JP6932506B2 - 細胞透過組成物およびそれを用いる方法 - Google Patents
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Description
本出願は、2013年11月26日に出願された米国特許仮出願第61/908,963号に対して35 U.S.C. §119(e)の下で優先権を主張し、その出願は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
本発明は、National Institutes of Healthによって授与されたHL064793、HL061371、HL096670、およびHL081190の下、政府の援助でなされた。政府は、本発明においてある一定の権利を有する。
細胞膜(形質膜または細胞質膜としても公知である)は、細胞の内部を外側の環境から分離し、細胞をその周囲から保護する生体膜である。膜は、埋め込まれたタンパク質を伴うリン脂質二重層を含み、細胞接着、イオン伝導性、および細胞シグナル伝達などの細胞プロセスに関与している。
を含む。さらに他の態様において、組成物は、SEQ ID NO: 1-SEQ ID NO: 3;SEQ ID NO: 1-SEQ ID NO: 4;SEQ ID NO: 1-SEQ ID NO: 5;SEQ ID NO: 1-SEQ ID NO: 6;SEQ ID NO: 3-SEQ ID NO: 1;SEQ ID NO: 4-SEQ ID NO: 1;SEQ ID NO: 5-SEQ ID NO: 1;およびSEQ ID NO: 6-SEQ ID NO: 1からなる群より選択される、輸送構築物をコードする核酸を含む。さらに他の態様において、組成物は、ペプチド;タンパク質;生物学的活性化合物;標識;イメージング剤;診断剤;治療剤;および予防剤からなる群より選択される少なくとも1つの積荷部分をコードする核酸をさらに含む。
[本発明1001]
アミノ酸配列RRPPR(SEQ ID NO: 1)を含む、単離された輸送ペプチド、またはその塩もしくは溶媒和物。
[本発明1002]
SEQ ID NO: 1からなる、本発明1001の輸送ペプチド。
[本発明1003]
薬学的に許容される担体をさらに含む薬学的組成物の一部である、本発明1001の輸送ペプチド。
[本発明1004]
積荷部分に連結されSEQ ID NO: 1を含む輸送ペプチドを含む、単離された輸送構築物、またはその塩もしくは溶媒和物。
[本発明1005]
輸送ペプチドがSEQ ID NO: 1からなる、本発明1004の輸送構築物。
[本発明1006]
積荷部分が、核酸;ペプチド;タンパク質;オリゴ糖;脂質;糖脂質;リポタンパク質;低分子化合物;治療薬;紫外可視、蛍光、または放射性標識;イメージング剤;診断剤;予防剤;リポソームおよびウイルスからなる群より選択される少なくとも1つである、本発明1004の輸送構築物。
[本発明1007]
積荷部分が、リンカーまたは化学結合を通して輸送ペプチドに共有結合で連結されている、本発明1004の輸送構築物。
[本発明1008]
リンカーがジスルフィド結合を含むか、または、積荷部分と輸送ペプチドとの間の化学結合がジスルフィド結合を含む、本発明1007の輸送構築物。
[本発明1009]
積荷部分がペプチド部分を含み、かつ輸送ペプチドが、該積荷部分のペプチド部分のN末端またはC末端にアミド結合を通して共有結合で連結されている、本発明1007の輸送構築物。
[本発明1010]
SEQ ID NO: 3〜6からなる群より選択される配列を含む積荷部分に連結されSEQ ID NO: 1を含む輸送ペプチドを含む、単離された輸送構築物、またはその塩もしくは溶媒和物。
[本発明1011]
積荷部分がペプチド部分を含み、かつ輸送ペプチドが、該積荷部分のペプチド部分のN末端またはC末端にアミド結合を通して共有結合で連結されている、本発明1010の輸送構築物。
[本発明1012]
SEQ ID NO: 1-SEQ ID NO: 3;SEQ ID NO: 1-SEQ ID NO: 4;SEQ ID NO: 1-SEQ ID NO: 5;SEQ ID NO: 1-SEQ ID NO: 6;SEQ ID NO: 3-SEQ ID NO: 1;SEQ ID NO: 4-SEQ ID NO: 1;SEQ ID NO: 5-SEQ ID NO: 1;およびSEQ ID NO: 6-SEQ ID NO: 1からなる群より選択される少なくとも1つの配列を含む、本発明1011の輸送構築物。
[本発明1013]
SEQ ID NO: 1-SEQ ID NO: 3;SEQ ID NO: 1-SEQ ID NO: 4;SEQ ID NO: 1-SEQ ID NO: 5;SEQ ID NO: 1-SEQ ID NO: 6;SEQ ID NO: 3-SEQ ID NO: 1;SEQ ID NO: 4-SEQ ID NO: 1;SEQ ID NO: 5-SEQ ID NO: 1;およびSEQ ID NO: 6-SEQ ID NO: 1からなる群より選択される、本発明1011の輸送構築物。
[本発明1014]
薬学的に許容される担体をさらに含む薬学的組成物の一部である、本発明1010の輸送構築物。
[本発明1015]
SEQ ID NO: 1を含む輸送ペプチドをコードする単離された核酸を含む、組成物。
[本発明1016]
輸送ペプチドがSEQ ID NO: 1からなる、本発明1015の組成物。
[本発明1017]
核酸が、
を含む、本発明1015の組成物。
[本発明1018]
ペプチド;タンパク質;生物学的活性化合物;標識;イメージング剤;診断剤;治療剤;および予防剤からなる群より選択される少なくとも1つの積荷部分をコードする核酸をさらに含む、本発明1015の組成物。
[本発明1019]
SEQ ID NO: 3〜6からなる群より選択される少なくとも1つの積荷部分をコードする追加的な核酸をさらに含む、SEQ ID NO: 1を含む輸送ペプチドをコードする単離された核酸を含む、組成物。
[本発明1020]
SEQ ID NO: 1-SEQ ID NO: 3;SEQ ID NO: 1-SEQ ID NO: 4;SEQ ID NO: 1-SEQ ID NO: 5;SEQ ID NO: 1-SEQ ID NO: 6;SEQ ID NO: 3-SEQ ID NO: 1;SEQ ID NO: 4-SEQ ID NO: 1;SEQ ID NO: 5-SEQ ID NO: 1;およびSEQ ID NO: 6-SEQ ID NO: 1からなる群より選択される輸送構築物をコードする核酸を含む、本発明1019の組成物。
[本発明1021]
SEQ ID NO: 1を含む輸送ペプチドをコードする核酸を含む、ベクター。
[本発明1022]
輸送ペプチドがSEQ ID NO: 1からなる、本発明1021のベクター。
[本発明1023]
輸送ペプチドをコードする核酸の発現を可能にする転写活性化エレメントをさらに含む、本発明1021のベクター。
[本発明1024]
輸送ペプチドをコードする核酸とインフレームで積荷部分をコードする核酸をさらに含む、本発明1021のベクター。
[本発明1025]
SEQ ID NO: 1を含む輸送ペプチドをコードする外来性核酸を含む、単離された宿主細胞。
[本発明1026]
核酸が、(a)輸送ペプチドをコードする核酸、および(b)該輸送ペプチドをコードする核酸とインフレームで積荷部分をコードする核酸を含むベクターである、本発明1025の宿主細胞。
[本発明1027]
宿主細胞における(a)の核酸および(b)の核酸の発現を可能にする転写活性化エレメントをさらに含む、本発明1026の宿主細胞。
[本発明1028]
積荷部分を標的細胞にまたはその中に送達する方法であって、該標的細胞を、SEQ ID NO: 1を含む輸送ペプチドに連結されている積荷部分を含む輸送構築物と接触させ、それにより該積荷部分が該標的細胞にまたはその中に送達される段階を含む、方法。
[本発明1029]
積荷部分が、リンカーまたは化学結合を通して輸送ペプチドに共有結合で連結されている、本発明1028の方法。
[本発明1030]
リンカーがジスルフィド結合を含むか、または、積荷部分と輸送ペプチドとの間の化学結合がジスルフィド結合を含む、本発明1029の方法。
[本発明1031]
積荷部分がペプチド部分を含み、かつ輸送ペプチドが、該積荷部分のペプチド部分のN末端またはC末端にアミド結合を通して共有結合で連結されている、本発明1029の方法。
[本発明1032]
輸送ペプチドがSEQ ID NO: 1からなる、本発明1028の方法。
[本発明1033]
積荷部分が、核酸;ペプチド;タンパク質;オリゴ糖;脂質;糖脂質;リポタンパク質;低分子化合物;治療薬;紫外可視、蛍光、または放射性標識;イメージング剤;診断剤;予防剤;リポソームおよびウイルスからなる群より選択される少なくとも1つである、本発明1028の方法。
[本発明1034]
標的細胞が、内皮細胞、心臓細胞、免疫細胞、骨格筋細胞、および脳細胞からなる群より選択される少なくとも1つを含む、本発明1028の方法。
[本発明1035]
細胞が哺乳動物である、本発明1028の方法。
[本発明1036]
哺乳動物がヒトである、本発明1035の方法。
[本発明1037]
積荷部分を、それを必要とする対象の標的細胞にまたはその中に送達する方法であって、SEQ ID NO: 1を含む輸送ペプチドに連結されている積荷部分を含む輸送構築物の治療的有効量を該対象に投与し、それにより該積荷部分が該対象の標的細胞にまたはその中に送達される段階を含む、方法。
[本発明1038]
積荷部分が、リンカーまたは化学結合を通して輸送ペプチドに共有結合で連結されている、本発明1037の方法。
[本発明1039]
リンカーがジスルフィド結合を含むか、または、積荷部分と輸送ペプチドとの間の化学結合がジスルフィド結合を含む、本発明1038の方法。
[本発明1040]
積荷部分がペプチド部分を含み、かつ輸送ペプチドが、該積荷部分のペプチド部分のN末端またはC末端にアミド結合を通して共有結合で連結されている、本発明1038の方法。
[本発明1041]
輸送ペプチドがSEQ ID NO: 1からなる、本発明1037の方法。
[本発明1042]
積荷部分が、核酸;ペプチド;タンパク質;オリゴ糖;脂質;糖脂質;リポタンパク質;低分子化合物;治療薬;紫外可視、蛍光、または放射性標識;イメージング剤;診断剤;予防剤;リポソームおよびウイルスからなる群より選択される少なくとも1つである、本発明1037の方法。
[本発明1043]
標的細胞が、内皮細胞、心臓細胞、免疫細胞、骨格筋細胞、および脳細胞からなる群より選択される少なくとも1つを含む、本発明1037の方法。
[本発明1044]
輸送構築物が、経口、経粘膜、局所、経皮、皮内、皮下、眼、硝子体内、結膜下、脈絡膜上、前房内、吸入、気管支内、肺、静脈内、動脈内、十二指腸内、膀胱内、非経口、クモ膜下腔内、筋肉内、および胃内からなる群より選択される少なくとも1つの経路によって対象に投与される、本発明1037の方法。
[本発明1045]
対象が哺乳動物である、本発明1037の方法。
[本発明1046]
哺乳動物がヒトである、本発明1045の方法。
[本発明1047]
積荷部分を標的細胞にまたはその中に送達する方法であって、該標的細胞を、SEQ ID NO: 3〜6からなる群より選択される配列を含む積荷部分に連結されSEQ ID NO: 1を含む輸送ペプチドを含む輸送構築物と接触させ、それにより該積荷部分が該標的細胞にまたはその中に送達される段階を含む、方法。
[本発明1048]
輸送ペプチドが、リンカーまたは化学結合を通して積荷部分に共有結合で連結されている、本発明1047の方法。
[本発明1049]
リンカーがジスルフィド結合を含むか、または、積荷部分と輸送ペプチドとの間の化学結合がジスルフィド結合を含む、本発明1048の方法。
[本発明1050]
積荷部分がペプチド部分を含み、かつ輸送ペプチドが、該積荷部分のペプチド部分のN末端またはC末端にアミド結合を通して共有結合で連結されている、本発明1048の方法。
[本発明1051]
輸送構築物が、SEQ ID NO: 1-SEQ ID NO: 3;SEQ ID NO: 1-SEQ ID NO: 4;SEQ ID NO: 1-SEQ ID NO: 5;SEQ ID NO: 1-SEQ ID NO: 6;SEQ ID NO: 3-SEQ ID NO: 1;SEQ ID NO: 4-SEQ ID NO: 1;SEQ ID NO: 5-SEQ ID NO: 1;およびSEQ ID NO: 6-SEQ ID NO: 1からなる群より選択される少なくとも1つの配列を含む、本発明1047の方法。
[本発明1052]
標的細胞が、内皮細胞、心臓細胞、免疫細胞、骨格筋細胞、および脳細胞からなる群より選択される少なくとも1つを含む、本発明1047の方法。
[本発明1053]
細胞が哺乳動物である、本発明1047の方法。
[本発明1054]
哺乳動物がヒトである、本発明1053の方法。
[本発明1055]
積荷部分を、それを必要とする対象の標的細胞にまたはその中に送達する方法であって、SEQ ID NO: 3〜6からなる群より選択される配列を含む積荷部分に連結されSEQ ID NO: 1を含む輸送ペプチドを含む輸送構築物の治療的有効量を該対象に投与し、それにより該積荷部分が該対象の標的細胞にまたはその中に送達される段階を含む、方法。
[本発明1056]
輸送ペプチドが、リンカーまたは化学結合を通して積荷部分に共有結合で連結されている、本発明1055の方法。
[本発明1057]
リンカーがジスルフィド結合を含むか、または、積荷部分と輸送ペプチドとの間の化学結合がジスルフィド結合を含む、本発明1056の方法。
[本発明1058]
積荷部分がペプチド部分を含み、かつ輸送ペプチドが、該積荷部分のペプチド部分のN末端またはC末端にアミド結合を通して共有結合で連結されている、本発明1056の方法。
[本発明1059]
輸送構築物が、SEQ ID NO: 1-SEQ ID NO: 3;SEQ ID NO: 1-SEQ ID NO: 4;SEQ ID NO: 1-SEQ ID NO: 5;SEQ ID NO: 1-SEQ ID NO: 6;SEQ ID NO: 3-SEQ ID NO: 1;SEQ ID NO: 4-SEQ ID NO: 1;SEQ ID NO: 5-SEQ ID NO: 1;およびSEQ ID NO: 6-SEQ ID NO: 1からなる群より選択される少なくとも1つの配列を含む、本発明1055の方法。
[本発明1060]
標的細胞が、内皮細胞、心臓細胞、免疫細胞、骨格筋細胞、および脳細胞からなる群より選択される少なくとも1つを含む、本発明1055の方法。
[本発明1061]
輸送構築物が、経口、経粘膜、局所、経皮、皮内、皮下、眼、硝子体内、結膜下、脈絡膜上、前房内、吸入、気管支内、肺、静脈内、動脈内、十二指腸内、膀胱内、非経口、クモ膜下腔内、筋肉内、および胃内からなる群より選択される少なくとも1つの経路によって対象に投与される、本発明1055の方法。
[本発明1062]
対象が哺乳動物である、本発明1055の方法。
[本発明1063]
哺乳動物がヒトである、本発明1062の方法。
本発明は、一部、短い5アミノ酸ペプチドであるEndo5(RRPPR;SEQ ID NO: 1)の、細胞透過性ペプチド(CPP)としての予想外の特定に関連する。
別の方法で定義されない限り、本明細書において使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同一の意味を有する。本明細書に記載されているものと同様または同等の任意の方法および材料を、本発明の実施または試験において使用することができるが、非限定的な方法および材料を説明する。
本発明は、短い5ペプチド(RRPPR)であるEndo5が非常に強力なCPPであるという、予想外の知見に関連する。本明細書に記載されているように、Endo5は、血管内皮細胞によって急速に内部移行されるその能力のために、競合選択プロセスを通して単離された。Endo5は、さらに、細胞による積荷の取り込みを増大させ、かつそれが結合した積荷の治療活性を増大させることが示された。
本発明は、細胞膜を通過する単離された輸送ペプチドを含む。ある特定の態様において、ペプチド、またはその塩もしくは溶媒和物は、アミノ酸配列RRPPR(SEQ ID NO: 1)を含む。他の態様において、輸送ペプチド、またはその塩もしくは溶媒和物は、SEQ ID NO: 1から本質的になる。さらに他の態様において、輸送ペプチド、またはその塩もしくは溶媒和物は、SEQ ID NO: 1からなる。さらに他の態様において、輸送ペプチドは、標的細胞に結合するか、または細胞膜を通過する。さらに他の態様において、細胞は、内皮細胞、心臓細胞、免疫細胞、骨格筋細胞、または脳細胞を含む。さらに他の態様において、細胞は、内皮細胞、心臓細胞、免疫細胞、骨格筋細胞、または脳細胞からなる。
を含む。
本発明は、積荷部分を、標的細胞にまたはその中に(標的細胞(中)にとも言及される)送達する方法を含む。ある特定の態様において、方法は、標的細胞を、積荷部分、およびSEQ ID NO: 1を含む輸送ペプチドを含む輸送構築物と接触させ、それにより該積荷部分が該標的細胞(中)に送達される段階を含む。
本発明内で有用な組成物は、本発明内で企図される疾患または障害を処置するために有用な1つまたは複数の追加的な化合物との組み合わせで、本発明の方法において有用であるように意図される。これらの追加的な化合物は、本発明の化合物、または、本発明内で企図される疾患もしくは障害の症状を処置、予防、もしくは低減することが公知である化合物、例えば、市販されている化合物を含み得る。
投与のレジメンは、有効量を構成するものに影響を及ぼし得る。治療用製剤は、疾患または障害の発生の前または後のいずれかに、患者に投与され得る。さらに、いくつかの分割された投薬量、および時差的な投薬量が、毎日もしくは逐次的に投与されてもよく、または、用量は、継続的に注入されてもよく、もしくはボーラス注射であってもよい。さらに、治療用製剤の投薬量は、治療または予防の状況の緊急性により示されるように、比例して増加または減少させてもよい。
経口適用のためには、錠剤、糖衣剤、液体剤、滴剤、坐剤、または、カプセル剤、カプレット剤、およびジェルカプセル剤が特に適している。経口用途が意図される組成物は、当技術分野において公知の任意の方法にしたがって調製され得、そのような組成物は、錠剤の製造に適している、不活性、非毒性の薬学的賦形剤からなる群より選択される1つまたは複数の剤を含有し得る。そのような賦形剤は、例えば、ラクトースなどの不活性希釈剤;コーンスターチなどの顆粒化および崩壊剤;デンプンなどの結合剤;ならびにステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤を含む。錠剤は、コーティングされていなくてもよいし、または、優雅のためもしくは活性成分の放出を遅延させるために、公知の技術によってコーティングされていてもよい。経口用途のための製剤はまた、活性成分が不活性希釈剤と混合されている硬いゼラチンカプセル剤として提示され得る
非経口投与のために、化合物は、注射もしくは注入、例えば、静脈内、筋肉内、もしくは皮下の注射もしくは注入用に、または、ボーラス用量での投与および/もしくは連続注入用に、製剤化されてもよい。懸濁剤、安定剤、および/または分散剤などの他の製剤用作用物質を任意で含有する、油性または水性ビヒクルにおける溶液、懸濁液、乳濁液が、使用され得る。
本発明の追加的な剤形は、米国特許第6,340,475号、第6,488,962号、第6,451,808号、第5,972,389号、第5,582,837号、および第5,007,790号に記載されているような剤形を含む。本発明の追加的な剤形はまた、米国特許出願第2003/0147952号、第2003/0104062号、第2003/0104053号、第2003/0044466号、第2003/0039688号、および第2002/0051820号に記載されているような剤形も含む。本発明の追加的な剤形はまた、PCT出願第WO 03/35041号、第WO 03/35040号、第WO 03/35029号、第WO 03/35177号、第WO 03/35039号、第WO 02/96404号、第WO 02/32416号、第WO 01/97783号、第WO 01/56544号、第WO 01/32217号、第WO 98/55107号、第WO 98/11879号、第WO 97/47285号、第WO 93/18755号、および第WO 90/11757号に記載されているような剤形も含む。
ある特定の態様において、本発明の製剤は、短期の、迅速な消失の、ならびに制御された、例えば、持続放出性、遅延放出性、および拍動放出性の製剤であり得るが、これらに限定されない。
化合物の治療的有効量または用量は、患者の年齢、性別、および体重、患者の現在の医学的状態、ならびに処置されるべき患者におけるパーキンソン病の進行に依存すると考えられる。当業者は、これらの要因および他の要因に依存して、適切な投薬量を決定することができるであろう。
細胞単離および培養:
培養ラット心臓微小血管内皮細胞(RHMVEC)は、VEC Technologies(Rensselaer, NY)から購入し、フィブロネクチンコーティングプレート上で、MCDB-131完全培地(VEC Technologies)中で増殖させた。BAECは、地元の屠殺場より得られたウシ大動脈から単離し、10% FBS(Hyclone)およびpen/strepを補給したDMEM(高グルコース;Cellgro)中で増殖させた。HUVECSは、ヒト臍帯から現地で単離し、内皮細胞増殖サプリメント(Invitrogen)、10% FBS、L-グルタミン(Invitrogen)、およびpen/strepを補給したM199培地(Invitrogen)中で増殖させた。
Novagen T7selectファージディスプレイシステムを、7merペプチドをランダムにコードするオリゴヌクレオチドのプールとともに、内皮細胞の取り込みを容易にするペプチドのランダムスクリーニングのために使用した。HindIII/XhoI部位を含有する7merランダムペプチドプライマーを、以下のように設計した:センスプライマー:
;アンチセンスプライマー
;配列中、N=A、T、C、G;およびB=G、C、T。
RHMVEC(80%コンフルエント;およそ2×107細胞/100mmディッシュ)をPBSで洗浄して、無血清培地中、37℃で30分間プレインキュベーションし、250の感染多重度(MOI)に達するようにT7ファージライブラリーの抽出物(5x109 pfu)を接種した。1時間、37℃でのインキュベーション後に、結合していないファージおよび弱く会合しているファージを細胞表面から除去するため、細胞を、氷冷PBSで洗浄し、0.1N HCl、pH 2.2で15秒間酸洗浄した。細胞をその後、トリプシン処理し、遠心分離して、氷上にて滅菌脱イオン水で溶解した。細胞破片を遠心分離により除去して、その前に内部移行したファージを含有する上清を、上述のように増幅し、各ラウンドの間に滴定して、各連続するラウンドの開始時に5 x 109 pfuの投入ファージを用いることを確実にした。6ラウンドの選択/増幅の完了後に、大腸菌BL21に結果として生じたファージを感染させてプレーティングし、個々のプラークを採取し、増幅し、配列決定した。
そのC末端
に融合された積荷を含むかまたは含まない、
に対応するペプチドを、Yale University School of MedicineのW.M. Keck biotechnology resource centerによって、標準的なFmoc化学を用いて合成し、質量分析法により解析して、純度を確認した。蛍光体(Endo5についてはカルボキシフルオレセイン、およびAPについてはローダミン)を、合成後にN末端に付加した。
VEGF誘導性NO放出実験を、以前に記載されているように行った。簡潔に言うと、コンフルエントのBAECを、ペプチドとともに6時間、無血清DMEM中でインキュベーションした。培地を除去して、VEGF(10-9 M)を含むかまたは含まない新鮮な無血清DMEMを30分間添加した。培地を収集し、細胞をトリプシン処理して計数し、上清中の亜硝酸レベルを、Sievers NO化学発光分析器を用いることによって測定した。
マウス皮膚における血漿漏出を、以前に記載されているようなマイルスアッセイを用いて研究した。簡潔に言うと、オスのスイスマウス(30〜35 g)に麻酔をかけて、エバンスブルー(PBS中30 mg/kg;Sigma)を注射した。カラシ油のアナログであるフェニルイソチオシアナート(鉱油中5%)(Pierce, Rockford, Illinois)を、綿棒で右耳上に塗布した。左耳は、対照として使用し、鉱油単独で処置した。30分後、麻酔をかけた動物を屠殺し、かん流して、耳を切除し、乾燥し、秤量した。エバンスブルーを、ホルムアミドで耳から抽出して、595 nmで分光光度的に定量した。
培養BAECを、6ウェルプレートにおいてコンフルエントに達するまで増殖させた。細胞を洗浄して、標識ペプチド(10-6 M)を含有する1 mLのDMEM中で1、2、4、または6時間37℃でインキュベーションし、0.1 Mグリシンを含有する冷PBS(pH 4)で3回洗浄して、非特異的な表面染色を除去した。完全な培地除去の後、細胞をトリプシン処理し、遠心分離して、150μLのSDSベースまたはTriton X-100溶解緩衝液を添加することによってタンパク質を抽出した。膜を遠心分離によって除去し、内部移行したペプチドを、蛍光プレートリーダー(Perseptive Biosystems)を用いることによって定量した。記載されているようにペプチドと5分間インキュベーションして洗浄した細胞を、基本の表面染色として使用した。使用した両方の蛍光体の直線性は、溶解溶液を用いて濃度-蛍光曲線を行うことによって決定した。各蛍光体での実験は、交差干渉を阻止するために個々で行った。
新しく単離したHUVECを、グルタミン、10%FBS、および内皮細胞増殖サプリメントを補給したM199培地中で、ガラス底を有するペトリ皿上で増殖させた。CPPは非特異的にガラスに結合するため、ガラス底ペトリ皿を、1%FBSを含む無色M199培地中に非標識APおよびEndo5を含有する(5 x 10-5 M)ブロッキング溶液で30分間前処置することによって、バックグラウンドの蛍光を低減させた。細胞播種後に、培地を除去して、カルボキシフルオレセイン標識Endo5およびローダミン標識APを細胞に添加し(10-5 M)、細胞を37℃、5%CO2で1時間インキュベーションした(パルス)。培地を除去して、細胞を温かい培養培地で1回リンスし、Zess Axiovert倒立蛍光顕微鏡上で、捕捉した画像のZスタックおよびその後の容積デコンボリューションを行うことによって(Openlabソフトウェア)、ペプチドの取り込みを迅速に視覚化した。新たな培地を細胞上にさらに2時間(全体で3時間)置いてCPPの局在をチェースし、細胞を再び視覚化した(チェース)。
データは、平均±S.E.である。分散の解析およびその後の独立スチューデントt検定によって、統計学的比較を行った。p<0.05の値が観察された場合に、データを有意に異なるとみなした。
平均で0.1〜1コピーのランダムに生成された7merペプチドをキャプシド上に発現するT7ファージディスプレイライブラリーを、生成した。キャプシド上の少ないペプチド数によって、その標的に強く結合するペプチドの選択に適するようになるため、このシステムを使用した。一定量の投入ファージ(5 x 109)を培養RHMVECに添加して、これらのファージを、細胞単層により急速に内部移行される(細胞の取り込み)能力について選択した。6ラウンドの感染/精製後に、同一の開始条件下で、0.018%(ラウンド1)から1.8%(ラウンド6)への、回収されたファージのパーセンテージの100倍の増加が観察され(表1)、結果として生じたファージライブラリーが、増強された内皮細胞内部移行特性を提示する証拠を提供した。各ラウンドの選択後の、ファージライブラリーの内皮細胞における内部移行の能力の解析によって、取り込みパーセンテージの指数関数的増加が示唆される(図1、指数関数との相関についてR2=0.975)。
中の終止コドンのランダムなかつ予想外の挿入が明らかになり、これは、我々のアプローチが生成することができる理論的なCPPサイズ(7アミノ酸)と比較してより小さいEndo5のサイズを、合理的に説明した。
AP-Cavは、培養内皮細胞においてアゴニスト誘導性eNOS活性を遮断し(Bucci et al., 2000, Nat. Med. 6:1362-7)、この生物活性は、AP-Cavの内部移行、投薬量、および前処置時間に依存する。本研究において、培養BAECによるNO放出に対する、Cavに融合されたEndo5(endo5-Cav)の効果を試験することによって、Endo5の取り込み潜在能力をAPのものと比較した。
EC由来のNO産生は、一部、毛細血管内圧の増大およびそれに続く血管透過性の増大を促進することにより、炎症において能動的役割を果たす。AP-Cavでのマウスの前処置は、マイルスアッセイにおいて血管漏出を遮断する(Bucci et al., 2000, Nat. Med. 6:1362-7;Bernatchez et al., 2005, Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 102:761-6)。したがって、この確立されたモデルは、Endo5融合ペプチドのインビボ効力を評価するための価値あるツールであり得る。
APは、ニューロンの膜を通過するCPPである(Joliot et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 88:1864-8)。本明細書において他の場所で議論されているように、Endo5は、予想外に、内皮細胞においてファージの高い内部移行を促進することが見出され、Endo5-Cavは、予想外に、eNOS活性化および血管透過性の阻止においてAP-Cavよりも強力であることが見出された。
細胞中へのCPP侵入に関与する取り込み機構に光をあてようと試みた以前の研究では、固定化細胞においてイメージングを行った。これらの研究の結果は、細胞固定がCPPの予想外の核移行をもたらすという増えていく証拠を考慮して、信頼できない可能性がある(Richard et al., 2003, J. Biol. Chem. 278:585-90)。
RHMVECを、1時間、5.0 x 109ファージ(投入)とともにインキュベーションし、溶解して、回収されたファージを定量し(細胞取り込み)、次のラウンドのバイオパンニングのために増幅した。回収パーセンテージを、投入ファージに対する回収されたファージの比として表す。
Claims (34)
- SEQ ID NO: 3〜6からなる群より選択されるアミノ酸配列のペプチドを含む積荷部分に連結されたアミノ酸配列RRPPR(SEQ ID NO: 1)からなる輸送ペプチドを含む、単離された輸送構築物、またはその塩もしくは溶媒和物。
- SEQ ID NO: 3〜6からなる群より選択されるアミノ酸配列のペプチドを含む積荷部分に連結されたSEQ ID NO: 1からなる、請求項1記載の輸送構築物。
- 薬学的に許容される担体をさらに含む薬学的組成物の一部である、請求項1記載の輸送構築物。
- 積荷部分に連結されたSEQ ID NO: 1からなる輸送ペプチドを含む、単離された輸送構築物、またはその塩もしくは溶媒和物であって、該積荷部分が、核酸;オリゴ糖;脂質;糖脂質;リポタンパク質;低分子化合物;治療薬;紫外可視、蛍光、または放射性標識;イメージング剤;診断剤;予防剤;リポソームおよびウイルスからなる群より選択される少なくとも1つである、輸送構築物、またはその塩もしくは溶媒和物。
- 積荷部分が、リンカーまたは化学結合を通して輸送ペプチドに共有結合で連結されている、請求項4記載の輸送構築物。
- リンカーがジスルフィド結合を含むか、または、積荷部分と輸送ペプチドとの間の化学結合がジスルフィド結合を含む、請求項5記載の輸送構築物。
- 積荷部分がペプチド部分を含み、かつ輸送ペプチドが、該積荷部分のペプチド部分のN末端にアミド結合を通して共有結合で連結されている、請求項5記載の輸送構築物。
- 薬学的に許容される担体をさらに含む薬学的組成物の一部である、請求項4記載の輸送構築物。
- SEQ ID NO: 3〜6からなる群より選択される少なくとも1つの積荷部分をコードする追加的な核酸をさらに含む、SEQ ID NO: 1からなる輸送ペプチドをコードする単離された核酸を含む、組成物。
- SEQ ID NO: 1からなる輸送ペプチドをコードする核酸を含み、SEQ ID NO: 3〜6からなる群より選択される少なくとも1つの積荷部分をコードする追加的な核酸をさらに含む、ベクター。
- 輸送ペプチドをコードする核酸の発現を可能にする転写活性化エレメントをさらに含む、請求項10記載のベクター。
- 輸送ペプチドをコードする核酸とインフレームで積荷部分をコードする核酸をさらに含む、請求項10記載のベクター。
- SEQ ID NO: 1からなる輸送ペプチドをコードする外来性核酸を含み、SEQ ID NO: 3〜6からなる群より選択される少なくとも1つの積荷部分をコードする追加的な核酸をさらに含む、単離された宿主細胞。
- 積荷部分を単離された標的細胞にまたはその中に送達する方法であって、該標的細胞を、SEQ ID NO: 1からなる輸送ペプチドに連結されている積荷部分を含む輸送構築物と接触させ、それにより該積荷部分が該標的細胞にまたはその中に送達される段階を含み、該積荷部分が、核酸;オリゴ糖;脂質;糖脂質;リポタンパク質;低分子化合物;治療薬;紫外可視、蛍光、または放射性標識;イメージング剤;診断剤;予防剤;リポソームおよびウイルスからなる群より選択される少なくとも1つである、方法。
- 積荷部分が、リンカーまたは化学結合を通して輸送ペプチドに共有結合で連結されている、請求項14記載の方法。
- リンカーがジスルフィド結合を含むか、または、積荷部分と輸送ペプチドとの間の化学結合がジスルフィド結合を含む、請求項15記載の方法。
- 単離された標的細胞が、内皮細胞、心臓細胞、免疫細胞、骨格筋細胞、および脳細胞からなる群より選択される少なくとも1つを含む、請求項14記載の方法。
- 単離された細胞が単離された哺乳動物細胞である、請求項14記載の方法。
- 哺乳動物がヒトである、請求項18記載の方法。
- SEQ ID NO: 3〜6からなる群より選択されるアミノ酸配列のペプチドを含む積荷部分を、それを必要とする対象の標的細胞にまたはその中に送達するための、SEQ ID NO: 1からなる輸送ペプチドに連結されている該積荷部分を含む輸送構築物の治療的有効量を含む薬学的組成物。
- 積荷部分が、リンカーまたは化学結合を通して輸送ペプチドに共有結合で連結されている、請求項20記載の薬学的組成物。
- リンカーがジスルフィド結合を含むか、または、積荷部分と輸送ペプチドとの間の化学結合がジスルフィド結合を含む、請求項21記載の薬学的組成物。
- 積荷部分がペプチド部分を含み、かつ輸送ペプチドが、該積荷部分のペプチド部分のN末端またはC末端にアミド結合を通して共有結合で連結されている、請求項21記載の薬学的組成物。
- 標的細胞が、内皮細胞、心臓細胞、免疫細胞、骨格筋細胞、および脳細胞からなる群より選択される少なくとも1つを含む、請求項20記載の薬学的組成物。
- 輸送構築物が、経口、経粘膜、局所、経皮、皮内、皮下、眼、硝子体内、結膜下、脈絡膜上、前房内、吸入、気管支内、肺、静脈内、動脈内、十二指腸内、膀胱内、非経口、クモ膜下腔内、筋肉内、および胃内からなる群より選択される少なくとも1つの経路によって対象に投与される、請求項20記載の薬学的組成物。
- 対象が哺乳動物である、請求項20記載の薬学的組成物。
- 哺乳動物がヒトである、請求項26記載の薬学的組成物。
- 積荷部分を単離された標的細胞にまたはその中に送達する方法であって、該標的細胞を、SEQ ID NO: 3〜6からなる群より選択される配列を含む積荷部分に連結されたSEQ ID NO: 1からなる輸送ペプチドを含む輸送構築物と接触させ、それにより該積荷部分が該標的細胞にまたはその中に送達される段階を含む、方法。
- 輸送ペプチドが、リンカーまたは化学結合を通して積荷部分に共有結合で連結されている、請求項28記載の方法。
- リンカーがジスルフィド結合を含むか、または、積荷部分と輸送ペプチドとの間の化学結合がジスルフィド結合を含む、請求項29記載の方法。
- 積荷部分がペプチド部分を含み、かつ輸送ペプチドが、該積荷部分のペプチド部分のN末端またはC末端にアミド結合を通して共有結合で連結されている、請求項29記載の方法。
- 単離された標的細胞が、内皮細胞、心臓細胞、免疫細胞、骨格筋細胞、および脳細胞からなる群より選択される少なくとも1つを含む、請求項28記載の方法。
- 単離された細胞が単離された哺乳動物細胞である、請求項28記載の方法。
- 哺乳動物がヒトである、請求項33記載の方法。
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