JP3833255B2 - タンパク質の精製方法 - Google Patents
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Description
銅キレート−アフィニティークロマトグラフィーはタンパク質の近接可能な電子供与基、例えばヒスチジンを銅イオンに結合させることでその機能を果たす。該銅イオンは固定化支持体に共有結合したキレート基が保持している。通常は近接可能なヒスチジンが一個存在すれば、銅(II)−IDA−キレート(IDA=イミノジアセテート)上にタンパク質を吸着せしめるのに十分である。銅キレート−アフィニティークロマトグラフィーにおけるタンパク質の保持力は、タンパク質上に張り出した該金属と相互作用し得る基の数と種類に依存する。この相互作用は種々の独立変数、例えば、pH、温度、溶媒種、塩種、塩濃度などにより影響を受ける。中性または低アルカリpH領域で銅キレートに結合しているタンパク質は、通常、pH低減グラジエント法(連続もしくは段階的)あるいはバッファー中の競合試薬、例えば、イミダゾールなどのルイス塩基を増濃するグラジエント法(連続もしくは段階的)により溶出される。代替法として可能な三番目の溶出法は、EDTAなどのキレート化剤を溶出液と共に用いる方法である。
しかしながらこれらの方法には幾つかの欠点がある。
・低選択性、すなわち、数種のタンパク質が同一条件下で溶出されること
・濃度が低いこと
・競合試薬またはキレート化剤を用いた場合、高濃度の銅(II)イオンがタンパク質と共に溶出されること
・溶出溶媒を除去するために更に精製工程を必要とすること
・選択性を高めるために、通常、連続グラジエント法を用いて所望のタンパク質を溶出しなければならないこと。
例えば、タンパク質を競合試薬またはキレート化剤を用いて溶出する場合、溶出液は当該タンパク質と共に競合試薬またはキレート化剤および遊離した銅(II)イオンを含んでいる。それ故、該競合試薬および銅(II)イオンを除去するために更に精製工程を経なければならないし、また、多くのタンパク質はその溶液中に高濃度の銅(II)イオン(酸化作用)が存在するとき、あるいはpH値が低い(沈殿生成)ときには不安定となり、不活性されてしまう。
本発明は、銅キレート複合体からタンパク質を溶出するための驚異的に有利な方法を提供する。本発明方法を使用すれば、驚くべきことに脱イオン水で所望のタンパク質を溶出することが可能となる。該脱イオン水は要すれば該タンパク質の安定化剤を含有していてもよい。脱イオン水の使用には既存技術にはない幾つもの利点がある。
・競合試薬あるいはキレート化剤を使用しないので、余分の精製工程が不要である
・酸化の問題を惹き起こすことのある高濃度の銅(II)イオンを所望タンパク質と一緒に溶出することもない
・沈殿あるいは不活化の問題を惹き起こすことのある低pH値では所望のタンパク質を溶出しない
・所望のタンパク質を特に高い純度と高い収率で回収できる
・溶出は(連続または段階的)グラジエント法を適用する代わりにワンステップで実施することができる
・溶出したタンパク質は更に処理することなく保存することができる。
発明の詳細な説明
本発明は以下の工程a)、b)およびc)からなるタンパク質の高濃度化方法に関する:
a)未精製または予め精製したタンパク質を固定化銅(II)イオンに吸着させる工程
b)吸着したタンパク質をルイス塩基溶液で洗浄する工程、および
c)所望のタンパク質を脱イオン水で溶出する工程。
通常、銅(II)イオンは、固定化支持体、例えばシリカまたはポリマーマトリックスなどの無機担体に固定化する。
固定化支持体は銅(II)イオンとキレートを形成し得るものであることが必要である。そのような固定化支持体の例としては、キレート化基としてイミド酢酸(IDA)、N,N,N'−トリス(カルボキシメチル)−エチレンジアミン(TED)、カルボキシメチル化アスパラギン酸(CM−ASP)、テトラエチレン・ペンタミン(TEPA)ニトリロ酢酸(NTA)またはカルボキシメチル化α、βジアミノこはく酸(CM−DASA)などが該固定化支持体に共有結合したものが挙げられる。キレート化基は固定化支持体に直接結合していてもよいし、スペーサーを介して結合していてもよい。該ポリマー担体は金属イオン−アフィニティクロマトグラフィーに通常使用されるポリマー化合物であればどのようなものでもよい。そのようなポリマー物質を例示すれば、アガロース、デキストランあるいは他の合成ポリマーが例示できる;好ましくは、アガロースおよびビニルポリマー類である。固定化支持体にキレート化基が共有結合したものの製造方法は、例えば、ホチュリー(Hochuli)、CHIMIA(1986)、40、408−412に記載されている(参照:フィゲロア(Figueroa)ら、J.Chromatography(クロマトグラフィー)(1986)、371、335−352;ポラス(Porath)、タンパク質発現と精製(Protein expressionand purification)(1992)、3、263−281;エル・カゲダル(L.Kagedal)、タンパク質精製、原則、高分解法および応用、ジャンソン(Janson)およびライデン(Ryden)編集(1989)、227−251、VCH出版、ニューヨーク)。本発明の好ましい態様によれば、固定化支持体は、1−200μmol/mlの固定化支持体濃度、より好ましくは10−100mol/mlの濃度で銅(II)イオンとキレートを形成し得る。
本発明に用いる好ましいポリマー担体は以下のような市販のものである:
・キレート化セファロース・ファスト・フロー(登録商標)(Chelating−Sepharose Fast Flow)(ファルマシア、ウプサラ):本物質においてはスペーサー上のイミノ酢酸基が安定なエーテル結合を介してセファロース・ファスト・フローに結合している;
・キレート化セファロース6B(Chelating Sepharose 6B)(ファルマシア、ウプサラ);および
・TSKトヨパールAF−キレート−650M(登録商標)(TSK Toyopearl AF−Chelate−650M)(トーソーハース(Toso Haas)、シュトウットガルト):本品ではイミノジ酢酸基が親水性半固形の固相化支持体に固定化されており、当該支持体はオリゴエチレングリコール、メタクリル酸グリシジルおよびジメタクリル酸ペンタエリスリトールから成る共重合体でできている。
銅(II)イオンの固定化に先立って、通常、固定化支持体を洗浄する。例えば、固定化支持体を以下の順で洗浄する;1−10床容量、好ましくは3−7床容量の5−50%、好ましくは10−30%エタノール;1−10床容量、好ましくは3−7床容量の脱イオン水;1−10床容量、好ましくは3−7床容量の0.01−0.1M、好ましくは0.03−0.07M EDTAおよび0.1−1M、好ましくは0.3−0.7M NaCl;1−10床容量、好ましくは3−7床容量の0.05−1M、好ましくは0.1−0.5M NaOHおよび0.1−5M、好ましくは0.5−2M NaCl;1−15床容量、好ましくは3−10床容量の脱イオン水;および最終工程で1−10床容量、好ましくは3−7床容量の0.01−1%、好ましくは0.05−0.5%ぎ酸および1−15床容量、好ましくは3−10床容量の脱イオン水。これら洗浄液の流速は通常単位時間当たり1−50床容量、好ましくは5−20床容量である。
上記の固定化支持体に銅(II)イオンを固定化するには、単に第二銅イオンを固定化支持体に負荷させることで実施できる。共通の銅(II)イオン源は銅(II)塩であり、例えば、CuCl2、Cu(CH3COO)2、および、特に、CuSO4などである。通常、1−10床容量、好ましくは3−7床容量の0.001−0.1M、好ましくは0.003−0.01MのCuSO4×5H2O水溶液を用い、ついで固定化支持体を大過剰の水で洗浄して残存する未結合第二銅イオンを除去する。このように調製した固定化銅(II)イオン含有固定化支持体はそのまま本発明の工程に使用することができる。
場合により、タンパク質含有溶液を負荷する前に、タンパク質の吸着の際に当該固定化支持体が膨潤あるいは収縮するのを避けるために、固定化支持体、タンパク質含有溶液のpHおよびイオン強度に応じて、固定化支持体を同一のpHおよびイオン強度を有する溶液で予め処理するのが好ましい。そのような処理が必要かどうかは少量での試験により容易に確かめることができる。この前処理は、1−10床容量、好ましくは3−7床容量の処理液を固定化支持体に流すことで達成できる。
上記のように調製した固定化支持体にキレート形成によってタンパク質を吸着せしめるには、該タンパク質含有溶液を固定化した銅(II)イオン含有カラムに装填するだけでよい。
タンパク質溶液は種々の起源のものが可能であり、また、予め精製してもしなくてもよい。例えば、単離すべきタンパク質が、宿主が培養液中に分泌したものである場合、例えば、遠心した培養液を直接固定化支持体に加えることも可能である。生成したタンパク質が宿主中に保持されている場合には、細胞を破壊してタンパク質含有溶液を、例えば、遠心により細胞破砕物から分離しなければならない。このようにして得られたタンパク質含有溶液を上述のように直接固定化支持体に加えてもよいし、例えば当該技術分野でよく知られた沈殿法、抽出法、クロマトグラフィー法などにより更に精製してもよい。従って、該タンパク質含有溶液は種々起源のものであってもよいし、また、種々の不純物、例えば、イオン性種、外来タンパク質等を含んでいてもよい。
あるタンパク質を本発明方法で精製可能か否かは小規模の実験で決めることができる。この場合、該タンパク質を少量の銅(II)負荷固定化支持体に吸着させ、下記のごときルイス塩基で処理し、次いで脱イオン水で溶出するタンパク質量を定量し、2M NH4Clで溶出するタンパク質量と比較する。一般に、本発明工程は下記のようなルイス塩基が当該タンパク質と銅(II)イオンとの間の複合体を破壊しないことで特徴づけられるタンパク質に適用できる。好ましいタンパク質は、インターフェロン、アミラーゼおよび関連タンパク質である。とりわけ、インターフェロン−α、トリプシン、α−アミラーゼが好ましい。
固定化支持体に装填するタンパク質含有溶液の量は、この固定化支持体に固定化した銅(II)イオン濃度、該溶液中のタンパク質濃度およびタンパク質の性質に依存する。それ故、装填すべき溶液の適量は、UVモニターなどの検出器による流出液の観察により実験的に決定する。
本発明における重要な工程は、脱イオン水での流出に先立って、固定化支持体に吸着したタンパク質をルイス塩基で洗浄する工程である。ルイス塩基とはアミン、HO-、フォスファン、ホスフィンなどの電子対供与体である。それらを例示すれば、NH3、CH3NH2、(CH3)2NH、(CH3)3N、C2H5(CH3)2N、C2H5NH2、(C2H5)2NH、(C2H5)3N、C3H7NH2、C4H9NH2、C5H11NH2、C6H13NH2、CH3PH2、(CH3)2PH、(CH3)3P、アミノ酸類、シスチン、ヒドロキシル担持アミン(HOCH2NH2、(HOCH2)2NHまたは(HOCH2)3N、HOC2H4NH2、(HOC2H4)2NHまたは(HOC2H4)3N、またはトリス−塩酸(TRIS−HCl)など)である。
本発明の好ましい形態において、当該ルイス塩基溶液は中性または弱アルカリpH領域においてNH4 +または一級、二級もしくは三級アミンを含んでおり、強アルカリpH領域においてOH-を含んでいる。より好ましい本発明の形態において、当該ルイス塩基溶液はNH4 +または一級、二級もしくは三級アミンを含んでおり、最も好ましい形態は、NH4 +または一級アミン(エタノールアミン、シスチン、NH4SCN、NH4Cl、NH4 +CH3COO-、(NH4)2SO4およびTRIS−HClなど)含有溶液である。
所望のタンパク質をルイス塩基溶液で溶出しないようにするために、ルイス塩基濃度またはルイス塩基含有溶液のpHを制御する。アミン(ルイス塩基)濃度の好ましい範囲は0.001ないし1Mである。
ルイス塩基の最適濃度は電子供与体に大きく依存する。例えば、シスチンの場合1mMの濃度が最適であるが、NH4Clの場合には300−500mMの濃度は最適である。幾種類かの塩についてその最適濃度を示すと、例えば、NH4SCNの場合は10−100mM、NH4Clでは10−500mM、NH4(CH3COO)では10−800mM以上、(NH4)2SO4では10−500mM以上などである。
ルイス塩基としてアミンを用いる場合には、pHを好ましくは6−9に、より好ましくは6.5−8.5、最も好ましくは7.0−8.0に調整する。OH-をルイス塩基として用いる場合は、例えば、ほう酸塩もしくは燐酸塩バッファーで、好ましくはpH9−11に調整する。
また、異なるルイス塩基の混合物を用いて結果を改善したり、あるいはNaClもしくはKClなどの非ルイス塩基である塩を更に加えることも可能である。当該添加塩の濃度は5Mまで、好ましくは2Mまでである。
一般例として示すと、タンパク質をすでに吸着している固定化支持体は1−10床容量、好ましくは3−7床容量の上述洗浄液で洗浄する。その際の流速は実験的に決めるが、例えば、1−10床容量/時、好ましくは3−5床容量/時である。
上述のごとく、洗浄工程はタンパク質を脱イオン水で溶出する直前に実施するのが有利である。溶出工程を洗浄後直ちに実施する場合、この洗浄工程をタンパク質の装填と同時に実施することも可能である。
上述のごとく、ルイス塩基での洗浄後、所望のタンパク質は固定化支持体を脱イオン水で洗浄するだけで溶出させることができる。高純度とするためには、脱イオン水は0.001Mを越えるイオン性化合物を含んでいてはならない。逆に、脱イオン水は、例えば、該タンパク質の三級もしくは四級構造を安定化する非イオン性化合物を含んでいてもよい。適当な非イオン性化合物とは、例えば、マンニトール、グルコース、ラクトース、フルクトース、グリセロール、ポリエチレングリコールなどの糖類もしくはポリオール類、あるいはタンパク質のスルフヒドリル基の酸化状態を維持する他の化合物類である。脱イオン水は、好ましくは1−10床容量、より好ましくは3−7床容量の量で用いる。
本発明方法においては、固定化支持体に特異的に結合する殆どの外来タンパク質は脱イオン水で溶出しない。それらは吸着されたままであり、古典的な溶出液(例えば、2M NH4Cl/25mM TRIS−HClバッファー、pH7.6)で事後除去することができる。それ故、得られる生成物の濃度はとりわけ高いものとなる。例えば、インターフェロン−αB1D2B3B4の場合、30%純度の吸着溶液から出発した生成物の純度は90%と高く、先行技術である銅キレート−アフィニティークロマトグラフィーでは高々30−50%の純度しか達成できない。
所望のタンパク質の純度および回収率を最適化するために、適当なバッファー、例えば、ほう酸カリウムバッファー、および/または脱イオン水での一回ないし複数回の洗浄工程をタンパク質吸着工程とルイス塩基での洗浄工程の間に適宜挿入してもよい。従って、本発明のより好ましい態様においては、吸着したタンパク質をルイス塩基溶液での洗浄に先立って、ルイス塩基でないバッファーで洗浄するか、および/または脱イオン水で洗浄する。この発見は、洗浄工程と溶出工程を同一の手段、すなわち脱イオン水を用いて実施することができるという意味で驚くべきことである。
この脱イオン水を用いる中間的な洗浄工程は、例えば、副生成物の除去、特に、疎水性相互作用(特殊な銅イオンの親和性によるものではない)により固定化支持体に結合した副生物の除去に効果がある。
銅(II)キレートに基づく他の精製手法からも分かるように、単離したタンパク質溶液は僅かながら銅(II)イオンを含んでいる可能性がある。これらのイオンは、イオン交換もしくは銅(II)イオンキレート化カラムなどの既存の方法で容易に除去することができる。後者の精製工程は別途行ってもよいし、処理後直ちに行ってもよい;この工程は、例えば、当該カラムの下段に銅(II)イオン除去物質を詰めて行う。
精製終了後、銅負荷固定化支持体を洗浄し、次回の精製工程に使用してもよいが、好ましくは、再現性を良くするために固定化支持体から銅(II)イオンを競合的キレート化試薬、例えば、EDTAを用いて除去し、次いで、上記のごとくに固定化支持体に銅(II)イオンを負荷する。
実施例
実施例1:IFN−B/Dの精製
組換えヒト・ハイブリッド・インターフェロン−αB1D2B3B4(以下、IFN−B/Dという)をEP−A−205404の記載に従って構築した。IFN−B/Dはサッカロミセス・セレビシエ(Saccharmyces cerevisiae)HT393株により製造する;当該株はハイネマイヤー(Heinemeyer)ら(EMBOジャーナル(1991)、10、555−562;DSM9697)により開示されたE95−1−2Aと同一であり、プラスミドpDP34R/PH05/IFN AM119で形質転換されている。酵母ベクターpDP34Rおよび酵母酸性ホスファターゼ遺伝子プロモーターPHO5についてはヒンネン(Hinnen)らの著書(酵母遺伝子工学(Yeast Genetic Engineering)、バー(Barr)ら監修、バターウオース(Butterworths)、ボストン、(1989)、193−213)に引用がある。IFN AM119はIFN−B/Dのコード配列であり、EP−A−205404に引用がある。
IFN−B/Dをコードする組換えプラスミド含有の酵母HT393株は大規模醗酵タンク中で成長させる。醗酵終了後、生物産生有機物を遠心分離により集める。得られる細胞沈降物を0.5M NaCl含有0.07M燐酸カリウムバッファーで50%湿潤細胞濃度(乾燥細胞濃度どして10%)に希釈する。ガラス−ビーズ摩砕機を通して細胞を破砕した後、IFN−B/Dタンパク質を細胞ホモジネートから水系二相系に分配することにより抽出する;該二相系は40%重量の細胞ホモジネート、18%重量のポリエチレングリコール1500、4%重量の燐酸カリウム(pH7)および1mol/kg総濃度相当のNaClから成る。遠心式ディスク濃縮分離機により8150rpm(13000g)で相分離した後、上層を回収、第二の水系二相系に分配して洗浄する;該二相系は4重量部の上層と20%重量燐酸カリウム(pH7)含有1mol/kg NaCl溶液1重量部とを混合したものである。沈降槽中で相分離した後、IFN−B/Dを新たな上層から第三の水系二相系への逆抽出により回収する;該水系二相系とは第二の二相系の上層3重量部および7重量部の1.56mol/kg硫酸マグネシウム溶液を混合して調製したものである。沈降槽中での相分離終了後、下層を回収し、2倍容量の水で希釈し、0.2ミクロンフィルターで濾過し、次いで、銅キレート−クロマトグラフィーに付す前に4℃で数日保存する。
この吸着溶液は以下の特性を有する:pH5.6、伝導率約43mS/cm(主にMgSO4による)、ポリエチレングリコール濃度6mg/ml、IFN−B/D濃度約0.1−0.15mg/ml、IFN−B/D濃度総タンパク質含量の約30%。
銅キレート−クロマトグラフィーは100mlのキレート化セファローズ・ファスト・フロー(登録商標)(Sepharose Fast Flow)(ファルマシア、ウプサラ)を充填したカラム(直径44mm)を用いて室温で行う。固定化支持体は以下の順序で連続的に洗浄する:20%エタノール5床容量、脱イオン水5床容量、0.05M EDTAおよび0.5M NaCl 5床容量,0.25M NaOHおよび1M NaCl 5床容量、脱イオン水7床容量、0.1%ぎ酸5床容量、および脱イオン水7床容量;流速は単位時間当たり12床容量である。次いで固定化支持体に第二銅イオンを負荷するが、その際、0.008M CuSO4・5H2O溶液5床容量を装填し、次いで大量の脱イオン水ですすぐ;そうすることで残存未反応の銅が除去される。吸着工程に先立って、カラムは500mlバッファー溶液で平衡化する;該バッファー溶液は0.68M MgSO4および0.092M酢酸ナトリウムから成り、pHは酢酸で5.6に調整してあり、吸着溶液と略同じ伝導率、すなわち43mS/cmを有する。次いで、5000mlのIFN−B/D吸着溶液を流速300ml/hで当該カラムに流す。流出液は波長280nmに設定したUV−モニターで追跡する。
カラムに添加後、500ml/hの流速で洗浄を連続して3回実施する;最初の洗浄は吸着前にすでに使用したpH5.6の平衡用バッファー500mlで行う;二度目の洗浄は脱イオン水500mlで行う;三度目の洗浄は0.2M NH4Clおよび1M NaClを含有する0.025M TRIS−HClバッファー(pH7.6)500mlで行う。次いで、IFN−B/Dを再び脱イオン水400mlを用いて流速500ml/hで溶出する。3回の洗浄液および水溶出液はUV−モニターで制御しながら採取する。
吸着溶液、3回の洗浄液および水流出液のそれぞれのIHN−B/D濃度を逆相HPLC分析により測定した(カラム:ヴァイダック(Vydac)C−18、30nm、粒子サイズ5ミクロン;移動相A:0.1%トリフルオロ酢酸・水;移動相B:80%アセトニトリル、19.91%水および0.09%トリフルオロ酢酸;流速1ml/min;注入量0.05ml;216nmにてUV検出)。
3回の洗浄液中のIFN−B/D量は無視し得る。すべての予想に反して、約70%の収量で回収される高純度のIFN−B/Dを含んでいる;これは総タンパク質含量の約90%である(すなわち、ファクター3によるIFN−B/Dの高濃度化)。
この水流出液が特に驚異的なのは、2度目の洗浄液にはIFN−B/Dが検出されないことである(5%以下の回収率);この2度目の洗浄液は全く同一の液体、すなわち精製水である。
この水流出液は低塩濃度とpH約8で特に高いIFN−B/D濃度(約1mg/ml)を示し、4℃での貯蔵に安定である;IFN−B/Dの沈殿は数日以上生じない。
実施例2:水溶出により得られる種々IFN−B/D溶液の特徴づけ
IFN−B/D水溶液は実施例1に記載した方法と同様に水での溶出により得られる。ただし、溶出に用いる水の容量を変えるか、および/または水溶出に先行する洗浄工程のバッファーの組成を変える。
第一のIFN−B/D溶液は実施例1で述べたと同じ洗浄バッファー(0.2M NH4Clおよび1M NaCl含有0.025M TRIS−HClバッファーpH7.6)を用い、且つ、溶出には脱イオン水約0.67床容量のみを用いて得られる。
第二のIFN−B/D溶液は洗浄バッファーとして0.2M NH4Cl含有0.025M燐酸カリウムバッファーpH7.6を用い、且つ、溶出には脱イオン水1.5床容量を用いて得られる。
第三のIFN−B/D溶液は洗浄バッファーとして0.025M TRIS−HClバッファー7.6(NH4Clを含まず、NaClも含まない)を用い、且つ、溶出には脱イオン水4床容量を用いて得られる。三種のIFN−B/D溶液の特性を表1に示す。
第一の溶液は特に高いインターフェロン濃度(7mg/ml)を有し、4℃で保存した場合驚く程安定であることが分かる;IFN−B/Dの沈殿は一夜生じない。比較のために示すと、純IFN−B/Dの溶解性は0.1M燐酸カリウムバッファーpH7.6または0.1M炭酸ナトリウムバッファーpH8.0では0.5mg/ml以下である。
第二および第三の溶液を4℃で数日間保存する。これら両溶液について逆相HPLC分析(実施例1に記載のとおり)によりインターフェロン濃度を測定すると、1週間後にも不変であることが分かる。この安定性は第三の溶液の場合特に驚異的である;第三の溶液は1.5mg/mlという高いインターフェロン濃度で非常に低い塩濃度(伝導率<0.5mS/cm)を示す。
実施例3:IFN−B/D溶出における回収率の評価
実験にはFPLC(登録商標)クロマトグラフィーシステム(ファルマシア、ウプサラ)およびキレート−セファローズ・ファスト・フロー(登録商標)(ファルマシア、ウプサラ)5mlを充填したガラスカラム(直径10mm)を使用し、室温で実験する。流速はカラムにポンプで送るすべての溶液について60ml/hに固定する。流出液は波長280nmに設定したUV−モニターに送る。固定化支持体の調製および再生は実施例1記載のとおりに行うが、その際以下の溶液をポンプでカラムに送る:0.05M EDTAおよび0.5M NaCl 25ml、0.25M NaOHおよび1M NaCl 25ml、脱イオン水35ml、0.1%ぎ酸25ml、脱イオン水35ml、0.008M CuSO4×5H2O 25mlおよび脱イオン水40ml。
最初の実験では、精製したIFN−B/D(純度:タンパク質含量として99.9%;濃度:約0.3mg/ml)0.2Mマンニトールおよび0.03M燐酸ナトリウムpH7.6に溶解した溶液約80mlをカラムに流し込む。0.3M塩化アンモニウムバッファーpH7.6 35mlで洗浄後、インターフェロンを脱イオン水35mlで溶出する。次いで、2M塩化アンモニウム含有0.025M TRIS−HClバッファーpH7.6 35mlをポンプでカラムに送り、流出液中のインターフェロンが完全に固定化支持体に結合したことを確認する。回収した各フラクションのインターフェロン濃度を実施例1に記載した逆相HPLC分析法により測定する。得られる各回収率を表2に示す。
0.3M塩化アンモニウムpH7.6の代わりに、0.1Mほう酸カリウムpH7.6を洗浄用バッファーとして用い、同じ実験を繰り返す。
表2に示すように、溶出に先立って洗浄工程で使用するバッファーの組成は水での溶出に大きく影響する。
実施例4:洗浄工程の影響
実施例3で述べたと同じ実験を洗浄バッファーの組成のみを変えて数回実施した。試験した種々洗浄バッファーおよび相応する回収率を表3に示す。
表3に示すごとく、水での溶出は洗浄バッファーのpHを塩基性域(例えば、0.1Mほう酸カリウムpH9.5)としても、あるいは洗浄バッファーが略中性pH域にあって、アミンもしくはアンモニウム塩を含有していたとしても(例えば、0.3M酢酸アンモニウムpH7.6;しかし、0.3M酢酸カリウムpH7.6は不可)、収率がよい(60%以上)。この場合、アミンは一級(例、トリエタノールアミン)、二級(例、ジエタノールアミン)もしくは三級(例、トリエタノールアミン)であってもよいが、四級アミン(例、塩化テトラメチルアンモニウム)は不可である。洗浄バッファーの最適濃度は使用するアミンに大きく依存する;例えば、シスチンpH7.6の場合には約1mM、NH4Cl pH7.6の場合には300−500mMである。
実施例5:ルイス塩基処理後の第2回目洗浄工程の影響
実施例3で述べたと同じ実験を繰り返す;ただし、2回目の洗浄工程は0.1Mほう酸カリウムバッファーpH7.6 35mlで行い、0.3M塩化アンモニウムバッファーpH7.6 35mlでの第一回目洗浄工程と水での溶出との間に挿入する。回収率は以下のとおりである。
少量のIFN−B/Dが水溶出液中に検出される。しかし、第一回目洗浄工程にアンモニウムが存在したにかかわらず、回収率は低い(約22%);この事実は溶出直前の洗浄工程が如何に大きく影響するかを示している。
実施例6:洗浄工程がない場合のIFN−B/D溶出回収率
実施例3で述べたと同じ実験を繰り返す;ただし、吸着工程と水溶出工程との間の洗浄工程を省く。
第一回目の実験は実施例3に述べたと全く同一の流出溶液(0.2Mマンニトールおよび0.03M燐酸ナトリウムpH7.6に溶解した0.3mg/mlIFN−B/D)を使用し実施する。第二回目の実験も同一の流出溶液で実施するが、該流下液は更に0.3Mol/L濃度の塩化アンモニウムを含有している。それぞれの回収率を表4に示す。
表4に示すごとく、溶出直前の流下バッファー組成は水での溶出に大きく影響する。
実施例7:塩析効果の影響
部分精製したIFN−B/D(純度:タンパク質含量として約90%)の水溶液を実施例1に記載の方法と同様に水溶出により調製する。この溶液の一定分量を凍結し、−5ないし−10℃で貯蔵後、使用前に融解する。
この貯蔵液の組成は以下のとおりである:
IFN−BD: 0.5−1mg/ml
TRIS−HCl: 約0.02M
NaCl: 約0.01M
Na−酢酸塩: 約0.01M
NH4Cl: 約0.002M
Cu2+: 約1μM
pH: 8
伝導率: 2.2mS/cm
実施例3に述べたと同一の実験を数回実施する;この際、保存液50mlを送液し、洗浄バッファーの組成のみを変更する。試験した種々洗浄バッファーおよびそれから得られる対応回収率を表5に示す。
試験した洗浄液のすべてがpH7.6でアンモニウム塩である。対イオンとして用いるアニオンを表5に列記してあるが、その順番は水構造を崩壊する傾向(カオトロピック効果)を示し、疎水性相互作用の強度を相対的に減少していくものから、疎水性相互作用を増大する(塩析効果)のに特に効果のあるものの順に並べてある。
塩析効果を増大:SCN-<Cl-<CH3COO-<SO4 2-
表5に示すごとく:
−NH4SCNの場合(低塩析効果)、アンモニウム濃度が高すぎると(≧0.3M)、IFN−B/Dは洗浄バッファーでそのまま溶出される。NH4SCN濃度を≦0.1Mとすると水での溶出が高収率(≧90%)で進行する。
−NH4Clの場合は、CH4Cl濃度を≦0.5Mとするとき水での溶出が高収率で進行する。
−NH4−酢酸塩の場合、0.8Mという高い濃度を用いることが可能となり、水での溶出も高収率となる。
−(NH4)2SO4の場合(高塩析効果)、アンモニウムを1.0Mと高くすることが可能であり、水での溶出も高収率となる。
実施例8:pHおよび濃度の影響
実施例7で述べたと同一の実験を繰り返すが、この際、洗浄バッファーの組成を変える。試験した種々洗浄バッファーおよびそれから得られる対応回収率を表6に示す。
表6に示すごとく:
−K−酢酸塩pH5.6(低pH値;アミンなし)およびトリス−塩酸pH5.6(低pH値;アミン存在)の場合、水溶出によって得られる回収率は非常に低い。
−トリス−塩酸pH7.6(略中性pH値;アミン存在)の場合、水溶出によって得られる回収率はよい(60%以上)。アミン濃度が高すぎる(>0.3M)とき、洗浄バッファーでもIFN−B/Dの部分溶出が起こる。アミン濃度が低すぎる(<0.1M)場合は、水溶出が定量的でなくなり、IFN−B/Dの残量を引き続き2M NH4Cl+0.025M TRIS−HClバッファーpH7.6で溶出することとなる。この後者の問題を避けるためにNaClを(1.7M濃度で)含有させるが、NaClは固定化支持体とインターフェロンタンパク質との間のイオン性相互作用を失活させることになる。
実施例9:グラジエントでの溶出
実施例7で述べたと同じ実験を、洗浄バッファーとして0.1M TRIS−HCl pH7.6を用い実施する。水溶出での回収率は89%である。残余のIFN−B/D(11%)は引き続き2M NH4Cl+0.025M TRIS−HClバッファーpH7.6で溶出する。
この実験を同一の洗浄バッファー(20ml 0.1M TRIS−HCl pH7.6)により繰り返すが、この洗浄工程に続いて直線的グラジエント溶出を12床容量(60ml)分、100%洗浄バッファーないし100%脱イオン水の条件で実施する。カラムを更に水55mlですすぎ、次いで2度目の直線的グラジエント溶出を7床容量(35ml)分、100%水ないし2M NH4Cl+0.025M TRIS−HClバッファーpH7.6100%の条件で行う。最後にカラムをこの後者のバッファーですすぐ。
IFN−B/Dは最初のグラジエントの終段階、すなわち、約10ないし5mM TRIS−HCl pH7.6で溶出されることが分かる;回収率は60%である。残余のIFN−B/D(40%)は二度目のグラジエントの中間段階、すなわち、約1M NH4Cl+12.5mM TRIS−HCl pH7.6の対応する濃度で溶出される。
実施例10:流出溶液の組成
実施例7に述べたと同じ実験を繰り返す;この場合、洗浄バッファーとして0.1M TRIS−HCl pH7.6の溶液を常時用いるが、最初の溶出溶液の組成、すなわち、溶出のための水の組成を変化させる。試験した種々溶出溶液およびそれから得られる対応回収率を表7に示す。
表7に示したごとく:
−IFN−B/Dの溶出液を50%以上の回収率で得るためには、水中の残余塩濃度は極度に低い(<0.0001M)ことが必要である。
−マンニトールあるいはグリセロールなどの未変化溶質は高濃度(1Mの範囲)で溶出溶液中に存在してもよいが、双性イオンは不可である。例えば、MES(2−[N−モルホリノ]エタンスルホン酸)は回収率をよくするために0.001M以下でなければならない。
−溶出溶液の伝導率を、IFN−B/D溶出液の存否予測のために基準として用いることはできない。
実施例11:IFN−BおよびIFN−D
ヒト・ハイブリッド・インターフェロン−αB1D2B3B4(IFN−B/D)に代えて、実施例3記載のようにヒト・インターフェロン−αB(IFN−B)またはヒト・インターフェロン−αD(IFN−D)を用い、0.5mlのキレート化セファロース・ファスト・フロー(登録商標)(ファルマシア、ウプサラ)のみを充填した小型ガラスカラム(直径5mm)を使用し、実験を行う。カラムにポンプ送液する際の対応する流速および液量はファクター10まで規模縮小する。
EP−A−205404に記載のIFN−B/D親分子であるIFN−BおよびIFN−Dは、酵母(Saccharomyces coervisiae)組換えDNAの発現、醗酵、回収および部分精製により製造する。
IFN−Bは、0.025M TRIS−HClバッファーpH7.6の保存液として得られ、その保存液中のインターフェロン濃度は0.05mg/mlであり、実施例7記載のIFN−B/D保存液と同じ純度を示す。
IFN−Dは保存液として得られ、その組成は実施例1記載のIFN−B/D吸着溶液と同じであり、純度も略同一である。
実施例3に記載のごとく、カラムに装填したインターフェロンは適当なバッファーで連続的に洗浄し、脱イオン水で溶出し、2M塩化アンモニウム含有0.025M TRIS−HCl pH7.6で溶出する。収集したフラクションのインターフェロン濃度は、実施例1に記載したように逆相HPLC分析法により測定し、ウシ細胞(マジン−ダーバイ(Madin−Darby)ウシ細胞)を用いて水泡性口内炎ウイルスに対する生物学的抗ウイルス作用の試験管内分析により確認する。試験した種々洗浄バッファーおよびそれから得られる対応回収率を表8に示す。
表8に示すように、IFN−BおよびIFN−Dは水で溶出することができる。
実施例12:α−アミラーゼおよびトリプシン
IFN−B/Dについて実施例3に記載したと同様に、種々のタンパク質について実験する;その際、同一のFPLC(登録商標)クロマトグラフィーシステム、同じ量(5ml)のキレート化セファロース・ファスト・フロー(登録商標)および同一のクロマトグラフィー条件を用いる。
試験したタンパク質は、バシラス種(Bacillus species)からのα−アミラーゼ(シグマ(Sigma)製品No.A6380)、ウシ膵臓からのトリプシン(セルヴァ(Serva)製品No.37260)を使用する。実験を行うに当たっては、相当するタンパク質溶液約50ml(0.5mg/ml濃度)を装填するが、TRIS−HClを次工程洗浄バッファーとして用いる場合は、0.01M TRIS−HClバッファーpH7.6溶液とし、また、K−ほう酸塩を次工程洗浄バッファーとして用いる場合あるいは洗浄工程を省略する場合は、0.01Mほう酸カリウムバッファーpH7.6溶液とする。
実施例3に記載のごとく、カラムに装填したタンパク質を連続的にバッファー(TRIS−HClまたはK−ほう酸塩)で洗浄し、脱イオン水で溶出し、次いで、2M塩化アンモニウム含有0.025M TRIS−HClバッファーpH7.6で溶出する。収集したフラクションのタンパク質濃度をバイオ−ラッド(Bio−Rad)タンパク質アッセイ法(バイオ−ラッド製品No.500−0006、微量アッセイ手技)により測定する。試験したタンパク質および洗浄バッファー、並びに対応する回収率を表9に示す。
表9に示したように:
−α−アミラーゼ(バシラス種由来)は以下の場合水で溶出できる(回収率:約90−100%):洗浄バッファーのpH値が塩基性領域にある場合(例えば、0.1Mほう酸カリウムpH9.5)、または洗浄バッファーが略中性pH値、且つ適正な濃度でアミンを含有している場合(0.025ないし0.1M TRIS−HCl pH7.6)。
−トリプシン(ウシ膵臓由来)もまた、例えば、洗浄バッファーとして0.025M TRIS−HClを使用することにより、水で溶出することができる(回収率:40%以上)。
実施例13:クロマトグラフ媒体
実施例7に述べたと同じ実験を二度行うが、その際、洗浄バッファーとして0.1MTRIS−HClpH7.6を常時使用し、クロマトグラフィーの媒体を変化させる。
最初の実験で用いる媒体は、実施例1ないし12同様のキレート化セファローズ・ファスト・フロー(登録商標)(ファルマシア、ウプサラ)である。ビーズ径は0.045−0.165mmである。キレート化セファローズ・ファスト・フローはスペーサー上にイミノジ酢酸を有し、該イミノジ酢酸は安定なエーテル結合を介してセファローズ・ファスト・フロー(登録商標)に結合されている:
[セファローズ・ファスト・フロー]-O-CH2-CHOH-CH2-O-CH2-CHOH-CH2-N-(CH2COOH)2
基本マトリックス−セファローズ・ファスト・フロー−は交差結合アガロースである。
第二の実験で用いる媒体はTSKトヨパール(登録商標)(Toyopearl)AF−キレート−650M(トーソーハース、シュトウットガルト)である。ビーズ径は約0.065mmである。TSKトヨパール(登録商標)とは親水性半固体ゲルであって、オリゴエチレングリコール、グリシジルメタクリレートおよびペンタエリスロールジメタクリレートから成る共重合体である。配位子は固定化イミノジ酢酸基から成る。
各実験を実施するに当たり、ガラスカラム(直径10mm)に各ゲル5mlを充填する。実施例3に示したと同じ調製法(銅イオンの負荷)および再生法をキレート化セファロース・ファスト・フロー(登録商標)媒体およびTSKトヨパールAF−キレート−650M(登録商標)媒体に適用する。使用するIFN−B/Dの吸着溶液は実施例7に記載した保存溶液である。対応する回収率を表10に示す。水での溶出により、両方の場合において良好な回収率が得られる。
微生物の寄託
下記の微生物株をドイツ微生物寄託機関(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen(DSM))、マッシェローデル・ウエッグ・1B、D−38142ブラウンシュバイク、ドイツ国に寄託した(受託番号および寄託日を示す)。
サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)HT393 DSM9697 1995年1月27日
Claims (20)
- 以下の工程a)、b)およびc)を含むことを特徴とする、タンパク質の高濃度化方法。
a)未精製または予備精製したタンパク質を固定化銅(II)イオンに吸着させる工程、
b)吸着したタンパク質をルイス塩基溶液で洗浄する工程、および
c)所望のタンパク質を0.001Mを越えるイオン性化合物を含有しない脱イオン水で溶出する工程。 - 銅(II)イオンが固定化支持体に固定化されている、請求項1の方法。
- 固定化支持体がアガロースまたはビニルポリマーである、請求項2の方法。
- ルイス塩基溶液が中性もしくは低アルカリ性pH域でNH4 +または一級、二級もしくは三級アミンを含有するか、あるいは高アルカリ性pH域でOH-を含有する、請求項1の方法。
- ルイス塩基溶液がNH4 +または一級、二級もしくは三級アミンを含有する、請求項1の方法。
- ルイス塩基溶液がNH4 +または一級アミンを含有する、請求項1の方法。
- ルイス塩基溶液がpH9−11の緩衝pH域でOH-を含有する、請求項1の方法。
- ルイス塩基がエタノールアミン、シスチン、NH4SCN、NH4Cl、NH4 +CH3COO-、(NH4)2SO4およびTRIS−HClから成る群より選択されるものである、請求項1の方法。
- ルイス塩基を0.001Mないし1Mの濃度で用いる請求項1の方法。
- ルイス塩基溶液が一種またはそれ以上の非ルイス塩基である塩を更に含有する、請求項1の方法。
- 更に含有する塩がNaClまたはKClである、請求項10の方法。
- 更に含有する塩を5Mまでの濃度で用いる、請求項10の方法。
- 更に含有する塩を2Mまでの濃度で用いる、請求項10の方法。
- ルイス塩基をpH6−9に調整する、請求項5の方法。
- タンパク質が、当該タンパク質と銅(II)イオンとの間で形成される複合体がルイス塩基では分解されないようなものであることを特徴とする、請求項1の方法。
- タンパク質がインターフェロン、アミラーゼ、トリプシンまたは関連のタンパク質であることを特徴とする、請求項1の方法。
- タンパク質がインターフェロン−α、トリプシンおよびα−アミラーゼから成る群より選択されるものであることを特徴とする、請求項1の方法。
- 脱イオン水が非イオン性化合物を含有する、請求項1の方法。
- 脱イオン水が糖またはポリオールを含有する、請求項1の方法。
- 脱イオン水がマンニトールまたはグリセロールを含有する、請求項1の方法。
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