JPH06313766A

JPH06313766A - 抗体固定化担体及びその製造方法、並びに該担体による免疫学的測定方法

Info

Publication number: JPH06313766A
Application number: JP10445393A
Authority: JP
Inventors: Masahiko Yamazaki; 誠彦山崎; Masayuki Numa; 雅之沼間
Original assignee: Konica Minolta Inc
Current assignee: Konica Minolta Inc
Priority date: 1993-04-30
Filing date: 1993-04-30
Publication date: 1994-11-08

Abstract

(57)【要約】【目的】高い保存性を有し、かつ高感度な測定が可能
な抗体固定化担体の提供。【構成】試料中の特定成分と特異的に結合する抗体を
不溶性の担体に固定化し、次いでブロッキングを行った
後に、緩衝溶液中でインキュベーションすることを特徴
とする抗体固定化担体の製造方法及び該抗体固定化担
体、並びに該抗体固定化担体を用いることを特徴とする
免疫学的測定方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、流体試料中の微量成
分、特に生物学的流体試料中の特定微量成分を測定する
に際して用いられる抗体固定化担体及びその製造方法に
関するものであり、上記担体を用いる免疫学的測定方法
に関する。

【０００２】

【従来の技術】生物学的流体試料中に極微量含有される
物質を検出する方法として、各種の分析法が開発されて
来ている。この分析法の一つとして、免疫反応をその原
理とするものがある。そして、この原理を用いた測定法
として種々のものが開発され、精度の高いものとして知
られている。

【０００３】すなわち、１９５８年にＢｅｒｓｏｎとＹ
ａｌｌｏｗが、放射性同位元素Ｉで標識した牛インシュ
リンと糖尿病患者血清中の抗インシュリン抗体を用い
て、血清中のインシュリンを測定することに成功して以
来、ラジオアイソトープを用いた免疫測定法が広く用い
られて来た。そして、これ以後、標識物質として放射性
同位元素以外のものも種々開発されて来た。例えば、酵
素、酵素基質、補酵素、酵素阻害物質、バクテリオファ
ージ、循環反応体、金属及び有機金属の錯体、有機補欠
分子族、化学発光性反応体及び螢光性分子等が挙げられ
る。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】従来、免疫測定が行わ
れるに際しては、抗体などが固定化された担体が用いら
れる。この抗体固定化担体は、一般に抗体を担体に固定
化した後にブロッキング反応を行う。そして、ブロッキ
ング反応は非特異吸着反応抑制のために行われ、通常一
定の温度以上のインキュベーションが行われる。しか
し、ブロッキング剤として一般によく用いられるＢＳＡ
（牛血清アルブミン）を用いた場合、長期インキュベー
ションを行うと、非特異吸着反応が上昇する。このため
に、ブロッキング剤として乳蛋白質例えばカゼインや脱
脂乳を用いると、非特異吸着反応は低減するが、蛋白質
の変性、沈殿等を生じ好ましくない。

【０００５】本発明は、このような問題点もなく、高い
保存性を有する抗体固定化担体の提供を目的としてい
る。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明の上記目的は、試
料中の特定成分と特異的に結合する抗体を不溶性の担体
に固定化し、次いでブロッキングを行った後に、緩衝溶
液中でインキュベーションすることを特徴とする抗体固
定化担体の製造方法及び該抗体固定化担体、並びに該抗
体固定化担体を用いることを特徴とする免疫学的測定方
法によって達成される。

【０００７】以下、本発明をさらに詳しく説明する。

【０００８】免疫反応に際して用いられる流体試料中の
特定成分と特異的に結合する抗体、特にモノクローナル
抗体が固定化される不溶性の担体としては粒状体、プレ
ート状といったものが有り、如何なるタイプのものでも
良い。不溶性担体の材料としては、アガロース、セルロ
ース、架橋デキストラン、ポリアクリルアミド、セルロ
ース、微結晶セルロース、架橋アガロース、架橋ポリア
クリルアミド、ガラス、シリカゲル、ケイ藻土、二酸化
チタン、硫酸バリウム、酸化亜鉛、酸化鉛、ケイ砂、ポ
リスチレン等の各種の合成樹脂のほか、多孔質な素材、
さらには磁性微粒子などが利用できる。好ましくはアガ
ロース、架橋アガロース、架橋デキストラン、ポリアク
リルアミド、架橋ポリアクリルアミド、ガラス、シリカ
ゲル、ポリスチレン、セルロース、微結晶セルロース等
であり、更に好ましくはポリアクリルアミド、架橋ポリ
アクリルアミド、ポリスチレン、微結晶セルロース等で
ある。これらの不溶性担体は数種を混合して用いても良
い。

【０００９】本発明に用いられる抗体は、これら不溶性
担体に、当業者に公知の方法で化学的及び／又は物理的
に直接、あるいは間接的に結合させることができる。結
合法については１９７６年、講談社発行、千畑一郎ほか
２名編「実験と応用アフィニティクロマトグラフィ
ー」（第１刷）、１９７５年、講談社発行、山崎誠ほ
か２名編「アフィニティクロマトグラフィー」（第１
版）を参考にできる。

【００１０】本発明は、抗体を担体に固定化した後、非
特異反応を排除する目的で、ブロッキング反応を行う。
ブロッキング剤として、測定すべき特異的反応に関与し
ない蛋白質を用いることができる。そして、本発明では
ブロッキング剤として好ましくは乳蛋白質が用いられる
が、特に好ましくはカゼインが用いられる。

【００１１】ブロッキング反応を終了した抗体固定化担
体は、緩衝溶液中でインキュベーションを行う。この緩
衝溶液のｐＨは５〜10が好ましいが、より好ましくはｐ
Ｈ６〜８である。また、インキュベーションの温度は25
〜45℃が好ましく、より好ましくは35〜40℃である。

【００１２】測定に用いられる流体試料としてはあらゆ
る形態の溶液、コロイド溶液などが使用しうるが、好ま
しくは生物由来の流体試料、例えば血液、血漿、血清、
脳脊髄液、唾液、羊水、乳、尿、汗、肉汁等が挙げられ
る。測定しうる流体試料中での特定成分は、その特定成
分に特異的に結合する物質が存在しうる物質（物質群）
である。具体的には、特開昭６２−９０５３９号公報や
特開昭６３−１３１０６２号公報に記載の物質（物質
群）を挙げることができるが、これらに限定されるもの
ではない。

【００１３】そして、上記したような例えばモノクロー
ナル抗体が固定化された固定化担体、標識抗体及び試料
中の抗原との間で免疫反応が行われ、その後標識物質を
測定することにより定量が行われる。

【００１４】免疫反応に用いられる抗体の標識物質とし
ては、通常の免疫測定法で一般に使用されるものを用い
ることが出来、例えば酵素、放射性物質、発光物質、蛍
光物質などが挙げられ、又、酵素基質、補酵素、酵素阻
害物質、バクテリオファージ、循環反応体、金属及び有
機金属の錯体、有機補欠分子族、化学発光性反応体及び
螢光性分子等も使用できるが、好ましくはβ−Ｄ−ガラ
クトシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダ
ーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルタメートデヒドロ
ゲナーゼ、アミラーゼ等の酵素である。これらの酵素を
標識物質とする場合、酵素反応系、発色系は公知のもの
を使用できる。具体的には、特開昭６１−２９２０６０
号公報、特開昭６２−９０５３９号公報、特開昭６３−
１３１０６２号公報、特開昭６３−４５５６２号公報、
特願昭６３−２１９８９３号明細書に記載の物質（物質
群）が挙げられるが、これらに限定されるものではな
い。そして、これら標識物質の抗体への結合は、当業者
間で知られている公知の試薬と方法で行うことができ、
例えば石川栄治、河合忠、宮井潔編「酵素免疫測
定法（第３版）、医学書院、１９８７年」や日本臨床病
理学会編「臨床病理」臨時増刊特集第５３号「臨床検査
の為のイムノアッセイ−技術と応用−、臨床病理刊行
会、１９８３年」などに記載された方法を参考にするこ
とができる。

【００１５】本発明で使用される抗体は、その由来を特
に限定されるものではなく、哺乳動物等に抗原を投与、
免疫して得られる抗血清、腹水液をそのままか、あるい
は従来公知の方法である硫酸ナトリウム沈澱法、硫酸ア
ンモニウム沈澱法、セファデックスゲルによるゲル濾過
法、イオン交換セルロースクロマトグラフィ法、電気泳
動法等（右田俊介偏「免疫化学」中山書店ｐｐ７４〜８
８参照）で精製して用いることができる。又、これらの
抗体はＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ各分画
を用いることができ、或いはこれらの抗体を酵素処理し
てＦａｂ、Ｆａｂ’又はＦ（ａｂ’）₂ といった活性抗
体フラグメントにして使用しても良い。本発明の免疫反
応型式としては、競合法、２抗体法、サンドイッチ法な
どが挙げられるが、特に限定はされない。

【００１６】免疫反応後の標識物質に起因した信号の測
定方法は標識の種類により異なるが、例えば標識物質が
螢光物質であれば、螢光強度を測定すれば良く、標識物
質が酵素であれば適当な基質、必要ならば酵素や発色系
を含む溶液を添加し、一定時間インキュベートした後
に、該発色系に適合した波長の光の吸光度または反射濃
度（基質の種類によっては螢光強度、発光強度）を測定
することにより信号強度を測定できる。このような目的
で用いられる基質、発色系は標識酵素の種類にしたがっ
て適宜なものを選択できる。標識酵素に起因した信号
は、吸光度法（比色法) 、螢光法、発光法、放射活性測
定法で検出することができ、測定法としては信号の経時
的変化を測定するレート測定法または一定時間後の信号
を測定するエンドポイント測定法で測定することができ
る。好ましくは吸光度法であり、吸光度法（比色法) で
は紫外線、可視光、近赤外光を利用することができる。

【００１７】

【実施例】以下、実施例により具体的に説明するが、本
発明は実施例によって限定されるものではない。

【００１８】実施例１材料の調製を以下の通り行った a.抗体固定化ビーズポリスチレン製のビーズ（d；1/4inch）を適当数用意し
た。これを広口瓶にいれ、エタノールを適当量加え15分
置き、軽く振盪して油分など汚れを除去した。蒸留水で
よくビーズを洗いエタノールを完全に除いた。さらに、
0.2M炭酸バッファー（PH9.1）で数回濯ぎ、特願平４−
７８３０５に記載のモノクローナル抗体ＡＣ−００５を
20μg/mlの濃度で含有する上記炭酸バッファーをビーズ
が浸る量加えた。４℃温度条件下で24±２時間静置し、
上記抗体を該ビーズに固定化させた。燐酸緩衝生理食塩
水（以後ＰＢＳという）で数回ビーズを洗ってから下記
要領でブロッキングを行った。

【００１９】ブロッキング反応ブロッキング剤として、 1.)１％ＢＳＡを含むＰＢＳ及び 2.)0.5％カゼインを含むＰＢＳを用い２種類のブロッキ
ングされたビーズを得た。この反応は37℃温度条件下で
18時間行った。ブロッキング反応後は上記２種類のブロ
ッキングされたビーズにそれぞれ下記４種の処理を施し
た。

【００２０】ブロッキング反応後の処理処理(1)：そのまま、３７℃条件下で２１日間インキュ
ベート処理(2)：そのまま、４℃条件下で２１日間、静置処理(3)：ＰＢＳに溶液を換え、３７℃条件下で２１日
間インキュベート処理(4)：ＰＢＳに溶液を換え、４℃条件下で２１日
間、静置また、免疫反応が行われる際、直接のビーズへ
の非特異吸着の程度を調べるため、抗体を添加する行程
を除いた上記方法により、抗体の固定化されていないビ
ーズも同時に用意した。

【００２１】b.酵素標識抗体液市販のウサギ抗ヒトα１-アンチキモトリプシン抗体
（株式会社医学生物学研究所製）を固定化したアフィニ
ティーカラムクロマトグラフィーにより精製した。つい
で過ヨウ素酸法（石川栄治ら；酵素免疫測定法(1987
年)）に従い、ペルオキシダーゼ（西洋わさび）を上記
抗体に結合させ酵素標識化を行った。それを0.05％のカ
ゼインを含有するＰＢＳに適当量加えて希釈し、酵素標
識抗体液を調製した。酵素標識抗体液には0.05％ p-ヒ
ドロキシ安息香酸、0.05％ p-ヒドロキシ安息香酸メチ
ルを加え、４℃で保存した。

【００２２】c.発色剤、基質液発色剤は、オルトフェニレンジアミン２塩酸塩を使い、
安定化剤として0.05％トリポリ燐酸を含む水溶液に規定
量（使用濃度３mg/ml）溶かした後、凍結乾燥させた。
基質液は0.02％過酸化水素水を含むクエン酸緩衝液(pH
5.0)を用い、使用時に双方を混ぜ合わせ発色液として用
いた。

【００２３】d.反応停止液発色反応停止は１Ｎ硫酸を用いた。

【００２４】e.免疫反応用緩衝液ＰＢＳに含有量0.5％となるようにカゼインを溶解し、
これに0.05％ p-ヒドロキシ安息香酸メチルを添加し、
免疫反応用緩衝液とした。各調製した緩衝液は４℃で保
存した。

【００２５】f.標準液の調製ＰＢＳに含有量0.03％となるようにカゼインを溶解し
た。これにヒト癌患者腹水（抗原であるActa量：100U/m
L）を目的の濃度になるよう適宜希釈添加し、標準液と
した。本実施例ではActa量300mU/mLの標準液を調製し
た。

【００２６】測定操作は、標準液100μl、次いで免疫反
応用緩衝液150μlをチューブ（トレイ）へ分注した。次
いで、上述したａにより調製した抗体結合ビーズをピン
セットで１個ずつ加えた。つぎにトレイにシールをかぶ
せて、37℃水浴中、1.5時間静置した。その後、1.5ml以
上のＰＢＳで３回洗浄した。250μlの酵素標識抗体液を
加え、室温(15〜25℃）で1.5時間静置した。反応終了
後、1.5ml以上のＰＢＳで４回洗浄した。洗浄したビー
ズを別のチューブへ移動させ、300μlの発色液を加え、
室温で30分間静置した。次いで1mlの反応停止液を加え
た。その溶液の波長492nmの吸光度を測定した。

【００２７】得られた結果は、表１及び図１に示す。

【００２８】

【表１】

【００２９】

【表２】

【００３０】表１、２及び図１から、本発明に係る、カ
ゼインをブロッキング溶液とし、タンパク質を含まない
緩衝液中に抗体結合担体を浸漬した後、インキュベーシ
ョン処理すると、バックグラウンドの上昇がなく、抗体
の活性が向上し、ばらつきが少なく、安定性の高い抗体
固定化担体が得られることが解る。

【００３１】

【発明の効果】本発明の抗体固定化担体は高い保存性を
有し、かつ高感度な測定が可能となる。

【図面の簡単な説明】

【図１】抗体固定化担体の経時活性度の吸光度を示すグ
ラフである。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】試料中の特定成分と特異的に結合する抗
体を不溶性の担体に固定化し、次いでブロッキングを行
った後に、緩衝溶液中でインキュベーションすることを
特徴とする抗体固定化担体の製造方法。
【請求項２】抗体固定化担体が請求項１記載の方法に
より製造されたことを特徴とする抗体固定化担体。
【請求項３】請求項２記載の抗体固定化担体を用いる
ことを特徴とする免疫学的測定方法。