JP2892879B2 - 高分子量分析物の測定法 - Google Patents
高分子量分析物の測定法Info
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Description
【０００１】技術分野 本発明は、酵素イムノアッセイ及び特に、酵素ラベルと
してβ−ガラクトシダーゼを用いてのイムノアッセイに
関する。
してβ−ガラクトシダーゼを用いてのイムノアッセイに
関する。
【０００２】背影 酵素は、多くの種々のイムノアッセイにおいて検出可能
なラベルとして好都合良く使用されて来た。多くのその
ようなアッセイは、お互い補足し、そして活性酵素を形
成するβ−ガラクトシダーゼのフラグメントの能力に基
づかれて来た。特に、酵素分子の一端からのフラグメン
トであるβ−ガラクトシダーゼ酵素ドナー（ＥＤ）は、
活性β−ガラクトシダーゼ酵素を形成するために、β−
ガラクトシダーゼ酵素受容体（ＥＡ）、すなわち酵素分
子の他端からのフラグメントと結合する。一定の部位で
のＥＤへの小さな分析物又は分析物類似体の場合は、Ｅ
ＤとＥＡの相補性又はβ−ガラクトシダーゼ接触された
活性の速度に高い影響を及ぼさない。しかしながら、Ｅ
Ｄ−分析物接合体が抗−分析物抗体により結合される場
合、反応の初期相の間、相補性及び酵素触媒された反応
速度は減じられる。
なラベルとして好都合良く使用されて来た。多くのその
ようなアッセイは、お互い補足し、そして活性酵素を形
成するβ−ガラクトシダーゼのフラグメントの能力に基
づかれて来た。特に、酵素分子の一端からのフラグメン
トであるβ−ガラクトシダーゼ酵素ドナー（ＥＤ）は、
活性β−ガラクトシダーゼ酵素を形成するために、β−
ガラクトシダーゼ酵素受容体（ＥＡ）、すなわち酵素分
子の他端からのフラグメントと結合する。一定の部位で
のＥＤへの小さな分析物又は分析物類似体の場合は、Ｅ
ＤとＥＡの相補性又はβ−ガラクトシダーゼ接触された
活性の速度に高い影響を及ぼさない。しかしながら、Ｅ
Ｄ−分析物接合体が抗−分析物抗体により結合される場
合、反応の初期相の間、相補性及び酵素触媒された反応
速度は減じられる。
【０００３】酵素触媒された反応速度のこの低下は、ア
ッセイ媒体に存在するＥＤ−分析物接合体及びサンプル
に存在する分析物の両者が、ＥＡの添加の前、抗−分析
物抗体と競争する情況において分析物を定量化するため
に使用されて来た。β−ガラクトシダーゼ触媒された反
応速度は、サンプル中に存在する分析物の量が上昇する
につれて上昇する。なぜならばサンプル中の分析物が、
ＥＤ−分析物接合体及び抗−分析物抗体の相互反応を減
じ、活性β−ガラクトシダーゼ酵素を形成するために多
くのＥＤ−分析物接合体のＥＡとの反応を可能にするか
らである。
ッセイ媒体に存在するＥＤ−分析物接合体及びサンプル
に存在する分析物の両者が、ＥＡの添加の前、抗−分析
物抗体と競争する情況において分析物を定量化するため
に使用されて来た。β−ガラクトシダーゼ触媒された反
応速度は、サンプル中に存在する分析物の量が上昇する
につれて上昇する。なぜならばサンプル中の分析物が、
ＥＤ−分析物接合体及び抗−分析物抗体の相互反応を減
じ、活性β−ガラクトシダーゼ酵素を形成するために多
くのＥＤ−分析物接合体のＥＡとの反応を可能にするか
らである。
【０００４】この技術は、本来、低分子量分析物のため
に開発されて来た。β−ガラクトシダーゼ相補性アッセ
イにおける最近の開発は、その技法の新規アッセイタイ
プへの適用の他に、本来開発されたように、新規ＥＡ及
びＥＤ分子を包含し、ここでβ−ガラクトシダーゼ鎖の
連続性の断絶が、アミノ末端でのα領域における代わり
にその鎖のカルボキシル末端でのオメガ領域に存在す
る。
に開発されて来た。β−ガラクトシダーゼ相補性アッセ
イにおける最近の開発は、その技法の新規アッセイタイ
プへの適用の他に、本来開発されたように、新規ＥＡ及
びＥＤ分子を包含し、ここでβ−ガラクトシダーゼ鎖の
連続性の断絶が、アミノ末端でのα領域における代わり
にその鎖のカルボキシル末端でのオメガ領域に存在す
る。
【０００５】問題は、大きな分子量分析物のためのアッ
セイに存在する。そのようなアッセイにおいては、結合
パートナーが大きな分析物又はＥＤ分子に結合される分
析物類似体に結合する場合、相補性速度に対して比較的
小さな効果のみが存在する。これは、そのようなＥＤ−
分析物接合体における小さな分析物への大きな結合タン
パク質（通常、分析物に対して特異的な抗体）の結合が
相補性活性の有意な上昇を引き起こすように（すなわち
この速度で、活性β−ガラクトシダーゼが不活性ＥＤ及
びＥＡフラグメントから形成される）、小さな分析物に
関する問題ではない。しかしながら、大きな分析物がＥ
Ｄフラグメントにすでに結合されている場合、大きな分
子への抗体分子又は他の結合パートナーの結合が、相補
性の速度の少々の変化を引き起こす。
セイに存在する。そのようなアッセイにおいては、結合
パートナーが大きな分析物又はＥＤ分子に結合される分
析物類似体に結合する場合、相補性速度に対して比較的
小さな効果のみが存在する。これは、そのようなＥＤ−
分析物接合体における小さな分析物への大きな結合タン
パク質（通常、分析物に対して特異的な抗体）の結合が
相補性活性の有意な上昇を引き起こすように（すなわち
この速度で、活性β−ガラクトシダーゼが不活性ＥＤ及
びＥＡフラグメントから形成される）、小さな分析物に
関する問題ではない。しかしながら、大きな分析物がＥ
Ｄフラグメントにすでに結合されている場合、大きな分
子への抗体分子又は他の結合パートナーの結合が、相補
性の速度の少々の変化を引き起こす。
【０００６】従って、β−ガラクトシダーゼのＥＤ及び
ＥＡフラグメントの相補性を用いて高分子量分析物を測
定できる従来の方法よりも高められた感度を有する新規
方法のための必要性が存在する。
ＥＡフラグメントの相補性を用いて高分子量分析物を測
定できる従来の方法よりも高められた感度を有する新規
方法のための必要性が存在する。
【０００７】関連文献 変性されたβ−ガラクトシダーゼ酵素ドナー及び酵素受
容体は、化学的合成及び組換えＤＮＡ技法により調製さ
れて来た。その変性されたフラグメントは、相補性に基
づいてβ−ガラクトシダーゼ活性を保持する。たとえ
ば、アメリカ特許第４，７０８，９２９号及びそれに引
用される文献を参照のこと。β−ガラクトシダーゼに由
来する変異体ポリペプチドは、Langley and Labin, Bi
o.Chem.(1976)15：4866に開示されており、ここでその
ポリペプチドは、適切なβ−ガラクトシダーゼ陰性変異
体の抽出物に添加される場合、酵素活性を補足し、又は
自発的に再生することができる。また、Lin など., Bi
o.Chem.Biophys.Res.Comm. (1970)40：249 も参照のこ
と。
容体は、化学的合成及び組換えＤＮＡ技法により調製さ
れて来た。その変性されたフラグメントは、相補性に基
づいてβ−ガラクトシダーゼ活性を保持する。たとえ
ば、アメリカ特許第４，７０８，９２９号及びそれに引
用される文献を参照のこと。β−ガラクトシダーゼに由
来する変異体ポリペプチドは、Langley and Labin, Bi
o.Chem.(1976)15：4866に開示されており、ここでその
ポリペプチドは、適切なβ−ガラクトシダーゼ陰性変異
体の抽出物に添加される場合、酵素活性を補足し、又は
自発的に再生することができる。また、Lin など., Bi
o.Chem.Biophys.Res.Comm. (1970)40：249 も参照のこ
と。
【０００８】発明の要約 均質イムノアッセイシステムを用いて、高められた感度
を有しそしてこれまでの技法以上に簡単な、高分子量分
析物の検出及び定量分析のための方法及び試薬を提供す
ることが本発明の目的である。
を有しそしてこれまでの技法以上に簡単な、高分子量分
析物の検出及び定量分析のための方法及び試薬を提供す
ることが本発明の目的である。
【０００９】本発明は、β−ガラクトシダーゼドナー及
び受容体フラグメントを新規アッセイ型に使用すること
によって、そのような方法及び試薬を提供する。特に、
サンプルにおける高分子量分析物の存在又は量は、β−
ガラクトシダーゼの相補性フラグメントを用いることに
よって決定され、ここで前記フラグメントは、酵素ドナ
ー（ＥＤ）及び酵素受容体（ＥＡ）として定義され、そ
して結合され、すなわち一緒にされる場合、活性β−ガ
ラクトシダーゼを形成し、ここで前記ＥＤフラグメント
は、結合分子、特に抗体（Ａｂ）が分析物に対して特異
的であるＥＤ／特異的結合分子接合体の形で存在する。
十分な相補性活性がＥＤ−Ａｂ接合体のために存続する
ことが見出された（前記接合体の略語は、種々のタイプ
の結合分子を含む本発明のすべての可能性ある複合体を
示すために使用される）。このＥＤ−Ａｂ相補性活性
は、測定されるべき大きな分析物により結合される場
合、有意に影響される。一般的に、Ａｂ−ＥＤ接合体の
Ａｂ−ＥＤ接合体の相補性活性は、分析物により結合さ
れるＥＤ−Ａｂ接合体の量に比例して低下する。従っ
て、高分子量分析物の存在及び量を決定することが可能
である。これは、相補性活性性を減じるために小さな分
析物−ＥＤ接合体に結合する競争抗体による従来のアッ
セイと対照をなす。
び受容体フラグメントを新規アッセイ型に使用すること
によって、そのような方法及び試薬を提供する。特に、
サンプルにおける高分子量分析物の存在又は量は、β−
ガラクトシダーゼの相補性フラグメントを用いることに
よって決定され、ここで前記フラグメントは、酵素ドナ
ー（ＥＤ）及び酵素受容体（ＥＡ）として定義され、そ
して結合され、すなわち一緒にされる場合、活性β−ガ
ラクトシダーゼを形成し、ここで前記ＥＤフラグメント
は、結合分子、特に抗体（Ａｂ）が分析物に対して特異
的であるＥＤ／特異的結合分子接合体の形で存在する。
十分な相補性活性がＥＤ−Ａｂ接合体のために存続する
ことが見出された（前記接合体の略語は、種々のタイプ
の結合分子を含む本発明のすべての可能性ある複合体を
示すために使用される）。このＥＤ−Ａｂ相補性活性
は、測定されるべき大きな分析物により結合される場
合、有意に影響される。一般的に、Ａｂ−ＥＤ接合体の
Ａｂ−ＥＤ接合体の相補性活性は、分析物により結合さ
れるＥＤ−Ａｂ接合体の量に比例して低下する。従っ
て、高分子量分析物の存在及び量を決定することが可能
である。これは、相補性活性性を減じるために小さな分
析物−ＥＤ接合体に結合する競争抗体による従来のアッ
セイと対照をなす。
【００１０】得られた酵素活性は、種々の広く知られた
方法で、たとえばβ−ガラクトシダーゼとの反応に基づ
いて測定可能な生成物を供給する酵素基質を用いること
によって検出され又は測定され得る。それによって、サ
ンプル中に存在する分析物の量は、既知量の分析物を含
む一連のサンプルを用いる場合に形成される量と測定可
能な生成物の量とを比較することによって決定され得
る。
方法で、たとえばβ−ガラクトシダーゼとの反応に基づ
いて測定可能な生成物を供給する酵素基質を用いること
によって検出され又は測定され得る。それによって、サ
ンプル中に存在する分析物の量は、既知量の分析物を含
む一連のサンプルを用いる場合に形成される量と測定可
能な生成物の量とを比較することによって決定され得
る。
【００１１】特定の態様の記載 本発明は、サンプル中の高分子量分析物の量を検出し、
そして定量化するための方法及び試薬を含んで成る。そ
の方法は、β−ガラクトシダーゼを包含する標準の相補
性アッセイに基づく変法であり、ここでβ−ガラクトシ
ダーゼの不活性フラグメントが活性β−ガラクトシダー
ゼを形成するために溶液で結合される。フラグメント
は、それぞれβ−ガラクトシダーゼ分子の小さな及び大
きなフラグメントを示すために、本明細書においては、
酵素−ドナー（ＥＤ）及び酵素受容体（ＥＡ）フラグメ
ントとして言及される。
そして定量化するための方法及び試薬を含んで成る。そ
の方法は、β−ガラクトシダーゼを包含する標準の相補
性アッセイに基づく変法であり、ここでβ−ガラクトシ
ダーゼの不活性フラグメントが活性β−ガラクトシダー
ゼを形成するために溶液で結合される。フラグメント
は、それぞれβ−ガラクトシダーゼ分子の小さな及び大
きなフラグメントを示すために、本明細書においては、
酵素−ドナー（ＥＤ）及び酵素受容体（ＥＡ）フラグメ
ントとして言及される。
【００１２】特に、本発明は、相補性活性が（１）抗体
又はβ−ガラクトシダーゼの酵素ドナーフラグメントに
結合される他の結合成分と（２）分析物との間の結合の
存在及び不在において異なるように、高分子量（好まし
くは多価の抗原決定基を有する）を有する分析物の存在
を検出するための方法を提供する。酵素相補性の割合
は、多価分析物の場合、占領されていない結合部位に結
合することによって親分析物の大きさを効果的に高める
過剰のラベルされていない結合成分の付加によりさらに
減じられる。
又はβ−ガラクトシダーゼの酵素ドナーフラグメントに
結合される他の結合成分と（２）分析物との間の結合の
存在及び不在において異なるように、高分子量（好まし
くは多価の抗原決定基を有する）を有する分析物の存在
を検出するための方法を提供する。酵素相補性の割合
は、多価分析物の場合、占領されていない結合部位に結
合することによって親分析物の大きさを効果的に高める
過剰のラベルされていない結合成分の付加によりさらに
減じられる。
【００１３】一般的に、本発明の方法は、 （ａ）分析物特異的結合成分に結合されるＥＤを含んで
成るＥＤ複合体を供給し、ここで前記ＥＤ複合体は、活
性β−ガラクトシダーゼがＥＡの存在下で形成されるよ
うに測定可能な相補性活性を保持し； （ｂ）前記分析物特異的結合成分と特異的に反応する高
分子量分析物を含むと思われるサンプルの存在下で前記
ＥＤ複合体及びＥＡ（並びに多価分析物を用いる好まし
い態様においては、過剰のラベルされていない結合成
分）を接触せしめ；そして （ｃ）前記サンプルにおける分析物の存在を活性β−ガ
ラクトシダーゼ酵素の形成に関連づけることを含んで成
る。
成るＥＤ複合体を供給し、ここで前記ＥＤ複合体は、活
性β−ガラクトシダーゼがＥＡの存在下で形成されるよ
うに測定可能な相補性活性を保持し； （ｂ）前記分析物特異的結合成分と特異的に反応する高
分子量分析物を含むと思われるサンプルの存在下で前記
ＥＤ複合体及びＥＡ（並びに多価分析物を用いる好まし
い態様においては、過剰のラベルされていない結合成
分）を接触せしめ；そして （ｃ）前記サンプルにおける分析物の存在を活性β−ガ
ラクトシダーゼ酵素の形成に関連づけることを含んで成
る。
【００１４】本発明は、ＥＤ／結合成分複合体及びＥＡ
が、ＥＤ／結合成分／高分子量分析物の三重複合体とＥ
Ａとの組合せよりも種々の割合で活性酵素を形成する原
理に基づくことが少なくとも一部予測される。少量の分
析物が存在する場合、たった一部のＥＤ−Ａｂ接合体が
分析物に結合でき、そして従って、多くのＥＤ−Ａｂ接
合体がＥＡとの相補性のために利用できる。それと反対
に、多量の分析物が存在する場合、少ないＥＤ−Ａｂ接
合体がＥＡとの相補性のために利用でき、そして従っ
て、低い酵素活性が観察される。両者の場合、多価の抗
原決定基が、ＥＤ−結合成分接合体およひ複数部位で結
合するラベルされていない抗−分析物抗体の同時複合体
化を可能にするた。ラベルされていない抗体は、未結合
部位を占領し、そして酵素相補性阻害をより効果的にす
る。ＥＤ−Ａｂ接合体、分析物及びラベルされていない
抗体から成る三重複合体の大きさは、ＥＤ分子当たりひ
じょうに大きくなり、そして従って、低い相補性が観察
される。従って、分析物の量は、酵素基質の使用を通し
てのようにいづれか適切な態様で測定され得る酵素活性
に反比例する。
が、ＥＤ／結合成分／高分子量分析物の三重複合体とＥ
Ａとの組合せよりも種々の割合で活性酵素を形成する原
理に基づくことが少なくとも一部予測される。少量の分
析物が存在する場合、たった一部のＥＤ−Ａｂ接合体が
分析物に結合でき、そして従って、多くのＥＤ−Ａｂ接
合体がＥＡとの相補性のために利用できる。それと反対
に、多量の分析物が存在する場合、少ないＥＤ−Ａｂ接
合体がＥＡとの相補性のために利用でき、そして従っ
て、低い酵素活性が観察される。両者の場合、多価の抗
原決定基が、ＥＤ−結合成分接合体およひ複数部位で結
合するラベルされていない抗−分析物抗体の同時複合体
化を可能にするた。ラベルされていない抗体は、未結合
部位を占領し、そして酵素相補性阻害をより効果的にす
る。ＥＤ−Ａｂ接合体、分析物及びラベルされていない
抗体から成る三重複合体の大きさは、ＥＤ分子当たりひ
じょうに大きくなり、そして従って、低い相補性が観察
される。従って、分析物の量は、酵素基質の使用を通し
てのようにいづれか適切な態様で測定され得る酵素活性
に反比例する。
【００１５】従って、本発明の方法は、サンプル中の分
析物の量が既知量の分析物の存在下で形成される量に測
定可能な生成物の量を比較することによって決定され得
るように、補足されたβ−ガラクトシダーゼとの反応に
基づいて測定可能な生成物を供給する酵素基質と接触せ
しめられる、ＥＤ−Ａｂ複合体、ＥＡ、ラベルされてい
ない抗体及びサンプルをさらに企画する。本発明はま
た、本発明の方法を実施するために使用されるキット並
びに本発明の方法に使用される個々の試薬も企画する。
析物の量が既知量の分析物の存在下で形成される量に測
定可能な生成物の量を比較することによって決定され得
るように、補足されたβ−ガラクトシダーゼとの反応に
基づいて測定可能な生成物を供給する酵素基質と接触せ
しめられる、ＥＤ−Ａｂ複合体、ＥＡ、ラベルされてい
ない抗体及びサンプルをさらに企画する。本発明はま
た、本発明の方法を実施するために使用されるキット並
びに本発明の方法に使用される個々の試薬も企画する。
【００１６】分析物の不在下でＥＡにより相補化するた
めの本発明のＥＤ−Ａｂ複合体の能力は、ＥＤ及びＥＡ
接合体を用いる多くのこれまで記載されたアッセイに観
察されるβ−ガラクトシダーゼ相補性現象と著しく異な
る。たとえば、アメリカ特許第４，７０８，９２９号に
記載されるアッセイにおいては、小さな分析物に接合さ
れるＥＤは、抗−分析物抗体の不在下でＥＡに相補的で
ある。抗−分析物抗体がアッセイ混合物に存在する場
合、相補性活性は、抗体の不在下で初期活性に比べて、
有意に低下する。未知のサンプルに存在する分析物の存
在において、競争が、制限された量の結合部位のため
に、ＥＤ−ラベルされた分析物とサンプルに存在する分
析物との間で生じる。従って、多くの分析物の存在は、
多くの抗体を拘束し、そして従って、多くのＥＤ−分析
物のＥＡによる相補を可能にする。従って、相補性化さ
れた酵素活性は、サンプルにおける分析物の量に直接的
に比例する。この競争アッセイ方法は、小さな分子と共
にのみ十分に作用する。対照的に、本発明は非競争性イ
ムノアッセイである。ＥＤ−結合成分接合体は、前記方
法におけるＥＤ−ハプテン接合体に比較して使用され
る。さらに、本発明の方法は、直接的なアッセイを可能
にし、ここで測定されるべき分析物は、酵素相補性の割
合を阻害するために使用される。さらに、本発明のアッ
セイ原理は、好ましくは多価抗原決定基を有する高分子
量分析物により十分に作用する。
めの本発明のＥＤ−Ａｂ複合体の能力は、ＥＤ及びＥＡ
接合体を用いる多くのこれまで記載されたアッセイに観
察されるβ−ガラクトシダーゼ相補性現象と著しく異な
る。たとえば、アメリカ特許第４，７０８，９２９号に
記載されるアッセイにおいては、小さな分析物に接合さ
れるＥＤは、抗−分析物抗体の不在下でＥＡに相補的で
ある。抗−分析物抗体がアッセイ混合物に存在する場
合、相補性活性は、抗体の不在下で初期活性に比べて、
有意に低下する。未知のサンプルに存在する分析物の存
在において、競争が、制限された量の結合部位のため
に、ＥＤ−ラベルされた分析物とサンプルに存在する分
析物との間で生じる。従って、多くの分析物の存在は、
多くの抗体を拘束し、そして従って、多くのＥＤ−分析
物のＥＡによる相補を可能にする。従って、相補性化さ
れた酵素活性は、サンプルにおける分析物の量に直接的
に比例する。この競争アッセイ方法は、小さな分子と共
にのみ十分に作用する。対照的に、本発明は非競争性イ
ムノアッセイである。ＥＤ−結合成分接合体は、前記方
法におけるＥＤ−ハプテン接合体に比較して使用され
る。さらに、本発明の方法は、直接的なアッセイを可能
にし、ここで測定されるべき分析物は、酵素相補性の割
合を阻害するために使用される。さらに、本発明のアッ
セイ原理は、好ましくは多価抗原決定基を有する高分子
量分析物により十分に作用する。
【００１７】従来の教授の結果と本発明の結果との差異
は、結合成分に対して、分析物／ＥＤ−Ａｂ／ラベルさ
れていないＡｂ複合体の大きなサイズに起因すると思わ
れる。本発明のアッセイを用いることによれば、分析物
がひじょうに大きい場合にのみ、相補性割合の差異を維
持することがまた可能であろう。そのような差異は、小
さな分析物がＥＤ分子に結合され、そして相補性割合を
減じるために抗体との反応を可能にされる従来のアッセ
イについてこれまで知られている相補性割合の規模に基
づいては検出不可能であった。
は、結合成分に対して、分析物／ＥＤ−Ａｂ／ラベルさ
れていないＡｂ複合体の大きなサイズに起因すると思わ
れる。本発明のアッセイを用いることによれば、分析物
がひじょうに大きい場合にのみ、相補性割合の差異を維
持することがまた可能であろう。そのような差異は、小
さな分析物がＥＤ分子に結合され、そして相補性割合を
減じるために抗体との反応を可能にされる従来のアッセ
イについてこれまで知られている相補性割合の規模に基
づいては検出不可能であった。
【００１８】本発明のＥＤ及びＥＡ成分は、β−ガラク
トシダーゼの一部の配列である。本発明の目的のために
は、β−ガラクトシダーゼ分子の短い部分が酵素ドナー
（ＥＤ）として言及され、そして長い部分が酵素受容体
（ＥＡ）として言及される。それらの酵素受容体及び酵
素ドナーは、一緒にされる場合、活性酵素複合体を形成
することによって特徴づけられる。β−ガラクトシダー
ゼ酵素ドナー及び受容体の調製は、アメリカ特許第４，
７０８，９２９号（引用により本発明に導入される）に
記載される。
トシダーゼの一部の配列である。本発明の目的のために
は、β−ガラクトシダーゼ分子の短い部分が酵素ドナー
（ＥＤ）として言及され、そして長い部分が酵素受容体
（ＥＡ）として言及される。それらの酵素受容体及び酵
素ドナーは、一緒にされる場合、活性酵素複合体を形成
することによって特徴づけられる。β−ガラクトシダー
ゼ酵素ドナー及び受容体の調製は、アメリカ特許第４，
７０８，９２９号（引用により本発明に導入される）に
記載される。
【００１９】他の分子にタンパク質を結合するためのい
づれかのこれまで記載された方法が、結合成分にＥＤ成
分を結合するために使用され得る。それ自体タンパク質
性である、ＥＤフラグメントにタンパク質性結合成分を
結合するためには、二官能価有機結合基の使用が特に好
ましい。タンパク質化学において良く知られているその
うよな結合基の例は、特定の文献（たとえば、J.Immuno
ussay, 1983, 4：209)に記載されているように、ジアル
デヒド、たとえばグルタルアルデヒド、及びジアミン、
たとえば１，６−ジアミノヘキサンを包含する。
づれかのこれまで記載された方法が、結合成分にＥＤ成
分を結合するために使用され得る。それ自体タンパク質
性である、ＥＤフラグメントにタンパク質性結合成分を
結合するためには、二官能価有機結合基の使用が特に好
ましい。タンパク質化学において良く知られているその
うよな結合基の例は、特定の文献（たとえば、J.Immuno
ussay, 1983, 4：209)に記載されているように、ジアル
デヒド、たとえばグルタルアルデヒド、及びジアミン、
たとえば１，６−ジアミノヘキサンを包含する。
【００２０】結合成分は、対象の特定分析物に結合する
ことができる成分である。結合成分と分析物との間の結
合は、好ましくは非共有性である。適切な結合分子は好
ましくは、分析されるサンプルにおいて、他の成分に対
してよりも分析物に対して高い親和性及び特異性を有す
る。適切な結合成分は、種々の分子カテゴリーのもの、
たとえば分析物の一部に対して特異的な抗体（好ましく
はモノクローナル抗体）；分析物に天然において結合す
る結合タンパク質、たとえば炭水化物部分を含んで成る
分析物に対するレクチン；及び分析物が相補的リガンド
を含んで成る場合のリガンド受容体、たとえばタンパク
質性ホルモンに対して特異的な細胞表面受容体を包含す
る。
ことができる成分である。結合成分と分析物との間の結
合は、好ましくは非共有性である。適切な結合分子は好
ましくは、分析されるサンプルにおいて、他の成分に対
してよりも分析物に対して高い親和性及び特異性を有す
る。適切な結合成分は、種々の分子カテゴリーのもの、
たとえば分析物の一部に対して特異的な抗体（好ましく
はモノクローナル抗体）；分析物に天然において結合す
る結合タンパク質、たとえば炭水化物部分を含んで成る
分析物に対するレクチン；及び分析物が相補的リガンド
を含んで成る場合のリガンド受容体、たとえばタンパク
質性ホルモンに対して特異的な細胞表面受容体を包含す
る。
【００２１】分析物が核酸である場合、結合成分は、ｓ
ｓＤＮＡ，ＲＮＡ又はいづれか他の天然の又は合成され
た一本鎖核酸であり得る。他方、結合成分は、特定のヌ
クレオチド配列を認識する非核酸分子、たとえば抗体又
は特定のＤＮＡ結合タンパク質であり得る。
ｓＤＮＡ，ＲＮＡ又はいづれか他の天然の又は合成され
た一本鎖核酸であり得る。他方、結合成分は、特定のヌ
クレオチド配列を認識する非核酸分子、たとえば抗体又
は特定のＤＮＡ結合タンパク質であり得る。
【００２２】本発明に使用される抗体又はモノクローナ
ル抗体の生成方法は文献において知られている。たとえ
ばアメリカ特許第４，５７４，１１６号及びそれに引用
される引例（これらは引用により本明細書に組込まれ
る）を参照のこと。他方、モノクローナル抗体又は結合
フラグメントは市販されている。
ル抗体の生成方法は文献において知られている。たとえ
ばアメリカ特許第４，５７４，１１６号及びそれに引用
される引例（これらは引用により本明細書に組込まれ
る）を参照のこと。他方、モノクローナル抗体又は結合
フラグメントは市販されている。
【００２３】結合成分が核酸分子である場合、その成分
は、通常少なくとも１２個のヌクレオチド、より通常に
は少なくとも１４個のヌクレオチド及び好ましくは少な
くとも約１８個のヌクレオチドを含んで成る。結合成分
の大きさは、分析物の性質、サンプル中の分析物の量及
び検出方法に使用される条件により変化するであろう。
結合成分に使用するための核酸配列は、天然源、合成か
ら又は当業界において知られている他の手段による単離
により供給され得る。
は、通常少なくとも１２個のヌクレオチド、より通常に
は少なくとも１４個のヌクレオチド及び好ましくは少な
くとも約１８個のヌクレオチドを含んで成る。結合成分
の大きさは、分析物の性質、サンプル中の分析物の量及
び検出方法に使用される条件により変化するであろう。
結合成分に使用するための核酸配列は、天然源、合成か
ら又は当業界において知られている他の手段による単離
により供給され得る。
【００２４】特異的結合相互反応は、サンプル中の他の
成分から分析物を区別することができるように分析物と
結合成分との間で生じるべきである。特異的結合相互反
応とは、アッセイが、サンプル中に通常存在する他の成
分の存在下で分析物の存在を検出できることを意味す
る。典型的には、分析物のための結合成分は、サンプル
中の他の成分にではなく、分析物にのみ結合する。
成分から分析物を区別することができるように分析物と
結合成分との間で生じるべきである。特異的結合相互反
応とは、アッセイが、サンプル中に通常存在する他の成
分の存在下で分析物の存在を検出できることを意味す
る。典型的には、分析物のための結合成分は、サンプル
中の他の成分にではなく、分析物にのみ結合する。
【００２５】本発明のアッセイ方法は、ＥＤ−Ａｂ複合
体に結合される場合、相補性の測定できる差異（分析物
の不在下で相補性活性に対して）を引き起こすように十
分に大きく、又は多価の抗原部位を有するいづれかの分
析物を検出するために使用され得る。一般的に、分析物
は、ポリペプチド、タンパク質、ウィルス粒子、多糖、
核酸、脂質又はそれらの組合せ、たとえば糖タンパク質
又はリポタンパク質であろう。
体に結合される場合、相補性の測定できる差異（分析物
の不在下で相補性活性に対して）を引き起こすように十
分に大きく、又は多価の抗原部位を有するいづれかの分
析物を検出するために使用され得る。一般的に、分析物
は、ポリペプチド、タンパク質、ウィルス粒子、多糖、
核酸、脂質又はそれらの組合せ、たとえば糖タンパク質
又はリポタンパク質であろう。
【００２６】分析物の分子量は、通常少なくとも約１
０，０００、より通常とは少なくとも約２０，０００で
あろう。対照のポリペプチドは、一般的に約１０，００
０〜約３×１０6 の分子量、より通常には約２０，００
０〜２×１０6 の分子量のものであろう。分析物が核酸
分子である場合、その分子は一般的に約１２個のヌクレ
オチド〜約２×１０6 個のヌクレオチドの範囲であろ
う。核酸サンプルは、染色体又は染色体外ＤＮＡ、たと
えばプラスミド、ウィルス、合成構造体又は同様のも
の；又はＲＮＡ、たとえばｍＲＮＡ、トランスファーＲ
ＮＡ、リボソームＲＮＡ、ウィルス又は同様のものを包
含する。核酸配列は、翻訳された領域、調節領域、イン
トロン、エキソン及び同様のもの上に構造遺伝子を包含
する。
０，０００、より通常とは少なくとも約２０，０００で
あろう。対照のポリペプチドは、一般的に約１０，００
０〜約３×１０6 の分子量、より通常には約２０，００
０〜２×１０6 の分子量のものであろう。分析物が核酸
分子である場合、その分子は一般的に約１２個のヌクレ
オチド〜約２×１０6 個のヌクレオチドの範囲であろ
う。核酸サンプルは、染色体又は染色体外ＤＮＡ、たと
えばプラスミド、ウィルス、合成構造体又は同様のも
の；又はＲＮＡ、たとえばｍＲＮＡ、トランスファーＲ
ＮＡ、リボソームＲＮＡ、ウィルス又は同様のものを包
含する。核酸配列は、翻訳された領域、調節領域、イン
トロン、エキソン及び同様のもの上に構造遺伝子を包含
する。
【００２７】アッセイのための手段は、使用されるシス
テム、アッセイの感度、アッセイが行なわれる速度、分
析物の性質及び同様のものに依存して広く異なる。Ｅ
Ａ，ＥＤ複合体、ラベルされていない抗体（多価分析物
が詳細される場合）、及びサンプルが、結合を可能にす
る厳重な条件下で一緒に組合される。試薬は、付随的に
組合され、又は連続的に添加され得る。順序が連続的で
ある場合、サンプル、ＥＤ複合体及び緩衝液の反応混合
物が好ましくは、約５〜２５分、通常約１０分間インキ
ュベートされ、その後、ＥＡ、ラベルされていない抗体
及び酵素基質が添加される。
テム、アッセイの感度、アッセイが行なわれる速度、分
析物の性質及び同様のものに依存して広く異なる。Ｅ
Ａ，ＥＤ複合体、ラベルされていない抗体（多価分析物
が詳細される場合）、及びサンプルが、結合を可能にす
る厳重な条件下で一緒に組合される。試薬は、付随的に
組合され、又は連続的に添加され得る。順序が連続的で
ある場合、サンプル、ＥＤ複合体及び緩衝液の反応混合
物が好ましくは、約５〜２５分、通常約１０分間インキ
ュベートされ、その後、ＥＡ、ラベルされていない抗体
及び酵素基質が添加される。
【００２８】サンプルは、従来の処理にゆだねられ得、
又は従来の処理を伴わないで使用され得る。サンプル中
の分析物が結合成分と結合することができる情況下にお
いては、従来のサンプル調製は一般的に必要でない。サ
ンプル中の分析物が結合成分とすぐに結合できない情況
下においては、従来のサンプル調製が必要であろう。た
とえば、分析物が二本鎖核酸であり、として結合成分が
相補的な核酸鎖である場合、ＥＤ複合体と混合する前、
二本鎖分子を変性するためにサンプルを処理する必要が
あろう。変性は、サンプルを高温、一般的に約９０℃〜
約１００℃の温度に約３〜約１５分間ゆだねることによ
って最っとも容易に達成され得る。変性のための他の手
段、たとえばアルカリ溶液又はホルムアミドの濃溶液に
より又は当業界において知られている他の方法の使用に
よりサンプルを処理する手段が利用され得る。
又は従来の処理を伴わないで使用され得る。サンプル中
の分析物が結合成分と結合することができる情況下にお
いては、従来のサンプル調製は一般的に必要でない。サ
ンプル中の分析物が結合成分とすぐに結合できない情況
下においては、従来のサンプル調製が必要であろう。た
とえば、分析物が二本鎖核酸であり、として結合成分が
相補的な核酸鎖である場合、ＥＤ複合体と混合する前、
二本鎖分子を変性するためにサンプルを処理する必要が
あろう。変性は、サンプルを高温、一般的に約９０℃〜
約１００℃の温度に約３〜約１５分間ゆだねることによ
って最っとも容易に達成され得る。変性のための他の手
段、たとえばアルカリ溶液又はホルムアミドの濃溶液に
より又は当業界において知られている他の方法の使用に
よりサンプルを処理する手段が利用され得る。
【００２９】アッセイ媒体は、タンパク質性結合成分を
用いる場合、便利な緩衝液、たとえばホスフェート、ト
リス又は同様のものを用いて、約６〜９の範囲のpHで緩
衝化される。適切な緩衝液を選択することにおける有意
な要因は、緩衝液がβ−ガラクトシダーゼ酵素反応、活
性β−ガラクトシダーゼを形成するためのＥＡ及びＥＤ
の相補性及び分析物への結合成分の結合を阻害しないこ
とである。診断アッセイ、たとえば本発明のアッセイに
使用するための緩衝液の選択は従来通りである。相補性
アッセイにこれまで使用されて来た緩衝液が、本発明の
方法に使用され得る。
用いる場合、便利な緩衝液、たとえばホスフェート、ト
リス又は同様のものを用いて、約６〜９の範囲のpHで緩
衝化される。適切な緩衝液を選択することにおける有意
な要因は、緩衝液がβ−ガラクトシダーゼ酵素反応、活
性β−ガラクトシダーゼを形成するためのＥＡ及びＥＤ
の相補性及び分析物への結合成分の結合を阻害しないこ
とである。診断アッセイ、たとえば本発明のアッセイに
使用するための緩衝液の選択は従来通りである。相補性
アッセイにこれまで使用されて来た緩衝液が、本発明の
方法に使用され得る。
【００３０】アッセイは、所望する反応を阻害しないい
づれか適切な温度、一般的に室温（典型的には少なくと
も約２０℃である）から好ましくは約４０℃以下の高温
で行なわれ得る。そのアッセイは一般的に及び好ましく
は、大気圧下で行なわれる。
づれか適切な温度、一般的に室温（典型的には少なくと
も約２０℃である）から好ましくは約４０℃以下の高温
で行なわれ得る。そのアッセイは一般的に及び好ましく
は、大気圧下で行なわれる。
【００３１】所望する反応の完結のために必要とされる
時間は、アッセイの特徴に依存して異なる。たとえば結
合成分が核酸である情況においては、ハイブリダイゼー
ション又は結合のために必要とされる時間は、核酸プロ
ーブの濃度及び配列複雑性並びにアッセイ温度、溶媒及
び塩濃度に依存する。一般的に、ハイブリダイゼーショ
ンは、約０．１５Ｍの塩化ナトリウム及び０．０１５Ｍ
のクエン酸ナトリウム中において約２０℃〜約５０℃の
温度で約３０分間行なわれる。
時間は、アッセイの特徴に依存して異なる。たとえば結
合成分が核酸である情況においては、ハイブリダイゼー
ション又は結合のために必要とされる時間は、核酸プロ
ーブの濃度及び配列複雑性並びにアッセイ温度、溶媒及
び塩濃度に依存する。一般的に、ハイブリダイゼーショ
ンは、約０．１５Ｍの塩化ナトリウム及び０．０１５Ｍ
のクエン酸ナトリウム中において約２０℃〜約５０℃の
温度で約３０分間行なわれる。
【００３２】ＤＮＡのハイブリダイゼーションのための
技法は、多くの文献、たとえばWalker and Gaastra（出
版者）Techniques in Molecular Biology (1983)MacMil
lanPublishing Company, New York, 113 〜135 及び273
〜283 ページ；Maniatisなど.,（出版者）Molecular C
lonny(1982) Cold Spring Harbor Laboratory, 309ペー
ジ；E.Southern, J.Mol.Biol.(1975) 98：503; Botchan
など., Cell (1976)9 ：269 ；Jeftreysなど., Cell (1
977)12：429 に開示される。これらの開示は、引用によ
り本明細書に組込まれる。
技法は、多くの文献、たとえばWalker and Gaastra（出
版者）Techniques in Molecular Biology (1983)MacMil
lanPublishing Company, New York, 113 〜135 及び273
〜283 ページ；Maniatisなど.,（出版者）Molecular C
lonny(1982) Cold Spring Harbor Laboratory, 309ペー
ジ；E.Southern, J.Mol.Biol.(1975) 98：503; Botchan
など., Cell (1976)9 ：269 ；Jeftreysなど., Cell (1
977)12：429 に開示される。これらの開示は、引用によ
り本明細書に組込まれる。
【００３３】本発明に使用されるサンプルの量は、多く
の中から、分析物の濃度、サンプルの性質及びアッセイ
の感度に依存する。
の中から、分析物の濃度、サンプルの性質及びアッセイ
の感度に依存する。
【００３４】本発明においては、いづれか適切な手段
が、活性酵素の量を検出し、そして定量化し、そしてサ
ンプル中に存在する分析物の量の検出及び決定にその情
報を関連づけるために使用され得る。酵素基質は、一般
的に及び好ましくは、活性β−ガラクトシダーゼ酵素と
の反応に基づいて測定可能な生成物を供給することによ
ってそのような目的のために使用される。次に、サンプ
ル中の分析物の量が、既知量の分析物の存在下で形成さ
れる量と測定可能な生成物の量とを比較することによっ
て決定され得る。
が、活性酵素の量を検出し、そして定量化し、そしてサ
ンプル中に存在する分析物の量の検出及び決定にその情
報を関連づけるために使用され得る。酵素基質は、一般
的に及び好ましくは、活性β−ガラクトシダーゼ酵素と
の反応に基づいて測定可能な生成物を供給することによ
ってそのような目的のために使用される。次に、サンプ
ル中の分析物の量が、既知量の分析物の存在下で形成さ
れる量と測定可能な生成物の量とを比較することによっ
て決定され得る。
【００３５】典型的に及び好ましくは使用される酵素基
質は、活性酵素により切断される場合、アッセイ媒体の
吸光度（光学濃度）又は発光の量の変化をもたらす。す
なわち、基質の分解は、着色された又は蛍光生成物の出
現又は消出をもたらす、好ましい酵素基質は、ｏ−ニト
ロフェニルガラクトシド（ＯＮＰＧ）及びクロロフェノ
ールレッド−β−ガラクトシド（ＣＰＲＧ）を包含す
る。ＯＮＰＧ，ＣＰＲＧ及び他の相当の酵素基質は市販
されている。ＯＮＰＧは一般的に、約０．５〜約２．０
mg／mlの濃度で使用される。他の基質は、ＯＮＰＧに比
較できるシグナルを供給するような濃度で使用される。
質は、活性酵素により切断される場合、アッセイ媒体の
吸光度（光学濃度）又は発光の量の変化をもたらす。す
なわち、基質の分解は、着色された又は蛍光生成物の出
現又は消出をもたらす、好ましい酵素基質は、ｏ−ニト
ロフェニルガラクトシド（ＯＮＰＧ）及びクロロフェノ
ールレッド−β−ガラクトシド（ＣＰＲＧ）を包含す
る。ＯＮＰＧ，ＣＰＲＧ及び他の相当の酵素基質は市販
されている。ＯＮＰＧは一般的に、約０．５〜約２．０
mg／mlの濃度で使用される。他の基質は、ＯＮＰＧに比
較できるシグナルを供給するような濃度で使用される。
【００３６】ＥＤ−Ａｂ複合体及びＥＡが酵素基質と共
に適切なアッセイ媒体において組合され、続いてサンプ
ルの添加が行なわれる場合、第１回目の読み取りは、酵
素活性のバックグラウンド測定を供給するために行なわ
れ得る。このバックグラウンド活性の不可欠な必要条件
は、それが分析物の検出可能限界の存在下で活性から区
別され得ることである。
に適切なアッセイ媒体において組合され、続いてサンプ
ルの添加が行なわれる場合、第１回目の読み取りは、酵
素活性のバックグラウンド測定を供給するために行なわ
れ得る。このバックグラウンド活性の不可欠な必要条件
は、それが分析物の検出可能限界の存在下で活性から区
別され得ることである。
【００３７】サンプルの添加の後、１又は複数の追加の
読み取りが、インキュベーションの後に取られ、その間
隔はその読み取りの間、約１分〜約１時間、通常約５分
〜約１５分である。一回の読み取りが行なわれ得るが、
通常の誤差を回避するために複数回の読み取りが所望さ
れる。好ましくは、対照溶液は、サンプルとの比較のた
めに対照として作用するように分析物の既知濃度から調
製される。この場合、正確な定量決定が得られる。
読み取りが、インキュベーションの後に取られ、その間
隔はその読み取りの間、約１分〜約１時間、通常約５分
〜約１５分である。一回の読み取りが行なわれ得るが、
通常の誤差を回避するために複数回の読み取りが所望さ
れる。好ましくは、対照溶液は、サンプルとの比較のた
めに対照として作用するように分析物の既知濃度から調
製される。この場合、正確な定量決定が得られる。
【００３８】本発明はまた、本発明の方法を実施するた
めの試薬を含むキットにも向けられる。キットは、少な
くとも１つの容器、通常別々の容器に、本発明のβ−ガ
ラクトシダーゼ酵素ドナー複合体、酵素受容体及び（好
ましい態様においては）ラベルされていない抗−分析物
抗体を含んで成る。酵素ドナー複合体及び酵素受容体の
容器はさらに、酵素基質を含むことができ、又は酵素基
質は別々に供給され得る。他方、キットは、それらが結
合成分を伴わないで結合基又は結合基の前駆体に結合さ
れるＥＤを含むように構成され得る。キットのＥＤ結合
要素への特定の結合成分の結合に基づいて、対象の所望
する分析物がアッセイされ得る。そのような場合、結合
要素は、末端使用者により供給される結合成分に容易に
結合するように反応性官能基により末端化され得る。次
の２つの例は、例示的であって、本発明を制限するもの
ではない。
めの試薬を含むキットにも向けられる。キットは、少な
くとも１つの容器、通常別々の容器に、本発明のβ−ガ
ラクトシダーゼ酵素ドナー複合体、酵素受容体及び（好
ましい態様においては）ラベルされていない抗−分析物
抗体を含んで成る。酵素ドナー複合体及び酵素受容体の
容器はさらに、酵素基質を含むことができ、又は酵素基
質は別々に供給され得る。他方、キットは、それらが結
合成分を伴わないで結合基又は結合基の前駆体に結合さ
れるＥＤを含むように構成され得る。キットのＥＤ結合
要素への特定の結合成分の結合に基づいて、対象の所望
する分析物がアッセイされ得る。そのような場合、結合
要素は、末端使用者により供給される結合成分に容易に
結合するように反応性官能基により末端化され得る。次
の２つの例は、例示的であって、本発明を制限するもの
ではない。
【００３９】
【実施例】例１ アッセイ原理 このアッセイにおいて、４８０，０００の分子量を有す
るフェリチン分子は、フェリチンに対して特異的な抗体
が酵素受容体（ＥＡ）分子と相補性をなすために結合さ
れている酵素ドナー（ＥＤ）分子の活性β−ガラクトシ
ダーゼを形成する能力を阻害した。阻害の量は、フェリ
チンの濃度に比例した。換言すれば、β−ガラクトシダ
ーゼと基質との反応に起因する色の形成により測定され
るように、フェリンの濃度が高くなるほど、アッセイ媒
体中のβ−ガラクトシダーゼの活性は低くなる。
るフェリチン分子は、フェリチンに対して特異的な抗体
が酵素受容体（ＥＡ）分子と相補性をなすために結合さ
れている酵素ドナー（ＥＤ）分子の活性β−ガラクトシ
ダーゼを形成する能力を阻害した。阻害の量は、フェリ
チンの濃度に比例した。換言すれば、β−ガラクトシダ
ーゼと基質との反応に起因する色の形成により測定され
るように、フェリンの濃度が高くなるほど、アッセイ媒
体中のβ−ガラクトシダーゼの活性は低くなる。
【００４０】フェリチンの測定のための均質アッセイに
おいては、フェリチンを含むサンプルを、ＥＤ−Ａｂ接
合体と共に３７℃で５〜１０分間インキュベートした。
ＥＤ−Ａｂ接合体は、架橋剤を用いて、ＥＤと抗体との
間で共有結合された複合体であった。インキュベーショ
ンの後、フェリチンに対する抗体及び第２抗体の抗体複
合体を含む第１試薬（Ｒ１として命名される）を添加
し、そして５〜１０分間インキュベートした。Ｒ１試薬
はまた、β−ガラクトシダーゼのための基質も含んだ。
次に、ＥＡを含む第２試薬（Ｒ２として命名される）を
アッセイ混合物に添加し、そして加水分解された基質の
色のシグナルを、４〜１０分後、分光的に測定した。サ
ンプル中のフェリチン量を、既知濃度のフェリチンを含
む一連のサンプルのアッセイ結果から構成された検量曲
線を用いて決定した。
おいては、フェリチンを含むサンプルを、ＥＤ−Ａｂ接
合体と共に３７℃で５〜１０分間インキュベートした。
ＥＤ−Ａｂ接合体は、架橋剤を用いて、ＥＤと抗体との
間で共有結合された複合体であった。インキュベーショ
ンの後、フェリチンに対する抗体及び第２抗体の抗体複
合体を含む第１試薬（Ｒ１として命名される）を添加
し、そして５〜１０分間インキュベートした。Ｒ１試薬
はまた、β−ガラクトシダーゼのための基質も含んだ。
次に、ＥＡを含む第２試薬（Ｒ２として命名される）を
アッセイ混合物に添加し、そして加水分解された基質の
色のシグナルを、４〜１０分後、分光的に測定した。サ
ンプル中のフェリチン量を、既知濃度のフェリチンを含
む一連のサンプルのアッセイ結果から構成された検量曲
線を用いて決定した。
【００４１】材料 アフィニティーカラムクロマトグラフィーにより精製さ
れたヤギ抗−フェリチン抗体を、Bios Pacific, Inc.か
ら購入した。ヘテロ−二官能価架橋剤、すなわちｓｕｌ
ｆｏ−ＳＭＣＣを、Pierce Chemical Company から得
た。クロロフェノールレッドβ−ガラクトシド（ＣＰＲ
Ｇ）を、Boehringer Mannheim から購入した。酵素ドナ
ー及び酵素受容体（市販の相補性アッセイで使用される
ように）を、Microgenics, Inc. から得た。他の化学薬
品は、Sigma Chemical Co.から得た。
れたヤギ抗−フェリチン抗体を、Bios Pacific, Inc.か
ら購入した。ヘテロ−二官能価架橋剤、すなわちｓｕｌ
ｆｏ−ＳＭＣＣを、Pierce Chemical Company から得
た。クロロフェノールレッドβ−ガラクトシド（ＣＰＲ
Ｇ）を、Boehringer Mannheim から購入した。酵素ドナ
ー及び酵素受容体（市販の相補性アッセイで使用される
ように）を、Microgenics, Inc. から得た。他の化学薬
品は、Sigma Chemical Co.から得た。
【００４２】接合体の調製 緩衝液Ａ（５０mMのリン酸ナトリウム、pH７．４，０．
１５ＭのＮａＣｌを含む）０．５ml中、ヤギ抗−フェリ
チン抗体１mgを、緩衝液Ａ中、２０mMのｓｕｌｆｏ−Ｓ
ＭＣＣ溶液５０μｌと共に、室温で１５分間インキュベ
ートした。インキュベーションの後、その混合物を、ゲ
ル濾過カラム（ＰＤ１０，Ｐｈａｒｍａｃｉａ−ＬＫ
Ｂ）上に負荷し、そして緩衝液Ａにより溶出した。画分
を２８０nmで吸光度によりモニターし、そして抗体を含
むボイド画分をプールした。次に、緩衝液Ａ０．５ml
中、ＥＤ（ＥＤ４）１mgを前記プールされた画分に添加
し、そして室温で１時間インキュベートした。接合体を
含む混合物を、Ａｍｉｃｏｎ濃縮器を用いて２００μｌ
に濃縮した。その濃縮物をＦＰＬＣ ＳＵＰＥＲＵＳＥ
１２ゲル濾過カラム上に負荷し、そして緩衝液Ｂ〔５０
mMのリン酸ナトリウム、pH７．４，５００mMのＮａＣ
ｌ，０．０５％のＴｗｅｅｎ２０及び０．０５mMのＤＴ
Ｔ（ジチオチ−レイトール）〕により溶出した。画分
を、２８０nmでの吸光度により及び相補性活性によりモ
ニターした。抗体及び相補性活性を含む画分をプール
し、そして接合体として使用した。
１５ＭのＮａＣｌを含む）０．５ml中、ヤギ抗−フェリ
チン抗体１mgを、緩衝液Ａ中、２０mMのｓｕｌｆｏ−Ｓ
ＭＣＣ溶液５０μｌと共に、室温で１５分間インキュベ
ートした。インキュベーションの後、その混合物を、ゲ
ル濾過カラム（ＰＤ１０，Ｐｈａｒｍａｃｉａ−ＬＫ
Ｂ）上に負荷し、そして緩衝液Ａにより溶出した。画分
を２８０nmで吸光度によりモニターし、そして抗体を含
むボイド画分をプールした。次に、緩衝液Ａ０．５ml
中、ＥＤ（ＥＤ４）１mgを前記プールされた画分に添加
し、そして室温で１時間インキュベートした。接合体を
含む混合物を、Ａｍｉｃｏｎ濃縮器を用いて２００μｌ
に濃縮した。その濃縮物をＦＰＬＣ ＳＵＰＥＲＵＳＥ
１２ゲル濾過カラム上に負荷し、そして緩衝液Ｂ〔５０
mMのリン酸ナトリウム、pH７．４，５００mMのＮａＣ
ｌ，０．０５％のＴｗｅｅｎ２０及び０．０５mMのＤＴ
Ｔ（ジチオチ−レイトール）〕により溶出した。画分
を、２８０nmでの吸光度により及び相補性活性によりモ
ニターした。抗体及び相補性活性を含む画分をプール
し、そして接合体として使用した。
【００４３】アッセイ工程 工程１．アッセイを、ＣＯＢＡＳ ＢＩＯ遠心分離分析
器上で行なった。サンプル又は検量物７５μｌのアリコ
ートを、Ｃｏｂａｓ Ｂｉｏサンプルカップにおいて、
緩衝液Ｃ中、接合体７５μｌと共に３７℃で１０分間イ
ンキュベートした。緩衝液Ｃは、０．１ＭのＭＯＰＳ，
pH７．０，０．４ＭのＮａＣｌ，５０mMのＥＧＴＡ，３
mMの酢酸マグネシウム、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０，
０．０５mMのＤＴＴ，３％のエチレングリコール及び２
０mMのアジ化ナトリウムを含む。インキュベーションの
後、サンプルカップを、Ｃｏｂａｓ Ｂｉｏ上に置き、
そしてその混合物２５μｌをピペットで取り、そして緩
衝液Ｃに抗−フェリチン抗体、第２抗体及び基質（ＣＰ
ＲＧ）を含むＲ１試薬１５５μｌと共にインキュベート
し、次に３７℃で５分間インキュベートした。次に、緩
衝液ＣにＥＡを含む試薬Ｒ２ ３０μｌを添加し、そし
て３７℃でさらに５〜１０分間インキュベートした。反
応速度を、個々のサンプル及び対照溶液について５７０
nmでの吸光度を測定することによって測定した。
器上で行なった。サンプル又は検量物７５μｌのアリコ
ートを、Ｃｏｂａｓ Ｂｉｏサンプルカップにおいて、
緩衝液Ｃ中、接合体７５μｌと共に３７℃で１０分間イ
ンキュベートした。緩衝液Ｃは、０．１ＭのＭＯＰＳ，
pH７．０，０．４ＭのＮａＣｌ，５０mMのＥＧＴＡ，３
mMの酢酸マグネシウム、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０，
０．０５mMのＤＴＴ，３％のエチレングリコール及び２
０mMのアジ化ナトリウムを含む。インキュベーションの
後、サンプルカップを、Ｃｏｂａｓ Ｂｉｏ上に置き、
そしてその混合物２５μｌをピペットで取り、そして緩
衝液Ｃに抗−フェリチン抗体、第２抗体及び基質（ＣＰ
ＲＧ）を含むＲ１試薬１５５μｌと共にインキュベート
し、次に３７℃で５分間インキュベートした。次に、緩
衝液ＣにＥＡを含む試薬Ｒ２ ３０μｌを添加し、そし
て３７℃でさらに５〜１０分間インキュベートした。反
応速度を、個々のサンプル及び対照溶液について５７０
nmでの吸光度を測定することによって測定した。
【００４４】工程２．アッセイ工程２を、Ｃｏｂａｓ
ＭＩＲＡ分析器上で行なった。サンプルカップからのサ
ンプル又は検量物３０μｌ及びＲ1 試薬１００μｌを分
析用ピペットでキュベットに移し、そして３７℃で１４
分間インキュベートした。Ｒ 1 試薬は、緩衝液Ｃにおい
てＡｂ−ＥＤ接合体及び基質（ＣＰＲＧ）を含んだ。イ
ンキュベーションの後、Ｒ2 試薬７５μｌをピペットで
取り、そして３７℃で３〜７分間インキュベートした。
Ｒ2 試薬は、緩衝液ＣにおいてＥＡ、抗−フェリチン抗
体及び第２抗体を含んだ。反応速度を、個々のサンプル
及び対照溶液について５５０nmでの吸光度を測定するこ
とによって決定した。
ＭＩＲＡ分析器上で行なった。サンプルカップからのサ
ンプル又は検量物３０μｌ及びＲ1 試薬１００μｌを分
析用ピペットでキュベットに移し、そして３７℃で１４
分間インキュベートした。Ｒ 1 試薬は、緩衝液Ｃにおい
てＡｂ−ＥＤ接合体及び基質（ＣＰＲＧ）を含んだ。イ
ンキュベーションの後、Ｒ2 試薬７５μｌをピペットで
取り、そして３７℃で３〜７分間インキュベートした。
Ｒ2 試薬は、緩衝液ＣにおいてＥＡ、抗−フェリチン抗
体及び第２抗体を含んだ。反応速度を、個々のサンプル
及び対照溶液について５５０nmでの吸光度を測定するこ
とによって決定した。
【００４５】結果 検量曲線を、０〜５００ng／mlの一連の既知フェリチン
濃度を用いて構成した。検量曲線は図１（工程１）又は
図４（工程２）に示される。検量曲線は、ゼロのフェリ
チン濃度のための早い速度から５００ng／mlのフェリチ
ン濃度での遅い速度まで線状である。低い最終濃度のフ
ェリチンの検出のための高い感度の検量曲線が図２に示
される。図２又は図４の検量曲線を用いて、６ng／mlの
フェリチンの検出感度を、この均質アッセイ方法により
達成する。７２人のヒト血清におけるフェリチン濃度
を、ＦＤＡ−承認された対照方法への比較により示され
るように、本発明のアッセイにより正しく測定した。そ
の相関曲線は、図３に示される。図５に示されるよう
に、工程２はまた、４５人のヒト血清におけるフェリチ
ンを正しく測定した。この方法は、複数の段階を必要と
し、そして複雑な装置を必要とする他の方法とは異なっ
て、フェリチンについての十分に自動化され、早く且つ
正確な均質イムノアッセイを提供する。
濃度を用いて構成した。検量曲線は図１（工程１）又は
図４（工程２）に示される。検量曲線は、ゼロのフェリ
チン濃度のための早い速度から５００ng／mlのフェリチ
ン濃度での遅い速度まで線状である。低い最終濃度のフ
ェリチンの検出のための高い感度の検量曲線が図２に示
される。図２又は図４の検量曲線を用いて、６ng／mlの
フェリチンの検出感度を、この均質アッセイ方法により
達成する。７２人のヒト血清におけるフェリチン濃度
を、ＦＤＡ−承認された対照方法への比較により示され
るように、本発明のアッセイにより正しく測定した。そ
の相関曲線は、図３に示される。図５に示されるよう
に、工程２はまた、４５人のヒト血清におけるフェリチ
ンを正しく測定した。この方法は、複数の段階を必要と
し、そして複雑な装置を必要とする他の方法とは異なっ
て、フェリチンについての十分に自動化され、早く且つ
正確な均質イムノアッセイを提供する。
【００４６】例２ アッセイ原理 このアッセイにおいて、１２５，０００の分子量を有す
るＣ−反応性タンパク質分子は、Ｃ−反応性タンパク質
に対して特異的な抗体が酵素受容体（ＥＡ）分子と相補
性をなすために結合されている酵素ドナー（ＥＤ）分子
の活性β−ガラクトシダーゼを形成する能力を阻害し
た。阻害の量は、Ｃ−反応性タンパク質の濃度に比例し
た。換言すれば、β−ガラクトシダーゼと基質との反応
に起因する色の形成により測定されるように、Ｃ−反応
性タンパク質の濃度が高くなるほど、アッセイ媒体中の
β−ガラクトシダーゼの活性は低くなる。
るＣ−反応性タンパク質分子は、Ｃ−反応性タンパク質
に対して特異的な抗体が酵素受容体（ＥＡ）分子と相補
性をなすために結合されている酵素ドナー（ＥＤ）分子
の活性β−ガラクトシダーゼを形成する能力を阻害し
た。阻害の量は、Ｃ−反応性タンパク質の濃度に比例し
た。換言すれば、β−ガラクトシダーゼと基質との反応
に起因する色の形成により測定されるように、Ｃ−反応
性タンパク質の濃度が高くなるほど、アッセイ媒体中の
β−ガラクトシダーゼの活性は低くなる。
【００４７】Ｃ−反応性タンパク質の測定のための均質
アッセイにおいては、Ｃ−反応性タンパク質を含むサン
プルを、ＥＤ−Ａｂ（モノクローナル）接合体及びもう
１つの接合されていないＡｂ（モノクローナル）と共に
３７℃で５〜１０分間インキュベートした。ＥＤ−Ａｂ
接合体は、架橋剤を用いて、ＥＤとＡｂとの間で共有結
合された複合体であった。インキュベーションの後、マ
ウスＩｇＧに対する第２抗体及びβ−ガラクトシダーゼ
のための基質を含む第１試薬（Ｒ１として命名される）
を添加し、そして５〜１０分間インキュベートした。次
に、ＥＡを含む第２試薬（Ｒ２として命名される）をア
ッセイ混合物に添加し、そして加水分解された基質の色
シグナルを、４〜１０分後、分光的に測定した。サンプ
ル中のＣ−反応性タンパク質量を、既知濃度のＣ−反応
性タンパク質を含む一連のサンプルのアッセイ結果から
構成された検量曲線を用いて決定した。
アッセイにおいては、Ｃ−反応性タンパク質を含むサン
プルを、ＥＤ−Ａｂ（モノクローナル）接合体及びもう
１つの接合されていないＡｂ（モノクローナル）と共に
３７℃で５〜１０分間インキュベートした。ＥＤ−Ａｂ
接合体は、架橋剤を用いて、ＥＤとＡｂとの間で共有結
合された複合体であった。インキュベーションの後、マ
ウスＩｇＧに対する第２抗体及びβ−ガラクトシダーゼ
のための基質を含む第１試薬（Ｒ１として命名される）
を添加し、そして５〜１０分間インキュベートした。次
に、ＥＡを含む第２試薬（Ｒ２として命名される）をア
ッセイ混合物に添加し、そして加水分解された基質の色
シグナルを、４〜１０分後、分光的に測定した。サンプ
ル中のＣ−反応性タンパク質量を、既知濃度のＣ−反応
性タンパク質を含む一連のサンプルのアッセイ結果から
構成された検量曲線を用いて決定した。
【００４８】材料 モノクローナル抗−Ｃ−反応性タンパク質抗体を、Ｍｅ
ｄｉｘ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａから購入した。ヘテロ−
二官能価架橋剤、すなわちｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣを、Pi
erce Chemical Company から得た。クロロフェノールレ
ッドβ−ガラクトシド（ＣＰＲＧ）を、Boehringer Man
nheim から購入した。酵素ドナー及び酵素受容体（市販
の相補性アッセイで使用されるように）を、Microgenic
s, Inc.から得た。他の化学薬品は、Sigma Chemical C
o.から得た。
ｄｉｘ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａから購入した。ヘテロ−
二官能価架橋剤、すなわちｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣを、Pi
erce Chemical Company から得た。クロロフェノールレ
ッドβ−ガラクトシド（ＣＰＲＧ）を、Boehringer Man
nheim から購入した。酵素ドナー及び酵素受容体（市販
の相補性アッセイで使用されるように）を、Microgenic
s, Inc.から得た。他の化学薬品は、Sigma Chemical C
o.から得た。
【００４９】接合体の調製 緩衝液Ａ（５０mMのリン酸ナトリウム、pH７．４，０．
１５ＭのＮａＣｌを含む）０．５ml中、モノクローナル
抗−Ｃ−反応性タンパク質抗体１mgを、緩衝液Ａ中、２
０mMのｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣ溶液５０μｌと共に、室温
で１５分間インキュベートした。インキュベーションの
後、その混合物を、ゲル濾過カラム（ＰＤ１０，Ｐｈａ
ｒｍａｃｉａ−ＬＫＢ）上に負荷し、そして緩衝液Ａに
より溶出した。画分を２８０nmで吸光度によりモニター
し、そして抗体を含むボイド画分をプールした。次に、
緩衝液Ａ０．５ml中、ＥＤ（ＥＤ４）１mgを前記プール
された画分に添加し、そして室温で１時間インキュベー
トした。接合体を含む混合物を、Ａｍｉｃｏｎ濃縮器を
用いて２００μｌに濃縮した。その濃縮物をＦＰＬＣ
ＳＵＰＥＲＵＳＥ １２ゲル濾過カラム上に負荷し、そ
して緩衝液Ｂ〔５０mMのリン酸ナトリウム、pH７．４，
５００mMのＮａＣｌ，０．０５％のＴｗｅｅｎ２０及び
０．０５mMのＤＴＴ（ジチオチ−レイトール）〕により
溶出した。画分を、２８０nmでの吸光度により及び相補
性活性によりモニターした。抗体及び相補性活性を含む
画分をプールし、そして接合体として使用した。
１５ＭのＮａＣｌを含む）０．５ml中、モノクローナル
抗−Ｃ−反応性タンパク質抗体１mgを、緩衝液Ａ中、２
０mMのｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣ溶液５０μｌと共に、室温
で１５分間インキュベートした。インキュベーションの
後、その混合物を、ゲル濾過カラム（ＰＤ１０，Ｐｈａ
ｒｍａｃｉａ−ＬＫＢ）上に負荷し、そして緩衝液Ａに
より溶出した。画分を２８０nmで吸光度によりモニター
し、そして抗体を含むボイド画分をプールした。次に、
緩衝液Ａ０．５ml中、ＥＤ（ＥＤ４）１mgを前記プール
された画分に添加し、そして室温で１時間インキュベー
トした。接合体を含む混合物を、Ａｍｉｃｏｎ濃縮器を
用いて２００μｌに濃縮した。その濃縮物をＦＰＬＣ
ＳＵＰＥＲＵＳＥ １２ゲル濾過カラム上に負荷し、そ
して緩衝液Ｂ〔５０mMのリン酸ナトリウム、pH７．４，
５００mMのＮａＣｌ，０．０５％のＴｗｅｅｎ２０及び
０．０５mMのＤＴＴ（ジチオチ−レイトール）〕により
溶出した。画分を、２８０nmでの吸光度により及び相補
性活性によりモニターした。抗体及び相補性活性を含む
画分をプールし、そして接合体として使用した。
【００５０】アッセイ工程 アッセイを、Ｃｏｂａｓ Ｂｉｏ遠心分離分析器上で行
なった。サンプルのアリコートを、ＥＧＴＡ緩衝液によ
り１０倍に希釈した。希釈されたサンプル１０．５μｌ
のアリコートを、ＥＧＴＡ緩衝液中、接合された及び接
合されていない抗−Ｃ−反応性タンパク質抗体１２９．
５μｌと共に３７℃で１０分間インキュベートした。イ
ンキュベーションの後、サンプルカップをＣｏｂａｓ
Ｂｉｏ上に置き、そしてその混合物１０μｌをピペット
で取り、そしてＥＧＴＡ緩衝液に第２抗体及び基質（Ｃ
ＰＲＧ）を含むＲ１試薬１７５μｌと共にインキュベー
トした。この段階でのインキュベーションは１０分間で
あった。次に緩衝液ＣにＥＡを含む試薬Ｒ２（３０ml）
を添加し、そして３７℃でさらに５〜１０分間インキュ
ベートした。反応速度を、個々のサンプル及び対照溶液
について５７４nmでの吸光度を測定することによって測
定した。
なった。サンプルのアリコートを、ＥＧＴＡ緩衝液によ
り１０倍に希釈した。希釈されたサンプル１０．５μｌ
のアリコートを、ＥＧＴＡ緩衝液中、接合された及び接
合されていない抗−Ｃ−反応性タンパク質抗体１２９．
５μｌと共に３７℃で１０分間インキュベートした。イ
ンキュベーションの後、サンプルカップをＣｏｂａｓ
Ｂｉｏ上に置き、そしてその混合物１０μｌをピペット
で取り、そしてＥＧＴＡ緩衝液に第２抗体及び基質（Ｃ
ＰＲＧ）を含むＲ１試薬１７５μｌと共にインキュベー
トした。この段階でのインキュベーションは１０分間で
あった。次に緩衝液ＣにＥＡを含む試薬Ｒ２（３０ml）
を添加し、そして３７℃でさらに５〜１０分間インキュ
ベートした。反応速度を、個々のサンプル及び対照溶液
について５７４nmでの吸光度を測定することによって測
定した。
【００５１】ＥＧＴＡ緩衝液は、１５０mMのリン酸カリ
ウム、１００mMのリン酸ナトリウム、３mMの酢酸マグネ
シウム、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０，０．０５mMのＤ
ＴＴ，１．２％のエチレングリコール及び２０mMのアジ
化ナトリウムを７．０の最終pHで含む。
ウム、１００mMのリン酸ナトリウム、３mMの酢酸マグネ
シウム、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０，０．０５mMのＤ
ＴＴ，１．２％のエチレングリコール及び２０mMのアジ
化ナトリウムを７．０の最終pHで含む。
【００５２】結果 検量曲線を、０〜１２０μｇ／mlの一連の既知Ｃ−反応
性タンパク質濃度を用いて構成した。その検量曲線は図
６に示される。検量曲線は、ゼロのＣ−反応性タンパク
質での早い速度（mAu ／分で測定される）から１２０μ
ｇ／mlのＣ−反応性タンパク質での遅い速度まで非線状
曲線である。非線状曲線の使用は、広いアッセイ範囲を
維持しながら、低い最終感度を可能にする。図６の検量
曲線を用いて、１μｇ／mlのＣ−反応性タンパク質の検
出感度を達成することができる。１１人のヒト血清にお
けるＣ−反応性タンパク質を、ＦＤＡ−承認された対照
方法への比較により示されるように、本発明のアッセイ
により正しく測定した。その相関曲線は、図７に示され
る。
性タンパク質濃度を用いて構成した。その検量曲線は図
６に示される。検量曲線は、ゼロのＣ−反応性タンパク
質での早い速度（mAu ／分で測定される）から１２０μ
ｇ／mlのＣ−反応性タンパク質での遅い速度まで非線状
曲線である。非線状曲線の使用は、広いアッセイ範囲を
維持しながら、低い最終感度を可能にする。図６の検量
曲線を用いて、１μｇ／mlのＣ−反応性タンパク質の検
出感度を達成することができる。１１人のヒト血清にお
けるＣ−反応性タンパク質を、ＦＤＡ−承認された対照
方法への比較により示されるように、本発明のアッセイ
により正しく測定した。その相関曲線は、図７に示され
る。
【００５３】この方法は、特に複合体混合物における高
分子量分析物のレベルを検出するために正確で、高い感
度の且つ急速な技法を提供することが、上記結果から明
らかである。観察された酵素活性は、サンプル中の分析
物の量に反比例する。
分子量分析物のレベルを検出するために正確で、高い感
度の且つ急速な技法を提供することが、上記結果から明
らかである。観察された酵素活性は、サンプル中の分析
物の量に反比例する。
【００５４】本明細書に引用されたすべての出版物及び
特許出願は、引用により本明細書に組込まれる。前述の
発明は、明確に理解するために例示的且つ例的にいくら
か詳細に記載されているけれども、特許請求の範囲内で
修飾及び変更を行なうことができる。
特許出願は、引用により本明細書に組込まれる。前述の
発明は、明確に理解するために例示的且つ例的にいくら
か詳細に記載されているけれども、特許請求の範囲内で
修飾及び変更を行なうことができる。
【図１】これは、本明細書に記載されるような例１のア
ッセイ工程１による高分子量分析物（フェリチン）の存
在下での相補性に従っての酵素活性を示すグラフであ
る。
ッセイ工程１による高分子量分析物（フェリチン）の存
在下での相補性に従っての酵素活性を示すグラフであ
る。
【図２】これは、低濃度の高分子量分析物（フェリチ
ン）の存在下での相補性に従っての酵素活性を示すグラ
フであり、それによってアッセイ工程１によるアッセイ
感度を示す。
ン）の存在下での相補性に従っての酵素活性を示すグラ
フであり、それによってアッセイ工程１によるアッセイ
感度を示す。
【図３】これは、アッセイ工程１によるフェリチンにつ
いての本発明のアッセイとＦＤＡ−承認されたアッセイ
との間の相互関係を示すグラフである。
いての本発明のアッセイとＦＤＡ−承認されたアッセイ
との間の相互関係を示すグラフである。
【図４】これは、本明細書に記載されるような例１のア
ッセイ工程２による高分子量分析物（フェリチン）の存
在下での相補性に従っての酵素活性を示すグラフであ
る。
ッセイ工程２による高分子量分析物（フェリチン）の存
在下での相補性に従っての酵素活性を示すグラフであ
る。
【図５】これは、アッセイ工程２によるフェリチンにつ
いての本発明のアッセイとＦＤＡ−承認されたアッセイ
との間の相互関係を示すグラフである。
いての本発明のアッセイとＦＤＡ−承認されたアッセイ
との間の相互関係を示すグラフである。
【図６】これは、本明細書に記載されるような例２の方
法に記載されるようにＣ−反応性タンパク質の存在下で
の相補性に従っての酵素活性を示すグラフである。
法に記載されるようにＣ−反応性タンパク質の存在下で
の相補性に従っての酵素活性を示すグラフである。
【図７】これは、例２の方法に記載されるようにＣ−反
応性タンパク質についての本発明のアッセイとＦＤＡ−
承認されたアッセイとの間の相互関係を示すグラフであ
る。
応性タンパク質についての本発明のアッセイとＦＤＡ−
承認されたアッセイとの間の相互関係を示すグラフであ
る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ジェフ シンデルマン アメリカ合衆国，カリフォルニア 94520，コンコード，マーシュ エルダ ー コート 4420 (72)発明者 パイアー エル． カンナ アメリカ合衆国，カリフォルニア 94539，フレモント，グレゴリー コー ト 864 (56)参考文献 特表 平２−501859（ＪＰ，Ａ) 特表 昭62−500633（ＪＰ，Ａ) Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂ ｉｏｃｈｅｍ．，29（10），1991，ｐ. 697−704
Claims (12)
- 【請求項１】 β−ガラクトシダーゼ相補性アッセイを
用いて少なくとも１０，０００ダルトンの分子量を有す
る分析物（アナライト）の存在を検出するための方法で
あって、 （ａ）上記分析物と特異的に反応する結合成分に結合さ
れた酵素ドナー（ＥＤ）を含んで成るＥＤ複合体を供給
し、ここでこのＥＤ複合体が、酵素受容体（ＥＡ）の存
在下で活性β−ガラクトシダーゼが形成されるように測
定可能な相補性活性を保持し； （ｂ）上記分析物を含むと思われるサンプルの存在下で
上記ＥＤ複合体とＥＡとを接触せしめ；そして（ｃ）活
性β−ガラクトシダーゼ酵素の形成の阻害に上記サンプ
ル中の分析物の存在を関連づける、 ことを含み、かつ、 上記分析物と上記結合成分のいずれも固体支持体に結合
されない、前記検出方法。 - 【請求項２】 前記ＥＤ複合体、前記ＥＡ及び前記サン
プルを、β−ガラクトシダーゼとの反応に基づいて測定
可能な生成物を供給する酵素基質と接触せしめ、その酵
素基質と活性酵素との反応により供給される測定可能な
生成物を測定し、そしてそのサンプル中の分析物の量
を、既知量の分析物から形成される量に対して測定可能
な生成物の量を比較することにより決定する、請求項１
に記載の方法。 - 【請求項３】 前記酵素基質がクロロフェノール・レッ
ドβ−ガラクトシドである、請求項２に記載の方法。 - 【請求項４】 前記分析物がポリペプチド、ＤＮＡ、Ｒ
ＮＡ又はウィルス粒子である、請求項１に記載の方法。 - 【請求項５】 前記分析物が少なくとも２０，０００ダ
ルトンの分子量を有する、請求項１に記載の方法。 - 【請求項６】 前記結合成分が抗体、天然の受容体、Ｄ
ＮＡ又はＲＮＡである、請求項１に記載の方法。 - 【請求項７】 前記抗体がモノクローナル抗体、組換え
抗体、又は抗体と等価な組換えペプチド断片である、請
求項６に記載の方法。 - 【請求項８】 前記ＥＤが二官能性有機結合基により分
析物に特異的な抗体に結合されている、請求項１に記載
の方法。 - 【請求項９】 前記ＥＤ複合体が組換え融合タンパク質
である、請求項１に記載の方法。 - 【請求項１０】 少なくとも１０，０００ダルトン、そ
して２，０００，０００ダルトン未満の分子量を有する
分析物に特異的な結合成分に共有結合された酵素ドナー
（ＥＤ）断片を含んで成る試薬複合体であって、ここ
で、サンプル中の分析物の存在が活性β−ガラクトシダ
ーゼの形成の阻害に関連づけられ、かつ、上記分析物と
上記結合成分のいずれも固体支持体に結合されない相補
性アッセイにおいて、上記ＥＤが、その相補性酵素受容
体断片との接触に基づいて、活性β−ガラクトシダーゼ
を形成することを特徴とする試薬複合体。 - 【請求項１１】 前記結合成分が抗体又は核酸である、
請求項１０に記載の試薬複合体。 - 【請求項１２】 前記結合成分が、二官能性有機結合化
合物によりＥＤに共有結合されたモノクローナル抗体で
ある、請求項１０に記載の試薬複合体。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US07/649,483 US5244785A (en) | 1991-02-01 | 1991-02-01 | Determination of high molecular weight analytes using a β-galactosidase complementation assay |
| US649483 | 1991-02-01 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0566223A JPH0566223A (ja) | 1993-03-19 |
| JP2892879B2 true JP2892879B2 (ja) | 1999-05-17 |
Family
ID=24604988
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4016386A Expired - Fee Related JP2892879B2 (ja) | 1991-02-01 | 1992-01-31 | 高分子量分析物の測定法 |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5244785A (ja) |
| EP (1) | EP0497613B1 (ja) |
| JP (1) | JP2892879B2 (ja) |
| AU (1) | AU653196B2 (ja) |
| CA (1) | CA2060377A1 (ja) |
| DE (1) | DE69211371T2 (ja) |
| ES (1) | ES2090492T3 (ja) |
Families Citing this family (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5612019A (en) * | 1988-12-19 | 1997-03-18 | Gordon, Deceased; David | Diagnosis and treatment of HIV viral infection using magnetic metal transferrin particles |
| CA2068190C (en) * | 1991-05-15 | 1996-12-17 | Microgenics Corporation | Methods and compositions for enzyme complementation assays using the omega region of beta-galactosidase |
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