JPH03502889A - ガン治療に用いられる新規高親和性改変抗体系統群 - Google Patents

ガン治療に用いられる新規高親和性改変抗体系統群

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JPH03502889A JP1511127A JP51112789A JPH03502889A JP H03502889 A JPH03502889 A JP H03502889A JP 1511127 A JP1511127 A JP 1511127A JP 51112789 A JP51112789 A JP 51112789A JP H03502889 A JPH03502889 A JP H03502889A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ３０、０Ｈ４４−１，ＣＨ４４−２，ＣＨ４４−４，ＣＨ３８−１，ＣＨ８Ｂ− ２，ＣＨ３８−３゜ＣＨ３８−４，ＣＨ３４−１，Ｃ）１８４−２．　ＣＨ３４ −３またはＣＨ３４−４の細胞の特徴を含んで成る、請求項２９の細胞。
３１、医薬上許容される非毒性の無菌担体中に請求項１〜１２のいずれか一項の 抗体または抗体断片を含んで成る組成物。
３２、医薬上許容される非毒性の無菌担体中に請求項１３〜１４のいずれか一項 の抗体または抗体断片接合体を含んで成る組成物。
３３、医薬上許容される非毒性の無菌担体中に請求項１５〜１８のいずれか一項 の抗体または抗体断片接合体を含んで成る組成物。
３４、ガンの生体内診断方法であって、ガン腫病巣の原位置における検出のため に医薬上有効量の請求項３１または３２の組成物を動物に投与することを含んで 成る方法。
３５、ガンの生体内治療方法であって、医薬上有効量の請求項３１または３３の 組成物を動物に投与することを含んで成る方法。
３６、前記動物がヒトである、請求項３４または３５に記載の方法。
３７、手術内治療方法であって、 （ａ）医薬上有効量の請求項３１または３２の組成物を動物に投与し、それによ って腫瘍が局在定位され、そして（ｂ）局在定位された腫瘍を切除する、ことを 含んで成る方法。
３８、抗体または抗体断片の調製方法であって、ｖＨαＴＡＧジャームライン遺 伝子（ｖ、ｌαＴＡＧ）と事実上相同であるＤＮＡ配列によりコードされる、重 鎮を有する可変領域（ＶＨ）を、 動物Ｖ遺伝子セグメントおよび動物Ｊ遺伝子セグメントによりコードされる、軽 鎖を有する可変領域（ＶＬ　）と接触せしめ、 抗体または抗体断片の可変領域を形成せしめることを含んで成り、 ここで前記可変領域は、前記抗体および８７２．３の結合親和力を同じ方法によ り測定した時、８７２．３の可変領域がＴＡＧ７２に結合するよりも少なくとも ２５％大きい結合親和力でＴＡＧ７２に結合することを特徴とする特許 ３９、前記可変領域ｖＨが、動物り遺伝子セグメントおよび動物Ｊ遺伝子セグメ ントによりコードされることを更に含んで成る、請求項３８の方法。
４０、前記軽鎖Ｊセグメントが、マウスおよびヒトＪ遺伝子セグメントから選択 された遺伝子によりコードされる、請求項３９の方法。
４１、前記重鎖り遺伝子セグメン（・がマウスおよびヒトＤ遺伝子セグメントか ら選択された遺伝子によりコードされ、そして前記Ｊ遺伝子セグメントがマウス およびヒトＪ遺伝子セグメントから選択された遺伝子によりコードされる、請求 項３９の方法。
４２、前記可変領域がＣＣ４６，ＣＣ４９，ＣＣ８３またはＣＣ９２の可変領域 由来である、請求項３８の方法。
４３、前記可変領域が、（１）　Ｖ）Ｉ　ｃｘ　ＴＡＧ由来の遺伝子によりコー ドされる相補性多様性領域（ＣＤＲ）　、および（２）該ＣＤＲ領域に隣接した ヒト遺伝子由来のフレームワーク領域を含んで成る、請求項３８の方法。
４４、前記抗体または抗体断片が、ヒト軽ＩＮ　（ＣＬ　’）およびヒト重鎮（ ＣＭ　）の少なくとも部分を有する定常領域を更に含んで成る、請求項３８の方 法。
４５、前記ＣＨがＩｇＧ＋−ｍ、　ＩｇＭ、　ｒｇＡ、　ＩｇＤまたはＩｇＥで ある、請求項４４の方法。
４６、前記ＣＬがカッパまたはラムダである、請求項４４の方法。
４７、前記抗体または抗体断片が、ＣＨ４４−１，ＣＨ４４−２，ＣＨ４４−４ ゜ＣＨ３８−１，ＣＨ３Ｓ−２，ＣＨ３８−３，ＣＨ３８−４，ＣＨ３４−１， ＣＨ３４−２，ＣＨ３４−３またはＣＨ３４−４からの細胞系により産生される 、請求項３８の方法。
４８、抗体または抗体断片接合体の調製方法であって、請求項１−１２のいずれ か一項において定義された抗体または抗体断片を、画像診断マーカーまたは治療 薬と接触せしめることを含んで成る方法。
４９、前記画像診断マーカーが１２５Ｉ、　＋：ｕｌ、　１２３１．…Ｉｎ。
１６Ｊｈ、　　１５３３１１．　６’？（ｕ、　　６″ＩＧａ、　　　ｌ＆６Ｈ ｏ、　　！？）ｌｕ、　　１１６１８．　ｌａ會Ｒｅまたは９９′″Ｔｃである 、請求項４８の方法。
５０、前記治療薬が放射性核種、薬剤もしくは生体応答調節剤、毒素または他の 抗体である、請求項４８の方法。
５１、前記放射性核種が！″’１．９０Ｙ、　”’Ｒｈ、　”Ｓｃ、　”Ｃｕ＋ １２Ｂ４．　２１１Ａｔ、　　ｌｌ？Ｇａ、　　Ｉ！５１．　１ｌ１６Ｒｅ、　 ｌｌ８Ｒｅ、　　Ｉフ”ＩＩ、、、　　ｅｌｌｌＴｃ。
１ｓ３ｓ、、　＋！３Ｔおよび”’ＩｎＴ！ある、請求項５０（７）方法。
５２、前記薬剤もしくは生体応答調節剤がメ））レキセード、アドリアマイシン またはリンホカインである、請求項５ｏの方法。
５３、組換え発現ビヒクルの調製方法であって、ｖＨαＴＡＧジ＋−ムライン遺 伝子（ＶＮαＴＡＧ）と事実上相同でありそして重鎮可変領域（Ｖイ）の少なく とも部分をコードするＤＮＡ配列セグメントを含んで成るＤＮＡ配列を、発現ビ ヒクル中に挿入することを含んで成る方法。
５４、前記ＶＷ配列が、動物り遺伝子セグメントのＤＮＡ配列セグメントおよび 動物Ｊ遺伝子セグメントのＤＮＡ配列セグメントを更に含んで成る、請求項５３ の方法。
５５、前記ｖＨをコートするＤＮＡ配列が、ＣＣ４６，ＣＣ４９，ＣＣ８３およ びＣＣ９２のＶＨｅＩ域をコードする配列由来である、請求項５４の方法。
５６、ヒト重鎮定常領域（ＣＩ４）の少なくとも部分をコードするＤＮＡ配列セ グメントを更に含んで成る、請求項５３の方法。
５７、前記ＤＮＡ配列セグメントがＩｇＧ＋−ｎ、ＩｇＭ、　ＩｇＡ、　ＩｇＤ またはＩｇＥをコードしているＣ９遺伝子の少なくとも部分を特徴とする請求項 ５６の方法。
５８、約１０４の発現ビヒクルが１０ＪＪ１の緩衝液中で約１０．ｑの前記ＤＮ Ａ配列セグメントおよびＩ０単位の酵素と接触される、請求項５３の方法。
５９、３７℃〜６５°Ｃの範囲の温度にて、７−９のｐＨで、１〜１８時間消化 が行われる、請求項５３の方法。
６０、形質転換された宿主の調製方法であって、請求項２８において定義された 発現ビヒクルを、適当な宿主中に挿入することを含んで成る方法。
６１、前記発現ビヒクルがプラスミドである、請求項６０の方法。
６２、１０−３０．ｇのプラスミドをｌＸｌ０’個までの宿主細胞の存在下で線 状化し、次いで宿主細胞を２００ボルトおよび９６０マイクロフアラツドにおて いエレクトロポレーションすることを含んで成る、請求項６１の方法。
浄１ｆｔ（内容に変更なし） 明　　　細　　　書 ガン治療に用いられる新規高親和性改変抗体系統群本発明は、免疫グロブリンの 製造及び天然抗体アミノ酸配列の変更に関する。具体的には、本発明は、組換え ＤＮＡ技術を用いてキメラ遺伝子を製造すること、およびこれらの遺伝子修飾法 を利用してキメラ抗体を作製することに関する。
抗体は、外来タンパク質、糖タンパク質、細胞又は他の抗原性外来物質による誘 発に応答してを椎動物の免疫系により産生される特異的免疫グロブリン（１ｍ） ポリペプチドである。、−生体が外来細胞による侵入に打ち勝ったり、外来物質 の系を取り除くことを可能にする際の糸路は、少なくとも部分的に理解されてい る。この過程で重要なことは、特定の外来物質に特異的に結合する抗体の製造で ある。特定の抗原に対するそのようなポリペプチドの結合特異性は非常に厳密で あり、そして個々のを椎動物により発生し得る多数の特異性は、その複雑性と多 様性が著しい。無数の抗原が抗体反応を惹起することができ、各抗体は、もっば ら殆どそれを惹起した特定の抗原に対してのみ向けられる。
哺乳動物Ｂリンパ球による原位置（ｉｎ　５ｉｔｕ）での産生及びＢ細胞ハイブ リッドによる細胞培養での産生、といったを椎未分化Ｂ細胞において、免疫グロ ブリンの種々の領域をコードしているＤＮＡの部分は、ゲノムＤＮＡにおいては 離れている。
発現に先立ち、配列が順次組立てられる。この過程については、Ｇｏｕｇｈ、Ｔ ｒｅｎｄｓ　ｉｎ　Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｓｃｉ、、　　６．２０３（１９８１）に 記載されている。
得られる再配列遺伝子は、成！＄！Ｂリンパ球中で発現して所望の抗体を産生ず ることができる。しかしながら、たとえ特定の哺乳動物を単一抗原に暴露しても 、抗体の均一集団は得られない。特定の抗原に対する原位置免疫反応は、抗原上 に存在する種々の決定基に対する反応のモザイクにより定義される。同種抗体の 各サブセントは、Ｂ細胞の単一集団により提供される。したがって、抗体の原位 置産生は「ポリクローナル」である。
この限定されているが生来の不均質性は、数多くの特定の場合において、ハイブ リドーマ技術を用いて、Ｂ細胞ハイブリドーマにより細胞培養中で「モノクロー ナル」抗体を製造することにより克服されている（Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔ ｅｉｎ、　Ｃ，。
Ｎａｔｕｒｅ、　２５６．４９５〜４９７（１９７５）参照〕。
この方法では、抗原を注射した哺乳動物から得た比較的短命の、または致死の肺 細胞又はリンパ球を、不死の腫瘍細胞系と融合させて、ハイブリッド細胞又は「 ハイブリドーマ」を製造する。これらは、両方とも、不死であり、Ｂ細胞の遺伝 子的にコードされた抗体を産生できる。このようにして作製されたハイブリッド は、選択、希釈及び再増殖により単−遺伝株に分離し、従って各株は単一遺伝系 を表す。したがって、これらの遺伝系は、所望の抗原に対して確実に均一である 抗体を産生ずる。純粋な遺伝系統に関係して、これらの抗体は、「モノクローナ ル」と呼ばれる。
単一特異性を有するモノクローナル抗体は、免疫学に非常に影響を及ぼしており 、そしてそれらの有効性は、生物学、薬理学、化学等の自然科学において既に示 されてきた。このようなモノクローナル抗体は、診断試薬として広く使用されて いるだけでなく〔例えば、釦懸朋ゼー二頃り担ユ。
Ｖｏｌｌｅｒ、Ａ　ｍ、Ｂａｒｔｌｅｔｔ、Ａ、及びＢｉｄｗｅｌｌ、Ｄ　、　 　ＭＴＰ社、ランカスター、１９８１年参照〕、治療にも使用されている〔例え ば、Ｒｉｔｚ、Ｊ、及び５ｃｈｌｏｓｓｓ＋ａｎ、　Ｓ、Ｆ、　、坦ｏｏｄ、　 ５１＋１〜１１（１９８２）参照〕。
ハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体は、上記で説明したように 理論上効果的であり、そしてそれらの特異性ゆえに、ポリクローナル抗体よりも 明らかに好ましいけれども、重大な欠点がある。即ち、多くの用途において、非 ヒト動物において産生されたモノクローナル抗体をヒトに使用しようとする場合 、大きな制限を受ける。ヒトにマウス抗体等の「外来」抗体を繰り返し注射する と、有害な過敏症反応を生じることがある。このような非ヒト由来モノクローナ ル抗体をヒトに注射すると、抗非ヒト抗体（ＡＮＨＡ）反応を引き起こす。マウ ス由来抗体を使用することにより生じる特異的ＡＮＩＪＡ反応〔ヒト抗マウス抗 体（ＨＡＭＡ）反応〕については、Ｓｈａ’ｗｌｅｒ等、Ｊｏｕｒｎａし＞ｆ　 Ｉｏ＋ｍｕｎｏｌｏ　　、　１３５．１５３０〜１５３５（１９８５）を参照の こと。
ヒト定常領域を有する動物免疫グロブリンは、ヒトに注射したときに、非ヒト定 常領域を有する動物免疫グロブリンよりも小さいＡＮＨＡ反応を引き起こすだろ う。
選択された抗原に対する良好な結合親和力を有しそしてヒト定常領域を有するモ ノクローナル抗体は、免疫診断及びガンを有するヒト患者の治療に大きな潜在的 効用を有するものと思われる。
いままで、ヒトハイブリドーマを使用することによりヒト由来のモノクローナル を製造する種々の試みがなされてきた。
例えば、ヒト・ヒトハイブリドーマ（Ｏ１ｓｓｏｎル０等、Ｐｒｏｃ。
Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、）　（ｔｌｓＡ）、７７、５４２９（１９８０） ）　、ヒト・マウスハイブリドーマ（Ｓｃｈｌｏｍ、Ｊ、等、同書、互、６８４ １（１９８０）　）及びいくつかの他の外因性ハイブリッドの組み合わせが製造 されている。また、ヒトモノクローナル抗体は、エプスタイン・バーウィルス（ ｆｉｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ　ｖｉｒｕｓ）を用いたリンパ球の形質転換により 製造されている。しかしながら、このようなハイブリドーマは、病原性ヒトウィ ルスを潜伏させる可能性がある。あるいは、−次性抗体産生Ｂ細胞は、ウィルス ＤＮＡで形質転換することにより試験官内で不死化されている。残念ながら、ヒ トハイブリドーマ細胞系からのモノクローナル抗体の収率は比較的低く（マウス ハイブリドーマでは１００．ｑ／ｄであるのに対してヒトではｌｘ／ａｄ）、生 産コストが高い。
ヒト免疫グロブリンはヒトガン患者の免疫診断及び治療に非常に望ましいが、ヒ トハイブリドーマ技術は、必要な抗原特異性を有するヒトモノクローナル抗体が 容易に得られる段階にはまだ達していない。さらに、明らかな倫理上の理由から 、研究者は、抜粋した有毒又は有害な抗原を用いてヒト被験者を免疫し、特定の 抗原に対する抗体を産生させることはできない。このため、ヒト患者の免疫診断 及び治療には、大きな制限がある。
ヒト由来モノクローナル抗体の生産は、可能であることは確実であるが、低再現 性及び上記した他の問題の点で未だ不十分である。〔さらに、Ｎａｔｕｒｅ、　 ３００，３１６〜３１７（１９８２）を参照のこと〕。その結果、はとんどのモ ノクローナル抗体は、非ヒト動物由来のものである。
高い結合親和力でヒト腫瘍抗原と反応するが、ヒトにより外来物質として認識さ れないモノクローナル抗体が非常に望ましい。この困難を克服するための方法と しては、ヒト抗体に非常に類イ以しているが、人体内で外来物質として認識され ない抗体、即ち、キメラ抗体、または「ヒト化（ｈｕｍａｎｉｚｅｄ）　」抗体 、を人工的に作製することが挙げられる。
典型的にキメラ抗体では、軽鎖及び重鎮の両方の可変領域は哺乳動物の一種に由 来する抗体の可変領域に類似しているが、定常部分はヒト由来の抗体の配列と相 同性がある。このようなキメラ形の一つの明確な利点は、例えば、可変領域が、 例えばヒト細胞調製物由来の定常領域との組合せにおいて、容易に入手可能な非 ヒト宿主生物からのＢ細胞のハイブリドーマを使って現在既知の源から都合よく 誘導できることである。可変領域の特異性はその源により影響されないが、定常 領域はヒトであるときには、抗体を注射すると非ヒト起源の定常領域よりもヒト 被験者から免疫応答を惹起せしめることが少ないようだ。
公知のヒト腫瘍抗原の一つは、腫瘍関連糖タンパク（ＴＡＧ７２）である。ＴＡ Ｇ７２は、ヒト起源のある種の腫瘍細胞、具体的にはＬＳＩ７４Ｔ腫瘍細胞系の 表面と関連している。ＬＳ１７４Ｔ　（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレ クション（Ａｍｅｒｉｃａｎ　ＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ ）（以下、ＡＴＣＣと称する）番号第ＣＬ１８８号〕は、ＬＳ１８０　（ＡＴＣ Ｃ第ＣＬ１８７号）結腸腺癌系の変異株である。
ＬＳ１７４Ｔの核型は、ＬＳ１８０のものと類似しているが、大部分の細胞でＸ 染色体を欠いている。Ｊｏｂｎｓｏｎ、Ｖ、Ｇ、等、ＣａｎｃｅｒＲｅｓ、、　 ４６．８５０〜８５７（１９８６）においては、データによりＴＧＡ７２分子を ムチンとして特性決定している。この結論は、以下の考察に基づくものである： 　（ａ）ＴＧ＾７２は、セファロース（商標）ＣＬ−４Ｂカラムからの排除によ り示されているように高分子量（＞　Ｉ　ＸＩＯ’）を有している；　（ｂ）Ｃ ｓＣ１中での平衡遠心分離により測定されたＴＧＡ７２の密度は１．４５ｇ／ｄ であり、高度にグリコジル化された糖タンパクであることを示す；　（ｃ）　Ｔ ＡＧ７２は、ノイラミニダーゼ消化後に移動度の変化を示し、ムチンの多量のＯ −グリコシド結合したオリゴ糖特性を有する高度にシアル酸が付いた分子である ことを示す：（ｄ）ムチンにおいて一般に見られる血液型抗原が、アフィニティ ー精製したＴＡＧ７２に見られる；（ｅ）コンドロイチナーゼＡＢＣ消化がＴＧ Ａ７２に何ら影響を及ぼさないことから、ＴＡＧ７２エピトープはコンドロイチ ン硫酸プロテオグリカン上で発現されないことを証明している。
ＴＧＡ７２に対する結合特異性を有する数多くのマウスモノクローナル抗体が開 発されている。これらのモノクローナル抗体の一つである８７２．３は、ハイブ リドーマ８７２．３（ＡＴＣＣ第ＨＢ−８１０８号）により産生されるマウスＩ ｇＧ　１である。８７２．３は、免疫原としてヒト乳癌抽出物を用いて開発され た第一世代モノクローナル抗体である（Ｃｏｌｃｈｅｒ、　Ｄ等、Ｐｒｏｃ、Ｎ ａｔ’　１．Ａｃａｄ。
Ｓｃｉ、（ＵＳＡ）　７８．３１９９〜３２０３（１９８１）　；及び米国特許 第４．５２２．９１８号及び４．６１２．２８２号参照〕。本明細書において使 用される表現「第一世代モノクローナル抗体」とは、免疫原として粗製細胞抽出 物を用いて産生されたモノクローナル抗体を意味する。ＴＡＧ７２に対して向け られる他のモノクローナル抗体を、ｒＣＣＪ　（結腸癌）と称する。ＣＣモノク ローナル抗体は、第二世代マウスモノクローナル抗体群である。本明細書におい て使用される表現「第二世代モノクローナル抗体」とは、第一世代モノクローナ ル抗体を用いて精製した抗原を免疫原として使って製造されたモノクローナル抗 体を意味する。ＣＣモノクローナル抗体は、８７２．３を用いて精製したＴＡＧ ７２を使用して製造されたものである。ＣＣ抗体の製造方法については、１９８ ７年７月１５日にＳｃｈｌｏｍ等により出願された米国特許出願第７−０７３， ６８５号（ＵＳＰＡ７−０７３．６８５）に記載されており、そしてナショナル ・インフォメーション・サービス（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｔｅｃｈ−ｎｉｃａｌ　 Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ　５ｅｒｖｉｃｅ）から入手できる。これらは、ＴＡＧ ７２に対して比較的良好な結合親和力を有しているため、以下のＣＣ抗体がＡＴ ＣＣにアクセス制限つきで寄託された：　ＣＣ４９（ＡＴＣＣ第１８９４５９号 ）ｉ　ＣＣ８３（ＡＴＣＣ第８８９４５３号）；　ＣＣ４６（ＡＴＣＣ第８８９ ４５８号）；　ＣＣ９２（ＡＴＣＣ第８８９４５４号）；ＣＣ３０（ＡＴＣＣ第 ８８９４５７号）：ＣＣＩＩ（ＡＴＣＣ第８８９４５５号）；及びＣＣｌ３　（ ＡＴＣＣ第）１８９４６０号）。
公知技術においては、ＴＡＧ７２に比較的強固に結合するヒト抗体は全く単離さ れていない。したがって、適当な抗体を設計する必要がある。
１ｇ分子の機能はその分子の三次元構造により決まり、そして三次元構造は一次 アミノ酸配列により決まる。したがって、Ｉｇのアミノ酸配列を変化させると、 活性に悪影響を及ぼす。
さらに、ＩｇをコードしているＤＮＡ配列の変化は、ＤＮＡ配列を含んでいる細 胞が工８を発現、分泌又は集成する能力に影響することがある。
ＵＳＰＡ　７−０７３，６８５は、当該技術分野において既知の組換えＤＮＡ技 術により、例えば、マウス定常領域をヒト定常領域（Ｆｃ）ドメインで置換して 、ＣＣ抗体をキメラ形に変えることができることを教示している。ＵＳＰＡ　７ −０７３，６８５に記載されている提案は、主１５１ｇポリペプチド鎖の発現、 Ｉｇ活性の産生、Ｉｇ鎖の所望のキメラＩｇへの分泌および集成の実際の試みに はいたらなかったと思う。
したがって、公知の組換えＤＮＡ技術が、選択されたヒト癌腫に特異的に結合し そしてヒトに注射したときにＡＮＨＡ副作用の開始を減少させる機能的キメラ抗 体を産生ずる選択されたＤＮＡ源から、日常的に動物−ヒトキメラ抗体を製造す るであろうことは、当該技術から全く明らかでない。
驚くべきことに、本発明は、上記の要望の多くを満たし、そして所望の抗体の供 給方法が提供される。例えば、本発明は、ＴＡＧ７２を発現しているヒト癌腫に 結合する動物Ｉｇの少なくとも一部分をコードしている遺伝子と、ヒトＩｇの少 なくとも一部分をコードしている遺伝子とを融合する方法を提供する。また、本 発明は、分泌及び集成されて機能的キメラ抗体を与えることのできるタンパク質 の発現を達成する方法を提供する。
さらに、本発明は、ＴＡＧ７２に対して向けられた抗体及びその一部分をコード しているＤＮＡ配列を含む発現ベクターを提供する。
また、本発明は、ＴＡＧ７２に対して向けられた抗体及びその一部分をコードし ているＤＮＡ配列を含む発現ベクターを用いて形質転換された細胞を提供する。
最後に、本発明は、生体内診断アッセイ、生体内治療及び放射線免疫誘導手術に 使用される新規抗体を提供する。
従って本発明は、重鎮を有する可変領域（ＶＨ＞を含んで成る抗体または抗体断 片であって、前記ＶＨは、ＶＨαＴＡＧジャームライン遺伝子（ＶＭαＴＡＧ） と事実上相同なりＮＡ配列によりコードされ、 ここで前記抗体と８７２．３の結合親和力を同じ方法により測定した時、前記可 変領域は８７２．３の可変領域がＴＡＧ７２に結合するよりも少なくとも２５％ 大きい結合−親和力でＴＡＧ７２に結合する°ことを特徴とする抗体または抗体 断片に関する。
本発明は、抗体重鎮の少なくとも部分をコードするＤＮＡ配列であって、前記配 列は、ｖＨαＴＡＧジャームライン遺伝子（ＶイαＴＡＧ）と事実上相同である ＤＮＡ配列セグメントを含んで成り、ここで前記ＤＮＡ配列セグメントが重鎮可 変領域（ＶＷ）の少なくとも部分をコードすることを特徴とする前記ＤＮＡ配列 に関する。
更に本発明は、 （Ａ）抗体または抗体断片の重鎮をコードする配列セグメントであって、 （１）　　ＶＨｃｒＴＡＧジャームライン遺伝子（ＶｕαＴＡＧ）と事実上相同 である配列サブセグメントであって、ここで該ＤＮＡ配列セグメントがＶＨの少 なくとも部分をコードし、および（２）ＣＭの少なくとも部分をコードする配列 サブセグメント、 を有する配列セグメント；並びに （Ｂ）抗体または抗体断片の軽鎖をコードする配列セグメントであって、 （１）動物軽鎖可変領域（ＶＬ）の少なくとも部分をコードする配列サブセグメ ント、および （２）ヒト軽鎖定常領域（ＣＬ　）の少なくとも部分をコードする配列サブセグ メント、 を有する配列セグメント；を含んで成るＤＮＡ配列であって、前記ＤＮＡ配列に よりコードされる抗体または抗体断片は、該抗体と８７２．３の結合親和力を同 じ方法により測定した時、ＢＴ２．３の可変領域がＴＡＧ７２に結合するよりも 少なくとも２５％大きい結合親和力でＴＡＧ７２に結合することを特徴とする、 前記ＤＮＡ配列に関する。
さらに、本発明は、単独の又は画像診断マーカー若しくは治療薬と接合した形態 の上記抗体に関する。また、本発明は、医薬上許容される非毒性の無菌担体中に 未接合又は接合形態で上記抗体を含有する組成物に関する。
また、本発明は、癌の病巣の原位置検出用の上記組成物の医薬上効果的な量を動 物に投与することを含んで成る癌の生体内診断方法にも関する。
また、本発明は、（ａ）上記組成物の医薬上効果的な量を動物に投与し、それに より腫瘍を局在定位、そして（ｂ）局在定位された腫瘍を切除することを含む手 術内療法（ｉｎｔｒａｏｐｅｒａ−ｔｉｖｅ　ｔｈｅｒａｐｙ）に関する。
さらに、本発明は、種々の抗体又は抗体断片、それらの接合体、適当な組換え発 現ビヒクル及び適当な宿主への挿入断片の調製方法に関する。これらの方法のい （つかは以下のとおりである。■Ｈ領領域■Ｌ領領域接触させて抗体又は抗体断 片の可変領域を形成することを含んで成る抗体又は抗体断片の調製方法。抗体又 は抗体断片を画像診断マーカー又は治療薬と接触させることを含む抗体又は抗体 断片接合体の調製方法。ＤＮＡ配列を発現ビヒクルに挿入することを含んで成る 組換え発現ビヒクルの調製方法。プラスミドを適当な宿主に挿入することを含ん で成る形質転換宿主の調製方法。
他の態様において、本発明は、上記抗体及びその断片をコードするＤＮＡ、適当 な宿主細胞中でそのような免疫グロブリンの産生を行うことのできる発現ベクタ ー又はプラスミドに関する。また、本発明は、宿主細胞及び上記のベクターによ る形質転換から得られる細胞培養物に関する。
胚１諺口【肌 第１図は、酵素的開裂部位を示した基本的な免疫グロブリン構造を示す。
第２図は、ＶｓｆｆＴＡＧ　ＶＮ　、ＣＣ４６Ｖｘ　、ＣＣ４９Ｖｕ　、ＣＣ８ ３Ｖ。
及びＣＣ９２ＶＭのヌクレオチド配列を示す。
第３図は、ＶＭ（ｒＴＡＧ　Ｖｓ　、ＣＣ４６ＶＨ、ＣＣ４９Ｖｘ　、ＣＣ８３ ＶＨ及びＣＣ９２ＶＨのアミノ酸配列を示す。
第４ａ図はＣＣ４９Ｖ、のヌクレオチド配列を示し、そして第４ｂ図は対応する アミノ酸配列を示す。
第５ａ図はＣＣ８３ＶＬのヌクレオチド配列を示し、そして第５ｂ図は対応する アミノ酸配列を示す。
第６ａ図はＣＣ９２ＶＬのヌクレオチド配列を示し、そして第６ｂ図は対応する アミノ酸配列を示す。
第７図は、プラスミドｐＧＤ１から単離されたＨｉｎｄＩ［Ｉ　−Ｐｓｔ　Ｉ断 片のヌクレオチド配列を示す。
第８図は、ｐＢＬＵＥｓｃＲＩＰＴ　ＳＫ　（−）のプラスミド地図を示す。
第９図は、ｐＲＬｌｏｌのプラスミド地図を示す。
第１０図は、ｐＲＬｌｏｌ中のＣＣ４９Ｌ鎖ゲノムＤＮＡ挿入断片の制限酵素地 図を示す。
第１１図は、ｐＲＬ２００のプラスミド地図を示す。
第１２図は、ｐＲＬ２００中のＣＣ８３Ｌ鎖ゲノムＤＮＡ挿入断片の制限酵素地 図を示す。
第１３図は、プラスミドｐＮＰ９から単離されたＥｃｏ　ＲＩ　−Ｂａｇ　８１ 断片のヌクレオチド配列を示す。
第１４図は、ｐＨ８４９のプラスミド地図を示す。
第１５図は、ｐ）ＩＳ８３のプラスミド地図を示す。
第１６図は、ＣＣ４９Ｖ　Ｈのヌクレオチド配列を示し、下線の付いたセグメン トはｍＲＮＡにおいてオリゴヌクレオチドプライマーを用いて誘導した配列を示 す。
第１７図は、ＣＣ８３Ｖ　１１のヌクレオチド配列を示し、下線の付いたセグメ ントはｌｌｌＲＮＡにおいてオリゴヌクレオチドブライマーを用いて誘導した配 列を示す。
第１８図は、ＣＣ４９Ｖｏのアミノ酸配列を示し、下線の付いたセグメントはタ ンパク質配列決定法により決定された配列を示す。
第１９図は、ＣＣ８３Ｖ　、のアミノ酸配列を示し、下線の付いたセグメントは タンパク賞配列決定法により決定された配列を示す。
第２０図は、ＣＣ８３抗体のＰＮＧアーゼＦ処理の結果とともにＳＯＳポリアク リルアミドゲルの結果を示す。
第２１図は、ヒトガンマ１、ヒトガンマ２、ヒトガンマ３及びヒトガンマ４の制 限酵素地図を示す。
第２２図は、ｐＳＶ２ｇｐｔ／Ｒ／Ｂのプラスミド地図を示す。
第２３図は、ｐＳＶ２ｇｐｔ／　ｒ　１−７．８のプラスミド地図を示す。
第２４図は、ｐＳＶ２ｇｐｔ／　ｒ　１−２．３のプラスミド地図を示す。
第２５図は、ｐｓＶ２ｇｐｊ−γ２のプラスミド地図を示す。
第２６図は、ｐＳＶ２ｇ９を一γ３のプラスミド地図を示す。
第２７図は、ｐＳＶ２ｇｐｔ−γ４のプラスミド地図を示す。
第２８図は、ｐ４９　ｒ　１−７．８のプラスミド地図を示す。
第２９図は、ｐ４９　ｒ　１−２．３のプラスミド地図を示す。
第３０図は、ｐ４９−　ｒ　２のプラスミド地図を示す。
第３１図は、ｐ４９−γ３のプラスミド地図を示す。
第３２図は、ｐ４９−ｒ４のプラスミド地図を示す。
第３３図は、ｐ８３　γ１−７．８のプラスミド地図を示す。
第３４図は、ｐ８３　γ１−２．３のプラスミド地図を示す。
第３５図は、ｐ８３−γ２のプラスミド地図を示す。
第３６図は、ｐ８３−　ｒ　３のプラスミド地図を示す。
第３７図は、ｐ８３−　ｒ　４のプラスミド地図を示す。
第３８図は、Ｈｏｒｔｏｎら、Ｇｅｎｅ、　７７．６０１９８９）の方法に基づ いたハイブリッド遺伝子の操作のための全体反応を示す。
第３９Ａ図は、第３９Ｂ図及び第３９Ｃ図は、ＣＨ４４−１の生体分布と全身保 持率を示す。
第４０Ａ図及び第４０Ｂ図は、ＣＨ３４−１の生体分布と全身保持率を示す。
本発明の免疫グロブリンは、゛従来技術に開示されているマウスモノクローナル 抗体の課題を解決するために開発された。
この免疫グロブリンは、ｖＨαＴＡＧ由来のＤＮＡによりコードされる重鎮可変 領域から成るキメラ構造を有することを特徴とする。
定義 本明細書において使用される「免疫グロブリン」とは、特異的免疫反応活性の有 無にかかわらず、四量体又はその凝集体を言う。「抗体」とは、軽鎖及び重鎮を 含有しく両者の間に共有結合を存するかまたは有しない）、抗原に対して有意な 公知の特異的免疫反応活性を有する集成物を言い、「非特異的免疫グロブリンＪ 　（ＮＳＩ）とは、抗原に対して公知の特異性を有さない免疫グロブリンを意味 する。
を椎動物系における基本的な免疫グロブリン構造単位は、比較的よく理解されて いる（Ｅｄｅｌｍａｎ、Ｇ、Ｍ、、　Ａｎｎ、Ｎ、Ｙ、Ａｃａｄ。
旦φユ、　１９０．５（１９７１））。第１図から明らかなように、構造単位は 、分子量が約２３．０００ダルトンである２本の同一の軽ポリペプチド鎖と分子 量が５３，０００〜７０．０００の２本の同一の重鎮から成る。４本の鎖は、ジ スルフィド結合により７字形に接合されており、軽鎖は、Ｙの口部から始まり多 様性領域を経て継続している重鎮の両側にある。
重鎖は、ガンマ、ミュー、デルタ又はイプシロンとして分類され、それらのうち いくつかはサブクラスを有している。
長い定常領域を有しているので、この鎖の特性により、抗体の「クラス」をＩｇ Ａ、　ＩｇＤ、　ＩｇＥ、　ｒｇＧ又はＩｇＦｊ　と決定する。
軽鎖は、カッパ（に）又はラムダ（λ）に分類される。各重鎮クラスは、カッパ 又はラムダ軽鎖のいずれがと結合することができる。一般的に、軽鎖と重鎮は、 互いに共有結合で結合しており、そして免疫グロブリンがハイプリドーマまたは Ｂ細胞により産生される時に、２本の重鎮の「尾ｊ部分はジスルフィド共有結合 により互いに結合されている。しかしながら、鎖の非共有結合が正確な幾何学で 行われ得る場合には、非ジスルフィド結合鎖の凝集体はまだ抗原と反応できる。
アミノ酸配列は、Ｙ字の二叉の端部のＮ端がら重鎖の底部のＣ末端までに及ぶ。
可変領域はＮ末端にあり、そして定常領域はＣ末端にある。
「定常」及び「可変」という用語は、機能的観点から使用される。軽鎖（Ｖｔ　 ）と重鎮（ＶＨ）の両方の可変領域により、抗原に対する結合認識および特異性 が決定される。軽鎖の定常領域ドメイン（ＣＬ）と重鎮の定常領域ドメイン（Ｃ イ）により、抗体鎖会合、分泌、経胎盤移動性及び補体結合等の重要な生物学的 性質が付与される。
可変領域は、重鎖において、■遺伝子配列とＣ遺伝子配列とを結合している結合 により定常領域に結合されている。この結合はゲノムレベルで生じ、組換え部位 を介してヌクレオチド配列を結びつける。この結合配列は、現在、軽鎖遺伝子で はｒＪＪ配列として知られており、約１２個のアミノ酸をコードしている。一方 、重鎮遺伝子では「Ｄ」配列とｒＪ」配列との組み合わせとして知られており、 これらは−緒になって約２５個のアミノ酸をコードしている。
本発明の目的の「キメラ抗体」は、重鎖において、マウスジャームライン遺伝子 由来のヌクレオチド配列によりコードされる可変領域アミノ酸配列と、ヒト遺伝 子由来のヌクレオチド配列によりコードされる定常領域アミノ酸配列とを有する 抗体について言及する。
しかしながら、本発明は、単に、免疫グロブリン定常領域をコードするマウスＣ 遺伝子配列を、免疫グロブリン定常領域をコードするヒトＣ遺伝子と置換するこ とには限定されない。したがって、本発明は、融合点が可変／定常境界にあるか どうかには限定されない。
種々の技術により、本明細書において開示されるヌクレオチド配列によりコード される改変キメラ抗体、複合キメラ抗体及び断片化キメラ抗体を製造することが 可能である。
「複合」免疫グロブリンは、いままで互いに会合していることが天然に見出され ていないポリペプチド可変領域を含んでいる。凝集物が特定の抗原又は抗原ファ ミリーと選択的に反応することができる限りは、上記のいずれかが共有的又は非 共有的に凝集しているかどうかは重要ではない。
「改変抗体」とは、アミノ酸配列（特に可変領域において）が変更された抗体を 意味する。組換えＤＮＡ技術と本発明との関連性のため、天然源から選択された 抗体のアミノ酸配列に限定する必要はなく１．所望の特性が得られるように抗体 のアミノ酸配列を再設計しそもよい。可能な変形は数多くあり、そしてその範囲 も一つ若しくは数個のアミノ酸の変更から抗体可変領域および／または定常領域 の完全な再設計までに及ぶ。
可変領域の変更は、抗原結合特性を改善するためになされるだろう。一方、定常 領域の変更は、一般に補体結合、膜との相互作用及び他のエフェクター機能等の 細胞過程の特性を向上させるためになされるだろう。変更は、標準的な組換え技 術により行われ、また、オリゴヌクレオチド指向突然変異誘発法によっても行う ことができる（Ｄａｌｂａｄｉｅ−ＭｃＦａｒｌａｎｄら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ 、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、（ＵＳＡ）、　？９．６４（Ｊ９（１９８２））。
免疫グロブリンの「断片」は、例えば、特定の抗原又は抗原群と選択的に反応で きる、抗体分子のタンパク質分解で開裂された部分または組換えで調製した部分 のセグメントを含む。このようなタンパク質分解および／または組換え断片の非 限定例としては、例えば、ｒＦａｂ　Ｊ、ｒＦ（ａｂ’　）ｚＪ及びｒＦａｂ　 Ｊ　（これらのタンパク質分解開裂部位は第１図に示されている）；並びに’Ｆ Ｖ　Ｊ及び「ＶＨ」が挙げられる。
’ＦＶ　Ｊ断片とは、軽鎖可変領域と重鎮可変領域の部分が、通常カルボキシ末 端でいっしょに結合していることを意味する。Ｆｖ断片を製造するための組換え 技術は、Ｗｏ　８Ｂ１０１６９、ＷＯ８８１０６６３０、罰８８１０７０８５　 、罰８８１０７．０８６及び讐０８８１０９３４４に記載されている。’ＶＨＪ 断片とは、可変領域が抗原結合性官能基として使用することのできる重鎮可変領 域の少なくとも部分を有していることを意味する。抗原結合性官能基としての軽 鎖可変領域（ＶＬ　）の調製及び用途は、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ。
Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　（ＵＳＡ）　、　８６．５５３７〜５５４１　（１９８９ ）において、Ｗｉｌｌｉａｍｓ等により「抗体構造に基づ（生物学的に活性なペ プチドの開発」と題する論文に記載されている。
本発明において、「動物」とは、牛、ブタ、ネズミ及びヒトなどの霊長類等が含 まれることを意味する。
「発現ベクター」という用語は、適当な宿主中で特定のＤＮＡコードの発現を行 うことのできるいずれのＤＮＡ配列の機能的定義に与えられる。現在、このよう なベクターは、しばしばプラスミドの形態であるので、「プラスミド」と「発現 ベクター」は、しばしば交換できるように用いられる。しかしながら、本発明で は、同等の機能を果たし、そして当該技術分野において時々公知となることがあ る他の形態の発現ベクターも含まれる。
「形質転換」とは、遺伝子型を変化せしめ、その結果、受容細胞の変化をもたら すような受容宿主細胞へのＤＮＡの導入を意味する。
「宿主細胞」とは、組換えＤＮＡ技術を使って作製されたベクターにより組換え 形質転換されている細胞を言う。本明細書で明らかにされているように、宿主細 胞により産生される抗体又はその変異体は、この形質転換によるものである。
組換え宿主から抗体を単離する方法の説明において、特記しない限り、「細胞」 と「細胞培養物」とは抗体の入手源を示すために交換できるように用いられる。
即ち、「細胞」からの抗体の回収は、遠心沈澱された全細胞からの回収か、培地 と懸濁細胞の両方を含有する細胞培養物からの回収を意味核酸、アミノ酸、ペプ チド、保護基、活性基及び類似成分を略記するときにはＩＵＰＡＣＩＵＢ（Ｃｏ ｍｏ＋１ｓｓｉｏｎ　ｏｎ　ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＮｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ） 又は関連分野における慣例により行う。以下にその例を示す。
拭−１ ＥＤＴＡ　：エチレンジアミン四酢酸 ＳＯ３ニドデシル硫酸ナトリウム 挾−敗 ＲＮＡ　　：リボ核酸 ＤＮＡ　　：デオキシリボ核酸 倉１１１１五 ブユｌ　　　　　　　ざ」」しとＺ Ａ：アデニン　　　　Ｔ：チミン Ｇニゲアニン　　　　Ｃ：シトシン Ｕ：ウラシル ＤＮＡとＲＮＡは、両方とも、リン酸、糖及び含窒素塩基からなる長鎖を含んで いる。ＤＮＡは糖が２−デオキシリボースである二本鎖らせんであり、一方、Ｒ ＮＡは糖がＤ−リボースである一本鎖である。ＤＮＡヌクレオチドを特徴づける ４種の含窒素塩基は、相補的対において水素結合により結合してＤＮＡの二重ら せんを形成する。この際、アデニンはチミンに結合し、グアニンはシトシンに結 合する。ＲＮＡにおいては、記載したＤＮＡ対においてチミンがウラシルに置き 換わる。
Ｇｕｙ　ニゲリシン　　　　Ｐｈｅ　：フェニルアラニンＡｌａ　　：アラニン 　　　　Ｔｙｒ　：チロシンＶａｌ　　：バリン　　　　　　Ｔｈｒ：）レオニ ンＬｅｕ　　：ロイシン　　　　Ｃｙｓ　ニジスティン１１ｅ　：イソロイシン 　　Ｍｅｔ　：メチオニンＳｅｒ　　：セリン　　　　　　Ｇｌｕ：グルタミン 酸Ａｓｐ　　：アスパラギン酸　ＴｒｐニトリブトファンＬｙｓ　　：リジン　 　　　　Ｐｒｏ　ニブロリンＡｒｇ　：アルギニン　　　Ａｓｎ　：アスパラギ ンＨｉｓ　　：ヒスチジン　　　Ｇｉｎ　：グルタミン河」Ｉ１嗟 重鎮をコードするＤＮＡは、ＶＨ遺伝子配列、ＤＨ遺伝子配列及びＪ、遺伝子配 列から成る。軽鎖をコードするＤＮＡは、ｖＬ遺伝子配列及びＪＬ遺伝子配列か ら成る。
呈し遺伝ヱ【剋 本発明は、ＴＡＧ７２に対して特異的反応性があるジャームライン遺伝子（ＶＨ αＴＡＧ）由来のＤＮＡ配列によりコードされるｖＨ領領域有する選択されたキ メラ抗体に関し、その配列を第２図に示す。該キメラ抗体は、ＴＡＧ７２に結合 する能力に基づいて選択される。即ち、可変領域は、８７２．３の可変領域がＴ ＡＧ７２に結合するよりも少なくとも２５％多くがＴＡＧ７２に結合する。
一般的に、キメラ抗体とＢ７２．３の結合親和力は、同じ方法で測定される。抗 体結合親和力を測定するための方法については、例えば、下記の文献に記載され ている：　５ｃａｔｃｈａｒｄ　Ｇ。
Ａｎｎａｌｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｎ、Ｙ、Ａｃａｄ、ｏｆ　５ｃｉｅｎｃｅｓ　５ Ｌ　６６０（１９４９）；５ｔｅｅｓａｒｄ、Ｍ、Ｗ、＋　およびＰｅｔｔｙ、 Ｒ，Ｅ、、　Ｉｍｍｕｎｔ山ＩＬ２３．８８１（１９７２）　；Ｍｕｒａｒｏ、 　Ｒ，、ら、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　４８＋　４５８８（１９８８） ；並びにＨｅｙｏ＋ａｎ＋　Ｂ、、　Ｊ、ｏｆＩｎ＋ｍｕｎｏ１．Ｍｅｔｈｏｄ ｓ　６ＥＬ１９３−２０４（１９８４）。
当業者は、本発明の結果としてｖＭαＴＡＧのヌクレオチド配列（及び■９αＴ ＡＧによりコードされるアミノ酸配列）には、事実上相同なヌクレオチド配列及 び対応するアミノ酸配列が含まれることは理解できるであろう。「事実上相同な 」とは、ヌクレオチド又はアミノ酸配列が同−又はほぼ同一であることを意味す る。したがって、本明細書における開示において、低度の配列の変化が相同配列 内に存在することができ、少なくとも８０％の相同性を示すいずれの配列も等価 とみなされることは理解されるであろう。
相同性は、２つの配列（恐らく長さの異なる）を整列した後の一致する塩基（又 はアミノ酸）の割合又は百分率で表される。用語「整列」は、…Ｌ旦駐」肛旺」 旦ｉ１Ｌ肘旦紅」皿Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ：Ｔｈｅ　Ｔｈｅｏｒ　　ａ ｎｄ　Ｐｒａｃｔｉｃｅ　ｏｆ　Ｓｅ　ｕｅｎｃｅ　Ｃｏｍ−朋道１卯Ａｄｄｉ ｓｏｎ−Ｗｅｌｓｌｅｙ、Ｒｅａｄｉｎｇ、マサチューセッツ州（１９８３）の 第１章において５ａｎｋｏｆｆ及びＫｒｕｓｋａｌにより定義されている意味で 用いられる。おおまかに説明すると、最小数の「ブランク」又は「ヌル」塩基を ２つの配列の一方に挿入させて重なりが最大となるようにしながら、一致する塩 基（又はアミノ酸）の数を最大することにより２つの配列を整列させる。
当該技術分野において理解されるように、ヌクレオチドのミス対合（ｍｉｓｏ＋ ａｔｃｈ）が、最終的なポリペプチド配列におけるアミノ酸置換を生じることな くコドンの第三塩基または対合を緩める（ｗｏｂｂｌｅ）塩基で生じてもよい。
また、遺伝子配列の一定領域における低度のヌクレオチド変異（例えば、置換、 挿入又は欠落）は、そのような変異が最終生成物の機能を変更しないアミノ酸配 列の変化を生じる時は常に許容され、重要でないと考えられる。遺伝子機能を損 失することなく、遺伝子配列全体又は一部分を化学的に合成したコピーを天然遺 伝子中の対応部分と置換できることは示されている。
特定のＤＮＡ配列の相同体は、当該技術分野において十分理解されるような（Ｎ ｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｈｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ＋　Ｈａｔａｅｓ　ａｎｄ Ｈｆｇｇｅｎｓ（Ｗ）　、ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ、０ｘｆｏｒｄ、ＵＫ（１９８５ ）において記載されているような〕緊縮条件下での核酸の交差ハイブリダイゼー ション試験を使って当業者により同定することができる。
２つの配列に与えられたアルゴリズムは、それらの相同性を計算するのに利用で きる〔例えば、Ｎｅｅｄｌｅｈａａ＋及び−ｕｎｓｃｈＪ、Ｍｏ１．Ｂｉｏ１． 　、４８．４４３〜４５３（１９７０）　；並びに５ａｎｋｏｆｆ及びＫｒｕｓ ｋａｌ（前掲）、第２３〜２９頁参照〕。また、このような比較を行うのに民間 のサービス例えば、Ｉｎｔｅｌ　ｌｆｇｅｎｅｔｉｃｓ、　Ｉｎｃ、　（Ｐａｌ 。
ＡＩｔｏ、ＣＡ）を受けることができる。
Ｄ　びＪ＝ｙ云配Ｉ ＤＨ及びＪＨ遺伝子セグメントは種々のタイプで存在するが、選択されるＤ又は Ｊ遺伝子セグメントのタイプは本発明にとって重要ではない。即ち、Ｄ、及びＪ ｏは、いずれの動物に由来するものでもよい。好ましい動物としては、マウス及 びヒトが挙げられる。明らかに、ヒ）ＤＨおよび／またはＪＨ遺伝子セグメント が特に好ましいが、本発明は、別の動物種由来のＤ又はＪ遺伝子セグメントが重 要な性質、即ち、ＴＡＧ７２に対する増加された結合を提供できる限りは、この ようなものには限定されない。
典型的なマウスＤＨ及びＪＨ配列は、「免疫グロブリン重鎮多様性ＤＮＡセグメ ント」、黒沢及び利根用、Ｊ、Ｅｘ、Ｍｅｄ、。
１５５、２０Ｈ１９８２）並びに「免疫グロブリン重鎮の接合領域遺伝子の配列 及び抗体多様性の発生におけるそれらの役割」、Ｇｏｕｇｈ及びＢｅｒｎａｒｄ 、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ’１．　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、（ＵＳＡ）＋　７８．５０９ （１９８１）　）に記載されている。典型的なマウスＤＨ及びＪＭ配列について は、「縦列多重遺伝子族にコードされているヒト免疫グロブリンＤセグメントＪ 　、５ｉｅｂｅｎｌｉｓｔら、Ｎａｔｕｒｅ　２９４゜６３１　（１９８１）に 記載されており、そして典型的なＪＮ配列については、「ヒト免疫グロブリンμ 遺伝子座の構造：胚性及び再配列Ｊ及びＤ遺伝子の特性決定Ｊ　（Ｒａｖｅｔｃ ｈ）等、Ｃｅ１ｌ　２７゜５８３　（１９８１）に記載されている。
Ｖ　　びＪ　−「 −ａに、ＶＨｃｒＴＡＧに事実上相同なヌクレオチド配列によりコードされる■ ８に相補的であるｖＬの一部分をコードするいずれのＶＬ及びＪＬ遺伝子配列も 使用できる。「相補的」とは、■９に結合し、そして結合親和力定数を測定する 標準法により測定した時、８７２．３より少なくとも２５％大きい結合親和力を 有する抗体可変領域を生じるＶ、を意味する。
選択されるＶ、及びＪＬ遺伝子セグメントのタイプは、本発明にとっては重要で はない。即ち、■、及びＪＬは、いずれの動物に由来するものでもよい。好まし い動物は、マウス及びヒトを含む、明らかに、ヒトＶＬ及び／又はＪ、遺伝子セ グメントが特に好ましいが、本発明は、別の種由来のＪＬ上セグメント重要な性 質、即ち、ＴＡＧ７２に対する結合力の増加を提供できる限りは、これに限定さ れない。
マウスＪＬ配列は、「マウスχ免疫グロブリンＪ及びＣｅＭ域遺伝子を含有する ５、５キロ塩基対のＤＮＡセグメントのヌクレオチド配列」Ｍａｘ等、Ｊ、Ｂｉ ｏｌ、Ｃｈｅ＊、　２５６．５１１６〜５１２０（１９８１）に記載されている 。ヒトＪ、配列については、「ヒト免疫グロブリンにＪ頬域遺伝子の進化」、ハ Ｌ起■旦「妊」圏旦■−ｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒ　、３５７（２）、１５１６ 〜１５２２（１９８２）に記載されている。
！ｍ旧ｉ導 上記の教示から、本発明の範囲内の抗体可変領域、即ち、Ｖ、ｃｔＴＡＧに対し て事実上相同なＶＨ配列を有し、そして該抗体と８７２．３の結合親和力を同じ 方法で測定した時、８７２．３の可変領域がＴＡＧ７２に結合するよりも少なく とも２５％多くＴＡＧ７２に結合する抗体可変領域の多数の特定の実施態様を誘 導することが可能である。い（つかの可能な方法を以下に示す。
天皇Ｗ填 免疫原ＴＡＧ７２に応答して、免疫処置動物は選択された抗体産生Ｂ細胞を増加 させ志だろう。Ｂ細胞により産生される抗体の可変領域は、再配列されたジャー ムライン重鎖及び軽鎖ＤＮＡによりコードされるだろう０例えば、再配列された ジャームライン重鎖は、リーダー配列を含むＶ、ＤおよびＪ遺伝子セグメント、 並びに以後除去され得るイントロンを含むだろう。軽鎖をコードしているＤＮＡ は、リーダー配列を含むＶおよびＪ遺伝子セグメント、並びに以後除去され得る イントロンを含むだろう。
多様性は、ＶＮαＴＡＧの生産的な再配列の際中にＢ細胞に起こる体細胞突然変 異から生じる。これらの体細胞突然変異は、ヌクレオチド変化であり、この変化 は、生産的に再配列されたｖＨのＴＡＧ７２に対する活性を変化させるようなア ミノ酸変化をもたらす場合と、そうでない場合がある。
スクリーニング法 モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体をスクリーニングして、前記抗体の どれが選択的にＴＡＧ７２に結合するかを測定することができる。このようなス クリーニングは、固相ラジオイムノアッセイ、エンザイムーリンクドイムノソル ベントアッセイ、ロゼツトアッセイ及びブロッキングアッセイ等の多数の周知の 方法により達成することができる。上記の方法は、当該技術分野において周知で ある。
ＶＫαＴＡＧの生産的再配列から産生される抗体の可変領域をコードするヌクレ オチド配列が得られた。ＶＨαＴＡＧのヌクレオチド配列に加えて、第２図は、 ＣＣ４６，ＣＣ４９，ＣＣ８３及びＣＣ９２抗体の重鎮可変領域をそれぞれコー ドするヌクレオチド配列も示している。第３図は、第２図に示したヌクレオチド 配列に対応するＶｓαＴＡＧＶＨ１ＣＣ４６ＶＮ　、ＣＣ４９Ｖｓ　、ＣＣ８３ ＶＮ及びＣＣ９２Ｖ　ｏのアミノ酸配列を示す。Ｖ、ｃｒＴＡＧＶＨ，ＣＣ４６ Ｖ、　。
ＣＣ８３ｖ、及びＣＣ９２ＶＰのヌクレオ・チド配列とアミノ酸配列を比較する と、最も注目すべき特徴、即ち、鎖が非常に類似していることが分かる。
ＣＣ４６Ｖｓ　、ＣＣ４９Ｖｎ　、ＣＣ８３ＶＭ及びＣＣ９２ＶＷ領領域コード するＤＮＡ、特に５′フランキングセグメントをコードするＤＮＡの相対的類似 性は、これらのＤＮＡ配列がＶ、αＴＡＧ由来のものであることを証明する。Ｂ 細胞中で発現されるべき■Ｈ領域遺伝子の生産的再配列中に起こる体細胞突然変 異は、ある種のヌクレオチド変化を生じる。このヌクレオチド変化は、２つの生 産的に再配列されたＶ、αＴＡＧを産生するハイブリドーマ間の相同アミノ酸変 化をもたらすこともたらさないこともある。
ＣＣ４９Ｖｔのヌクレオチド配列と対応アミノ酸配列を、それぞれ第４ａ図及び 第４ｂ図に示す。ＣＣ８３ＶＬのヌクレオチド配列と対応アミノ酸配列を、それ ぞれ第５ａ図及び第５ｂ図に示す。ｃｃ９２　ＶＬのヌクレオチド配列と対応ア ミノ酸配列を、それぞれ第６ａ図及び第６ｂ図に示す。
プローブ法 九αＴＡＧ由来のＤＮＡによりコードされる他の抗体は、ハイブリダイゼーショ ンプローブとしてｖＨαＴＡＧを使用することにより誘導できる。一般的に、ｖ ＨαＴＡＧのＤＮＡ又はＲＮＡまたは組換え■□αＴＡＧを含有する再配列遺伝 子から作製されたプローブは、未知のハイブリドーマ中の相同遺伝子を見つける ために当業者により使用され得る。このような相同抗体は、そのｍＲＮＡがｖＨ αＴＡＧジャームライン遺伝子及びそのフランキング領域の全部又は一部分のプ ローブとハイブリダイズするＤＮＡ配列を有するだろう。「フランキング領域」 は、ｖＨαＴＡＧの５′末端から上流遺伝子の３′末端までのＤＮＡ配列及びｖ ８αＴＡＧの３′末端から下流遺伝子の５′末端までのＤＮＡ配列を含む。
ム　・にＡ　　れた口　６　の さらなるアプローチは、本明細書に開示される抗体の他にブロービングにより発 見された抗体の変性可変領域の合理的な合成である。このようなアプローチは、 いくつかの潜在的な利点がある。即ち、研究者は、免疫処置した宿主動物をスク リーニングして、まずＴＡＧに結合する抗体を選択し、次にｖＨαＴＡＧ由来の ＤＮＡによりコードされる■Ｈ領領域特異的に有する抗体を選択する必要がなく なるだろう。
突然変異誘発法 ＶＨ及び／又は■、遺伝子セグメントは、突然変異誘発により「改変」すること ができる。典型的な方法は、限られた数の種々のヌクレオチドの付加、削除若し くは保存性置換又は多数のヌクレオチドの保存置換を含むが。但し、この際、適 当な読み枠が維持されなければならない。
置換、削除、挿入又はいずれかのサブコンビネーションを組み合わせて、最終的 な構成物に到達することができる。６４個のコドン配列があり得るが、２０個の アミノ酸が公知であるにすぎないので、遺伝子コードは、異なるコドンが同一の アミノ酸を生じ得る点で退化している。しかしながら、このコードは各アミノ酸 について正確である。したがって、各アミノ酸に対して少な（とも一つのコドン があり、即ち、各コドンは単一アミノ酸を生じ、他のアミノ酸は生じない。最終 的に産生されるポリペプチドにおいて適当なアミノ酸を得るために、翻訳中に適 当な読み枠は維持されなければならないことは明らかである。
公知の配列を有する所定のアミノ酸部位に付加させる手法はよく知られている。
典型的な方法は、例えば、オリゴヌクレオチド媒介部位特異的突然変異誘発及び ポリメラーゼ鎖反応が挙げられる。
既知の配列を有する所定のアミノ酸部位での削除方法もよく知られている。典型 的な方法は、例えば、オリゴヌクレオチド媒介部位特異的突然変異誘発及びポリ メラーゼ鎖反応を含む。
既知の配列を有する所定のアミノ酸部位での置換方法も周知である。典型的な方 法は、部位特異的突然変異誘発及びポリメラーゼ鎖反応を含む。
オリゴヌクレオチド媒介部位特異的突然変異誘発は、本質的には、所望の変異を コードしているオリゴヌクレオチドを、突然変異させようとする領域を含む一本 鎖ＤＮＡとハイブリダイズせしめ、そしてオリゴヌクレオチドの延長のための鋳 型としてその１本鎖を使って突然変異を含む鎖を製造することを含む。この方法 の種々の態様が以下の文献に記載されている：　Ｚｏｌｌｅｒ、Ｍ、Ｊ、及びＳ ｎ＋ｉｔｈ、Ｍ、＋Ｎｕｃ、Ａｃ１ｄｓＲｅｓ、　１０＋　６４８７−６５００ 　（１９８２）　；Ｎｏｒｒｉｓ、　Ｋ、　＋　Ｎｏｒｒｉｓ＋　Ｆ、　、　Ｃ ｈｒｉｓｔｉａｎｓｅｎ＋　Ｌ、及びＦｉｉｉ。
Ｎ、、　Ｎｕｃ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５−１１．５１０３−５１１２（１９８３） ；Ｚｏｌｌｅｒ、Ｍｕ、及びＳｍ１ｔｈ＋Ｍ、、　ＤＮＡ　３＋　４７９−４８ ８（１９８４）；Ｋｒａｍｅｒ、Ｗ、、Ｓｃｈｕｇｈａｒｔ、Ｋ。
及びＦｒ１ｔｚ、Ｗ、Ｊ、、　Ｎｕｃ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ　１０．６４７５− ６４８５（１９８２）。
ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）は、本質的には、配列特異的オリゴヌクレオチド を用いて試験官内でＤＮＡを指数的に増幅することを含む。オリゴヌクレオチド には、所望であれば、配列の変化を組み込むことができる。ポリメラーゼ鎖反応 方法は、Ｍｕｌｌｉｓ及びＦａｌｏｏｎａ、Ｍｅｔｈ、Ｅｎｚ、、　１５５＋３ ３５〜３５０（１９８７）に記載されている。ＰＣＲを用いた突然変異誘発の例 は、旧ｇｕｃｈ　ｉ等、Ｎｕｃ、Ａｃ１ｄｓ、Ｒｅｓ、、１６．７３５１〜７３ ６７（１９８８）；　Ｈｏ等、Ｇｅｎｅ＋　７７゜５１〜５９（１９８９）　； 及び「制限酵素を使用しないハイブリッド制限遺伝子の操作ニオ−バラツブ延長 による遺伝子スプライシングＪ　Ｈｏｒｔｏｎ等Ｇｅｎｅ　７７６Ｈ１９８９） に記載されている。
抗体可変領域の改変は、特にモノクローナル抗体の治療用途に用いることができ る。現在、完全マウス可変ドメインを含むキメラ抗体をヒトに注射すると、完全 マウス抗体ではないにもかかわらず、人体の免疫系はマウス可変ドメインを外来 のものとして認識し、そしてそのマウス可変ドメインに対する免疫反応を生じる 。したがって、それ以後にヒトにマウス抗体又はキメラ抗体を注射すると、外来 抗体に対する人体免疫系の作用によりその有効性がかなり減少する。従って、マ ウスＶ、及び■Ｌ領領域改変は、改変抗体に対するヒト免疫反応を減らすことが できる。
組換え技術 抗体は、組換え技術により作製することができる。言い換えれば、種々の■８コ ード領域及び■、コゴー領域のヌクレオチド配列が現在提供されているので、当 業者は、重鎮可変領域及び軽鎖可変領域をコードしている完全遺伝子を試験管内 で製造できる。
作製された遺伝子は、選択されたり、及び３Ｍ遺伝子セグメントが、選択された ■□遺伝子セグメント即ち、Ｖ、ｃｒＴＡＧセグメント又はＣＣ４９もしくはＣ Ｃ８３の■８遺伝子セグメントと機能的に組合わされている形態で操作すること ができる。
例えば、作製された重鎮コードＤＮＡは、ジャームラインｖＮαＴＡＧの３′末 端と隣接しているＤＨ及びＪＨ遺伝子配列を含み、それにより■８　ドメインの ＣＤＲ３とフレームワーク（ＰＲ）４を完成する。リーダー配列は存在していて もよいが、以後に除去してもよい。
用いられる軽鎖によっては、作製した軽鎖コードＤＮＡを提供することが必要な ことがある。このようなりＮＡ遺伝子は、例えば、以後に除去することができる リーダー配列を含んだＪＬ遺伝子セグメントと隣接した機能的組合わせにおいて ｖＬ遺伝子セグメントを含んで成るだろうｅ　ＪＬ遺伝子セグメントは、軽鎖が ラムダ系又はカッパ系であるかどうかにより異なるだろう。Ｊ頭域配列は、ｖＬ エクソラン末端に隣接してｖＬ　ドメインのＰＲ４を完成している。このような 作製は、７Ｍ遺伝子を作製するのに使用される方法により行うことができる。
作製された遺伝子は、従来の組換え技術により操作して、例えば、発現できるプ ラスミド中の遺伝子挿入断片を提供することができる。その後、プラスミドは、 宿主細胞中で発現され得る。典型的な組換えの生物学的方法を以下に説明する。
軽鎖又は重鎮可変領域のいずれかをコードしている断片を提供する際、通常、Ｊ 　ｆｉＪｌ域から下流にイントロンの全部又は一部分を含めることが望ましいだ ろう。特に、可変領域が、融合遺伝子を発現させようとする宿主に由来する場合 そうである。イントロンが保持される場合、イントロン末端に機能的スプライス アクセプター及びドナー配列が存在することが必要であろう、融合遺伝子のＪ　 ＳＪｉ域と定常領域との間のイントロンは、主に、（１）定常領域、（２）Ｊド メイン又は（３）各々の一部分と関連したイントロン配列でよい、最後のちのは 、便宜上２つの源からのイントロン中に便利な制限部位がある場合である。イン トロンを定常領域に連結するためにアダプターを設けることが必要であるかもし れない。ある場合には、イントロンの全体又は一部分を、削除、ヌクレオチド置 換又は挿入により改変して、操作、発現等をより容易にすることができる。好ま しくは、天然プロモーターに対して機能的に活性であるエンハンサ−を含ませる ために十分な量のイントロンが存在することが必要である。
また、Ｊ遺伝子とＣ遺伝子との間にイントロンがない融合遺伝子を有することが 望ましいことがある。即ち、Ｊ遺伝子の３′末端がＣ遺伝子の５′末端に隣接す る。エキソヌクレアーゼを使用することができ、そして消化期間を変えることに より３′末端を変えることができる。その後、これを定常領域との結合に用い、 そして機能的生成物についての選択を種々の方法で行うことができる；また、ポ リメラーゼ連鎖反応技術を用いた重複延長によるスプライシングによっても可能 であるＣＨｏｒｔｏｎら、前掲参照〕。この場合、エンハンサ−に対して必ずし も機能的に活性である必要がない人工プロモーターが一般的に利用されるだろう 。
好ましい一態様において、■８及び■１をコードしている遺伝子は、抗体の軽鎖 又は重鎮可変領域中の相補性決定領域（ＣＤＲｓ）の少なくとも一部分を、異な る特異性の抗体からのＣＤＲ５の類似部分で置換することにより変更できる。Ｃ ＤＲ５を置換する典型的な方法は、Ｇｒｅｇｏｒｙ　Ｗｉｎｔｅｒによるヨーロ ッパ特許出願公開公報第０２３９４００号及びハストン（Ｈｏｓ　ｔｏｎ）等に よるＰＣＴ出願第一０８８１０９３４４号に記載されている。本発明の改変抗体 においては、抗体のＣＤＲ５のみが人体に対して外来であるので、人の治療に使 用しても副作用を最小に抑えることができる。しかしながら、ヒト及びマウスフ レームワーク領域は、ヒトフレームワーク領域とマウスフレームワーク領域とを 区別する特徴を有している。したがって、ヒトフレームワーク中にマウスＣＤＲ ５を含有する抗体は、もはや真性ヒト抗体よりも人体に対して外来であることは ない。
ＶＨ（Ｘ　ＴＡＧ、　ＣＣ４６，ＣＣ４９，ＣＣ８３及びＣＣ９２のｖＨアミノ 酸配列に対応するヌクレオチド配列並びに、ＣＣ４９，ＣＣ８３及びＣＣ９２の ｖＬ遺伝子セグメントのヌクレオチド配列が提供される。
その結果、本発明の抗体からのＣＤＲ５はヒト抗体のフレームワーク領域上にグ ラフトさせることができると思われる。
一般に、ヒトｖＮ又はｖＬドメインからＣＤＲｔＪ域は、本発明の抗体のｖ９又 は■Ｌ領領域らのＣＤＲ５により置換することができる。フレームワーク部分が 使用できる典型的なヒト抗体としては、Ｇｒｅｇ　Ｗｉｎｔｅｒ博士から入手で きるヒトプラズマ細胞ＮＩＷＭ　［Ｊｏｎｅｓ等、「ヒト抗体における相補性決 定領域とマウスからのものとの置換Ｊ　Ｎａｔｕｒｅ　３２１．５２２〜５２５ （１９８６））　：及びＴｅｒｒｅｎｃｅ　Ｒａｂｂｉｔｔｓ博士から入手でき る他の種々のｖＮ及び■、遺伝子が含まれる。上記の両研究者は、ＷＩＮ４ＡＬ 、ロンドン、２０パーク・クレセントにあるザ・メディカル・リサーチ・カラン セル（Ｔｈｅ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｃｏｕｎｃｉｌ）の研究者 である。
何がＣＤＲを構成しているかそして何がフレームワークを構成しているかの決定 は、Ｋａｂａ　を等、御玉二μ土旦り江蛙蛙Ｕｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏ　１ｃａ ｌニ一月丼、第４版（１９８７）、Ｕ、Ｓ、Ｄｅｐｔ、ｏｆＨｅａｌｔｈ　ａｎ ｄ　Ｈｕｍａｎ　５ｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨにおいて示されている選択されたＩ ｇのアミノ酸配列に基づいて行われる。
４つのフレームワーク領域は主としてβシート高次構造をとり、そしてＣＤＲ５ はβシート構造を接続しているそしである場合にはβシート構造の一部分を形成 しているループを形成する。
さらに、ループ領域中のアミノ酸残基の全てが溶媒に近づきやすいわけではなく 、そしである場合には、フレームワーク領域中のアミノ酸残基が抗原結合に関与 している（Ａｍｉｔ。
八、Ｇ、、Ｍａｒｉｕｚｚａ、Ｒ，Ａ、、　Ｐｈ１ｌｌｉｐｓ、Ｓ、ＥＪ、及び Ｐｏ１ｊａｋ、Ｒ，Ｊ、。
５ｃｉｅｎｃｅ、　２３３，７４７〜７５３（１９８６）参照〕。
また、抗原結合性部位の２つの部分の可変領域は、鎖間非共有相互作用により正 しい方向に保たれる。それらは、ＣＤＲ内のアミノ酸残基が関与することがある 。
したがって、一つの可変ドメインの抗原結合能力を別の可変ドメインに移すため に、ＣＤＲ５の全てをドナー可変領域からの完全ＣＤＲ５と置換する必要はない 。抗原結合性部位に必要な残基を移動させればよいだけであり、そしてこれはフ レームワーク領域残基とＣＤＲ残基を移動することを含むだろう。
したがって、一つまたは複数のＣＤＲを単に相補的なＣＤＲ５と置換するだけで は、かならずしも機能的に変更された抗体が生じるわけではないことは明らかで ある。しかしながら、ヨーロッパ特許出願公開第０２３９４００に記載されてい るように、日常の実験を行うか、試行錯誤試験により機能変更抗体を得ることは 、当業者の能力の範囲内であろう。
重鎮と軽鎖の両方可変ドメインが、少なくとも部分的なＣＤＲ置換により、並び に必要ならば、部分的フレームワーク領域置換及び配列変更により変更されるの が好ましい。ＣＤＲは、フレームワーク領域の由来する抗体と同じクラス又は同 じサブクラスの抗体に由来してもよいが、ＣＤＲは異なるクラスの抗体、好まし くは異なる種からの抗体に由来することを意図する。
複泊１！−埃 一般的に、■、をコードするＶ遺伝子は、選択されたｖ）Ｉと本来結合している ■１をコードするものと同じ■遺伝子である。例えば、ＣＣ４９及びＣＣ８３の ■９をコードするＶ遺伝子を用いるときには、それぞれＣＣ４９及びＣＣ８３の ｖＬ領領域コードするＶ遺伝子を用いるのが有利である。
驚くべきことに、本発明の抗体のＶＨ領領域、ＶＭαＴＡＧ由来のｖＨ遺伝子に よりコードされるので、複合抗体が有利に形成され得る。換言すれば、本発明の 一つの抗体のＶ、ｌｊｌ域は、本発明の別の抗体の■Ｌ領領域適切に組み合わさ れ得る。ＣＣ４９及びＣＣ８３重鎖のアミノ酸配列は表面的には類似しているが 、数個又は１個のアミノ酸の変化が抗体の結合機能に著しく影響することが予想 される。即ち、得られる抗体は、一般的に、非特異的免疫グロブリン（ＮＳＩ） であり、即ち、抗体特性を欠いていると推定される〔ヨーロッパ特許出願公開第 ０１２５０２３号参照〕。
全く驚くべきことに、本発明の必須の■８を有する抗体は、同じ天然の動物抗体 からの■、とのみ再結合する必要はないことが判明した。例えば、実施例に記載 されているように、ＣＣ８３からの■８を有する重鎖とＣＣ４９からの■、を有 する軽鎖を含むキメラ抗体を作製することが可能である。このようにして形成さ れた複合抗体は、ＴＡＧ７２へのＢ７２．３の結合親和力よりも２５％大きい結 合特異性を有している。
定１惺堰 言゛°　Ｃドメイン Ｃ９ドメインは種々のヒトイソタイプ、即ち、ＩｇＧ（例えばループの種々のサ ブタイプであることができる。
ヒトγ１の論文については、例えばＥｌｌｉｓｏｎら、「ヒト免疫グロブリンＣ −ガンマ−１のヌクレオチド配列Ｊ　、Ｎｕｃｌ。
Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ、　１０．４０７１−４０７９（１９８２）　；Ｔａｋａｈａ ｓｈｉら、「ヒト免疫グロブリンガンマ遺伝子の構造：遺伝子ファミリーの進化 についての暗示」、如月−刈、　６７１−６７９（１９８２）を参照のこと。
ヒトガンマ２（Ｔ２）については、Ｋｒａｗｉｎｋｅｌ　ら、「ヒト免疫グロブ リンガンマ重鎖遺伝子中のヒンジーコードゼグメントの比較並びにガンマ２およ びガンマ４サブクラス遺伝子の連鎖Ｊ　、ＥＭＢＯＪ、　１　、４０３−４０７ （１９８２）；Ｅｔｌｉｓｏｎら、「２つのヒト免疫グロブリンガンマ重鎖定常 領域遺伝子の連鎖および配列相同性Ｊ　、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ、Ａｃａｄ、５ｃｉ （ＵＳＡ）　７９．１９８４−１９８８（１９８２）；Ｔａｋａｈａｓｈｉ　ら 、後述を参照のこと。ヒトガンマ３（γ３）については、Ｋｒａｗｉｎｋｅｌ　 ら、後述、およびＴａｋａｈａｓｈｉ　ら、後述を参照のこと。ヒトガンマ４　 （ｒ４）については、Ｅｌｌｉｓｏｎら、「ヒト免疫グロブリンＣ−ガンマ−４ 遺伝子のヌクレオチド配列」、財値上、　１１　１８（１９８１）ＨＫｒａｗｉ ｎｋｅｌら、後述；およびＴａｋａｈａｓｈｉ　ら、後述を参照のこと。
ヒトミューについては、Ｒａｂｂｉｔｔら、「ヒト免疫グロブリン重鎮遺伝子二 Ｃμ、ＣδおよびｃＴ遺伝子並びに関連のスイッチ配列の進化的比較」、Ｎｕｃ ｌ、Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ、　９．４５０９−４５０２４を参照のこと。
ヒトアルファについては、Ｐｌａｎａｇａｎら、「ヒト免疫グロブリンアルファ １およびアルファ２定常領域遺伝子配列の分岐および収束のメカニズム」、伽」 −践、　６８１−６８８（１９８４）を参照のこと。
ヒトデルタについては、Ｗｈｉｔｅら、「免疫グロブリンＤ：デルタ重鎖のゲノ ム配列Ｊ　、５ｃｉｅｎｃｅ　２２８．７３３−７３７（１９８５）を参照のこ と。
ヒトイプシロンについては、Ｍａｘら、「ヒト免疫グロブリンε遺伝子における 重複および欠失Ｊ　、Ｃｅ１１２９．６９１−６９９（１９８２）を参照のこと 。
業゛　　Ｃドメイン ＣＬ　ドメインは、ヒトカッパ（に）またはヒトラムダ（λ）であることができ る。
ヒトにについては、「クローン化されたヒトおよびマウスカッパ免疫グロブリン 定常およびＪ領域遺伝子は機能性セグメントにおいて相同性を保存しているＪ　 、Ｈｅ１ｔｅｒら、□□□■２２、１９７−２０７．１１月（１９８０）を参照 のこと。
ヒトλについては、「プロセシングされた遺伝子ＣＲＮＡタイプのプロセシング の証拠を有する分散ヒト免疫グロブリン遺伝子Ｊ　、Ｈｏ１ｌｉｓら、Ｎａｔｕ ｒｅ　２９６．３２１−３２５を参照のこと。
ＣＨおよび／またはＣＬ遺伝子セグメントは、突然変異誘発により゛°変更”す ることもできる。典型的な方法は、限定された数の種々のヌクレオチドの付加、 欠失もしくは非保存性置換、または多数のヌクレオチドの保存性置換を含み、た だし正しいリーディングフレームが維持されることを前提とする。加えて、例え ばＣ，３をＣＭ　２で置換することにより、タンパク質の完全ドメインを変更す ることができる。この置換は、配列の完全エキランを挿入、除去または置換する ことによりＤＮＡレベルで行われる。
坑盗企作ｌ− 九袋処！ モノクローナルであるかポリクローナルであるかにはかかわらず、ｖＨαＴＡＧ 由来のＤＮＡによりコードされる■９を有する抗体を製造するための第一の方法 は、宿主動物を精製ＴＡＧ７２で免疫処置することである。宿主動物をＴＡＧ７ ２で免疫処置する典型的なプロトコールは、米国特許第４，５２２，９１８号及 び第４．６１２，２８２号（免疫原としてヒト乳癌抽出物を使用）；並びに米国 特許出願第７−０７３，６８５号（これは一般に入手できる）（免疫原として８ ７２．３で精製したＴＡＧ７２を使用）に記載されている。
その後、免疫処置プロトコールから製造されたモノクローナル又はポリクローナ ル抗体をスクリーニングして、前記抗体のどれが選択的にＴＡＧ７２に結合する かを決定する。このようなスクリーニングは、固相ラジオイムノアッセイ、エン ザイムリンクドイムノソルベントアソセイ、ロゼッティングアッセイ及びブロッ キングアッセイ等の多数の周知の方法のいずれかにより行うことができる。上記 の方法は、当該技術分野において周知である。
：Ｌえム最酊死９冶戒 本発明の免疫グロブリンは、それらの構成アミノ酸から合成できる。適当な手法 は、Ｊ、Ａｍｅｒ、Ｃｈｅａ＋、Ｓｏｃ、８５＋　２１４９〜２１５４（１９６ ３）に記載されているメリフィールド面相法である。アミノ酸の配列を合成する ためのこの固相法は、Ｓｔｅｗａｒｔ　及びＹｏｕｎｇ　、　５ｏｌｉｄ　Ｐｈ ａｓｅ　Ｐｅ　ｔｉｄｅ　Ｓ　ｎｔｈｅｓｉｓ（Ｗ、Ｈ，Ｆｒｅｅｍｅｎ　ａｎ ｄＣｏ、、サンフランシスコ、１９６９年）の第１頁〜第４頁にも記載抗体重鎮 及び軽鎖をコードするＤＮＡは、当業者に公知の種々の入手源、例えば、ゲノム ＤＮＡ、　ｃＤＮＡ、合成りＮＡ又はそれらの組み合わせから得ることができる 。
所望の配列をコードしている細胞を単離し、そしてゲノムＤＮＡを一種または複 数の制限酵素により断片化できる。ゲノムＤＮＡは、天然のイントロンを含んで いてもいなくてもよい。
得られた断片は、クローニングし、そして重鎖Ｊ　９７４域（ＪＭ　）プローブ を用いて着目のポリペプチド配列をコードしているＤＮＡ配列の存在についてス クリーニングすることができる。
調製用アガロースゲル電気泳動により単離されたＤＮＡ断片を連結する。ライブ ラリーの組換えプラークを、マウスＪ、プローブを用いてスクリーニングする。
また、ＤＮＡはｃＤＮＡライブラリーから得ることもできる。重鎮又は軽鎖をコ ードしているメツセンジャーＲＮＡを、ＲＮＡ単離の標準方法を用いて、適当な 入手源（成熟Ｂ細胞又はハイブリドーマ培養物）から単離し、そしてオリゴｄＴ セルロースクロマトグラフィーを用いてポリＡ　ｍＲＮＡを分離する。さらに、 ポリＡ　ｍＲＮＡを分画して、必要に応じて所望の抗体の軽鎖又は重鎮中のアミ ノ酸配列をコードするのに十分な大きさの配列を得る。
次いで、適当なプライマー、好ましくは所望のｃＤＮＡに特徴的な核酸配列を用 いて、ｓ＋ＲＮＡ混合物からｃＤＮＡライブラリーを調製する。そのようなブラ イマーは、抗体のアミノ酸配列に基づいて合成することができる。また、所望の 抗体又はポリｄＴを産生ずる細胞系からの未分画ポリＡ　ｍＲＮＡ由来のｃＤＮ Ａも使用できる。得られたｃＤＮＡは、所望により、ポリアクリルアミドゲルで サイズ分画した後、例えばｄＣ残基で延長し、Ｐｓｔｌ等の適当な制限酵素によ り開裂せしめそしてｄＧ残基で延長したｐＢＲ３２２又は他の適当なりローニン グベクターとアニーリングする。他のテール及び他のクローニングベクター残部 を使ってｃＤＮＡを含むクローニングベクターを形成せしめる代替手段をもちろ ん使用できるが、上記の方法は標準的で好ましいものである。適当な宿主細胞株 、典型的には大腸菌（４延）をアニールしたクローニングベクターで形質転換せ しめ、そして好結果の形質転換体を、例えば、アンピシリン若しくはテトラサイ クリン耐性又はクローニングベクタープラスミド上に残存している他の表現型特 性により同定する。
好結果の形質転換体を採取し、そして更なる増殖および保存のためミクロタイタ ープレート又は他の支持体に移す、これらの増殖培養物のニトロセルロースフィ ルター転写物を、次に、ｃＤＮＡ中の所望の配列と相補的であることが知られて いる塩基を含有する適当なヌクレオチド配列で探索する。数種のプローブを使用 できるが、７−”Ｐ　ＡＴＰでリン酸化することにより標識した合成一本１ｉ　 ＤＮＡ配列が好ましい、ニトロセルロースフィルターに固定された細胞を溶解し 、ＤＮＡを変性し、固定した後、リン酸化プローブと反応させる。好結果にハイ ブリダイズするクローンをフォトプレートと接触させることにより検出し、増殖 しているコロニーからプラスミドを単離し、そして当該技術分野で公知の手段に より配列決定して、遺伝子の所望の部分が存在することを確認する。
所望の遺伝子断片を切り取り、操作して、適当な発現ベクターに挿入した時調節 セグメントを有する適当なリーディングフレームを確保する。典型的には、ヌク レオチドを５′端に付加して開始シグナルおよび適当に配置された制限エンドヌ クレアーゼ部位を含める。
本発明等はｖ）ＩαＴＡＧのヌクレオチド配列を提供したので、ＤＮＡも、例え ば、アプライド・バイオシステムズ（商標）３８０Ａ型ＤＮＡ合成装置を用いて 合成し、そして標準法により作製することができる。
上記の技術の組み合わせを利用する典型的な方法は、ポリメラーゼ連鎖反応を使 った重複伸長でのスプライシングによるものである（Ｈｏｒｔｏｎ等、前掲）。
一般的に、いわゆる「ワギング・テール（Ｗａｇｇｉｎｇ　ｔａｉｌ）　Ｊを有 する合成ブライマーを、選択された配列、例えば、ゲノムＤＮＡと共に挿入でき る。その後、配列を増幅し、−緒にスプライスする。
ＣびＣコード　るＤＮＡ ヒト定常領域のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ断片は、ヒト免疫グロブリンを 産生じている細胞の染色体ＤＮＡをスクリーニングすることにより得ることがで きる。
ゴ３−乞ニー 所望のＤＮＡ断片は、選択されたＤＮＡ断片中に存在しない適当な調節配列を含 むことがある生物学的に機能的な発現ビヒクルに置くことができる。「生物学的 に機能的」とは、発現ビヒクルが、染色体外因子として維持するか、または宿主 ゲノム中への組込みにより、適当な宿主中で複製及び／又は発現できることを意 味する。多数のベクターが入手可能であるか又は容易に調製でき、そして当業者 にとって周知である。
ヨーロッパ特許出願公開第００３６７７６号、第００４８９７０号及び第００５ １８７３号に記載されているものなど、既に遺伝子を有するリーディングフレー ム中にブロモ−クーを含み、そして提案された宿主細胞に適合する多数のプラス ミドが記載されている。
本明細書において開示されるベクター及び方法は、形質転換を受けやすい広範囲 の微生物（原核又は真核）に渡る使用に適当である。このプラスミドは、微生物 、特に細菌中で複製することができる。
一般的に、それ本来のタンパク質の発現のために微生物により使用され得る適当 なプロモーターを含有するプラスミドベクターは、調節配列、リポソーム結合部 位及び転写終止部位も含んでいる。一般的に、宿主細胞に適合する種に由来する レプリコン及び調節配列は、これらの宿主に関連して使用される。
より小さいＳＶ４０断片又はより大きい断片もまた使用できる。
但し、この場合、ウィルスの複製開始点に位置するＢｉｎｄｎＩ部位からハｔｕ Ｕまでに及ぶ約２５０塩基対（ｂｐ）の配列が含まれることを前提とする。さら に、所望の遺伝子配列と通常関連したプロモーター又は調節配列を利用すること も可能であり、しばしば望ましい。但し、このような調節配列は、宿主細胞系と 適合するものであることを前提とする。
最終的に、望ましくは、プラスミドは、発現ベクターを含んでいる宿主細胞の選 択を考慮して表現型特性を提供できる遺伝子（マーカー遺伝子）を有するべきで ある。特に有用なものは、生存選択のための遺伝子である。生存選択は、増殖阻 害物質に対する耐性を付与するか、または増殖因子能力をこのような能力を欠い ている細菌に付与することにより達成できる。一般的に、原核生物が好ましい。
例えば、Ｅ、　ｃｏｌｔ種由来のプラスミドであるｐＢＲ３２２（Ｂｏｌｉｖａ ｒ等、Ｇｅｎｅ　２，９５（１９７７）　）が、特にを用である。ｐＢＲ３２２ は、アンピシリン耐性及びテトラサイクリン耐性遺伝子を含んでおり、従って、 形質転換細胞や同定するための簡単な手段を提供する。
それらの原核生物が最も一般的に使用されるが、使用され得る他の微生物株は、 旦、　ｃｏ￥ＬＢ、影Ｃｏ旦に１２株２９４　（ＡＴＣＣ第３１４４６号）及び Ｅ、皿Ｘ１７７６　（ＡＴＣＣ第３１５３７号）、４延Ｗ３１１０　（Ｆ−、ｒ −、原栄養体、ＡＴＴＣ第２７３２５号）等の大腸菌株、バシラス・サブチリス （Ｂａｃｉｌｌｕｓ’５ｕｂｔｉｌｕｓ）等の桿菌並びにサルモネラ・チフィム リウム（Ｓａｌａ＋ｏｎｅｌｌａ　ｔ　　ｈｉｎ＋ｕｒｉｕｍ）又はセラチア・ マセッセンス（Ｓｅｒｒａｔｔａ　ａ＋ａｃｒｃｅｓａｎｓ）等の他の腸内細菌 を含み、そして種々のシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏ−ｍｏｎａｓ）種も用いる ことができる。これらの例は例示の目的のみに取り上げたものである。
原核生物の他に、真核微生物も使用できる。サツカロミセス・セレビシェ−（錘 匹ＩヨＲ旦ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）　、または普通のイース）　（ｂａｋｅｒ’ ｓ　ｙｅａｓｔ）が、真核微生物のうちで最も普通に用いられるが、他の多数の 菌株も一般的に利用可能である。
サツカロミセス中での発現には、例えばプラスミドＹＲｐ７（Ｓｔｉｎｃｈｃｏ ｍｂら、Ｎａｔｕｒｅ　２８２．３９（１９７９）；Ｋｉｎｇｓｓ＋ａｎら、Ｇ ｅｎｅ７　、１４１　（１９７９）　；　Ｔｓｃｈｅａ＋ｐｅｒら、Ｇｅｎｅ　 １０．１５７（１９８０）　）が通常使用される。このプラスミドは、既にトリ プトファン中で増殖する能力を欠いている酵母変異株、例えばＡＴＣＣｋ４４０ ７６またはＰＥＰ４−１　（Ｊｏｎｅｓ、Ｇｅｎｅ　８５，１２（１９７７）） に選択マーカーを提供するＷ遺伝子を既に含んでいる。酵母宿主細胞ゲノムの特 徴としてのあ壮損傷の存在は、トリブトファン不在下での増殖により形質転換を 検出するための効果的な環境を提供する。
酵母適合性プロモーター、複製開始点及び終止配列を含むプラスミドベクターは 、酵母に用いるのに適当である。酵母ベクターにおける適当なプロモーター配列 としては、３−ホスホグリセレートキナーゼのプロモーター［Ｈｉ　ｔｚｅ＋ｍ ａｎ等、ムＢｉｏ１．Ｃｈｅｍ、　２５５．２０７３（１９８０））又は他の解 糖酵素のブロモ−等、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１７．４９００（１９７８） ）が含まれる。
哺乳動物細胞中での使用のためには、発現ベクター上の調節機能がウィルス材料 によりしばしば提供される。例えば、通常使用されるプロモーターは、ポリオー マ、アデノウィルス２及び最も頻繁にはシミアンウィルス４０　（ＳＶ４０）で ある。
ＳＶ４０ウィルスの初期及び後期プロモーターが特に有効である。
というのは、ＳＶ４０ウィルス複製開始点も含んでいる断片としてウィルスから 容易に得られるからである［Ｆｉｅｒｓ等、Ｎａ　ｔｕｒｅ例えば、ｐｓＶ２ｎ ｅｏは、ＳＶ４０プロモーターの支配下にあるアンピシリン耐性ネオマイシン耐 性遺伝子を含む、したがって、ｐＳＶ２ｎｅｏは、動物可変領域とヒト定常領域 の両方の遺伝子で形質転換された細胞を同定する容易な手段を提供する。
−先Ｌう１訪」ｊ１袈 重鎮又は軽鎖をコードしている遺伝子は、定常領域をコードしているＤＮＡ断片 の５′末端を可変領域をコードしているＤＮＡ断片の３′末端に連結することに より作製されるだろう。
抗体アミノ酸配列をコードしているＤＮＡ配列は、ゲノムＤＮＡからプロモータ ーと複製部位との関連において得られる。宿主細胞が異種遺伝子に関連する転写 調節シグナル及び転写開始シグナルを認識する区域まで、次に可変領域コード配 列の５′及び３′領域が可変領域コード配列とともに保持され、そして転写開始 及び翻訳開始調節に使用され得る。定常領域の３′−非コード領域は、終止及び ポリアデニル化等の転写終止調節配列のために保持され得る。２本鎖の５′又は ３′を言及する場合、転写方向を意味し、５′は３′から上流である。
各鎖の可変領域間のイントロン配列は、いずれかの便利な制限部位のところで対 応するヒト定常ＤＮＡ断片に接合できる。
可変領域をコードする断片を提供する際、Ｊ　Ｓｉ域から下流にイントロンの一 部分を含めることが通常望ましいだろう。イントロンが保持される場合、イント ロン末端に機能的なスプライスアクセプター及びドナー配列が存在する必要があ ろう。
可変領域に隣接する５′−非コード領域は、通常、ＴＡＴＡボックス、キャップ 配列及びＣＡＡＴ配列等の転写及び翻訳の開始に関係する配列を含むだろう０通 常、５′−非コード配列は、約１〜２キロ塩基（ｋｂ）を超えない。
エンハンサ−配列が、Ｊ　Ｓｉ域と定常領域との間に存在するである。用いられ るエンハンサ−は、（１）動物１Ｎ域又は（２）ヒト定常領域のエンハンサ−で あることができる。
定常領域をコードしているＤＮＡ配列に生来隣接している３′領域を保持するこ とにより、その遺伝子に転写終止シグナルを提供してもよい。転写終止シグナル が発現宿主細胞中において十分に機能的でない場合には、宿主細胞中で機能的な ３′領域で置換してもよい。３′−非コード領域は、便利には発現宿主からの定 常領域の非コード隣接３′領域から得ることができる。３′−非コード領域は、 ＤＮＡ断片の操作及び連結について以前に記載されている手段のいずれかによっ て定常領域に接合できる。次に、この領域は遺伝子を調製する際の組立てブロッ ク（ｂｕｉｌｄｉｎｇ　ｂｌｏｃｋ）として使用できる。
ビヒクルの３　′ 所望のコード配列及び調節配列を含む適当な発現ビヒクルの構成物は、以下のよ うにして製造できる。ベクター及びＤＮＡ断片の末端を再連結せしめ、所望の発 現ビしクルを形成できる。用いられる方法は、ＤＮＡ源又は意図する宿主とは無 関係である。
軽鎖及び重鎮をコードしているＤＮＡ断片は、別々の発現ビヒクルまたは同じベ クターに挿入できる。好ましくは、軽及び重キメラ鎖をコードする融合遺伝子を 、２つの異なる発現ベクターに組立て、これらを用いて受容細胞を同時又は逐次 形質転換せしめることができる。
キメラ遺伝子を含有するＤＮＡ断片を発現ベクターに挿入する手段は、制限エン ドヌクレアーゼの使用を含む。「制限エンドヌクレアーゼ」（又は「制限酵素」 ）は、ＤＮＡ分子の部位特異的開裂を触媒することができる加水分解酵素である 。制限エンドヌクレアーゼ作用の位置は、特定のヌクレオチド配列の存在により 決定される。このような配列は、制限エンドヌクレアーゼの認識部位と呼ばれる 。種々の細菌種由来の数多くの制限エンドヌクレアーゼが単離され、そして認識 部位のヌクレオチド配列の観点から特性決定されている。制限エンドヌクレアー ゼのあるものは、両方の鎖上の同じ点でホスホジエステル結合を加水分解して、 平滑端を生成する。他のものは、数個のヌクレオチドにより互いに離れた結合の 加水分解を触媒し、開裂された分子の各末端に遊離の１本鎖領域を生成する。こ のような一本鎖末端は、自己相補性であり、したがって粘着性であるので、加水 分解ＤＮＡを再連結するのに使用できる。典型的な制限酵素としては、担μ■、 Ｂａｇ旧。
は遼ＲＩ、肛皿■、ル神Ｉ、ジ徂Ｉ、摺阻■、狗駈Ｉ、シＬＬＩ［。
均＋ｔ　Ｉ、　Ｓｔ壮Ｉ及びハ慣■が含まれる。
さらに、発現ベクターは、複数のユニーク制限部位を有するポリリンカーが挿入 されていてもよい。発現ベクターを適当な制限酵素で消化することにより、遺伝 子を含む少なくとも１つのＤＮＡ断片が挿入できるようにポリリンカーが開裂さ れるだろう、ポリリンカーが、識別できる末端を許容する場合、ＤＮＡ断片は単 一方向で挿入できる。末端が同じである場合、ＤＮＡ断片の挿入により、２つの 異なる配向性を有するプラスミドを生じる。
プラスミドを制限酵素で処理することにより開裂を行うことができる。一般的に 、約１０ｘのプラスミド又はＤＮＡ断片を、緩衝液約１００Ｊｔｌ中で酵素約１ ０単位と共に用いる。エンドヌクレアーゼ消化は、通常、３７〜６５°Ｃの温度 でｐＨ７〜９で行われる。（個々の制限酵素に関する適当な緩衝液及び基質の量 は、製造業者により規定されている。）反応時間は１〜１８時間である。
開裂ベクターをアルカリホスファターゼで前処理することにより開裂ベクターの 再連結を防止するのが有効なことがある。特定の条件は、製造業者により規定さ れている。
制限酵素消化が完了した後、フェノール及びクロロホルムで抽出してタンパク質 が除去される。核酸は、約２．５容のエタノールでの沈澱により水性分画（約０ ．３Ｍ酢酸ナトリウム含有）から回収される。
制限酵素による開裂方法の記載は、下記の文献中に見つけることができる：　Ｇ ｒｅｅｎｅ等、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏ　　、 第９巻、Ｗｉｃｋｎｅｒ、Ｒ，Ｂ、Ｓｉ、Ｍａｒｃｅｌ　Ｄｅｋｋｅｒ　Ｉｎｃ 、、ニューヨーク、ｒ　ＤＮＡの複製及び生合成Ｊ　；　Ｍｅｒｔｚ及びＤａｖ ｉｓ、、Ｐｒｏｃ。
Ｎａｔ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、（ＵＳＡ）　６９；３３７０（１９７２）　。
アガロースゲル電気泳動による開裂断片のサイズ分離は容易に実施でき、反応の 推移を追跡できる。消化が一旦所望の程度まで進んだ時点で、約６５°Ｃ以上で １０分間加熱するか、有機抽出を行うことによりエンドヌクレアーゼを不活性化 することができる。
次に、所望の断片を消化物から精製する。適当な精製方法としては、ゲル電気泳 動又はショ糖勾配遠心分離が挙げられる。
その後、プラスミドビヒクル及び外来ＤＮＡ断片をＤＮＡリガーゼで連結して再 環化する。このプロセスは、アニーリング及びＤＮＡ連結と呼ばれる。
ＤＮＡ断片、ＤＮＡリガーゼ及び適当な共同因子を含有する適当な緩衝液を用い る。使用温度は、２５°Ｃ〜４　”Ｃである。　　ＤＮＡセグメントが水素結合 するとき、ＤＮＡリガーゼは、２つのセグメントの間に共有結合を導入できる。
アニーリングに用いられる時間は、使用温度、塩溶液の性質の他に、粘着タンパ ク又は相補末端の性質により異なる。一般的に、連結反応時間は、５〜１８時間 であろう。（Ｍａｎｉａｔｉｓ　Ｔ、、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒすμ状１．Ｃｏ１ｄ 　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、前掲〕を参照のこと。
且二風ｍ その後、発現ビヒクル構成物を用いて適当な宿主細胞を形質転換することができ る。適当な宿主細胞は、単細胞生物及び多細胞生物由来の細胞を包含する。
キメラ免疫グロブリン遺伝子は、細菌又は酵母等の非リンパ系細胞中で発現させ ることができる。
細菌等の種々の単細胞微生物を形質転換せしめることができる。即ち、培養又は 醗酵で増殖できる単細胞生物を形質転換せしめることができる。細菌は一般的に 操作するのに最も箭便な生物であるので、以下、他の単細胞生物の典型例として 言及することにする。形質転換を受けやすい細菌としては、大腸菌（Ｅｓｃｈｅ ｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｔ）株等の腸内細菌科；サルモネラ（Ｓａｌｎ＋ｏｎｅｌ ｌａ）　；バシラス・サブチリス（Ｂａｃｔｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ）等の バシラス科；肺炎球菌（ＰｎｅＷｍｏｃｏｃｃｕｓ）　；ストレプトコッカス（ 牌旦鄭μＩ徂■＞：及ヒヘモフィルス・インフルエンザ（ｈ堕並肚旦し旦旦匹旦 憇）のメンバーが挙げられる。
細菌中で発現されるとき、免疫グロブリン重鎮及び軽鎖は、封入体の一部分とな る。次に、鎖を単離し、精製し、そして機能性免疫グロブリン分子に組み立てな ければならない。
原核微生物に加えて、酵母培養物等の真核微生物も使用できる。真核微生物のう ち、サツカロミセス・セレビシェ−（釦夏加ニジ突臣１江吐堕廷）、または普通 のイースト（ｂａｃｋｅｒ’ｓ　ｙｅａｓｔ）が最も一般的に用いられる。但し 、多数の他の菌株も通常利用可能である。酵母宿主細胞ゲノムの特徴として立且 裟損傷が存在すると、トリプトファンの不存在下での増殖により形質転換を検出 するのに効果的な環境が提供される。
微生物に加えて、多細胞生物由来の細胞培養も宿主として使用できる。原則的に 、細胞系が少なくとも初めは抗体を産生したものである限りは、そのような細胞 培養物は、を椎動物または無を椎動物培養物からにかかわらず、操作可能である 。培養中のを椎動物の増殖は、近年では日常の操作となっている（Ｔｉｓｓｕｅ 　Ｃｕ１ｔｕｒｅ、　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　ＫｎｉｓｅおよびＰａ ｔｔｅｒｓｏｎＷ　（１９７３））　、このような有用な宿主細胞系は、５ｐ２ １０　、ベロ（ＶＥＲＯ）及びヘラ（ＨｅＬａ）細胞、チャイニーズハムスター 卵巣（ＣＨＯ）細胞系並びに−１３８，８ＨＫ、　ＣＯ５−７及びＭＤＣに細胞 系が挙げられる。
好ましい受容細胞系は、Ｂリンパ球又はハイプリドーマ細胞等の形質細胞腫細胞 である。形質細胞腫細胞は、形質転換された免疫グロブリン遺伝子によりコード される免疫グロブリンを合成し、集成しそして分泌することができる。さらに、 それらは免疫グロブリンのグリコジル化機構を有している。
５ｐ２１０は、免疫グロブリン非産生形質細胞腫細胞であるため受容細胞として 好ましい。この細胞は、形質転換された免疫グロブリン遺伝子によりコードされ る免疫グロブリンのみを産生ずる。形質細胞腫細胞は、培養において又はマウス の腹腔中で増殖させることができ、後者の場合には、腹水から分泌免疫グロブリ ンを得ることができる。
゛　の乏　− 宿主細胞の形質転換は、以下のようにして行うことができる。発現ビヒクルを線 状化し、そして抗体産生のためにＤＮＡを宿主細胞に挿入する。ＤＮＡを宿主細 胞に挿入する典型的な方法には、エレクトロポーション（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒ ｔｔｏｎ）、プロトプラスト融合、リン酸カルシウム沈澱、又はデキストラン硫 酸及びＰＥＧを用いる他の従来の方法が含まれる。
強力な細胞壁バリヤーのない細胞を宿主細胞として使用するならば、Ｇｒａｈａ ｍおよびＶａｎ　ｄｅｒ　Ｅｂ、　鳳９違ＩＬ５２５４６（１９７８）により記 載されているリン酸カルシウム沈澱法により行うことができる。
原核細胞又は堅固な細胞壁構造を有する細胞を使用する場合、好ましい形質転換 法はＣｏｈｎ、Ｐ、Ｎ、ら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ’１．　Ａｃａｄ。
Ｓｃｉ、（ＵＳＡ）　６９２１１０（１９７２）に記載されているような塩化カ ルシウムを用いたカルシウム処理である。
宿主細胞は、同時形質転換又は標的形質転換により形質転換できる。
同時形質転換の場合、軽鎖及び重鎮をコードしている遺伝子を用いて同−又は異 なる種の別個の細胞培養物を形質転換せしめることができ；軽鎖および重鎖の別 々のプラスミドを用いて単一細胞培養物を同時形質転換せしめることができ；あ るいは、両方の遺伝子を含みそして軽鎖及び重鎮の両方の遺伝子を発現すること ができる単一発現プラスミドを用いて単一細胞培養物を形質転換せしめることが できる。
標的形質転換法では、宿主細胞は、軽鎖をコードしている遺伝子で形質転換され 、そして軽鎖マーカーを含有する細胞が選択される。細胞染色を用いるか、また は分泌されているのであれば多分上清中の軽鎖の検出により軽鎖が見つかる。
軽鎖を有するように選択した細胞を、重鎮構成物で形質転換せしめ、そして重鎮 マーカーも更に含有している得られた細胞を選択する。
形質細胞腫細胞系等のある種の不死化リンパ球細胞系は、通常の状態で、単離さ れた１ｇ軽鎖又は重鎮を分泌する。その結果、このような細胞系を本発明のキメ ラ重鎖又は軽鎖を含むベクターで形質転換せしめると、他方のＩｇｆｆｌを用い てその細胞系又は別の細胞系を形質転換せしめる必要はない。但し、正常に分泌 された鎖は、細胞系を形質転換せしめるのに最初に使用したベクターによりコー ドされるＩｇ鎖の可変ドメインに相補的であることを前提とする。
ノ　−　　れた　　　　の゛　　び 一般に、宿主細胞の形質転換後、細胞を約４８時間増殖させてマーカー遺伝子を 発現させることができる。次に、細胞を選択培地に入れ、そこで未形質転換細胞 は死滅し、該ＤＮＡ構成物で形質転換された細胞のみが生き残る。
重鎮及び軽鎖又はそれらの一部分は互いに単離した状態で産生でき、そして抗体 及びその断片を得ることができる。そのような調製物は、単離した鎖を再集成す るための方法を使用する必要がある。
本発明の方法が互いに単離した形態で重鎮及び軽鎖又はそれらの一部分を産生で きることは、免疫グロブリンのユニークな集成体、Ｐａｂ領域及び−価抗体を得 る機会を付与する。
重鎮及び軽鎖を試験管内で再結合し、鎖間ジスルフィドのみの開裂により***さ せ、そして鎖間ジスルフィドの修復なしで抗体活性を回復することが可能である （Ｅｄｅｌｍａｎ、Ｇ、Ｍ、ら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、　ｃａｄ、５ｃｉ（ＬＩ ＳＡ）　５０．７５３（１９６３））。
形質転換細胞を軽鎖及び／又は重鎖の産生に適当な条件下で増殖させ、そして重 鎖及び／又は軽鎖タンパク賞合成についてアッセイする。典型的なアッセイ法に は、エンザイムリンクドイムノソルベント７ツセイ（ＥＬＩＳＡ）　、ラジオイ ムノアッセイ（ＲＩＡ）又は蛍光標示式細胞分取器分析（ＦＡＣ３）、免疫組織 化学等が含まれる。　ＴＡＧ７２に対するモノクローナル抗体の結合親和力は、 当該技術分野に周知の手段により測定される（Ｈｅｙｍａｎ、Ｂ、、Ｊ、Ｉｍｍ ｕｎｏｌ、Ｍｅｔｈｏｄｓ、　６８，１９３〜２０４（１９８４）参照；以下の 実施例でも詳細に説明する〕。
純粋な形質転換コロニーを単離するために、選択された陽性培養物をサブクロー ニングする。サブクローニングを得るための適当な方法は、Ｍｃｋｅａｒａ、　 Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、プレナム・プレス社、ニューヨ ークにより教示されている限定希釈法によるものが挙げられる。
そのようなキメラ抗体を産生ずるハイブリドーマは、公知の方法を用いて増殖さ せることができる。形質転換細胞は、中空繊維系、スピナー培養、静置培養のよ うな試験管内培養、又は腹水形成等の生体内培養により、多量の軽鎖及び／又は 重鎮を分泌できる。
ハイブリドーマをブリスタン感作マウスの腹腔内に注射し、適当な時間（約１〜 ２週間）の経過後に、マウスから非常に高い力価の均一のモノクローナル抗体を 生じる腹水を採取し、そして当該技術分野において公知の方法によりそこからモ ノクローナル抗体を単離することにより、キメラ抗体を多量に製造することがで きる［Ｓｔｒａｍｉｇｎｏｎｉ、　Ｐ等、Ｉｎｔｌ、Ｊ、Ｃａｎｃｅｒ。
３１．５４３〜５５２　（１９８３）参照］。ハイブリドーマは、生体内で動物 において腫瘍として増殖し、その血清又は腹水は、最大的５０■／ｄのモノクロ ーナル抗体を提供することができる。通常、組織適合性ハイブリドーマ細胞１０ ’〜１０７を注射（好ましくは腹腔内）すると、数週間後に腫瘍が形成されるだ ろう。
次に１、抗体を採取し、そして周知の方法により処理することができる〔例えば 、一般的に、ハ烈朋遣ｆμ山１蛙眩鎖、第１巻及び第■巻、Ｌｅｆｋｏｖｉｔｓ 、　Ｉ及びＰｅｒｎｉｓＪ＋　（１９７９及び１９８１）　、アカデミツクブレ ス社、ニューヨーク；　Ｈａｎｄｂｏｏｋｏｆ　Ｅｘ　ｅｒｉｓ＋ｅｎｔａｌ　 Ｉｍｍｕｎｏｌｏ　　＋　Ｗｅｉｒ、Ｄ、（１９７Ｂ）　、ブラックウェル・サ イエンティフィック・パブリケーションズ、セントルイス、ＭＯ）を参照のこと 〕。
次に、抗体を、更なる使用のために通常安定な抗体溶液を提供するリン酸塩緩衝 化塩溶液（ＰＢＳ）等の種々の緩衝液中で保存することができる。
本発明のキメラ抗体は、公知のプロテアーゼ酵素、例えば、パパイン及びペプシ ンを用いて断片化することにより高度に免疫反応性のＦ（ａｂ’　）ｚ　、Ｆ（ ａｂ’　）及びＦａｂ断片を得ることができる。さらに、タンパク賞分解により 形成されるｒｇの活性断片（分子量：約５０．０００）を分割して十分に縮小し た重鎮及び軽鎖成分とし、そしてかなり効率的に再構成して活性抗体を得ること ができる（Ｈａｂｅｒ、Ｅ、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　ＵＳＡ 　　５２＋１０９９（１９６４）　；　　Ｗｈｉｔｎｅｙ、Ｐ、Ｌ、、ら、Ｐｒ ｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、（ＵＳＡ５３．５２４（１９６５））　、 得られるＦ（ａｂ’　）ｚ、Ｆ（ａｂ’　）及びＦａｂ断片は、完全モノクロー ナル抗体分子について上記した方法により測定できる。
五体坐里盈 本発明の抗体並びにそれらの免疫反応性断片又は組換え体は、種々の癌治療に利 用するのに独特の利点を提供する。悪性細胞に特異的に結合する能力及び腫瘍を 局在定位する能力に加えて、これらの抗体は、主要器官における線維芽細胞、内 皮細胞又は上皮細胞等の正常細胞に検出できる程には結合しない定常可変領域を 有する。
特に、抗体、免疫反応性断片又はそれらの組換え体は、以下のタイプの癌治療に 有効であるが、これらに限定されない：（１）以下でさらに詳細に説明するよう な癌病変の原位置検出のための画像診断マーカーに接合した生体内診断アッセイ ；（２）以下で説明するような単独で又は放射性核種、毒素、エフェクター細胞 、他の抗体等の治療薬に接合させた形態で又は補体結合を介して本発明の抗体を 用いる生体内療法；及び（３）以下で説明するような放射線免疫誘導手術（ｒａ ｄｉｏＬｗｍｕｎ。
ｇｕｉｄｅｄ　ｓｕｒｇｅｒｙ）　　ｅさらに、生理的食塩水、非毒性緩衝液等 の医薬上許容される非毒性の無菌担体中に本発明の抗体を含有する医薬組成物も 可能である。
本発明の注射可能組成物は、懸濁液の形態でも、溶液の形態でもよい。溶液形の 場合、複合体（又は必要に応じて別々の成分）を医薬上許容される担体に溶解す る。そのような担体は、適当な溶媒、必要に応じてベンジルアルコール等の保存 剤、及び緩衝剤を含む。有用な溶媒には、例えば、水、水性アルコール、グリコ ール及びリン酸エステル又は炭酸エステルが含まれる。そのような水性溶液は、 多くて５０容積％の有機溶媒を含む、　　　′ 本発明の組成物としての注射可能懸濁液には、補助薬を含むかまたは含まない液 体懸濁液媒質が担体として必要である。
懸濁液媒質は、例えば、水性ポリビニルピロリドン、植物油もしくは高度に精製 した鉱油等の不活性油、又は水性カルボキシメチルセルロースである。懸濁液中 で複合体を保持するために必要であれば、適当な生理学的に許容される補助剤が 、カルボキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ゼラチン及びアルギン 酸塩のような増粘剤の中から選択される。
また、例えば、レシチン、アルキルフェノール、ポリエチレンオキシド付加物、 ナフタレンスルホン酸塩、アルキルベンゼンスルホン酸塩及びポリオキシエチレ ゛ンソルビタンエステル等の多数の界面活性剤も懸濁化剤として有用である。液 体懸濁液媒質の親水性、密度及び表面張力に影響を及ぼす数多くの物質も、個々 の場合に応じて注射可能懸濁液を調製するのに役立つことができる。例えば、シ リコーン消泡剤、ソルビトール及び糖は、全て、有用な懸濁化剤である。
癌細胞は異種であるので、単一特異性キメラ抗体は、腫瘍の異なるエピトープを 発現している全ての細胞を認識することができないかもしれない。
したがって、本発明の幾つかの異なるキメラ抗体を投与することが望ましいだろ う。これらの種々の抗体を逐次使用すると、単一抗体の■使用に比べて、ヒト患 者における抗イデオタイ、プ応答をかなり減少させる。例えば、ＣＨ９２，ＣＨ ８Ｂ及びＣＨ４４を、患者に順次投与することができる。これらの抗体は異なる 軽鎖を有し、そして実際には、異なるＣＤＲａｅＮ域を有しているので、抗イデ オタイブ応答を最小限に抑えることができる。
二孫詔ＩＪし−とｉ工 抗体、免疫反応性断片又はその組換え体を用いたヒト腫瘍又はその転移の生体内 診断アッセイでは、それらをマーカーと接合し、患者に投与後、患者を適当な検 出手段に暴露することにより患者における画像診断マーカーの存在を検出する。
抗体−画像診断マーカー接合体の投与及び検出並びに画像診断マーカーへの抗体 の接合は、例えば、以下の文献から容易に知られ、または容易に決定できる方法 により達成される：Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ、　Ｄ、Ｍ、ら、Ｎｅｔｓ　Ｅｎ　１ ａｎｄ　Ｊ、Ｍｅｄ、、２９８．１３８４−１３８８（１９７８）；Ｇｏｌｄｅ ｒ＋ｂｅｒｇ、　Ｄ、Ｍ、ら、Ｊ、Ａｍｅｒ、Ｍｅｄ、Ａｓ５ｏｃ、　２８０． ６３０−６３５（１９８３）；Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ＋　Ｄ、Ｍ、ら、Ｇａ５ｔ ｒｏｅｎｔｅｒｏ１．８４．５２４−５３２（１９８３）；５ｉｃｃａｒｄｉ、 Ａ、Ｇ、ら、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、旦、４８１７−４８２２（１９８６）　 ；Ｅｐｅｎｅｔｏｓ。
Ａ、Ａ−ら、　Ｃａｎｃｅｒ　５５，９８４−９８７（１９８５）；Ｐｈ１ｌｂ ｅｎ、Ｖ、Ｊ、ら、Ｃａ、ｎ　ｃ　ｅ　ｒ５７、５７１−５７６（１９８６）； Ｃｈｉｏｕ、Ｒ，ら、Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎ５ｔ、　７６．８４９−８５５（１９ ８６）；　Ｃｏ１ｃｈｅｒ、Ｅ、ら、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、、　４３．７３６ −７４２（１９８３）；Ｃｏ１ｃｈｅｒ、　Ｅ、ら、Ｌａｂｏｒａｔｏｒ　　Ｒ ｅ５ｅａｒｃｈ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｂｉｏｌｏ■ａｎｄ　Ｍｅｄｉｃｉｎ ｅ　Ｉ　ｍｕｎｏｄｉａ　ｎｏｓｔｉｃｓ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、Ａｌａｎ　Ｒ， Ｌｉ５ｓ＋ｐｐ、　２１５−２５８（１９８３）；　Ｋｅｅｎａｎ、Ａ、Ｍ、ら 、Ｊ、Ｎｕｃｌ、Ｍｅｄ、　２５．１１９７−１２０３（１９８４）；Ｃｏ１ｃ ｈｅｒ　Ｄ、ら、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、　４７．１１８５−１１８９（１９８ ７）；Ｅｓｔａｂａｎ、Ｊ、Ｍ、ら、Ｉｎｔｌ、Ｊ、Ｃａｎｃｅｒ　３９．５Ｏ −５９（１９８７）；　ｌ１ａｒｔｉｎ。
Ｄ−Ｔ、、　　ら、イＤ！ｂＬＬ４Ｌ１９３−１９４（１９８４）；　Ｍａｒｔ ｉｎ、ＥＪｊｒ。
ら、勤オニ臼μ、５．５９７−３１０８（１９８６）；　Ｍａｒｔｉｎ、Ｄ、Ｔ 、ら、ハ１工鉤」Ｌ１５０．６７２−６７５（１９８５）；Ｍｅａｒｅｓら、Ａ ｎａｌ、Ｂｔｏｃｈｅａｉ、　１４２６８−７８　（１９８４）　；およびＫｒ ｅｊ　ｃａｒｅｋら、Ｂｉｏｃｈｅｍ、ａｎｄ　Ｂｉｏ　ｈ　ｓ、Ｒｅｓ。
並懸、Ｔム５８１−５８５（１９７７）。
投与量は、愚者の年令及び体重により異なるだろう。一般的には、投与量は、正 常組織とは異なる腫瘍部位を視覚化又は検出するのに効果的な量でなければなら ない。好ましくは、１回の投与量は、患者−人当たり抗体−マーカー接合体０． １〜２００■の間であろう。
抗体に接合できる画像診断マーカーは当業者に周知であり、例えば、上記で取り 上げた文献に記載されているようなガンマスキャナー又は手持ガンマプローブ又 はポジトロン・エミッション°トモグラフィー（Ｐｏｓｉｔｒｏｎ　Ｅｍｉｓｓ ｉｏｎ　Ｔｏｓ＋ｏｇｒａｐｈＶ）等を用いた診断イメージングにより検出され 得る物質、並びに上記で取り上げた文献に記載されているような分光計を用いた 核磁気共鳴分光分析計により検出され得る物質を含む。
ガンマスキャナー等を用いて検出できる物質の適当な例は、例えば、重２ｓ１． １３１１．１１３１．　■ＩＩ、　ｌ０５Ｈｈ、　１５１３．、６フＣｕ。
６　？　Ｇ　ａ　、　＋　６６１　ｏ　、　＋フフｌ、　ｌ１６Ｒｅ、　ＩＩＩ ＩＩＲ８及び９軸７．のような放射性核種を含む。”’Ｌ　”Ｌ　”Ｓｅａ　及 Ｕ　９９”Ｔｃハ、エネルギーが低いうえに、遠距離検出に適当であるため好ま しい。
核磁気共鳴分光計等を使って検出できる物質の例は、ガドリニウム（Ｇｄ）であ る。
ユ潜！ＩおＬ畦別Ｌ１Ｃｄ１遼 この方法では、ガン腫部位に抗体−治療薬接合体を供給し、それによってガン腫 組織を直接治療薬に暴露することができる。
本発明の抗体、それの免疫反応性断片または組換え体は、ヒトのガン腫またはそ れの転移の生体内治療のために医薬上有効な量において投与することができる。
「医薬上有効な量」の抗体、それの免疫反応性断片または組換え体とは、医薬組 成物中の前記抗体の量が、前記抗体が特異的親和性を有する抗原との効果的な結 合を達成するのに十分であることを意味する。医薬組成物は一回または複数回投 薬において投与することができる。
抗体、それの免疫反応性断片または組換え体と治療薬との接合体の調製および投 与方法は、当業者に周知であるかまたは容易に決定され得る。また、適当な用量 は患者の年令および体重に依存し、そして使用する治療薬は当業者に周知である かまたは容易に決定され得る。代表的なプロトコールは下記の記載の参考文献中 に記載されている。
治療において使用され得る抗体−治療薬接合体の例は次のものを含む：（１）放 射性核種、例えば１３！Ｉ、　９（ＩＹ、　ｌ０５ｌ？ｈ。
４）Ｓｃ、　　６フＣｕ、　　　””Ｂｉｔ　　”’Ａｔ＋　　６’７Ｇ、、　 　　”Ｌ　　　ｌ１１６Ｒｅ、　　　１８１１Ｒｅ。
１７７Ｌｕ、９９＠　Ｔｃ、　＋３３Ｓ、　ＩｔコＩおよび目ＩＩｎと結合され た抗体であって、例えばＧｏｌｄｅｎｂｅｒｇ、　Ｄ、Ｍ、ら、Ｃａｎｃｅｒ　 Ｒｅｓ、　４Ｌ４３５４−４３６０（１９８１）；　Ｃａｒｒａｓｑｕｆｌｌｏ 、Ｊ、Ａ−ら、Ｃａｎｃｅｒ　Ｔｒｅａｔ、Ｒｅ　、　６８＋（１９８５）；Ｌ ａｎｇｅ、Ｐ、Ｈ，ら、頌」巴コ９８＋　１４３−１５０（１９８５）　；Ｋａ ｌ　ｔｏｖｉｃｈ。
Ｆ、Ａ、ら、Ｊ、Ｎｕｃｌ、Ｍｅｄ、　２７，８９７（１９８６）、０ｒｄｅｒ 、Ｓ、Ｂ、　　ら、Ｉｎｔ、Ｊ。
Ｒａｄｉｏｔｈｅｒ、０ｎｃｏ１．Ｂｉｏｌ、Ｐｈ　ｓ、　　８．２５９−２６ １（１９８２）、Ｃｏｕｒｔｅｎａｙ−Ｌｕｃｋ、Ｎ、ら、Ｌａｎｃｅｔ上、　 １４４１−１４４３（１９８４）およびＥｔｔｉｏｇｅｒ、Ｄ、Ｓ−ら、５μ耳 二１弘玉ｔｌ、堕、２８９−２９７（１９８２）に記載されたちの；（２）薬剤 または生体応答調節剤、例えばメトトレキセート、アドリアマイシン、およびリ ンホカイン、例えばインターフェロン、と結合された抗体であって、例えば、Ｃ ｈａｂｎｅｒ、Ｂ、ら、Ｃａｎｃｅｒ　Ｐｒ１ｎｃｉ　ｌｅｓ　ａｎｄ　Ｐｒａ ｃｔｉｃｅ　ｏｆ　０ｎｃｏｌｏ　　、Ｐｈｆｌａｄｅｌｐｈｉａ。
ＰＡ、Ｊ、Ｂ、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ　Ｃｏ、Ｖｏｌ、　１．　ｐｐ、２９０− ３２８（１９８５）；Ｑｌｄｈａｍ。
Ｒ，に、ら、Ｃａｎｔ胆ムカ１匹違佳胚ａｎｄシ１０頂１」Ｌ１匹」旦■。
Ｐｈ１ｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡ、Ｊ、Ｂ、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ　Ｃｏ、、　 Ｖｏｌ、２＋ｐｐ、２２２３−２２４５（１９８５）；　Ｄｅｇｕｃｈｉ、Ｔ、 ら、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ５−４６．３７５１−３７５５（１９８６）；Ｄｅｇｕ ｃｈｉ＋Ｔ、ら、Ｆｅｄ、Ｐｒｏｃ、　４４．１６８４（１９８５）；Ｅｏ＋ｂ ｌｅｔｏｎ、Ｍ、Ｊ、　　ら、Ｂｒ、Ｊ、Ｃａｎｃｅｒ　４９．５５９−５６５ （１９８４）およびＰｆ＋ｉ、Ｍ、Ｖ、ら、ＣａｎｃｅｒＩｓｎｕｎｏｌ、Ｉｍ ｍｕｎｏｔｈｅｒ、　１２＋１２５−１３４（１９８２）に記載されたもの；（ ３）毒素と結合された抗体であって、例えば、Ｕｈｒ、Ｊ、Ｗ、ら、Ｍｏｎｏｃ ｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ａｎｄ　Ｃａｎｅｅｒ、Ａｃａｄｅｍｉｃ 　Ｐｒｅｓｓ＋　Ｉｎｃ、＋ｐｐ、８５−９８（１９１１？３）　、シ１ｔｅｔ Ｌａ、Ｅ、Ｓ、ら１、ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏＪＬ１回Ｂｉｏ。
箪旦ｅｒｓ、　Ｂｄ、Ｐ、Ｈ，Ａｂｅｌｓｏｎ、　ｐｐ、７３−８５（１９８４ ）およびＶｉｔｅｔｔａ＋Ｅ−Ｓ、ら、とし、幻４．６４４−６５０　（１９８ ３）に記載されたちの；（４）ヘテロ機能性抗体、例えば、ガン腫細胞とエフェ クター細胞、例えばＴ細胞などのキラー細胞との両方に複合体が結合するように 、別の抗体と結合または連結された抗体であって、例えば、Ｐｅｒｅｚ、　Ｐ、 ら、Ｊ、Ｅｘ　ｅｒ、Ｍｅｄ、　１６３．１６６−１．７８（１９８６）；およ び１、ａｕ、Ｍ、Ａ、ら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、（［ｌ５Ａ ）　８２．　８６４８−８６５２（１９８５）に記載されたもの；並びに（５） 生来の抗体、即ち接合または複合体形成されていない抗体であって、例えば、Ｈ ｅｒｌｙｎ＋　Ｄ、　　ら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、（ＵＳ Ａ）７９．４７６１−４７６５（１９８２）　Ｈ５ｃｈｕｌｚ、　Ｇ、ら、Ｐｒ ｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃ　ｄ、Ｓｃｉ、、（ＵＳＡ）８０，５４０７−５４１１　 （１９８３）　；Ｃａｐｏｎｅ、　Ｐ、Ｍ、ら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、Ａｃａ ｄ、Ｓｃｉ、　、　（ＵＳＡ）８０＋７３２８−７３３２（１９８３）　；５ｅ ａｒｓ、　Ｈ，Ｐ、ら、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、　４５．５９１０−５９１３（ １９８５）；　Ｎｅｐｏｍ、Ｇ、Ｔ、ら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃ ｉ　、　＋　（ＵＳＡ）８１＋　２８６４−２８６７（１９８４）　；Ｋｏｐｒ ｏｗｓｋｔ、　Ｈ，ら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、５ｃｉ−、（ＵＳＡ） 上述のような抗体または抗体断片を所望の治療薬と結合させる方法は、当業界に おいて常用でありそして周知である。
例えば、その方法は上記の参照文献中に与えられている。
＋　　　　　　　； 抗体、それの免疫反応性断片または組換え体は、放射線免疫誘導外科学（ＲＩＧ Ｓ）にとって重要である。ＲＩＧＳ、即ち手術内療法においては、腫瘍が局在定 位されそして切除される０画像診断マーカーで標識された抗体を患者に注入し、 そして結合した抗体を手動ガンマ検出プローブ（ＧＤＰ）により局在定位し、そ して切除する。模範的なＧＤＰは、Ｎｅｏｐｒｏｂｅ７ＭＣｏｒｐｏｒａ−ｔｔ ｏｎ、　Ｔａｍｐａ、　ＰＬから市販されているＮｅｏｐｒｏｂｅ”である。Ｍ ａｒｔｉｎら、「放射線免疫誘導外科学：　Ｂ７２．３抗体を使った腫瘍の手術 内検出に対する新規アプローチＪ　、Ａ＋ｓｅｒ、Ｊ、Ｓｕ■工１５６．３８６ −３９２（１９８８）　ＨＭａｒｔｉｎら、「放射線免疫誘導外科学：　結腸カ ンニおける１７−ＩＡ抗体の手術内利用Ｊ　、勘畑山泣す５．５９７−３１０８ （１９８６）を参照のこと。
抗体−画像診断マーカー接合体の投与および検出、並びに画像診断マーカーと抗 体との接合方法は、例えば上述したような当業者に周知である方法により達成さ れるが、または容易に決定される。
用量は患者の年令および体重に依存して異なることができるが、一般に患者あた り０．１〜２００■の抗体−マーカー接合体の一回量が十分である。
次の非限定的実施例は、本発明の抗体をコードするキメラＤＮＡ配列の作製およ び発明の詳な説明に過ぎない。特に指定しない限り、温度は全て摂氏度である。
特に指定しない限り、百分率は全て重量百分率である。
１１里 マウス　　＄　の ＣＣ抗体はマウス由来であり、これはヒト定常領域が有するエフェクター機能を 発揮することがほとんど不可能である。
従って、次の実施例において、重鎮および軽鎖の定常領域を遺伝子的に除去し、 そしてそれらをヒトの等個物で置き換えることにより、特定の抗体を「ヒト化」 する。
マウス軽鎖定常領域遺伝子をヒトカッパ（に）遺伝子で置換し、そしてマウス重 鎮遺伝子を４つのヒトガンマイソタイプ（γ１．γ２．γ３およびγ４）の各々 で置換した。それら４つのガンマイソタイプの各々は、固有の生物学性質を有す る。一般的概観については、ｒヒトＩｇＧサブクラス」、Ｈａｍｉｌｔｏｎ、Ｒ ，Ｇ、（１９８９）　　Ｄｏｃ、Ｎｏ、ＣＢ００５１−２８９．Ｃａｌｂｉｏｃ ｈｅｍ　　Ｃｏｒｐｏ−ｒａｔｉｏｎを参照のこと。
′　・よび　１口　・６　の蕾 匹泪Ｉ」し蝮１版 ＣＣ４９ハイプリドーマ細胞は、ＩｇＧ、イソタイプ重鎖およびカッパ軽鎖を有 する抗体を分泌する。ＣＣ４９ハイブリドーマ細胞、Ｂａ１ｂ／Ｃマウス腎臓細 胞およびＮＳＩ形質細胞腫細胞からの全ＤＮＡを釦旦、　２４，３５３−３５６ （１９８１）に記載の方法に従って単離した。
一般に、各細胞系から抽出されたＤＮＡ約１０〜２０■を、適当な反応緩衝液を 含む５０〜１００１！１の反応混合物中で８０単位のＢａｅ＋　ＨＩ、抽Ｒ１， 肛１ｍ、治Ｉ、珈■、握Ｉ、　１１ＩおよびＰｓｔ　Ｉで３７°Ｃにて一晩完全 消化した。
次いで、各細胞系からの全抽出ＤＮＡを、Ｅ、Ｍ、５ｏｕｔｈｅｒｎ　（Ｊ。
脂」」狭蝉ユ理、５０３，５１７（１９７５）　）により開発されたサザンハイ プリダイゼーション技術にかけた。０．８％アガロースゲル上での電気泳動によ り、それらのサイズに基づいてＤＮＡ断片を分画した。二本鎖ＤＮＡ断片をアル カリ溶液中で一本鎖ＤＮＡ断片に変性せしめ、次いでニトロセルロース濾紙をゲ ルと密着させて置き、高塩濃度溶液の存在下で変性ＤＮＡセグメントを濾紙に移 行せしめた。
ハイブリダイゼーションは、プローブとして、ランダムブライミングされた［！ ！ｐ］−標ｍＬ鎖を使って行った。
より詳しくは、プローブはマウスＪｔｅＪＷ域（Ｊｌ−Ｊ５）をコードするエク ソンを含む１．７１キロ塩基対（ｋｂｐ）の旧ｎｄｌ［Ｉ　−ＰｓｔＩ断片であ り、プラスミドｐＧＤ１から単離された。このプローブ断片のヌクレオチド配列 は第７図に与えられている。このプラスミドは、ｒリンパ系細胞抽出物による免 疫グロブリン遺伝子セグメントの部位特異的開裂」、Ａｇｏｓｔａｒｏら、Ｃａ ｎ、Ｊ。
Ｂｉｏｃｈｅ＋ｓ、Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、　６３，９６９−９７６（１９８５） 中に記載されている。
このプラスミドはＮｏｂｕｓ＋１ｃｈｉ　ＨｏｚｕｍｉおよびＪｏｈｎ　Ｒｏｄ ｅｒ、Ｍｔ。
５ｉｎａｉ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ＋Ｔｏｒｏｎｔｏ、０ｎｔ ａｒｉｏ＋Ｃａｎａｄａにより提供された。
プローブを放射能標識するために、Ａｍｅｒｓｈａｍ、　ＡｒｌｉｎｇｔｏｎＨ ｅＡｒｌｌｎ、　ＩＬ、　ＵＳＡからａ　−［”Ｐｌ−ｄＣＴＰを入手し、そし てＰｈａｒｍａ−ｃｉａ、Ｐｉｓｃａｔａｈａｙ、ＮＪ、ＵＳＡからランダムブ ライミングキツトを入手した。
サザントランスファーにおけるシグナルを、Ｋｏｄａｋχ−ＯＭＡＴ”ＡＲフィ ルムを使ったオートラジオグラフィーにより可視化した。明らかに再配列された バンドは全く観察されなかった。
従って、標準と比較して、Ｂｉｎｄｌ［Ｉで消化されたＣＣ４９ＤＮＡについて のオートラジオグラム上に全くユニークなバンドが検出されなかった。しかしな がら、Ｌ鎖についての再配列されたバンドが、ＣＣ４９のＨｉｎｄＩＩＩ消化さ れたＤＮＡにおいてマウス腎臓細胞ＤＮＡ　（ジャームラインＤＮＡを表わす） の…ｎｄｍ消化物から生じるバンドと平行して移動するバンドにより遮蔽される ことを、サザンのデータから除外することはできなかった。
実際に、事実そうであることがわかった。
マウスＶ　゛　−４・ブースミ゛の１ｉｊｌＪ自己切除可能なラムダベースの挿 入クローニングベクターであるＬＡＭＢＤＡ−ＺＡＰＴ１４をＳｔｒａｔａｇｅ ｎｅ　Ｃｏ、、Ｌａ　Ｊｏｌｌａ、ＣＡ、ＵＳＡから購入した。ＬＡＭＢＤＡ− ＺＡＰＴＨは、１９８７年Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅカタログの２０−２１頁に記載 されている。ＬＡＭＢＤＡ−ＺＡＰ７Ｍの粘着（ｃｏｓ）末端を、製造業者のプ ロトコールに従って一晩連結した。
２０カの連結したＬＡＭＢＤ＾−ＺＡＰ”を、Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏ ｌａｂｓ。
Ｉｎｃ、から購入した５ｔ１１（１５単位）のジ徂Ｉで消化した。５５分の消化 後、更に６単位のＳｐｙ　■を添加した。７０分後、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅのプ ロトコールに従ってフェノール抽出により反応を停止しそしてエタノール沈澱を 行った。
狗徂Ｉ制限酵素での消化は、両端に「粘着末端」の生成をもたらす。それらの粘 着末端を７４　ＤＮＡポリメラーゼで変更し、半分フィルインされた５５２３１ 粘着末端、例えば５　’　ＡＣＴ／３’ＴＣＡＴＧを作製した。半分のフィルイ ン反応を行うために、エタノール沈澱で得られたＤＮＡペレットを８Ｊ１１の水 に溶解した。
これに２Ｉｌ！の１０ｍＭ　ｄＴＴＰ、　２　ｔｄの１０ｍＭ　ｄＣＴＰ、　２ 　ｔｄのＳｔｒａｔａｇｅｎｅの１０×リガーゼ緩衝液、４１１１の脱イオン化 蒸留水、および２Ｉのフレノウ断片（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌ ａｂｏｒａｔｏｒｆｅｓ（ＢＲＬ））を添加した。周囲温度にて３０分間反応を 行った。ＤＮＡポリメラーゼを６５“Ｃで１０分間不活性化することにより反応 を止めた。
１６０ｇの全ＣＣ４９ハイブリドーマＤＮＡ　（マウス軽鎖プロモーター並びに ＬおよびＶＪエクソラン含む）をＨｉｎｄｌｌｌで完全消化した。約１ｋｂ〜約 ２０ｋｂの断片を０．８％アガロースゲルから切り出した。ＢＩＯ１０１（Ｌａ 　Ｊｏｌｌａ、ＣＡ、ＵＳＡ）から市販されているＧＥＮＥＣＬＥＡＮＴＭを使 って［ｌＮＡを精製した。
全ＣＣ４９ハイブリドーマＤＮＡの肛剋■消化断片を、ＬＡＭＢＤＡ−ＺＡＰ” のｍＩ断片と同様にして半分フィルインした。ただし、ｄＡＴＰとｄＧＴＰを使 用した。半分フィルインされた…ｎｄＨＩ消化断片は、５　’　ＡＧＣＴＴ／３ ’　ＧＡＡ粘着末端を生じ、これは上記のジ徂Ｉの半分フィルインされたＬＡＭ ＢＤＡ−ＺＡＰ”断片と適合性である。
フェノール抽出とエタノール沈澱の後、Ｍａｎｉａｔｉａの教示に従って、全Ｃ Ｃ４９ハイブリドーマＨｉｎｄＩＩ［改変ＤＮＡ断片およびＬＡＭＢＤＡ−ＺＡ ＰＴＮジ徂Ｉ改変ＤＮＡ断片をＴ４　ＤＮＡリガーゼにより連結した。連結反応 は、次のものを含む６．１　ｄの連結混合物を使って行った：３４の溶液中の約 ０．２　ｔａｒの全ＣＣ４９バイブリド−？Ｈｔｒ＋ｄｌｌｌ改変ＤＮＡ、ｌｄ の溶液中の約ｌｘのＬＡＭＢＤＡ−ＺＡＰ”５ｐ４１改変ＤＮＡ、　０．６　、 ＪのＳｔｒａｔａｇｅｎｅの１０×リガーゼ緩衝液、０、５　ＡＩの１０ａ＋Ｍ 　ＡＴＰ、および１μ！のＳｔｒａｔａｇｅｎｅリガーゼ。これを水浴中で一晩 インキユベートし、そして温度を約１８°Ｃがら約４°Ｃに大幅に下げた。この 連結はＨｔｎｄｌＩＩおよびカ＋ｅＩ部位を両方とも除去した。
連結混合物のゲノムライブラリーをＳｔｒａｔａｇｅｎｅのプロトコールに従っ て作製した。簡単に言えば、上記で生成された連結混合物２１ｔ！を、製造業者 の指示に従ってＳｔｒａｔａｇｅｎｅのＧｉｇａ−ｐａｃｋ　Ｇｏｌｄパッケー ジングシステムにおいて使用した。プレートあたり５０，０００プラークの密度 を有する１５枚の１５０ｍ＋ａプレートを、製造業者の指示に従って、５ｃｈｌ ｅｉｃｈｅｒ−Ｓｃｈｕｅｌｌ。
Ｋｅｅｎｅ、　ＮＨ，ＵＳＡから入手したニトロセルロース濾紙へのハイブリダ イゼーションにより、陽性のクローンについてスクリーニングした。ｐＧＤｌか ら誘導した［”ＰＩ−ランダム標識プローブをハイブリダイゼーションに使用し た。２つの陽性クローンが得られた。
各クローンをプラーク精製し、そしてＳ　ｔｒａ　ｔａｇｅｎｅの自己切除プロ トコールヲ使ッテ、ＣＣ４９Ｌ　Ｍ　可変領域を含ムＬＡＭＢＤＡ−ＺＡＰ”の 組換えプラスミド（〕７−ジミド）を得た。得られた組換えプラスミドのベクタ 一部分はｐＢＬＵＥｓｃＲＩＰＴ　ＳＫ（〜）と呼称され、そして１９８７年Ｓ ｔｒａｔａｇｅｎｅカタログに記載されたような２９６４ｂｐから成る。ｐＢＬ ＵＥｓｃＲＩＰＴ　５Ｋ（−）　（７）プラスミド地図は第８図に示される。
２つの陽性クローンからのＤＮＡを部分的に配列決定すると、両者とも同じであ った。ｐＲＬｌｏｌと命名された１つのクローンを更なる研究に使用した。
ＣＣ４９の　　マ・ピング ｐＲＬｌｏｌは７．６１ｋｂであり、そしてＤＮＡ挿入断片のサイズは制限酵素 マツピングにより４．６５ｋｂであることが決定された。
ｐＲＬｌｏｌのプラスミド地図は第９図に示される。ｐＲＬ１０１中のＣＣ４９ Ｌ鎖ゲノムＤＮＡ挿入断片の制限酵素地図は第１０図に示される。
匹邸１１目］劃λ隻岨 ＣＣ８３軽鎖を単離するのに使われる方法は、本質的にはＣＣ４９重鎖を単離す るのに使われたものであった。
ただし、［ｆｆ！ｐｌ　でランダム標識されたｐＧＤ１由来の１．７１ｋｂのＨ ｉｎｄｌｆｆ　−Ｐｓｔ　Ｉ断片をプローブとして使って、上述のようにして７ Ｘ１０Ｓプラークを含むゲノムライブラリーをスクリーニングした。１つの陽性 クローンが得られた。この陽性クローンをｐＲＬ２００と命名した。
匹影μｍじ」すＬ−ム堅乙久 ρＲＬ２００は７−４４ｋｂであり、そしてＤＮＡ挿入断片のサイズは制限酵素 マツピングにより４．４８ｋｂであることが決定された。
ｐＲＬ２００のプラスミド地図は第１１図に示される。　ｐＲＬ２００中のＣＣ ８３Ｌ鎖ゲノムＤＮＡ挿入断片の制限酵素地図は第１２図に示される。
ＣＣ４９ｔ′口〜”の ＣＣ４９重鎖を単離するのに使用される方法は、本質的にはＣＣ４９軽鎖を単離 するのに使用されたものであり、同じＣＣ４９ＨｉｎｄＩ［Ｉ改変ＤＮＡのスク リーニングを含んだ。
ライブラリーをスクリーニングするのに使用されるハイブリダイゼーションプロ ーブは、ｐＮＰ９から作製され、そしてＣＣ４９免疫グロブリン重鎖のＪイ３お よびＪ、１４のコードエクマンを含有する１、９８ｋｂｐのＥｃｏ　ＲＩ−Ｂａ ｑ旧断片を含む。このプローブ断片のヌクレオチド配列は第１３図に与えられる 。プラスミドはＤｒ、Ｎｏｂｕｓｉｃｈｉ　ＨｏｚｕｍｉおよびＤｒ、Ｊｏｂｎ 　Ｒｏｄｅｒ、ｌ’１ｔ−５ｉｎａｔ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｉｎ５ｔｔｔｕｔｅ ＋Ｔｏｒｏｎｔｏ＋０ｎｔａｒｉｏ、Ｃａｒ＋ａｄａにより提供された。
９．５Ｘ１０’プラークを含むゲノムライブラリーをスクリーニングし、それか ら１つの陽性クローンが得られた。この陽性クローンをｐ　＋１　）１４９と命 名した。
別４９！Ｊの　　マ・ピング ｐ　Ｈ１４９は約７．０ｋｂであり、そしてＤＮＡ挿入断片のサイズは制限酵素 マンピングにより約４．Ｏｋｂであることが決定された。
ｐＨＨ４９のプラスミド地図は第１４図に示される。
ＣＣ８３″ロバ１　　の　１ ＣＣ８３重鎖を単離するのに使われる方法は、本質的にはＣＣ４９重鎖を単離す るのに使われたものであった。
ただし、約１３埒の連結したＬＡＭＢＤＡ−ＺＡＰ”ヘクターＤＮＡを、Ｎｅｗ 　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ＋Ｉｎｃ、＋　から購入した１２単位の力徂 ■により、全体で１００Ｉｌｌの適当な緩衝液中で消化した。ＬＡＭＢＤＡ−Ｚ ＡＰ”は３７°Ｃで一時間消化した。　Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅのプロトコールに 従って反応混合物をフェノール抽出しそしてエタノール沈澱せしめた。狗徂Ｉで 消化されたＬＡＭＢＤＡ−ＺＡＰ”を、Ｍａｎｉａｔｔｓに記載の方法に従って 、ただし４０倍過剰の仔つシ腸アルカリホスファターゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ 　Ｍａｎｎｈｅｉａ＋、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ、ＵＳＡ）を使って、 脱リン酸した。
ＣＣ８３からのＤＮＡを力狙Ｉで完全消化した。Ｍａｎｉａｔｉｓにより記載さ れたような電気溶出により、０．８％アガロースゲル切片から約３ｋｂ〜約４０ ｋｂの断片を単離し、そして脱リン酸されたＳｐ３．１切断ＬＡＭＢＤＡ−ＺＡ Ｐ”ヘクター　ト連結セＬ　メタ。
ｐＮＰ９から作製されたプローブ（この配列は第１３図に示される）を使って、 ５Ｘ１０’プラークを含むゲノムライブラリーをスクリーニングした。１つの陽 性クローンが得られた。この陽性クローンをｐＨ５８３と命名した。
匹剣Ｉ」じ」すＬ乙ムく乙Ａ ｐＨ３８３は７．９５ｋｂであり、そしてＤＮＡ挿入断片のサイズは制限酵素マ ツピングにより約５ｋｂであることが決定された。
ｐＨ５８３のプラスミド地図は第１５図に示される。
四」Ｉヱり狙」■ｕ主羞びＣＣ９２剣恨二ｕ１帆夾定−７０°Ｃで凍結された約 １×１０７個のＣＣ４９細胞からの全ＲＮＡを、本質的にはＭａｎｉａｔｉｓに より報告されたようにして抽出した。ただし、４Ｍグアニジウムイソチオシアネ ートおよび２．５Ｍクエン酸ナトリウム（ｐ）１７．０　）　、並びに３１　、 ００Ｏｒｐｍで遠心する５Ｗ４０Ｔｉローターを使用した。
全部で２．７■のＣＣ４９１２ＮＡが抽出された。遠心後、Ｃｏ１１ａｂｏｒａ −ｔｉｖｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｉｎｃ、、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ、ＵＳＡから 入手したタイプ３のオリゴ（ｄＴ）−セルロースを使ったオリゴ（ｄＴ）−セル ロースクロマトグラフィーにより、約１．６８■のＲＮＡからポリＡ十ａＲＮＡ を精製した。この方法は、ＡｖｉｖおよびＬｅｄｅｒ　、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａ　 ｔ　’　１゜Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、（ＵＳＡ）　６９．１４０８（１９７２）によ り記載されたものと同様である。１．６８■のＲＮＡから全部で５０．２４罐の ポリＡ＋＋ｗＲＮＡが得られた。
約ｌＸｌ０’個の細胞から全部で３．８２■のＣＣ８３ＲＮＡが単離された。１ ．９１■の全ＲＮＡから全部で５４．６ｔＩｘのポリＡ＋ｍＲＮＡが単離された 。
約２．６Ｘ１０＠個の細胞から全部で０．８１４■のＣＣ９２２ＮＡが単離され た。０．８１４■の全ＲＮＡから全部で４１．８８ｇのポリＡ＋ＲＮＡが単離さ れた。
約２．８９　Ｘ　１０層個の細胞カラ全部テ１．７　＠（ＤＣＣ４６ＲＮＡカ単 離された。１．７■の全ＲＮＡから全部で６８．８８層のポリＡ＋ＲＮＡが単離 された。
Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅ ｒａｓ（ＡＢＩ＞、ＦｏｓｔｅｒＣｉ　ｔｙ、　ＣＡ、　ＵＳＡ　）のモデル３ ８０Ａ　ＤＮＡ合成装置を使って、ＡＢＩにより指示されたようなホスホルアミ ダイドに基づく化学により、合成オリゴヌクレオチドブライマーを合成した。製 造業者により指示されたようにして、７Ｍ尿素を含む２０％ポリアクリルアミド ゲル上での電気泳動後、オリゴヌクレオチドを精製した。オリゴヌクレオチド濃 度は２６０ｎ請の光学濃度により分光光度的に決定した。この場合、１００ｚａ ｏ−単位は３３籍／ｄの一本鎖ＤＮＡに等しい。
ａ＋ＲＮＡ配列決定用に次のようなオリゴヌクレオチドプライマーを合成した： （１）　ＣＣ４９，ＣＣ８３およびＣＣ９２軽鎖については、マウス免疫グロブ リンに鎖の定常領域の５′末端のコード配列と相補的である２２マーのＫ　ｔ　 （−）　： ５’　−ＧＧＡＡＧＡＴＧＧＡＴＡＣＡＧＴＴＧＧＴＧＣ−３’を使って、軽鎖 可変領域の３′−■ＲＮＡ配列のほとんどを決定した。
更に、ＣＣ４９軽鎖については、１７マーの４９ＦＲ１（−）　：５’　−ＧＧ ＡＡＧＡＴＧＧＡＴＡＣＡＧＴＴＧＧＴＧＣ−３’を使って残りの配列を決定し た。
更に、ＣＣ８３軽鎖については、２４マーの＋４（−）：５’　−ＣＣＡＡＣＴ ＴＴＧＴＣＣＣＣＧＡＧＣＣＧＡＡＣＧ−３’および更に１７マーの８３Ｌ　Ｃ ＤＲ２（−）：５’　−ＣＡＧＧＧＡＣＴＣＣＡＧＴＧＴＧＣ−３’を使って残 りの配列を決定した。
更に、ＣＣ９２軽鎖については、＋５（−）：５’　−ＣＧＴＴＴＣＡＧＣＴＣ ＣＡＧＣＴＴＧＧＴＣＣＣ−３’を使っ、て残りの配列を決定した。
ＣＣ４６，ＣＣ４９，ＣＣ８３およびＣＣ９２γ１重鎖については、マウスγ１ ３を鎖定常領域の５′末端のコード配列と相補的である２４マーのＣＨＩ（−） 　： ５’　−ＡＴＧＧＡＧＴＴＡＧＴＴＴＧＧＧＣＡＧＣＡＧＡＴ−３’を使ワた。
　ＣＨＩ（−）２４マーを使った重鎮可変領域の大部分の３′ｄＮＡ配列を決定 した。
更に、ＣＣ４９重鎖については、ＪＨ４（−）−２０マー：５’　−ＧＧＴＧＡ ＣＴＧＡＧＧＴＴＣＣＴＴＧＡＣ−３’を使って残りの配列を決定した。
更に、ＣＣ８３重鎖については、ＪＨ２（−）−１６マー：５’　−ＣＴＧＡＧ ＧＡＧＡＣＴＧＴＧＡＧ−３’を使って残りの配列を決定した。
更に、ＣＣ９２重鎮および８７２．３重鎮については、８７２．３／ＣＣ９２Ｈ Ｃ−２０マー： ５’　　−ＣＣＴＴＧＡＡＣＴＴＣＴＣＡＴＴＧＴＡＣ−３’を使って残りの配 列を決定した。
Ｊａｎ　Ｇｅ１ｌｉｅｂｔｅｒによりＢＲＬ　ＦＯＣＵＳ　９．１（１９８７） において概説されるようにして、次の操作を行った。
次のようにしてオリゴヌクレオチドプライマーを末端標識した。１１００ｎのオ リゴヌクレオチドを、１３ｊＩＩの容量において５ｂＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ ８）　、１０ｍＭ　ＭｇＣｂ、５ａ＋Ｍジチオトレイトール、１ｍＭスペルミジ ン、１００　ｕ　Ｃｉ　（７−”Ｐ）ＡＴＰ（Ａｎ＋ｅｒｓｈａａ＋、５０００ Ｃｉ／ミリモル）および７単位のＴ４ポリヌクレオチドキナーゼと混合した。反 応は３７°Ｃで３０分間進行させ、次いで６５°Ｃで５分間加熱してキナーゼを 不活性化し、そして７Ｉの水を添加して５ａｇ／ｍの濃度にした。標識されたプ ライマーは使用まで一２０°Ｃで保存した。
それぞれＣＣ４９，ＣＣ８３，ＣＣ９２またはＣＣ４６のポリ（Ａ）”　ｍＲＮ Ａ約１３河を含む個々の試料を、アニーリング緩衝液（１０ｍＭ　Ｔｒｔｓ−Ｈ ＣＩ（ｐ）１８．３）および２５０ｍＭ　ＭＣＩ）　１０ｍ中に再懸濁した。
各ａ＋ＲＮＡ試料に５ａｇ試料の末端標識されたオリゴヌクレオチドプライマー を添加し、８０”Ｃで３分間加熱し、そしてＫＬ（−）については６１“Ｃで、 ＣＨＩ（−）オリゴヌクレオチドについては６５°Ｃで４５分間アニーリングし た。各ｍＲＮＡ配列決定反応のために６単位のレベルでＡＭＶ逆転写酵素（Ｂｏ ｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉ＠）を使った。配列決定の残りは、ＢＲＬ　 ＦＯＣＵＳ　９．１（１９８７）に記載のようにして行った。
最初の配列データは、重鎮および軽鎖が次の通りに再配列されたことを示した： Ｊ５を使ったＣＣ４９に軽鎖；　ＪＭ　４を使ったＣＣ４９７１重鎖。Ｊ４を使 ったＣＣ８３軽鎖；　Ｊ、２を使ったＣＣ８３Ｔ１゜Ｊ２を使ったＣＣ４６ｘ軽 鎖；　Ｊ、３を使ったＣＣ４６重鎖。Ｊ５を使ったＣＣ９２軽鎖；Ｊ、２を使っ たＣＣ９２ｒ　１゜第１６図は、ＣＣ４９ＶＨのヌクレオチド配列を示し、下線 を引いたセグメントは、ｍＲＮＡにおいてオリゴヌクレオチドプライマーを使っ て誘導された配列を示す。
第１７図は、ＣＣ８３Ｖｏのヌクレオチド配列を示し、下線を引いたセグメント は、ｍＲＮＡにおいてオリゴヌクレオチドプライマーを使って誘導された配列を 示す。
第２図に示されるＣＣ４６ＶｏおよびＣＣ４９Ｖｏの完全なヌクレオチド配列は 、ｍＲＮＡにおいてオリゴヌクレオチドプライマーを使って誘導された。
第４ａ図は、ＣＣ４９ＶＬのヌクレオチド配列を示し、下線を付したセグメント は、オリゴヌクレオチドプライマーを使ってｍＲＮＡにおいて誘導された配列を 示す。
第５ａ図は、ＣＣ８３ＶＬのヌクレオチド配列を示し、下線を付したセグメント は、オリゴヌクレオチドプライマーを使ってｍＲＮＡにおいて誘導された配列を 示す。
第６図に示されるＣＣ９２Ｖｔの完全なヌクレオチド配列は、オリゴヌクレオチ ドプライマーを使ってｍＲＮＡにおいて誘導された。
Ｕ野」１１凰 精製されたマウスＣＣ４９およびＣＣ８３免疫グロブリン分子を、Ｎ−末端アミ ノ酸配列分析のためにミシガン大学タンパク質配列決定施設のＤｒ、Ｇｅｏｒｇ ｅ　Ｔａｒｒに送った。Ｄｒ、　Ｔａｒｒは、「手動エドマン配列決定システム Ｊ　、Ｍｔｃｒｏｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆＰｅ　を陣庄Ａ　Ｐ ｒａｃｔｉｃａｌ　Ｍａｎｎｕａｌ　（Ｊｏｈｎ　Ｅ、５ｂｉｖｅｌｙ［、Ｈｕ ｍａｎａＰｒｅｓｓ、　Ｉｎｃ、、Ｃ１１ｆｔｏｎ、Ｎ、Ｊ、、ｐｐ１５５−１ ９４（１９８６）　）においてＴａｒｒ。
Ｇ、Ｅ、により変形されたエドマン分解法を使用した。簡単に言えば、Ｄｒ、Ｔ ａｒｒは免疫グロブリン分子を還元アルキル化し、免疫グロブリン分子の軽鎖お よび重鎖を逆相ＨＰＬＣにより分離した。
第４　ｂ図はＣＣ４９ＶＬについてのアミノ酸配列を示し、成ｐ５　ＣＣ４９Ｖ Ｌの最初の２４アミノ酸についてのアミノ酸配列決定の結果に下線を引いた。第 ５ｂ図はＣＣ８３ＶＬについてのアミノ酸配列を示し、成熟ＣＣ８３ＶＬの最初 の５１アミノ酸についてのアミノ酸配列決定の結果に下線を引いた。ＣＣ８３軽 鎖においてＭＳＮ−２０は決定できなかった。というのは、下記のＰＮＧアーゼ Ｆ実験において示されるように、この位置にＮ−結合した炭水化物残基が存在す るためである。　Ａｓｎ−１１ｅ−Ｔｈｒ配列は、Ａｓｎへの炭水化物結合のた めの共通配列Ａｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒ／Ｓｅｒに相当する。
免疫グロブリンＣＣ４９およびＣＣ８３の重鎖はＮ末端でブロックされており、 従ってアミノ酸配列決定に利用できないので、生来の糖ペプチドを臭化シアン（ ＣＮＢｒ）で処理し、メチオニン残基のところで開裂せしめた。開裂で生成した 断片を逆相ＨＰＬＣにより精製した。このＣＮＢｒ断片についてＮ末端アミノ酸 配列決定を行った。
１つのＣＣ４９ＶＭＣＮＢｒペプチド断片のアミノ酸配列決定の結果を、第１８ 図において下線を引いた残基として示す。１つのＣＣ４９ＶＨＣＮＢｒペプチド 断片のアミノ酸決定の結果を、第１９図において下線を引いた残基として示す。
ＣＣ４９と同様に、その地金てのペプチド配列はマウスＴ１の定常領域から誘導 されたＣＮＢｒ断片と一致する。
ＣＣ８３Ｌ　！上のＮ−人した　　ヒ　の。
この実験は、おそら（ＭＳＮ−２０においてＣＣ８３軽鎖に結合したＮ−結合炭 水化物があることを確かめるために行った（第５ｂ図参照）。酵素グリコペプチ ダーゼＦ　（ＰＮＧアーゼＦ）はフラボバクテリウム・メニンゴセプチカム（Ｆ １ａｖｏｂａｃｔｅｒｔｕａ＋懸坦Ｊμ問棟国明）の培養濾液から単離され（Ｔ ａｒｅｎｔｉｎｏ、Ａ、Ｌら、影男上明Ｉ↓■２４．４６６５−４６７１）　、 そしてこれはＭＳＮにＮ−結合した高マンノースおよび／または二触角状の（ｂ ｉａｎｔｅｎ−ｎａｒｙ）複合糖質を開裂し、遊離の炭水化物構造およびそれが 結合していたＡＳＮからＡＳＰ残基を生成せしめる。同一ペプチドのグリコジル 化形と非グリコジル化形の間の分子量の相違は、５ＯＳ−ＰＡＧＥにより決定す ることができる。
精製したマウス抗体ＣＣ４９，ＣＣ８３およびＣＣＩＩ　Ｐ（ａｂ’　）！（正 の対照）　１２ＩＪＸについての反応は、ＰＮＧアーゼＦ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅ ｒ　Ｍａｎｎ−ｈｅｉｍ、　Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、　ＩＮ、ＵＳＡ）を含 有するかまたは含有しないで４０ｍの最終水性反応液量で行った。各反応混合物 に４４の１０×緩衝液（ＩＭ　リン酸カリウム、０．１　Ｍ　ＥＤＴＡニナトリ ウム、ｐｔ１７．４）を添加した。ｒ　ＰＮＧアーゼＦ含有」と指示した試験管 には７．５　ｄのＰＮＧアーゼＦを更に添加し、そして全試験管を３７℃で１時 間インキエベートした。この反応試験管に、β−メルカプトエタノールを含有す るＬａｅｍｍｌｉの２×試料希釈緩衝液４０ｍを添加した。１０％ＳＯＳポリア クリルアミド上で電気泳動し、ゲルをクーマシーブリリアントブルーＲ−２５０ で染色し、次いで脱色した。その結果を第２０図に示す。レーン２において示さ れるように、ＲＮＧアーゼＦで処理されたＣＣ８３試料には新しいバンド（＊） が現われるが、未処理のＣＣ８３試料（レーン３）には現われない。この新しい バンドは、生来の軽鎖のバンドよりも小さい約２　、０００−３　、０００の分 子量であり、これはＮ−結合した炭水化物成分の除去を示す。ＣＣ８３軽鎖の唯 一の共通グリコジル化部位はＡＳＮ２０のところであり、よって推論の結果、こ れが実際のグリコジル化部位であり、そしてＣＣ８３軽鎖のＮ−末端配列分析時 に何故ＡＳＮと判明しなかったが推測される。ＣＣ４９軽鎖はＰＮＧアーゼで処 理した時に成分が変化しなかった（レーン６）が、正の対照として働（ＣＣＩＩ Ｆ（ａｂ’　＞を重鎖断片については新しいバンドが観察された（レーン４の＊ 印）。ＣＣ１１重鎖の１ＲＮＡ配列データは、■領域中の共通グリコジル化部位 を示す（データは示してない）。標準（レーンｌ）は、ウシ血清アルブミン（Ｂ ＳＡ）ＭＷ　６Ｂ、０００およびダイズトリプシンインヒビター（ＳＴＩ）　Ｆ ’ｌＷ　２１，５００である。
四相１死 プラスミドＤＮＡは、Ｕｎｉｔｅｄ　５ｔａｔｅｓ　Ｂｉｏｃｈｅ＋＋＋１ｃａ ｌ（ＵＳＢ）。
Ｃ１ｅｖｅｌａｎｄ、　ＯＲ，ＵＳＡから入手した５ｅｑｕｅｎａｓｅ　ＤＮＡ 配列決定キットを使って直接配列決定した。ＵＳＨのプロトコールに従って二本 鎖ＤＮＡを配列決定した。各可変領域のＤＮＡは、各々が生産的に再配列された 重鎮または軽鎖遺伝子それぞれに特異的であることがｍＲＮＡ配列情報から決定 されたＪｕｌまたはＪＬオリゴを使って配列決定した。
最初の配列を決定した後、追加のブライマーを使って配列を更に拡張した。追加 のブライマーは、前に作製した配列から推測される情報を使って合成した。
上述の方法を使って、ＣＣ４９およびＣＣ８３の完全な重鎮可変領域エクソンと 軽鎖可変領域エクソンが得られた。該ＤＮＡ配列を編集し、そして日立のＤＮＡ 配列分析ソフトウェアプログラムＤＮＡ５ＹＳＴＮを使って分析した。
ＤＮＡ配列分析のために次のオリゴヌクレオチドブライマーを作製した： （１）両者の軽鎖については、ＣＸイントロン（−）；５’　−ＧＡＡＡＡＣＣ ＴＧＴＧＴＣＴＴＡＣＡＣ３’。
（２）　ＣＣ４９軽鎖ニツイテは、ＣＣ４９ＦＲｌ（＋）：およびＪＭ５（−） −２３７−： ５’−ＣＧＴＴＴＣＡＧＣＴＣＣＡＧＣＴＴＧＧＴＣＣＣ−３’。
（３）　ＣＣ８３軽鎖ニツイテは、ＣＣ８３ＣＤＲ２（−）：５’　−ＣＡＧＧ ＧＡＣＴＣＣＡＧＴＧＴＧＣ３’　；ＣＣ８３Ｌイントロン（−）： ５’　−ＧＡＣＴＴＣＡＡＧＡＴＡＣＡＡＡＴＧＴＴＡＧ−３’　；およびＪＭ ４（−）−２０マー： ５’　−ＣＣＡＡＣＴＴＴＧＴＣＣＣＣＧＡＧＣＣＧＡＡＣＧ　。
ＣＣ４９ＶＬおよびＣＣ８３Ｖｔの完全ヌクレオチド配列は、それぞれ第４ａ図 および第５ａ図に示される。
ＣＣ４９重鎖については、ＪＭ　４（−）−２０マー：５’　ＧＧＴＧＡＣＴＧ ＡＧＧＴＴＣＣＴＴＧＡＣ−３’　　；およびＪ、４イントロン（−）： ５’　−ＧＣＡＡ’ｒＧＣＴＣＡＧＡＡＡＡＣＴＣＣ。
ＣＣ８３重鎖については、ＪＭ　２（−）−１６マー：５’　ＣＴＧＡＧＧＡＧ ＡＣＴＧＴＧＡＧ−３’　。
およびＪＮ２イントロン（−）： ５’　−ＧＣＡＧＴＡＡＡＡＴＣＴＡＴＣＴＡＡＧＣＴＧ　。
その後、次の配列を使って各重鎮の配列決定を拡張した：ＣＣ４９／８３　ＨＣ ｌ５’　（＋）：５’　−ＧＣＡＣＴＧＣＴＣＡＴＧＡＴＡＴＧＣＡＡＡＴＣ− ３’　；ＣＣ４９／８３　ＨＣｌ５’　（−）：５’　−ＧＡＴＴＴＧＣＡＴＡ ＴＣＡＴＧＡＧＣＡＧＴＧＣ−３’　。
オヨヒｃｃ４９／８３　ＨＭ　ＦＲＩ（−）：５’　−ＣＴＣＡＧＣＧＴＣＡＧ ＡＣＴＧＣＴＧ−３’ＣＣ４９ＶＨおよびＣＣ８３ｖＨについての完全ヌクレオ チド配列は第２図に示される。
特徴付けられたｍＲＮＡ配列と特徴付けられたＤＮＡ配列との比較、特徴付けら れたアミノ酸配列とＤＮＡ配列から推定されるアミノ酸配列との比較を行った。
それらの比較に基づいて、ＣＣ４９およびＣＣ８３の重鎖および軽鎖可変領域を コードする正しいＤＮＡ配列を含むプラスミドクローンを同定した。
ＣＣ４９およびＣＣ８３の重鎖可変領域のヌクレオチド配列から推定されるアミ ノ酸配列は、第２図に示されるように、フレームワーク領域並びに超可変領域１ および２に渡り広範な配列相同性を示す。超可変領域３は、異なるＤおよびＪＨ 配列によるＶＭｅｆｆ域の組換え、即ちＪＭ４を使ったＣＣ４９１１重鎮、およ びＪ、２を使ったＣＣ８３ｒ　１による組換えのため、三者の間で全く異なる。
ＣＣ４９およびＣＣ８３重鎖可変領域遺伝子中の５′からコード領域までの広範 なりＮＡ配列相同性は、２つの重鎮可変領域遺伝子が同じジャームラインエクソ ンに由来することを示す。
ＣＣ４６ＣＣ４９，ＣＣ８３およびＣＣ９２の　　に・　るジャームーインｌ　 云でるＶαＴＡＧの ＣＣ４６，ＣＣ４９，ＣＣ８３およびＣＣ９２の重鎖可変領域に対するジャーム ライン前駆体遺伝子を単離するのに使用する方法は、本質的には、ＣＧ４９重鎖 可変領域を単離するのに使用したものであった。ただし、ＬＡＭＢＤＡ−ＺＡＰ ”ライブラリーを作製するのに用いるＤＮＡは、無意味なバイプリドーマ細胞系 （即ち、感知できるほどにはＴＡＧ７２に結合しない抗体を産生ずる細胞系）か らのものであった。約９００．０００プラークを含むゲノムライブラリーをスク リーニングし、そこから１つの陽性クローンを単離した。この陽性クローンをＰ ＶＮαＴＡＧと命名した。
ｐｖ、Ｉα↑ＡＧは約５．２ｋｂであり、そして制限酵素マツピングによりＤＮ Ａ挿入断片のサイズが約２．２ｋｂであることが決定された。
Ｖ　ａＴＡＧ　（７）　ＤＮＡ　　Ｉ ＶＨ（ｒＴＡＧのＤＮＡ配列を決定するために、次のオリゴヌクレオチドブライ マーを使った： Ｂ７２．３／ＣＣ９２ＨＣ−２０７−：　５’　−ＣＣＴＴＧＡＡＣＴＴＣＴＣ ＡＴＴＧＴＡＣ−３’　；ＣＣ４９／ＣＣ８３ＨＣ５’　　（＋）：　５’　− ＧＣＡＣＴＧＣＴＣＡＴＧＡＴＡＴＧＣＡＡＡＴＣ−３’　　；ＣＣ４９／ＣＣ ８３ＨＣ５’　　（−）：　　５’　　−ＧＡＴＴＴＧＣＡＴＡＴＣＡＴＧＡＧ ＣＡＧＴＧＣ−３’　　：ＶＨαＴＡＧ　ＩＶＳ（＋）：　５’　−ＣＴＡＡＡ ＧＴＧＧＡＧＴＣＡＧＧＧＣＣＴＧ−３’　　；ＶＨ（ｒＴＡＧ　ＩＶＳ（−） ：　　５’　　−ＣＡＧＧＣＣＣＴＧＡＣＴＣＣＡＣＴＴＴＡＧ−３’　　；Ｖ Ｍ（ＸＴＡＧ　　ＣＤＲ２（＋）：　　５’　　−ＧＡＡＴＧＧＡＴＴＧＧＡＴ ＡＴＡＴＴＴＣＴＣ−３’　　。
Ｖ）ＩｔｘＴＡＧの完全ヌクレオチド配列は第２図に示される。
ヒト　′　６−　の 種々の重鎮ヒト定常領域を含むプラスミド構成物（ｐγ１゜ｐ　ｙ　２．　ｐ　 ｒ　３およびｐ　ｒ　４）は、Ｎａｔｔｏｎａｌ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎ５ｔｉｔ ｕｔｅ。
Ｂｅｔｈｅｓｄａ、　ＭａｒｙｌａｎｄのＤｒ、ｌ１ａｎ　Ｒ，Ｋｉｒｓｃｈに より提供された。
それらの遺伝子に関して制限酵素マツピングを行ない、それらの正体を確かめた 。ヒト定常領域についての制限地図は第２１図に示される。
土り立藍亘 ヱ立久匹Ｕヱ皿贋 Ｊ５とＣＪｅＯ間のマウスイントロン領域中に存在するＣＣ４９軽鎖ゲノムＤＮ ＡのＨｉｎｄＩＩＩ部位（Ｍａｘ、Ｅｄｗａｒｄ　Ｅ、　ら、Ｊ、Ｂｉｏｌ。
たジ徂１部位と連結するクローニング操作において消失した。
プラスミドｐＲＬ１０１　（第９図）はこの変更物を有した。Ｈｉｎｄ　ｍ−シ 埼旧ヒトジャームラインに軽１！ｊ　ＤＮＡ断片（Ｈｉｅｔｅｒ、Ｐ、ら、Ｊ、 Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　２５７．１５１６（１９８２）参照〕を直接マウス可変 領域と連結できるようにするために、上述の段階において要約したようにしてイ ントロｙＨｉｎｄＩＩＩ部位を再生せしめた。当業者によく知られておりそして Ｍａｎｉａｔｉｓのようなマニュアルにおいて見つけることができる標準的な分 子生物学技術を使って、全ての段階を行った。
上述（７）　ｐ　ＲＬ　１０１から１．６９ｋｂのは１０１　Ｈｌ−カ匹ｌ断片 を単離する。
上述のｐＢＩｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅがら購入） がら２．９６ｋｂの町υ旧−Ｐｓｔ　Ｉ断片を単離する。この二断片を連結シ、 そして下記のｐＲＬ１０３を単離する。
（以下余白） プラスミドｐＧＤ１　（上述）をＰｓｔ　Ｉおよび…ｎｄｌ［［制限酵素で消化 し、必要な１．０３ｋｂのイントロン含有断片を得、そしてｐＲＬ１０３もＰｓ ｔｌおよびＨｉｎｄｌ［制限酵素で消化し、ポリリンカー中のＤＮＡの小断片を 除去した。
得られた二断片をＴ４　ＤＮＡリガーゼを用いて連結し、ｐＲＬ１０４と命名し た５、６８ｋｂのプラスミドを作製した。ｐＧＤｌおよびｐＲＬ１０４の部分制 限地図は下記に示される。
（以下余白） ！」四Ｕ坂 プラスミドｐｂｕａ　Ｃ，をＤｒ、Ｊｏｈｎ　Ｒｏｄｅｒ、Ｍｔ　５ｉｎａｉ　 Ｒｅ５ｅａｒｃｈＩｎｓｔｉｔｕｔｅ、　Ｔｏｒｏｎｔｏ＋　０ｎｔａｒｉｏ、 　Ｃａｎａｄａがら入手した。このプラスミドはｐＢＲ３２２由来であり、ヒト ｃ、ｅエクソンを含む１２ｋｂのＢａ＋ｓ旧断片がその中に挿入されたものであ る。１２ｋｂのＢａａ　Ｈ１断片の制限地図は下記に示される（Ｈｅｉ　ｔｅｒ 、　Ｐ、ら、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　２５７，１５１６（１９８２）から〕 。
（以下余白） プラスミドｐｈｕｍ　Ｃえを肛皿■およびルυ旧制限酵素で消化し、ヒトＣえエ クソンを含む５．０ｋｂ断片を得た。ｐｌ？Ｌ１０４をＬ利ＩおよびＨｉｎｄｌ ［Ｉ制限酵素で消化し、ＣＣ４９のマウス軽鎖可変エクソンを含む４．２ｋｂの 断片を得た。
得られた２断片を７４　ＤＮＡリガーゼにより連結し、生成した断片混合物の中 から９．２ｋｂの断片を得た。この混合物をシ１旧で消化し、影１旧粘着末端を 有する７、７ｋｂの影υＨＩ　ＣＣ４９Ｌ鎖キメラ構成物を得た。これは、マウ ス可変領域エクソンとヒト定常領域（に）エクソンの両方を含む。それらの構成 物は、ヒトエンハンサ−配列とマウスプロモーター配列を使用する。
マウス軽鎖可変領域エクソン（ＬおよびＶＪ）とヒト定常領域カッパ（に）エク ソンの両方を含むキメラＢａｇ　ＨＩ断片を、選択可能なマーカー遺伝子奥を含 むｐＢＲ３２２由来のプラをＧ４１８とも称されるネオマイシン様薬剤ゲネチシ ンによる増殖阻害に対して耐性にする。
下記に示されるように、両方向においてキメラ堀１旧断片をｐＳＶＺｎｅｏ中に 挿入した。奥遺伝子に関して、両方の転写方向のキメラ軽鎖遺伝子を作製した。
プラスミドｐＳＶ２ｎｅ。
をＢａｇ　ＨＩ部位のところで線状にし、仔つシ腸アルカリホスファターゼを使 って（Ｍａｎｉａｔｉｓにより記載された方法に従って）脱リン酸しく自己連結 を防ぐため）、そして上記からのキメラＣＣ４９Ｌ鎖Ｂａａ＋　Ｈ１断片と連結 せしめた。
ｐＲＬ１５０とｐＲＬ１０５においてｎｅｏ遺伝子およびＣＣ４９キメラ軽鎖の 転写方向は矢印で示されている。ｐＳＶ２ｎｅｏに由来する部分も示されている 。それらのプラスミドを、大スケールにおいて各プラスミドを複製するＥ、コリ （Ｅ、　ｃｏｌｔ）クローンの調製スケール（１，Ｏｆ）堵養物から精製した。
精製したプラスミドを用いて後述のようにしてキメラＣＣ４９軽鎖を５ｐ２１０ 形質細胞腫細胞中に導入した。
マウスＣＣ８３Ｖ　　令　およびヒトＣ？ＩＣＣ８３軽鎖のクローニング工程に おいて失われたｐＲＬ２００中のＨｉｎｄＩ［［部位を、ＣＣ４９軽鎖キメラ構 成物と同じ理由で再生せしめた。再生は次のようにして行った。プラスミドｐＲ Ｌ２００をユニークＮｈｅ　１部位のところで線状化し、そしてｄＮＴＰｓとＤ ＮＡポリメラーゼ■を用いてフィルインすることにより両端の粘着末端を平滑末 端に変換した。このフィルイン部位にＲａｍ　８！リン酸化リンカ−（Ｎ６ｗ　 Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓから購入）を連結した。新規プラスミドをｐＲ Ｌ２０１と命名し、そして下記に示す。
（以下余白） ＣＣ８３軽鎖可変領域のゲノムＤＮＡを含むｐＲＬ２０１からの２．５ｋｂのＢ ａｇ旧−Ｐｓｔ　Ｉ断片を、ＣＣ４９軽鎖構成物において上述されておりそして 既にＨｔｎｄＩ［Ｉ含有イントロン断片を有しているｐＲＬ１０４からの４ｋｂ のＢａｍ　ＨＩ−Ｐｓｔ　Ｉベクター断片と連結せしめた。新規プラスミドをｐ ＲＬ２０２と命名し、そして下記に示す。
（以下余白） ｐＲＬ２０２から約５．０５ｋｂのシｑＩ−Ｈｉ皿■断片を単離し、そしてＣＣ ４９軽鎖キメラ構成物について上述したヒトＣｔ含有５．０ｋｂＨｉｎｄｌｌ［ −Ｂａａ＋旧断片と連結せしめた。ＣＣ８３軽鎖ベクターの作製は、この時点か らはＣＣ４９軽鎖について実施されたものと同じ方式で行った。得られた８、５ ｋｂのＢａｇ　ｔｌＩ　ＣＣ８３軽鎖キメラ構成物をｐＳＶ２ｎｅｏ−坦υ旧（ ホスファターゼ処理したもの）と連結し、そして下記に示されるように２つの可 能な方向の挿入断片を有するプラスミドを得た。
（以下余白） ｎｅｏ遺伝子およびＣＣ８３キメラ軽鎖遺伝子の転写方向は、ｐＲＬ２０３およ びｐＲＬ２３０において矢印により示されている。それらのプラスミドは、該プ ラスミドの各々を複製しているＥ、コリ（Ｂ、　Ｃ０ＩＬ）クローンの市販イン キュベーター中での分取スケール（１，Ｏｆ）培養物から大スケールで精製した 。精製したプラスミドを用いて、後述のようにして、５ｐ２１０形質細胞腫細胞 中にキメラＣＣ８３軽鎖を導入した。
４つのキメラ軽鎖プラスミド構成物（ｐＲＬ１０５．　ｐＲＬ１５０．　ｐＲＬ ２０３およびｐＲＬ２３０）の全てが、制限酵素ＡａｔＩＩでの消化により線状 化され得る。それらプラスミド中のＡａｔＩ［部位は、キメラ軽鎖遺伝子または 選択可能マーカー遺伝子ｎｅｏの発現にとって重要でない領域中にある。
土Ｌｒ里亘 ヒトＴ定常遺伝子エクソン キメラ重鎖構成物を運ぶのに使われるプラスミドベクターはｐＳＶ２ｇｐ　ｔと 称し、ＭｕｌｌｉｇａｎおよびＢｅｒｇ、　　ｒキサンチン−グアニンホスホリ ボシルトランスフェラーゼをコードしているＥ、コリ遺伝子を発現する動物細胞 の選択Ｊ　、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ′ｌ。
Ａｃａｄ、　５ｃｉ（ＵＳＡ）　７８（４）、２０７２−２０７６中に発表され たものである。
ｐｓＶ２ｇｐｔは、ｐＢＲ３２２由来のプラスミドであり、選択可能マーカー遺 伝子であるグアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ軸ｐｔ）遺伝子を含み、 これはミコフェノール酸を含有する培地中での選択的増殖のために使用すること ができる。ヒトＣｒＬ　Ｃｒ２．Ｃ７３，Ｃｒ４エクソンのための受容体として ｐＳＶ２ｇｐｔを調製するために、それをＥｃｏ　Ｒ１および影徂旧で消化した 。消化されたＤＮＡを４％ポリアクリルアミドゲル上で分画し、そしてＭａｎｉ ａｔｉｓにおいて記載されたような電気溶出によりゲルから４．５ｋｂのベクタ ー断片を回収した。この線状化されたプラスミドをｐＳＶ２ｇｐｔ／Ｒ／Ｂと命 名し、そのプラスミド地図は第２２図に示されている。それはＥｃｏ　Ｒ１−Ｂ ａｇ旧で終わる断片を収容することができる。
ヒ）　ｒｇＧ、定常領域断片上に存在する５’Ｈｉｎｄｌ１１部位を、ｐＳＶ２ ｇｐｔのＥｃｏ　Ｒ１部位中へのクロー、ニングに向けるためＥｃｏ　ＲＩ部位 に変換した。ｒｌ、γ２．γ３およびＴ４については、ｐＢＲ３２２ベクター中 のＥｃｏ、ＲＩ部位を使用した。
Ｃｒ１ ヒトＣｒ１エクソンを含む断片は、ｐＴｌをＨ３ｎｄｍで消化しそして線状化し 、次いで全４種のｄＮＴＰおよびＤＮＡポリメラーゼのフレノウ断片を使って… ｎｄｌＩ［粘着末端をフィルインし、ＨｉｎｄｌＩＩ末端を平滑にした。Ｅｃｏ 　ＲＩ　リンカ−をこの平滑末端に連結せしめ、旦耐」部位をＥｃｏ　Ｒ１に置 き換えた。次いでこの構成物をＥｃｏ　ＲＩおよびＢａｇ旧で消化し、ＣＴ１エ クソンを含む７．８ｋｂ断片を遊離せしめた。この断片をＣｒ１−７．８ｋｂと 命名した。
この断片を、ｐＳＶ２−ｇｐｔ／Ｒ／ＢのＥｃｏ　Ｒ１−Ｂａａ＋旧部位中にそ れぞれ連結した。コノヘクター（ｐＳＶ２−ｇｐｔ−ｒ　１−７．２）デザイン は、いずれかのマウス重鎮可変領域遺伝子（Ｅｃｏ　Ｒ１末端を有する）をヒト ＩｇＧ重鎖ベクターのＥｃｏ　ＲＩ中に挿入することを可能にする。より詳しく は、１２５ｎｇのヒトＣγ１−７．８　ｋｂ断片を、４００単位の７４　ＤＮＡ リガーゼ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓから入手）を使って、１０ １１１の容量において１００ｎＨの線状化したｐＳＶ２ｇｐｔ／Ｒ／Ｂベクター と連結せしめた。この連結反応物を用いてＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのプロトコール に従ってＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｓａｎ　Ｄｉｅ−ｇｏ、ＣＡ）からコンピテン トＥ、コリ（Ｅ、　ｃｏｌｔ）ＤＨＩ細胞を形質転換せしめた。得られたプラス ミドをｐＳＶ２ｇｐｔ　ｒ　１−７．８と命名した。ｐＳν２ｇｐｔγ１−７． ８のプラスミド地図は第２３図に示されている。
加えて、Ｃγｌエクソンを含むより短い別の断片を作製した。７．８　ｋｂ（Ｄ 　Ｃｒｌ断片、４．５　ｋｂのｐＳＶ２−ｇｐｔ／Ｒ／Ｂヘクターおよび１．９ ｋｂのＣＣ４９可変領域を存する全サイズのキメラ重鎖ベクター（全体＝１４． ２ｋｂ）について、大きいサイズの７．８ｋｂＣｒｌ　Ｅｃｏ　ＲＩ−Ｂａｇ　 ＨＩ断片を縮小することを思いついた。
７．８ｋｂのＣｒｌのコード領域は、その断片の５′末端の最初のわずか１／３ を占めるにすぎない。
サイズ縮小は、シ１旧リンカ−の平滑末端付加によりさッ■部位の下流をＢａｇ ■１部位に変換することにより達成された。ｐＴｌをＨｉｎｄＩ［Ｉで消化し、 ３′末端をフィルインして平滑末端を作り、そして上述のようにＦｓｃｏ　ＲＩ 　リンカ−を付加することにより、ｐＴｌのＨｉｎｄＩ［部位をＥｃｏ　Ｒ１部 位に変換した０次いでＰｖｕ　Ｕで消化しそして平滑ハｒｙｆｌ末端に直接坦１ 旧リンカ−を連結することにより、ハラ■部位の′２．．３ｋｂ下流をＢａｇ　 ＩＩ部位に変換した。この構成物を次にＥｃｏ　ＲＩおよびＢａｇ　［で消化し 、Ｃγｌエクソンを含む２．３ｋｂ断片を遊離せしめた。短縮された影遼ＲＩ− 坦ｔｍ　ＩＩ断片（２，３ｋｂ）は、まだｒエエクランと３′ポリアデニル化配 列を含んでいる。
これは全ベクターサイズを５．５ｋｂｔＩｉらし、全体の構成物をより扱いやす くする（全体＝８．７ｋｂ）。
約２００ｎｇのヒトＣＴＩ　２．３　ｋｂ断片を、４００単位の７４　ＤＮＡリ ガーゼ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）を使って１０ｍの容量にお いて１１００ｎの線状化されたプラスミドｐＳＶ２ｇｐｔ／Ｒ／Ｂベクターと連 結せしめた。この連結混合物を用いてＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのプロトコールに従 って、ｒｎｖｉ　ｔｒｏｇｅｎから入手した凍結コンピテントＥ。
コリ（影匹且）細胞を形質転換せしめた。得られたプラスミドをｐＳＶ２ｇｐｔ 　ｒ　１−２．３と命名した。ｐＳＶ２ｇｐｔ　ｒ　１−２．３のプラスミド地 図は第２４図に示される。
他の３つのヒ）ＩｇＧ定常領域エクソンを含むＤＮＡ断片も単離した。Ｃｒ２エ クソンはプラスミドｐγ２から４．ＯｋｂのＥｃｏ　ＲＩ−Ｂａｍ＋　ＩＩ断片 として回収された。ＣＴ３エクソンはプラスミドｐγ３から８．０ｋｂのＥｃｏ 　Ｒ１−Ｂａａ＋　ＩＩ断片として回収された。ＣＴ４エクソンはプラスミドｐ ｒ４から７．６ｋｂのＥｃｏ　Ｒ１−Ｂａａ＋旧断片として回収された。それら の断片を、Ｃｒ１−７．８およびＣｒ　１−２．３について記載したようにして ｐＳＶ２ｇｐｔ／Ｒ／Ｂ中にそれぞれ連結せしめた。得られたブラスミトノフラ スミト地図は、ｐＳＶ２ｇｐｔ−７２が第２５図ニ；　ｐＳＶ２ｇｐｔ−Ｔ３が 第２６図に；そしてｐＳＶ２ｇｐ　ｔ−Ｔ４が第２７図に示されている。
１１」フ賢月１腹豐 完全なマウス重鎖可変領域／ヒトＴ１定常領域キメラ構成物は、マウス重鎮可変 領域エクソンを含む断片を、次のようにして、ヒトγ１定常領域を含むプラスミ ド中に挿入することにより作製された。
まず、ＣＣ４９およびＣＣ８３ハイブリドーマ細胞からのマウス重鎮可変領域遺 伝子を含むＥｃｏ　Ｒ１断片を、次のようにしてγ１〜γ４含有ｐＳＶ２−ｇｐ ｔヘクター（ｐＳＶ２ｇｐｔ−ｒ　１；ｐＳＶ２ｇｐｔ−ｒ　２；ｐＳＶ２ｇｐ ｔ−ｒ　３；ｐＳＶ２ｇｐｔ−ｒ　４）の各々に連結せしめた。
Ｃ４９ １４Ｉｇのｐ）！）１４９を５０単位のシ冴ＲＩ（ＢＲＬから入手）で３７°Ｃ にて２時間消化することにより、ＣＣ４９重鎖可変領域をコードしている重鎮可 変領域エクソンを含む断片を調製した。消化物を４％ポリアクリルアミドゲル上 で分画し、そしてＭａｎｉａｔｉｓにより記載されたような電気溶出により、Ｃ Ｃ４９の重鎮可変領域エクソンを含む１．９ｋｂのＥｃｏ　Ｒ１断片を回収した 。この断片をｆ４９Ｒと命名した。
γ１をコードしている７、８ｋｂ配列を含む断片を次のようにして調製した。
約５０ｘ（７）ベクターｐＳＶ２ｇｐｔ　ｒ　１−７．８をＥｃｏ　Ｒ１”？？ 消化した。
Ｍａｎｉａｔｉｓにより記載されたようにして仔つシ腸アルカリホスファターゼ を使って該生成断片を脱リン酸した（自己連結を防ぐため）、０．８％アガロー スゲルから電気溶出により該断片を精製した。このベクターをｐＳＶ２ｇｐｔ　 Ｔｌ−７，８／Ｒと命名した。
転写開始部位の２４５ｋｂ上流にＢｃｏ　ＲＩ部位が置かれ、そして効率的な発 現のためのプロモーターおよび必要な組織特異的配列を含む。可変領域遺伝子の ３′側のイントロン領域は、ヒトＩｇＧ　！Ｉベクター上にないマウス重鎮エン ハンサ−配列を含んでいる。従って、重鎮キメラベクターはマウスプロモーター とエンハンサ−配列の両方を使用する。
約３２５ｎｇの線状化されたｐＳＶ２ｇｐｔ　ｒ　１−７．８／Ｒを、１単位の Ｔ４　ＤＮＡリガーゼ（ＢＲＬ）を用いてＩＯｄの容量において１８８ｎｇのｆ ４９Ｒと連結せしめた。Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅのプロトコールに従って、この連 結混合物を用いてＳｔｒａｔａｇｅｏｅからの凍結コンピテントＥ、コリＡＧ− １細胞を形質転換せしめた。得られたプラスミドをＲ４９ｒ　１−７．８と命名 した。第２８図はＲ４９γ１−７．８のプラスミド地図を表わす。
ｐＳＶ２ｇｐｔγ１．−７．８についてと同様にして約５０ｔｔｇのベクターｐ ＳＶ２ｇｐｔ　ｒ　１−２．３をＥｃｏ　ＲＩで消化した。生じた断片を、Ｍａ ｎｉａｔｉｓにより記載されたようにして仔つシ腸アルカリホスファターゼを使 って脱リン酸した。該断片を０６８％アガロースゲルから電気溶出により精製し た。この線状プラスミドをｐＳＶ２ｇｐｔ　ｒ　１−２．３／Ｒと命名した。
約３００ｎｇの線状化されたプラスミドｐＳＶ２ｇｐｔ　ｒ　１−２．３／Ｒを 、１単位のＴ４　ＤＮＡリガーゼ（ＢＲＬ）を用いて１０Ｉの容量において１８ ８ｎｇのｆ４９Ｒと連結せしめた。　Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ　Ｊｏｌｌａ ｔＣＡ）のプロトコールに従って、この連結混合物を用いてＳｔｒａｔａｇｅｎ ｅからの凍結コンピテントＥ、コリＡＧ−１細胞を形質転換せしめた。得られた プラスミドをＲ４９γ１−２．３と命名した。第２９図はＲ４９γ１−２．３の プラスミド地図を示す。
プラスミドｐＳＶ２ｇｐｔ−ｒ　２．　ｐＳＶ２ｇｐｔ−７３およびｐＳＶ２ｇ ｐｔ−７４をそれぞれＥｃｏ　Ｒ１で消化し、それぞれ線状プラスミドベクター ｐＳＶ２ｇｐｔ−ｒ　２／Ｒ，ｐＳＶ２ｇｐｔ−ｒ　３／ＲおよびｐＳＶ２ｇｐ ｔ−ｒ　４／Ｒを生ぜしめた。それら３種の線状プラスミドベクターの各々をｆ ４９Ｒと連結せしめた。得られたプラスミドのプラスミド地図は、Ｒ４９−ｒ　 ２が第３０図；　Ｒ４９−ｒ　３が第３１図；およびＲ４９−ｒ　４が第３２図 に示されている。
Ｃ８３ ＣＣ４９のキメラ構成物と同様にして、ＣＣ８３の重鎮可変領域を含むキメラ構 成物を作製した。１９汀のｐＨ５８３を５０単位のＥｃｏ　ＲＩ（ＢＲＬから入 手）で３７°Ｃにて２時間消化することにより、ＣＣ８３重鎮可変領域をコード している重鎮可変領域エクソンを含む断片を調製した。消化物を４％ポリアクリ ルアミドゲル上で分画し、そしてＭａｎｔａｔｉｓにより記載されたような電気 溶出により、ＣＣ８３の重鎮可変領域エクソンを含む２．９ｋｂのＥｃｏ　ＲＩ 断片を回収した。この断片をｆ８３Ｒと命名した。
上記で得られた線状化されたプラスミドｐＳＶ２ｇｐｔ　ｒ　１−７．８／Ｒ約 ３００ｎｇを、１単位のＴ４　ＤＮＡリガーゼ（ＢＲＬから入手）を用いて１０ Ｊｉ１の容量において２７Ｑｎｇのｆ８３Ｒと連結せしめた。Ｓｔｒａｔａ−ｇ ｅｎｅのプロトコールに従って、この連結混合物を用いてＳｔｒａ−ｔａｇｅｎ ｅから入手した凍結コンピテントＥ、コリＡＧ−１細胞を形質転換せしめた。得 られたプラスミドをＲ８３ｒ　１−７．８と命名した。第３３図はＲ８３γ１− ７．８のプラスミド地図を示す。
上記で得られた約９０ｎｇの線状化されたプラスミドｐＳＶ２ｇｐ　ｔγ１−２ ．３／Ｒを、１単位の７４　ＤＮＡリガーゼ（ＢＲＬ）を用いて１０ｍの容量に おいて２７０ｎｇのｆ８３Ｒと連結せしめた。　Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅのプロト コールに従って、この連結混合物を用いてＳｔｒａｔａｇｅｎｅからの凍結コン ピテントＥ、コリＡＧ−１細胞を形質転換せしめた。得られたプラスミドをＲ８ ３ｒ　Ｌ−２，３と命名した。第３４図はＲ８３γ１−２．３のプラスミド地図 を示す。
ｐＳＶ２ｇｐｔ−γ２／Ｒについて上述したようにして、プラスミドｐＳＶ２ｇ ｐｔ−ｒ　２．　ｐＳＶ２ｇｐｔ−ｒ　３およびｐＳＶ２ｇｐｔ−ｒ　４をそれ ぞれＥｃｏ　ＲＩで消化し、それぞれ線状プラスミドベクターｐＳＶ２ｇｐｔ− ｒ　２／Ｒ，ｐＳＶ２ｇｐｔ−ｒ　３／ＲおよびｐＳＶ２ｇｐｔ−ｒ　４／Ｒを 生ぜしメタ。
それら３種の線状プラスミドベクターの各々をｆ８３Ｒと連結せしめた。得られ たプラスミドのプラスミド地図は、Ｒ８３−ｒ　２が第３５図；Ｒ８３−γ３が 第３６図；およびＲ８３−γ４が第３７図に示されている。
１０種類の環状プラスミド構成物（Ｒ４９γ１−７．８；　Ｒ４９γ１−２．３ ；Ｒ８３γ１−７．８；　Ｒ８３γ１−２．３；　Ｒ４９−γ２；　Ｒ８３−ｒ ２：　Ｒ４９−γ３：ｐ８３−　ｒ　３；　Ｒ４９−ｒ　４；およびＲ８３−γ ４）を制限酵素消化■で消化することにより、形質転換のために線状化した。該 プラスミド中のＮｄｅ　１部位は、キメラ免疫グロブリン遺伝子または選択可能 マーカー遺伝子ｇｐｔの発現にとって重要でない領域中に存在する。該プラスミ ドは、受容細胞中への形質転換前に線状形にして宿主細胞のゲノムＤＮＡ中への 該ＤＮＡの選択的組込みを増加させる必要がある。
盪底ｌ■確乏 Ｅｃｏ　Ｒ１断片はどちらの方向においても連結され得るので、正しい方向をＮ ｅｏ　ＲＩでの消化により決定した。上述の構成物において、プラスミドに制限 酵素部位マツピングを行うことによりプラスミド構成物についての正しい連結が 確かめられる。制限酵素消化とゲル電気泳動から作成した制限酵素地図と、個々 の出発断片から理論上作成され得るものとが比較される。軽鎖ベクターにおける 転写方向に関する経験により、重鎮ベクターはｇｐｔ遺伝子と反対の転写方向に おいてのみ作製された。
ヱ立ス彫１膚胞ｌｌｌ沖Ｃ郵ワツ弓りＬ白凶しｌ（宜軽鎖および重鎖キメラ遺伝 子の両方を同一の細胞中に形質転換せしめると、四量体（Ｈ、Ｌ　、）免疫グロ ブリンが得られる。
それらの「キメラ」抗体タンパク質の合成および分泌は、キメラ（マウス■：ヒ トＣ領域）遺伝子をマウス形質細胞腫細胞（Ｓｐ２１０）中に導入することによ り行った。形質転換はエレクトロポレーション（Ｓａｈａｇａｎ、Ｂ、Ｇ、ら、 ムカυ凹」旦旺月狂。
１０６６　（１９８６）　）により達成された。
形質転換されたマウス形質細胞腫細胞（Ｓｐ２１０）中でのキメラ（マウス■： ヒトＣＡＭ域）遺伝子の発現は、２つの異なる方法を使って行われた。１つの方 法では、軽鎖対重鎮遺伝子を種々の比で一緒に導入することができる。これは同 時形質転換と呼ばれている。あるいは、キメラ軽鎖遺伝子を有する適当なりロー ンを得、続いて盗煎展ｉ転喚と呼ばれる第二の方法において使用することができ る。いずれの方法においても、目標は上述のような完全ＨｔＬｚ免疫グロブリン を産生ずる、Ｈ鎖遺伝子とＬ鎖遺伝子の両方を含むクローンを得ることである。
Ａ−上」Ｉｊ１１爽 同時形質転換は、２つの薬剤耐性マーカーを同時に用いた細胞の形質転換、次い で１または２つの薬剤での選択を含む。
重鎮および軽鎖ベクターの同時形質転換（それぞれ１：ｌおよびｉ：ｉｏの比で ）は、最初はｎｅｏ選択のみを使って行った。
明白なＴＡＧ７２結合活性を有する第一のキメラＩｇＧ　ｌ抗体を発現するｎｅ ｏ−耐性細胞を得た。Ｃｏｒｎａｌｉａ　Ｇｏｒｗａｎ、　ｒｌ乳類細胞中への 高効率の遺伝子トランスファーＪ　、ＤＮＡ　Ｃ旦吐■ＶｏｌＩＩ、Ｄ、Ｍ、Ｇ ｌｏｖｅｒ［、ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ、０ｘｆｏｒｄ、Ｅｎｇｌａｎｄ（１９８５ ）に記載されたプロトコールに従って同時形質転換を行った。
旦−監的五！転換 軽鎖および重鎖キメラ免疫グロブリン遺伝子を含む構成物を逐次的に使って、５ ｐ２１０マウス形質細胞腫細胞を形質転換せしめた。標的形質転換は、第一の薬 剤耐性遺伝子（即ち、キメラ軽鎖遺伝子ベクターについてはゲネチシン）を含む ベクターを用いた形質転換および選択、続いて第二の薬剤耐性遺伝子（即ち、キ メラ重鎖遺伝子ベクターについてはミコフェノール酸）を含むベクターを用いた 形質転換および選択を伴う。
勤ｊ」沢 キメラ軽鎖構成物を含むｐＳＶ２−ｎｅｏベクターを用いた形質転換の前に、形 質転換されていない５ｐ２１０形賞細胞腫細胞〔アメリカン・タイプ・カルチャ ー・コレクション（ＡＴＣＣ）から入手〕の増殖の抑制のための薬剤選択条件を 、ネオマイシン様薬剤ゲネチシン（ＧＩＢＣＯ）の滴定により確立させた。薬剤 選択に使われるゲネチシン濃度について発表された値は、１００−１０００ｘ／ ｄの範囲であった。４００ｇ／−以上の濃度が本発明者らの組織培養環境におい て５ｐ２１０細胞の増殖を防ぐことがわかった。
（列ｉ製 最初に次のようにして軽鎖含有ｐＳシ２−ｎｅｏベクターを用いて５ｐ２１０マ ウス形質細胞腫細胞を形質転換せしめた。５％ウシ胎児血清を有するＲＰＭ１１ ６４０培地中で細胞を増殖させた。細胞をＰＢＳ中で洗浄し、ｌＸｌ０’生存細 胞／ｄ　ＰＢＳの濃度に懸濁した。０．８ｄの細胞懸濁液を、２０〜の軽鎖含有 ｐｓＶ２−ｎｅｏベクター　（ＣＣ４９キメラし鎖ニツイテはｐＲＩ、１０５と ｐＲＬ１５０．　ソしてＣＣ８３キメラＬＭニツイテハｐＲＬ２０３とｐＲＬ、 ２３０）を含むエレクトロボレーシランキュベント（氷上）に移し、ＡａｔＩＩ 制限エンドヌクレアーゼで線状にした。試料を６５°Ｃで１Ｏ分間加熱すること によりＡａｔｌｌを不活性化した。線状化されたＤＩＩＩＡをエタノール沈澱さ せ、次いで１Ｏ−２０ｊ１１のＰＢＳ中に溶解した。氷上で１５分間後、キャパ シタンスエキステンダー（ＢｉｏＲａｄ）を追加してＧｅｎｅ　Ｐｕ１ｓｅｒエ レクトロポレーシヨン装置を使って０．２キロボルトおよび９６０μＦにおいて エレクトロポレーションを行った。時定数（τ）は通常的２６ｍ５ｅｃであった 。
形質転換後、乱れた膜の緩和を可能にするため氷上に１５分間置き細胞を再生さ せた。その後、５％ウシ胎児血清を含むＲＰＭ１１６４０培地（ＲＰＭＩ＋）２ ４ｄ中に細胞を懸濁し、そして９６または２４ウエルのプレートに移した。ウェ ルあたり１より多い薬剤耐性細胞の確率を減らすために、更に細胞を培地（ＲＰ Ｍｂ）で１０倍希釈し、そして別の９６ウエル（または２４ウエル）プレートに 入れた。細胞懸濁液を３７°Ｃおよび５％ｃｏ２雰囲気においてインキュベート した。
４８時間後（薬剤耐性の発現を考慮して）、培地を除去し、そして１■／ｄのゲ ネチシンを含む培地と交換した。
７−１０日後、ゲネチシン耐性クローンをサブクローニングし、そして細胞染色 によりキメラ軽鎖についてスクリーニングした。
豊目袋色 細胞のアリコートを、Ｃｙｔｏｓｐｉｎ−２遠心機（Ｓｈａｎｄｏｎ、　Ｉｎｃ ）を使ってスライドガラス上にペレット化した。風乾した後、細胞を酢酸／エタ ノール（酢酸５部／エタノール９５部）中で固定した。ＰＢＳ（Ｃａ”とＨｇｔ −を含まない）で３回すすいだ後、スライドを湿潤チャンバー（１００％ＲＨ） 中に置き、そして２ｏｊ１１のヤギ抗−ヒトに−ＦＩＴＣ１即ちヒトに軽鎖に特 異的である蛍光色素接合抗体で２０分間染色した。該接合抗体は、ＰＢＳ中１％ ＢＳＡで１：３希釈された。ＰＢＳで一晩洗浄した後、組織用固定培地であるＰ １ｕｏｒｏ＋５ｏｕｎｔ−Ｇでスライドをカバーガラス下に固定した。このスラ イドを、外部照明ＵＶ付属品を備えた０１ｙｗｐｕｓモデルＢＨ−２顕微鏡を用 いて観察した。
蛍光の強度に基づいて、ベクター中のｎｅｏ’遺伝子の転写方向とは反対の転写 方向において軽鎖の方向を有する構成物が最も高いＬ鎖発現を与えることがわか った。従って、ｐＲＬ１０５が好ましいＣＣ４９Ｌ鎖構放物であり、ｐＲＬ２３ ０が好ましいＣＣ８３Ｌ鎖構放物であった。それらの実験の結果として、次のよ うなキメラ軽鎖含有細胞系（Ｓｐ２１０由来）を標的形質転換に使用した。
ＣＣ４９キメラし鎖については、ＣＣ４９由来のキメラ軽鎖を発現する１つの細 胞系（４９に−１３〜１３）を得た。この細胞系を、キメラＣＣ４９軽鎖を使っ た構成物へのキメラ重鎖ベクターによる次なる標的形質転換に使った。
ＣＣ８３ギメラＬ鎖については、ＣＣ８３由来のキメラ軽鎖を発現する３つの細 胞系（８３に−２６−５，８３に−３４−１０および８３に−４２−２）を得た 。１つの細胞系（８３に−２６−５）は、他よりも強（染色され、そして細胞質 免疫強度の領域が局在化されていた。キメラＣＣ８３７１重鎖ベクターによる形 質転換後に高レベルのキメラ抗体を産生ずる相対能力について、３つの全ての細 胞系を比較した。キメラ抗体をより多く発現する細胞系は、他の２つのキメラ軽 鎖標的細胞系のいずれよりも８８Ｌ３４４０標的細胞系ノエレクトロポレーシヨ ンから誘導された。従って、８３に−３４、，１０軽鎖細胞系を、キメラ重鎖ベ クターでの次なるエレクトロポレーションのためのＣＣ８３軽鎖可変領域を含む 構成物の標的として使用した。
ＣＣ４９およびＣＣ８３キメ−！ｉＪ　　　　をＰ　している　ｔ　　りど二２ ゴｌｔ袈 キメラ重鎖構成物を含むｐＳＶ２−ｇｐｔベクターでの形質転換の前に、形質転 換されていない５ｐ２１０形質細胞腫細胞〔アメリカン・タイプ・カルチャー・ コレクション（ＡＴＣＣ）から入手〕の増殖の抑制のための薬剤選択を確立した 。ｐＳＶ２−ｇｐｔベクターにより形質転換された細胞の薬剤選択のための条件 は確立することが難しかった。グアノシンホスホリボシルトランスフェラーゼ酵 素をコードするＥ、コリｍ遺伝子は、哺乳類のグアニン代謝経路がミコフェノー ル酸（ＭＰＡ）により阻害される時、グアニンの生合成のための基質としてキサ ンチンおよびヒポキサンチンを利用する能力を付与する。
ｐＳＶ２−ｇｐｔベクターで形質転換された他のリンパ系細胞の増殖を考慮した ＭＰＡの濃度について発表された値は、はとんど２オーダーの大きさであり、本 発明者らの組織培養環境におけるｐＳＶ２−ｇｐｔベクターで形質転換された細 胞の増殖には高すぎる。その後、０．１ｔｔｇ／ｄのＭＰＡの濃度が、ｇｐｔ耐 性の選択に最適であることがわかった。加えて、アミノプテリンおよびチミジン の使用（グアニン経路を更に遮断するため）は不必要であることがわかった。
キメラ重鎖構成物の標的として４９に−１３−１３細胞を使った。
この細胞を、Ｎｄｅ　Ｉ消化により線状化された２０ｇのキメラ重鎖ＤＮＡベク ター（ｐ４９γ１−７．８またはｐ４９γ１−２．３）を用いて形質転換せしめ た。キメラ軽鎖について上述した通りにエレクトロポレーションにより形質転換 を行った。
しかしながら、４８時間後の選択は、ゲネチシン含有培地を、ゲネチシン並びに ０．３ｔａｒ／ｍｌミコフェノール酸、２５０ｇ／ｍキサンチンおよびＬｏｇ／ Ｉｄヒポキサンチンを含有する培地で置き換えることにより行った。
形質転換細胞は、１４日間のうちに肉眼で見ることができるコロニーに増殖した 。その時点で５０４の上清を取り出し、そしてＥＬＩＳＡ法によりＴＡＧへの結 合およびヒ）ＩｇＧ定常領域の発現についてアッセイした。陽性のＴＡＧ結合を 存する細胞を含むウェルを、新鮮な薬剤選択培地を使って２４ウエルに広げ、そ して３−７日間増殖させた。
サブクローニングは次のように行った。生存細胞数を決定し、そして細胞を２枚 の９６ウエルプレートに再び移した。一方のプレートは５０個の生存細胞を含み 、そして他方は２５０個の生存細胞を含んだ。再サブクローニングが必要である 場合には、液体窒素中での保存を考慮して細胞密度が十分となるまで６ウエルプ レートにサブクローン化してない細胞を広げた。
サブクローニング後、最も高いキメラ抗体産生を示すそれらのクローンを、バイ オリアクター中でのキメラ抗体産生のために選択した。
ＣＨ４４−２ キメラ重鎖ベクターとして２ＯＮのｐ４９−　ｒ　２を使用すること以外は、Ｃ Ｈ４４−１の作製において５ｐ２１０形賞細胞腫細胞を逐次的に形質転換せしめ るのに使った方法を繰り返した。
Ｃ）１４４−３ 重鎮ベクターとして２０河のｐ４９−　ｒ　３を使用すること以外は、ＣＨ４４ −１の作製において５ｐ２１０形賞細胞腫細胞を逐次的に形質転換せしめるのに 使った方法を繰り返した。
Ｈ４４−４ 重鎮ベクターとして２０Ｉｔｇのｐ４９−γ４を使用すること以外は、ＣＨ４４ −１の作製において５ｐ２１０形質細胞腫細胞を逐次的に形質転換せしめるのに 使った方法を繰り返した。
キメ−８８ノを　　　るクローンの　１ＣＨ４４−１の作製において５ｐ２１０ 形質細胞腫細胞を逐次的に形質転換せしめるのに使った方法を繰り返した。
ただし、キメラＣＣ８３重鎖遺伝子を含むｐＳＶ２ｇＰ　ｔベクターである２０ ■のｐ８３γ１−７．８またはｐ８３　ｒ　１−２．３を重鎮ベクターとして使 用すること以外は、ＣＨ４４−１の形質転換において記載されたようにして、Ｃ Ｃ８３軽鎖の産生が証明されている８３に＝２６−５．８３に−３４−１０およ び８３に−４２−２細胞を形質転換せしめた。
Ｈ８８−２ 重鎮ベクターとして２０眉のｐ８３−　ｒ　２を使用すること以外は、ＣＨ３８ −１の作製において５ｐ２１０形賞細胞腫細胞を逐次的に形質転換せしめるのに 使った方法を繰り返した。
Ｈ８８−３ 重鎮ベクターとして２０Ｉｒｇのｐ８３−　ｒ　３を使用すること以外は、ＣＨ ３８−１の作製において５ｐ２１０形質細胞腫細胞を逐次的に形質転換せしめる のに使った方法を繰り返した。
ＣＨ３８−４ 重鎮ベクターとして２ＯＮのｐ８３−　ｒ　４を使用すること以外は、ＣＨ３８ −１の作製において５ｐ２１０形質細胞腫細胞を逐次的に形質転換せしめるのに 使った方法を繰り返した。
キメ−８４するクローンの ＣＣ４９とＣＣ８３の重鎖可変領域間の高度な配列相同性のため、軽鎖と重鎮が 異なる親に由来するキメラ抗体を混合標的形質転換により作製した。２つの「混 合された」化合物を作製するだめに、ＣＣ４９およびＣＣ８３のキメラ重鎖γ１ イソタイプを、それぞれキメラ軽鎖標的８３に−３４−１０および４９に−１３ −３中にエレクトロポレーションした。生じた細胞系をＣＨ３Ｓ　−１およびＣ Ｈ４８−１と命名した。これは最初の２つの数字がそれぞれ親の重鎮と軽鎖を表 わしている。例えば、ＣＨ４８−１は、ＣＣ４９由来の重鎖とＣＣ８３由来の軽 鎖を有するＴＩイソタイプを表わす。
Ｃ）１４８−１複合抗体は、ＴＡＧ７２に結合しなかった。これは、真実のキメ ラ抗体を作ることができなかったためではない。
何故なら、はとんどの薬剤耐性細胞系がキメラＩｇＧを産生したからである（プ ローブとしてヤギ抗−ヒトＩｇＧ−アルカリホスファターゼによるヤギー抗ヒト Ｉｇ）ラップを使ったＥＬＩＳＡ分析により測定）。もし結合親和力が存在する としても、第一世代抗体８７２．３について観察されたものよりも有意に小さく 、ＴＡＧ７２に対する親和力がＣＣ４９やＣＣ８３よりもかなり小さいオーダー であった。
驚（べきことに、ＣＨ４８−１は、両親と同様の親和力でＴＡＧ７２に結合した 。この新規抗体は本発明者らの研究室において初めから作製され、そして天然に は未だ発見されていない。
競合実験を行ってこの新規混合抗体ＣＨ４８−１の特異性を決定した。ＣＣ４９ とＣＣ８３の両者はＴＡＧ７２抗原に対して幾らか競合的認識を示すことに注目 すべきである。ＣＨ４８−１は、ＴＡＧ７２への結合に対してＣＣ８３とよりも ＣＣ４９とより多く競合することがわかった。これはＴＡＧ７２への結合に対す る特異性が軽鎖中にあることを示すだろう。
ＣＨ３４−・１ 次のこと以外は、ＣＨ４４−１の作製において５ｐ２１０形質細胞腫細胞を逐次 的に形質転換せしめるのに使った方法を繰り返した。
ＣＨ４４重鎖遺伝子を含むｐｓＶＺｇｐｊ　ヘクターであるＲ４９　ｒ　１−２ ．３の代わりに、ＣＨ３３重鎖遺伝子を含むｐＳＶ２ｇｐｔベクターであるＲ８ ３　ｒ　１−２．３を２０鱈用いること以外は、ＣＨ４４−１（７）形質転換に おいて記載されたようにして、細胞染色によりＣＨ４４軽鎖の産生が証明されて いる４９に−１３−１３細胞を形質転換せしめた。
Ｃ）１８４−２ Ｒ８３ｒ　１−２．３の代わりに２０ｘｒのＲ８３ｒ−２を用いること以外は、 ＣＨ３４−１の作製において５ｐ２１０形賞細胞腫細胞を逐次的に形質転換せし めるのに使った方法を繰り返した。
ＨＢ４−３ ρ８３γ１−２．３の代わりに２ＯｎのＲ８３γ−３を用いること以外は、、　 ＣＨ３４−１の作製において５ｐ２１０形質細胞腫細胞を逐次的に形質転換せし めるのに使った方法を繰り返した。
Ｈ８４−４ Ｒ８３ｒ　Ｉ−２，３の代わりに２０４のＲ８３Ｔ−４を用いること以外は、Ｃ Ｈ３４−１の作製において５ｐ２１０形質細胞腫細胞を逐次的に形質転換せしめ るのに使った方法を繰り返した。
■遺えバ生ｑ権袈 キメラ抗体を発現している細胞を遠心によって培地から除去し、そして培地を０ ．２　ｎのフィルターを通して濾過した。
培養上清から２段階においてキメラ抗体を精製した。精製の第一段階において、 製造業者の指示に従ってプロティンＡアフィニティーカートリッジ（Ｎｙｇｅｎ ｅ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｙｏｎｋｅｒｓ＋ＮＹ）を使った。１．Ｏｆまで の培養上清を５ｍ／分の速度で１■容量カートリツジに通過させた。カートリッ ジをリン酸塩緩衝化塩溶液ＣＰＢＳ）で洗浄し、微量のアルブミンを除去した。
０．１Ｍ硝酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３，０）での溶出によりキメラ抗体を回収 した。キメラ抗体を含む画分のｐＨをＴｒｉｚｓａ塩基の１？’ｌ溶液により直 ちに中性に調整した。最後の精製は、この溶液のＡｍ１ｃｏｎ　ｃｅｎｔｒｆｃ ｏｎ　３０装置上での濃縮後、製造業者（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｐｔｓｃａｔａ ｗａｙ、ＮＪ）により明記されたようにしてＰｈａｒｍａｃｉａ　５ｕｐｅｒｏ ｓｅ　１２　ＨＲ１６１５０カラムを使ったゲル濾過により達成された。
ｍ：マウスＶαＴＡＧジ　−ムーインロ　１　　　　・グロブ１ンの 次の例は、当業者に、ＶＭαＴＡＧ由来のＤＮＡ配列によりコードされるｖＨ領 領域有する抗体を調製するための再現性のある方法を提供するために記載される 。
口　なＶαＴＡＧ　　霊゛　云　のためのマウスｖＭαＴＡＧジャームライン重 鎮可変領域、ｖＨαＴＡＧｖ、１と相補的である軽鎖可変領域、例えばＣＣ４９ またはＣＣ８３マウス軽鎖可変領域、およびヒト定常領域を含む、マウス−ヒト キメラ抗体分子を作製することができる。
ｖＨαＴＡＧＶＨエクソン配列を含む２．２ｋｂの…ｎｄＩＩＩジャームライン ＤＮＡ断片を鋳型として使い、機能的に再配列されたｖＭαＴＡＧ可変領域が得 られる。マウスゲノムＪ−Ｃμイントロン領域がマウス重鎖エンハンサ−配列の 入手源として使われる。後者の領域はプラスミドｐＮＰ９から得られる（　ｒＣ Ｃ４９重鎖可変領域の単離」における上記例を参照のこと）。第３８図は、Ｈｏ ｒ　ｔｏｎら（１９８９）、前掲の方法に基づくハイブリッド遺伝子の操作につ いての全体反応を示す。４種のオリゴヌクレオチド（オリゴ）は、標的ＤＮＡの 酵素的増幅および改変において使用するために設計されている。オリゴ１は、Ａ ＴＧ開始コドンの２４９ｂｐ５　’側にあるＥｃｏ　Ｒ１部位にがかるｖ８αＴ ＡＧの５′末端にアニールする。オリゴ２は、ｖＨαＴＡＧエクソンの３′末端 に相補的な配列にアニールし、そしてＤセグメントをコードしている配列も含む 。オリゴ２中のＤセグメント配列は、ｖＨαＴＡＧ配列と全くアニールしない。
オリゴ３は、マウスゲノムＪ−Ｃμ領域の５′末端に相補的な配列を含み、そし てＤセグメント（オリゴ２中のものと同じ）およびＪセグメントをコードしてい る配列を含む。オリゴ４は、ＪＣＢ領域の３′末端にアニールし、そしてＪＨ４ の１２１９ｂｐ　３’側にあるＥｃｏ　ＲＩ部位に相補的な配列を含む。それら オリゴの配列は次のようである： オリゴ１　　５’　ＧＴＣＴＡｆＡＩＩＴ’ｒＣ４７７４ＡＡＡＡＣＴＴＴＡＴ Ｇ　　　　（２５？　−”）オリゴ２　　ＣＡＧＴＧＴＡＴＴＴＣＴＧＴＡＡＡ ＡＧＡＴＣ’！’ＡＣＴ八↑鏝Ｔｉ’ＡＣ（ｒ（３５マー） オリゴ３　５’ＴＣＴへＣＴＡＴＧＧＴＴＡＣＩｌｔＴＧＧＧＧＴＣＡＡＧＧＡ ＡＣＣＴＣＡＧＴＣＡＣＣオリゴ４　５’ＡＣＴＴＣＴＡＡＡＡＴＧＴＡＴＴＴ Ａｆ、４ψシＴＴＴＴＣ３’この実施例では、Ｄ配列はＫｕｒｏｓａｗａおよび Ｔｏｎｅｇａｗａ。
ム匡り厘虹、　１５５　：　２０１　（１９８２）の発表された配列からとった ＳＰ２．３である。Ｄ配列は、オリゴ２と３の中に肉太活字体（ボールド）で示 されている。オリゴ２および３のそれらの位置においてそれらの配列を置きかえ ることにより、他のいずれかの特徴付けられたマウスまたはヒトＤセグメントを 使用することができる。
オリゴヌクレオチド３中のＪセグメントは下線が引かれている。それはＧｏｕｇ ｈおよびＢｅｒｎａｒｄ　、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａ　ｔ’　１　、　Ａｃａｄ、Ｓ ｃｉ。
（ＵＳＡ）、　７８：５０９（１９８１）の発表された配列からとったマウスＪ や４である。オリゴ３中のＪＩ４４配列の代わりに用いることにより、他のいず れかのマウスまたはヒトＪセグメントを含めることができる。
オリゴ１と４において、Ｅｃｏ　Ｒ１部位（ＧＡＡＴＴＣ）はイタリック体で示 されている。
主全星」狼６がし９稟戊 上述の成分を使って、２つの別個のＤＮＡ増幅反応を行った。
ＤＮＡ増幅反応Ｉ１１は、ｖＨαＴＡＧ配列をコピーしそしてその３′末端にＤ セグメントを付加する。ＤＮＡ増幅反応１１２は、重鎮エンハンサ−配列を含む マウスイントロン配列をコピーし、そしてオリゴ３内部にコードされたＤおよび Ｊセグメントを付加する０反応１および２からの増幅反応生成物をゲル精製し、 −緒にし、そしてオリゴ１および４を添加して反応＃３を開始する。反応３では 、反応１および２の生成物がそれらの共通のＤ配列の向こう側にアニールする。
オリゴ１と４からの次なるＤＮＡ増幅は、第３８図の最下部に示される生成物を もたらす。この断片をＢｃｏ　Ｒ１で消化しそしてゲル精製する。改変されたＶ ＭαＴＡＧ断片を、上記例の「重鎖キメラ構成物」のところで述べたようにして ｐｓＶ２ｇｐｔγ１（２゜３）のＥｃｏ　ＲＩ部位中に連結する。完全ｖＨαＴ ＡＧ−Ｄ−Ｊ−エンハンサ−含有断片を完全に配列決定し、ＤＮＡ増幅反応中に 全く変異が導入されなかったことを確かめる。同じ改変ｖＨαＴＡＧ断片を他の ３種のＴ含有ｐｓＶ２ｇｐｔへ’）　ター　（ｐＳＶ２ｇｐｔ−ｒ　２：ｐＳＶ ２ｇｐｔ−ｒ　３：ｐＳＶ２ｇｐｔ−ｒ　４）中に連結せしめることにより、他 の３種の重鎖Ｔイソタイプを作製することができる。
・ｖｏｃｒＴＡＧ゛云の 改変ＶイαＴＡＧ遺伝子を含むプラスミドをＮｄｅ　Ｉで線状化し、そしてエレ クトロポレーションによりキメラＣＣ４９またはＣＣ８３軽鎖発現細胞系中に導 入することができる（上記例のｒＣ９標的形質転換」を参照のこと）。形質転換 細胞を、「Ｃ０標的形質転換」において概説したようにしてゲネチシンおよびミ コフェノール酸の存在下での増殖について選択する。発現抗体の存在はＴＡＧ７ ２　ＥＬＩＳＡによりモニターする〔結果の部のエンザイムーリンクドイムノア ッセイ（ＥＬＩＳＡ）を参照のこと〕。
それらの細胞からの発現抗体は、ヒトＩｇ　ｒ　１．に定常領域と、ＣＣ４９ま たはＣＣ８３軽鎖可変領域および改変ｖＨαＴＡＧジャームラインｖ８エクソン からの重鎮可変領域を含むだろう。
種々のＤおよびＪセグメントを有する改変ν８α↑ＡＧ重鎖可変顯域の４つの例 を下記に示す。
−Ｖ−ｔｌ”／７上　Ｄセグ、７１７上　ＪセグメントＶ、αＴＡＧ　Ｉｉ　　 　　？ウスＤ（ＳＰ２．３）　　　？ウスＪＶＨαＴＡＧ　１ｔｉｉ　　　ヒト 　Ｄ（Ｄｉ）　　　　マウス　ＪＶｇ（ｒＴＡＧ　＃ｉｉｉ　　　？ウスＤ（Ｓ Ｐ２．３）　　　ヒト　　ＪＶＨαＴＡＧ　　１ｔｉｖ　　　　　ヒ　ト　　　 Ｄ（Ｄ　　１）　　　　　　　ヒ　ト　　　　ＪヒトＤ配列ＤＩの配列は、５ｉ ｅｂｅｎｌｉｓｔら、Ｎａｔｕｒｅ、２９４：６３１（１９８１）から得られる 。ヒトＪ、ｌの配列は、Ｒａｖｅｔｃｈ　ら、如旦２７，５８３（１９８１）か ら得られる。
ｖ、ｌαＴＡＧ　Ｉｉの作製ば、上記に示されたオリゴ１〜オリゴ４により説明 される。ｖ１４αＴＡＧ　ｔｔｉｉ−ｉｖを作製するためには、対応するＤおよ びＪセグメントをオリゴ２および３において変更する必要がある。次のオリゴは それらの変化を描写する。
反応＃１と反応＃２におけるそれらのオリゴの置換がｖＨαＴＡＧ　１ｌｉｉ〜 ｉνの生成をもたらすだろう。
Ｖ）、αＴＡＧ　１ｌｉｉ オリゴ２　　５’　ＣＡＧＴＧＴＡＴＴＴＣＴＧＴＡＡＡＡＧＡＧＴＡＣＴＧＧ ＴＧＧＴ（３４マー）ＴＡＴ ＣＴＣＣＡＧＧＴＣＴ　３’ 」幻ｒＴＡＧ　ｌ１ｉｉ オリゴ２　　５’　ＣＡＧＴＧＴＡＴＴＴＣＴＧＴＡＡＡＡＧＡＴＣＴＡＣＴＡ ＴＧＧ　（３５マー）ＴＡＣＧ オリゴ３　　５’　ＴＣＴＡＣＴＡＴＧＧＴＴＡＣＧＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＣ ＡＣ（７２７−）ＣＣＴＧＧＴＣＡ　ＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡ　ＧＧＴＡ　Ａ　 ＧＡＡＴＧＧ　ＣＣＴＣＴＣＣＡＧＧＴＣＴ３′ Ｖ、、αＴＡＧ　　ｔｉｖ オＩ）ｆ２　　５’ＣＡＧＴＧＴＡＴＴＴＣＴＧＴＡＡＡＡＧＡＧＴＡＣＴＧＧ ＴＧ　　（３５７−）ＴＧＴＡＴ オリゴ３　　５’　ＧＴＡＣＴＧＧＴＧＧＴＧＴＡＴＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＣ ＡＣ（７２７−）ＣＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡＧＧＴＡＡＧＡＡＴ ＧＧＣＣＴＣＴＣＣＡＧＧＴＣＴ　３’ 重鎮と軽鎖の同時検出は次のプローブ抗体を使って達成された： １）　蛍光染料ＦＩＴＣで標識されたヤギ抗−ヒトに；および２）　蛍光染料Ｔ ＲＩＴＣで標識されたヤギ抗−ヒ）ＩｇＧ。
重鎮および軽鎖の両方について陽性応答を有する細胞系を、集成されたキメラ免 疫グロブリンの産生および生物活性、即ちＴＡＧ７２への結合について更にテス トした。
エンザイムーリングドイムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ）キメラモノクローナル抗体 を産生ずる形質転換細胞を選択するために、ＥＬＩＳＡ法を使用した。重鎮およ び軽鎖薬剤選択構成物を含むクローンを、選択培地中でのそれらの増殖により選 択した。次の細胞系をテストした：　（１）　ＣＨ４４−１：　ＣＣ４９ＶＮ。
ＣＣ４９ＶＬおよびＩｇＧ＋（７）定常領域を有する細胞系ｉ　（２）　ＣＨ４ ４−２：ＣＣ４９Ｖ、４．ＣＣ４９ｖ、およびＩｇＧ、の定常領域を有する細胞 系；（３）　ＣＨ４４−４：　ＣＣ４９Ｖｎ　、ＣＣ４９Ｖｔおよび１ｇＧ４の 定常領域を有する細胞系；　（４）　ＣＨ３８−１：　ＣＣ８３ＶＭ　、ＣＣ８ ３ＶｔおよびＩｇＧ１の定常領域を有する細胞系；　（５）ＣＨ８８−２：　Ｃ Ｃ８３ＶＨ、ＣＣ８３Ｖｔおよび１ｇＧ２の定常領域を有する細胞系；　（６） ＣＩ（８８−３：　ＣＣ８３Ｖ、。
ＣＣ８３Ｖ　Ｌおよびｒｇｃ、の定常領域を有する細胞系ｉ　（７）ＣＨ３Ｓ− ４：ＣＣ８３Ｖ）ｌ　、ＣＣ８３ＶＬおよびＩｇＧ、の定常領域を有する細胞系 ：（８）　Ｃｌ１８４−にＣＣ８３Ｖ　ｓ　、　ＣＣ４９Ｖ　ＬおよびＩｇＧ＋ の定常領域を有する細胞系ｉ　（９）　ＣＨ３４−２：　ＣＣ８３Ｖ□、ＣＣ４ ９Ｖ、およびＩｇＧ、の定常領域を有する細胞系、　（１０）Ｃ）１８４−３　 ：　ＣＣ８３ＶＨ、ＣＣ４９ｖ、−およびＩｇＧ３の定常領域を存する細胞系； および（１１）ＣＨ８４−４：ＣＣ８３Ｖ　１１　、　ＣＣ４９Ｖ　ｔおよび１ ｇＧ４の定常領域を有する細胞系。
それらの培養液の上清をＥＬＩＳＡにかけた。抗原（ＴＡＧ７２）でコーティン グされたミクロタイターウェルにキメラ抗−ＴＡＧ７２を結合させた後、アルカ リホスファターゼのような酵素で標識された過剰のヤギ抗−ヒトＩｇＧ抗体の反 応により、キメラ抗−ＴＡＧ７２抗体の存在を直接測定した。好結果の組換えの 基準として抗−ＴＡＧ７２活性を測定した。
１４日間の増殖後、サブクローニングされた細胞のウェルから５０ＩＬｌの上清 を取り出し、そしてＥＬＩＳＡによりＴＡＧ結合について再びアッセイした。薬 剤耐性細胞系からの上滑の試料（５０ｍ）を、予めＴＡＧ抗原（１１５０希釈） でコーティングされているＮｕｎｃ　Ｉ＋ａｍｕｌｏｎ　９６ウエルプレートの ウェルに通用した。
洗浄により未結合物質を除去した後、該プレート上に固定されたＴＡＧ抗原に結 合したキメラ抗体のヒト定常領域を検出するためのプローブとして、アルカリホ スファターゼと接合したヤギ抗−ヒ）ＩｇＧ抗体（ＧＡＨＩｇＧ−ＡＰ）を用い て、該ウェルをインキュベートし、次いで色素産生アルカリホスファターゼ基質 の添加により、ヒト定常領域に関係するＴＡＧ結合（即ち、キメラ抗−ＴＡＧ７ ２抗体）を有するそれらのウェルにおいて色を生成させた。４０５ｎｍでの吸光 度の読みは、薬剤耐性細胞系により産生されるキメラ抗体の相対量を示す。
ＣＨ４４−１ 好結果の組換えの基準として抗−ＴＡＧ７２活性を使った。精製ＴＡＧ７２　（ Ｍｕｒａｒｏ、Ｒ，ら、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　４８＋４５８８−４ ５９６（１９８Ｂ）　）の１ニア５希釈液５０ハを室温で１８時間インキュベー トすることにより、ミクロタイタープレートのウェルをＴＡＧでコーティングし た。次いでウェルをリン酸塩緩衝化塩溶液（ＰＢＳ）　テ４回洗浄し、そしテＰ ＢＳ中（７）０．５％ＢＳＡ　５０ｍを３７℃で２時間インキュベートすること によりブロックし、次いでＰＢＳで４回洗浄した。それらのプレートは、４　” Ｃにて湿らせておけば安定である。次に５０４の試料を各ウェルに適用する。
新鮮な培地を含むブランクを対照として用いる。プレート中の全ての試料を３７ °Ｃで９０分間または４°Ｃにて一晩のいずれかで密閉容器中でインキュベート した。
次に、プレートをＰＢＳで４回洗浄し、そしてヤギ抗ヒトＩｇＧ−アルカリホス ファターゼ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈ　Ａｓ５ｏｃ、）を、１：２５ ０希釈液５０ｕを添加することにより各ウェルに適用した。
この溶液を３７°Ｃで９０分間インキュベー）−した。ＰＢＳで４回プレートを 洗浄し、該プローブを除去した後、色の生成をモニターした。
色の生成のため、エタノールアミン緩衝化塩溶液中のｐ　−ニトロフェニルホス フェート（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ　＆　Ｐｅｒｒｙ）基質溶液２００　ｄにおい て基質を室温で６分間インキュベートした。
Ｄｙｎａｔｅｃｈミクロプレートリーダー（Ｄｙｎａｔｅｃｈ　Ｉｎｃ、）によ り各ウェルの４５０ｎｍでの光学濃度を読み取った。
ＴＡＧ７２結合キメラ抗体活性を有する上清を含むウェル中のＳρ２１０コロニ ーを、限界希釈によりサブクローニングした。
比較的高いキメラ抗体産生に基づいて個々のサブクローニングを選択した。
Ｈ４４−２ 前記抗体がＣＨ４４−２であること以外は、Ｃ）１４４−１で使ったＴＡＧ−Ｅ ＬＩＳＡ法を繰り返した。
ＣＨ４４−３ 前記抗体がＣＨ４４−３であること以外は、ＣＨ４４−１で使ったＴＡＧ−ＥＬ ＩＳＡ法を繰り返した。
Ｈ４４−４ 前記抗体がＣＨ４４−４であること以外は、ＣＨ４４−１で使ったＴＡＧ−ＥＬ ＩＳＡ法を繰り返した。
ＣＨ３Ｓ−１ 前記抗体がＣＨ３Ｓ−１であること以外は、ＣＨ４４−１で使ったＴＡＧ−ＥＬ ＩＳＡ法を繰り返した。
Ｈ８８−２ 前記抗体がＣＨ３８−２であること以外は、ＣＩ（４４−１で使ったＴＡＧ−Ｅ ＬＩＳＡ法を繰り返した。
Ｈ８８−３ 前記抗体がＣＨ３８−３であること以外は、ＣＨ４４−１で使ったＴＡＧ−ＥＬ ＩＳＡ法を繰り返した。
Ｃ）１８８−４ 前記抗体がＣ）１８８−４であること以外は、ＣＨ４４−１で使ったＴＡＧ−Ｅ ＬＩＳＡ法を繰り返した。
ＣＨ３４−１ 前記抗体がＣＨ３４−１であること以外は、ＣＨ４４−１で使ったＴＡＧ−ＥＬ ＩＳＡ法を繰り返した。
Ｈ８４−２ 前記抗体がＣＨ８４−２であること以外は、ＣＨ４４−１で使ったＴＡＧ−ＥＬ ＩＳＡ法を繰り返した。
Ｈ８４−３ 前記抗体がＣＨ３４−３であること以外は、ＣＨ４４−１で使ったＴＡＧ−ＥＬ ＩＳＡ法を繰り返した。
Ｈ８４−４ 前記抗体がＣＨ３４−４であること以外は、ＣＨ４４−１で使ったＴＡＧ−ＥＬ ＩＳＡ法を繰り返した。
Ｃ）１４Ｂ−１ 前記抗体がＣＨ４８−１であること以外は、ＣＨ４４−１で使ったＴＡＧ−ＥＬ ＩＳＡ法を繰り返した。
Ｂ　　　　　（ｉｎ　ｖｉｖｏ　　ガン　　−一・−ング動物実験において使用 されそして下記第１−４表に示されるキメラモノクローナル抗体を、Ｉｏｄｏｇ ｅｎ（Ｐｉｅｒｃｅ　ＣｈｅｍｉｃａｌＲｏｃｋｆｏｒｄ、　ＩＬ）を使ってＨ ａ＋ｔＳ１で標識した。より詳しくは、約０．５−２■の精製キメラモノクロー ナル抗体を約０．５　ｄの０．１Ｍ　リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７，２）に 調整し、そして５０ｔｒｇのＩｏｄｏｇｅｎでコーティングされた１２Ｃ！ｌｌ Ｘ７５−のガラス管に添加し、次いでＯ，ｌ　−０，５ｉＣｉのＮａ”’Ｉ（Ｎ ｅｗ　ＥｎｇｌａｎｄＮｕｃｌｅａｒ＋Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）を添加した。室温 での２分間のインキュベーション後、取込まれなかった＋ｚ５）を、緩衝液とし てＰＢＳを使って１０−カラム５ｅｐｈａｄｅｘ”Ｇ−２５を通すゲル濾過によ り抗体から分離させた。このヨウ素化プロトコールは、０．０５〜０．２μＣｉ 　／　ｔｒｇの比活性を有する標ｆｉ　ＩｇＧキメラ抗体をもたらした。
ＣＤ　Ｉバンクグラウンドにおける雌の無胸腺マウス（ｎｕ／ｎｕ）を約４週齢 においてＣｈａｒｌｅｓ　Ｒｉｖｅｒから入手した。９日後、マウスにＬＳ１７ ４Ｔ細胞（ＩＸＩＯ’細胞／動物）を皮下接種（０，１ｄ／マウス）した。
重さ７０〜４００■のガン腫を有する無胸腺マウスに、前記細胞の接種の約１２ 〜１３日後に、ＰＢＳ中の０．５〜２．０μＣ３（１０〜５０汀タンパク質）の 上述のようにしてヨウ素化されたキメラモノクローナル抗体を静注した。５匹ず つのマウスのグループを種々の時点で瀉血により犠牲にし、ガン腫および正常組 織を切除しそして重さを量り、ガンマカウンター中でｃｐｏｉを測定した。各組 織中のｃｐｍ／■を決定し、そしてガン腫中に認められるものと比較した。
ＣＨ４４−１についての結果は第１〜２表並びに第３９Ａ　、　３９Ｂおよび３ ９Ｃ図に示される。ＣＨ３４−１についての結果は第３〜４表並びに第４０Ａお よび４０Ｂ図に示される。
１２５■−゛　　　のダラム当　の注　　　％第１表 第１表に示されるように、注入後約１２２時間口に、ＣＨ４４−１についての腫 瘍への注入線量％は４４．１６％であった。従って、Ｃ）１４４−１はヒト腫瘍 を原位置でターゲットするのに効果的であった。これは、本発明のキメラモノク ローナル抗体が生体内ガン腫ターゲツティングに効果的であり、従ってガンの生 体内治療に有用であることを証明する。
Ｉ２５Ｉ−へ　　の　　　当　　のン゛　　　　　％第２表 第２表に示されるように、注入後約１２２時間口に、ＣＨ４４−１についての腫 瘍への注入線量％は４．５％であった。従って、Ｃ）１４４−１はヒト腫瘍を原 位置でターゲットするのに効果的であった。これは、本発明のキメラモノクロー ナル抗体が生体内ガン腫ターテンティングに効果的であ一す、従ってガンの生体 内治療にを用であることを証明する。
１２ｓ■”り−ム当ノ”７へｌ」量」ｆ第３表 第３表に示されるように、注入後的１１８時間口に、ＣＨ３４−１についての腫 瘍への注入線量％は３０．２７％であった。従って、Ｃ１（８４−１はヒト腫瘍 を原位置でターゲットするのに効果的であった。これは、本発明のキメラモノク ローナル抗体が生体内ガン腫ターゲツティングに効果的であり、従ってガンの生 体内治療に有用であることを証明する。
兄ユニ（竜且屏の　　当　の０ 第４表 第４表に示されるように、注入後約１１８時間口に、ＣＨ３４−１についての腫 瘍への注入線量％は７．０２％であった。従って、ＣＨ３４−１はヒト腫瘍を原 位置でターゲットするのに効果的であった。これは、本発明のキメラモノクロー ナル抗体が生体内ガン腫ターゲツティングに効果的であり、従ってガンの生体内 治療にを用であることを証明する。
キメ−を　　する　胞二の　托 上記実施例により作製された、全てに軽鎖を有するキメラ抗体を分泌する１１種 の実例となる細胞系は、１９８８年１０月１９日アメリカン・タイプ・カルチャ ー・コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託された。詳しくは、次の細胞系が寄託され た：（１）　ＣＨ４４−１：ＣＣ４９Ｖ　Ｈ、ＣＣ４９Ｖ　ｔおよびＩｇＧ　Ｈ の定常領域を有する細胞系（ＡＴＣＣＮｏ、ＨＢ９８８４）；（２）　ＣＨ４４ −２：　ＣＣ４９Ｖｎ　、ＣＣ４９ＶＬおよびＩｇＧｚの定常領域を有する細胞 系（ＡＴＣＣＮαＨＢ９８８０）；（３）　Ｃ）１４４−４：ｃｃ４９　Ｖｌｌ 　、ＣＣ４９ＶＬおよびＩｇＧ、（７）定常’ｐＪ［ｊを有する細胞系（ＡＴＣ Ｃｋｇ８８７）；（４）　ＣＨ３８−１：　ＣＣ８３Ｖ、ｌ　、ＣＣ８３ｖ、お よびＩｇＧ。
の定常領域を有する細胞系（ＡＴＣＣＮα９８８２）　；　（５）　ＣＨ２Ｏ− ２：　ＣＣ８３ＶＨ、ＣＣ８３ＶｔおよびＩｇＧ、（７）定常領域を有する細胞 系（ＡＴＣＣＮｌ１９８８１）　；　（６）　ＣＨ２Ｏ−３：　ＣＣ８３Ｖイ、 　ＣＣ８３Ｖ　ＬおよびＩｇＧ、の定常領域を有する細胞系（ＡＴＣＣｋｇ８７ ６）；（７）　ＣＨ３８−４：　ＣＣ８３Ｖ、　。
ＣＣ８３ＶＬおよび１ｇＧ４の定常領域を有する細胞系（ＡＴＣＣｋｇ８７４） ；（８）　ＣＨ３４−１：　ＣＣ８３Ｖ翼、　ＣＣ４９Ｖ　Ｌおよびｒｇｃ、の 定常領域を有スル細胞系（ＡＴＣＣｋｇ８８３）：（９）　ＣＨ３４−２：　Ｃ Ｃ８３ｖ、　、ＣＣ４９ＶＬおよびＩｇＧｚの定常領域を有する細胞系（ＡＴＣ ＣＮα９８７９）　；　（１０）Ｃ）１８４−３　：　ＣＣ８３ＶＭ　、ＣＣ４ ９ｖｔおよびＩｇＧｚの定常領域を有する細胞系（ＡＴＣＣ随９８７８）　；お よび（１１）ＣＨ８４−４：　ＣＣ８３Ｌｌ　、ＣＣ４９ｖＬおよびＩｇＧｎノ 定常領域を有する細胞系（ＡＴＣＣｋｇ８７５）　。
寄託された態様物は本発明の１つの観点の単なる例示であるので本発明は寄託さ れた細胞系により範囲を限定されるものではなく、そして機能的に等価である全 ての細胞系が本発明の範囲内に含まれる。実際、本発明をその特定の態様に関し て詳細に記載してきたが、添付された請求の範囲の精神および範囲から逸脱する ことなく、様々な変更および改良を行い得ることは当業者にとって明らかであろ う。
浄書（内容に変更なし） Ｆｉｇｕｒｅ　１ −〇〇〇〇 、＋−門一のへい門−ロトーｎ−■ト マ■マφＭ　ｃｏｆ１’５０門さ〜ｌ’％　ＩＮ　１％　−ＬＯｆ−Ｐｆ’４１ Ｎ閂閂ママ硝−−１トド渋す１臼１ごミ己ゑ■口Ｈ１剛目 ｌジ１畦ミｇ　ｉ：０ロ’３５　ｆｉｌ葺１ミた目長じ眠Ｉ ＝＝１己さＪ円Ｊ＝ ”　”　−ｆ　ＩＮ　ＩＮ　Ｉ’ｌ’ｌ　Ｉ’ｌ’＋　？　？　ｕ’ｌ　Ｌｌ’ ｌ　Ｊ　ｔ。
受量１・巳ロー団目目Ｉ旨１目１葺目 ■１０ミ甚１嚢１膨ｌｊ國：ｍｌ　ｉｇ！　ｈ＼−ｇＫ−〇 〇〉（り■Ｆ−４− マウス１ｇカッパジャームラインＪ−Ｃ９ｌ域Ｊｌ−Ｊ５ＦＩＧ、７ Ｆｉｇｕｒｅ　９ ε ｐＮＰ９からのマウスＩｇジャームラインＪ−Ｈ遺伝子Ｆｉｇｕｒｅ　１４ １マ〜ロー１７ｎ−ロトー門−■ゝ１ Ｎｌ’ｌ’ｌ　ＩＰ＋ママ■硝（のトドの。［Ｆ］ロ９８目■ロ耳己ＩＩ民５３ ＋　ｆｆ１ｉ　ｇｌグ１ジ１ざジ騨５ｉＺｉ５Ｗ関Ｅｍｇ３１！ｊ國額丈いｎ＋ ０１％　Ｌ／’ｌ　ｍへＯωロクロい■マい硝ω１トド叩田■の８三＝＝二＝ 詠’ｆｆｌ　Ｅ：：３Ｗｊ’２１■ミ１ソ１ど１シト１げ■繭３　％　ｅ量１■ ミミ１葺１３１ｉ１Ｄｌざジ騨■１冒９９１３ヨＥ’３ゴ１９ 年已七言ａ臣ヨま ←−ロＬ　（Ｐ＋−（ ごコｃｅ　Ｚ　２フズフα ニーＷいい１．ｕ１騙− ←ｏＩ／Ｉ＜＜−ψ−Ｖ ば５ゴミ七￥ミ巴巴 〉〈くＯリドくぃψ ＣＩ：ｃＬ＋”　”　Ｏ（二（：）　ｗｗ　ｌ／’　＞　）−に−１．ＩＪ工く −＜−−へ＜−＜〉 巳巳ロギ已ロミ手手 ←Ｉ／Ｉす〉い−ク←ト １１１■引 呂■同弓邑叫ｌ壬 ざココ岳１−１袈兎 裂Ｓ　ｔＡ　／　Ｑコ引目ゴ 奪ε’４　’ａ　Ｅ百１目呂 ド ア２　　３４５６７８ Ｆｌｑ、２０ ヒト重鎮定常領域 ＦＩＧ、２１ ＦＩＧ、２３ ＦＩＧ、２４ ＦＩＧ、２５ ＦＩＧ、２６ Ｆ　Ｉ　Ｇ　、　２７ ＦＩＧ、２Ｂ ＦＩＧ、２９ ＦＩＧ、３０ ＦＩＧ、３１ ＦＩＧ、３２ ＦＩＧ、３３ ＦＩＧ、３４ ＦＩＧ、３５ ＦＩＧ、３６ ＦＩＧ、３７ ＦＩＧ、　３９ａ 時間 時間 ＦＩＧ、　３９ｃ １２５−Ｉ　Ｃ）１４４の生体分布 時間 ヨウ素化ＩｇＧの生体分布 時間 ＦＩＧ、４０ａ ヨウ素化１ｇＧの全身保持率 ＦＩＧ、４０ｂ 手続補正書（方式） ％式％ １、事件の表示 ＰＣＴ／ＵＳ８９１０４４０２ λ　発明の名称 ガン治療に用いられる新規高親和性改変抗体系統群 ３、補正をする者 事件との関係　　　特許出願人 名称　ザ　ダウ　ケミカル　カンパニー４、代理人 住所　〒１０５東京都港区虎ノ門−丁目８番１ｏ号静光虎ノ門ビル　電話３５０ ４−０７２１６、補正の対象 明細書及び請求の範囲の翻訳文 ７、補正の内容 明細書、請求の範囲の翻訳文の浄書 （内容に変更なし） ８、　添附書類の目録 明細書及び請求の範囲の翻訳文　　各１通手続補正書（方式） 平成３年ｑ月デ　日 特許庁長官　植　松　　　敏　殿 １、事件の表示 ＰＣＴ／ＵＳ　８９１０４４０２ ２、発明の名称 ガン治療に用いられる新規高親和性改変抗体系統群３、補正をする者 事件との関係　　　特許出願人 名称　ザ　ダウ　ケミカル　カンパニー４、代理人 住所　〒１０５東京都港区虎ノ門−丁目８番１０号６、補正の対象 図面の翻訳文 ７、補正の内容 図面の翻訳文の浄書（内容に変更なし）８、添付書類の目録 図面の翻訳文　　　　　　　　　　　１通国際調査報告 力合衆国、ミシガン　４８６４０．　　ミツドランド、オーチャードイブ　３７ １３ 力合衆国、ミシガン　４８６４０．　　ミツドランド、キャツスルブ４１１０

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １．重鎖を有する可変領域（ＶＨ）を含んで成る抗体または抗体断片であって、 前記ＶＨは、ＶＨαＴＡＧジャームライン遺伝子（ＶＨαＴＡＧ）と事実上相同 なＤＮＡ配列によりコードされ、ここで前記抗体とＢ７２．３の結合親和力を同 じ方法により測定した時、前記可変領域はＢ７２．３の可変領域がＴＡＧ７２に 結合するよりも少なくとも２５％大きい結合親和力でＴＡＧ６７２に結合するこ とを特徴とする抗体または抗体断片。 ２．前記ＶＨが、動物Ｄ遺伝子セグメントと動物Ｊ遺伝子セグメントにより更に コードされる、請求項１の抗体または抗体断片。 ３．前記重鎖Ｄ遺伝子セグメントがマウスおよびヒトＤ遺伝子セグメントから選 択された遺伝子によりコードされ、そして前記重鎖Ｊ遺伝子セグメントがマウス およびヒトＪ遺伝子セグメントから選択された遺伝子によりコードされる、請求 項２の抗体または抗体断片。 ４．前記可変領域が、動物Ｖ遺伝子セグメントによりコードされる軽鎖（ＶＬ） を更に有する、請求項１の抗体または抗体断片。 ５．前記ＶＬが更にＪ遺伝子セグメントによりコードされる、請求項４の抗体ま たは抗体断片。 ６．前記軽鎖Ｊセグメントが、マウスおよびヒトＪ遺伝子セグメントから選択さ れた遺伝子によりコードされる、請求項５の抗体または抗体断片。 ７．前記可変領域がＣＣ４６，ＣＣ４９，ＣＣ８３またはＣＣ９２の可変領域由 来である、請求項１の抗体または抗体断片。 ８．前記可変領域が、（１）ＶＨαＴＡＧ由来の遺伝子によりコードされる相補 性多様性領域（ＣＤＲ）、および（２）該ＣＤＲ領域に隣接したヒト遺伝子由来 のフレームワーク領域を含んで成る、請求項１の抗体または抗体断片。 ９．ヒト軽鎖（ＣＬ）およびヒト重鎖（ＣＨ）の少なくとも部分を有する定常領 域を更に含んで成る、請求項１の抗体または抗体断片。 １０．前記ＣＨがＩｇＧ１−４，ＩｇＭ，ＩｇＡ，ＩｇＤまたはＩｇＥである、 請求項９の抗体または抗体断片。 １１．前記ＣＬがカッパまたはラムダである、請求項９の抗体または抗体断片。 １２．ＣＨ４４−１，ＣＨ４４−２，ＣＨ４４−４，ＣＨ８８−１，ＣＨ８８− ２，ＣＨ８８−３，ＣＨ８８−４，ＣＨ８４−１，ＣＥ８−２，ＣＨ８４−３ま たはＣＨ８４−４からの細胞系により産生される、請求項１の抗体または抗体断 片。 １３．画像診断マーカーと接合された請求項１〜１２のいずれかの抗体または抗 体断片を含んで成る、抗体または抗体断片接合体。 １４．前記画像診断マーカーが１２５Ｉ，１３１Ｉ，１２３Ｉ，１１１Ｉｎ，１ ０５Ｒｈ，１５３Ｓｍ，６７Ｃｕ，６７Ｇａ，１６６Ｈｏ，１７７Ｌｕ，１８６ Ｒｅ，１８８Ｒｅまたは９９ｍＴｃである、請求項１３の抗体または抗体断片接 合体。 １５．治療薬と接合された請求項１〜１２のいずれかの抗体または抗体断片を含 んで成る、抗体または抗体断片接合体。 １６．前記治療薬が放射性核種、薬剤もしくは生体応答調節剤、毒素または他の 抗体である、請求項１５の抗体または抗体断片接合体。 １７．前記放射性核種が１３１Ｉ，９０Ｙ，１０５Ｒｈ，４７Ｓｃ，６７Ｃｕ； ２１２Ｂｉ，２１１ＡＴ，６７Ｇａ，１２５Ｉ，１８６Ｒｅ，１８８Ｒｅ，１７ ７Ｌｕ，９９ｍＴｃ；１５３Ｓｍ，１２３Ｉおよび１１１Ｉｎである、請求項１ ６の抗体または抗体断片接合体。 １８．前記薬剤もしくは生体応答調節剤がメトトレキセート、アドリアマイシン またはリンホカインである、請求項１６の抗体または抗体断片接合体。 １９．抗体重鎖の少なくとも部分をコードするＤＮＡ配列であって、 前記配列は、ＶＨαＴＡＧジャームライン遺伝子（ＶＨαＴＡＧ）と事実上相同 であるＤＮＡ配列セグメントを含んで成り、ここで前記ＤＮＡ配列セグメントが 重鎖可変領域（ＶＨ）の少なくとも部分をコードすることを特徴とする、前記Ｄ ＮＡ配列。 ２０．前記配列が、動物Ｄ遺伝子のＤＮＡ配列セグメントおよび動物Ｊ遺伝子の ＤＮＡ配列セグメントを更に含んで成る、請求項１９のＤＮＡ配列。 ２１．前記ＶＨをコードするＤＭ配列が、ＣＣ４６，ＣＣ４９，ＣＣ８３および ＣＣ９２のＶＨ領域をコードする配列由来である、請求項２０のＤＮＡ配列。 ２２．前記配列が、（１）ＶＨＴＡＧと事実上相同な遺伝子によりコードされる 少なくとも１つの相補性多様性領域（ＣＤＲ）および（２）該ＣＤＲ領域に隣接 したヒト遺伝子によりコードされるフレームワーク領域、を有するＶＨをコード する、請求項２０のＤＮＡ配列。 ２３．ヒト重鎖定常領域（ＣＨ）の少なくとも部分をコードする配列セグメント を更に含んで成る、請求項１９のＤＮＡ配列。 ２４．前記配列セグメントが、ＩｇＧ１−４，ＩｇＭ，ＩｇＡ，ＩｇＤまたはＩ ｇＥをコードしているＣＨ遺伝子の少なくとも部分をコードする、請求項２３の ＤＮＡ配列。 ２５．（Ａ）抗体または抗体断片の重鎖をコードする配列セグメントであって、 （１）ＶＨαＴＡＧジャームライン遺伝子（ＶＨαＴＡＧ）と事実上相同である 配列サブセグメントであって、ここで該ＤＮＡ配列セグメントがＶＨの少なくと も部分をコードし、および（２）ＣＨの少なくとも部分をコードする配列サブセ グメント、 を有する配列セグメント；並びに （Ｂ）抗体または抗体断片の軽鎖をコードする配列セグメントであって、 （１）動物軽鎖可変領域（ＶＬ）の少なくとも部分をコードする配列サブセグメ ント、および （２）ヒト軽鎖定常領域（ＣＬ）の少なくとも部分をコードする配列サブセグメ ント、 を有する配列セグメント；を含んで成るＤＮＡ配列であって、前記ＤＮＡ配列に よりコードされる抗体または抗体断片は、該抗体とＢ７２．３の結合親和力を同 じ方法により測定した時、Ｂ７２．３の可変領域がＴＡＧ７２に結合するよりも 少なくとも２５％大きい結合親和力でＴＡＧ７２に結合することを特徴とする、 前記ＤＮＡ配列　。 ２６．前記配列セグメントが、ＩｇＧ１−４，ＩｇＭ，ＩｇＡ，ＩｇＤまたはＩ ｇＥをコードしているＣＨ遺伝子の少なくとも部分をコードする、請求項２５の ＤＮＡ配列。 ２７．前記配列セグメントが、カッパまたはラムダをコードしているＣＬ遺伝子 の少なくとも部分をコードする、請求項２５のＤＮＡ配列。 ２８．請求項１９〜２７のいずれか一項のＤＮＡ配列を含む生物学的機能性発現 ビヒクル。 ２９．請求項２８の生物学的機能性発現ビヒクルにより形質転換された細胞。 ３０．ＣＨ４４−１，ＣＨ４４−２，ＣＨ４４−４，ＣＨ８８−１，ＣＨ８８− ２，ＣＨ８８−３，ＣＨ８８−４，ＣＨ８４−１，ＣＨ８４−２，ＣＨ８４−３ またはＣＨ８４−４の細胞の特徴を含んで成る、請求項２９の細胞。 ３１．医薬上許容される非毒性の無菌担体中に請求項１〜１２のいずれか一項の 抗体または抗体断片を含んで成る組成物。 ３２．医薬上許容される非毒性の無菌担体中に請求項１３〜１４のいずれか一項 の抗体または抗体断片接合体を含んで成る組成物。 ３３．医薬上許容される非毒性の無菌担体中に請求項１５〜１８のいずれか一項 の抗体または抗体断片接合体を含んで成る組成物。 ３４．ガンの生体内診断方法であって、ガン腫病巣の原位置における検出のため に医薬上有効量の請求項３１または３２の組成物を動物に投与することを含んで 成る方法。 ３５．ガンの生体内治療方法であって、医薬上有効量の請求項３１または３３の 組成物を動物に投与することを含んで成る方法。 ３６．前記動物がヒトである、請求項３４または３５に記載の方法。 ３７．手術内治療方法であって、 （ａ）医薬上有効量の請求項３１または３２の組成物を動物に投与し、それによ って腫瘍が局在定位され、そして（ｂ）局在定位された腫瘍を切除する、ことを 含んで成る方法。 ３８．抗体または抗体断片の調製方法であって、ＶＨαＴＡＧジャームライン遺 伝子（ＶＨαＴＡＧ）と事実上相同であるＤＮＡ配列によりコードされる、重鎖 を有する可変領域（ＶＨ）を、 動物Ｖ遺伝子セグメントおよび動物Ｊ遺伝子セグメントによりコードされる、軽 鎖を有する可変領域（ＶＬ）と接触せしめ、 抗体または抗体断片の可変領域を形成せしめることを含んで成り、 ここで前記可変領域は、前記抗体およびＢ７２．３の結合親和力を同じ方法によ り測定した時、Ｂ７２．３の可変領域がＴＡＧ７２に結合するよりも少なくとも ２５％大きい結合親和力でＴＡＧ７２に結合することを特徴とする方法。 ３９．前記可変領域ＶＨが、動物Ｄ遺伝子セグメントおよび動物Ｊ遺伝子セグメ ントによりコードされることを更に含んで成る、請求項３８の方法。 ４０．前記軽鎖Ｊセグメントが、マウスおよびヒトＪ遺伝子セグメントから選択 された遺伝子によりコードされる、請求項３９の方法。 ４１．前記重鎖Ｄ遺伝子セグメントがマウスおよびヒトＤ遺伝子セグメントから 選択された遺伝子によりコードされ、そして前記Ｊ遺伝子セグメントがマウスお よびヒトＪ遺伝子セグメントから選択された遺伝子によりコードされる、請求項 ３９の方法。 ４２．前記可変領域がＣＣ４６，ＣＣ４９，ＣＣ８３またはＣＣ９２の可変領域 由来である、請求項３８の方法。 ４３．前記可変領域が、（１）ＶＨαＴＡＧ由来の遺伝子によりコードされる相 補性多様性領域（ＣＤＲ）、および（２）該ＣＤＲ領域に隣接したヒト遺伝子由 来のフレームワーク領域を含んで成る、請求項３８の方法。 ４４．前記抗体または抗体断片が、ヒト軽鎖（ＣＬ）およびヒト重鎖（ＣＨ）の 少なくとも部分を有する定常領域を更に含んで成る、請求項３８の方法。 ４５．前記ＣＨがＩｇＧ１−４，ＩｇＭ，ＩｇＡ，ＩｇＤまたはＩｇＥである、 請求項４４の方法。 ４６．前記ＣＬがカッパまたはラムダである、請求項４４の方法。 ４７．前記抗体または抗体断片が、ＣＨ４４−１，ＣＨ４４−２，ＣＨ４４−４ ，ＣＨ８８−１，ＣＨ８８−２，ＣＨ８８−３，ＣＨ８８−４，ＣＨ８４−１， ＣＨ８４−２，ＣＨ８４−３またはＣＨ８−４からの細胞系により産生される、 請求項３８の方法。 ４８．抗体または抗体断片接合体の調製方法であって、請求項１〜１２のいずれ か一項において定義された抗体または抗体断片を、画像診断マーカーまたは治療 薬と接触せしめることを含んで成る方法。 ４９．前記画像診断マーカーが１２５Ｉ，１３１Ｉ，１２３Ｉ，１１１Ｉｎ，１ ０５Ｒｈ，１５３Ｓｍ，６７Ｃｕ，６７Ｇａ，１６６Ｈｏ，１７７Ｌｕ，１８６ Ｒｅ，１８８Ｒｅまたは９９ｍＴｃである、請求項４８の方法。 ５０．前記治療薬が放射性核種、薬剤もしくは生体応答調節剤、毒素または他の 抗体である、請求項４８の方法。 ５１．前記放射性核種が１３１Ｉ，９０Ｙ，１０５Ｒｈ，４７Ｓｃ，６７Ｃｕ， ２１２Ｂｉ，２１１Ａｔ，６７Ｇａ，１２５Ｉ，１８６Ｒｅ，１８８Ｒｅ，１７ ７Ｌｕ，９９ｍＴｃ，１５３Ｓｍ，１２３Ｉおよび１１１Ｉｎである、請求項５ ０の方法。 ５２．前記薬剤もしくは生体応答調節剤がメトトレキセート、アドリアマイシン またはリンホカインである、請求項５０の方法。 ５３．組換え発現ビヒクルの調製方法であって、ＶＨαＴＡＧジャームライン遺 伝子（ＶＨαＴＡＧ）と事実上相同でありそして重鎖可変領域（ＶＨ）の少なく とも部分をコードするＤＮＡ配列セグメントを含んで成るＤＮＡ配列を、発現ビ ヒクル中に挿入することを含んで成る方法。 ５４．前記ＶＨ配列が、動物Ｄ遺伝子セグメントのＤＮＡ配列セグメントおよび 動物Ｊ遺伝子セグメントのＤＮＡ配列セグメントを更に含んで成る、請求項５３ の方法。 ５５．前記ＶＨをコードするＤＮＡ配列が、ＣＣ４６，ＣＣ４９，ＣＣ８３およ びＣＣ９２のＶＨ領域をコードする配列由来である、請求項５４の方法。 ５６．ヒト重鎖定常領域（ＣＨ）の少なくとも部分をコードするＤＭ配列セグメ ントを更に含んで成る、請求項５３の方法。 ５７．前記ＤＮＡ配列セグメントがＩｇＧ１−４，ＩｇＭ，ＩｇＡ，ＩｇＤまた はＩｇＥをコードしているＣＨ遺伝子の少なくとも部分をコードする、請求項５ ６の方法。 ５８．約１０μｇの発現ビヒクルが１０μｌの緩衝液中で約１０μｇの前記ＤＮ Ａ配列セグメントおよび１０単位の酵素と接触される、請求項５３の方法。 ５９．３７℃〜６５℃の範囲の温度にて、７−９のｐＨで、１〜１８時間消化が 行われる、請求項５３の方法。 ６０．形質転換された宿主の調製方法であって、請求項２８において定義された 発現ビヒクルを、適当な宿主中に挿入することを含んで成る方法。 ６１．前記発現ビヒクルがプラスミドである、請求項６０の方法。 ６２．１０−３０μｇのプラスミドを１×１０７個までの宿主細胞の存在下で線 状化し、次いで宿主細胞を２００ボルトおよび９６０マイクロファラッドにおて いエレクトロポレーションすることを含んで成る、請求項６１の方法。
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