JP3267965B2 - 化合物製造生合成法 - Google Patents
化合物製造生合成法Info
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/305—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Micrococcaceae (F)
- C07K14/31—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Micrococcaceae (F) from Staphylococcus (G)
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- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明は化合物の生合成、殊にデヒドロアミノ酸残基
および（または）チオエーテル架橋を含む化合物の生合
成に関する。
および（または）チオエーテル架橋を含む化合物の生合
成に関する。
若干のポリペプチド抗生物質例えばナイシン、スブチ
リン、ズラマイシン（duramycin）、シンナマイシン（c
innamycin）、アンコベニン（ancovenin）、Ro09−0198
およびエピデルミン（epidermin）はデヒドロアミノ酸
およびランチオニン架橋を含む。
リン、ズラマイシン（duramycin）、シンナマイシン（c
innamycin）、アンコベニン（ancovenin）、Ro09−0198
およびエピデルミン（epidermin）はデヒドロアミノ酸
およびランチオニン架橋を含む。
これらのポリペプチドは種々のそれぞれの株の微生物
により生成される。例えばナイシンはストレプトコッカ
ス・ラクチン（Streptococcus lactin）の株の培養によ
り、スブチリンはバシラス・サチリス（Bacillus subti
lis）の培養により製造することができる。
により生成される。例えばナイシンはストレプトコッカ
ス・ラクチン（Streptococcus lactin）の株の培養によ
り、スブチリンはバシラス・サチリス（Bacillus subti
lis）の培養により製造することができる。
これらの抗生物質の生合成に対する遺伝学根拠はこれ
まで明らかにされなかった。従って、例えばそのような
抗生物質の生合成、殊にそれらの中に見出された異常な
アミノ酸の形成がリボソーム合成を経由するかまたは多
酵素複合体を経由して生ずるか知られなかった。
まで明らかにされなかった。従って、例えばそのような
抗生物質の生合成、殊にそれらの中に見出された異常な
アミノ酸の形成がリボソーム合成を経由するかまたは多
酵素複合体を経由して生ずるか知られなかった。
さらに、そのような抗生物質の前駆物質タンパク質が
明瞭な構造遺伝子によりコードされるかまたはより大き
いタンパク質の分解生成物であるか知られなかった。
明瞭な構造遺伝子によりコードされるかまたはより大き
いタンパク質の分解生成物であるか知られなかった。
エピデルミンの構造遺伝子を確証するために行なった
研究の過程において、我々は意外にも前記抗生物質、殊
にエピデルミンが明瞭な構造遺伝子によりコードされる
こと、およびプレ配列ポリペプチドのプロセッシングが
デヒドロアミノ残基および（または）チオエーテル架橋
の形成を行なう酵素複合体により行なわれることを確証
することができた。
研究の過程において、我々は意外にも前記抗生物質、殊
にエピデルミンが明瞭な構造遺伝子によりコードされる
こと、およびプレ配列ポリペプチドのプロセッシングが
デヒドロアミノ残基および（または）チオエーテル架橋
の形成を行なう酵素複合体により行なわれることを確証
することができた。
さらに、多酵素複合体が細胞膜を通る培養上澄み中へ
のタンパク質の分泌、並びにプレポリペプチドのプロセ
ッシングに関連されることができる。これに関連して、
そのような活性が例えば後記するプレ−エピデルミンの
−30〜−１配列の場合のように、プレ−ポリペプチドに
より所有されるプレ−配列に関連させることができる。
のタンパク質の分泌、並びにプレポリペプチドのプロセ
ッシングに関連されることができる。これに関連して、
そのような活性が例えば後記するプレ−エピデルミンの
−30〜−１配列の場合のように、プレ−ポリペプチドに
より所有されるプレ−配列に関連させることができる。
概括的に記載すると、本発明は１観点においてプラス
ミドが宿主により通常生成されないポリペプチドをコー
ドし、培養の間に前記宿主が多酵素複合体を与え、それ
により少くとも１つのデヒドロアミノ酸および（また
は）少くとも１つのランチオニン架橋を含むポリペプチ
ドが生成され、前記生成ポリペプチドが前記宿主にとっ
て外来である、プラスミドを含む細菌宿主を提供する。
ミドが宿主により通常生成されないポリペプチドをコー
ドし、培養の間に前記宿主が多酵素複合体を与え、それ
により少くとも１つのデヒドロアミノ酸および（また
は）少くとも１つのランチオニン架橋を含むポリペプチ
ドが生成され、前記生成ポリペプチドが前記宿主にとっ
て外来である、プラスミドを含む細菌宿主を提供する。
適当な多酵素複合体は、次の作用、すなわち水脱離お
よびスルフィド架橋形成、の少くとも１つを行なうこと
ができ；複合体はまた脱炭酸および二重結合形成を行な
うことができる。
よびスルフィド架橋形成、の少くとも１つを行なうこと
ができ；複合体はまた脱炭酸および二重結合形成を行な
うことができる。
本発明の方法の実施に適する宿主は、それらの遺伝物
質の修飾なく、デヒドロアミノ酸残基および（または）
ランチオニン架橋並びに（または）メチルランチオニン
架橋を含むポリペプチドを生成することができる。その
ような宿主の例はストレプトコッカス・ラクチス（Stre
ptococcus lactis）、バシラス・サチリス（Bacillus s
utilis）、ストレプトマイセス・シンナモネウス（Stre
ptomyces cinnamoneus）、ストレプトマイセス種（Stre
ptomyces sp.）、ストレプトベルティカラム・グリセオ
ベルティシラム（Streptoverticullum griseoverticill
um）、スタヒロコッカス・エピデルミス（Staphylococc
us epidermis）、スタヒロコッカス・エピデルミン（St
aphylococcus epidermin）株５およびスタヒロコッカス
・ガリナラム（Staphylococcus gallinarum）である。
質の修飾なく、デヒドロアミノ酸残基および（または）
ランチオニン架橋並びに（または）メチルランチオニン
架橋を含むポリペプチドを生成することができる。その
ような宿主の例はストレプトコッカス・ラクチス（Stre
ptococcus lactis）、バシラス・サチリス（Bacillus s
utilis）、ストレプトマイセス・シンナモネウス（Stre
ptomyces cinnamoneus）、ストレプトマイセス種（Stre
ptomyces sp.）、ストレプトベルティカラム・グリセオ
ベルティシラム（Streptoverticullum griseoverticill
um）、スタヒロコッカス・エピデルミス（Staphylococc
us epidermis）、スタヒロコッカス・エピデルミン（St
aphylococcus epidermin）株５およびスタヒロコッカス
・ガリナラム（Staphylococcus gallinarum）である。
殊に関心のある株は、1988年５月18日にブダペスト条
約の条件下にドイッチェ・ザムルング・フォン・ミクロ
オルガニスメン（Deutsche Sammlung von Microorganis
men）に寄託され、受託番号DSM4616を受けたスタヒロコ
ッカス・ガリナラム（F16/P57）Tii 3928および本出願
人により1984年10月26日にブダペスト条約の条件下にド
イッチェ・ザムルング・フォン・ミクロオルガニスメン
に寄託されたスタヒロコッカス・エピデルミスDSM3095
である。
約の条件下にドイッチェ・ザムルング・フォン・ミクロ
オルガニスメン（Deutsche Sammlung von Microorganis
men）に寄託され、受託番号DSM4616を受けたスタヒロコ
ッカス・ガリナラム（F16/P57）Tii 3928および本出願
人により1984年10月26日にブダペスト条約の条件下にド
イッチェ・ザムルング・フォン・ミクロオルガニスメン
に寄託されたスタヒロコッカス・エピデルミスDSM3095
である。
適当な宿主を形質転換するために適当なプラスミドを
公知遺伝子工学技術により修飾することができる。
公知遺伝子工学技術により修飾することができる。
望ましくは少くとも１つのデヒドロアミノ酸残基およ
び（または）少くとも１つのスルフィド架橋を含むポリ
ペプチドを生成する宿主のプラスミドを、プレ−ポリペ
プチドをコードする遺伝子の修飾または置換により処理
して前記宿主にとって外来のポリペプチドをコードする
プラスミドを与え、次いで前記宿主を改変プラスミドで
形質転換する。
び（または）少くとも１つのスルフィド架橋を含むポリ
ペプチドを生成する宿主のプラスミドを、プレ−ポリペ
プチドをコードする遺伝子の修飾または置換により処理
して前記宿主にとって外来のポリペプチドをコードする
プラスミドを与え、次いで前記宿主を改変プラスミドで
形質転換する。
種々の方法のいずれもプレ−ポリペプチドをコードす
る遺伝子の置換または修飾に使用することができる。
る遺伝子の置換または修飾に使用することができる。
所望化合物のプレ−ポリペプチド配列をコードするDN
Aは化学合成により製造することができる。適当な化学
合成はアナリティカル・バイオケミストリー（Anal.Bio
chem.），121,365（1982）中に開示されている。公知技
術は例えば60〜100塩基までのポリヌクレオチドの調製
物の製造を可能にする。
Aは化学合成により製造することができる。適当な化学
合成はアナリティカル・バイオケミストリー（Anal.Bio
chem.），121,365（1982）中に開示されている。公知技
術は例えば60〜100塩基までのポリヌクレオチドの調製
物の製造を可能にする。
適当に保護されたヌクレオチドをホスホジエステル法
〔アガルウォル（Agarwal）ほか、アンゲバンテ・ヘミ
ー（Angew,Chem.），84,489（1972）〕、ホスホトリエ
ステル法〔リーセム（Reesem），テトラヘドロン（Tetr
ahedron），39,3（1983）〕またはホスフィツトトリエ
ステル法〔レッツィンガー（Letsinger）ほか、ジャー
ナル・オブ・ジ・アメリカン・ケミカル・ソサイアティ
ー（J.Am.Chem.Soc.），98,3655（1976）〕あるいはホ
スホルアミジット法により連結させることができる。固
相法はポリヌクレオチドの合成の単純化を可能にする。
〔アガルウォル（Agarwal）ほか、アンゲバンテ・ヘミ
ー（Angew,Chem.），84,489（1972）〕、ホスホトリエ
ステル法〔リーセム（Reesem），テトラヘドロン（Tetr
ahedron），39,3（1983）〕またはホスフィツトトリエ
ステル法〔レッツィンガー（Letsinger）ほか、ジャー
ナル・オブ・ジ・アメリカン・ケミカル・ソサイアティ
ー（J.Am.Chem.Soc.），98,3655（1976）〕あるいはホ
スホルアミジット法により連結させることができる。固
相法はポリヌクレオチドの合成の単純化を可能にする。
二本鎖DNAは化学的に製造した短かいが、しかし重な
りセグメントから酵素的に構築することができる。
りセグメントから酵素的に構築することができる。
例えば、両DNA鎖の重なりポリヌクレオチド配列を用
いることができ、それらは塩基対合により正しい配座中
にともに保持され、酵素DNAリガーゼにより化学的に連
結される〔コラナ（Khorana）ほか、ジャーナル・オブ
・バイオロジカル・ケミストー（J.Biol.Chem.），251,
565（1976）〕。
いることができ、それらは塩基対合により正しい配座中
にともに保持され、酵素DNAリガーゼにより化学的に連
結される〔コラナ（Khorana）ほか、ジャーナル・オブ
・バイオロジカル・ケミストー（J.Biol.Chem.），251,
565（1976）〕。
他の可能性には、それぞれの場合に短かい重なり配列
を有する２つのDNA鎖の１ポリヌクレオチド配列を４所
要デオキシヌクレオシド三リン酸の存在下に、DNAポリ
メラーゼ、例えばDNAポリメラーゼＩ、ポリメラーゼＩ
のクレノウフラグメントまたはT4DNAポリメラーゼとと
もに、あるいは逆転写酵素とともにインキュベートする
ことが含まれる。２つのポリヌクレオチド配列がそれに
より塩基対合により正しい配列に保持され、酵素により
所要ヌクレオチドを補足されて完全二本鎖DNAを与える
〔ナラニー（Narany）ほか、アナリティカル・バイオケ
ミストリー（Anal.Biochem.），121,365（1982）〕。
を有する２つのDNA鎖の１ポリヌクレオチド配列を４所
要デオキシヌクレオシド三リン酸の存在下に、DNAポリ
メラーゼ、例えばDNAポリメラーゼＩ、ポリメラーゼＩ
のクレノウフラグメントまたはT4DNAポリメラーゼとと
もに、あるいは逆転写酵素とともにインキュベートする
ことが含まれる。２つのポリヌクレオチド配列がそれに
より塩基対合により正しい配列に保持され、酵素により
所要ヌクレオチドを補足されて完全二本鎖DNAを与える
〔ナラニー（Narany）ほか、アナリティカル・バイオケ
ミストリー（Anal.Biochem.），121,365（1982）〕。
ポリペプチドをコードするDNAを得る他の適当な方法
は微生物の組織または細胞培養のゲノムDNAから前記DNA
を分離し、細胞を例えばSDSまたはプロテイナーゼＫ
で、または望むならば機械的に、溶解し、DNAをフェノ
ールによる反復抽出により除タンパクすることを含む。
は微生物の組織または細胞培養のゲノムDNAから前記DNA
を分離し、細胞を例えばSDSまたはプロテイナーゼＫ
で、または望むならば機械的に、溶解し、DNAをフェノ
ールによる反復抽出により除タンパクすることを含む。
RNAは好ましくはRAaseで消化することができる。得ら
れたDNAは適当な制限酵素例えばHae IIIおよびAlu IIで
部分消化され、フラグメントが分離され、適当なファー
ジまたはコスミド中、例えばシャロン4AまたはBMBL−３
ファージ中で増殖され、例えば放射性標識DNAプローブ
で所望配列について検定される。
れたDNAは適当な制限酵素例えばHae IIIおよびAlu IIで
部分消化され、フラグメントが分離され、適当なファー
ジまたはコスミド中、例えばシャロン4AまたはBMBL−３
ファージ中で増殖され、例えば放射性標識DNAプローブ
で所望配列について検定される。
所望ポリペプチドをコードするDNAはまた分離されたm
RNAをcDNA中へ逆転写することにより得ることができ
る。これはDNA構造が知られていなければ好ましい方法
であろう。この方法においてDNAはcDNAライブラリー中
のゲノムDNAからmRNAを経て得られる。
RNAをcDNA中へ逆転写することにより得ることができ
る。これはDNA構造が知られていなければ好ましい方法
であろう。この方法においてDNAはcDNAライブラリー中
のゲノムDNAからmRNAを経て得られる。
cDNAライブラリーは細胞から分離されたmRNAに相補的で
ある遺伝子情報を含む。
ある遺伝子情報を含む。
cDNAライブラリーを得るためにmRNAが所望の塩基（で
きる限り非修飾）タンパク質を発現する細胞から分離さ
れる。このmRNAが二本鎖cDNAに転化される。
きる限り非修飾）タンパク質を発現する細胞から分離さ
れる。このmRNAが二本鎖cDNAに転化される。
よく知られた標準法がmRNAの製造に適用される。細胞
膜が破壊され、細胞内容物が遊離され、それからmRNAが
分離される。細胞膜は、好ましくは物理的方法または洗
剤例えばSDS、グアニジンチオシアネート、一定塩条件
または均質化による溶解により、好ましくは混合により
破壊される。mRNAはフェノール抽出、エタノール沈殿、
遠心分離およびクロマトグラフィーの標準的方法、好ま
しくは若干の方法の組合せ、により分離される。遠心分
離は好ましくは勾配で、例えばCs Cl勾配で行なわれ
る。クロマトグラフィーには好ましくはカラム、殊にオ
リゴ−dTカラムが使用される。
膜が破壊され、細胞内容物が遊離され、それからmRNAが
分離される。細胞膜は、好ましくは物理的方法または洗
剤例えばSDS、グアニジンチオシアネート、一定塩条件
または均質化による溶解により、好ましくは混合により
破壊される。mRNAはフェノール抽出、エタノール沈殿、
遠心分離およびクロマトグラフィーの標準的方法、好ま
しくは若干の方法の組合せ、により分離される。遠心分
離は好ましくは勾配で、例えばCs Cl勾配で行なわれ
る。クロマトグラフィーには好ましくはカラム、殊にオ
リゴ−dTカラムが使用される。
全mRNAは該技術の方法に従い直接Ds−cDNAに転化する
ことができる。好ましくは、所望ポリペプチドをコード
するmRNAは若干の技術例えば電気泳動法、クロマトグラ
フ法および遠心分離法、好ましくはショ糖勾配遠心分離
法を用いてさらに濃縮される。
ことができる。好ましくは、所望ポリペプチドをコード
するmRNAは若干の技術例えば電気泳動法、クロマトグラ
フ法および遠心分離法、好ましくはショ糖勾配遠心分離
法を用いてさらに濃縮される。
所望のポリペプチドをコードするmRNAを含む画分は種
々の方法、例えば生体内または試験管内翻訳、次いで適
切な活性の検出または、ヌクレオチド配列が知られてい
るときにオリゴヌクレオチドプローブとのハイブリッド
形成により検出することができる。
々の方法、例えば生体内または試験管内翻訳、次いで適
切な活性の検出または、ヌクレオチド配列が知られてい
るときにオリゴヌクレオチドプローブとのハイブリッド
形成により検出することができる。
生体内翻訳系は原核または真核系であることができ
る。好ましい生体内翻訳系はアフリカツメガエル（Xeno
pus laevis）卵母細胞系である〔マニアティス（Maniat
is）ほか、分子クローニング、実験室マニュアル（Mole
cular Cloning,A Laboratory Manual），コールド・ス
プリング・ハーバー・ラボラトリー（Cold Spring Harb
or Laboratory）（1982）参照〕。試験管内系は例えば
小麦胚およびウサギ網状赤血球溶解物であり、それらの
いずれも市販されている。
る。好ましい生体内翻訳系はアフリカツメガエル（Xeno
pus laevis）卵母細胞系である〔マニアティス（Maniat
is）ほか、分子クローニング、実験室マニュアル（Mole
cular Cloning,A Laboratory Manual），コールド・ス
プリング・ハーバー・ラボラトリー（Cold Spring Harb
or Laboratory）（1982）参照〕。試験管内系は例えば
小麦胚およびウサギ網状赤血球溶解物であり、それらの
いずれも市販されている。
非分画または分画mRNA由来mRNAの任意のプールから、
よく知られた方法によりdS−cDNAを得ることができる
〔好ましい一般法はマニアティス（Maniatis）ほか（前
掲）、オカヤムほか（Okayam and Berg），モレキュラ
ー・アンド・セル・バイオロジー（Molecular and Cell
Biology），２,161〜170（1982）およびハイデッカー
（Heidecker），ニュクリーク・アシド・リサーチ（Nuc
leic Acid Research），11,4891〜4906（1983）中に記
載されている〕。一般に、mRNAは初めにリバーストラン
スクリプターゼまたはDNAポリメラーゼＩ〔クレノウ（K
lenow）フラグメント〕を用いてss−cDNAに転化され
る。２つの方法がds−cDNAの合成の開始に択一的に使用
される。第１法はss−cDNAの自然ループ形成であった。
第２法はss−cDNAをホモポリマー尾例えばdCまたはポリ
DTでテーリングすることである。
よく知られた方法によりdS−cDNAを得ることができる
〔好ましい一般法はマニアティス（Maniatis）ほか（前
掲）、オカヤムほか（Okayam and Berg），モレキュラ
ー・アンド・セル・バイオロジー（Molecular and Cell
Biology），２,161〜170（1982）およびハイデッカー
（Heidecker），ニュクリーク・アシド・リサーチ（Nuc
leic Acid Research），11,4891〜4906（1983）中に記
載されている〕。一般に、mRNAは初めにリバーストラン
スクリプターゼまたはDNAポリメラーゼＩ〔クレノウ（K
lenow）フラグメント〕を用いてss−cDNAに転化され
る。２つの方法がds−cDNAの合成の開始に択一的に使用
される。第１法はss−cDNAの自然ループ形成であった。
第２法はss−cDNAをホモポリマー尾例えばdCまたはポリ
DTでテーリングすることである。
相当するポリペプチドが検出系中で最高の活性を示す
mRNA画分はよく知られた方法により相補的cDNA中で転写
される。mRNAおよびオリゴーdTがプライマーとして混合
され、次いでdNTPsが出発物質として添加され、cDNA−m
RNAハイブリッド分子の合成が酵素リバーストランスク
リプターゼにより実現される。
mRNA画分はよく知られた方法により相補的cDNA中で転写
される。mRNAおよびオリゴーdTがプライマーとして混合
され、次いでdNTPsが出発物質として添加され、cDNA−m
RNAハイブリッド分子の合成が酵素リバーストランスク
リプターゼにより実現される。
RNA分子はNaOHの添加により分解される。
DNAポリメラーゼ、好ましくはDNAポリメラーゼＩのクレ
ノウフラグメントが混合され、混合物が適当な温度、好
ましくは12〜15℃でインキュベートされる。混合物はヌ
クレアーゼS1とともにインキュベートされ、所望ポリペ
プチドをコードするmRNAに相当するds−cDNAが得られ
る。
ノウフラグメントが混合され、混合物が適当な温度、好
ましくは12〜15℃でインキュベートされる。混合物はヌ
クレアーゼS1とともにインキュベートされ、所望ポリペ
プチドをコードするmRNAに相当するds−cDNAが得られ
る。
増幅のために、得られたds−cDNAは適当なベクター、
例えばプラスミドpUC−KOにスプライシングすることが
でき、得られたハイブリッドベクターを適当な宿主、例
えばＥ、コリ（E.coli）HB101の使用により増殖させる
ことができる。ハイブリッドベクターの再分離およびそ
れから分離されたcDNAの回収が所望ポリペウチドをコー
ドするDNAの構造決定を可能にする。
例えばプラスミドpUC−KOにスプライシングすることが
でき、得られたハイブリッドベクターを適当な宿主、例
えばＥ、コリ（E.coli）HB101の使用により増殖させる
ことができる。ハイブリッドベクターの再分離およびそ
れから分離されたcDNAの回収が所望ポリペウチドをコー
ドするDNAの構造決定を可能にする。
ハイブリッドベクターの調製 本発明のハイブリッドベクターは、所望配列のポリペ
プチドをコードするDNAを適当なベクターにスプライシ
ングすることにより調製することができる。
プチドをコードするDNAを適当なベクターにスプライシ
ングすることにより調製することができる。
適当なベクターは宿主微生物の形質転換に使用できる
組込まれたパッセンジャーDNAに対する担体である。
組込まれたパッセンジャーDNAに対する担体である。
非形質転換状態でデヒドロアミノおよび（または）ス
ルフィド基を含むポリペプチドを生ずる微生物から誘導
されたプラスミドがベクターとして適当である。適当な
ベクターは挿入断片DNAを一定の位置に保持する。
ルフィド基を含むポリペプチドを生ずる微生物から誘導
されたプラスミドがベクターとして適当である。適当な
ベクターは挿入断片DNAを一定の位置に保持する。
一般に、そのようなベクターはレプリコンおよび制御
配列、すなわちプロモーター、を含むことができ、それ
らは、それらが使用される宿主細胞と適合する宿主細胞
または種から誘導される。ベクターは通常レプリコン部
位を保持し、形質転換された細胞中に表現型選択を与え
ることができる配列（標識遺伝子）を含むことができ
る。適当な標識遺伝子は抗生物質耐性または重金属に対
する耐性を与えることができ、あるいはそれらが宿主の
遺伝欠損を補足することができる。そのようなベクター
中のさらに有用な配列はエンハンサーおよびアクチベー
ター配列である。
配列、すなわちプロモーター、を含むことができ、それ
らは、それらが使用される宿主細胞と適合する宿主細胞
または種から誘導される。ベクターは通常レプリコン部
位を保持し、形質転換された細胞中に表現型選択を与え
ることができる配列（標識遺伝子）を含むことができ
る。適当な標識遺伝子は抗生物質耐性または重金属に対
する耐性を与えることができ、あるいはそれらが宿主の
遺伝欠損を補足することができる。そのようなベクター
中のさらに有用な配列はエンハンサーおよびアクチベー
ター配列である。
適当な出発ベクターの１つは株スタヒロコッカス・エ
ピデルミスDSM3095からの54KbpプラスミドpEpi32であ
る。このプラスミドは下記特徴を有し、52−プレペプチ
ドをコードするepi A遺伝子を含み、それは四環21−ペ
プチドアミド抗生物質にプロセッシングされる。
ピデルミスDSM3095からの54KbpプラスミドpEpi32であ
る。このプラスミドは下記特徴を有し、52−プレペプチ
ドをコードするepi A遺伝子を含み、それは四環21−ペ
プチドアミド抗生物質にプロセッシングされる。
パッセンジャーDNAを保持するベクターはハイブリッ
ドベクターと称される。
ドベクターと称される。
所望DNAは常法により出発ベクターにスプライシング
される。
される。
例えば出発プラスミドは初めに適当な制限酵素によ
り、例えばプラスミドpEpi32をHind III、BamH Iおよび
EcoR Iにより、線状化し、次いでdGTPおよび末端デオキ
シヌクレオチジルトランスフェラーゼの存在下にd/Gテ
ーリングすることができる。二本鎖cDNA挿入断片はdCTP
および末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ
の存在下にdC−テーリングされる。両cDNAおよびベクタ
ーを結合させるとハイブリッドベクターを生ずる。バク
テリオファージ例えばラムダはゲノムライブラリーの構
築に好ましい。ラムダクローニング系はマニアティス
（Maniatis）により記載されている（前掲）。適当なベ
クターDNAは適当な制限酵素で完全に消化され、左右の
アームが中心フラグメントから速度勾配遠心分離または
ゲル電気泳動により分離される。他の方法は左右のアー
ム中に認識部位を欠く制限酵素でスタッファーフラグメ
ントの部位を消化することである。分離されたゲノムDN
Aは長さ13〜20kbのフラグメントに部分的に消化される
ことができる。その後アームはアームの末端と適合する
末端を有する外来DNAのフラグメントと連結される。
り、例えばプラスミドpEpi32をHind III、BamH Iおよび
EcoR Iにより、線状化し、次いでdGTPおよび末端デオキ
シヌクレオチジルトランスフェラーゼの存在下にd/Gテ
ーリングすることができる。二本鎖cDNA挿入断片はdCTP
および末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ
の存在下にdC−テーリングされる。両cDNAおよびベクタ
ーを結合させるとハイブリッドベクターを生ずる。バク
テリオファージ例えばラムダはゲノムライブラリーの構
築に好ましい。ラムダクローニング系はマニアティス
（Maniatis）により記載されている（前掲）。適当なベ
クターDNAは適当な制限酵素で完全に消化され、左右の
アームが中心フラグメントから速度勾配遠心分離または
ゲル電気泳動により分離される。他の方法は左右のアー
ム中に認識部位を欠く制限酵素でスタッファーフラグメ
ントの部位を消化することである。分離されたゲノムDN
Aは長さ13〜20kbのフラグメントに部分的に消化される
ことができる。その後アームはアームの末端と適合する
末端を有する外来DNAのフラグメントと連結される。
適当なDNA挿入断片は初めのクローニングに使用され
た初めのベクターから適当な発現ベクター中へ再クロー
ニングされる。この目的のために適当な制限酵素が、お
そらくオキソヌクレオン（cxonucleones）と組合せて使
用され、所望DNAフラグメントが生成される。
た初めのベクターから適当な発現ベクター中へ再クロー
ニングされる。この目的のために適当な制限酵素が、お
そらくオキソヌクレオン（cxonucleones）と組合せて使
用され、所望DNAフラグメントが生成される。
DNA挿入断片は適当なよく知られたプラスミドベクタ
ー例えばpC194、pTI81およびpUB110の誘導体の多部位中
へ制限部位Hind III/BamH I/EcoR Iでサブクローニング
することができる。
ー例えばpC194、pTI81およびpUB110の誘導体の多部位中
へ制限部位Hind III/BamH I/EcoR Iでサブクローニング
することができる。
従って本発明の方法は、非修飾ペプチド中のシステイ
ン残基がスルフィド架橋アミノ酸により置換され、セリ
ンおよびチアミンが相当するデヒドロアミノ酸残基によ
り置換される公知ペプチドおよびホルモンの誘導体の製
造に使用できる。
ン残基がスルフィド架橋アミノ酸により置換され、セリ
ンおよびチアミンが相当するデヒドロアミノ酸残基によ
り置換される公知ペプチドおよびホルモンの誘導体の製
造に使用できる。
これらのフラグメントは粘着末端を用いることにより
直接、または適当な化学合成オリゴヌクレオチド架橋の
付加により適当な発現ベクター中へ取込まれる。末端の
修飾には、例えばHind IIIおよびBaL IIを用いることが
できる。方法は任意の特異制限酵素に限定されない。適
当な制限酵素を化学合成オリゴヌクレオチドと組合せて
用いて任意の所望連鎖を発現ベクターとDNA挿入断片と
の間に作ることができる。
直接、または適当な化学合成オリゴヌクレオチド架橋の
付加により適当な発現ベクター中へ取込まれる。末端の
修飾には、例えばHind IIIおよびBaL IIを用いることが
できる。方法は任意の特異制限酵素に限定されない。適
当な制限酵素を化学合成オリゴヌクレオチドと組合せて
用いて任意の所望連鎖を発現ベクターとDNA挿入断片と
の間に作ることができる。
部分特異的変異誘発を有するポリペプチドをコードす
る適当なDNA挿入断片もまた得ることができる。
る適当なDNA挿入断片もまた得ることができる。
種々の方法を基礎となるDNAの変異の誘発に用いて所
望変異体を調製することができる。
望変異体を調製することができる。
１つの方法は初めに変異させる領域をコードする配列
を含む自生または基礎遺伝子のフラグメントを複製形態
のファージ例えばMI3mp8中に挿入してMI3mp8PAを形成す
ることを含むことができる。従って挿入配列に相補的
な、しかし置換されるアミノ酸をコードする１つまたは
それ以上のヌクレオチドトリプレットを含む合成オリゴ
ヌクレオチドを一本鎖形態のMI3mp8Aにアニールして二
本鎖領域を形成させる。この領域は残留相補鎖のDNAポ
リメラーゼＩ合成に対するプライマーとして役立つ。複
製および確認後、変異体配列をさらに修飾するかまたは
それを用いて変異ポリペプチドを発現する適当なベクタ
ーを構築することができる。
を含む自生または基礎遺伝子のフラグメントを複製形態
のファージ例えばMI3mp8中に挿入してMI3mp8PAを形成す
ることを含むことができる。従って挿入配列に相補的
な、しかし置換されるアミノ酸をコードする１つまたは
それ以上のヌクレオチドトリプレットを含む合成オリゴ
ヌクレオチドを一本鎖形態のMI3mp8Aにアニールして二
本鎖領域を形成させる。この領域は残留相補鎖のDNAポ
リメラーゼＩ合成に対するプライマーとして役立つ。複
製および確認後、変異体配列をさらに修飾するかまたは
それを用いて変異ポリペプチドを発現する適当なベクタ
ーを構築することができる。
エピデルミンで行なった研究において、対合を緩めた
DNAプローブ、５′−GTG（Ａ）CAT（G/A）ATG（Ａ）AAT
（Ｃ）TT−３′がエピデルミンの提案プレ−配列の適当
なペンタペプチドセグメントから演繹された。LysPheIl
eCylThrが調製された。このDNAプローブをS.エピデルミ
ンDSM3095からのプラスミドDNAに対してハイブリッド形
成させた。
DNAプローブ、５′−GTG（Ａ）CAT（G/A）ATG（Ａ）AAT
（Ｃ）TT−３′がエピデルミンの提案プレ−配列の適当
なペンタペプチドセグメントから演繹された。LysPheIl
eCylThrが調製された。このDNAプローブをS.エピデルミ
ンDSM3095からのプラスミドDNAに対してハイブリッド形
成させた。
分離したプラスミドの制限分析はEcoR Iによる7DNAフ
ラグメント（16、11、10、6.5、5.5、3.5および2.5kb
p）、Hind IIIによる9DNAフラグメント（17、14、10、
5.3、2.8、1.8、0.8、0.6および0.5kbp）並びにBamH I
による5DNAフラグメント（20、19、10、３および1kbp）
を示す。
ラグメント（16、11、10、6.5、5.5、3.5および2.5kb
p）、Hind IIIによる9DNAフラグメント（17、14、10、
5.3、2.8、1.8、0.8、0.6および0.5kbp）並びにBamH I
による5DNAフラグメント（20、19、10、３および1kbp）
を示す。
5.4kbp Hind IIIフラグメントをサブクローンし、再
ハイブリッド化させ、それにより構造遺伝子epi Aを2.2
kbp EcoR I/Bal IIフラグメント内に位置させた。
ハイブリッド化させ、それにより構造遺伝子epi Aを2.2
kbp EcoR I/Bal IIフラグメント内に位置させた。
24の混合物として異なる14−マ−をハイブリッド形成
プローブとして用いた。プローブは、ノビック（Novic
k）ほか、アナルズ・オブ・ザ・ニュー・ヨーク・アカ
デミィ・オブ・サイエンス（Ann.N.Y.Acad.Sci.），18
2,279〜194（1971）、サザン（Southern）、ジャーナル
・オブ・モレキュラー・バイオロジー（J.Mol.Bio
l.），98,503〜517（1975）およびハインリッヒ（Heinr
ich）ほか、モレキュラー・アンド・ゼネラル・ジネテ
ィクス（Molecul.gen.Genet.），209,563〜569（1987）
中に記載された方法に従って配列決定プライマーとして
30倍過剰に適用した。エピデルミンのペプチド配列はオ
ープン読み枠の確認を可能にした。単にメチオニンコド
ンはシャイン・ダルガルノ配列に対して適当な距離中に
ある。プレ−エピデルミンの構造遺伝子はTAA終止コド
ンで終結し、従ってプレ−エピデルミンは52アミノ酸か
らなり（第１図）、それはArg-1とIle+1との間でエピデ
ルミンにプロセッシングされる。従って、明らかに認め
られるように、プレ−エピデルミンは大タンパク質の分
離生成物ではなくて明らかな構造遺伝子によりコードさ
れる。
プローブとして用いた。プローブは、ノビック（Novic
k）ほか、アナルズ・オブ・ザ・ニュー・ヨーク・アカ
デミィ・オブ・サイエンス（Ann.N.Y.Acad.Sci.），18
2,279〜194（1971）、サザン（Southern）、ジャーナル
・オブ・モレキュラー・バイオロジー（J.Mol.Bio
l.），98,503〜517（1975）およびハインリッヒ（Heinr
ich）ほか、モレキュラー・アンド・ゼネラル・ジネテ
ィクス（Molecul.gen.Genet.），209,563〜569（1987）
中に記載された方法に従って配列決定プライマーとして
30倍過剰に適用した。エピデルミンのペプチド配列はオ
ープン読み枠の確認を可能にした。単にメチオニンコド
ンはシャイン・ダルガルノ配列に対して適当な距離中に
ある。プレ−エピデルミンの構造遺伝子はTAA終止コド
ンで終結し、従ってプレ−エピデルミンは52アミノ酸か
らなり（第１図）、それはArg-1とIle+1との間でエピデ
ルミンにプロセッシングされる。従って、明らかに認め
られるように、プレ−エピデルミンは大タンパク質の分
離生成物ではなくて明らかな構造遺伝子によりコードさ
れる。
従って、意外にも抗生物質の前駆物質タンパク質が明
白な構造遺伝子によりコードされることが明らかであ
る。
白な構造遺伝子によりコードされることが明らかであ
る。
二次構造（α、β、折返し）、屈曲性、ヒドロパシ
ー、親水性およびヘリックスホィールプロットに対する
予想プロフィルの組合せがハイコン（Hycon）プログラ
ムを用いて作られた（第２図）。高α−ヘリックス確率
はプレ−エピデルミン−30〜−８に対し予想され、一方
プレ−エピデルミンに相当するＣ末端部１〜22は非常に
高い折返し確率を示す。さらに予想プロットは明らかに
Ｎ末端−30〜−１が非常に親水性であり、Ｃ末端部が一
層親油性であることを示す。Ｎ末端部−30〜−８は部分
的に両親媒性α−ヘリックスを折りたゝまれると思われ
る。
ー、親水性およびヘリックスホィールプロットに対する
予想プロフィルの組合せがハイコン（Hycon）プログラ
ムを用いて作られた（第２図）。高α−ヘリックス確率
はプレ−エピデルミン−30〜−８に対し予想され、一方
プレ−エピデルミンに相当するＣ末端部１〜22は非常に
高い折返し確率を示す。さらに予想プロットは明らかに
Ｎ末端−30〜−１が非常に親水性であり、Ｃ末端部が一
層親油性であることを示す。Ｎ末端部−30〜−８は部分
的に両親媒性α−ヘリックスを折りたゝまれると思われ
る。
プレ−エピデルミン−30〜−１のＮ末端セグメントは
システイン残基を含まず、Ｃ末端セグメント１〜22はス
ルフィド架橋形成に含まれる４システイン残基を含む、
配列−30〜−１はエンドプロテアーゼに対する多くの切
断部位を含み、一方プレ−エピデルミン状態においても
配列１〜22はタンパク質加水分解に対して非常に耐性で
ある。
システイン残基を含まず、Ｃ末端セグメント１〜22はス
ルフィド架橋形成に含まれる４システイン残基を含む、
配列−30〜−１はエンドプロテアーゼに対する多くの切
断部位を含み、一方プレ−エピデルミン状態においても
配列１〜22はタンパク質加水分解に対して非常に耐性で
ある。
成熟抗生物質は単に位置13中のLysでトリプシンによ
り攻撃されることができる。プロセッシング部位Arg-1
−Ile+1は折返し形成Pro-2残基のために親水性であり、
接近できる。
り攻撃されることができる。プロセッシング部位Arg-1
−Ile+1は折返し形成Pro-2残基のために親水性であり、
接近できる。
抗生物質例えばエピデルミンの生成中に生ずる種々の
酵素反応はプロ−ポリペプチド部１〜22の修飾;N末端プ
レペプチドフラグメント−30〜−１の切断および成熟抗
生物質の分泌を含む（第３および４図参照）。
酵素反応はプロ−ポリペプチド部１〜22の修飾;N末端プ
レペプチドフラグメント−30〜−１の切断および成熟抗
生物質の分泌を含む（第３および４図参照）。
酵素修飾はプレペプチドフラグメントの切断前に生ず
る。酵素修飾はそれぞれデヒドロアラニンおよびデヒド
ロブチリン残基を形成する位置５、16、19、および８、
14中のSerおよびThr残基からの水の脱離を含む。位置
２、11、21および22中のCys残基のチオール基のＣ＝Ｃ
二重結合に対する付加もまた生じ、メソ−ランチオニン
または（2S、3S、6R）−３−メチル−ランチオニン架橋
を生ずる。さらに、残基22の脱炭酸および二重結合形成
がＣ−末端Ｓ−（２−アミノビニル）−Ｄ−システイン
を生ずる。Ｃ末端に位置するシステインチオール基のＮ
−末端に位置するデヒドロアミノ酸との反応がエピデル
ミン、ナイシンおよびスブチリン中に完全な立体特異性
で生ずる。従って、修飾の間にこれらの脱離−付加反応
がプレ−エピデルミン残基Ｌ−SerおよびＬ−Thrにおけ
るＣα炭素原子の配置のＤ配置Ｃα原子を与える反転を
意味する。一方、システインの半分のＬ配列がなお維持
される。
る。酵素修飾はそれぞれデヒドロアラニンおよびデヒド
ロブチリン残基を形成する位置５、16、19、および８、
14中のSerおよびThr残基からの水の脱離を含む。位置
２、11、21および22中のCys残基のチオール基のＣ＝Ｃ
二重結合に対する付加もまた生じ、メソ−ランチオニン
または（2S、3S、6R）−３−メチル−ランチオニン架橋
を生ずる。さらに、残基22の脱炭酸および二重結合形成
がＣ−末端Ｓ−（２−アミノビニル）−Ｄ−システイン
を生ずる。Ｃ末端に位置するシステインチオール基のＮ
−末端に位置するデヒドロアミノ酸との反応がエピデル
ミン、ナイシンおよびスブチリン中に完全な立体特異性
で生ずる。従って、修飾の間にこれらの脱離−付加反応
がプレ−エピデルミン残基Ｌ−SerおよびＬ−Thrにおけ
るＣα炭素原子の配置のＤ配置Ｃα原子を与える反転を
意味する。一方、システインの半分のＬ配列がなお維持
される。
次に同一触媒部位に４スルフィド環もまた形成され、
それはＮ末端両親媒性α−ヘリックスとの相互作用によ
り支持される。Thr+14のみがシステインを見出すことな
く脱水する。この位置（Lys+13−Dhb+14）は、トリプシ
ンが抗生物質エピデルミンを不活性化する酵素切断部位
を構成する。スルフィド環形成の間にＣ末端の硬さおよ
び疎水性が増大し、プレ−エピデルミンと脂質二重層と
の相互反応を容易にすることができ、トランスロケーシ
ョンを誘発することができる。
それはＮ末端両親媒性α−ヘリックスとの相互作用によ
り支持される。Thr+14のみがシステインを見出すことな
く脱水する。この位置（Lys+13−Dhb+14）は、トリプシ
ンが抗生物質エピデルミンを不活性化する酵素切断部位
を構成する。スルフィド環形成の間にＣ末端の硬さおよ
び疎水性が増大し、プレ−エピデルミンと脂質二重層と
の相互反応を容易にすることができ、トランスロケーシ
ョンを誘発することができる。
最後に、親水性α−ヘリカルＮ末端−30〜−１が特異
プロテアーゼにより前記特有切断部位で切断される。
プロテアーゼにより前記特有切断部位で切断される。
前記技術を用いてランチバイオティックス（lantibio
tics）をコードするプラスミドを、それぞれのポリペプ
チドをコードする遺伝子の変異によるかまたはそのよう
な遺伝子を異なるポリペプチドをコードする遺伝子によ
り置換することにより修飾し、原宿主または異なる宿主
の軽質転換に、そのような宿主がまたその自生状態にお
いてランチバイオティックスを発現できれば、使用する
ことができる。
tics）をコードするプラスミドを、それぞれのポリペプ
チドをコードする遺伝子の変異によるかまたはそのよう
な遺伝子を異なるポリペプチドをコードする遺伝子によ
り置換することにより修飾し、原宿主または異なる宿主
の軽質転換に、そのような宿主がまたその自生状態にお
いてランチバイオティックスを発現できれば、使用する
ことができる。
一般的に言えば、原機能性遺伝子がプレ−配列をコー
ドする場合に、例えばエピデルミンの場合に記載したよ
うに、そのようなプレ−配列をコードするDNA配列が修
飾されたプラスミド中に保持されることができ；この場
合に新または変異プロ−ポリペプチドに対するDNA配列
が原プロ−ポリペプチド配列と同様にプレ−配列DNAの
すぐ上流に位置するであろう。
ドする場合に、例えばエピデルミンの場合に記載したよ
うに、そのようなプレ−配列をコードするDNA配列が修
飾されたプラスミド中に保持されることができ；この場
合に新または変異プロ−ポリペプチドに対するDNA配列
が原プロ−ポリペプチド配列と同様にプレ−配列DNAの
すぐ上流に位置するであろう。
本発明による細菌宿主の培養は、例えば1988年５月18
日に提出された我々の同時係属英国特許出願第8811760.
1号および欧州特許出願公表第0 181 578号中に記載され
た普通に使用される培養条件下に行なうことができる。
所望タンパク質の精製および分離もまた、吸着剤、イオ
ン交換樹脂、および望むならばHPLCの使用を含めて、前
記特許出願中にエピデルミンおよびガリデルミンについ
て記載された技術またはその改変を用いて行なうことが
できる。
日に提出された我々の同時係属英国特許出願第8811760.
1号および欧州特許出願公表第0 181 578号中に記載され
た普通に使用される培養条件下に行なうことができる。
所望タンパク質の精製および分離もまた、吸着剤、イオ
ン交換樹脂、および望むならばHPLCの使用を含めて、前
記特許出願中にエピデルミンおよびガリデルミンについ
て記載された技術またはその改変を用いて行なうことが
できる。
本発明の方法は実験目的に対する新規化合物の形成
に、あるいは新宿主中の公知化合物または公知化合物の
誘導体の形成に適用できる。例えば、エピデルミンをコ
ードする遺伝子を含むプラスミドを、種ストレプトコッ
カス・ラクチスを形質転換してその宿主からエピデルミ
ンを生成させるために用いることができ、またはガリデ
ルミン（前に参照した我々の同時係属英国特許出願参
照）をコードする遺伝子を、例えばプラスミドpEpi32中
のエピデルミンに対するプロ−ポリペプチドをコードす
る遺伝子の置換に用い、スタヒロコッカス・エピデルミ
スDSM3095を形質転換してこの宿主からガリデルミンを
生成させるのに使用することができる。同様に、デヒド
ロアミノ酸残基および（または）ランチオニン架橋ある
いは（または）メチルランチオニン架橋を含む他の生物
活性ペプチド誘導体、ホルモンの誘導体例えばヒトイン
シュリン、オキシトシン、バソプレッシン、ペプチド抗
生物質、ホルモン抑制物質例えばエラスターゼ抑制物質
および線維素溶解活性物質例えばヒト組織プラスミノー
ゲン活性化物質を生成させることができる。そのような
誘導体並びに親化合物の保持生物活性が高い安定性およ
び改良された半減期を有することができる。
に、あるいは新宿主中の公知化合物または公知化合物の
誘導体の形成に適用できる。例えば、エピデルミンをコ
ードする遺伝子を含むプラスミドを、種ストレプトコッ
カス・ラクチスを形質転換してその宿主からエピデルミ
ンを生成させるために用いることができ、またはガリデ
ルミン（前に参照した我々の同時係属英国特許出願参
照）をコードする遺伝子を、例えばプラスミドpEpi32中
のエピデルミンに対するプロ−ポリペプチドをコードす
る遺伝子の置換に用い、スタヒロコッカス・エピデルミ
スDSM3095を形質転換してこの宿主からガリデルミンを
生成させるのに使用することができる。同様に、デヒド
ロアミノ酸残基および（または）ランチオニン架橋ある
いは（または）メチルランチオニン架橋を含む他の生物
活性ペプチド誘導体、ホルモンの誘導体例えばヒトイン
シュリン、オキシトシン、バソプレッシン、ペプチド抗
生物質、ホルモン抑制物質例えばエラスターゼ抑制物質
および線維素溶解活性物質例えばヒト組織プラスミノー
ゲン活性化物質を生成させることができる。そのような
誘導体並びに親化合物の保持生物活性が高い安定性およ
び改良された半減期を有することができる。
理想的には、所望プロ−ポリペプチドをコードするDN
Aはシステインおよびセリンに対して、並びに（また
は）システインおよびトレオニンに対してチオエーテル
架橋を形成するコドンを含むべきである。
Aはシステインおよびセリンに対して、並びに（また
は）システインおよびトレオニンに対してチオエーテル
架橋を形成するコドンを含むべきである。
比較的短鎖のポリペプチドに対し、これらのそれぞれ
のコドンは通常８個を越えず、好ましくは６個を越えな
いコドン、離れているべきであるが、しかし最終ポリペ
プチド分子の立体配座により一層大きい間隔が可能であ
ることが計画される。
のコドンは通常８個を越えず、好ましくは６個を越えな
いコドン、離れているべきであるが、しかし最終ポリペ
プチド分子の立体配座により一層大きい間隔が可能であ
ることが計画される。
デヒドロアミノ酸の形成に関して、これらは通常セリ
ンおよびトレオニンから誘導され、従って所望プロ−ペ
プチドをコードするDNAはそのようなアミノ酸に対する
コドンを含む。
ンおよびトレオニンから誘導され、従って所望プロ−ペ
プチドをコードするDNAはそのようなアミノ酸に対する
コドンを含む。
本発明により生成されるポリペプチド中に存在できる
異常なアミノ酸にはテヒドロアラニン、2,3−デヒドロ
−２−アミノ酪酸、メソ−ランチオニン、（2S、3S、6
R）−３−メチルランチオニン、Ｓ−（２−（Ｚ）−ア
ミノビニル）−Ｄ−システイン、リシノアラニンおよび
β−ヒドロキシアスパラギン酸があり、これらの残基の
構造は第５図中に示される。
異常なアミノ酸にはテヒドロアラニン、2,3−デヒドロ
−２−アミノ酪酸、メソ−ランチオニン、（2S、3S、6
R）−３−メチルランチオニン、Ｓ−（２−（Ｚ）−ア
ミノビニル）−Ｄ−システイン、リシノアラニンおよび
β−ヒドロキシアスパラギン酸があり、これらの残基の
構造は第５図中に示される。
実施例 １ 1. ガリデルミンの過剰生成 ガリデルミンのオープン読み枠を含むDNAフラグメン
トをスタヒロコッカス・エピデルミディスDSM3095、エ
ピデルミン生産株、中に、中間コピープラスミド例えば
pC194、pE194、pUB110、pT181またはpMK148ガリデルミ
ンの使用によりクローニングすることができる。遺伝子
量の増加は通常生成物生成の増加と相関し；相関は必ら
ずしも直線的ではない。pC194またはpT181の高コピー数
プラスミド誘導体またはクローニングビヒクルとして使
用できる。
トをスタヒロコッカス・エピデルミディスDSM3095、エ
ピデルミン生産株、中に、中間コピープラスミド例えば
pC194、pE194、pUB110、pT181またはpMK148ガリデルミ
ンの使用によりクローニングすることができる。遺伝子
量の増加は通常生成物生成の増加と相関し；相関は必ら
ずしも直線的ではない。pC194またはpT181の高コピー数
プラスミド誘導体またはクローニングビヒクルとして使
用できる。
2. リーダー配列の交換 アミノ酸−１〜−30に相当するエピデルミンのリーダ
ー配列はエピデルミンの分泌中に含まれる。その配列は
S.エピデルミディス中の他のペプチド例えばガリデルミ
ンの分泌に使用できる。
ー配列はエピデルミンの分泌中に含まれる。その配列は
S.エピデルミディス中の他のペプチド例えばガリデルミ
ンの分泌に使用できる。
リーダー配列DNAはそれぞれのリンカーをその配列の
初めおよび末端に挿入することにより移動可能にするこ
とができる。従ってリーダー配列DNAはプラスミドから
多量に分離することができ、他のペプチドおよびタンパ
ク質のそれぞれの位置に挿入することができる。リーダ
ー配列DNAはまた化学合成により生成されることができ
る。
初めおよび末端に挿入することにより移動可能にするこ
とができる。従ってリーダー配列DNAはプラスミドから
多量に分離することができ、他のペプチドおよびタンパ
ク質のそれぞれの位置に挿入することができる。リーダ
ー配列DNAはまた化学合成により生成されることができ
る。
実施例 ２ S.エピデルミスを宿主として用いたガリデルミンの製造 （１） プラスミドの調製（第６図参照） （ａ） ミュンヘン工科大学の図書館で閲覧可能なロ
ーセンスタイン（Dr.Ralf Rosenstein）の学位論文「ス
タヒロコッカスによるプラスミドコード化アルセニット
およびアルセナートレスティステントの分子遺伝学的研
究（Molekular gentistische Untersuchungen zur plas
midkodierten Arsenit und Arsenatrestistent bei Sta
phylococcen）」中に記載されたようにPst 1消化pCLP10
0およびNde1消化pUC18をクレノウを用いて連結すること
によりプラスミドpCUIを調製した。
ーセンスタイン（Dr.Ralf Rosenstein）の学位論文「ス
タヒロコッカスによるプラスミドコード化アルセニット
およびアルセナートレスティステントの分子遺伝学的研
究（Molekular gentistische Untersuchungen zur plas
midkodierten Arsenit und Arsenatrestistent bei Sta
phylococcen）」中に記載されたようにPst 1消化pCLP10
0およびNde1消化pUC18をクレノウを用いて連結すること
によりプラスミドpCUIを調製した。
得られたプラスミドを次にEcoR1で消化した。
ｂ） 染色体DNAをS.ガリナラム（DSM4616）から分離
し、EcoR Iで消化した。Hind IIIおよびEcoR I制限部位
間の2.4kb長配列中のガリデルミン構造遺伝子を含む4.7
kbフラグメントをプライマーとして配列 ５′CAC ATC CAG GAG TAC 3′ を用いて分離した。
し、EcoR Iで消化した。Hind IIIおよびEcoR I制限部位
間の2.4kb長配列中のガリデルミン構造遺伝子を含む4.7
kbフラグメントをプライマーとして配列 ５′CAC ATC CAG GAG TAC 3′ を用いて分離した。
ｃ） 次いで4.7kbフラグメントを段階ａ）からの消
化したpCUIプラスミドのEcoE I部位中へ連結し、pCUgdm
1と称されるプラスミドが得られた。
化したpCUIプラスミドのEcoE I部位中へ連結し、pCUgdm
1と称されるプラスミドが得られた。
（２） S.エピデルミス宿主の調製 この実施例において、エピデルミンを生成できるS.エ
ピデルミスDSM3095の変異株が分離された。
ピデルミスDSM3095の変異株が分離された。
変異誘発は染色体にコードしたリファンピシン耐性を
特徴とする株（20μg/m）に行なった。
特徴とする株（20μg/m）に行なった。
寒天平板上で増殖したS.エピデルミスDSM3095を用い
て30m基礎ブロス培地に接種し、それを一夜培養し
た。次いで一夜培養物0.5mを用いて生産培地50mに
接種し、それを37℃で３時間振とう培養した。
て30m基礎ブロス培地に接種し、それを一夜培養し
た。次いで一夜培養物0.5mを用いて生産培地50mに
接種し、それを37℃で３時間振とう培養した。
細胞を培地から移し、4.5m前加温TM緩衝液（30mMト
リスーマレアートpH6.5）中に懸濁した（生じた溶液を
溶液Ａと称する）。
リスーマレアートpH6.5）中に懸濁した（生じた溶液を
溶液Ａと称する）。
溶液Ａを自然変異および細胞数について調べた（1.25
×1010細胞/m）。
×1010細胞/m）。
溶液A4mを1mエチルメチルスルホナートとともに
（最終濃度47μg/m）十分振とうし、次いで振とう下
に37℃で１時間維持した。
（最終濃度47μg/m）十分振とうし、次いで振とう下
に37℃で１時間維持した。
次いで細胞を培養ブロスから抽出し、２回TM緩衝液で
洗浄し、5mTM緩衝液中に再懸濁した（生じた溶液は溶
液Ｂと称され、変異細胞を含有した）。
洗浄し、5mTM緩衝液中に再懸濁した（生じた溶液は溶
液Ｂと称され、変異細胞を含有した）。
溶液Ｂは２×108細胞/mを含み、1.6％の生存率に相
当する。
当する。
溶液B50μを5m生産培地に加え、37℃で一夜増殖
させた（表現型発現）。生じた溶液を溶液Ｃと称した。
細胞数は7.3×108細胞/mを示した。
させた（表現型発現）。生じた溶液を溶液Ｃと称した。
細胞数は7.3×108細胞/mを示した。
溶液をBM寒天平板上で培養し、個々のクローンを採集
した。これを用いて試験平板（ミクロコッカス・ルテウ
スを表面上に置いたBM寒天からなる）に接種した。M.ル
テウスに関する阻止効果を有しなかったコロニーをエピ
デルミン非生産体として選んだ。
した。これを用いて試験平板（ミクロコッカス・ルテウ
スを表面上に置いたBM寒天からなる）に接種した。M.ル
テウスに関する阻止効果を有しなかったコロニーをエピ
デルミン非生産体として選んだ。
BM寒天は毎当り 10g ペプトンNo.140 5g 酵母エキス 1mg グルコース 5mg NaCl 1mg K2HPO4 pH 7.5 を含有する。
約３％の変異率が認められた。
見出された45非生産体を20回サブクローンし、16安定
非生産体が得られた。
非生産体が得られた。
安定非生産体はすべて野生型プラスミドpEpi32を含む
と認められた。制限パターンから、これは野生型株中の
プラスミドに等しいと同定される。
と認められた。制限パターンから、これは野生型株中の
プラスミドに等しいと同定される。
非生産性S.エピデルミスの形質転換 BM培地750mを安定非生産性株の一夜培養により得た
培地5mで接種し、接種した培地を２フラスコ中で37
℃で120rpmの振とう速度で振とう培養した。
培地5mで接種し、接種した培地を２フラスコ中で37
℃で120rpmの振とう速度で振とう培養した。
接種したBM培地の初期光学濃度は0.03〜0.04であっ
た。光学濃度が0.45〜0.55に達したとき、細胞をGS−３
−ローター中、8500rpmで４℃で15分間の遠心分離によ
り除去した。分離した細胞を次いで、順次750、350、40
および10mの10％グリセリン中で洗浄し、２〜3mの1
0％グリセリン中に懸濁し、ERG中に110μ部中で−70
℃で凍結した。細胞数は15×1010/mになった。
た。光学濃度が0.45〜0.55に達したとき、細胞をGS−３
−ローター中、8500rpmで４℃で15分間の遠心分離によ
り除去した。分離した細胞を次いで、順次750、350、40
および10mの10％グリセリン中で洗浄し、２〜3mの1
0％グリセリン中に懸濁し、ERG中に110μ部中で−70
℃で凍結した。細胞数は15×1010/mになった。
凍結細胞を室温で５分間融解させ、次いで細胞懸濁液
50μをERG中でTE緩衝液中の２μのプラスミドpCUgd
m1とともに室温で30分間インキュベートした。
50μをERG中でTE緩衝液中の２μのプラスミドpCUgd
m1とともに室温で30分間インキュベートした。
次いで混合物を0.2cm電極間隙を有する電気泳動セル
中へ導入して直ちに電気泳動した。その後細胞を速やか
に950μSMMP50培地中に再懸濁し、2.5mERG中へ移
し、37℃で90分間振とうした。ERGは培地の良好な通気
を与えるために45゜に傾斜させた。
中へ導入して直ちに電気泳動した。その後細胞を速やか
に950μSMMP50培地中に再懸濁し、2.5mERG中へ移
し、37℃で90分間振とうした。ERGは培地の良好な通気
を与えるために45゜に傾斜させた。
SMMP50培地は100m当り、55m2SMM、40m4PABおよ
び５モル５％BSAを含有する。2SMMは１モルサッカロー
ス、0.04モルマレイン酸、0.04モルMgCl2およびNaOHpH
6.5までを含み、4PABは7g/100mギブコ（Gibco）抗生
物質培地３の溶液である。
び５モル５％BSAを含有する。2SMMは１モルサッカロー
ス、0.04モルマレイン酸、0.04モルMgCl2およびNaOHpH
6.5までを含み、4PABは7g/100mギブコ（Gibco）抗生
物質培地３の溶液である。
細胞懸濁液を希釈し、ガリデルミンを含むBM寒天上に
広げ、それを37℃で20分間インキュベートした。
広げ、それを37℃で20分間インキュベートした。
ガリデルミンを生ずる増殖株の試験を、M.ルテウス試
験平板からのコロニーの選択により、それぞれの選択コ
ロニーを培養し、HPLCによりガリデルミンの存在を測定
することにより行なった。
験平板からのコロニーの選択により、それぞれの選択コ
ロニーを培養し、HPLCによりガリデルミンの存在を測定
することにより行なった。
ガリデルミンの生成できる3pCUgdm1形質転換変異体が
突きとめられた。
突きとめられた。
pCUgdm1形質転換S.エピデルミンにより生成されたガリ
デルミンの存在の決定 ａ） 生物検定 FP寒天をM.ルテウスATCC9341で接種し、37℃で18時間
インキュベートした。生じた培養株の1/2をループで移
し、100mFP培地中に懸濁し、36℃で８時間培養した。
光学濃度が1.0に達したときに培養を止めた。FP寒天を
この懸濁液0.5％で接種し、各10mをペトリ皿に入れ、
４℃で３週間貯蔵した。
デルミンの存在の決定 ａ） 生物検定 FP寒天をM.ルテウスATCC9341で接種し、37℃で18時間
インキュベートした。生じた培養株の1/2をループで移
し、100mFP培地中に懸濁し、36℃で８時間培養した。
光学濃度が1.0に達したときに培養を止めた。FP寒天を
この懸濁液0.5％で接種し、各10mをペトリ皿に入れ、
４℃で３週間貯蔵した。
プレート拡散試験をツァーナーほか（Zahner and Maa
s）、「抗生物質の生物学（Biology of Antibiotic
s）」、スプリンガー・フエルラーク（Springer Verla
g,Berlin）1972中に記載のように行ない、形質転換した
S.エピデルミンの培養の培養濾液10μを濾紙上に捕捉
し、乾燥した。濾紙を試験プレート上に置き、次いでそ
れを37℃で24時間インキュベートした。
s）、「抗生物質の生物学（Biology of Antibiotic
s）」、スプリンガー・フエルラーク（Springer Verla
g,Berlin）1972中に記載のように行ない、形質転換した
S.エピデルミンの培養の培養濾液10μを濾紙上に捕捉
し、乾燥した。濾紙を試験プレート上に置き、次いでそ
れを37℃で24時間インキュベートした。
ｂ） HPLC 選んだ形質転換株を生産培地中で26時間培養した。培
養ブロスを10分間13,000rpmで遠心分離した。
養ブロスを10分間13,000rpmで遠心分離した。
分離培養液を次いでSP8.700液体クロマトグラフィー
装置〔スペクトラ・フィジックス（Spectra Physics Da
rmstadt,FRG）〕上で移動相として、Ａ）0.5％70％過塩
素酸を有するH2OおよびＢ）アセトニトリルを用いてHPL
Cにかけた。カラム充填物は粒径７μｍのヌクレオシル
（Nucleosil）−100C18であり、カラムサイズは125mm×
4.6mmI.D.およびプレカラムに対する20mm×4.6mmI.D.で
あった。
装置〔スペクトラ・フィジックス（Spectra Physics Da
rmstadt,FRG）〕上で移動相として、Ａ）0.5％70％過塩
素酸を有するH2OおよびＢ）アセトニトリルを用いてHPL
Cにかけた。カラム充填物は粒径７μｍのヌクレオシル
（Nucleosil）−100C18であり、カラムサイズは125mm×
4.6mmI.D.およびプレカラムに対する20mm×4.6mmI.D.で
あった。
勾配は次のとおりであった： 時 間（分） Ａ〔％〕 Ｂ〔％〕 0 77.5 22.5 8 63.0 37.0 8.5 0 100 9.5 0 100 10 77.5 22.5 14 77.5 22.5 生じたクロマトグラムは第7A図中に示される。標準曲
線は第7B図中に示され、ガリデルミンが7.54分で溶出す
ることを示す。
線は第7B図中に示され、ガリデルミンが7.54分で溶出す
ることを示す。
次のものが培地として使用された。
1. FP寒天 肉エキス 4g ペプトン 10g NaCl 3g Na2HPO4 5g グルコース 10g 複合寒天 15g 水 １ pH 7.2 2. FP培地 肉エキス 4g ペプトン 10g NaCl 3g Na2HPO4 5g グルコース 10g 水 １ pH 7.2 3. 生産培地 肉エキス 33 ｇ 麦芽エキス 30 ｇ NaCl 40 ｇ 水酸化カルシウム 3.8g 水 １ pH 6.5
第１図はプレ−エピデルミンのアミノ酸配列を示す図で
あり、第２図は二次構造、屈曲性、ヒドロパシー、親水
性およびヘリックスホィールプロットに対する予想プロ
フィルを示す図であり、第３図および第４図は抗生物質
の生成中に生ずる酵素反応を示す図であり、第５図はタ
ンパク質プロ抗生物質から誘導されたランチオニンペプ
チド抗生物質（ランチバイオティックス）中に認められ
る異常アミノ酸を示す図であり、第６図はプラスミドpC
Udgm1の調製を示す図であり、第７図はpCUdgm1形質転換
S.エピデルミン分泌物のHPLCクロマトグラム（第7A図）
および標準曲線（第7B図）を示す図である。
あり、第２図は二次構造、屈曲性、ヒドロパシー、親水
性およびヘリックスホィールプロットに対する予想プロ
フィルを示す図であり、第３図および第４図は抗生物質
の生成中に生ずる酵素反応を示す図であり、第５図はタ
ンパク質プロ抗生物質から誘導されたランチオニンペプ
チド抗生物質（ランチバイオティックス）中に認められ
る異常アミノ酸を示す図であり、第６図はプラスミドpC
Udgm1の調製を示す図であり、第７図はpCUdgm1形質転換
S.エピデルミン分泌物のHPLCクロマトグラム（第7A図）
および標準曲線（第7B図）を示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:46） Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｒ 1:46） (72)発明者 ローラント ケルナー ドイツ連邦共和国 デー6148 ヘッペン ハイム ドクトル ハー ヴィンター シュトラーセ 17 (72)発明者 カルル ディーテル エンティアン ドイツ連邦共和国 デー7406 メッシン ゲン アホールンヴェーク 12 (72)発明者 ノルベルト シュネル ドイツ連邦共和国 デー8630 コーブル ク ザイトマンスドルフェル シュトラ ーセ 148 (72)発明者 コルティナ カレッタ ドイツ連邦共和国 デー7403 エントリ ンゲン グレッチェンシュトラーセ ９ (72)発明者 フリートリッヒ ゲーツ ドイツ連邦共和国 デー7400 テュービ ンゲン バイム ヘルプシュテンホフ 31 (72)発明者 ロルフ ゲー ヴェルナー ドイツ連邦共和国 デー7950 ビベラッ ハ フーゴ ヘリンク シュトラーセ 72 (72)発明者 ヘルマン アルガイエル ドイツ連邦共和国 デー7950 ビベラッ ハ ケーレスライン 105 (56)参考文献 特開 昭62−14786（ＪＰ，Ａ) 特開 昭61−85199（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 C12N 1/00 - 1/38 C12P 1/00 - 41/00 A61P 31/00 - 31/22 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ) ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ（Ｇ ＥＮＥＴＹＸ)
Claims (4)
- 【請求項１】ガリデルミンをコードする遺伝子を含むプ
ラスミドを含む細菌宿主であって、該遺伝子が、 染色体DNAをS.ガリナラム（DSM4616）から単離し、 該染色体DNAを制限酵素EcoR1で消化し、 プライマーとして配列5'CAC ATC CAG GAG TAC 3'を使用
してガリデルミン構造遺伝子を含む4.7kb EcoR1フラグ
メントを単離し、 該4.7kbフラグメントを発現ベクターのEcoR1部位に連結
させることにより得られ、及び 培養の間に前記宿主が水脱離及びスルフィド架橋形成、
並びに脱炭酸及び二重結合形成を行うことができる多酵
素複合体を与え、それにより少なくとも一つのデヒドロ
アミノ酸及び少なくとも一つのランチオニン架橋を含む
ガリデルミンが生成され、生成されたガリデルミンが前
記宿主にとって外来である前記細菌宿主。 - 【請求項２】宿主が、ストレプトコッカス・ラクチス
（Streptococcus lactice）、バシラス・サチリス（Bac
illus subtilis）、ストレプトマイセス・シンナモネウ
ス（Streptomyces cinnamoneus）、ストレプトマイセス
種（Streptomyces Sp.）、ストレプトベルティカラム・
グリセオベルティシラム（Streptoverticullum griseov
erticillum）、スタヒロコッカス・エピデルミス（Stap
hylococcus epidermis）、スタヒロコッカス・エピデル
ミン（Staphylococcus epidermin）株５又はスタヒロコ
ッカス・ガリナラム（Staphylococcus gallinarum）で
ある、請求項１記載の細菌宿主。 - 【請求項３】宿主がスタヒロコッカス・エピデルミスDS
M3095である請求項１記載の細菌宿主。 - 【請求項４】請求項１〜３いずれか１項記載の細菌宿主
を培養し、得られたガリデルミンを分離することを含む
ガリデルミンを製造する方法。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB888811761A GB8811761D0 (en) | 1988-05-18 | 1988-05-18 | Biosynthetic process for preparation of chemical compounds |
| GB8811761.9 | 1988-05-18 |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2001320159A Division JP3350533B2 (ja) | 1988-05-18 | 2001-10-18 | Ｄｎａ含有プラスミド |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02107191A JPH02107191A (ja) | 1990-04-19 |
| JP3267965B2 true JP3267965B2 (ja) | 2002-03-25 |
Family
ID=10637101
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP12411889A Expired - Lifetime JP3267965B2 (ja) | 1988-05-18 | 1989-05-17 | 化合物製造生合成法 |
| JP2001320159A Expired - Lifetime JP3350533B2 (ja) | 1988-05-18 | 2001-10-18 | Ｄｎａ含有プラスミド |
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|---|---|---|---|
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| Country | Link |
|---|---|
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| JP (2) | JP3267965B2 (ja) |
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| DE (1) | DE68915204T2 (ja) |
| ES (1) | ES2055759T3 (ja) |
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| GB2254852B (en) * | 1991-04-11 | 1995-04-05 | Thomae Gmbh Dr K | Lantibiotic isolation and purification by plural chromatography processes |
| CA2081704C (en) * | 1991-10-31 | 2007-05-01 | Karl-Dieter Entian | Biosynthetic process for the preparation of lantibiotics |
| US5962253A (en) * | 1996-05-13 | 1999-10-05 | Boehringer Ingelheim International Gmbh | Oxidative decarboxylation of peptides catalyzed by flavoprotein EpiD |
| US6861236B2 (en) | 2002-05-24 | 2005-03-01 | Applied Nanosystems B.V. | Export and modification of (poly)peptides in the lantibiotic way |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4716115A (en) * | 1983-09-06 | 1987-12-29 | Microlife Technics, Inc. | Derived nisin producing microorganisms, method of production and use and products obtained thereby |
| US4766066A (en) * | 1984-09-27 | 1988-08-23 | Eli Lilly And Company | Method of using bacteriophage lambda p1 promoter to produce a functional polypeptide in streptomyces |
| GB8517071D0 (en) * | 1985-07-05 | 1985-08-14 | Hoffmann La Roche | Gram-positive expression control sequence |
| GB8811760D0 (en) * | 1988-05-18 | 1988-06-22 | Thomae Gmbh Dr K | Antibiotic |
-
1988
- 1988-05-18 GB GB888811761A patent/GB8811761D0/en active Pending
-
1989
- 1989-05-17 JP JP12411889A patent/JP3267965B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1989-05-18 EP EP89108907A patent/EP0342658B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1989-05-18 DE DE68915204T patent/DE68915204T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1989-05-18 ES ES89108907T patent/ES2055759T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1989-05-18 AT AT8989108907T patent/ATE105584T1/de not_active IP Right Cessation
-
2001
- 2001-10-18 JP JP2001320159A patent/JP3350533B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2002176978A (ja) | 2002-06-25 |
| ATE105584T1 (de) | 1994-05-15 |
| DE68915204T2 (de) | 1994-10-27 |
| ES2055759T3 (es) | 1994-09-01 |
| JPH02107191A (ja) | 1990-04-19 |
| EP0342658A1 (en) | 1989-11-23 |
| EP0342658B1 (en) | 1994-05-11 |
| DE68915204D1 (de) | 1994-06-16 |
| GB8811761D0 (en) | 1988-06-22 |
| JP3350533B2 (ja) | 2002-11-25 |
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