JP2529677B2 - 試薬としてフィブリノ−ゲンを使用する新規な測定 - Google Patents
試薬としてフィブリノ−ゲンを使用する新規な測定Info
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Description
【発明の詳細な説明】 発明の背景 発明の分野 血液凝固物の形成及び阻害に関与する種々の血液因子
の検出の可能性に実質的な関心が払われている。２つの
古典的な手法は遺伝的に欠損を有する血漿又は１つの必
須因子を欠く凝固因子の混合物の使用を含み、そして血
液凝固物の形成をアッセイする１つのケースにおいては
種々の物理的技法を用いる。他のケースにおいては個々
の凝固因子のための特異的な合成基質が使用され、ここ
で、このような因子は酵素であるか、又は酵素因子の活
性を変更する。これらの技法は、高価であり、アッセイ
の実施に技術的熟練を要し、そして試薬の入手及び／又
は調製が困難である点において種々の欠点を有する。
の検出の可能性に実質的な関心が払われている。２つの
古典的な手法は遺伝的に欠損を有する血漿又は１つの必
須因子を欠く凝固因子の混合物の使用を含み、そして血
液凝固物の形成をアッセイする１つのケースにおいては
種々の物理的技法を用いる。他のケースにおいては個々
の凝固因子のための特異的な合成基質が使用され、ここ
で、このような因子は酵素であるか、又は酵素因子の活
性を変更する。これらの技法は、高価であり、アッセイ
の実施に技術的熟練を要し、そして試薬の入手及び／又
は調製が困難である点において種々の欠点を有する。
従って、血液因子の検出のための自動化可能な迅速で
効率的なアッセイのかなりの必要性が存在する。さら
に、種々の方法及びラベルを用いる現在使用可能な多く
のイムノアッセイにもかかわらず、高い感度、及び迅速
性を許容しそして注目する広範な分析対象を検出するこ
とができるアッセイ法を提供することになお関心が持た
れる。
効率的なアッセイのかなりの必要性が存在する。さら
に、種々の方法及びラベルを用いる現在使用可能な多く
のイムノアッセイにもかかわらず、高い感度、及び迅速
性を許容しそして注目する広範な分析対象を検出するこ
とができるアッセイ法を提供することになお関心が持た
れる。
従来技術の記載 CRC Handbook Series in Clinical Laboratory Scien
ce（Seligson編集長）、Section I:Hematology,vol.III
（Schimidt編）1980は個々の因子のアッセイ法を簡便に
要約している。合成基質の使用がFareed等、Clin.Chem.
（1983）29:225−236に記載されている。次のものはフ
ィブリノーゲンがプラスチック表面に非常に強固に結合
すると報告している:Parsons,Meth.Enzymology（1981）
73:224−239;Pesce,Biochim.Biophys.Acta（1977）492:
399−407;及びMorrisey,Ann.N.Y.Acad.Sci.（1977）28
3:50−64。次のものは、プラスチックに結合したフィブ
リノーゲンがフィブリン沈着のマトリクスとして役立つ
であろうことを報告している:Ihlenfeld及びCooper,J.B
iomed.Mat.Res.（1979）13:577−591及びPackman等、J.
Lab.& Clin.Med.（1969）73:686−697。
ce（Seligson編集長）、Section I:Hematology,vol.III
（Schimidt編）1980は個々の因子のアッセイ法を簡便に
要約している。合成基質の使用がFareed等、Clin.Chem.
（1983）29:225−236に記載されている。次のものはフ
ィブリノーゲンがプラスチック表面に非常に強固に結合
すると報告している:Parsons,Meth.Enzymology（1981）
73:224−239;Pesce,Biochim.Biophys.Acta（1977）492:
399−407;及びMorrisey,Ann.N.Y.Acad.Sci.（1977）28
3:50−64。次のものは、プラスチックに結合したフィブ
リノーゲンがフィブリン沈着のマトリクスとして役立つ
であろうことを報告している:Ihlenfeld及びCooper,J.B
iomed.Mat.Res.（1979）13:577−591及びPackman等、J.
Lab.& Clin.Med.（1969）73:686−697。
発明の概要 不溶化されたフィブリノーゲンの存在下でのラベルさ
れたフィブリンの形成によるラベルされたフィブリノー
ゲンの酵素触媒不溶化に基礎を置き、さらに酵素で触媒
されたフィブリン形成に従い、これによってラベル化フ
ィブリン−不溶化フィブリン複合体が不溶化フィブリノ
ーゲンの部位において形成されるような、新規な方法及
び組成物が提供される。この方法は広範囲の種類の分析
対象の検出のために使用することができ、凝血の形成及
び凝血形成の阻害に関与する血液因子を直接的に、そし
てハトプテン、抗原、及びリセプター、特に抗体を包含
する広範囲の種類の分析対象を間接的に検出することが
できる。
れたフィブリンの形成によるラベルされたフィブリノー
ゲンの酵素触媒不溶化に基礎を置き、さらに酵素で触媒
されたフィブリン形成に従い、これによってラベル化フ
ィブリン−不溶化フィブリン複合体が不溶化フィブリノ
ーゲンの部位において形成されるような、新規な方法及
び組成物が提供される。この方法は広範囲の種類の分析
対象の検出のために使用することができ、凝血の形成及
び凝血形成の阻害に関与する血液因子を直接的に、そし
てハトプテン、抗原、及びリセプター、特に抗体を包含
する広範囲の種類の分析対象を間接的に検出することが
できる。
具体的態様の記載 この方法は、固体基体に結合したフィブリノーゲン、
ラベル化フィブリノーゲン、アッセイがトロンビンに対
するものである場合を除きトロンビン又はプロトロンビ
ン、並びにトロンビンによるフィブリンの形成及び注目
の分析対象の検出と関連する他の補助的試薬を用いる。
凝血形成の相似としてプラトー値が観察される場合、エ
ンドポイント決定法を用いることができ、あるいは複合
体形成についての速度の決定を効果的に得るように１又
は複数の決定を行うことができるある中間段階を選択す
ることができる。一旦複合体が形成された後、複合体中
に存在するラベルの量の決定はラベルの種類に応じて容
易に決定することができる。
ラベル化フィブリノーゲン、アッセイがトロンビンに対
するものである場合を除きトロンビン又はプロトロンビ
ン、並びにトロンビンによるフィブリンの形成及び注目
の分析対象の検出と関連する他の補助的試薬を用いる。
凝血形成の相似としてプラトー値が観察される場合、エ
ンドポイント決定法を用いることができ、あるいは複合
体形成についての速度の決定を効果的に得るように１又
は複数の決定を行うことができるある中間段階を選択す
ることができる。一旦複合体が形成された後、複合体中
に存在するラベルの量の決定はラベルの種類に応じて容
易に決定することができる。
分析対象に依存して種々の方法を用いることができ
る。異る分析対象は異る方法及び試薬を必要とするであ
ろう。基体に結合したフィブリノーゲン、及びラベルさ
れたフィブリノーゲンであってそれは単独のもの又は非
ラベル化フィブリノーゲンと組み合わせたものはすべて
の方法に共通であろう。
る。異る分析対象は異る方法及び試薬を必要とするであ
ろう。基体に結合したフィブリノーゲン、及びラベルさ
れたフィブリノーゲンであってそれは単独のもの又は非
ラベル化フィブリノーゲンと組み合わせたものはすべて
の方法に共通であろう。
トロンビンのアッセイ法は凝固物形成のための追加の
試薬を必要としないであろう。但し、他の試薬を使用す
ることも可能であろう。分析対象がトロンビンを活性化
するか又は阻害する場合、このような分析対象のための
アッセイ媒体にはトロンビンが添加されるかも知れな
い。
試薬を必要としないであろう。但し、他の試薬を使用す
ることも可能であろう。分析対象がトロンビンを活性化
するか又は阻害する場合、このような分析対象のための
アッセイ媒体にはトロンビンが添加されるかも知れな
い。
凝固因子が分析対象である場合、アッセイ媒体中に、
プロトロンビンからトロンビンを生成するために分析対
象が必要とする他の因子、及びプロトロンビンを含める
ことが必要であろう。同様に、分析対象が特定の因子を
活性化し又は阻害する場合、プロトロンビンのトロンビ
ンへの開裂のために必要な追加の因子と共にその因子が
含まれよう。因子の混合物は注目の因子が欠損している
稀釈された血漿、又は凝固カスケードを完成する注目の
因子を欠く精製された因子の混合物であることができよ
う。
プロトロンビンからトロンビンを生成するために分析対
象が必要とする他の因子、及びプロトロンビンを含める
ことが必要であろう。同様に、分析対象が特定の因子を
活性化し又は阻害する場合、プロトロンビンのトロンビ
ンへの開裂のために必要な追加の因子と共にその因子が
含まれよう。因子の混合物は注目の因子が欠損している
稀釈された血漿、又は凝固カスケードを完成する注目の
因子を欠く精製された因子の混合物であることができよ
う。
本発明においては、血液凝固カスケードの因子並びに
それらの因子を活性化又は阻害する因子を、液血凝固カ
スケードに関与する物質、又は液血凝固関連物質等と称
する場合がある。
それらの因子を活性化又は阻害する因子を、液血凝固カ
スケードに関与する物質、又は液血凝固関連物質等と称
する場合がある。
最後に、血液凝固又は血液凝固の調節に関与する試薬
と分析対象との結合体を使用することができよう。この
ような試薬はプロトロンビン、トロンビン、フィブリノ
ーゲン以外の他の凝固因子、又はトロンビンもしくは他
の凝固因子の活性化剤又は阻害剤であることができよ
う。これらの物質を本発明においては「凝固カスケード
関連物質」と称する場合がある。この試薬は分析対象と
凝血形成に影響を与えるその相補的結合員との間の複合
体形成の結果として、凝血に対する効果を有する。（複
合体形成とは、リガンド及びリセプターが特異的結合対
を構成する場合、リガンドとその相補的リセプターとの
非共有結合を意味する。） 種々の試薬が混合され、そして中間段階又は凝血形成
まで反応が起こるのに十分な時間にわたってインキュベ
ートされるであろう。次に液相が除去され、すべての非
特異的に結合したラベルを除去するために固相が洗浄さ
れ、そして表面に結合したラベルの量が、存在する分析
対象の量の指標として決定される。
と分析対象との結合体を使用することができよう。この
ような試薬はプロトロンビン、トロンビン、フィブリノ
ーゲン以外の他の凝固因子、又はトロンビンもしくは他
の凝固因子の活性化剤又は阻害剤であることができよ
う。これらの物質を本発明においては「凝固カスケード
関連物質」と称する場合がある。この試薬は分析対象と
凝血形成に影響を与えるその相補的結合員との間の複合
体形成の結果として、凝血に対する効果を有する。（複
合体形成とは、リガンド及びリセプターが特異的結合対
を構成する場合、リガンドとその相補的リセプターとの
非共有結合を意味する。） 種々の試薬が混合され、そして中間段階又は凝血形成
まで反応が起こるのに十分な時間にわたってインキュベ
ートされるであろう。次に液相が除去され、すべての非
特異的に結合したラベルを除去するために固相が洗浄さ
れ、そして表面に結合したラベルの量が、存在する分析
対象の量の指標として決定される。
すでに示したように、この発明のアッセイは“直接
的”に又は“間接的”に行うことができ、ここで間接法
はトロンビンの生成又はトロンビン活性に影響を与える
競争的又は二次的相互作用を用い、他方直接法は注目の
分析対象がトロンビンの生成又はトロンビン活性に対す
る活性化又は阻害のいずれかの直接的効果を有すること
を意味する。
的”に又は“間接的”に行うことができ、ここで間接法
はトロンビンの生成又はトロンビン活性に影響を与える
競争的又は二次的相互作用を用い、他方直接法は注目の
分析対象がトロンビンの生成又はトロンビン活性に対す
る活性化又は阻害のいずれかの直接的効果を有すること
を意味する。
直接法において考慮されるべき第１のアッセイ法は血
液因子を用いるアッセイ法である。アッセイの方法は、
因子が外因系（extrinsic）又は内因系（intrinsic）経
路の成分であるかあるいは共通（common）経路と称され
る両経路と関連するかに依存して幾分異るであろう。内
因系経路に関与する因子はVIII、IX、XI、及びXIIを包
含し、他方外因系経路に関与する因子はIII（組織因
子）及びVIIである。共通経路に関与する因子はＶ、
Ｘ、XIII、Ｉ（フィブリノーゲン）及びII（プロトロン
ビン）を包含する。
液因子を用いるアッセイ法である。アッセイの方法は、
因子が外因系（extrinsic）又は内因系（intrinsic）経
路の成分であるかあるいは共通（common）経路と称され
る両経路と関連するかに依存して幾分異るであろう。内
因系経路に関与する因子はVIII、IX、XI、及びXIIを包
含し、他方外因系経路に関与する因子はIII（組織因
子）及びVIIである。共通経路に関与する因子はＶ、
Ｘ、XIII、Ｉ（フィブリノーゲン）及びII（プロトロン
ビン）を包含する。
ヒトの凝固因子欠損血漿は商業的に入手可能であり、
ここでこの血漿は特定の因子又は因子群を欠いている。
これらの血漿はアッセイにおいて、及び遺伝的欠損を有
するか又は活性化することができる凝固因子を十分に有
しない他の理由を有すると予想される血漿と比較するた
めの標準として、使用されるであろう。内因系経路の因
子（VIII、IX、XI、及びXII）が欠損していると信じら
れる血漿はセライト又はカオリン＋脂質により刺激され
得、他方外因系経路（VII）を欠く血漿は組織因子（ト
ロンボプラスチン、III）により刺激され得るであろ
う。注目の因子を欠く精製された因子の混合物を調製す
ることも、幾つかの場合において個々の因子を活性化す
ることができる酸素、例えばヘビ毒ファクターＸ活性化
因子又はファクターＶ活性化因子を用いて、可能であろ
う。共通経路（Ｘ、II、Ｖ）の因子を測定する場合この
方法は特に好ましい。なぜなら一層少数の精製された因
子が必要とされるはずだからである。
ここでこの血漿は特定の因子又は因子群を欠いている。
これらの血漿はアッセイにおいて、及び遺伝的欠損を有
するか又は活性化することができる凝固因子を十分に有
しない他の理由を有すると予想される血漿と比較するた
めの標準として、使用されるであろう。内因系経路の因
子（VIII、IX、XI、及びXII）が欠損していると信じら
れる血漿はセライト又はカオリン＋脂質により刺激され
得、他方外因系経路（VII）を欠く血漿は組織因子（ト
ロンボプラスチン、III）により刺激され得るであろ
う。注目の因子を欠く精製された因子の混合物を調製す
ることも、幾つかの場合において個々の因子を活性化す
ることができる酸素、例えばヘビ毒ファクターＸ活性化
因子又はファクターＶ活性化因子を用いて、可能であろ
う。共通経路（Ｘ、II、Ｖ）の因子を測定する場合この
方法は特に好ましい。なぜなら一層少数の精製された因
子が必要とされるはずだからである。
ほとんどの場合異る種からの因子は交差反応をもたら
すであろうから、多くの場合において分析対象の種と同
一の種の因子を使用することは必要ないであろう。すな
わち、種々の凝固因子について及び決定される特定の種
の使用について、既知量の活性を有するサンプルを用い
て因子が検定され得る場合、マウス、ラビット、ラッ
ト、モンキー、ウシ、ヒト等のごとき色々な種からの因
子を使用することができる。すなわち、ヒトの分析対象
のためのこの発明のアッセイにおいてヒトの因子を使用
する必要はない。但し、これが好ましいことが証明され
るかも知れない。
すであろうから、多くの場合において分析対象の種と同
一の種の因子を使用することは必要ないであろう。すな
わち、種々の凝固因子について及び決定される特定の種
の使用について、既知量の活性を有するサンプルを用い
て因子が検定され得る場合、マウス、ラビット、ラッ
ト、モンキー、ウシ、ヒト等のごとき色々な種からの因
子を使用することができる。すなわち、ヒトの分析対象
のためのこの発明のアッセイにおいてヒトの因子を使用
する必要はない。但し、これが好ましいことが証明され
るかも知れない。
この発明の技法は特定の凝固因子についてのみなら
ず、１又は複数の因子を活性化又は阻害する天然の又は
合成材料についても使用され得る。すなわち、１又は複
数の血液因子の活性を変える物質の存在を測定するため
にもこの発明の方法を使用することができる。サンプル
中の特定の因子の活性を決定しようとする場合、血液サ
ンプルを採取し、これを１又は複数の、通常多数の稀釈
度に稀釈し、そしてアッセイされるべき因子を欠き血漿
中にこれを添加する。この態様において、凝固形成に対
するサンプルの寄与は分析対象を除き無視できるほど小
さく、従って観察される効果はもっぱら血漿中の注目の
特定の因子の結果であるか、又はこの寄与は標準に関連
付けられ得るであろう。同様に、生理的サンプル中に存
在するであろう内因性活性化因子又は阻害因子を研究し
ようとする場合、血漿の稀釈釈物をすべての因子を含有
する媒体に添加する。この場合、これらの因子はサンプ
ルからの寄与を圧倒するのに十分な量で媒体中に存在す
る。他方、分析されるべき特定の材料を実質的に濃縮し
て凝固経路に関与する他の因子を含有しないようにする
ことができる場合には、その濃縮物を使用することがで
き、そして媒体中に存在する種々に因子の量は正常な血
清の実質的な稀釈から濃縮物にまでわたることができ
る。
ず、１又は複数の因子を活性化又は阻害する天然の又は
合成材料についても使用され得る。すなわち、１又は複
数の血液因子の活性を変える物質の存在を測定するため
にもこの発明の方法を使用することができる。サンプル
中の特定の因子の活性を決定しようとする場合、血液サ
ンプルを採取し、これを１又は複数の、通常多数の稀釈
度に稀釈し、そしてアッセイされるべき因子を欠き血漿
中にこれを添加する。この態様において、凝固形成に対
するサンプルの寄与は分析対象を除き無視できるほど小
さく、従って観察される効果はもっぱら血漿中の注目の
特定の因子の結果であるか、又はこの寄与は標準に関連
付けられ得るであろう。同様に、生理的サンプル中に存
在するであろう内因性活性化因子又は阻害因子を研究し
ようとする場合、血漿の稀釈釈物をすべての因子を含有
する媒体に添加する。この場合、これらの因子はサンプ
ルからの寄与を圧倒するのに十分な量で媒体中に存在す
る。他方、分析されるべき特定の材料を実質的に濃縮し
て凝固経路に関与する他の因子を含有しないようにする
ことができる場合には、その濃縮物を使用することがで
き、そして媒体中に存在する種々に因子の量は正常な血
清の実質的な稀釈から濃縮物にまでわたることができ
る。
種々の成分を同時に又は逐次的に混合することができ
る。好ましくは、サンプル及び適切な因子を有する媒体
中のラベルされたフィブリノーゲンを支持体に結合した
フィブリノーゲンと混合し、次にカルシウムのごとき活
性化剤を添加する。次に混合物を反応が起るために十分
な時間インキュベートする。事情により、反応をレート
法又はエンドポイント法として行うことができ、エンド
ポイント法が特に好ましい。表面に結合したラベルに基
ずく検出可能なシグナルが存在しない時間が存在し、そ
して次に表面に結合したラベルが急速に増加して限界値
に達することを認識すべきである。従って、サンプルの
種々の濃度を持つことにより、最大値又は最大値よりす
ぐ下の値を与える第１の濃度である最高濃度を見ること
ができる。次にこの値を特定の因子、活性化因子又は阻
害因子の濃度又は活性量に翻訳することができる。
る。好ましくは、サンプル及び適切な因子を有する媒体
中のラベルされたフィブリノーゲンを支持体に結合した
フィブリノーゲンと混合し、次にカルシウムのごとき活
性化剤を添加する。次に混合物を反応が起るために十分
な時間インキュベートする。事情により、反応をレート
法又はエンドポイント法として行うことができ、エンド
ポイント法が特に好ましい。表面に結合したラベルに基
ずく検出可能なシグナルが存在しない時間が存在し、そ
して次に表面に結合したラベルが急速に増加して限界値
に達することを認識すべきである。従って、サンプルの
種々の濃度を持つことにより、最大値又は最大値よりす
ぐ下の値を与える第１の濃度である最高濃度を見ること
ができる。次にこの値を特定の因子、活性化因子又は阻
害因子の濃度又は活性量に翻訳することができる。
この発明の方法が、トロンビン活性を変更するために
複合体の形成を許容することにより、任意の分析対象を
検出するための簡単な技法を提供するという事実も同様
に重要である。トロンビン、支持体に結合したフィブリ
ノーゲン及びラベル化フィブリノーゲンの組合わせの使
用をトロンビン活性の変更を許容する任意の系に結びつ
けることができる。種々の系が開発されており、そして
この発明の検出系と共に使用することができる。
複合体の形成を許容することにより、任意の分析対象を
検出するための簡単な技法を提供するという事実も同様
に重要である。トロンビン、支持体に結合したフィブリ
ノーゲン及びラベル化フィブリノーゲンの組合わせの使
用をトロンビン活性の変更を許容する任意の系に結びつ
けることができる。種々の系が開発されており、そして
この発明の検出系と共に使用することができる。
１つの態様において、トロンビン活性化因子又は阻害
因子を注目の分析対象とリンクさせるが、この場合注目
の分析対象への抗体又は他のリセプターの結合が、トロ
ンビン活性化因子又は阻害因子（調節因子）がトロンビ
ンと相互作用するのを阻害するであろう。次に、分析対
象へのリセプターに対する接合体と分析対象との間の競
争アッセイを行い、次に競争アッセイ媒体を結合したフ
ィブリノーゲンの存在下で既知量のトロンビン及びラベ
ル化フィブリノーゲンと混合することができる。分析対
象が特定の限界濃度より高濃度に存在するか又は低濃度
に存在するかについてのみ関心がある場合、限界濃度よ
り高濃度に分析対象が存在することを示すものとして、
所定時間内に凝血が起ったか否かを容易に決定すること
ができる。分析対象の量について定量的決定が望まれる
場合、サンプルの異る濃度においてアッセイを逐次的に
行い、そしてプラトー値又はプラトーのすぐ下の値が得
られる濃度を、分析対象の濃度の指標として決定するこ
とができる。
因子を注目の分析対象とリンクさせるが、この場合注目
の分析対象への抗体又は他のリセプターの結合が、トロ
ンビン活性化因子又は阻害因子（調節因子）がトロンビ
ンと相互作用するのを阻害するであろう。次に、分析対
象へのリセプターに対する接合体と分析対象との間の競
争アッセイを行い、次に競争アッセイ媒体を結合したフ
ィブリノーゲンの存在下で既知量のトロンビン及びラベ
ル化フィブリノーゲンと混合することができる。分析対
象が特定の限界濃度より高濃度に存在するか又は低濃度
に存在するかについてのみ関心がある場合、限界濃度よ
り高濃度に分析対象が存在することを示すものとして、
所定時間内に凝血が起ったか否かを容易に決定すること
ができる。分析対象の量について定量的決定が望まれる
場合、サンプルの異る濃度においてアッセイを逐次的に
行い、そしてプラトー値又はプラトーのすぐ下の値が得
られる濃度を、分析対象の濃度の指標として決定するこ
とができる。
他の方法として、凝固カスケード中の１つの因子（例
えば、トロンビン、Xa、VIIa、組織因子）を分析対象、
特にハプテン性分析対象と接合せしめ、そして均一アッ
セイ又は不均一アッセイを行うことができる。均一アッ
セイは抗体とその活性を変える因子との結合を用いる。
不均一アッセイは因子の接合体と分析対象のためのリセ
プターを含む支持体との結合を用いる。分析対象と因子
に接合した分析対象との間の競争アッセイを行い、そし
て次に補体を除去することができる。次に、結合した因
子の量を、固相に結合した特定の因子についてのアッセ
イにより決定する。結合した因子の量はサンプル中の分
析対象の量に逆比例し、そして上記の技法を用いること
によってサンプル中の分析対象の量を定性的又は定量的
に決定することができる。同様の技法はアフィニティー
カラムを用いることができ、この場合カラム中に保持さ
れた因子の量がサンプル中の分析対象の量に逆比例す
る。分析対象への接合のために選択される因子はアッセ
イのために望まれる感度に依存するであろう。すなわ
ち、ファクターVIIa及びIII（組織因子）はピコグラム/
mlのレンジで検出することができ、他方トロンビンはナ
ノグラム/mlの範囲で検出することができる。アッセイ
のエンドポイントを検出するための１つの方法により、
任意の分析対象のアッセイのための感度範囲を選択する
ことができることはこの方法の十分な利点の１つであ
る。
えば、トロンビン、Xa、VIIa、組織因子）を分析対象、
特にハプテン性分析対象と接合せしめ、そして均一アッ
セイ又は不均一アッセイを行うことができる。均一アッ
セイは抗体とその活性を変える因子との結合を用いる。
不均一アッセイは因子の接合体と分析対象のためのリセ
プターを含む支持体との結合を用いる。分析対象と因子
に接合した分析対象との間の競争アッセイを行い、そし
て次に補体を除去することができる。次に、結合した因
子の量を、固相に結合した特定の因子についてのアッセ
イにより決定する。結合した因子の量はサンプル中の分
析対象の量に逆比例し、そして上記の技法を用いること
によってサンプル中の分析対象の量を定性的又は定量的
に決定することができる。同様の技法はアフィニティー
カラムを用いることができ、この場合カラム中に保持さ
れた因子の量がサンプル中の分析対象の量に逆比例す
る。分析対象への接合のために選択される因子はアッセ
イのために望まれる感度に依存するであろう。すなわ
ち、ファクターVIIa及びIII（組織因子）はピコグラム/
mlのレンジで検出することができ、他方トロンビンはナ
ノグラム/mlの範囲で検出することができる。アッセイ
のエンドポイントを検出するための１つの方法により、
任意の分析対象のアッセイのための感度範囲を選択する
ことができることはこの方法の十分な利点の１つであ
る。
他の方法において、個々の因子に対して特異的であ
り、その活性を阻害するモノクローナル抗体を調製する
ことができる。抗体及び分析対象を接合せしめ、そして
表面に結合した特異的結合対の他方の構成員に対する抗
体接合体の分析対象とサンプル中の分析対象との間の競
争を行うことにより、上清媒体中の阻害抗体の量をサン
プル中の分析対象の量に関連付けることができる。
り、その活性を阻害するモノクローナル抗体を調製する
ことができる。抗体及び分析対象を接合せしめ、そして
表面に結合した特異的結合対の他方の構成員に対する抗
体接合体の分析対象とサンプル中の分析対象との間の競
争を行うことにより、上清媒体中の阻害抗体の量をサン
プル中の分析対象の量に関連付けることができる。
次に、上清を検出系と混合してサンプル中の分析対象
の量を決定する。
の量を決定する。
ELISA法を用いることもでき、この場合、支持体に結
合した反対の結合員に対して分析対象と競争する因子の
接合体が用いられる。表面に結合した因子の接合体の量
又は上清に残った量を検出系を用いて決定することがで
きる。
合した反対の結合員に対して分析対象と競争する因子の
接合体が用いられる。表面に結合した因子の接合体の量
又は上清に残った量を検出系を用いて決定することがで
きる。
トロンビン阻害因子又は活性化因子として使用するこ
とができる化合物には、ベンズアミジン、アンチ−トロ
ンビンIII、セリンプロテアーゼ阻害剤、α2−マクログ
ロブリン、α1−アンチトリプシン、Ｃ−１エステラー
ゼインヒビターが含まれる。
とができる化合物には、ベンズアミジン、アンチ−トロ
ンビンIII、セリンプロテアーゼ阻害剤、α2−マクログ
ロブリン、α1−アンチトリプシン、Ｃ−１エステラー
ゼインヒビターが含まれる。
フィブリノーゲンのラベルとして、凝血を妨害しない
が検出が可能な任意の分子を用いることができる。種々
のラベル、例えば酵素、放射性核種、蛍光物質、化学発
光物質、酵素基質及びコーファクター、酵素阻害剤等が
使用されている。ラベルは直接的又は間接的にフィブリ
ノーゲンに結合することができ、この場合種々の結合
基、例えば抗体、ハプテン−リセプター、例えばビオチ
ン−アビジン、ポリヌクレオチド等が用いられる。これ
らの種々の材料の使用を記載する多くの特許が発行して
おり、例えば、米国特許No.Re 29,169、Re 29,955、3,6
54,090、3,690,834、3,817,837、3,867、517、3,935,07
4、3,975,511、3,996,345、及び4,020,151が例示され
る。
が検出が可能な任意の分子を用いることができる。種々
のラベル、例えば酵素、放射性核種、蛍光物質、化学発
光物質、酵素基質及びコーファクター、酵素阻害剤等が
使用されている。ラベルは直接的又は間接的にフィブリ
ノーゲンに結合することができ、この場合種々の結合
基、例えば抗体、ハプテン−リセプター、例えばビオチ
ン−アビジン、ポリヌクレオチド等が用いられる。これ
らの種々の材料の使用を記載する多くの特許が発行して
おり、例えば、米国特許No.Re 29,169、Re 29,955、3,6
54,090、3,690,834、3,817,837、3,867、517、3,935,07
4、3,975,511、3,996,345、及び4,020,151が例示され
る。
基体に結合したフィブリノーゲンは種々の方法で存在
することができ、便利にはミクロタイターウエルの壁、
毛細管の壁、粒子、例えば磁性粒子、ポリサッカライド
等、又はラベルが測定され得る部位に凝血が局在する他
の表面に結合することができる。特に興味あるのはミク
ロタイタープレートであり、この場合シグナルをミクロ
タイタープレートリーダーにより測定することができ
る。これらのリーダーは現在市販されている。
することができ、便利にはミクロタイターウエルの壁、
毛細管の壁、粒子、例えば磁性粒子、ポリサッカライド
等、又はラベルが測定され得る部位に凝血が局在する他
の表面に結合することができる。特に興味あるのはミク
ロタイタープレートであり、この場合シグナルをミクロ
タイタープレートリーダーにより測定することができ
る。これらのリーダーは現在市販されている。
フィブリノーゲンは基体表面に種々の濃度でコートさ
れ得る。便利にはフィブリノーゲンの溶液を表面に噴霧
し、塗布し、又は他の任意の便利な手段で適用し、そし
て自然乾燥する。フィブリノーゲンの量は一般に約１〜
10μg/ウエルである。一般に約６〜９の範囲のpHの任意
の便利に緩衝化された溶液を使用することができる。表
面をコートした後、周囲温度又はわずかに上昇した温度
条件下で真空を伴って又は伴わないで乾燥する。表面へ
の非特異的な結合を実質的に減少せしめるか又は除去す
るため、表面を不活性蛋白質、例えば血清アルブミンで
コートすることができる。この場合、蛋白質が表面に結
合するのに十分な時間にわたって表面を１〜20mg/mlの
蛋白質を有する溶液と接触せしめ、次に洗浄しそして穏
和に乾燥する。次に、フィブリノーゲンを中程度に湿潤
な環境に保持することによってその継続する活性を保証
すべきであり、これは少量の水を表面に接触せしめるこ
とにより、例えばウエルを使用直前までシールすること
により達成することができる。
れ得る。便利にはフィブリノーゲンの溶液を表面に噴霧
し、塗布し、又は他の任意の便利な手段で適用し、そし
て自然乾燥する。フィブリノーゲンの量は一般に約１〜
10μg/ウエルである。一般に約６〜９の範囲のpHの任意
の便利に緩衝化された溶液を使用することができる。表
面をコートした後、周囲温度又はわずかに上昇した温度
条件下で真空を伴って又は伴わないで乾燥する。表面へ
の非特異的な結合を実質的に減少せしめるか又は除去す
るため、表面を不活性蛋白質、例えば血清アルブミンで
コートすることができる。この場合、蛋白質が表面に結
合するのに十分な時間にわたって表面を１〜20mg/mlの
蛋白質を有する溶液と接触せしめ、次に洗浄しそして穏
和に乾燥する。次に、フィブリノーゲンを中程度に湿潤
な環境に保持することによってその継続する活性を保証
すべきであり、これは少量の水を表面に接触せしめるこ
とにより、例えばウエルを使用直前までシールすること
により達成することができる。
アッセイは穏和な温度条件下で、一般に約10℃〜40
℃、さらに通常は約20℃〜37℃で行うことができる。種
々の試薬の濃度は、特定の方法、分析されるべきもの、
注目の分析対象の濃度範囲、定量測定又は定性測定のい
ずれが必要であるか、アッセイ時間等に依存して広く異
るであろう。すなわち、アッセイ時間は約１分間〜６時
間であり、さらに普通には約１分間〜２時間である。イ
ンキュベーション時間は約１分間〜２時間又はそれ以上
の範囲であろう。使用される媒体は通常水性媒体であ
り、この場合少量の、通常40容量％未満の、さらに普通
には約10容量％未満の極性有機溶剤を導入することがで
きる。溶液は一般に約６〜９の範囲のpH、さらに普通に
は約７〜8.5の範囲のpHに緩衝化されるであろう。凝固
反応を阻害しない種々の緩衝剤、例えばリン酸塩、Tris
等を使用することができる。
℃、さらに通常は約20℃〜37℃で行うことができる。種
々の試薬の濃度は、特定の方法、分析されるべきもの、
注目の分析対象の濃度範囲、定量測定又は定性測定のい
ずれが必要であるか、アッセイ時間等に依存して広く異
るであろう。すなわち、アッセイ時間は約１分間〜６時
間であり、さらに普通には約１分間〜２時間である。イ
ンキュベーション時間は約１分間〜２時間又はそれ以上
の範囲であろう。使用される媒体は通常水性媒体であ
り、この場合少量の、通常40容量％未満の、さらに普通
には約10容量％未満の極性有機溶剤を導入することがで
きる。溶液は一般に約６〜９の範囲のpH、さらに普通に
は約７〜8.5の範囲のpHに緩衝化されるであろう。凝固
反応を阻害しない種々の緩衝剤、例えばリン酸塩、Tris
等を使用することができる。
種々の方法におけるラベルとして哺乳類血液源以外か
らの因子−活性化剤を使用することができる。因子−活
性化剤、例えばヘビ毒ファクターＸアクチベーター、例
えばルッセル（Russell）のマムシ素のプロテアーゼ成
分を不均一アッセイ又は均一アッセイの両者において使
用することができる。
らの因子−活性化剤を使用することができる。因子−活
性化剤、例えばヘビ毒ファクターＸアクチベーター、例
えばルッセル（Russell）のマムシ素のプロテアーゼ成
分を不均一アッセイ又は均一アッセイの両者において使
用することができる。
不均一アッセイにおいては、酵素はラベルであること
ができ、又はラベルとして酵素が作用する血液因子であ
ることができる。別の方法として、酵素に対する抗体又
は他のリセプター（酵素−リセプター複合体は酵素活性
を維持する）がラベルであってもよい。すなわち、ラベ
ルはプロテアーゼの結合を提供する任意の化合物である
ことができる。
ができ、又はラベルとして酵素が作用する血液因子であ
ることができる。別の方法として、酵素に対する抗体又
は他のリセプター（酵素−リセプター複合体は酵素活性
を維持する）がラベルであってもよい。すなわち、ラベ
ルはプロテアーゼの結合を提供する任意の化合物である
ことができる。
アッセイは、適切な試薬、例えば競争アッセイにおい
ては、分析対象−酵素接合体及び支持体に結合した均一
な特異的結合対構成員、又はサンドイッチ型アッセイに
おいては、分析対象に対する特異的結合対構成員−酵素
接合体及び支持体に結合した同一の又は異る分析対象に
対する特異的結合対構成員、を混合し、この混合物をイ
ンキュベートし、そして次にフィブリノーゲンからフィ
ブリンへの反応のため及び生成したフィブリンの量の検
出のための追加の試薬を添加することにより行うことが
できる。
ては、分析対象−酵素接合体及び支持体に結合した均一
な特異的結合対構成員、又はサンドイッチ型アッセイに
おいては、分析対象に対する特異的結合対構成員−酵素
接合体及び支持体に結合した同一の又は異る分析対象に
対する特異的結合対構成員、を混合し、この混合物をイ
ンキュベートし、そして次にフィブリノーゲンからフィ
ブリンへの反応のため及び生成したフィブリンの量の検
出のための追加の試薬を添加することにより行うことが
できる。
“均一”法（米国特許No.3,817,837を参照のこと）に
おいては、プロテアーゼを分析対象に、又は分析対象と
免疫的に競争する化合物、通常はハプテンに接合せし
め、リセプターの結合の後、酵素活性が酵素に結合した
リセプターの量に関連して変化する、通常は低下する様
にする。分析対象及び接合体を限定された量のリセプタ
ーと競争せしめることにより、得られる酵素活性を媒体
中の分析対象の量と関係付けることができる。
おいては、プロテアーゼを分析対象に、又は分析対象と
免疫的に競争する化合物、通常はハプテンに接合せし
め、リセプターの結合の後、酵素活性が酵素に結合した
リセプターの量に関連して変化する、通常は低下する様
にする。分析対象及び接合体を限定された量のリセプタ
ーと競争せしめることにより、得られる酵素活性を媒体
中の分析対象の量と関係付けることができる。
この発明の方法は、ハプテン性又は抗原性の、任意の
タイプのリガンド、リセプター、ポリヌクレオチド等と
共に使用することができる。前に記載した血液因子のほ
かに、薬物、ホルモン、酵素、リンホカイン、神経伝達
物質、膜蛋白質、制御蛋白質、成長因子等がすべて関心
がもたれる。
タイプのリガンド、リセプター、ポリヌクレオチド等と
共に使用することができる。前に記載した血液因子のほ
かに、薬物、ホルモン、酵素、リンホカイン、神経伝達
物質、膜蛋白質、制御蛋白質、成長因子等がすべて関心
がもたれる。
この発明の使用を助けるため、この方法の感度を最適
にするための好ましい比率で種々の試薬を含むキットを
提供することができる。血液因子の決定のため、プロト
ロンビン、ラベル化フィブリノーゲン、フィブリノーゲ
ンがコートされた容器、特にミクロタイタープレート、
及び１又は複数の因子を欠く血漿を、異る因子の検出の
ために備えることができる。フィブリンがコートされた
支持体以外の種々の試薬は、再溶解され得る凍結乾燥試
薬として提供することができ、そして緩衝剤、安定剤、
不活性蛋白質、例えば血清アルブミン等と組み合わせて
調製される。幾つかの適用のためには、その試薬をミク
ロタイターウエル中で、アッセイのために適当な濃度に
おいて冷結乾燥するのが好ましい。血液因子以外のもの
が関与する場合、キットは分析対象と、プロトロンビン
の代りにトロンビンとの組合わせにおいてトロンビンの
活性を変える分子との接合体を含むことができる。酵素
がラベルである場合、他の試薬、例えば酵素基質及びコ
ーファクターもキットに含めることができる。
にするための好ましい比率で種々の試薬を含むキットを
提供することができる。血液因子の決定のため、プロト
ロンビン、ラベル化フィブリノーゲン、フィブリノーゲ
ンがコートされた容器、特にミクロタイタープレート、
及び１又は複数の因子を欠く血漿を、異る因子の検出の
ために備えることができる。フィブリンがコートされた
支持体以外の種々の試薬は、再溶解され得る凍結乾燥試
薬として提供することができ、そして緩衝剤、安定剤、
不活性蛋白質、例えば血清アルブミン等と組み合わせて
調製される。幾つかの適用のためには、その試薬をミク
ロタイターウエル中で、アッセイのために適当な濃度に
おいて冷結乾燥するのが好ましい。血液因子以外のもの
が関与する場合、キットは分析対象と、プロトロンビン
の代りにトロンビンとの組合わせにおいてトロンビンの
活性を変える分子との接合体を含むことができる。酵素
がラベルである場合、他の試薬、例えば酵素基質及びコ
ーファクターもキットに含めることができる。
次の例は説明のために提供され、そして限定するもの
ではない。
ではない。
実験 フィブリノーゲン−パーオキシダーゼ接合体 これは、40mgの西洋ワサビパーオキシダーゼ及び300m
gのヒトフィブリノーゲンを用いて、Nakane及びKawaoi
〔J.Histochem.Cytochem（1974）22:1084〕の方法によ
り調製された。最終生成物中のパーオキシダーゼとフィ
ブリノーゲンのモル比は0.39であった。これを未ラベル
フィブリノーゲンで稀釈して0.72mg/mlのフィブリノー
ゲン濃度で、フィブリノーゲンモル当り0.12モルのパー
オキシダーゼのモル比とし、−20℃にて50％グリセロー
ル中に貯蔵した。
gのヒトフィブリノーゲンを用いて、Nakane及びKawaoi
〔J.Histochem.Cytochem（1974）22:1084〕の方法によ
り調製された。最終生成物中のパーオキシダーゼとフィ
ブリノーゲンのモル比は0.39であった。これを未ラベル
フィブリノーゲンで稀釈して0.72mg/mlのフィブリノー
ゲン濃度で、フィブリノーゲンモル当り0.12モルのパー
オキシダーゼのモル比とし、−20℃にて50％グリセロー
ル中に貯蔵した。
トロンビンアッセイ 第１のアッセイにおいて、ミクロタイタープレート
を、10mM EDTAを含有する10mM Tris−アセテート緩衝化
塩溶液（pH7.6）（TABS）中50μg/mlのフィブリノーゲ
ンのウエル当り150μｌにより、４℃にて一夜コートし
た。溶液をプレートから除去し、そして10mM塩化カルシ
ウムを含有するTABS中3.8mg/mlウシ血清アルブミン（BS
A）中パーオキシダーゼ−フィブリノーゲンの10μg/ml
の溶液100μｌをウエルに加えた。0.1〜0.00078NIHユニ
ット/ml（30〜0.25ng/ml）に稀釈されたトロンビン50μ
ｌを各ウエルに０〜60分間の種々の時間にわたって加
え、この後溶液をプレートから洗浄した。指示色素とし
てオルト−フェニレンジアミンを用いて、11分間のイン
キュベーションによりパーオキシダーゼアッセイを行っ
た。ミクロタイターリーダーを用いて光学濃度を490mm
にて測定し、次の結果を得た。
を、10mM EDTAを含有する10mM Tris−アセテート緩衝化
塩溶液（pH7.6）（TABS）中50μg/mlのフィブリノーゲ
ンのウエル当り150μｌにより、４℃にて一夜コートし
た。溶液をプレートから除去し、そして10mM塩化カルシ
ウムを含有するTABS中3.8mg/mlウシ血清アルブミン（BS
A）中パーオキシダーゼ−フィブリノーゲンの10μg/ml
の溶液100μｌをウエルに加えた。0.1〜0.00078NIHユニ
ット/ml（30〜0.25ng/ml）に稀釈されたトロンビン50μ
ｌを各ウエルに０〜60分間の種々の時間にわたって加
え、この後溶液をプレートから洗浄した。指示色素とし
てオルト−フェニレンジアミンを用いて、11分間のイン
キュベーションによりパーオキシダーゼアッセイを行っ
た。ミクロタイターリーダーを用いて光学濃度を490mm
にて測定し、次の結果を得た。
エンドポイント（O.D＞２）のみならず部分反応（0.4
＜O.D＜２）もトロンビン活性の測定として使用するこ
とができる。エンドポイントの前２番目の値、又は１の
OD値をもたらすトロンビンの濃度へのおよその外挿を用
いてこのアッセイ法を標準化することができる。上記の
実験において、この値は次のトロンビン濃度において達
成される。
＜O.D＜２）もトロンビン活性の測定として使用するこ
とができる。エンドポイントの前２番目の値、又は１の
OD値をもたらすトロンビンの濃度へのおよその外挿を用
いてこのアッセイ法を標準化することができる。上記の
実験において、この値は次のトロンビン濃度において達
成される。
次のアッセイにおいて、ベンズアミジン及びＤ−フェ
ニルアラニル−Ｌ−プロピル−Ｌ−アルギニンクロロメ
チルケトン（PPACK）をアッセイの出発時においてトロ
ンビンに加えた。これらの阻害剤の添加が、固相へのパ
ーオキシダーゼ−フィブリンの同等な結合を得るために
要求されるトロンビンの濃度を上昇せしめた。阻害の％
を、同等な活性を得るために要求される上昇したトロン
ビン濃度から、 阻害の％＝100×（１−To/Ti） として計算することができ、ここでToは阻害剤の不存在
下でO.D.＝１をもたらすトロンビン濃度であり、そして
Tiは与えられた阻害剤濃度の存在下でO.D.＝１をもたら
すトロンビン濃度である。80分間アッセイにおけるこれ
ら２種類のインヒビーターによる阻害は下記の通りであ
る。
ニルアラニル−Ｌ−プロピル−Ｌ−アルギニンクロロメ
チルケトン（PPACK）をアッセイの出発時においてトロ
ンビンに加えた。これらの阻害剤の添加が、固相へのパ
ーオキシダーゼ−フィブリンの同等な結合を得るために
要求されるトロンビンの濃度を上昇せしめた。阻害の％
を、同等な活性を得るために要求される上昇したトロン
ビン濃度から、 阻害の％＝100×（１−To/Ti） として計算することができ、ここでToは阻害剤の不存在
下でO.D.＝１をもたらすトロンビン濃度であり、そして
Tiは与えられた阻害剤濃度の存在下でO.D.＝１をもたら
すトロンビン濃度である。80分間アッセイにおけるこれ
ら２種類のインヒビーターによる阻害は下記の通りであ
る。
これら２種類の阻害剤による阻害は、Markwardt等、E
ur.J.Biochemistry（1968）6:502;Kettner及びShaw,Thr
ombosis Research（1979）14:969に詳述されているそれ
らの既知の親和性及び作用機構と一致した。同じ方法
を、トロンビンの天然阻害剤、例えばアンチトロンビン
IIの阻害剤濃度を測定するために使用することができ
た。阻害剤の濃度は、精製された阻害剤を用いて阻害の
標準曲線を決定し、次に試験サンプルによるトロンビン
の同等の阻害を得ることにより決定される。１つのトロ
ンビン濃度において阻害剤の幾つかの稀釈を試験するの
が、阻害剤の濃度を測定するための便利な方法である。
ur.J.Biochemistry（1968）6:502;Kettner及びShaw,Thr
ombosis Research（1979）14:969に詳述されているそれ
らの既知の親和性及び作用機構と一致した。同じ方法
を、トロンビンの天然阻害剤、例えばアンチトロンビン
IIの阻害剤濃度を測定するために使用することができ
た。阻害剤の濃度は、精製された阻害剤を用いて阻害の
標準曲線を決定し、次に試験サンプルによるトロンビン
の同等の阻害を得ることにより決定される。１つのトロ
ンビン濃度において阻害剤の幾つかの稀釈を試験するの
が、阻害剤の濃度を測定するための便利な方法である。
ファクターIII（トロンボプラスチン、組織因子）の測
定 この研究において、アッセイ法を変更して基質として
正常ヒト血漿を使用した。正常血漿からのフィブリノー
ゲンを、Masri等〔Thrombosis and Haemostasis（198
3）49:116〕に記載されているようにして、最終濃度10
％でのポリエチレングリコール1000により沈澱せしめ
た。上清を同容量の100％グリセリンと混合し、そして
−70℃にて凍結するか又は−20℃で液体の形で貯蔵し
た。簡単には、20mM塩化カルシウム、1mg/ml BSA、TABS
中稀釈された組織因子50μｌをプレートに分配し、次に
TABS中2mM EDTA、3.8mg/ml BSA、3.6μg/molパーオキシ
ダーゼ−フィブリノーゲン、及び６％ラビット脳ケファ
リン懸濁液中に稀釈された血漿をウエル当り100μｌを
分配した。アッセイのエンドポイントはトロンビンのそ
れと同様、すなわち、１のO.D.値をもたらすトロンボプ
ラスチンの濃度であった。異る血漿濃度及びインキュベ
ーション時間において得られた結果を下に要約する。ア
ッセイの感度は、予想通り基質濃度及びインキュベーシ
ョンの時間に依存した。感度限界は粗脳トロンボプラス
チン蛋白質1ng/ml未満であった。
定 この研究において、アッセイ法を変更して基質として
正常ヒト血漿を使用した。正常血漿からのフィブリノー
ゲンを、Masri等〔Thrombosis and Haemostasis（198
3）49:116〕に記載されているようにして、最終濃度10
％でのポリエチレングリコール1000により沈澱せしめ
た。上清を同容量の100％グリセリンと混合し、そして
−70℃にて凍結するか又は−20℃で液体の形で貯蔵し
た。簡単には、20mM塩化カルシウム、1mg/ml BSA、TABS
中稀釈された組織因子50μｌをプレートに分配し、次に
TABS中2mM EDTA、3.8mg/ml BSA、3.6μg/molパーオキシ
ダーゼ−フィブリノーゲン、及び６％ラビット脳ケファ
リン懸濁液中に稀釈された血漿をウエル当り100μｌを
分配した。アッセイのエンドポイントはトロンビンのそ
れと同様、すなわち、１のO.D.値をもたらすトロンボプ
ラスチンの濃度であった。異る血漿濃度及びインキュベ
ーション時間において得られた結果を下に要約する。ア
ッセイの感度は、予想通り基質濃度及びインキュベーシ
ョンの時間に依存した。感度限界は粗脳トロンボプラス
チン蛋白質1ng/ml未満であった。
異る血漿濃度及びインキュベーション時間における１の
O.D.値をもたらすヒト脳トロンボプラスチンの濃度（ng
/mlの粗蛋白質） アッセイは、正常ヒト血漿の各濃度において４個の稀
釈を用いて行った。インキュベーションは37℃であり、
パーオキシダーゼのアッセイは37℃にて８分間であっ
た。
O.D.値をもたらすヒト脳トロンボプラスチンの濃度（ng
/mlの粗蛋白質） アッセイは、正常ヒト血漿の各濃度において４個の稀
釈を用いて行った。インキュベーションは37℃であり、
パーオキシダーゼのアッセイは37℃にて８分間であっ
た。
特異的因子の１つを欠く血漿基質においてこれを反復
することによりアッセイの特異性を確認した。正常血
漿、及びVIII欠損血漿、IX欠損血漿、XI欠損血漿及びXI
I−欠損血漿において同等の活性が得られた。外因系又
は共通経路欠損因子が欠損している基質血漿において活
性が測定できず（Ｘ及びII欠損）又は100分の１の活性
（Ｖ及びVII欠損）が測定された。
することによりアッセイの特異性を確認した。正常血
漿、及びVIII欠損血漿、IX欠損血漿、XI欠損血漿及びXI
I−欠損血漿において同等の活性が得られた。外因系又
は共通経路欠損因子が欠損している基質血漿において活
性が測定できず（Ｘ及びII欠損）又は100分の１の活性
（Ｖ及びVII欠損）が測定された。
白血球組織因子のアッセイ このアッセイにおいて、正常者の末梢血から単離され
た単球の組織因子活性を培地中でのインキュベーション
の前後において測定した。データーを、組織因子アッセ
イにおいて１のO.D.をもたらすアッセイウエル当りに存
在する細胞の数について標準化する。フィコル−ハイパ
ク層上でバフィーコート細胞を遠心し、そして界面の細
胞を集めることにより循環血から白血球を単離した。１
×RPMI、25mM HEPES、１×ペニシリン及びストレプトマ
イシン並びに0.5％ラクトアルブミン加水分解物から成
る組織培養培地中で細胞をインキュベートする。インキ
ュベーションを伴わないで、及び数時間又は一夜（16時
間）のインキュベーションの後に同じ細胞を試験した。
下記のごとく、組織活性の劇的な誘導が測定された。
た単球の組織因子活性を培地中でのインキュベーション
の前後において測定した。データーを、組織因子アッセ
イにおいて１のO.D.をもたらすアッセイウエル当りに存
在する細胞の数について標準化する。フィコル−ハイパ
ク層上でバフィーコート細胞を遠心し、そして界面の細
胞を集めることにより循環血から白血球を単離した。１
×RPMI、25mM HEPES、１×ペニシリン及びストレプトマ
イシン並びに0.5％ラクトアルブミン加水分解物から成
る組織培養培地中で細胞をインキュベートする。インキ
ュベーションを伴わないで、及び数時間又は一夜（16時
間）のインキュベーションの後に同じ細胞を試験した。
下記のごとく、組織活性の劇的な誘導が測定された。
末梢血から単離された白血球中の組織因子のレベル データは、組織因子についての特異的アッセイにおい
て１のO.D.値をもたらす、表示されたインキュベーショ
ン時間後に単離されたウエル当りの細胞数で示される。
て１のO.D.値をもたらす、表示されたインキュベーショ
ン時間後に単離されたウエル当りの細胞数で示される。
単離された血球又は他の画分における組織因子のレベ
ルの測定においてこのアッセイ法の非常に高い感度を用
いることができる。このアッセイ法は、ある条件下で１
個の細胞中に存在する組織因子の量を測定することがで
きる様である。これは、インビボで活性化された細胞の
臨床試験において、又は組織因子を含有する細胞の集団
を同定することによる細胞分別（cell sorting）の附属
として使用することができる。
ルの測定においてこのアッセイ法の非常に高い感度を用
いることができる。このアッセイ法は、ある条件下で１
個の細胞中に存在する組織因子の量を測定することがで
きる様である。これは、インビボで活性化された細胞の
臨床試験において、又は組織因子を含有する細胞の集団
を同定することによる細胞分別（cell sorting）の附属
として使用することができる。
他の外因系経路因子 他の外因系経路因子の測定がこのアッセイ法の変法に
より達成された。この方法においては、2mM EDTA、1mg/
ml BSA、TABS中稀釈された因子50μｌをウエルに入れ、
7.6mg/ml BSA、7.2μg/mlパーオキシダーゼ−フィブリ
ノーゲン及び1.2％ラビット脳ケファリン懸濁液中稀釈
された単一欠損血漿50μｌを入れた。1mg/ml BSA、20mM
塩化カルシウム、TABS中に稀釈された組織因子50μｌの
添加により反応を開始した。下記の表は、ファクターVI
I及びVIIaのアッセイの結果を、適切な血漿濃度及びイ
ンキュベーション時間において検出可能な因子のng/ml
として示す。
より達成された。この方法においては、2mM EDTA、1mg/
ml BSA、TABS中稀釈された因子50μｌをウエルに入れ、
7.6mg/ml BSA、7.2μg/mlパーオキシダーゼ−フィブリ
ノーゲン及び1.2％ラビット脳ケファリン懸濁液中稀釈
された単一欠損血漿50μｌを入れた。1mg/ml BSA、20mM
塩化カルシウム、TABS中に稀釈された組織因子50μｌの
添加により反応を開始した。下記の表は、ファクターVI
I及びVIIaのアッセイの結果を、適切な血漿濃度及びイ
ンキュベーション時間において検出可能な因子のng/ml
として示す。
ファクターVII欠損血漿中でのファクターVII及びVIIaの
アッセイ 幾つかの血漿濃度及びインキュベーション時間を用い
て上記のようにしてアッセイを行った。各条件下で４種
類の稀釈をアッセイした。各血漿濃度につきトロンボプ
ラスチン濃度を次のように変えた:0.1μｌの血漿、300n
g/mlトロンボプラスチン;0.2μｌ、120ng/ml;0.4μｌ、
30ng/ml;0.8μｌ、9ng/ml。パーオキシダーゼのアッセ
イは各場合において８分間であった。示されるデーター
は、これらの条件下で１のO.D.値をもたらす、最終イン
キュベーション混合物中のファクターVII又はVIIaの濃
度（ng/ml）である。
アッセイ 幾つかの血漿濃度及びインキュベーション時間を用い
て上記のようにしてアッセイを行った。各条件下で４種
類の稀釈をアッセイした。各血漿濃度につきトロンボプ
ラスチン濃度を次のように変えた:0.1μｌの血漿、300n
g/mlトロンボプラスチン;0.2μｌ、120ng/ml;0.4μｌ、
30ng/ml;0.8μｌ、9ng/ml。パーオキシダーゼのアッセ
イは各場合において８分間であった。示されるデーター
は、これらの条件下で１のO.D.値をもたらす、最終イン
キュベーション混合物中のファクターVII又はVIIaの濃
度（ng/ml）である。
このシリーズの最も高感度のアッセイにおいて、150
μｌのサンプル中5pg/ml未満のファクターVIIaを測定す
ることができる。適切に欠損した血漿を用いる匹敵する
アッセイにおいて、ファクターII、Ｘ及びＶのアッセイ
のための同様に高い感度が得られた。
μｌのサンプル中5pg/ml未満のファクターVIIaを測定す
ることができる。適切に欠損した血漿を用いる匹敵する
アッセイにおいて、ファクターII、Ｘ及びＶのアッセイ
のための同様に高い感度が得られた。
この方法は、凝固因子に対する抗体のアッセイのた
め、及びこれらの抗体に使用して凝固因子を測定するた
めに同様に有用である。次のアッセイにおいて、トロン
ビン及びXaの活性を阻害する特異的ポリクローナルラビ
ット抗体の能力を測定した。抗体調製物を、ヤギ抗−ラ
ビット IgG−アガロースのカラム上への吸着及び0.5M
酢酸中での溶出、又はファクターII−又はＸ−アガロー
スのカラム上への吸着及び0.025M クエン酸−クエン酸
ナトリウム（pH3）中での溶出により精製した。これら
の抗体調製物を３〜15μg/mlの最終蛋白質濃度に稀釈
し、そしてトロンビン及びXaの阻害について試験した。
トロンビンのアッセイは前記のようにして行った。Xaの
アッセイは、プロトロンビン、ファクターVa、パーオキ
シダーゼ−フィブリノーゲン、ラビット脳ケファリン及
びBSAの混合物から成る基質中で行った。データーを、
表示された抗体の存在下で、１のO.D.値を得るのに要求
される因子の濃度として示す。
め、及びこれらの抗体に使用して凝固因子を測定するた
めに同様に有用である。次のアッセイにおいて、トロン
ビン及びXaの活性を阻害する特異的ポリクローナルラビ
ット抗体の能力を測定した。抗体調製物を、ヤギ抗−ラ
ビット IgG−アガロースのカラム上への吸着及び0.5M
酢酸中での溶出、又はファクターII−又はＸ−アガロー
スのカラム上への吸着及び0.025M クエン酸−クエン酸
ナトリウム（pH3）中での溶出により精製した。これら
の抗体調製物を３〜15μg/mlの最終蛋白質濃度に稀釈
し、そしてトロンビン及びXaの阻害について試験した。
トロンビンのアッセイは前記のようにして行った。Xaの
アッセイは、プロトロンビン、ファクターVa、パーオキ
シダーゼ−フィブリノーゲン、ラビット脳ケファリン及
びBSAの混合物から成る基質中で行った。データーを、
表示された抗体の存在下で、１のO.D.値を得るのに要求
される因子の濃度として示す。
ファクターIIに対する抗体がこれらの濃度においてト
ロンビンを60〜80％阻害し、そしてファクターＸに対す
る抗体98％以上阻害的であった。阻害は対応する抗原に
対して特異的であり、そして抗体の純度に関連した。な
ぜなら、特異的アフィニティー精製抗体は同じ免疫感作
動物からのIgGより阻害的であったからである。
ロンビンを60〜80％阻害し、そしてファクターＸに対す
る抗体98％以上阻害的であった。阻害は対応する抗原に
対して特異的であり、そして抗体の純度に関連した。な
ぜなら、特異的アフィニティー精製抗体は同じ免疫感作
動物からのIgGより阻害的であったからである。
特異的因子の阻害に加えて、因子の活性に影響を与え
ないエピトープに結合する抗体を特異的凝固アッセイと
組合わせて用いてこれらの活性化された因子の非常に低
い濃度をアッセイすることができる。この例として、次
のアッセイにおいて、本発明者等はファクターＸと反応
することができるモノクローナル抗体へのXaの結合を測
定した。このアッセイにおいて、ヤギ抗−マウスIgGで
コートされたミクロタイタープレートを0.9〜667ng/ml
のモノクローナル抗体及び0.16〜20ng/mlのファクターX
aと共に４℃にて16時間インキュベートした。プレート
を洗浄し、そしてファクターII、ファクターVa、BSA及
びラビット脳ケファリンから成るファクターXa特異的基
質をプレートに加え、そして37℃にて40分間及び60分間
インキュベートした。50μｌの混合物をTABS緩衝液中に
パーオキシダーゼ−フィブリノーゲン及びBSAを含むア
ッセイプレートに移すことにより、このアッセイにおい
て生じたトロンビンを測定した。40分間のインキュベー
トの後、プレートを洗浄し、そして結合したパーオキシ
ダーゼを測定した。この場合に得られた光学濃度は次の
通りであった。
ないエピトープに結合する抗体を特異的凝固アッセイと
組合わせて用いてこれらの活性化された因子の非常に低
い濃度をアッセイすることができる。この例として、次
のアッセイにおいて、本発明者等はファクターＸと反応
することができるモノクローナル抗体へのXaの結合を測
定した。このアッセイにおいて、ヤギ抗−マウスIgGで
コートされたミクロタイタープレートを0.9〜667ng/ml
のモノクローナル抗体及び0.16〜20ng/mlのファクターX
aと共に４℃にて16時間インキュベートした。プレート
を洗浄し、そしてファクターII、ファクターVa、BSA及
びラビット脳ケファリンから成るファクターXa特異的基
質をプレートに加え、そして37℃にて40分間及び60分間
インキュベートした。50μｌの混合物をTABS緩衝液中に
パーオキシダーゼ−フィブリノーゲン及びBSAを含むア
ッセイプレートに移すことにより、このアッセイにおい
て生じたトロンビンを測定した。40分間のインキュベー
トの後、プレートを洗浄し、そして結合したパーオキシ
ダーゼを測定した。この場合に得られた光学濃度は次の
通りであった。
この組み合わされた固相イムノアッセイ及び固相凝固
アッセイの感度は高く、0.2ng/ml未満のファクターXaが
0.15mlのサンプルにおいて、又はサンプル当り約23pgの
Xaが検出可能であった。これは、鋭敏なイムノアッセイ
において特に有意義なXa又は他の活性化された凝固因子
を使用するであろう。抗原又は抗体に接合した活性化さ
れた凝固因子を用いる免疫化学的反応は、適切な抗体及
びフィブリノーゲンの両者が固相に付着されており、そ
して結合した凝固因子についてのその後のアッセイがラ
ベルされたフィブリノーゲンの付着をもたらすようなア
ッセイ媒体において行うことができる。免疫化学的複合
体の検出を助けるために抗原又は抗体に共有結合するこ
とができる任意の基が同様にフィブリノーゲンに付着す
ることができた。凝固因子接合体と、それに続く、固相
に付着した報告可能なリガンドの量を増幅する凝固カス
ケード反応の組み合わせ使用の利点は、検出の感度があ
まり限定されないことである。活性化された結合した因
子の各分子当たり多数のフィブリン−接合体の分子が固
相に結合するようになるであろう。イムノアッセイにお
いては低濃度の凝固因子接合体が使用され、これは競争
的イムノアッセイ設計及びこのアッセイ技法を用いるコ
ストにおいて利点を有する。凝固カスケードの早期で活
性な因子、例えばファクターVIIaもしくは組織因子、又
は凝固を促進することにおいて活性であり得る任意の酵
素を用いることにより感度をさらに上げることができ
る。このような酵素は哺乳類源から得ることが必然的に
必要なのではなく、凝固活性化因子を生産する細胞又は
他の種から単離することができる。１つのこのような酵
素はルッセルのマムシ毒中に存在するファクターＸ−活
性化プロテアーゼ、すなわち、この毒中の全蛋白質の５
〜10％を占め、そしてファクターＸのXaへの加水分解に
よる凝固の促進において非常に活性な酵素である。下記
のごとく、この酵素のアッセイは非常に高感度である。
アッセイの感度は高く、0.2ng/ml未満のファクターXaが
0.15mlのサンプルにおいて、又はサンプル当り約23pgの
Xaが検出可能であった。これは、鋭敏なイムノアッセイ
において特に有意義なXa又は他の活性化された凝固因子
を使用するであろう。抗原又は抗体に接合した活性化さ
れた凝固因子を用いる免疫化学的反応は、適切な抗体及
びフィブリノーゲンの両者が固相に付着されており、そ
して結合した凝固因子についてのその後のアッセイがラ
ベルされたフィブリノーゲンの付着をもたらすようなア
ッセイ媒体において行うことができる。免疫化学的複合
体の検出を助けるために抗原又は抗体に共有結合するこ
とができる任意の基が同様にフィブリノーゲンに付着す
ることができた。凝固因子接合体と、それに続く、固相
に付着した報告可能なリガンドの量を増幅する凝固カス
ケード反応の組み合わせ使用の利点は、検出の感度があ
まり限定されないことである。活性化された結合した因
子の各分子当たり多数のフィブリン−接合体の分子が固
相に結合するようになるであろう。イムノアッセイにお
いては低濃度の凝固因子接合体が使用され、これは競争
的イムノアッセイ設計及びこのアッセイ技法を用いるコ
ストにおいて利点を有する。凝固カスケードの早期で活
性な因子、例えばファクターVIIaもしくは組織因子、又
は凝固を促進することにおいて活性であり得る任意の酵
素を用いることにより感度をさらに上げることができ
る。このような酵素は哺乳類源から得ることが必然的に
必要なのではなく、凝固活性化因子を生産する細胞又は
他の種から単離することができる。１つのこのような酵
素はルッセルのマムシ毒中に存在するファクターＸ−活
性化プロテアーゼ、すなわち、この毒中の全蛋白質の５
〜10％を占め、そしてファクターＸのXaへの加水分解に
よる凝固の促進において非常に活性な酵素である。下記
のごとく、この酵素のアッセイは非常に高感度である。
基質として正常血漿を用いるルッセルのマムシ毒ファク
ターＸ活性化因子のアッセイ ラビット脳ケファリン、パーオキシダーゼ−フィブリ
ノーゲン及びBSAを含有するTris−緩衝化塩溶液（pH8）
＋ウエル当り表示された量で添加された正常ヒト血清
（最終容量150μｌ）から成る基質中でアッセイを行っ
た。パーオキシダーゼのアッセイは各場合において８分
間であった。示されているデーターは、これらの条件下
で１のO.D.値をもたらすルッセルのマムシ毒ファクター
Ｘ活性化因子の濃度（最終インキュベーション混合物中
ピコグラム/ml）である。
ターＸ活性化因子のアッセイ ラビット脳ケファリン、パーオキシダーゼ−フィブリ
ノーゲン及びBSAを含有するTris−緩衝化塩溶液（pH8）
＋ウエル当り表示された量で添加された正常ヒト血清
（最終容量150μｌ）から成る基質中でアッセイを行っ
た。パーオキシダーゼのアッセイは各場合において８分
間であった。示されているデーターは、これらの条件下
で１のO.D.値をもたらすルッセルのマムシ毒ファクター
Ｘ活性化因子の濃度（最終インキュベーション混合物中
ピコグラム/ml）である。
このアッセイにおいて、30〜50フェムトグラム/mlの
下限が150μｌの容客において、すなわちこの酵素4.5〜
7.5フェムトグラムにおいて達成された。酵素の分子量
は60,000ダルトンであるから、これは0.075アットモル
の検出限界、又は酵素の20,000分子未満に換算される。
この低い検出限界は、この酵素の蛋白質又は核酸接合体
を用いるイムノアッセイ、リセプター結合アッセイ又は
ブロッティングアッセイにおいて使用されるこの酵素の
主たる価値である。
下限が150μｌの容客において、すなわちこの酵素4.5〜
7.5フェムトグラムにおいて達成された。酵素の分子量
は60,000ダルトンであるから、これは0.075アットモル
の検出限界、又は酵素の20,000分子未満に換算される。
この低い検出限界は、この酵素の蛋白質又は核酸接合体
を用いるイムノアッセイ、リセプター結合アッセイ又は
ブロッティングアッセイにおいて使用されるこの酵素の
主たる価値である。
ELISA型イムノアッセイのための接合体としてのルッセ
ルのマムシ毒ファクターＸ活性化因子の使用 イムノアッセイのためのこの酵素の有用性を標価する
ため、ルッセルのマムシ毒ファクターＸアクチベーター
とファクターＸと、及びファクターＸに対して生成した
２種類のモノクローナル抗体（BG−X2及びBG−X4）であ
ってファクターＸ上の異るエピトープと反応性であるも
のとの接合体を調製した。接合する酵素としてのこの酵
素の有用性を試験するためのこの系の使用はこの係の能
力の厳密な試験を可能にする。なぜなら、この酵素を用
いるアッセイにおける可能性ある副反応は反応種のプロ
テアーゼ分解だからである。アッセイにおいて酵素の天
然基質を使用することにより、この可能性ある副反応は
排除されるであろう。
ルのマムシ毒ファクターＸ活性化因子の使用 イムノアッセイのためのこの酵素の有用性を標価する
ため、ルッセルのマムシ毒ファクターＸアクチベーター
とファクターＸと、及びファクターＸに対して生成した
２種類のモノクローナル抗体（BG−X2及びBG−X4）であ
ってファクターＸ上の異るエピトープと反応性であるも
のとの接合体を調製した。接合する酵素としてのこの酵
素の有用性を試験するためのこの系の使用はこの係の能
力の厳密な試験を可能にする。なぜなら、この酵素を用
いるアッセイにおける可能性ある副反応は反応種のプロ
テアーゼ分解だからである。アッセイにおいて酵素の天
然基質を使用することにより、この可能性ある副反応は
排除されるであろう。
第１の試験は、ファクターＸ、及びファクターＸとル
ッセルのマムシ毒ファクターＸ活性化因子との接合体を
用いる競争アッセイである。プレートをヤギ抗−マウス
IgG及びフィブリノーゲンでコートし、そしてファクタ
ーＸ、接合体及びモノクローナル抗体BG−X4の混合物を
10mg/mlの濃度において、20mg/mlのゼラチンを含有する
Tris−緩衝化塩溶液中で一夜４℃にてインキュベートし
た。対象として、パーオキシダーゼ−ラベル化ファクタ
ーＸを用いる同様の実験を比較のために含めた。インキ
ュベーションの後、プレートをゼラチン−Tris緩衝化塩
で３回洗浄し、そしてファクターII、Ｖ及びＸの混合
物、パーオキシダーゼ−フィブリノーゲン、ラビット脳
ケファリン及びTris−緩衝化塩から成る、5mg/mlのゼラ
チンを含む基質（pH8）中で40及び60分間、結合した接
合体についてアッセイした。パーオキシダーゼラベル化
ファクターＸを用いる対照アッセイのため、パーオキシ
ダーゼアッセイを直接にプレート上で40分間行った。ル
ッセルのマムシ毒接合体を用いるアッセイのためにはパ
ーオキシダーゼアッセイは40分間であった；（毒酵素ア
ッセイ混合物と共に40分間インキュベーション又は20分
間（毒酵素混合物と共に60分間インキュベーション）。
この競争アッセイの結果を下に示す。これらの条件下で
のO.D.（490）として表現する。
ッセルのマムシ毒ファクターＸ活性化因子との接合体を
用いる競争アッセイである。プレートをヤギ抗−マウス
IgG及びフィブリノーゲンでコートし、そしてファクタ
ーＸ、接合体及びモノクローナル抗体BG−X4の混合物を
10mg/mlの濃度において、20mg/mlのゼラチンを含有する
Tris−緩衝化塩溶液中で一夜４℃にてインキュベートし
た。対象として、パーオキシダーゼ−ラベル化ファクタ
ーＸを用いる同様の実験を比較のために含めた。インキ
ュベーションの後、プレートをゼラチン−Tris緩衝化塩
で３回洗浄し、そしてファクターII、Ｖ及びＸの混合
物、パーオキシダーゼ−フィブリノーゲン、ラビット脳
ケファリン及びTris−緩衝化塩から成る、5mg/mlのゼラ
チンを含む基質（pH8）中で40及び60分間、結合した接
合体についてアッセイした。パーオキシダーゼラベル化
ファクターＸを用いる対照アッセイのため、パーオキシ
ダーゼアッセイを直接にプレート上で40分間行った。ル
ッセルのマムシ毒接合体を用いるアッセイのためにはパ
ーオキシダーゼアッセイは40分間であった；（毒酵素ア
ッセイ混合物と共に40分間インキュベーション又は20分
間（毒酵素混合物と共に60分間インキュベーション）。
この競争アッセイの結果を下に示す。これらの条件下で
のO.D.（490）として表現する。
従って、このアッセイのための有効範囲は、ルッセル
のマムシ毒酵素接合体を用いるアッセイについては３〜
20,000ng/mlであり、そしてパーオキシダーゼ接合体に
ついては250〜＞20,000である。マムシ毒酵素接合体の
検出下限は、この競争アッセイにおいては一層低いレベ
ルの接合体の使用を可能にし、アッセイのさらに高い感
度をもたらす。
のマムシ毒酵素接合体を用いるアッセイについては３〜
20,000ng/mlであり、そしてパーオキシダーゼ接合体に
ついては250〜＞20,000である。マムシ毒酵素接合体の
検出下限は、この競争アッセイにおいては一層低いレベ
ルの接合体の使用を可能にし、アッセイのさらに高い感
度をもたらす。
“サンドイッチアッセイ” この場合、モノクローナル抗体BG−X2の接合体を調製
し、そしてプレートをフィブリノーゲン＋ファクターＸ
に対する抗体〔（１）ファクターＸに対する免疫吸着精
製されたポリクローナル抗体、（２）モノクローナル抗
体BG−X2（すなわち、ラベルされた同じ抗体）、（３）
モノクローナル抗体BG−X4（すなわち、BG−X2抗体が反
応するのと異るエピトープと反応する抗体）のいずれ
か〕によりコートした。このプレートを、2mM EDTAを含
有するTris緩衝化塩溶液（pH7.8）中20mg/mlカゼイン中
のファクターＸ＋ラベル化BG−X2抗体と共に４℃にて一
夜インキュベートし、そして2mM EDTAを含有するTris−
緩衝化塩溶液中20mg/mlゼラチン中で３回洗浄した。結
合した接合体についてのアッセイを上記のようにしてそ
して表示されたインキュベーション時間にわたって実施
したが、但しアッセイが10mg/mlのゼラチンを含むよう
にした。結合したパーオキシダーゼのアッセイはカイネ
ティックプレートリーダーを用い、20％エアノールを含
有するTris−クエン酸緩衝液（pH5.2）中テトラメチル
ベンジンから成る基質を用いて行った。与えられた値
は、各サンプルについて、分当りミリO.D.ユニット数で
ある。
し、そしてプレートをフィブリノーゲン＋ファクターＸ
に対する抗体〔（１）ファクターＸに対する免疫吸着精
製されたポリクローナル抗体、（２）モノクローナル抗
体BG−X2（すなわち、ラベルされた同じ抗体）、（３）
モノクローナル抗体BG−X4（すなわち、BG−X2抗体が反
応するのと異るエピトープと反応する抗体）のいずれ
か〕によりコートした。このプレートを、2mM EDTAを含
有するTris緩衝化塩溶液（pH7.8）中20mg/mlカゼイン中
のファクターＸ＋ラベル化BG−X2抗体と共に４℃にて一
夜インキュベートし、そして2mM EDTAを含有するTris−
緩衝化塩溶液中20mg/mlゼラチン中で３回洗浄した。結
合した接合体についてのアッセイを上記のようにしてそ
して表示されたインキュベーション時間にわたって実施
したが、但しアッセイが10mg/mlのゼラチンを含むよう
にした。結合したパーオキシダーゼのアッセイはカイネ
ティックプレートリーダーを用い、20％エアノールを含
有するTris−クエン酸緩衝液（pH5.2）中テトラメチル
ベンジンから成る基質を用いて行った。与えられた値
は、各サンプルについて、分当りミリO.D.ユニット数で
ある。
従って、このサンドイッチアッセイは、この比較的簡
単な方法を用いて、50pg/ml未満の感度の能力を有す
る。ラベルされたのと同じ抗体をプレート上で使用する
対照は、アッセイがモノファクターＸ分子に対して特異
的であることを示した。負のO.D.変化は、これらの条件
下でのアッセイの人口的結果と見なすことができる。前
記の説明を、理解を明瞭にするために説明及び例により
幾分詳細に記載したが、添付された請求の範囲の請求に
おいて幾つかの変化及び変更を行うことができることが
自明であろう。
単な方法を用いて、50pg/ml未満の感度の能力を有す
る。ラベルされたのと同じ抗体をプレート上で使用する
対照は、アッセイがモノファクターＸ分子に対して特異
的であることを示した。負のO.D.変化は、これらの条件
下でのアッセイの人口的結果と見なすことができる。前
記の説明を、理解を明瞭にするために説明及び例により
幾分詳細に記載したが、添付された請求の範囲の請求に
おいて幾つかの変化及び変更を行うことができることが
自明であろう。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ドエルガスト，ジヨ−ジ，ジエイ. アメリカ合衆国，ノ−スカロライナ 27103，ウインストン−セルム，サウス ホ−ソン ロ−ド300，ザ ボウマン グレイ スク−ル オブ メディソ ン，デパ−トメント オブ バイオケミ ストリ− (56)参考文献 米国特許4046635（ＵＳ，Ａ) 米国特許4463090（ＵＳ，Ａ)
Claims (13)
- 【請求項１】血液凝固カスケードに直接又は間接的に関
与することができる分析対象の存在を検出する方法であ
って、 前記分析対象を含有すると予想されるサンプルと、該分
析対象との組合わせにおいて血液凝固のために必要なす
べての成分を含む混合物であってラベルされたフィブリ
ノーゲンを含むものとを、基材に結合したフィブリノー
ゲンと接触せしめ、 前記ラベルされたフィブリノーゲンが検出可能な量のラ
ベルされたフィブリンとして前記基材に結合するのに十
分な時間にわたってインキュベーションを行い、そして
前記基材に結合したラベルを検出する、ことを特徴とす
る方法。 - 【請求項２】前記ラベルが酵素である請求の範囲第１項
に記載の方法。 - 【請求項３】前記ラベルが蛍光物質である請求の範囲第
１項に記載の方法。 - 【請求項４】前記分析対象が血液凝固因子である請求の
範囲第１項に記載の方法。 - 【請求項５】前記分析対象が凝固阻害因子又は活性化因
子である請求の範囲第１項に記載の方法。 - 【請求項６】フィブリノーゲン又はプロトロンビン以外
の血液凝固に関与する血液因子の存在を検出する方法で
あって、 分析対象としてアッセイされるべき少なくとも１つの血
液凝固因子を含有すると予想されるサンプルと、ラベル
化フィブリノーゲンと、基材表面に結合したフィブリノ
ーゲンと、プロトロンビンと、プロトロンビンからのト
ロンビンの生成に必要なすべての追加の血液因子とを混
合し； この混合物を、フィブリンが生成しそしてラベルされた
フィブリンの少なくとも部分的な沈着が始まるのに十分
な時間にわたってインキュベートし；そして 表面に結合した、又は上清中のラベルを検出する； ことを含んで成る方法。 - 【請求項７】前記ラベルが酵素である請求の範囲第６項
に記載の方法。 - 【請求項８】前記酵素がパーオキシダーゼである請求の
範囲第７項に記載の方法。 - 【請求項９】前記血液因子がファクターＶ〜VIIである
請求の範囲第６項に記載の方法。 - 【請求項１０】前記因子が凝固阻害因子又は活性化因子
である請求の範囲第６項に記載の方法。 - 【請求項１１】分析対象の存在を検出するための方法で
あって、 （１）アッセイ媒体中で、 A.（ａ）血液凝固カスケード関連物質である前記分析対
象を含有すると予想されるサンプル、又は （ｂ）前記分析対象を含有すると予想されるサンプル、
及び該分析対象と血液凝固カスケード関連物質との結合
体、又は （ｃ）血液凝固カスケード関連物質である前記分析対象
を含有すると予想されるサンプル、及び該分析対象に対
する特異的結合対構成員に対して該分析対象と競争する
ことができる化合物、又は （ｄ）前記分析対象を含有すると予想されるサンプル、
及び血液凝固カスケード関連物質に直接もしくは間接的
に連結された、分析対象に対する特異的結合対構成員、 の内のいずれか；並びに B.支持体に結合した、分析対象に対する特異的結合対構
成員、 を混合して混合物を得； （２）この混合物を、血液凝固カスケード関連物質が前
記サンプル中の分析対象の量に関連して前記支持体に結
合するのに十分な時間インキュベートし； （３）未結合の凝固カスケード関連物質から支持体に結
合した凝固カスケード関連物質を分離し； （４）支持体に結合した又は未結合の凝固カスケード関
連物質を、基材に結合したフィブリノーゲン、過剰量の
又は一定量のラベルされたフィブリノーゲン、及び前記
結合又は未結合の凝固カスケード関連物質と組み合わせ
て凝固のために必要な残りの構成員と混合し； 混合物をインキュベートし；そして 前記基材に結合した、又は上清中のラベルの量をサンプ
ル中の分析対象の量と関連ずける； ことを含んで成る方法。 - 【請求項１２】請求項11.（１）A.（ｂ）又は（ｄ）の
血液凝固カスケード関連物質がトロンビン又はプロトロ
ンビンである請求の範囲第11項に記載の方法。 - 【請求項１３】前記凝固カスケード関連物質がヘビ毒フ
ァクターＸ活性化因子である請求の範囲第11項に記載の
方法。
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|---|---|---|---|
| US725460 | 1985-04-22 | ||
| US06/725,460 US4668621A (en) | 1985-04-22 | 1985-04-22 | Detecting blood clotting factors with immobilized fibrinogen and labeled fibrinogen |
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|---|---|
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| JP2529677B2 true JP2529677B2 (ja) | 1996-08-28 |
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|---|---|---|---|---|
| DE3727610A1 (de) * | 1987-08-19 | 1989-03-02 | Behringwerke Ag | Synthetische peptide, gegen diese gerichtete antikoerper und deren verwendung |
| US6541275B1 (en) * | 1988-02-03 | 2003-04-01 | Dade Behring Inc. | Immunoassay for F1.2 prothrombin fragment |
| WO1989009409A1 (en) * | 1988-03-31 | 1989-10-05 | Ram Nunna | Immunoassays employing novel markers |
| US5071745A (en) * | 1988-12-14 | 1991-12-10 | Elcatech, Inc. | Fibrinolytic assay |
| US5196306A (en) * | 1989-03-29 | 1993-03-23 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Method for the detection or quantitation of an analyte using an analyte dependent enzyme activation system |
| AU5952090A (en) * | 1989-06-15 | 1991-01-08 | William I. Smith Jr. | Method and apparatus for inactivating infectious agents in and resisting coagulation of biological fluids |
| US5318524A (en) * | 1990-01-03 | 1994-06-07 | Cryolife, Inc. | Fibrin sealant delivery kit |
| JPH04233458A (ja) * | 1990-08-23 | 1992-08-21 | New York Blood Center Inc | 可溶性フィブリン様モノマーを使ったアッセイ |
| GB9122180D0 (en) * | 1991-10-18 | 1991-11-27 | Marconi Gec Ltd | Separation and analysis |
| CA2132518A1 (en) * | 1992-03-20 | 1993-09-30 | Uma Sinha | Glycosylation-mediated inhibition of factor x |
| US5476771A (en) * | 1993-02-22 | 1995-12-19 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army | Test for quantitative thrombin time |
| US5308755A (en) * | 1992-06-08 | 1994-05-03 | Research Corporation Technologies, Inc. | Method for measuring heparin |
| US5985548A (en) * | 1993-02-04 | 1999-11-16 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Amplification of assay reporters by nucleic acid replication |
| JPH08507148A (ja) * | 1993-02-17 | 1996-07-30 | カーディオヴァスキュラー ダイアグノスティクス，インク． | 固相化学カスケードイムノアッセイおよびアフィニティアッセイ |
| US5567596A (en) * | 1994-12-29 | 1996-10-22 | Research Foundation Of State University Of New York | Rapid assay of activators and inhibitors of clotting |
| US5858665A (en) * | 1996-07-25 | 1999-01-12 | Navix, Inc. | Homogeneous diagnostic assay method utilizing simultaneous target and signal amplification |
| US5879897A (en) * | 1996-09-23 | 1999-03-09 | Wake Forest University | Methods and compositions for the diagnosis of extraesophageal gastric reflux |
| FR2769093B1 (fr) * | 1997-09-30 | 1999-11-12 | Pasteur Sanofi Diagnostics | Procede in vitro d'evaluation des risques thrombotiques par dosage du fibrinogene plasmatique |
| DE19756773A1 (de) | 1997-12-19 | 1999-06-24 | Dade Behring Marburg Gmbh | Neues Verfahren und Diagnosemittel zur Hämostase-Diagnostik |
| US6596501B2 (en) | 1998-02-23 | 2003-07-22 | Fred Hutchinson Cancer Research Center | Method of diagnosing autoimmune disease |
| CA2323812C (en) | 1998-03-20 | 2011-05-10 | The Curators Of The University Of Missouri | Early pregnancy diagnosis using pags (pregnancy-associated glycoproteins) |
| US6632628B1 (en) | 1999-08-20 | 2003-10-14 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Methods and compositions relating to HDAC 4 and 5 regulation of cardiac gene expression |
| US6511809B2 (en) | 2000-06-13 | 2003-01-28 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Method for the detection of an analyte by means of a nucleic acid reporter |
| WO2003028582A2 (en) * | 2001-09-28 | 2003-04-10 | Aspenbio, Inc. | Bovine pregnancy test |
| NZ536229A (en) * | 2002-05-02 | 2008-12-24 | Aspenbio Pharma Inc | Pregnancy detection |
| US7790410B2 (en) | 2008-04-25 | 2010-09-07 | General Electric Company | Method and apparatus for determining hemocompatibility |
| US20120276067A1 (en) * | 2009-10-13 | 2012-11-01 | Allocure, Inc. | Assay for the Prediction of Therapeutic Effectiveness of Mesenchymal Stromal Cells, and Methods of Using Same |
| EP2333555A1 (de) * | 2009-12-09 | 2011-06-15 | Siemens Healthcare Diagnostics Products GmbH | Heterogener Gerinnungstest |
| US8541187B2 (en) | 2011-03-01 | 2013-09-24 | Bio Tracking, LLC | Systems and methods for detecting animal pregnancy |
| US9594081B2 (en) | 2011-06-20 | 2017-03-14 | Proterixbio, Inc. | Methods and systems for the rapid characterization of functional biological molecules |
| US20140038204A1 (en) * | 2012-07-31 | 2014-02-06 | Baxter Healthcare S.A. | Selective measurement of active human protease coagulation factors |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4046635A (en) | 1975-08-27 | 1977-09-06 | Canadian Patents And Development Limited | Method for detecting enzymes capable of digesting fibrinogen or fibrin |
| US4463090A (en) | 1981-09-30 | 1984-07-31 | Harris Curtis C | Cascade amplification enzyme immunoassay |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3960669A (en) * | 1973-01-15 | 1976-06-01 | Association For Pharmacologic Research, Inc. | Urine diagnostic test for fibrinolytic activity |
| DE2431342C3 (de) * | 1973-07-27 | 1978-10-26 | Behringwerke Ag, 3550 Marburg | Verfahren zur Messung des Plasminogengehaltes durch Bestimmung der Bildung von Fibrin in einer Probe |
| US3778352A (en) * | 1973-02-23 | 1973-12-11 | Baxter Laboratories Inc | Plasminogen assay system |
| NL7511055A (nl) * | 1975-09-19 | 1977-03-22 | Leuven Res & Dev Vzw | Trombosetest. |
| US4045635A (en) * | 1976-01-22 | 1977-08-30 | Robertshaw Controls Company | Electrical switch construction and improved overtravel switch blade therefor and method of making the same |
| AU4158785A (en) * | 1984-03-26 | 1985-11-01 | International Health Services | A method of determining the clotting time of blood and particulate reagents therefor |
-
1985
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1986
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- 1986-04-14 AT AT86902720T patent/ATE78098T1/de active
- 1986-04-14 JP JP61502321A patent/JP2529677B2/ja not_active Expired - Lifetime
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Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4046635A (en) | 1975-08-27 | 1977-09-06 | Canadian Patents And Development Limited | Method for detecting enzymes capable of digesting fibrinogen or fibrin |
| US4463090A (en) | 1981-09-30 | 1984-07-31 | Harris Curtis C | Cascade amplification enzyme immunoassay |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
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| DE3685937D1 (de) | 1992-08-13 |
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