JPH07213280A - 耐熱性エステラーゼ - Google Patents
耐熱性エステラーゼInfo
- Publication number
- JPH07213280A JPH07213280A JP6011014A JP1101494A JPH07213280A JP H07213280 A JPH07213280 A JP H07213280A JP 6011014 A JP6011014 A JP 6011014A JP 1101494 A JP1101494 A JP 1101494A JP H07213280 A JPH07213280 A JP H07213280A
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- JP
- Japan
- Prior art keywords
- amino acid
- esterase
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- type
- acid sequence
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- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【構成】配列番号１で示されるアミノ酸配列において１
６０番目および／または１８９番目のアミノ酸に部位特
異的変異を有するアミノ酸配列であり、かつ少なくとも
１番目から３６２番目までの３６２個のアミノ酸からな
ることを特徴とするエステラーゼ。 【効果】本発明により、有機合成反応において、熱安定
性に優れたエステラーゼの利用を可能とした。また、本
発明遺伝子を含有するＤＮＡ断片をベクターＤＮＡに組
み込んだプラスミドを構築し、該プラスミドが微生物に
導入された形質転換体微生物を培養することによって、
耐熱性エステラーゼを効率良く製造することができるよ
うになった。
６０番目および／または１８９番目のアミノ酸に部位特
異的変異を有するアミノ酸配列であり、かつ少なくとも
１番目から３６２番目までの３６２個のアミノ酸からな
ることを特徴とするエステラーゼ。 【効果】本発明により、有機合成反応において、熱安定
性に優れたエステラーゼの利用を可能とした。また、本
発明遺伝子を含有するＤＮＡ断片をベクターＤＮＡに組
み込んだプラスミドを構築し、該プラスミドが微生物に
導入された形質転換体微生物を培養することによって、
耐熱性エステラーゼを効率良く製造することができるよ
うになった。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、エステル加水分解反
応、エステル合成反応、エステル交換反応等に用いられ
る耐熱性である変異エステラーゼ、該酵素をコードする
遺伝子、該遺伝子を含有するプラスミド、該プラスミド
を含有する微生物、さらには該微生物を培養し、該微生
物によってエステラーゼを生産させることを特徴とする
変異エステラーゼの製造法に関するものである。
応、エステル合成反応、エステル交換反応等に用いられ
る耐熱性である変異エステラーゼ、該酵素をコードする
遺伝子、該遺伝子を含有するプラスミド、該プラスミド
を含有する微生物、さらには該微生物を培養し、該微生
物によってエステラーゼを生産させることを特徴とする
変異エステラーゼの製造法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】エステラーゼは、エステル結合を加水分
解する酵素であり、同時にエステル合成およびエステル
交換反応に対する触媒能を有するため、近年、有機合成
反応に利用される試みが盛んに行われている。この場
合、目的とする有機合成反応において優れた触媒活性を
発揮するエステラーゼを第１目標として探索し、最適な
ものを選抜して用いている。
解する酵素であり、同時にエステル合成およびエステル
交換反応に対する触媒能を有するため、近年、有機合成
反応に利用される試みが盛んに行われている。この場
合、目的とする有機合成反応において優れた触媒活性を
発揮するエステラーゼを第１目標として探索し、最適な
ものを選抜して用いている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、このよ
うに選抜されたエステラーゼを生体外で利用するには、
温度・ｐＨ・溶媒・圧力等に対する蛋白質の安定性も高
くしなければならないが、必ずしも優れた触媒活性を有
するものが、蛋白質の安定性においても優れているとは
いえない。その中でも温度、即ち熱安定性を高めること
は、反応速度を高め（反応時間の短縮）、かつ失活を抑
制する（反応効率の向上）ことに役立つために特に重要
であり、工業化において必須なことである。
うに選抜されたエステラーゼを生体外で利用するには、
温度・ｐＨ・溶媒・圧力等に対する蛋白質の安定性も高
くしなければならないが、必ずしも優れた触媒活性を有
するものが、蛋白質の安定性においても優れているとは
いえない。その中でも温度、即ち熱安定性を高めること
は、反応速度を高め（反応時間の短縮）、かつ失活を抑
制する（反応効率の向上）ことに役立つために特に重要
であり、工業化において必須なことである。
【０００４】
【課題を解決するための手段】このような状況下で、本
発明者らは、遺伝子の部位特異的変異導入技術を用い
て、鋭意検討を行った結果、ある種の野生型のエステラ
ーゼが有するアミノ酸配列において、ある特定のアミノ
酸に変異を導入したアミノ酸配列を有する変異型エステ
ラーゼが極めて高い熱安定性を示すことを見い出し、本
発明を完成した。即ち、本発明は、配列番号１で示され
るアミノ酸配列における１６０番目および／または１８
９番目のアミノ酸に部位特異的変異を有するアミノ酸配
列であり、かつ該アミノ酸配列のうち少なくとも耐熱性
のエステラーゼ活性が機能する部分アミノ酸配列を有す
ることを特徴とする変異エステラーゼ（以下、本発明酵
素と記す。）、該酵素をコードする遺伝子（以下、本発
明遺伝子と記す。）、該遺伝子を含有するプラスミド
（以下、本発明プラスミドと記す。）、該プラスミドを
含有する微生物（以下、本発明微生物と記す。）、さら
には該微生物を培養し、該微生物によってエステラーゼ
を生産させることを特徴とする変異エステラーゼの製造
方法（以下、本発明製造方法と記す。）を提出するもの
である。
発明者らは、遺伝子の部位特異的変異導入技術を用い
て、鋭意検討を行った結果、ある種の野生型のエステラ
ーゼが有するアミノ酸配列において、ある特定のアミノ
酸に変異を導入したアミノ酸配列を有する変異型エステ
ラーゼが極めて高い熱安定性を示すことを見い出し、本
発明を完成した。即ち、本発明は、配列番号１で示され
るアミノ酸配列における１６０番目および／または１８
９番目のアミノ酸に部位特異的変異を有するアミノ酸配
列であり、かつ該アミノ酸配列のうち少なくとも耐熱性
のエステラーゼ活性が機能する部分アミノ酸配列を有す
ることを特徴とする変異エステラーゼ（以下、本発明酵
素と記す。）、該酵素をコードする遺伝子（以下、本発
明遺伝子と記す。）、該遺伝子を含有するプラスミド
（以下、本発明プラスミドと記す。）、該プラスミドを
含有する微生物（以下、本発明微生物と記す。）、さら
には該微生物を培養し、該微生物によってエステラーゼ
を生産させることを特徴とする変異エステラーゼの製造
方法（以下、本発明製造方法と記す。）を提出するもの
である。
【０００５】以下、さらに詳細に本発明を説明する。本
発明酵素には、配列番号１で示されるアミノ酸配列にお
ける１６０番目および／または１８９番目のアミノ酸に
部位特異的変異を有するアミノ酸配列であり、かつ該ア
ミノ酸配列のうち少なくとも耐熱性のエステラーゼ活性
が機能する部分アミノ酸配列を有するすべての変異エス
テラーゼが含まれる。なお、上記の部位特異的変異を有
するアミノ酸配列のうち少なくとも耐熱性のエステラー
ゼ活性が機能する部分アミノ酸配列とは、たとえば、配
列番号１で示されるアミノ酸配列における少なくとも１
番目から３６２番目までの３６２個のアミノ酸からなる
エステラーゼおよびその等価体をあげることができる。
配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するエステラー
ゼ（以下、野生型エステラーゼと記す。）は、クロモバ
クテリウム（Chromobacterium）属に属する微生物であ
る Chromobacterium SC-YM-1 （工業技術院 生命工学
技術研究所 寄託番号 ＦＥＲＭ Ｐ−１４００９）由
来のものであり、その分子量は３９３４８である。この
野生型エステラーゼをコードする遺伝子（以下、野生型
遺伝子と記す。）は、例えばJ.Sambrook、 E.F.Fritsch
、 T.Maniatis著；モレキュラークローニング 第２版
(Molecular Cloning 2nd edition) 、コールドスプリン
グハーバー ラボラトリー(Cold Spring Harbor Labora
tory) 発行、１９８９年等に記載の通常の遺伝子工学的
手法に準じて得られる。即ち、培養して得た微生物菌体
より通常の方法に準じて、ゲノムＤＮＡを抽出する。微
生物菌体を超音波破砕等の通常の方法によって破壊し
て、そしてプロテアーゼ処理等を行った後、ゲノムＤＮ
Ａを抽出する。得られたゲノムＤＮＡを適当な制限酵素
で切断し、例えば、ファージベクターであるλgt11、あ
るいはプラスミドベクターであるｐＵＣ１９などにリガ
ーゼを用いて挿入することによりゲノムＤＮＡライブラ
リーを作製する。それを例えば、エステラーゼに対する
抗体を用いた免疫学的方法、エステラーゼの部分アミノ
酸配列に対応した合成ＤＮＡプローブを用いたハイブリ
ダイゼーション法、エステラーゼの活性を測定する方法
等のスクリーニング法により、野生型遺伝子を取得する
ことができる。
発明酵素には、配列番号１で示されるアミノ酸配列にお
ける１６０番目および／または１８９番目のアミノ酸に
部位特異的変異を有するアミノ酸配列であり、かつ該ア
ミノ酸配列のうち少なくとも耐熱性のエステラーゼ活性
が機能する部分アミノ酸配列を有するすべての変異エス
テラーゼが含まれる。なお、上記の部位特異的変異を有
するアミノ酸配列のうち少なくとも耐熱性のエステラー
ゼ活性が機能する部分アミノ酸配列とは、たとえば、配
列番号１で示されるアミノ酸配列における少なくとも１
番目から３６２番目までの３６２個のアミノ酸からなる
エステラーゼおよびその等価体をあげることができる。
配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するエステラー
ゼ（以下、野生型エステラーゼと記す。）は、クロモバ
クテリウム（Chromobacterium）属に属する微生物であ
る Chromobacterium SC-YM-1 （工業技術院 生命工学
技術研究所 寄託番号 ＦＥＲＭ Ｐ−１４００９）由
来のものであり、その分子量は３９３４８である。この
野生型エステラーゼをコードする遺伝子（以下、野生型
遺伝子と記す。）は、例えばJ.Sambrook、 E.F.Fritsch
、 T.Maniatis著；モレキュラークローニング 第２版
(Molecular Cloning 2nd edition) 、コールドスプリン
グハーバー ラボラトリー(Cold Spring Harbor Labora
tory) 発行、１９８９年等に記載の通常の遺伝子工学的
手法に準じて得られる。即ち、培養して得た微生物菌体
より通常の方法に準じて、ゲノムＤＮＡを抽出する。微
生物菌体を超音波破砕等の通常の方法によって破壊し
て、そしてプロテアーゼ処理等を行った後、ゲノムＤＮ
Ａを抽出する。得られたゲノムＤＮＡを適当な制限酵素
で切断し、例えば、ファージベクターであるλgt11、あ
るいはプラスミドベクターであるｐＵＣ１９などにリガ
ーゼを用いて挿入することによりゲノムＤＮＡライブラ
リーを作製する。それを例えば、エステラーゼに対する
抗体を用いた免疫学的方法、エステラーゼの部分アミノ
酸配列に対応した合成ＤＮＡプローブを用いたハイブリ
ダイゼーション法、エステラーゼの活性を測定する方法
等のスクリーニング法により、野生型遺伝子を取得する
ことができる。
【０００６】得られた野生型遺伝子に下記の部位特異的
変異を導入することによって、本発明遺伝子を調製する
ことができる。部位特異的変異導入法は、原型の遺伝子
（ここでは野生型遺伝子である。）が組み込まれたプラ
スミドの１本鎖ＤＮＡを鋳型にして、変異を導入する塩
基配列を含む合成オリゴヌクレオチドをプライマーとし
て変異型の遺伝子（ここでは本発明遺伝子である。）を
合成するものである。本発明では、配列番号１で示され
るアミノ酸配列において１６０番目および／または１８
９番目のアミノ酸がグリシン以外の他のアミノ酸に置換
されるように変異プライマーを調製し、ＰＣＲ法による
増幅を行えば良い。好ましくは、１６０番目のアミノ酸
が下記のアミノ酸からなるＡ群から選ばれ、かつ１８９
番目のアミノ酸が下記のアミノ酸からなるＢ群から選ば
れるアミノ酸に置換されるような特異的変異が良い。 （Ａ群）アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、
セリン （Ｂ群）アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、
セリン、スレオニン、フェニルアラニン、ヒスチジン、
チロシン、アルギニン さらに好ましくは、１６０番目および１８９番目のアミ
ノ酸に同時に特異的変異を導入することがあげられる。
なお、上記以外の部位特異的変異の方法としては、例え
ばSmith ら（Genetic Engineering 3 1 Setlow,J.and H
ollaender,A Plenum:New York ）、Vlasukら（Experime
ntal Manipulation of Gene Expression,Inouye,M.:Aca
demic Press,New York）、Hos.N.Huntら（Gene,77,51,1
989 ）の方法等があげられる。
変異を導入することによって、本発明遺伝子を調製する
ことができる。部位特異的変異導入法は、原型の遺伝子
（ここでは野生型遺伝子である。）が組み込まれたプラ
スミドの１本鎖ＤＮＡを鋳型にして、変異を導入する塩
基配列を含む合成オリゴヌクレオチドをプライマーとし
て変異型の遺伝子（ここでは本発明遺伝子である。）を
合成するものである。本発明では、配列番号１で示され
るアミノ酸配列において１６０番目および／または１８
９番目のアミノ酸がグリシン以外の他のアミノ酸に置換
されるように変異プライマーを調製し、ＰＣＲ法による
増幅を行えば良い。好ましくは、１６０番目のアミノ酸
が下記のアミノ酸からなるＡ群から選ばれ、かつ１８９
番目のアミノ酸が下記のアミノ酸からなるＢ群から選ば
れるアミノ酸に置換されるような特異的変異が良い。 （Ａ群）アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、
セリン （Ｂ群）アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、
セリン、スレオニン、フェニルアラニン、ヒスチジン、
チロシン、アルギニン さらに好ましくは、１６０番目および１８９番目のアミ
ノ酸に同時に特異的変異を導入することがあげられる。
なお、上記以外の部位特異的変異の方法としては、例え
ばSmith ら（Genetic Engineering 3 1 Setlow,J.and H
ollaender,A Plenum:New York ）、Vlasukら（Experime
ntal Manipulation of Gene Expression,Inouye,M.:Aca
demic Press,New York）、Hos.N.Huntら（Gene,77,51,1
989 ）の方法等があげられる。
【０００７】この様にして調製された本発明遺伝子を利
用すれば、通常の遺伝子工学的方法に準じて、エステラ
ーゼを大量に製造、取得することができる。より詳細に
は、本発明遺伝子が宿主微生物細胞中で発現できるよう
なプラスミドを作製し、これを宿主微生物細胞に導入し
て形質転換し、該形質転換体微生物を培養すればよい。
上記のプラスミドとしては、宿主微生物細胞中で複製可
能な遺伝情報を含み、自立的に増殖できるものであっ
て、宿主からの単離・精製が容易であり、検出可能なマ
ーカーをもつ発現ベクターに、本発明遺伝子を導入した
ものを好ましくあげることができる。なお、発現ベクタ
ーは各種のものが既に市販されており、これに本発明遺
伝子を導入するために用いられる発現ベクター切断用制
限酵素も市販されている。例えば、大腸菌での発現に
は、ｌａｃ，ｔｒｐ，ｔａｃなどのプロモーターを含む
発現ベクター（これらは、発現ベクターとしてあるいは
プロモーターカートリッジとしてファルマシアＰＬ社よ
り市販されている）を用いることができる。さらには本
発明遺伝子上流にリボゾーム結合領域を連結することに
より、より高発現が可能となる。リボゾーム結合領域と
してはGuarente.Lら（Cell 20 p543(1980)） の報告や
谷口ら（Genetics of Industrial Microorganismsp202
(1982) 講談社）の報告が知られているが、望ましくは
本発明遺伝子の発現に適したリボゾーム結合領域を設計
し、合成してもよい。
用すれば、通常の遺伝子工学的方法に準じて、エステラ
ーゼを大量に製造、取得することができる。より詳細に
は、本発明遺伝子が宿主微生物細胞中で発現できるよう
なプラスミドを作製し、これを宿主微生物細胞に導入し
て形質転換し、該形質転換体微生物を培養すればよい。
上記のプラスミドとしては、宿主微生物細胞中で複製可
能な遺伝情報を含み、自立的に増殖できるものであっ
て、宿主からの単離・精製が容易であり、検出可能なマ
ーカーをもつ発現ベクターに、本発明遺伝子を導入した
ものを好ましくあげることができる。なお、発現ベクタ
ーは各種のものが既に市販されており、これに本発明遺
伝子を導入するために用いられる発現ベクター切断用制
限酵素も市販されている。例えば、大腸菌での発現に
は、ｌａｃ，ｔｒｐ，ｔａｃなどのプロモーターを含む
発現ベクター（これらは、発現ベクターとしてあるいは
プロモーターカートリッジとしてファルマシアＰＬ社よ
り市販されている）を用いることができる。さらには本
発明遺伝子上流にリボゾーム結合領域を連結することに
より、より高発現が可能となる。リボゾーム結合領域と
してはGuarente.Lら（Cell 20 p543(1980)） の報告や
谷口ら（Genetics of Industrial Microorganismsp202
(1982) 講談社）の報告が知られているが、望ましくは
本発明遺伝子の発現に適したリボゾーム結合領域を設計
し、合成してもよい。
【０００８】宿主微生物細胞としては、真核生物および
原核生物のいずれも用いることができ、例えば大腸菌等
をあげることができる。なお、該宿主微生物細胞に、通
常の遺伝子工学的方法により、上記プラスミドを導入す
ることができる。大腸菌の培養は通常の方法によって行
うことができる。例えば適当な炭素源、窒素源およびビ
タミン等の微量栄養物を適宜含む培地中で培養を行う。
培養方法としては、固体培養、液体培養のいずれでも可
能であるが、好ましくは、通気撹拌培養方法をあげるこ
とができる。この様にして得られた本発明微生物の培養
菌体からのエステラーゼの採取は、適宜通常の単離・精
製の方法を組み合わせて実施すれば良く、例えば、培養
終了後、菌体を遠心分離等で集め、破砕または溶菌せし
め、イオン交換，疎水，ゲルろ過等の各種クロマトグラ
フィーを用いた工程を組み合わせて精製すれば良い。こ
うして製造した耐熱性エステラーゼを産生する組換え体
微生物は、エステル加水分解を行うバイオリアクターと
して、例えば医薬品，農薬品の中間体など有用な化合物
の生産に利用することが可能である。また、組換え体微
生物を培養することによって耐熱性エステラーゼを大量
に生産し、それをエンザイムリアクターとして利用する
ことができる。
原核生物のいずれも用いることができ、例えば大腸菌等
をあげることができる。なお、該宿主微生物細胞に、通
常の遺伝子工学的方法により、上記プラスミドを導入す
ることができる。大腸菌の培養は通常の方法によって行
うことができる。例えば適当な炭素源、窒素源およびビ
タミン等の微量栄養物を適宜含む培地中で培養を行う。
培養方法としては、固体培養、液体培養のいずれでも可
能であるが、好ましくは、通気撹拌培養方法をあげるこ
とができる。この様にして得られた本発明微生物の培養
菌体からのエステラーゼの採取は、適宜通常の単離・精
製の方法を組み合わせて実施すれば良く、例えば、培養
終了後、菌体を遠心分離等で集め、破砕または溶菌せし
め、イオン交換，疎水，ゲルろ過等の各種クロマトグラ
フィーを用いた工程を組み合わせて精製すれば良い。こ
うして製造した耐熱性エステラーゼを産生する組換え体
微生物は、エステル加水分解を行うバイオリアクターと
して、例えば医薬品，農薬品の中間体など有用な化合物
の生産に利用することが可能である。また、組換え体微
生物を培養することによって耐熱性エステラーゼを大量
に生産し、それをエンザイムリアクターとして利用する
ことができる。
【０００９】
【実施例】以下に、実施例をあげ、さらに詳細に本発明
を説明するが、本発明はこれらによって何ら限定される
ものではない。
を説明するが、本発明はこれらによって何ら限定される
ものではない。
【００１０】実施例１ （鋳型ＤＮＡである野生型遺伝
子の調製：ゲノムＤＮＡの調製） クロモバクテリウムＳＣ−ＹＭ−１（ＦＥＲＭ Ｐ−１
４００９）を、５ｍｌの前培養用培地（グルコース１％
(W/V) 、酵母エキス１％(W/V) 、Ｋ2 ＨＰＯ4０. １％
(W/V) 、ＭｇＳＯ4 ０. ０２％(W/V) 、ｐＨ７. ３）
で、３０℃ ２４時間振盪培養した後、得られた培養液
を１０００ｍｌの本培養用培地（グルコース１％(W/V)
、酵母エキス１％(W/V) 、Ｋ2 ＨＰＯ4 ０. １％(W/V)
、ＭｇＳＯ4 ０. ０２％(W/V) 、ｐＨ７. ３）に接種
し、３０℃で培養した。その際、ＯＤ660 が３. ４に達
した時点で、ペニシリンＧを最終濃度として２ユニット
／ｍｌ培養液になるように添加し、ＯＤ660 が１０に達
するまで培養を継続した。遠心分離（８０００ｇ、１０
分、４℃）により菌体を回収し、８０ｍｌの１０ｍＭト
リス塩酸緩衝液（ｐＨ８. ０）、２５％(W/V) ショ糖溶
液に卵白リゾチーム（生化学工業社製）を最終濃度が５
ｍｇ／ｍｌになるように添加して、３７℃で３０分間イ
ンキュベートした。次に１０ｍｌの１０％(W/V) ＳＤＳ
を添加し、さらにプロテアーゼＫ（ベーリンガー社製）
を最終濃度２００μｇ／ｍｌになるように添加し、３７
℃で３時間インキュベートした。その後、等量の０．１
Ｍトリス飽和フェノールで３回、エーテルで２回抽出を
行った後、水層に２倍容のエタノールを添加し、核酸を
沈澱させ、遠心分離（１２０００ｇ、３０分、４℃）し
た。得られた核酸を乾燥後、２０ｍｌのトリスＥＤＴＡ
緩衝液（１０ｍＭトリス塩酸、１ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ
８. ０）に溶解し、ＣｓＣｌ−ＥｔＢｒ平衡密度勾配超
遠心分離（２７５０００ｇ、１８時間、２５℃）し、Ｄ
ＮＡのバンドを回収し、それをトリスＥＤＴＡ緩衝液
（１０ｍＭトリス塩酸、１ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ８. ０）
に対し透析し、約５. ４ｍｇ のゲノムＤＮＡを得た。
子の調製：ゲノムＤＮＡの調製） クロモバクテリウムＳＣ−ＹＭ−１（ＦＥＲＭ Ｐ−１
４００９）を、５ｍｌの前培養用培地（グルコース１％
(W/V) 、酵母エキス１％(W/V) 、Ｋ2 ＨＰＯ4０. １％
(W/V) 、ＭｇＳＯ4 ０. ０２％(W/V) 、ｐＨ７. ３）
で、３０℃ ２４時間振盪培養した後、得られた培養液
を１０００ｍｌの本培養用培地（グルコース１％(W/V)
、酵母エキス１％(W/V) 、Ｋ2 ＨＰＯ4 ０. １％(W/V)
、ＭｇＳＯ4 ０. ０２％(W/V) 、ｐＨ７. ３）に接種
し、３０℃で培養した。その際、ＯＤ660 が３. ４に達
した時点で、ペニシリンＧを最終濃度として２ユニット
／ｍｌ培養液になるように添加し、ＯＤ660 が１０に達
するまで培養を継続した。遠心分離（８０００ｇ、１０
分、４℃）により菌体を回収し、８０ｍｌの１０ｍＭト
リス塩酸緩衝液（ｐＨ８. ０）、２５％(W/V) ショ糖溶
液に卵白リゾチーム（生化学工業社製）を最終濃度が５
ｍｇ／ｍｌになるように添加して、３７℃で３０分間イ
ンキュベートした。次に１０ｍｌの１０％(W/V) ＳＤＳ
を添加し、さらにプロテアーゼＫ（ベーリンガー社製）
を最終濃度２００μｇ／ｍｌになるように添加し、３７
℃で３時間インキュベートした。その後、等量の０．１
Ｍトリス飽和フェノールで３回、エーテルで２回抽出を
行った後、水層に２倍容のエタノールを添加し、核酸を
沈澱させ、遠心分離（１２０００ｇ、３０分、４℃）し
た。得られた核酸を乾燥後、２０ｍｌのトリスＥＤＴＡ
緩衝液（１０ｍＭトリス塩酸、１ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ
８. ０）に溶解し、ＣｓＣｌ−ＥｔＢｒ平衡密度勾配超
遠心分離（２７５０００ｇ、１８時間、２５℃）し、Ｄ
ＮＡのバンドを回収し、それをトリスＥＤＴＡ緩衝液
（１０ｍＭトリス塩酸、１ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ８. ０）
に対し透析し、約５. ４ｍｇ のゲノムＤＮＡを得た。
【００１１】実施例２ （鋳型ＤＮＡである野生型遺伝
子の調製：ゲノムＤＮＡライブラリーの作製） 実施例１で得たゲノムＤＮＡ１００μｇをＸｈｏＩ（宝
酒造社製制限酵素）で消化し、ゲノムＤＮＡ断片を得
た。一方、λファージλＺＡＰＩＩ（ストラタジーン社
製）１μｇを同じくＸｈｏＩで消化後、前記ゲノムＤＮ
Ａ断片と混合し、リガーゼ（宝酒造社製）を加え、１６
℃一夜反応した。つぎにこの反応液をインビトロパッケ
ージングキット（ストラタジーン社製）を用いて大腸菌
ＸＬ−１ｂｌｕｅ株（キットに添付）にパッケージング
し、ゲノムＤＮＡライブラリーを作製した。
子の調製：ゲノムＤＮＡライブラリーの作製） 実施例１で得たゲノムＤＮＡ１００μｇをＸｈｏＩ（宝
酒造社製制限酵素）で消化し、ゲノムＤＮＡ断片を得
た。一方、λファージλＺＡＰＩＩ（ストラタジーン社
製）１μｇを同じくＸｈｏＩで消化後、前記ゲノムＤＮ
Ａ断片と混合し、リガーゼ（宝酒造社製）を加え、１６
℃一夜反応した。つぎにこの反応液をインビトロパッケ
ージングキット（ストラタジーン社製）を用いて大腸菌
ＸＬ−１ｂｌｕｅ株（キットに添付）にパッケージング
し、ゲノムＤＮＡライブラリーを作製した。
【００１２】実施例３ （鋳型ＤＮＡである野生型遺伝
子の調製：ゲノムＤＮＡライブラリーのスクリーニン
グ） １．合成ＤＮＡプローブの作製およびアイソトープ標識 鋳型ＤＮＡである野生型エステラーゼのＮ末端アミノ酸
配列をもとに下記に示す４４ｍｅｒのオリゴヌクレオチ
ド（混合プローブ：配列番号２および３）を合成した。 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Thr Leu Phe Asp Gly Ile Thr Ser Arg Ile Val Asp Thr Asp Arg 5' ACI CTI TTC GAC GGI ATC ACI TGI CGI ATC GTI GAC ACI GAC CG 3' C オリゴヌクレオチドの合成は、ＤＮＡ自動合成機（アプ
ライド バイオシステムズ モデル３８０Ａ）を用いて
行った。このプローブＤＮＡ５０ｐｍｏｌに３μｌの
０. ５Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７. ６）、０. １ＭＭ
ｇＣｌ2 、０. ０５ＭＤＴＴ、０. ００１ＭＥＤＴＡ、
１０ｕｎｉｔｓＴ４ポリヌクレオチドカイネース（宝酒
造社製）、１０μｌ［γ32Ｐ］ＡＴＰ（アマーシャム社
製）を混合し、３７℃、６０分反応させた後、セファデ
ックスＧ−５０（ファルマシア社製）によるゲルろ過を
行うことによりアイソトープ標識したＤＮＡプローブを
調製した。 ２．ゲノムＤＮＡライブラリーのスクリーニング 実施例２で示したように、インビトロパッケージングキ
ット（ストラタジーン社製）を用いて、ファージで感染
させた大腸菌をプレーティングし、プレートを４℃に冷
やした後、表面にニトロセルロースフィルターを密着さ
せてファージをフィルター上に移した。フィルターを
１. ５Ｍ ＮａＣｌ- ０. ５Ｍ ＮａＯＨ溶液に浸し、
付着したＤＮＡを変性させ、ついで１. ５Ｍ ＮａＣｌ
- ０. ５Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８. ０）溶液で中和
した。その後０. ３６Ｍ ＮａＣｌ- ２０ｍＭＮａＨ2
ＰＯ4 （ｐＨ７. ５）- ２ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ７.
５）でフィルターを洗浄した後乾燥させた。次に、上記
のようにして調製した野生型エステラーゼのＮ末端アミ
ノ酸配列に対応するアイソトープ標識したＤＮＡプロー
ブを用いて、実施例２で作製されたゲノムＤＮＡライブ
ラリーを以下の方法に従いプラークハイブリダイゼーシ
ョンを行った。すなわち、フィルターを１）４ｘＳＳ
Ｃ，１％(W/V) ＳＤＳ、１０ｘデンハルト（０. ２％(W
/V) フィコール、０. ２％(W/V) ポリビニルピロリド
ン、０. ２％(W/V) ウシ血清アルブミン）を含む溶液で
６０℃、３０分インキュベートした後、２）５ｘＳＳ
Ｃ、５ｘデンハルト、１００μｇ／ｍｌサケ精巣ＤＮＡ
を含む溶液で、６０℃、５時間インキュベートし、反応
を行った。ハイブリダイゼーションは、プラスティック
バックにフィルターと上記２）の溶液を加え、アイソト
ープ標識したＤＮＡプローブをフィルター１枚当たり約
５ｘ１０5 ｃｐｍ 添加して、６０℃で一夜行った。ハ
イブリダイゼーションを行ったフィルターは、１）２ｘ
ＳＳＣ、０. ５％(W/V) ＳＤＳを含む溶液で６０℃、１
５分、２）２ｘＳＳＣ、０. ５％(W/V) ＳＤＳを含む溶
液で２５℃、３０分、３）２ｘＳＳＣ、０. ５％ＳＤＳ
(W/V) を含む溶液で６０℃、１５分の順に洗浄した後、
風乾し、Ｘ線フィルム（ＦＵＪＩ ＲＸ）と増感紙をあ
て、−８０℃、一夜オートラジオグラムをとった。この
結果、ポジティブシグナルを与えるｐＣＣ３株を得た。
ダイデオキシ法により、塩基配列を決定した結果、得ら
れたクローン株は、エステラーゼ遺伝子の全長をコード
してはいなかった。そこでその配列の一部をＤＮＡプロ
ーブとして再度、プラークハイブリダイゼーションによ
るスクリーニングを行った。その際ゲノムＤＮＡをＳａ
ｕ３ＡＩで部分消化し、同様にλファージλＺＡＰＩＩ
（ストラタジーン社製）に連結して作製したライブラリ
ーを使用した。その結果、ポジティブシグナルを与える
野生型遺伝子クローンを９株取得した。
子の調製：ゲノムＤＮＡライブラリーのスクリーニン
グ） １．合成ＤＮＡプローブの作製およびアイソトープ標識 鋳型ＤＮＡである野生型エステラーゼのＮ末端アミノ酸
配列をもとに下記に示す４４ｍｅｒのオリゴヌクレオチ
ド（混合プローブ：配列番号２および３）を合成した。 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Thr Leu Phe Asp Gly Ile Thr Ser Arg Ile Val Asp Thr Asp Arg 5' ACI CTI TTC GAC GGI ATC ACI TGI CGI ATC GTI GAC ACI GAC CG 3' C オリゴヌクレオチドの合成は、ＤＮＡ自動合成機（アプ
ライド バイオシステムズ モデル３８０Ａ）を用いて
行った。このプローブＤＮＡ５０ｐｍｏｌに３μｌの
０. ５Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７. ６）、０. １ＭＭ
ｇＣｌ2 、０. ０５ＭＤＴＴ、０. ００１ＭＥＤＴＡ、
１０ｕｎｉｔｓＴ４ポリヌクレオチドカイネース（宝酒
造社製）、１０μｌ［γ32Ｐ］ＡＴＰ（アマーシャム社
製）を混合し、３７℃、６０分反応させた後、セファデ
ックスＧ−５０（ファルマシア社製）によるゲルろ過を
行うことによりアイソトープ標識したＤＮＡプローブを
調製した。 ２．ゲノムＤＮＡライブラリーのスクリーニング 実施例２で示したように、インビトロパッケージングキ
ット（ストラタジーン社製）を用いて、ファージで感染
させた大腸菌をプレーティングし、プレートを４℃に冷
やした後、表面にニトロセルロースフィルターを密着さ
せてファージをフィルター上に移した。フィルターを
１. ５Ｍ ＮａＣｌ- ０. ５Ｍ ＮａＯＨ溶液に浸し、
付着したＤＮＡを変性させ、ついで１. ５Ｍ ＮａＣｌ
- ０. ５Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８. ０）溶液で中和
した。その後０. ３６Ｍ ＮａＣｌ- ２０ｍＭＮａＨ2
ＰＯ4 （ｐＨ７. ５）- ２ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ７.
５）でフィルターを洗浄した後乾燥させた。次に、上記
のようにして調製した野生型エステラーゼのＮ末端アミ
ノ酸配列に対応するアイソトープ標識したＤＮＡプロー
ブを用いて、実施例２で作製されたゲノムＤＮＡライブ
ラリーを以下の方法に従いプラークハイブリダイゼーシ
ョンを行った。すなわち、フィルターを１）４ｘＳＳ
Ｃ，１％(W/V) ＳＤＳ、１０ｘデンハルト（０. ２％(W
/V) フィコール、０. ２％(W/V) ポリビニルピロリド
ン、０. ２％(W/V) ウシ血清アルブミン）を含む溶液で
６０℃、３０分インキュベートした後、２）５ｘＳＳ
Ｃ、５ｘデンハルト、１００μｇ／ｍｌサケ精巣ＤＮＡ
を含む溶液で、６０℃、５時間インキュベートし、反応
を行った。ハイブリダイゼーションは、プラスティック
バックにフィルターと上記２）の溶液を加え、アイソト
ープ標識したＤＮＡプローブをフィルター１枚当たり約
５ｘ１０5 ｃｐｍ 添加して、６０℃で一夜行った。ハ
イブリダイゼーションを行ったフィルターは、１）２ｘ
ＳＳＣ、０. ５％(W/V) ＳＤＳを含む溶液で６０℃、１
５分、２）２ｘＳＳＣ、０. ５％(W/V) ＳＤＳを含む溶
液で２５℃、３０分、３）２ｘＳＳＣ、０. ５％ＳＤＳ
(W/V) を含む溶液で６０℃、１５分の順に洗浄した後、
風乾し、Ｘ線フィルム（ＦＵＪＩ ＲＸ）と増感紙をあ
て、−８０℃、一夜オートラジオグラムをとった。この
結果、ポジティブシグナルを与えるｐＣＣ３株を得た。
ダイデオキシ法により、塩基配列を決定した結果、得ら
れたクローン株は、エステラーゼ遺伝子の全長をコード
してはいなかった。そこでその配列の一部をＤＮＡプロ
ーブとして再度、プラークハイブリダイゼーションによ
るスクリーニングを行った。その際ゲノムＤＮＡをＳａ
ｕ３ＡＩで部分消化し、同様にλファージλＺＡＰＩＩ
（ストラタジーン社製）に連結して作製したライブラリ
ーを使用した。その結果、ポジティブシグナルを与える
野生型遺伝子クローンを９株取得した。
【００１３】実施例４ （鋳型ＤＮＡである野生型遺伝
子の調製：サブクローンの作製） 実施例３で得られた野生型遺伝子クローン即ちλＺＡＰ
ＩＩにクローン化されたインサートＤＮＡを、J.Sambro
ok、 E.F.Fritsch 、 T.Maniatis著；モレキュラー クロ
ーニング 第２版(Molecular Cloning 2nd edition) 、
コールドスプリング ハーバー ラボラトリー(Cold Sp
ring Harbor Laboratory) 発行、１９８９年等に記載さ
れる通常の方法を用いて、ヘルパーファージＲ４０８を
感染させることにより、プラスミドベクターを含む形で
ｉｎ ｖｉｖｏで切り出され、サブクローン化した。こ
のようにしてプラスミドｐＣＣ６を得た（図４参照）。
子の調製：サブクローンの作製） 実施例３で得られた野生型遺伝子クローン即ちλＺＡＰ
ＩＩにクローン化されたインサートＤＮＡを、J.Sambro
ok、 E.F.Fritsch 、 T.Maniatis著；モレキュラー クロ
ーニング 第２版(Molecular Cloning 2nd edition) 、
コールドスプリング ハーバー ラボラトリー(Cold Sp
ring Harbor Laboratory) 発行、１９８９年等に記載さ
れる通常の方法を用いて、ヘルパーファージＲ４０８を
感染させることにより、プラスミドベクターを含む形で
ｉｎ ｖｉｖｏで切り出され、サブクローン化した。こ
のようにしてプラスミドｐＣＣ６を得た（図４参照）。
【００１４】実施例５ （鋳型ＤＮＡである野生型遺伝
子を含有する発現プラスミド） 発現ベクターｐＫＫ２２３−３（Boyer ら、 Prot.Natl.
Acad.Sci.USA,80,21ー25(1983) 、ファルマシア社製）を
BamHI により部分分解し、次にＴ４ＤＮＡポリメラーゼ
により平滑末端化し、ライゲーションを行うことにより
BamHI 部位を１カ所欠失させたｐＫＫ２２３−４を作製
した。一方、野生型遺伝子の開始コドン周辺とその５’
上流側の塩基配列を大腸菌での遺伝子発現に適した配列
に変換するため、下記の塩基配列のＤＮＡ断片をアプラ
イド社ＤＮＡ合成機モデル３８０Ａを用いて合成した。 ＬＰ−１ （配列番号４に示す） ＬＰ−２ （配列番号５に示す） ＥＳ−３ （配列番号６に示す） ＥＳ−４ （配列番号７に示す） ＥＳ−５ （配列番号８に示す） ＥＳ−６ （配列番号９に示す） ＥＳ−７ （配列番号１０に示す） 合成したＬＰ−２，ＥＳ−３，ＥＳ−５，ＥＳ−６およ
びＥＳ−７断片の５’末端をリン酸化し、それぞれの未
処理の断片とライゲーション、アニーリングを行って、
下記の２本鎖ＤＮＡ断片（ＳＤ）を作製した。作製した
２本鎖ＤＮＡ断片（ＳＤ）は、その両端をリン酸化し
た。 ＳＤ < LP-1 > < ES-7 > < AATTCTTTTT TAATAAAATC AGGAGGAAAA AACATATGAC TCTGTTCGAT GGTATCACTT GAAAAA ATTATTTTAG TCCTCCTTTT TTGTATACTG AGACAAGCTA CCATAGTGAA < LP-2 >< ES-6 EcoRI ES-3 > < ES-5 > CGCGAATCGT AGATACTGAT CGTCTGACTG TTAACATCCT GGAACGTGC GCGCTTAGCA TCTATGACTA GCAGACTGAC AATTGTAGGA CCTTGCACGC CGG >< ES-4 > Eco52I 一方、ｐＣＣ６中のＳａｃＩ断片（約３. ５ｋｂｐ）を
ｐＵＣ１１８（宝酒造社製）へサブクローニングしたｐ
ＣＣ３０を作製した。このｐＣＣ３０をＥｃｏ５２Ｉ、
およびＳａｃＩで消化することによりエステラーゼの翻
訳領域（約１.２Ｋｂｐ）を切り出した。一方ｌａｃプ
ロモーターを有するｐＵＣ１１８をＥｃｏＲＩとＳａｃ
Ｉで消化し、アルカリフォスファターゼ処理を行った。
ついでこのｐＵＣ１１８のＥｃｏＲＩとＳａｃＩ部位の
間に、前記ＤＮＡ断片（ＳＤ）および、本発明遺伝子翻
訳領域を含むＥｃｏ５２ＩーＳａｃＩ断片をＤＮＡライ
ゲーションキット（宝酒造社製）を用いて連結すること
により、ｐＣＣ１０１（図５および図６参照）を作製し
た。
子を含有する発現プラスミド） 発現ベクターｐＫＫ２２３−３（Boyer ら、 Prot.Natl.
Acad.Sci.USA,80,21ー25(1983) 、ファルマシア社製）を
BamHI により部分分解し、次にＴ４ＤＮＡポリメラーゼ
により平滑末端化し、ライゲーションを行うことにより
BamHI 部位を１カ所欠失させたｐＫＫ２２３−４を作製
した。一方、野生型遺伝子の開始コドン周辺とその５’
上流側の塩基配列を大腸菌での遺伝子発現に適した配列
に変換するため、下記の塩基配列のＤＮＡ断片をアプラ
イド社ＤＮＡ合成機モデル３８０Ａを用いて合成した。 ＬＰ−１ （配列番号４に示す） ＬＰ−２ （配列番号５に示す） ＥＳ−３ （配列番号６に示す） ＥＳ−４ （配列番号７に示す） ＥＳ−５ （配列番号８に示す） ＥＳ−６ （配列番号９に示す） ＥＳ−７ （配列番号１０に示す） 合成したＬＰ−２，ＥＳ−３，ＥＳ−５，ＥＳ−６およ
びＥＳ−７断片の５’末端をリン酸化し、それぞれの未
処理の断片とライゲーション、アニーリングを行って、
下記の２本鎖ＤＮＡ断片（ＳＤ）を作製した。作製した
２本鎖ＤＮＡ断片（ＳＤ）は、その両端をリン酸化し
た。 ＳＤ < LP-1 > < ES-7 > < AATTCTTTTT TAATAAAATC AGGAGGAAAA AACATATGAC TCTGTTCGAT GGTATCACTT GAAAAA ATTATTTTAG TCCTCCTTTT TTGTATACTG AGACAAGCTA CCATAGTGAA < LP-2 >< ES-6 EcoRI ES-3 > < ES-5 > CGCGAATCGT AGATACTGAT CGTCTGACTG TTAACATCCT GGAACGTGC GCGCTTAGCA TCTATGACTA GCAGACTGAC AATTGTAGGA CCTTGCACGC CGG >< ES-4 > Eco52I 一方、ｐＣＣ６中のＳａｃＩ断片（約３. ５ｋｂｐ）を
ｐＵＣ１１８（宝酒造社製）へサブクローニングしたｐ
ＣＣ３０を作製した。このｐＣＣ３０をＥｃｏ５２Ｉ、
およびＳａｃＩで消化することによりエステラーゼの翻
訳領域（約１.２Ｋｂｐ）を切り出した。一方ｌａｃプ
ロモーターを有するｐＵＣ１１８をＥｃｏＲＩとＳａｃ
Ｉで消化し、アルカリフォスファターゼ処理を行った。
ついでこのｐＵＣ１１８のＥｃｏＲＩとＳａｃＩ部位の
間に、前記ＤＮＡ断片（ＳＤ）および、本発明遺伝子翻
訳領域を含むＥｃｏ５２ＩーＳａｃＩ断片をＤＮＡライ
ゲーションキット（宝酒造社製）を用いて連結すること
により、ｐＣＣ１０１（図５および図６参照）を作製し
た。
【００１５】実施例６ （本発明遺伝子の作製：変異プ
ライマーの調製） 160 Ｇｌｙおよび189 Ｇｌｙを各アミノ酸に変換するた
めの変異プライマーとして、図７および配列番号１１〜
２５に示すように、各アミノ酸に対応する各種合成オリ
ゴヌクレオチド（変異プライマー１６０Ａ，１６０Ｉ，
１６０Ｌ，１６０Ｓ，１６０Ｖ，１８９Ａ，１８９Ｆ，
１８９Ｈ，１８９Ｉ，１８９Ｌ，１８９Ｒ，１８９Ｓ，
１８９Ｔ，１８９Ｖおよび１８９Ｙ）を使用した。これ
らの変異プライマーはアプライドバイオシステムズ社製
ＤＮＡ合成機３９４型を用いて合成した後、同社製「オ
リゴヌクレオチド精製カートリッジ」にて精製した。野
生型エステラーゼを組換え大腸菌で生産させると、完全
長エステラーゼ以外にＣ末端アミノ酸が８個欠失した
（Ｃ末端アミノ酸は362 Ｇｌｕ） エステラーゼ分解物
が生じるために、３６３番目のアミノ酸を終止コドンへ
変換するための変異プライマーとして、図７および配列
番号２６〜３０に示すような合成オリゴヌクレオチド
（変異プライマーＲＶ−１，ＭＹ−１，Ａ３６３ｔｅｒ
ｍ，ＲＶ−ＤおよびＭＹ−２）を使用し、同様にアプラ
イドバイオシステムズ社製ＤＮＡ合成機３９４型を用い
て合成した後、同社製「オリゴヌクレオチド精製カート
リッジ」にて精製した。
ライマーの調製） 160 Ｇｌｙおよび189 Ｇｌｙを各アミノ酸に変換するた
めの変異プライマーとして、図７および配列番号１１〜
２５に示すように、各アミノ酸に対応する各種合成オリ
ゴヌクレオチド（変異プライマー１６０Ａ，１６０Ｉ，
１６０Ｌ，１６０Ｓ，１６０Ｖ，１８９Ａ，１８９Ｆ，
１８９Ｈ，１８９Ｉ，１８９Ｌ，１８９Ｒ，１８９Ｓ，
１８９Ｔ，１８９Ｖおよび１８９Ｙ）を使用した。これ
らの変異プライマーはアプライドバイオシステムズ社製
ＤＮＡ合成機３９４型を用いて合成した後、同社製「オ
リゴヌクレオチド精製カートリッジ」にて精製した。野
生型エステラーゼを組換え大腸菌で生産させると、完全
長エステラーゼ以外にＣ末端アミノ酸が８個欠失した
（Ｃ末端アミノ酸は362 Ｇｌｕ） エステラーゼ分解物
が生じるために、３６３番目のアミノ酸を終止コドンへ
変換するための変異プライマーとして、図７および配列
番号２６〜３０に示すような合成オリゴヌクレオチド
（変異プライマーＲＶ−１，ＭＹ−１，Ａ３６３ｔｅｒ
ｍ，ＲＶ−ＤおよびＭＹ−２）を使用し、同様にアプラ
イドバイオシステムズ社製ＤＮＡ合成機３９４型を用い
て合成した後、同社製「オリゴヌクレオチド精製カート
リッジ」にて精製した。
【００１６】実施例７ （本発明遺伝子の作製：部位特
異的変異の導入） 変異エステラーゼの作製には、Hos.N.Huntら（Gene,77,
51,1989 ）の方法を用いた。部位特異的変異導入の概略
を図８に示した。 １．部位特異的変異導入操作 実施例５で得たｐＣＣ１０１ ５００ｎｇを鋳型ＤＮＡ
とし、配列番号２７で示される変異プライマ−ＭＹ−１
（１００ｐｍｏｌ）および配列番号１１で示される変異
プライマー１６０Ａ（１００ｐｍｏｌ）を用いて、Gene
AmpTM PCR Reagent キット（宝酒造社製）によりＤＮＡ
断片を増幅した（１ｓｔＰＣＲ）。得られたＰＣＲ産物
（２７０ｂｐ断片）をＳＵＰＲＥＣー０２（宝酒造社
製）カラムを使用して精製した。続いて、同様にｐＣＣ
１０１ ５００ｎｇを鋳型ＤＮＡとし、配列番号２６で
示される変異プライマーＲＶ−Ｃ（５０ｐｍｏｌ）およ
び先に精製した２７０ｂｐＤＮＡ断片（５０ｐｍｏｌ）
をプライマーとしてGeneAmpTM PCR Reagentキットによ
りＤＮＡ断片を増幅した。増幅したＤＮＡ断片を制限酵
素ＣｅｌＩＩＩおよびＣｌａＩで消化し、サンプルを４
％アガロースゲル（ＮｕＳｉｅｖｅ３：１Ａｇａｒｏｓ
ｅ宝酒造社製）で電気泳動後、約２４０ｂｐのＤＮＡ断
片を分離し、バイオ１０１社ジーンクリーンＤＮＡ精製
キットを用いて精製した。一方、ｐＣＣ１０１ ３μｇ
をＣｅｌＩＩＩおよびＣｌａＩで消化し、アルカリフォ
スファターゼ処理を行った。ついでこのｐＣＣ１０１の
ＣｅｌＩＩＩ−ＣｌａＩ断片（４.２Ｋｂｐ） と先に調
製して得られた変異の導入されたＣｅｌＩＩＩ−Ｃｌａ
Ｉ断片（２４０ｂｐ）をＤＮＡライゲーションキット
（宝酒造社製）を用いて連結し、通常の方法に従って大
腸菌ＪＭ１０９株に形質転換した。 ２．変異体のスクリーニング 上記１で得られた形質転換体からプラスミドを調製した
後、ダイデオキシ法により変異箇所の塩基配列を決定
し、設計どおりの変異が導入されていることを確認し
た。以上、１、２の操作を１６０番目のグリシンの変異
体５種あるいは１８９番目のグリシンの変異体１０種に
ついて同様に行い、それぞれの変異体プラスミド（本発
明プラスミドｐＣＣ１６０Ａ，ｐＣＣ１６０Ｉ，ｐＣＣ
１６０Ｌ，ｐＣＣ１６０Ｓ，ｐＣＣ１６０Ｖ，ｐＣＣ１
８９Ａ，ｐＣＣ１８９Ｆ，ｐＣＣ１８９Ｈ，ｐＣＣ１８
９Ｉ，ｐＣＣ１８９Ｌ，ｐＣＣ１８９Ｒ，ｐＣＣ１８９
Ｓ，ｐＣＣ１８９Ｔ，ｐＣＣ１８９ＶおよびｐＣＣ１８
９Ｙ）の形質転換体を取得した。
異的変異の導入） 変異エステラーゼの作製には、Hos.N.Huntら（Gene,77,
51,1989 ）の方法を用いた。部位特異的変異導入の概略
を図８に示した。 １．部位特異的変異導入操作 実施例５で得たｐＣＣ１０１ ５００ｎｇを鋳型ＤＮＡ
とし、配列番号２７で示される変異プライマ−ＭＹ−１
（１００ｐｍｏｌ）および配列番号１１で示される変異
プライマー１６０Ａ（１００ｐｍｏｌ）を用いて、Gene
AmpTM PCR Reagent キット（宝酒造社製）によりＤＮＡ
断片を増幅した（１ｓｔＰＣＲ）。得られたＰＣＲ産物
（２７０ｂｐ断片）をＳＵＰＲＥＣー０２（宝酒造社
製）カラムを使用して精製した。続いて、同様にｐＣＣ
１０１ ５００ｎｇを鋳型ＤＮＡとし、配列番号２６で
示される変異プライマーＲＶ−Ｃ（５０ｐｍｏｌ）およ
び先に精製した２７０ｂｐＤＮＡ断片（５０ｐｍｏｌ）
をプライマーとしてGeneAmpTM PCR Reagentキットによ
りＤＮＡ断片を増幅した。増幅したＤＮＡ断片を制限酵
素ＣｅｌＩＩＩおよびＣｌａＩで消化し、サンプルを４
％アガロースゲル（ＮｕＳｉｅｖｅ３：１Ａｇａｒｏｓ
ｅ宝酒造社製）で電気泳動後、約２４０ｂｐのＤＮＡ断
片を分離し、バイオ１０１社ジーンクリーンＤＮＡ精製
キットを用いて精製した。一方、ｐＣＣ１０１ ３μｇ
をＣｅｌＩＩＩおよびＣｌａＩで消化し、アルカリフォ
スファターゼ処理を行った。ついでこのｐＣＣ１０１の
ＣｅｌＩＩＩ−ＣｌａＩ断片（４.２Ｋｂｐ） と先に調
製して得られた変異の導入されたＣｅｌＩＩＩ−Ｃｌａ
Ｉ断片（２４０ｂｐ）をＤＮＡライゲーションキット
（宝酒造社製）を用いて連結し、通常の方法に従って大
腸菌ＪＭ１０９株に形質転換した。 ２．変異体のスクリーニング 上記１で得られた形質転換体からプラスミドを調製した
後、ダイデオキシ法により変異箇所の塩基配列を決定
し、設計どおりの変異が導入されていることを確認し
た。以上、１、２の操作を１６０番目のグリシンの変異
体５種あるいは１８９番目のグリシンの変異体１０種に
ついて同様に行い、それぞれの変異体プラスミド（本発
明プラスミドｐＣＣ１６０Ａ，ｐＣＣ１６０Ｉ，ｐＣＣ
１６０Ｌ，ｐＣＣ１６０Ｓ，ｐＣＣ１６０Ｖ，ｐＣＣ１
８９Ａ，ｐＣＣ１８９Ｆ，ｐＣＣ１８９Ｈ，ｐＣＣ１８
９Ｉ，ｐＣＣ１８９Ｌ，ｐＣＣ１８９Ｒ，ｐＣＣ１８９
Ｓ，ｐＣＣ１８９Ｔ，ｐＣＣ１８９ＶおよびｐＣＣ１８
９Ｙ）の形質転換体を取得した。
【００１７】実施例８ （形質転換体微生物による本発
明酵素の生産） 実施例７によって得られた１５種類の本発明酵素発現プ
ラスミドの組換え体大腸菌および野生型エステラーゼ発
現ベクターの組換え体大腸菌（ｐＣＣ１０１／ＪＭ１０
９）の計１６株をＬＢ培地（トリプトン１％，酵母エキ
ス０. ５％，ＮａＣｌ０. ５％）に接種後、３７℃で培
養し、対数増殖期にＩＰＴＧ（イソプロピルーβーＤー
チオガラクトピラノシド）を終濃度１ｍＭになる様に添
加して、エステラーゼの発現を誘導した。培養終了後、
遠心分離（８０００ｇ、１０分、４℃）により菌体を回
収し、その一部をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供したところ、１
６種すべてのサンプルにおいて、分子量約４００００の
位置にエステラーゼが主バンドとして認められ、大腸菌
内で本発明酵素がいずれも高発現していた。
明酵素の生産） 実施例７によって得られた１５種類の本発明酵素発現プ
ラスミドの組換え体大腸菌および野生型エステラーゼ発
現ベクターの組換え体大腸菌（ｐＣＣ１０１／ＪＭ１０
９）の計１６株をＬＢ培地（トリプトン１％，酵母エキ
ス０. ５％，ＮａＣｌ０. ５％）に接種後、３７℃で培
養し、対数増殖期にＩＰＴＧ（イソプロピルーβーＤー
チオガラクトピラノシド）を終濃度１ｍＭになる様に添
加して、エステラーゼの発現を誘導した。培養終了後、
遠心分離（８０００ｇ、１０分、４℃）により菌体を回
収し、その一部をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供したところ、１
６種すべてのサンプルにおいて、分子量約４００００の
位置にエステラーゼが主バンドとして認められ、大腸菌
内で本発明酵素がいずれも高発現していた。
【００１８】実施例９ （本発明酵素の精製） 実施例８で示した方法で培養を行った組換え微生物（ｐ
ＣＣ１０１／ＪＭ１０９）の１６種（本発明である変異
型１５種および野性型）各々を超音波破砕（２０ＫＨ
ｚ、１５分、４℃）後、遠心分離（１２０００ｇ、３０
分、４℃）を行い、その上清を得た。得られた上清１５
０ｍｌを陰イオン交換樹脂（ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏ
ｓｅ ｆａｓｔｆｌｏｗ、ファルマシア社製）２００ｍ
ｌを充填したカラムに通し、目的酵素を担体に吸着させ
た。０. １５ＭＮａＣｌ＋１０ｍＭトリス塩酸緩衝液
（ｐＨ７. ５）でカラムを充分に洗浄し、非吸着分を除
去した後、０. １５ー ０. ３５ＭＮａＣｌ直線濃度勾配
法にて目的酵素を溶出した。目的酵素であるエステラー
ゼの活性画分を集め、疎水性樹脂（Ｂｕｔｙｌー Ｔｏｙ
ｏｐｅａｒｌ６５０Ｓ、東洋曹達工業社製）２００ｍｌ
を充填したカラムに通した。１０％(W/V) の（ＮＨ4 ）
2 ＳＯ4 ＋１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７.５）で
カラムを充分に洗浄し、非吸着分を除去した後、１０ー
０％(W/V) 飽和硫酸アンモニウム直線濃度勾配法にて目
的酵素を溶出した。目的酵素であるエステラーゼの活性
画分を集め、精製酵素を得た（以下、本発明酵素１６０
Ａ，１６０Ｉ，１６０Ｌ，１６０Ｓ，１６０Ｖ，１８９
Ａ，１８９Ｆ，１８９Ｈ，１８９Ｉ，１８９Ｌ，１８９
Ｒ，１８９Ｓ，１８９Ｔ，１８９Ｖおよび１８９Ｙ，野
生型エステラーゼＷＴと記す。）。
ＣＣ１０１／ＪＭ１０９）の１６種（本発明である変異
型１５種および野性型）各々を超音波破砕（２０ＫＨ
ｚ、１５分、４℃）後、遠心分離（１２０００ｇ、３０
分、４℃）を行い、その上清を得た。得られた上清１５
０ｍｌを陰イオン交換樹脂（ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏ
ｓｅ ｆａｓｔｆｌｏｗ、ファルマシア社製）２００ｍ
ｌを充填したカラムに通し、目的酵素を担体に吸着させ
た。０. １５ＭＮａＣｌ＋１０ｍＭトリス塩酸緩衝液
（ｐＨ７. ５）でカラムを充分に洗浄し、非吸着分を除
去した後、０. １５ー ０. ３５ＭＮａＣｌ直線濃度勾配
法にて目的酵素を溶出した。目的酵素であるエステラー
ゼの活性画分を集め、疎水性樹脂（Ｂｕｔｙｌー Ｔｏｙ
ｏｐｅａｒｌ６５０Ｓ、東洋曹達工業社製）２００ｍｌ
を充填したカラムに通した。１０％(W/V) の（ＮＨ4 ）
2 ＳＯ4 ＋１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７.５）で
カラムを充分に洗浄し、非吸着分を除去した後、１０ー
０％(W/V) 飽和硫酸アンモニウム直線濃度勾配法にて目
的酵素を溶出した。目的酵素であるエステラーゼの活性
画分を集め、精製酵素を得た（以下、本発明酵素１６０
Ａ，１６０Ｉ，１６０Ｌ，１６０Ｓ，１６０Ｖ，１８９
Ａ，１８９Ｆ，１８９Ｈ，１８９Ｉ，１８９Ｌ，１８９
Ｒ，１８９Ｓ，１８９Ｔ，１８９Ｖおよび１８９Ｙ，野
生型エステラーゼＷＴと記す。）。
【００１９】実施例１０ （本発明酵素の熱安定性） 実施例９で得られた１６種の精製酵素について、下記の
手順によりその熱安定性を検討した。２. ５ｍｌの１０
ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７. ０）に上記の精製酵素５μ
ｇが添加された検液を、５０℃で６０分間保温した後、
本発明酵素の残存活性を測定した。活性測定はエステラ
ーゼの一般的な基質であるｐ−ニトロフェニルアセテー
ト（ｐＮＰＡ）を用いて行った。具体的には、２％アセ
トンに溶解した基質４０μＭを含む０.１Ｍ リン酸緩衝
液（ｐＨ７. ２）に上記保温後の検液を加え、３７℃で
保温し、遊離するｐ−ニトロフェノール量を４０５ｎｍ
の吸光度の増加から測定して行った。活性は１分間に１
μｍｏｌのｐ−ニトロフェノールを遊離させる酵素量を
１ユニットとした。その結果を表１に示す。５０℃で６
０分間保温した後の残存活性率は、野生型エステラーゼ
が２６％であるのに対して、本発明酵素はすべて３０％
以上であり、いずれも熱安定性が向上していた。
手順によりその熱安定性を検討した。２. ５ｍｌの１０
ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７. ０）に上記の精製酵素５μ
ｇが添加された検液を、５０℃で６０分間保温した後、
本発明酵素の残存活性を測定した。活性測定はエステラ
ーゼの一般的な基質であるｐ−ニトロフェニルアセテー
ト（ｐＮＰＡ）を用いて行った。具体的には、２％アセ
トンに溶解した基質４０μＭを含む０.１Ｍ リン酸緩衝
液（ｐＨ７. ２）に上記保温後の検液を加え、３７℃で
保温し、遊離するｐ−ニトロフェノール量を４０５ｎｍ
の吸光度の増加から測定して行った。活性は１分間に１
μｍｏｌのｐ−ニトロフェノールを遊離させる酵素量を
１ユニットとした。その結果を表１に示す。５０℃で６
０分間保温した後の残存活性率は、野生型エステラーゼ
が２６％であるのに対して、本発明酵素はすべて３０％
以上であり、いずれも熱安定性が向上していた。
【００２０】
【表１】 ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ 本発明酵素 残存活性率（％） ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ １６０Ａ ４９ １６０Ｉ ４０ １６０Ｌ ３０ １６０Ｓ ５６ １６０Ｖ ４３ １８９Ａ ６９ １８９Ｆ ８１ １８９Ｈ ８９ １８９Ｉ ５７ １８９Ｌ ８０ １８９Ｒ ６２ １８９Ｓ ８６ １８９Ｔ ６４ １８９Ｖ ６９ １８９Ｙ ９６ 野生型エステラーゼ（ＷＴ） ２６ （対照区） ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━
【００２１】実施例１１ （多重変異型本発明遺伝子の
作製） 変異エステラーゼの作製には、実施例７と同様にHos.N.
Huntら（Gene,77,51,1989 ）の方法を用いた。部位特異
的変異導入の概略を図７に示した。 １．部位特異的変異導入操作 実施例６によって得られたｐＣＣ１０１ ５００ｎｇを
鋳型ＤＮＡとし、配列番号３０で示される変異プライマ
ーＭＹ−２（１００ｐｍｏｌ）および配列番号２８で示
される変異プライマーＡ３６３ｔｅｒｍ（１００ｐｍｏ
ｌ）を用いて、GeneAmpTM PCR Reagent キット（宝酒造
社製）によりＤＮＡ断片を増幅した。（１ｓｔＰＣＲ）
得られたＰＣＲ産物（１５０ｂｐ断片）をＳＵＰＲＥＣ
ー０２（宝酒造社製）カラムを使用して精製した。続い
て、同様にｐＣＣ１０１ ５００ｎｇを鋳型ＤＮＡと
し、配列番号２９で示される変異プライマーＲＶ−Ｄ
（５０ｐｍｏｌ）および先に精製した１５０ｂｐＤＮＡ
断片（５０ｐｍｏｌ）をプライマーとしてGeneAmpTM PC
R Reagent キットによりＤＮＡ断片を増幅した。増幅し
たＤＮＡ断片を制限酵素ＢｓｔＰＩおよびＸｂａＩで消
化し、サンプルを４％アガロースゲル（ＮｕＳｉｅｖｅ
３：１Ａｇａｒｏｓｅ宝酒造社製）で電気泳動し、約２
８０ｂｐのＤＮＡ断片を分離し、バイオ１０１社ジーン
クリーンＤＮＡ精製キットを用いて精製した。一方、ｐ
ＣＣ１０１ ３μｇをＢｓｔＰＩおよびＸｂａＩで消化
し、アルカリフォスファターゼ処理を行った。ついでこ
のｐＣＣ１０１のＢｓｔＰＩ−ＸｂａＩ断片（４. ２Ｋ
ｂｐ）と先に調製して得られた変異の導入されたＢｓｔ
ＰＩ−ＸｂａＩ断片（２８０ｂｐ）をＤＮＡライゲーシ
ョンキット（宝酒造社製）を用いて連結し、通常の方法
に従って大腸菌ＪＭ１０９株に形質転換した。 ２．変異体のスクリーニング 上記１で得られた形質転換体からプラスミドを調製した
後、ダイデオキシ法により変異箇所の塩基配列を決定
し、設計どうりの変異が導入されていることを確認し
た。このようにして調製されたプラスミドをｐＣＣ３６
３ｔｅｒｍと命名した。 ３．多重変異型本発明遺伝子の作製 実施例７によって得られた形質転換体から調製された変
異体プラスミドであるｐＣＣ１６０Ｓ １０μｇをＥｃ
ｏＲＩおよびＦｓｐＩで消化して得た０. ６Ｋｂｐの断
片，同変異体プラスミドｐＣＣ１８９Ｙ １０μｇをＦ
ｓｐＩおよびＢｓｔＰＩで消化して得た０. ４Ｋｂｐの
断片および上記２によって得られたｐＣＣ３６３ｔｅｒ
ｍ ３μｇをＢｓｔＰＩおよびＥｃｏＲＩで消化して得
た３. ４Ｋｂｐの断片の３種をＤＮＡライゲーションキ
ット（宝酒造社製）を用いて連結し、通常の方法に従っ
て大腸菌ＪＭ１０９株に形質転換し、多重変異型本発明
遺伝子を含有する組換えプラスミドｐＣＣ１６０Ｓ１８
９Ｙ３６３ｔｅｒｍを得た。同様にして、ｐＣＣ１６０
Ａ１８９Ｆ３６３ｔｅｒｍ，ｐＣＣ１６０Ａ１８９Ｈ３
６３ｔｅｒｍ，ｐＣＣ１６０Ａ１８９Ｙ３６３ｔｅｒ
ｍ，ｐＣＣ１６０Ｓ１８９Ｆ３６３ｔｅｒｍ，ｐＣＣ１
６０Ｓ１８９Ｈ３６３ｔｅｒｍの計６種の多重変異型本
発明プラスミドを含有する形質転換体を得た（図８参
照）。
作製） 変異エステラーゼの作製には、実施例７と同様にHos.N.
Huntら（Gene,77,51,1989 ）の方法を用いた。部位特異
的変異導入の概略を図７に示した。 １．部位特異的変異導入操作 実施例６によって得られたｐＣＣ１０１ ５００ｎｇを
鋳型ＤＮＡとし、配列番号３０で示される変異プライマ
ーＭＹ−２（１００ｐｍｏｌ）および配列番号２８で示
される変異プライマーＡ３６３ｔｅｒｍ（１００ｐｍｏ
ｌ）を用いて、GeneAmpTM PCR Reagent キット（宝酒造
社製）によりＤＮＡ断片を増幅した。（１ｓｔＰＣＲ）
得られたＰＣＲ産物（１５０ｂｐ断片）をＳＵＰＲＥＣ
ー０２（宝酒造社製）カラムを使用して精製した。続い
て、同様にｐＣＣ１０１ ５００ｎｇを鋳型ＤＮＡと
し、配列番号２９で示される変異プライマーＲＶ−Ｄ
（５０ｐｍｏｌ）および先に精製した１５０ｂｐＤＮＡ
断片（５０ｐｍｏｌ）をプライマーとしてGeneAmpTM PC
R Reagent キットによりＤＮＡ断片を増幅した。増幅し
たＤＮＡ断片を制限酵素ＢｓｔＰＩおよびＸｂａＩで消
化し、サンプルを４％アガロースゲル（ＮｕＳｉｅｖｅ
３：１Ａｇａｒｏｓｅ宝酒造社製）で電気泳動し、約２
８０ｂｐのＤＮＡ断片を分離し、バイオ１０１社ジーン
クリーンＤＮＡ精製キットを用いて精製した。一方、ｐ
ＣＣ１０１ ３μｇをＢｓｔＰＩおよびＸｂａＩで消化
し、アルカリフォスファターゼ処理を行った。ついでこ
のｐＣＣ１０１のＢｓｔＰＩ−ＸｂａＩ断片（４. ２Ｋ
ｂｐ）と先に調製して得られた変異の導入されたＢｓｔ
ＰＩ−ＸｂａＩ断片（２８０ｂｐ）をＤＮＡライゲーシ
ョンキット（宝酒造社製）を用いて連結し、通常の方法
に従って大腸菌ＪＭ１０９株に形質転換した。 ２．変異体のスクリーニング 上記１で得られた形質転換体からプラスミドを調製した
後、ダイデオキシ法により変異箇所の塩基配列を決定
し、設計どうりの変異が導入されていることを確認し
た。このようにして調製されたプラスミドをｐＣＣ３６
３ｔｅｒｍと命名した。 ３．多重変異型本発明遺伝子の作製 実施例７によって得られた形質転換体から調製された変
異体プラスミドであるｐＣＣ１６０Ｓ １０μｇをＥｃ
ｏＲＩおよびＦｓｐＩで消化して得た０. ６Ｋｂｐの断
片，同変異体プラスミドｐＣＣ１８９Ｙ １０μｇをＦ
ｓｐＩおよびＢｓｔＰＩで消化して得た０. ４Ｋｂｐの
断片および上記２によって得られたｐＣＣ３６３ｔｅｒ
ｍ ３μｇをＢｓｔＰＩおよびＥｃｏＲＩで消化して得
た３. ４Ｋｂｐの断片の３種をＤＮＡライゲーションキ
ット（宝酒造社製）を用いて連結し、通常の方法に従っ
て大腸菌ＪＭ１０９株に形質転換し、多重変異型本発明
遺伝子を含有する組換えプラスミドｐＣＣ１６０Ｓ１８
９Ｙ３６３ｔｅｒｍを得た。同様にして、ｐＣＣ１６０
Ａ１８９Ｆ３６３ｔｅｒｍ，ｐＣＣ１６０Ａ１８９Ｈ３
６３ｔｅｒｍ，ｐＣＣ１６０Ａ１８９Ｙ３６３ｔｅｒ
ｍ，ｐＣＣ１６０Ｓ１８９Ｆ３６３ｔｅｒｍ，ｐＣＣ１
６０Ｓ１８９Ｈ３６３ｔｅｒｍの計６種の多重変異型本
発明プラスミドを含有する形質転換体を得た（図８参
照）。
【００２２】実施例１２ （形質転換体微生物による多
重変異型本発明酵素の生産） 実施例１１によって得られた６種類の多重変異型本発明
酵素発現プラスミドの組換え体大腸菌をＬＢ培地（トリ
プトン１％，酵母エキス０. ５％，ＮａＣｌ０. ５％）
に接種後、３７℃で培養し、対数増殖期にＩＰＴＧ（イ
ソプロピルーβーＤーチオガラクトピラノシド）を終濃
度１ｍＭになる様に添加して、エステラーゼの発現を誘
導した。培養終了後、遠心分離（８０００ｇ、１０分、
４℃）により菌体を回収し、その一部をＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅに供したところ、６種すべてのサンプルにおいて、分
子量約３９０００の位置にエステラーゼが主バンドとし
て認められ、大腸菌内で本発明酵素がいずれも高発現し
ていた。続いて、培養された６種類の組換え体微生物か
ら実施例９で示した方法に準じて、同様に精製を行い、
各々の精製酵素を得た（多重変異型本発明酵素１６０Ａ
１８９Ｆ３６３ｔｅｒｍ，１６０Ａ１８９Ｈ３６３ｔｅ
ｒｍ，１６０Ａ１８９Ｙ３６３ｔｅｒｍ，１６０Ｓ１８
９Ｆ３６３ｔｅｒｍ，１６０Ｓ１８９Ｈ３６３ｔｅｒ
ｍ，１６０Ｓ１８９Ｙ３６３ｔｅｒｍ）。
重変異型本発明酵素の生産） 実施例１１によって得られた６種類の多重変異型本発明
酵素発現プラスミドの組換え体大腸菌をＬＢ培地（トリ
プトン１％，酵母エキス０. ５％，ＮａＣｌ０. ５％）
に接種後、３７℃で培養し、対数増殖期にＩＰＴＧ（イ
ソプロピルーβーＤーチオガラクトピラノシド）を終濃
度１ｍＭになる様に添加して、エステラーゼの発現を誘
導した。培養終了後、遠心分離（８０００ｇ、１０分、
４℃）により菌体を回収し、その一部をＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅに供したところ、６種すべてのサンプルにおいて、分
子量約３９０００の位置にエステラーゼが主バンドとし
て認められ、大腸菌内で本発明酵素がいずれも高発現し
ていた。続いて、培養された６種類の組換え体微生物か
ら実施例９で示した方法に準じて、同様に精製を行い、
各々の精製酵素を得た（多重変異型本発明酵素１６０Ａ
１８９Ｆ３６３ｔｅｒｍ，１６０Ａ１８９Ｈ３６３ｔｅ
ｒｍ，１６０Ａ１８９Ｙ３６３ｔｅｒｍ，１６０Ｓ１８
９Ｆ３６３ｔｅｒｍ，１６０Ｓ１８９Ｈ３６３ｔｅｒ
ｍ，１６０Ｓ１８９Ｙ３６３ｔｅｒｍ）。
【００２３】実施例１３ （多重変異型本発明酵素の熱
安定性） 実施例１２および実施例９によって得られた精製酵素に
ついて、５０℃の代わりに５５℃を用いた以外は実施例
１０に記載される方法と同様な方法により、その熱安定
性を検討した。その結果を表２に示す。５５℃で６０分
間保温した後の残存活性率は、野生型エステラーゼが１
３％であるのに対して、多重変異型本発明酵素である１
６０Ｓ１８９Ｙ３６３ｔｅｒｍは８９％とほとんど失活
しなかった。またこの多重変異型本発明酵素は、単独変
異型本発明酵素である１６０Ｓ，１８９Ｙよりもさらに
熱安定性が向上していた。
安定性） 実施例１２および実施例９によって得られた精製酵素に
ついて、５０℃の代わりに５５℃を用いた以外は実施例
１０に記載される方法と同様な方法により、その熱安定
性を検討した。その結果を表２に示す。５５℃で６０分
間保温した後の残存活性率は、野生型エステラーゼが１
３％であるのに対して、多重変異型本発明酵素である１
６０Ｓ１８９Ｙ３６３ｔｅｒｍは８９％とほとんど失活
しなかった。またこの多重変異型本発明酵素は、単独変
異型本発明酵素である１６０Ｓ，１８９Ｙよりもさらに
熱安定性が向上していた。
【００２４】
【表２】 ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ 本発明酵素 残存活性率（％） ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ １６０Ｓ ４４ １８９Ｙ ５２ １６０Ｓ１８９Ｙ３６３ｔｅｒｍ ８９ 野生型エステラーゼ（ＷＴ） １３ （対照区） ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━
【００２５】
【発明の効果】本発明により、有機合成反応において、
熱安定性に優れたエステラーゼの利用を可能とした。ま
た、本発明遺伝子を含有するＤＮＡ断片をベクターＤＮ
Ａに組み込んだプラスミドを構築し、該プラスミドが微
生物に導入された形質転換体微生物を培養することによ
って、耐熱性エステラーゼを効率良く製造することがで
きるようになった。
熱安定性に優れたエステラーゼの利用を可能とした。ま
た、本発明遺伝子を含有するＤＮＡ断片をベクターＤＮ
Ａに組み込んだプラスミドを構築し、該プラスミドが微
生物に導入された形質転換体微生物を培養することによ
って、耐熱性エステラーゼを効率良く製造することがで
きるようになった。
【００２６】配列番号 ：１ 配列の長さ：３７０ 配列の型 ：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 5 10 15 Met Thr Leu Phe Asp Gly Ile Thr Ser Arg Ile Val Asp Thr Asp Arg 20 25 30 Leu Thr Val Asn Ile Leu Glu Arg Ala Ala Asp Asp Pro Gln Thr Pro 35 40 45 Pro Asp Arg Thr Val Val Phe Val His Gly Asn Val Ser Ser Ala Leu 50 55 60 Phe Trp Gln Glu Ile Met Gln Asp Leu Pro Ser Asp Leu Arg Ala Ile 65 70 75 80 Ala Val Asp Leu Arg Gly Phe Gly Gly ser Glu His Ala Pro Val Asp 85 90 95 Ala Thr Arg Gly Val Arg Asp Phe Ser Asp Asp Leu His Ala Thr Leu 100 105 110 Glu Ala Leu Asp Ile Pro Val Ala His Leu Val Gly Trp Ser Met Gly 115 120 125 Gly Gly Val Val Met Gln Tyr Ala Leu Asp His Pro Val Leu Ser Leu 130 135 140 Thr Leu Gln Ser Pro Val Ser Pro Tyr Gly Phe Gly Gly Thr Arg Arg 145 150 155 160 Asp Gly Ser Arg Leu Thr Asp Asp Asp Ala Gly Cys Gly Gly Gly Gly 165 170 175 Ala Asn Pro Asp Phe Ile Gln Arg Leu Ile Asp His Asp Thr Ser Asp 180 185 190 Asp Ala Gln Thr Ser Pro Arg Ser Val Phe Arg Ala Gly Tyr Val Ala 195 200 205 Ser Asp Tyr Thr Thr Asp His Glu Asp Val Trp Val Glu Ser Met Leu 210 215 220 Thr Thr Ser Thr Ala Asp Gly Asn Tyr Pro Gly Asp Ala Val Pro Ser 225 230 235 240 Asp Asn Trp Pro Gly Phe Ala Ala Gly Arg His Gly Val Leu Asn Thr 245 250 255 Met Ala Pro Gln Tyr Phe Asp Val Ser Gly Ile Val Asp Leu Ala Glu 260 265 270 Lys Pro Pro Ile Leu Trp Ile His Gly Thr Ala Asp Ala Ile Val Ser 275 280 285 Asp Ala Ser Phe Tyr Asp Leu Asn Tyr Leu Gly Gln Leu Gly Ile Val 290 295 300 Pro Gly Trp Pro Gly Glu Asp Val Ala Pro Ala Gln Glu Met Val Ser 305 310 315 320 Gln Thr Arg Asp Val Leu Gly Arg Tyr Ala Ala Gly Gly Gly Thr Val 325 330 335 Thr Glu Val Ala Val Glu Gly Ala Gly His Ser Ala His Leu Glu Arg 340 345 350 Pro Ala Val Phe Arg His Ala Leu Leu Glu Ile Ile Gly Tyr Val Gly 355 360 365 Ala Ala Ala Asp Pro Ala Pro Pro Thr Glu Ala Ile Ile Ile Arg Ser 370 Ala Asp
【００２７】配列番号 ：２ 配列の長さ：４４ 配列の型 ：核酸 鎖の数 ：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ACICTITTCG ACGGIATCAC ITGICGIATC GTIGACACIG ACCG 44
【００２８】配列番号 ：３ 配列の長さ：４４ 配列の型 ：核酸 鎖の数 ：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ACICTITTCG ACGGIATCAC ITCICGIATC GTIGACACIG ACCG 44
【００２９】配列番号 ：４ 配列の長さ：２０ 配列の型 ：核酸 鎖の数 ：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 AATTCTTTTT TAATAAAATC 20
【００３０】配列番号 ：５ 配列の長さ：２６ 配列の型 ：核酸 鎖の数 ：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 TTTTCCTCCT GATTTTATTA AAAAAG 26
【００３１】配列番号 ：６ 配列の長さ：３０ 配列の型 ：核酸 鎖の数 ：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GGTATCACTT CGCGAATCGT AGATACTGAT 30
【００３２】配列番号 ：７ 配列の長さ：４５ 配列の型 ：核酸 鎖の数 ：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GGCCGCACGT TCCAGGATGT TAACAGTCAG ACGATCAGTA TCTAC 45
【００３３】配列番号 ：８ 配列の長さ：２９ 配列の型 ：核酸 鎖の数 ：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CGTCTGACTG TTAACATCCT GGAACGTGC 29
【００３４】配列番号 ：９ 配列の長さ：３７ 配列の型 ：核酸 鎖の数 ：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GATTCGCGAA GTGATACCAT CGAACAGAGT CATATGT 37
【００３５】配列番号 ：１０ 配列の長さ：３０ 配列の型 ：核酸 鎖の数 ：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 AGGAGAAAA AACATATGAC TCTGTTCGAT 30
【００３６】配列番号 ：１１ 配列の長さ：３２ 配列の型 ：核酸 鎖の数 ：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 TGCCGGTTGC GGTGGCGGCG CCGCGAACCC CG 32
【００３７】配列番号 ：１２ 配列の長さ：３２ 配列の型 ：核酸 鎖の数 ：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 TGCCGGTTGC GGTGGCGGCA TTGCGAACCC CG 32
【００３８】配列番号 ：１３ 配列の長さ：３２ 配列の型 ：核酸 鎖の数 ：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 TGCCGGTTGC GGTGGCGGCC TTGCGAACCC CG 32
【００３９】配列番号 ：１４ 配列の長さ：３２ 配列の型 ：核酸 鎖の数 ：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 TGCCGGTTGC GGTGGCGGCA GTGCGAACCC CG 32
【００４０】配列番号 ：１５ 配列の長さ：３２ 配列の型 ：核酸 鎖の数 ：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 TGCCGGTTGC GGTGGCGGCG TTGCGAACCC CG 32
【００４１】配列番号 ：１６ 配列の長さ：３０ 配列の型 ：核酸 鎖の数 ：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CGTCTTCCGC GCCGCCTACG TCGCCTCGGA 30
【００４２】配列番号 ：１７ 配列の長さ：３０ 配列の型 ：核酸 鎖の数 ：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CGTCTTCCGC GCCTTCTACG TCGCCTCGGA 30
【００４３】配列番号 ：１８ 配列の長さ：３０ 配列の型 ：核酸 鎖の数 ：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CGTCTTCCGC GCCCACTACG TCGCCTCGGA 30
【００４４】配列番号 ：１９ 配列の長さ：３０ 配列の型 ：核酸 鎖の数 ：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CGTCTTCCGC GCCATCTACG TCGCCTCGGA 30
【００４５】配列番号 ：２０ 配列の長さ：３０ 配列の型 ：核酸 鎖の数 ：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CGTCTTCCGC GCCCTCTACG TCGCCTCGGA 30
【００４６】配列番号 ：２１ 配列の長さ：３０ 配列の型 ：核酸 鎖の数 ：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CGTCTTCCGC GCCCGCTACG TCGCCTCGGA 30
【００４７】配列番号 ：２２ 配列の長さ：３０ 配列の型 ：核酸 鎖の数 ：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CGTCTTCCGC GCCAGCTACG TCGCCTCGGA 30
【００４８】配列番号 ：２３ 配列の長さ：３０ 配列の型 ：核酸 鎖の数 ：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CGTCTTCCGC GCCACCTACG TCGCCTCGGA 30
【００４９】配列番号 ：２４ 配列の長さ：３０ 配列の型 ：核酸 鎖の数 ：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CGTCTTCCGC GCCGTCTACG TCGCCTCGGA 30
【００５０】配列番号 ：２５ 配列の長さ：３０ 配列の型 ：核酸 鎖の数 ：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CGTCTTCCGC GCCTACTACG TCGCCTCGGA 30
【００５１】配列番号 ：２６ 配列の長さ：３０ 配列の型 ：核酸 鎖の数 ：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GACCACCCGG TGCTGAGCCT GACCCTGCAG 30
【００５２】配列番号 ：２７ 配列の長さ：３０ 配列の型 ：核酸 鎖の数 ：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 TACTGCGGGG CCATGGTGTT CAGCACGCCG 30
【００５３】配列番号 ：２８ 配列の長さ：３０ 配列の型 ：核酸 鎖の数 ：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CCGCCGACCG AGTAGATCTT CATCCGCTCC 30
【００５４】配列番号 ：２９ 配列の長さ：３０ 配列の型 ：核酸 鎖の数 ：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GGCGGAACGG TCACCGAGGT CGCCGTCGAG 30
【００５５】配列番号 ：３０ 配列の長さ：３０ 配列の型 ：核酸 鎖の数 ：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CGACGGCCAG TGCCAAGCTT GCATGCCTGC 30
【図１】野生型エステラーゼのアミノ酸配列および該酵
素をコードする遺伝子の塩基配列を示す図（その１）で
ある（アミノ酸配列における１番目から１４４番目ま
で）。
素をコードする遺伝子の塩基配列を示す図（その１）で
ある（アミノ酸配列における１番目から１４４番目ま
で）。
【図２】野生型エステラーゼのアミノ酸配列および該酵
素をコードする遺伝子の塩基配列を示す図（その２）で
ある（アミノ酸配列における１４５番目から３０４番目
まで）。
素をコードする遺伝子の塩基配列を示す図（その２）で
ある（アミノ酸配列における１４５番目から３０４番目
まで）。
【図３】野生型エステラーゼのアミノ酸配列および該酵
素をコードする遺伝子の塩基配列を示す図（その３）で
ある（アミノ酸配列における３０５番目から３７０番目
まで）。
素をコードする遺伝子の塩基配列を示す図（その３）で
ある（アミノ酸配列における３０５番目から３７０番目
まで）。
【図４】野生型エステラーゼをコードする遺伝子がサブ
クローニング化されたプラスミドｐＣＣ６の制限酵素地
図を示す図である。
クローニング化されたプラスミドｐＣＣ６の制限酵素地
図を示す図である。
【図５】野生型エステラーゼをコードする遺伝子を含有
する発現プラスミドｐＣＣ１０１の構築工程を示す図で
ある。
する発現プラスミドｐＣＣ１０１の構築工程を示す図で
ある。
【図６】野生型エステラーゼをコードする遺伝子を含有
する発現プラスミドｐＣＣ１０１の制限酵素地図を示す
図である。図中白抜きは、Chromobacterium SC-YM-1(F
ERM P-14009)由来のＤＮＡを、斜線部は野生型エステラ
ーゼの翻訳領域を示す図である。
する発現プラスミドｐＣＣ１０１の制限酵素地図を示す
図である。図中白抜きは、Chromobacterium SC-YM-1(F
ERM P-14009)由来のＤＮＡを、斜線部は野生型エステラ
ーゼの翻訳領域を示す図である。
【図７】野生型エステラーゼの１６０番目のアミノ酸、
１８９番目のアミノ酸および３６３番目のアミノ酸に特
異的変異を導入するために使用される合成オリゴヌクレ
オチドの塩基配列を示す図である。
１８９番目のアミノ酸および３６３番目のアミノ酸に特
異的変異を導入するために使用される合成オリゴヌクレ
オチドの塩基配列を示す図である。
【図８】本発明遺伝子を含有する組換えプラスミドの構
築工程を示す図である。
築工程を示す図である。
【図９】Ｃ末端欠失変異型本発明遺伝子を含有する組換
えプラスミドｐＣＣ３６３ｔｅｒｍの構築工程を示す図
である。
えプラスミドｐＣＣ３６３ｔｅｒｍの構築工程を示す図
である。
【図１０】多重変異型酵素本発明遺伝子を含有する組換
えプラスミドｐＣＣ１６０Ｓ１８９Ｙ３６３ｔｅｒｍの
構築工程を示す図である。
えプラスミドｐＣＣ１６０Ｓ１８９Ｙ３６３ｔｅｒｍの
構築工程を示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19）
Claims (6)
- 【請求項１】配列番号１で示されるアミノ酸配列におけ
る１６０番目および／または１８９番目のアミノ酸に部
位特異的変異を有するアミノ酸配列であり、かつ該アミ
ノ酸配列のうち少なくとも耐熱性のエステラーゼ活性が
機能する部分アミノ酸配列を有することを特徴とする変
異エステラーゼ。 - 【請求項２】配列番号１で示されるアミノ酸配列におい
て１６０番目のアミノ酸が下記のアミノ酸からなるＡ群
から選ばれ、かつ１８９番目のアミノ酸が下記のアミノ
酸からなるＢ群から選ばれるアミノ酸に置換されるよう
な特異的変異を有するアミノ酸配列である請求項１記載
の変異エステラーゼ。 （Ａ群）アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、
セリン （Ｂ群）アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、
セリン、スレオニン、フェニルアラニン、ヒスチジン、
チロシン、アルギニン - 【請求項３】請求項１記載のエステラーゼをコードする
遺伝子。 - 【請求項４】請求項３記載の遺伝子を含有するプラスミ
ド。 - 【請求項５】請求項４記載のプラスミドを含有する微生
物。 - 【請求項６】請求項５記載の微生物を培養し、該微生物
によってエステラーゼを生産させることを特徴とする変
異エステラーゼの製造方法。
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|---|---|---|---|
| JP01101494A JP3486942B2 (ja) | 1994-02-02 | 1994-02-02 | 耐熱性エステラーゼ |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP01101494A JP3486942B2 (ja) | 1994-02-02 | 1994-02-02 | 耐熱性エステラーゼ |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07213280A true JPH07213280A (ja) | 1995-08-15 |
| JP3486942B2 JP3486942B2 (ja) | 2004-01-13 |
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| JP01101494A Expired - Fee Related JP3486942B2 (ja) | 1994-02-02 | 1994-02-02 | 耐熱性エステラーゼ |
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|---|---|
| JP (1) | JP3486942B2 (ja) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0969094A2 (en) * | 1998-06-30 | 2000-01-05 | Sumitomo Chemical Company, Limited | Thermostable esterase and its gene |
| EP1046712A2 (en) | 1999-04-16 | 2000-10-25 | Sumitomo Chemical Company, Limited | Method of resolving 2-oxobicyclo (3.1.0) hexane-6-carboxylic acid derivatives |
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| WO2019211969A1 (ja) * | 2018-05-02 | 2019-11-07 | 天野エンザイム株式会社 | 改変型エステラーゼ及びその用途 |
| CN113201516A (zh) * | 2021-04-28 | 2021-08-03 | 安徽丰乐香料有限责任公司 | 一种对硝基苄基酯酶突变体及应用 |
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-
1994
- 1994-02-02 JP JP01101494A patent/JP3486942B2/ja not_active Expired - Fee Related
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| US6518053B2 (en) | 1998-06-30 | 2003-02-11 | Sumitomo Chemical Co., Ltd. | Thermostable esterase and its gene |
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| CN112055751A (zh) * | 2018-05-02 | 2020-12-08 | 天野酶制品株式会社 | 修饰型酯酶和其用途 |
| JPWO2019211969A1 (ja) * | 2018-05-02 | 2021-05-13 | 天野エンザイム株式会社 | 改変型エステラーゼ及びその用途 |
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