JPH0658940A - 複合体化したカテプシンＧとα−１−抗キモトリプシンの検出方法 - Google Patents
複合体化したカテプシンＧとα−１−抗キモトリプシンの検出方法Info
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 本発明は、ヒト血漿中のα−１−抗キモトリ
プシンとカテプシンＧの複合体の検出方法に関する。本
発明はまた、サンプル中の、α−１−抗キモトリプシン
とカテプシンＧの複合体の定量的および定性的検出のた
めの診断用キットに関する。 【効果】 体液および細胞培養液のような任意のサンプ
ル中のカテプシンＧとα−１−抗キモトリプシンの複合
体の検出を可能にし、その濃度が上昇する疾患の診断を
可能にした。
プシンとカテプシンＧの複合体の検出方法に関する。本
発明はまた、サンプル中の、α−１−抗キモトリプシン
とカテプシンＧの複合体の定量的および定性的検出のた
めの診断用キットに関する。 【効果】 体液および細胞培養液のような任意のサンプ
ル中のカテプシンＧとα−１−抗キモトリプシンの複合
体の検出を可能にし、その濃度が上昇する疾患の診断を
可能にした。
Description
【０００１】本発明は、体液中のカテプシンＧとα−１
−抗キモトリプシンの複合体の検出方法に関する。さら
に本発明は、この方法を実施するための診断用キットに
関する。
−抗キモトリプシンの複合体の検出方法に関する。さら
に本発明は、この方法を実施するための診断用キットに
関する。
【０００２】α−１−抗キモトリプシンは６８−ｋＤａ
の糖蛋白質で、血漿中プロテアーゼインヒビターの「セ
ルピン」ファミリー（セリンプロテアーゼインヒビタ
ー）に属す（Journal of Medicine 16; 101-128, 1985;
Annual Review of Biochemistry 52; 655-709, 198
3）。それは主として肝臓で合成されるが、各種組織で
も産生することができる。血漿中の急性相反応物である
α−１−抗キモトリプシンの濃度は、傷害後数時間内に
劇的に増大する。それは、キモトリプシン様特異性をも
つセリンプロテアーゼを阻害する。好中球からのカテプ
シンＧは、α−１−抗キモトリプシンによって標的とさ
れる一次酵素である。キモトリプシンに対する会合速度
は遅く、生物学的重要性は考え難い（Journal of Biolo
gical Chemistry 155: 3931-3934, 1980）。
の糖蛋白質で、血漿中プロテアーゼインヒビターの「セ
ルピン」ファミリー（セリンプロテアーゼインヒビタ
ー）に属す（Journal of Medicine 16; 101-128, 1985;
Annual Review of Biochemistry 52; 655-709, 198
3）。それは主として肝臓で合成されるが、各種組織で
も産生することができる。血漿中の急性相反応物である
α−１−抗キモトリプシンの濃度は、傷害後数時間内に
劇的に増大する。それは、キモトリプシン様特異性をも
つセリンプロテアーゼを阻害する。好中球からのカテプ
シンＧは、α−１−抗キモトリプシンによって標的とさ
れる一次酵素である。キモトリプシンに対する会合速度
は遅く、生物学的重要性は考え難い（Journal of Biolo
gical Chemistry 155: 3931-3934, 1980）。
【０００３】α−１−抗キモトリプシンとカテプシンＧ
の相互関係については十分確立されているが、この系の
生理的役割については不明である。カテプシンＧの機能
については、結合組織の代謝回転（Biochemical Journa
l 167; 629-237, 1977）、微生物の除去（Infection an
d Immunity 14; 1276-1283, 1976）、アンギオテンシン
IIの生成（Journal of Biological Chemistry 257: 861
9-8622, 1982）、血液凝固の代謝回転（Thrombocyte Re
search 6: 315-326, 1975）および補体因子のように、
いくつかの提案がなされている。
の相互関係については十分確立されているが、この系の
生理的役割については不明である。カテプシンＧの機能
については、結合組織の代謝回転（Biochemical Journa
l 167; 629-237, 1977）、微生物の除去（Infection an
d Immunity 14; 1276-1283, 1976）、アンギオテンシン
IIの生成（Journal of Biological Chemistry 257: 861
9-8622, 1982）、血液凝固の代謝回転（Thrombocyte Re
search 6: 315-326, 1975）および補体因子のように、
いくつかの提案がなされている。
【０００４】α−１−抗キモトリプシンと類縁の一部の
他のセリンプロテアーゼインヒビターの欠損の検出が、
それらの生物学的機能の説明に役立ってきた。しかしな
がら、α−１−抗キモトリプシンの免疫学的測定では、
広範囲のスクリーニングにもかかわらず、患者でのα−
１−抗キモトリプシンの完全な欠損は検出できていな
い。α−１−抗キモトリプシン濃度が正常の≦５０％の
患者では、常染色体優性トレードの異型接合体または肝
疾患による後天性のものいずれでも、肺および肝疾患に
罹患しやすいようであるが、明確な因果関係についての
結論は現在のところ引出されていない。α−１−抗キモ
トリプシンの機能的損傷は、複雑な生物学的液体たとえ
ば血漿中では、α−１−抗キモトリプシンともっぱら反
応するプロテアーゼは知られていないことから、評価で
きなかった。しかしながら、これは、活性α−１−抗キ
モトリプシンを血漿中で特異的に測定し得たイムノアッ
セイによって達成された（Clinical Chemistry 36: 207
7-2081, 1990）。
他のセリンプロテアーゼインヒビターの欠損の検出が、
それらの生物学的機能の説明に役立ってきた。しかしな
がら、α−１−抗キモトリプシンの免疫学的測定では、
広範囲のスクリーニングにもかかわらず、患者でのα−
１−抗キモトリプシンの完全な欠損は検出できていな
い。α−１−抗キモトリプシン濃度が正常の≦５０％の
患者では、常染色体優性トレードの異型接合体または肝
疾患による後天性のものいずれでも、肺および肝疾患に
罹患しやすいようであるが、明確な因果関係についての
結論は現在のところ引出されていない。α−１−抗キモ
トリプシンの機能的損傷は、複雑な生物学的液体たとえ
ば血漿中では、α−１−抗キモトリプシンともっぱら反
応するプロテアーゼは知られていないことから、評価で
きなかった。しかしながら、これは、活性α−１−抗キ
モトリプシンを血漿中で特異的に測定し得たイムノアッ
セイによって達成された（Clinical Chemistry 36: 207
7-2081, 1990）。
【０００５】しかし、いくつかの適用では、カテプシン
Ｇまたはα−１−抗キモトリプシンの代謝回転が増大し
ている疾患状態を認識するために、カテプシンＧとα−
１−抗キモトリプシンの複合体をナノモル濃度で測定す
ることが望ましい。ヒト白血球エラスターゼとその一次
血漿インヒビターの類似の系については高感度のサンド
イッチＥＬＩＳＡ（固相酵素免疫測定法）が報告されて
いる（Journal of Clinical Biochemistry 22: 693-69
7, 1984、 EP-0 038 935）が、カテプシンＧとα−１−
抗キモトリプシンの複合体には、カテプシンＧの固体表
面に対する強く結合活性がこのような基本的なサンドイ
ッチＥＬＩＳＡにおけるカテプシンの適用を阻止するの
で、このようなアッセイは利用できない。
Ｇまたはα−１−抗キモトリプシンの代謝回転が増大し
ている疾患状態を認識するために、カテプシンＧとα−
１−抗キモトリプシンの複合体をナノモル濃度で測定す
ることが望ましい。ヒト白血球エラスターゼとその一次
血漿インヒビターの類似の系については高感度のサンド
イッチＥＬＩＳＡ（固相酵素免疫測定法）が報告されて
いる（Journal of Clinical Biochemistry 22: 693-69
7, 1984、 EP-0 038 935）が、カテプシンＧとα−１−
抗キモトリプシンの複合体には、カテプシンＧの固体表
面に対する強く結合活性がこのような基本的なサンドイ
ッチＥＬＩＳＡにおけるカテプシンの適用を阻止するの
で、このようなアッセイは利用できない。
【０００６】本発明の課題は、したがって、体液中のカ
テプシンＧとα−１−抗キモトリプシンの複合体の特異
的同定のためのアッセイを提供することにある。この課
題は、（ａ） 蛋白質吸着剤の表面をコート剤でコート
し、（ｂ） 上記複合体を含むサンプルをコートした表
面に適用し、（ｃ） α−１−抗キモトリプシンを検出
剤で検出することにより吸着された複合体を検出する各
工程からなる、サンプル中のα−１−抗キモトリプシン
とカテプシンＧの複合体の検出方法によって解決され
る。
テプシンＧとα−１−抗キモトリプシンの複合体の特異
的同定のためのアッセイを提供することにある。この課
題は、（ａ） 蛋白質吸着剤の表面をコート剤でコート
し、（ｂ） 上記複合体を含むサンプルをコートした表
面に適用し、（ｃ） α−１−抗キモトリプシンを検出
剤で検出することにより吸着された複合体を検出する各
工程からなる、サンプル中のα−１−抗キモトリプシン
とカテプシンＧの複合体の検出方法によって解決され
る。
【０００７】この方法は、体液および細胞培養液上清の
ような任意のサンプル中のカテプシンＧとα−１−抗キ
モトリプシンの複合体の検出を可能にする。本発明によ
れば、サンプルは、血液、血漿、血清、尿、関節液また
は脳脊髄液から採取できる。エム・ベック患者の気管支
洗浄液サンプル中に、この複合体の濃度の上昇が見出さ
れている。このアッセイは、蛋白質吸着剤のコート表面
に対するカテプシンＧの高い結合活性を利用している。
このような表面は、ポリスチレン、金、シリカ、ポリア
クリルアミドまたはガラスのような、本技術分野の熟練
者に知られている材料から選択できる。表面は、ミクロ
タイタープレート、ＥＬＩＳＡ管、ラテックスビーズ、
ミンロビーズまたはフリースとして形成できる。
ような任意のサンプル中のカテプシンＧとα−１−抗キ
モトリプシンの複合体の検出を可能にする。本発明によ
れば、サンプルは、血液、血漿、血清、尿、関節液また
は脳脊髄液から採取できる。エム・ベック患者の気管支
洗浄液サンプル中に、この複合体の濃度の上昇が見出さ
れている。このアッセイは、蛋白質吸着剤のコート表面
に対するカテプシンＧの高い結合活性を利用している。
このような表面は、ポリスチレン、金、シリカ、ポリア
クリルアミドまたはガラスのような、本技術分野の熟練
者に知られている材料から選択できる。表面は、ミクロ
タイタープレート、ＥＬＩＳＡ管、ラテックスビーズ、
ミンロビーズまたはフリースとして形成できる。
【０００８】表面に飽和させるコート剤は好ましくは蛋
白質またはゼラチンであり、さらに好ましくは、ウシ血
清アルブミンまたはオバルブミンが使用される。
白質またはゼラチンであり、さらに好ましくは、ウシ血
清アルブミンまたはオバルブミンが使用される。
【０００９】複合体はそれらのカテプシンＧ残基によっ
て直接吸着され、ついで検出剤によって定量できる。検
出剤は、標識または非標識のいずれでもよいα−１−抗
キモトリプシンに特異的な抗体であることが好ましい。
抗体が標識される場合には、放射性同位元素たとえばＩ
１２５、Ｐ３２もしくはＣ１４で標識されるのが好まし
く、またビオチン化もしくは酵素への連結を行うことも
できる。抗体がビオチン化された場合は、ついでよく知
られたアビジン−ビオチン系によって検出される。抗体
が酵素に連結された場合は、吸着活性はついで適当な基
質の変換によって追跡される。好ましい酵素としては、
基質ｏ−フェニレンジアミンもしくはテトラメチルジア
ミノビフェニル二塩酸塩と組合せた西洋ワサビペルオキ
シダーゼまたは基質４−ニトロフェニルホスフェートと
組合せたアルカリホスファターゼが用いられる。抗体は
また、化学発光剤または蛍光剤とのカップリングにより
標識することもできる。
て直接吸着され、ついで検出剤によって定量できる。検
出剤は、標識または非標識のいずれでもよいα−１−抗
キモトリプシンに特異的な抗体であることが好ましい。
抗体が標識される場合には、放射性同位元素たとえばＩ
１２５、Ｐ３２もしくはＣ１４で標識されるのが好まし
く、またビオチン化もしくは酵素への連結を行うことも
できる。抗体がビオチン化された場合は、ついでよく知
られたアビジン−ビオチン系によって検出される。抗体
が酵素に連結された場合は、吸着活性はついで適当な基
質の変換によって追跡される。好ましい酵素としては、
基質ｏ−フェニレンジアミンもしくはテトラメチルジア
ミノビフェニル二塩酸塩と組合せた西洋ワサビペルオキ
シダーゼまたは基質４−ニトロフェニルホスフェートと
組合せたアルカリホスファターゼが用いられる。抗体は
また、化学発光剤または蛍光剤とのカップリングにより
標識することもできる。
【００１０】本発明の好ましい実施態様においては、検
出剤は２種の抗体から構成され、この場合、抗α−１−
抗キモトリプシンに特異的な第一の抗体がついで第二の
抗体によって検出される。検出剤として２種の抗体を使
用すると、アッセイの感度が高まる。第二の抗体を使用
する場合は、第一の抗体は標識する必要がない。どの標
識操作も抗体の部分不活性化を招くことが知られてい
る。この欠点は回避される。第二の抗体は、放射性同位
元素たとえばＩ１２５、Ｐ３２もしくはＣ１４、または
適当な酵素で標識され、あるいはビオチン化される。後
者の場合、検出工程はついでよく知られたアビジン−ビ
オチン系によって実施される。抗体はアルカリホスファ
ターゼに連結することが好ましく、この場合、適当な基
質は４−ニトロフェニルホスフェートである。抗体はま
た、化学発光剤または蛍光剤とのカップリングにより標
識することもできる。
出剤は２種の抗体から構成され、この場合、抗α−１−
抗キモトリプシンに特異的な第一の抗体がついで第二の
抗体によって検出される。検出剤として２種の抗体を使
用すると、アッセイの感度が高まる。第二の抗体を使用
する場合は、第一の抗体は標識する必要がない。どの標
識操作も抗体の部分不活性化を招くことが知られてい
る。この欠点は回避される。第二の抗体は、放射性同位
元素たとえばＩ１２５、Ｐ３２もしくはＣ１４、または
適当な酵素で標識され、あるいはビオチン化される。後
者の場合、検出工程はついでよく知られたアビジン−ビ
オチン系によって実施される。抗体はアルカリホスファ
ターゼに連結することが好ましく、この場合、適当な基
質は４−ニトロフェニルホスフェートである。抗体はま
た、化学発光剤または蛍光剤とのカップリングにより標
識することもできる。
【００１１】蛋白質コートビーズは濁り測定または比ろ
う法による比濁分析に適用できる。この場合、粒子の一
部は抗−α−１−抗キモトリプシン抗体でコートされ
る。
う法による比濁分析に適用できる。この場合、粒子の一
部は抗−α−１−抗キモトリプシン抗体でコートされ
る。
【００１２】本発明の方法は、カテプシンＧとα−１−
抗キモトリプシンの複合体に極めて特異的であるという
利点がある。特異性の証明には、カテプシンＧをキモト
リプシンおよびヒト白血球エラスターゼに置換した。い
ずれの場合も、相当する正常血漿の吸光度値を越える値
は得られなかった。
抗キモトリプシンの複合体に極めて特異的であるという
利点がある。特異性の証明には、カテプシンＧをキモト
リプシンおよびヒト白血球エラスターゼに置換した。い
ずれの場合も、相当する正常血漿の吸光度値を越える値
は得られなかった。
【００１３】キモトリプシンがα−１−抗キモトリプシ
ンと複合体を形成することは知られているが、その速度
はカテプシンＧに比べてはるかに遅い。したがって、そ
れは、α−１−抗キモトリプシンの一次生理的標的プロ
テアーゼとは考えられない。キモトリプシンのｐＩは８
である。それは与えられた条件ではミクロタイターウエ
ルに付着せず、したがってα−１−抗キモトリプシンは
保持されなかった。
ンと複合体を形成することは知られているが、その速度
はカテプシンＧに比べてはるかに遅い。したがって、そ
れは、α−１−抗キモトリプシンの一次生理的標的プロ
テアーゼとは考えられない。キモトリプシンのｐＩは８
である。それは与えられた条件ではミクロタイターウエ
ルに付着せず、したがってα−１−抗キモトリプシンは
保持されなかった。
【００１４】ヒト白血球エラスターゼはカテプシンＧと
同じ顆粒中に含有される。それはα−１−抗キモトリプ
シンとは複合体を形成しない。それも同じくｐＩが１０
の塩基性蛋白質であるから、α−１−抗キモトリプシン
との非特異的相互作用の排除を考慮した。干渉は検知さ
れなかった。カテプシンＧは、ジイソプロピルフルオロ
ホスフェート(ＤＦＰ)で不活性化した場合も、吸光度の
読みの上昇を生じることはできなかった。これは、本発
明の方法においてα−１−抗キモトリプシンが保持され
るのは、反応部位を介するインヒビターへの特異的結合
によるもので、酵素へのインヒビターの非特異的付着に
よるものではないことを示している。
同じ顆粒中に含有される。それはα−１−抗キモトリプ
シンとは複合体を形成しない。それも同じくｐＩが１０
の塩基性蛋白質であるから、α−１−抗キモトリプシン
との非特異的相互作用の排除を考慮した。干渉は検知さ
れなかった。カテプシンＧは、ジイソプロピルフルオロ
ホスフェート(ＤＦＰ)で不活性化した場合も、吸光度の
読みの上昇を生じることはできなかった。これは、本発
明の方法においてα−１−抗キモトリプシンが保持され
るのは、反応部位を介するインヒビターへの特異的結合
によるもので、酵素へのインヒビターの非特異的付着に
よるものではないことを示している。
【００１５】本発明の方法は、ヒトプロテアーゼに複合
体化するプロテアーゼインヒビターの検出のための既知
のサンドイッチＥＬＩＳＡとは異なる。カテプシンＧの
固体表面に対する強い結合活性が、このような非特異的
結合による基本的サンドイッチＥＬＩＳＡへのカテプシ
ンＧの適用を妨げていたのである。この結合を克服する
ための１Mol／リットル ＮａＣｌの添加のような試み
は、抗体の結合に強力に干渉した。これらの重大な問題
が、今日まで、α−１−抗キモトリプシンとカテプシン
Ｇの複合体の検出方法が開示されていない理由である。
体化するプロテアーゼインヒビターの検出のための既知
のサンドイッチＥＬＩＳＡとは異なる。カテプシンＧの
固体表面に対する強い結合活性が、このような非特異的
結合による基本的サンドイッチＥＬＩＳＡへのカテプシ
ンＧの適用を妨げていたのである。この結合を克服する
ための１Mol／リットル ＮａＣｌの添加のような試み
は、抗体の結合に強力に干渉した。これらの重大な問題
が、今日まで、α−１−抗キモトリプシンとカテプシン
Ｇの複合体の検出方法が開示されていない理由である。
【００１６】本発明の方法は既知のサンドイッチＥＬＩ
ＳＡに比し優れている。カテプシンＧの強力な結合は、
本技術分野で既知のＥＬＩＳＡ系における第一の抗体を
省略することによって活用された。カテプシンＧとα−
１−抗キモトリプシンの複合体は、ミクロタイタープレ
ート表面に、それらがアルブミンおよびツイーン２０で
コートされていても付着するのに対し、一方これらの条
件下では、遊離のα−１−抗キモトリプシンは結合しな
かった。結合した複合体は、ついで、α−１−抗キモト
リプシンに対する特異的抗体で免疫学的に検出された。
ＳＡに比し優れている。カテプシンＧの強力な結合は、
本技術分野で既知のＥＬＩＳＡ系における第一の抗体を
省略することによって活用された。カテプシンＧとα−
１−抗キモトリプシンの複合体は、ミクロタイタープレ
ート表面に、それらがアルブミンおよびツイーン２０で
コートされていても付着するのに対し、一方これらの条
件下では、遊離のα−１−抗キモトリプシンは結合しな
かった。結合した複合体は、ついで、α−１−抗キモト
リプシンに対する特異的抗体で免疫学的に検出された。
【００１７】カテプシンＧの強力な結合は高いアルギニ
ン含量に伴うその１０という塩基性ｐＩによるもので
（Biochim. Biophys, Acta 364: 103-112, 1974）、一
方、ｐＩが５のα−１−抗体キモトリプシンはコートさ
れた表面には付着しない。
ン含量に伴うその１０という塩基性ｐＩによるもので
（Biochim. Biophys, Acta 364: 103-112, 1974）、一
方、ｐＩが５のα−１−抗体キモトリプシンはコートさ
れた表面には付着しない。
【００１８】この方法における検量線の作成は１４nMol
／リットルまでの複合体濃度について設計された。この
範囲は、重篤な患者からの数例の血漿標本の予備的な測
定で得られた値を包含することで選択された。複合体を
全く含まない正常血漿（真のサンプルブランク）は手に
入らなかったので、検量標本は５０名の健康ドナーから
プールした血漿に予め作製した複合体の既知量を添加し
て調製した。したがって、検量曲線からの結果は、正常
血漿中に含まれる量にプラスされた複合体の濃度を表す
にすぎない。正常血漿中の複合体の実際の濃度は、試薬
ブランクに対する検量曲線の外挿によって評価しなけれ
ばならなかった。個々の正常血漿標本の値は常に低値
で、標準偏差は小さく、病的に上昇した値の同定は比較
的容易であった。正常血漿の試薬ブランクを越える吸収
が定常状態の複合体濃度によるものか、あるいはバック
グランドノイズによるものかは、確定できない。しかし
ながら、それはアッセイの総範囲の１０％未満の上昇で
あったから、実用上は、無視できるものである。これ
は、プロテナーゼ複合α−１−抗キモトリプシンが循環
から急速に消失するとの所見(Biochemistry 30(6): 172
3-1730, 1991)とよく一致する。
／リットルまでの複合体濃度について設計された。この
範囲は、重篤な患者からの数例の血漿標本の予備的な測
定で得られた値を包含することで選択された。複合体を
全く含まない正常血漿（真のサンプルブランク）は手に
入らなかったので、検量標本は５０名の健康ドナーから
プールした血漿に予め作製した複合体の既知量を添加し
て調製した。したがって、検量曲線からの結果は、正常
血漿中に含まれる量にプラスされた複合体の濃度を表す
にすぎない。正常血漿中の複合体の実際の濃度は、試薬
ブランクに対する検量曲線の外挿によって評価しなけれ
ばならなかった。個々の正常血漿標本の値は常に低値
で、標準偏差は小さく、病的に上昇した値の同定は比較
的容易であった。正常血漿の試薬ブランクを越える吸収
が定常状態の複合体濃度によるものか、あるいはバック
グランドノイズによるものかは、確定できない。しかし
ながら、それはアッセイの総範囲の１０％未満の上昇で
あったから、実用上は、無視できるものである。これ
は、プロテナーゼ複合α−１−抗キモトリプシンが循環
から急速に消失するとの所見(Biochemistry 30(6): 172
3-1730, 1991)とよく一致する。
【００１９】以下に本発明の方法をさらに詳細に記述す
る。複合したα−１−抗キモトリプシンのアッセイの基
本的原理は図１に示す。ミクロタイタープレートは、血
漿蛋白質の非特異的結合を防止するために、アルブミン
およびツイーン２０でコートした。カテプシンＧと複合
体を形成したα−１−抗キモトリプシンは、カテプシン
Ｇ残基を介してこの表面に結合した。固定化されたα−
１−抗キモトリプシンをついで、α−１−抗キモトリプ
シンに対する抗血清で検出した。
る。複合したα−１−抗キモトリプシンのアッセイの基
本的原理は図１に示す。ミクロタイタープレートは、血
漿蛋白質の非特異的結合を防止するために、アルブミン
およびツイーン２０でコートした。カテプシンＧと複合
体を形成したα−１−抗キモトリプシンは、カテプシン
Ｇ残基を介してこの表面に結合した。固定化されたα−
１−抗キモトリプシンをついで、α−１−抗キモトリプ
シンに対する抗血清で検出した。
【００２０】以下の試薬が使用された。すなわち、凍結
乾燥された純粋なα−１−抗キモトリプシン（ARTS, At
hens, GA, USA）は水で再構築し、１５０mmol／リット
ル ＮａＣｌ含有５０mmol／リットル トリス緩衝液pH
８.０中１ｇ／リットル濃度とした。α−１−抗キモト
リプシンの活性は、カテプシンＧの量を増量していっ
て、複合体の形成を８％ＳＤＳ−ポリアクリルゲル電気
泳動で評価することにより測定した。この製品は、カテ
プシンＧとの複合体形成の評価から判断して、完全な活
性を示した。１１に５０mmol酢酸および５００mmol Ｎ
ａＣｌを含有する緩衝液pH５.５中３.３ｇ／リットルの
カテプシンＧ（ＥＣ２.３.２１.２０）および同一緩衝
液中３.０ｇ／リットルのヒト白血球エラスターゼ（Ｅ
Ｃ３.４.２１.１１）を用いた。ヒトα−１−抗キモト
リプシンに対するウサギ抗血清は、DAKO,Copenhagen, D
enmarkから、アルカリホスファターゼ（ＥＣ３.１.３.
１）にカップリングした、ウサギ免疫グロブリンに対す
るヤギ抗血清はJackson Immunoresearch Laboratories,
Westgrove, PAから、ウシ血清アルブミン（ＲＩＡ
用）、ツイーン２０およびウシキモトリプシン（ＥＣ
３.４.２１.１）はSigma Chemical,St. Louls, MO, USA
から、４−ニトロフェニルホスフェート（二ナトリウム
六水和物）およびＤＭＳＯはMerck, Darmstadt, FRGか
ら、スクシニル−アラニル−アラニル−プロリル−フェ
ニルアラニル−パラニトロアニリドはSERVA, Heidelber
g, FRGから、ヘパリンナトリウム（LiqueminR）はHoffm
ann-La Roche, Grenzach-Wyhlen, FRGから入手した。
乾燥された純粋なα−１−抗キモトリプシン（ARTS, At
hens, GA, USA）は水で再構築し、１５０mmol／リット
ル ＮａＣｌ含有５０mmol／リットル トリス緩衝液pH
８.０中１ｇ／リットル濃度とした。α−１−抗キモト
リプシンの活性は、カテプシンＧの量を増量していっ
て、複合体の形成を８％ＳＤＳ−ポリアクリルゲル電気
泳動で評価することにより測定した。この製品は、カテ
プシンＧとの複合体形成の評価から判断して、完全な活
性を示した。１１に５０mmol酢酸および５００mmol Ｎ
ａＣｌを含有する緩衝液pH５.５中３.３ｇ／リットルの
カテプシンＧ（ＥＣ２.３.２１.２０）および同一緩衝
液中３.０ｇ／リットルのヒト白血球エラスターゼ（Ｅ
Ｃ３.４.２１.１１）を用いた。ヒトα−１−抗キモト
リプシンに対するウサギ抗血清は、DAKO,Copenhagen, D
enmarkから、アルカリホスファターゼ（ＥＣ３.１.３.
１）にカップリングした、ウサギ免疫グロブリンに対す
るヤギ抗血清はJackson Immunoresearch Laboratories,
Westgrove, PAから、ウシ血清アルブミン（ＲＩＡ
用）、ツイーン２０およびウシキモトリプシン（ＥＣ
３.４.２１.１）はSigma Chemical,St. Louls, MO, USA
から、４−ニトロフェニルホスフェート（二ナトリウム
六水和物）およびＤＭＳＯはMerck, Darmstadt, FRGか
ら、スクシニル−アラニル−アラニル−プロリル−フェ
ニルアラニル−パラニトロアニリドはSERVA, Heidelber
g, FRGから、ヘパリンナトリウム（LiqueminR）はHoffm
ann-La Roche, Grenzach-Wyhlen, FRGから入手した。
【００２１】CookeR ９６穴ミクロタイタープレートはG
reiner, Nuertingen, FRGから入手した。ミクロタイタ
ープレートの吸収の測定にはTitertek Multiscanフォト
メーター(Flow, Helsinki, Finland）を使用した。血液
サンプルについては、抗凝固剤として１０６mmol／リッ
トル クエン酸ナリトウム溶液０.５mlを含有するシリン
ジ（MonovetteR“Coagulation 5 ml", Sarstedt, Nuemb
recht, FRG）を使用した。
reiner, Nuertingen, FRGから入手した。ミクロタイタ
ープレートの吸収の測定にはTitertek Multiscanフォト
メーター(Flow, Helsinki, Finland）を使用した。血液
サンプルについては、抗凝固剤として１０６mmol／リッ
トル クエン酸ナリトウム溶液０.５mlを含有するシリン
ジ（MonovetteR“Coagulation 5 ml", Sarstedt, Nuemb
recht, FRG）を使用した。
【００２２】カテプシンＧの活性は、上述のように、発
色性基質、スクシニル−アラニル−アラニル−プロリル
−フェニルアラニル−パラニトロアニリドによってモニ
タリングした。ジイソプロピルフルオロホスフェート
(ＤＦＰ)によるカテプシンＧの不活性化には、この酵素
を０.２Ｍ／リットル トリスおよび０.５mmol／リット
ル ＮａＣｌ含有緩衝液pH８.０中０.３３ｇ／リットル
濃度で、１０mmol／リットルのＤＦＰ存在下にインキュ
ベートした。１５分後には、活性の残存は検出できなか
った。カテプシンＧとα−１−抗キモトリプシンの複合
体の調製には、プロテナーゼを０.２mol／リットル ト
リスおよび０.５mol／リットル ＮａＣｌ含有緩衝液pH
８.０中、０.０３３ｇ／リットル濃度で、２倍モル過剰
の活性α−１−抗キモトリプシンとともに室温で１０分
間インキュベートした。この後には、プロテナーゼの残
存活性は検出できなかった。
色性基質、スクシニル−アラニル−アラニル−プロリル
−フェニルアラニル−パラニトロアニリドによってモニ
タリングした。ジイソプロピルフルオロホスフェート
(ＤＦＰ)によるカテプシンＧの不活性化には、この酵素
を０.２Ｍ／リットル トリスおよび０.５mmol／リット
ル ＮａＣｌ含有緩衝液pH８.０中０.３３ｇ／リットル
濃度で、１０mmol／リットルのＤＦＰ存在下にインキュ
ベートした。１５分後には、活性の残存は検出できなか
った。カテプシンＧとα−１−抗キモトリプシンの複合
体の調製には、プロテナーゼを０.２mol／リットル ト
リスおよび０.５mol／リットル ＮａＣｌ含有緩衝液pH
８.０中、０.０３３ｇ／リットル濃度で、２倍モル過剰
の活性α−１−抗キモトリプシンとともに室温で１０分
間インキュベートした。この後には、プロテナーゼの残
存活性は検出できなかった。
【００２３】標本実験：静脈または動脈血を、感染の可
能性の防止に注意しながら、加クエン酸シリンジに採取
した。血漿は２０００ｇで１０分間遠心分離して得、直
ちに凍結した。標本は小分けして−２０℃で１カ月まで
保存したが、明らかな変化は認められなかった。解凍を
４回まで反復したが、結果に影響はみられなかった。４
℃で２４時間以上保存すると、シグナル強度の４０％の
喪失を生じた。遠心分離は、最終値に何らの変化も生じ
ることなく、２時間まで遅延させることが可能であっ
た。同一の患者から同時に採取した動脈血および静脈血
標本は、同一の結果を与えた。
能性の防止に注意しながら、加クエン酸シリンジに採取
した。血漿は２０００ｇで１０分間遠心分離して得、直
ちに凍結した。標本は小分けして−２０℃で１カ月まで
保存したが、明らかな変化は認められなかった。解凍を
４回まで反復したが、結果に影響はみられなかった。４
℃で２４時間以上保存すると、シグナル強度の４０％の
喪失を生じた。遠心分離は、最終値に何らの変化も生じ
ることなく、２時間まで遅延させることが可能であっ
た。同一の患者から同時に採取した動脈血および静脈血
標本は、同一の結果を与えた。
【００２４】実用範囲および検量：プールした正常血漿
に予め作製した複合体１４nMol／リットルまでを添加し
た希釈系列を調製した。予備試験後にこの範囲が選択さ
れた。集中治療病練における重篤な患者からの無作為に
抽出した患者サンプルの値の大部分が包含されたからで
ある（表１）。検量用の希釈系列の値を越える吸収値を
示したサンプルは、プールした正常血漿で希釈した。真
のサンプルブランクは手に入らなかったので、検量用希
釈系列の最低値、すなわちプールした正常血漿の値を対
照とした。したがって、検量曲線から誘導される濃度
は、実際には、プールされた正常血漿中に含まれる複合
体濃度がプラスされた濃度を意味する。プールされた正
常血漿の吸収が検量希釈系列に１０％以上の増加を生じ
ることはなかった（図２）。
に予め作製した複合体１４nMol／リットルまでを添加し
た希釈系列を調製した。予備試験後にこの範囲が選択さ
れた。集中治療病練における重篤な患者からの無作為に
抽出した患者サンプルの値の大部分が包含されたからで
ある（表１）。検量用の希釈系列の値を越える吸収値を
示したサンプルは、プールした正常血漿で希釈した。真
のサンプルブランクは手に入らなかったので、検量用希
釈系列の最低値、すなわちプールした正常血漿の値を対
照とした。したがって、検量曲線から誘導される濃度
は、実際には、プールされた正常血漿中に含まれる複合
体濃度がプラスされた濃度を意味する。プールされた正
常血漿の吸収が検量希釈系列に１０％以上の増加を生じ
ることはなかった（図２）。
【００２５】時間依存性および実用性：インキュベーシ
ョン時間を各工程あたり３０分に短縮しても、吸収の読
みの絶対値は低下するが、アッセイは可能である。その
場合、サンプルの提示から読み取りまでの最低時間は約
３.５時間になる。しかしながら、至適アッセイ条件の
説明において特定したように６０分間インキュベーショ
ンを用いた場合でも、各工程での１つのプレートの処理
に１０分かかるとして、１回のアッセイでは、最大量６
ミクロタイタープレートのサンプルしか測定できない。
比較可能な、吸収の読みの絶対値を得るためには、常に
完全なインキュベーション時間を採用することが薦めら
れる。
ョン時間を各工程あたり３０分に短縮しても、吸収の読
みの絶対値は低下するが、アッセイは可能である。その
場合、サンプルの提示から読み取りまでの最低時間は約
３.５時間になる。しかしながら、至適アッセイ条件の
説明において特定したように６０分間インキュベーショ
ンを用いた場合でも、各工程での１つのプレートの処理
に１０分かかるとして、１回のアッセイでは、最大量６
ミクロタイタープレートのサンプルしか測定できない。
比較可能な、吸収の読みの絶対値を得るためには、常に
完全なインキュベーション時間を採用することが薦めら
れる。
【００２６】本発明の方法は、カテプシンＧの遊離とα
−１−抗キモトリプシンの代謝回転の増大が疑われる疾
患状態に対して使用できる。例えば急性反応相において
は、反応がまだ誘発させているか、または複合体を形成
したα−１−抗キモトリプシンがインターロイキン−６
を介して急性反応相における陽性フィードバックシグナ
ルを調節して循環から急速に消失して既に解決している
か、その過程の重篤度についての手がかりを与える。さ
らに、このアッセイは、この顕著なプロティナーゼ阻害
系の生理的機能の本質をさらに明瞭にするのに有用であ
る。
−１−抗キモトリプシンの代謝回転の増大が疑われる疾
患状態に対して使用できる。例えば急性反応相において
は、反応がまだ誘発させているか、または複合体を形成
したα−１−抗キモトリプシンがインターロイキン−６
を介して急性反応相における陽性フィードバックシグナ
ルを調節して循環から急速に消失して既に解決している
か、その過程の重篤度についての手がかりを与える。さ
らに、このアッセイは、この顕著なプロティナーゼ阻害
系の生理的機能の本質をさらに明瞭にするのに有用であ
る。
【００２７】
【表１】
【００２８】例１ 本発明の方法の実施例 工程１． アルブミンによるコーティング ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を、０.０５％ツイーン
２０と０.０２％ ＮａＮ3を含有するリン酸緩衝食塩溶
液（ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ）に１％の濃度に溶解した。２
００μｌを各ウエルに添加し、３７℃で６０分間インキ
ュベートした。このアッセイにおいてインキュベーショ
ンといった場合にはすべて、ミクロタイタープレートの
湿潤大気中での保持を意味する。インキュベーション
後、ウエルを傾瀉して液体を除き、２５０μｌのＰＢＳ
−Ｔｗｅｅｎで４回洗浄した。各洗浄サイクルは3０秒
間続けた。この洗浄操作は以下のすべての工程で採用さ
れ、以下単に「洗浄」という。
２０と０.０２％ ＮａＮ3を含有するリン酸緩衝食塩溶
液（ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ）に１％の濃度に溶解した。２
００μｌを各ウエルに添加し、３７℃で６０分間インキ
ュベートした。このアッセイにおいてインキュベーショ
ンといった場合にはすべて、ミクロタイタープレートの
湿潤大気中での保持を意味する。インキュベーション
後、ウエルを傾瀉して液体を除き、２５０μｌのＰＢＳ
−Ｔｗｅｅｎで４回洗浄した。各洗浄サイクルは3０秒
間続けた。この洗浄操作は以下のすべての工程で採用さ
れ、以下単に「洗浄」という。
【００２９】工程２． サンプルの適用 １０μｌの血漿サンプルを、１００Ｕ／リットルのヘパ
リン（LiqueminR）を含有するＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ ５０
０μｌに添加し、６秒間回転振盪した。ついで直ちに、
各１００μｌの４つのサンプルを、ミクロタイタープレ
ートの４つのウエルに適用した。検量希釈系列の場合に
は、予め形成させた複合体１４nMol／リットルを添加し
た健常ドナープールからの血漿を、元の血漿で希釈して
下は１.４nMol／リットルから等間隔で濃度が上昇する
１０個の検量標本系列を調製した。ブランクはＰＢＳ−
Ｔｗｅｅｎのみとした。１.４nMol／リットル、７.０nM
ol／リットルおよび１４nMol／リットルの検量サンプル
を各試行毎に、それぞれの付加ミクロタイタープレート
に二重に適用した。希釈標本の適用に要する時間を最短
に維持するため、それらは、多チャンネルピペットでの
迅速な添加が可能なように、ミクロタイタープレートに
おける所望の順序に対応したエッペンドルフカップのパ
ネルに配置させた。インキュベーションは３７℃で６０
分間とし、ついで洗浄操作を行った。
リン（LiqueminR）を含有するＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ ５０
０μｌに添加し、６秒間回転振盪した。ついで直ちに、
各１００μｌの４つのサンプルを、ミクロタイタープレ
ートの４つのウエルに適用した。検量希釈系列の場合に
は、予め形成させた複合体１４nMol／リットルを添加し
た健常ドナープールからの血漿を、元の血漿で希釈して
下は１.４nMol／リットルから等間隔で濃度が上昇する
１０個の検量標本系列を調製した。ブランクはＰＢＳ−
Ｔｗｅｅｎのみとした。１.４nMol／リットル、７.０nM
ol／リットルおよび１４nMol／リットルの検量サンプル
を各試行毎に、それぞれの付加ミクロタイタープレート
に二重に適用した。希釈標本の適用に要する時間を最短
に維持するため、それらは、多チャンネルピペットでの
迅速な添加が可能なように、ミクロタイタープレートに
おける所望の順序に対応したエッペンドルフカップのパ
ネルに配置させた。インキュベーションは３７℃で６０
分間とし、ついで洗浄操作を行った。
【００３０】工程４． 第一の抗体の反応 ウサギ−抗−ヒト−α−１−抗キモトリプシン抗血清
を、１％ＢＳＡを含むＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎに１：１００
０に希釈した。１００μｌを各ウエルに適用した。イン
キュベーションは３７℃で６０分間とし、ついで洗浄操
作を行った。
を、１％ＢＳＡを含むＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎに１：１００
０に希釈した。１００μｌを各ウエルに適用した。イン
キュベーションは３７℃で６０分間とし、ついで洗浄操
作を行った。
【００３１】工程５． 第二の抗体の反応 アルカリホスファターゼにカップリングしたヤギ−抗−
ウサギ−ＩｇＧ抗血清を、１％ＢＳＡを含むＰＢＳ−Ｔ
ｗｅｅｎに１：１０００に希釈した。１００μｌを各ウ
エルに適用した。インキュベーションは３７℃で６０分
間とし、ついで洗浄操作を行った。
ウサギ−ＩｇＧ抗血清を、１％ＢＳＡを含むＰＢＳ−Ｔ
ｗｅｅｎに１：１０００に希釈した。１００μｌを各ウ
エルに適用した。インキュベーションは３７℃で６０分
間とし、ついで洗浄操作を行った。
【００３２】工程６． 発色 アルカリホスファターゼは、０.０１mol／リットル Ｍ
ｇＣｌ2含有０.１mol／リットル グリシンpH１０.５中
４ｇ／リットルの４−ニトロフェニルホスフェート１０
０μｌ／ウエルとともに、３７℃で３０分間インキュベ
ーションして検出した。吸収は４０５nmで測定した。
ｇＣｌ2含有０.１mol／リットル グリシンpH１０.５中
４ｇ／リットルの４−ニトロフェニルホスフェート１０
０μｌ／ウエルとともに、３７℃で３０分間インキュベ
ーションして検出した。吸収は４０５nmで測定した。
【００３３】工程７． 計算 標本の吸収を直線の検量曲線と比較し、それから正常レ
ベルを越える複合体濃度を直接決定することができた。
ベルを越える複合体濃度を直接決定することができた。
【００３４】例２ 方法の精度：アッセイの精度は、複合化したα−１−抗
キモトリプシンの低濃度（１.９nmol／リットル）、中
程度の濃度（９.８nmol／リットル）、および高濃度
（１４.０nmol／リットル）の３つの標本の測定によっ
て評価した。６回の同一測定を実施した。試行内の変動
係数（ＣＶ）はそれぞれ３.９％、７.５％および２.６
％、試行間のＣＶはそれぞれ５％、４％および３％であ
った。
キモトリプシンの低濃度（１.９nmol／リットル）、中
程度の濃度（９.８nmol／リットル）、および高濃度
（１４.０nmol／リットル）の３つの標本の測定によっ
て評価した。６回の同一測定を実施した。試行内の変動
係数（ＣＶ）はそれぞれ３.９％、７.５％および２.６
％、試行間のＣＶはそれぞれ５％、４％および３％であ
った。
【００３５】例３ 正確度：予め形成させた複合体を正常プール血漿に添加
すると、アッセイの範囲内において、吸収の直線的な増
加が認められた（図２）。α−１−抗キモトリプシンに
暴露する前に、カテプシンＧをＤＦＰで不活性化する
と、アッセイにおける付加的な吸収は完全に消失した。
また、ＤＦＰ不活性化カテプシンＧを直接血漿に添加し
ても、検出可能な吸収シグナルは生じなかった。３回の
回収実験において、異なる標本に予め形成させた複合体
５nmol／リットルを添加した。期待された吸収と実際の
吸収（回収）の間の差は１０％未満であった。
すると、アッセイの範囲内において、吸収の直線的な増
加が認められた（図２）。α−１−抗キモトリプシンに
暴露する前に、カテプシンＧをＤＦＰで不活性化する
と、アッセイにおける付加的な吸収は完全に消失した。
また、ＤＦＰ不活性化カテプシンＧを直接血漿に添加し
ても、検出可能な吸収シグナルは生じなかった。３回の
回収実験において、異なる標本に予め形成させた複合体
５nmol／リットルを添加した。期待された吸収と実際の
吸収（回収）の間の差は１０％未満であった。
【００３６】例４ 方法の特異性：２倍モル過剰のα−１−抗キモトリプシ
ンを、カテプシンＧに代えて、１４nmol／リットルのウ
シα−キモトリプシンまたはヒト白血球エラスターゼに
暴露した場合には、吸収の読みの上昇は生じなかった。
標本に極端に高濃度のヘパリン（２５０Ｕ／mlおよびそ
れ以上）を添加すると３０％までの吸収の低下を生じ、
一方、低濃度（２０Ｕ／mlおよびそれ以下）では吸収の
わずかな変化を生じたのみであった（５％未満）。しか
しながら、多くの重篤な患者は治療用量のヘパリンを投
与されているので、ヘパリンを血漿濃度５０００Ｕ／リ
ットルに相当する１００Ｕ／リットル、分析能の有意な
劣化を招くことなく患者サンプル中に存在するヘパリン
を無関係にしてしまうのに十分な濃度を標本緩衝液に添
加することにした。遠心分離前に標本に肉眼でわかるよ
うな機械的溶血があると、吸収シグナルは１００％まで
上昇する。したがって、溶血の徴候があるサンプルはこ
のアッセイには包含させるべきでない。
ンを、カテプシンＧに代えて、１４nmol／リットルのウ
シα−キモトリプシンまたはヒト白血球エラスターゼに
暴露した場合には、吸収の読みの上昇は生じなかった。
標本に極端に高濃度のヘパリン（２５０Ｕ／mlおよびそ
れ以上）を添加すると３０％までの吸収の低下を生じ、
一方、低濃度（２０Ｕ／mlおよびそれ以下）では吸収の
わずかな変化を生じたのみであった（５％未満）。しか
しながら、多くの重篤な患者は治療用量のヘパリンを投
与されているので、ヘパリンを血漿濃度５０００Ｕ／リ
ットルに相当する１００Ｕ／リットル、分析能の有意な
劣化を招くことなく患者サンプル中に存在するヘパリン
を無関係にしてしまうのに十分な濃度を標本緩衝液に添
加することにした。遠心分離前に標本に肉眼でわかるよ
うな機械的溶血があると、吸収シグナルは１００％まで
上昇する。したがって、溶血の徴候があるサンプルはこ
のアッセイには包含させるべきでない。
【００３７】例５ 検出可能域および基準範囲：５０名の健常個体（女性２
２名、男性２８名、２１才から５５才まで）のプール血
漿を基準として使用した。正常血漿中に一般に認められ
る複合体の濃度の評価には、検量曲線を用いて、プール
した正常血漿から試薬ブランクへ外挿した。これらの血
漿の個々の測定では、１.７３nmol／リットルに相当す
る平均値が得られ、標準偏差は０.５８nmol／リットル
であった。平均値プラス２×標準偏差（２.８９nmol／
リットル）を越える値は上昇があるとみなした。Intern
ational Federation of Clinical Chemistryによって定
義された検出限界、ブランクの平均値プラス２.６×標
準偏差は０.８４nmol／リットルであった。
２名、男性２８名、２１才から５５才まで）のプール血
漿を基準として使用した。正常血漿中に一般に認められ
る複合体の濃度の評価には、検量曲線を用いて、プール
した正常血漿から試薬ブランクへ外挿した。これらの血
漿の個々の測定では、１.７３nmol／リットルに相当す
る平均値が得られ、標準偏差は０.５８nmol／リットル
であった。平均値プラス２×標準偏差（２.８９nmol／
リットル）を越える値は上昇があるとみなした。Intern
ational Federation of Clinical Chemistryによって定
義された検出限界、ブランクの平均値プラス２.６×標
準偏差は０.８４nmol／リットルであった。
【００３８】以上、本発明を詳細に説明したが、本発明
はさらに次の実施態様によってこれを要約して示すこと
ができる。 １） サンプル中のα−１−抗キモトリプシンとカテプ
シンＧの複合体の検出方法において、（ａ） 蛋白質吸
着剤の表面をコート剤でコートし、（ｂ） 上記複合体
を含むサンプルをコートした表面に適用し、（ｃ） α
−１−抗キモトリプシンを検出剤で検出することにより
吸着された複合体を検出する各工程からなる方法。
はさらに次の実施態様によってこれを要約して示すこと
ができる。 １） サンプル中のα−１−抗キモトリプシンとカテプ
シンＧの複合体の検出方法において、（ａ） 蛋白質吸
着剤の表面をコート剤でコートし、（ｂ） 上記複合体
を含むサンプルをコートした表面に適用し、（ｃ） α
−１−抗キモトリプシンを検出剤で検出することにより
吸着された複合体を検出する各工程からなる方法。
【００３９】２） サンプルは、血液、血漿、血清、
尿、唾液、関節液、脳脊髄液、気管支洗浄液または細胞
培養液の上清から選択されることを特徴とする前項１記
載の方法。 ３） 蛋白質吸着剤は、ポリスチレン、金、シリカ、ポ
リアクリルアミドまたはガラスから選択されることを特
徴とする前項１または２記載の方法。 ４） コート剤は、蛋白質またはゼラチンであることを
特徴とする前項１〜３いずれか一項記載の方法。 ５） コート剤は好ましくは、ウシ血清アルブミンまた
はオバルブミンであることを特徴とする前項４記載の方
法。 ６） 検出剤は、α−１−抗キモトリプシンに特異的な
標識ポリクローナルまたはモノクローナル抗体であるこ
とを特徴とする前項１〜５いずれか一項記載の方法。
尿、唾液、関節液、脳脊髄液、気管支洗浄液または細胞
培養液の上清から選択されることを特徴とする前項１記
載の方法。 ３） 蛋白質吸着剤は、ポリスチレン、金、シリカ、ポ
リアクリルアミドまたはガラスから選択されることを特
徴とする前項１または２記載の方法。 ４） コート剤は、蛋白質またはゼラチンであることを
特徴とする前項１〜３いずれか一項記載の方法。 ５） コート剤は好ましくは、ウシ血清アルブミンまた
はオバルブミンであることを特徴とする前項４記載の方
法。 ６） 検出剤は、α−１−抗キモトリプシンに特異的な
標識ポリクローナルまたはモノクローナル抗体であるこ
とを特徴とする前項１〜５いずれか一項記載の方法。
【００４０】７） 抗体は、放射性同位元素、酵素、ビ
オチンまたは化学発光剤もしくは蛍光剤で標識されるこ
とを特徴とする前項６記載の方法。 ８） 検出剤は、ポリクローナルまたはモノクローナル
抗体であり、それはα−１−抗キモトリプシン抗体に特
異的な第二の標識抗体によって同定されることを特徴と
する前項１〜５いずれか一項記載の方法。 ９） 第二の抗体は、放射性同位元素、ビオチン、化学
発光剤もしくは蛍光剤で標識されるかまたは酵素に連結
されたポリクローナルまたはモノクローナル抗体である
ことを特徴とする前項８記載の方法。 10） 第二の抗体が連結される酵素はアルカリホスファ
ターゼまたは西洋ワサビペルオキシダーゼであることを
特徴とする前項９記載の方法。 11） 体液および細胞培養上清のサンプル中のα−１−
抗キモトリプシンとカテプシンＧの複合体の定性的およ
び定量的検出のための診断キット。
オチンまたは化学発光剤もしくは蛍光剤で標識されるこ
とを特徴とする前項６記載の方法。 ８） 検出剤は、ポリクローナルまたはモノクローナル
抗体であり、それはα−１−抗キモトリプシン抗体に特
異的な第二の標識抗体によって同定されることを特徴と
する前項１〜５いずれか一項記載の方法。 ９） 第二の抗体は、放射性同位元素、ビオチン、化学
発光剤もしくは蛍光剤で標識されるかまたは酵素に連結
されたポリクローナルまたはモノクローナル抗体である
ことを特徴とする前項８記載の方法。 10） 第二の抗体が連結される酵素はアルカリホスファ
ターゼまたは西洋ワサビペルオキシダーゼであることを
特徴とする前項９記載の方法。 11） 体液および細胞培養上清のサンプル中のα−１−
抗キモトリプシンとカテプシンＧの複合体の定性的およ
び定量的検出のための診断キット。
【図面の簡単な説明】
【図１】複合体を形成したα−１−抗キモトリプシンを
検出する本発明の方法の基本的原理を示す図である。
検出する本発明の方法の基本的原理を示す図である。
【図２】プールした正常血漿に１４nMol／リットルまで
のあらかじめ形成させた複合体を添加した正常血清の検
量系列を示す図である。
のあらかじめ形成させた複合体を添加した正常血清の検
量系列を示す図である。
Claims (3)
- 【請求項１】 サンプル中のα−１−抗キモトリプシン
とカテプシンＧの複合体の検出方法において、 （ａ） 蛋白質吸着剤の表面をコート剤でコートし、 （ｂ） 上記複合体を含むサンプルをコートした表面に
適用し、 （ｃ） α−１−抗キモトリプシンを検出剤で検出する
ことにより吸着された複合体を検出する各工程からなる
方法。 - 【請求項２】 検出剤は、非標識ポリクローナルまたは
モノクローナル抗体であり、それはα−１−抗キモトリ
プシン抗体に特異的な第二の標識抗体によって同定され
ることを特徴とする請求項１記載の方法。 - 【請求項３】 体液および細胞培養上清のサンプル中の
α−１−抗キモトリプシンとカテプシンＧの複合体の定
性的および定量的検出のための診断キット。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP92109994A EP0574599A1 (en) | 1992-06-13 | 1992-06-13 | Process for the detection of complexed cathepsin G and alpha-1-antichymotrypsin |
| DE92109994:1 | 1992-06-13 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0658940A true JPH0658940A (ja) | 1994-03-04 |
Family
ID=8209706
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5140489A Pending JPH0658940A (ja) | 1992-06-13 | 1993-06-11 | 複合体化したカテプシンＧとα−１−抗キモトリプシンの検出方法 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5631136A (ja) |
| EP (1) | EP0574599A1 (ja) |
| JP (1) | JPH0658940A (ja) |
| AU (1) | AU667370B2 (ja) |
| CA (1) | CA2098254A1 (ja) |
| NO (1) | NO932160L (ja) |
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|---|---|---|---|---|
| WO2007077291A1 (en) * | 2005-12-30 | 2007-07-12 | Turun Yliopisto | Method for determination of concentration, charge or unit size of a substance |
| US20090017477A1 (en) * | 2005-12-30 | 2009-01-15 | Harri Harma | Method for determination of concentration, charge or unit size of a substance |
| JP2017530356A (ja) | 2014-09-26 | 2017-10-12 | ソマロジック, インコーポレイテッドSomaLogic, Inc. | 心血管系のリスクイベントの予測及びその使用 |
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| DE3016575A1 (de) * | 1980-04-30 | 1981-11-05 | Merck Patent Gmbh, 6100 Darmstadt | Verfahren zur immunologischen bestimmung von enzymen, mittel zur durchfuehrung des verfahrens und seine verwandung |
| US4849353A (en) * | 1980-09-30 | 1989-07-18 | Cornell Research Foundation, Inc. | Immunocapture of enzyme inhibitor, enzyme complexes and uses thereof |
-
1992
- 1992-06-13 EP EP92109994A patent/EP0574599A1/en not_active Withdrawn
-
1993
- 1993-06-11 NO NO932160A patent/NO932160L/no unknown
- 1993-06-11 CA CA002098254A patent/CA2098254A1/en not_active Abandoned
- 1993-06-11 AU AU40182/93A patent/AU667370B2/en not_active Ceased
- 1993-06-11 JP JP5140489A patent/JPH0658940A/ja active Pending
-
1994
- 1994-12-05 US US08/353,342 patent/US5631136A/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| NO932160L (no) | 1993-12-14 |
| AU667370B2 (en) | 1996-03-21 |
| EP0574599A1 (en) | 1993-12-22 |
| CA2098254A1 (en) | 1993-12-14 |
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| NO932160D0 (no) | 1993-06-11 |
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