC49 VL, og konstant område lgG4

(ATCC nr 9875)

Claims (8)

1 Fremgangsmåte ved fremstilling av et terapeutisk aktivt antistoff, eller et terapeutisk aktivt antistoff-fragment derav, hvor antistoffet eller antistoff-fragmentet er i stand til å selektivt reagere med TAG-72-antigen og er oppnådd fra en av cellelinjene CH44-1 (ATCC HB 9884), CH44-2 (ATCC HB 9880),CH44-4 (ATCC HB 9877), CH88-1 (ATCC HB 9882), CH88-2 (ATCC HB 9881), CH88-3 (ATCC HB 9876), CH88-4 (ATCC HB 9874), CH 84-1 (ATCC HB 9883), CH84-2 (ATCC HB 9879), CH84-3 (ATCC HB 9878), eller CH84-4 (ATCC HB 9875), karakterisert ved at en av de nevnte cellelinjene dyrkes i et egnet medium, hvoretter antistoffet eller et antistoff-fragment derav isoleres

2 Fremgangsmåte for fremstilling av et terapeutisk antistoff ifølge krav 1, ytterligere omfattende å fremstille et antistoff-konjugat eller antistoff-fragment-konjugat, hvor antistoffet eller antistoff-fragmentet kontaktes med et terapeutisk middel, karakterisert ved at tilsvarende fremgangsmåte benyttes

3 Fremgangsmåte ifølge krav 2, hvor antistoffet eller antistoff-fragmentet ifølge krav 1 konjugeres til et terapeutisk middel, karakterisert ved at tilsvarende fremgangsmåte benyttes

4 Fremgangsmåte ifølge krav 3, hvor det terapeutiske middel er et radionuklid, medikament eller biologisk responsmodifisenngsmiddel, toksin eller annet antistoff, karakterisert ved at tilsvarende fremgangsmåte benyttes

5 Fremgangsmåte ifølge krav 4, hvor radionukhdet er 1311, ^ Y, 105Rn,47 Sc, 67Cu, 212Bl, 211At, 6<7>G3i 125|, 186Re> 188Re, 177Lu> 99mTc, 153Sm, 123| eller H1|n, karakterisert ved at tilsvarende fremgangsmåte benyttes

6 Fremgangsmåte ifølge krav 4, hvor legemiddelet eller det biologiske responsmodrfiseringsmiddel er metotreksat, adriamycin eller lymfokin, karakterisert ved at tilsvarende fremgangsmåte benyttes

7 Fremgangsmåte for fremstilling av et terapeutisk aktivt antistoff eller terapeutisk aktivt antistoff-fragment derav ifølge krav 1, ytterligere omfattende at antistoffet eller antistoff-fragmentet derav kontaktes med en farmasøytisk akseptabel, ikke-toksisk stenl bærer, karakterisert ved at tilsvarende fremgangsmåte benyttes

8 Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 2-6, ytterligere omfattende at antistoffkonjugatet eller antistoff-fragmentkonjugatet kontaktes med en farmasøytisk akseptabel, ikke-toksisk steril bærer, karakterisert ved at tilsvarende fremgangsmåte benyttes