JP2023047348A - グルテン分解によってパンの物理・化学的消化率を増加させるラクチプランチバチルスプランタラムlrcc 5318菌株及びその用途 - Google Patents
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Abstract
Description
(1)試料採取及び乳酸菌分離
パンの消化率を増加させる乳酸菌を選別するために、韓国全域の伝統在来市場から約150種のキムチ試料とミレウォンモールからハ-ブ6種を購買した。購買したキムチ試料には滅菌蒸留水を添加して10倍希釈した後、粉砕均質器(Stomacher,Pro-Media SH-001,ELMEX)を用いて均質化し、ハ-ブ試料には砂糖と蒸留水を添加して30℃で7日間培養後に濾過した。前記希釈液と濾過液を滅菌食塩水で多段希釈後に0.1mlを取り、0.002重量%のBCP(Bromocresol purple)と1.5重量%の寒天(Agar)が添加されたMRS固体培地に塗抹し、37℃培養器で48時間培養した。
培養後に、黄色の環が見られるコロニー(Colony)を選別し、個体別に、上述したBCP-MRS固体培地に2~3回継代培養して各菌株を純粋分離した。
前記菌株を個体別にMRS液体培地に接種して37℃で48時間再培養した後、4℃冷蔵保管しながら実験に使用した。
生地のpHは4.5にまで落ちるが、このような環境でも生長するためには耐酸性に優れた菌株が要求される。したがって、前記で分離した菌株の耐酸性を比較して優秀菌株を選別した。
上記で分離した乳酸菌をMRS平板培地に接種して37℃で24時間培養した。培養されたコロニーの一部を採取してMRS液状培地に接種した後、さらに、37℃で24時間静置培養し、種菌培養液を製造した。
分離乳酸菌の耐酸性試験のために種菌培養液1%をMRS液体培地に接種して37℃で24時間培養した。この培養液を遠心分離して菌体を沈殿させた後に上澄液を除去し、10% H2SO4を用いてpHを3.0に調整した0.1Mリン酸緩衝液(0.1M Phosphate buffer)を同体積で添加した。pH3.0緩衝液を添加した時点を基準に37℃培養器で0、2、4、8時間、その後は24時間単位で試料1mlを採取してその多段希釈液をMRS平板培地に塗抹し、37℃で24時間培養した。その後、初期生菌数と、pH3.0リン酸緩衝液処理後の生菌数をそれぞれ測定した後、(初期生菌数/pH処理後生菌数)で耐酸性を計算した。その結果、最も長い時間で高い耐酸性を示す菌株を選択し、本発明の最終菌株とした。
最終選別された菌株はMRS液体培地に接種して37℃で48時間培養して増殖させた後、遠心分離(10,000g,10分)して菌体を得た。前記菌体を、クライオチューブ(Cryo-tube)にあらかじめ分注しておいたMRS液体培地とグリセロール(Glycerol)が4:1の割合で混合された冷凍保管溶液(Freezing solution)1mlに入れ、-70℃で冷凍保管した。冷凍された菌株を、本発明の他の実験のためのスターターとして使用した。
選別された菌株の形態学的及び生化学的特徴を分析した。分析結果は、下記の表1の通りである。
前記菌株の簡易的な同定のために糖利用性を測定しようとした。ここで、API 50CHLキット(bioMerieux ,France)を 用いた。詳細には、MRS固体培地で培養されたコロニーをAPI 50CHL培地10mlに懸濁した後、API 50CHストリップのチューブに接種し、37℃培養器で48時間培養した。
27F(5'-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3')と
1492R(5'-TAC GGY TAC CTT GTT ACG ACT T-3')とでPCR反応を行って16s rDNA遺伝子を増幅させた。
塩基配列分析結果は、図1Bの通りである。
塩基配列分析の結果、前記菌株はラクチプランチバチルスプランタラム菌株と最大で99%の相同性を有する。本願発明菌株の系統図は、図1Cの通りである。
パンに適用した時に物理化学的消化率に影響を与える要素の一つであり、タンパク質分解力を平板培地上で測定した。タンパク質源はスキムミルクとし、指示薬としてBCP(Bromocresol purple)を添加し、2%スキムミルクBCP-PCA培地を製造した。この培地に63種の乳酸菌の培養液を100μlずつ塗抹して37℃で48時間培養し、コロニー周辺のクリアゾーン(Clear zone)を確認した。
平板培地上でタンパク質分解力を示した18種の菌株に対して、当該タンパク質分解力の原因を明確にするために、MRS液体培地内でのプロテアーゼ活性を測定した。プロテアーゼの測定は、プロテアーゼアッセイキット(Pierce(tm) Colorimetric Protease Assay Kit、製造社:Thermo Scientific(tm))を用いてなされたし、TNBSA(2,4,6-Trinitrobenzene sulfonic acid)がタンパク質の分解物であるアミノ酸、ペプチドと定量的に反応して黄色化合物を生成する現象を測定原理とする。
平板培地上でタンパク質分解力を示した18種の菌株に対して、当該菌株がグルテンを栄養分(窒素源)として利用できるかどうか確認するために、グルテンを含む培地内での生長性を測定した。グルテン培地の組成は下記の表5に、生長性測定結果のうち上位8種に対する結果は図3に示した。
8種の前記乳酸菌発酵液(実施例1~8)に対して、プロテアーゼ濃度を、実験例2と同一の方法で測定した。結果は、下記の表7の通りである。液体培地でのプロテアーゼ濃度と乳酸菌発酵液中のプロテアーゼ濃度の両方を確認した理由は、小麦粉を含有する乳酸菌発酵液組成とMRS液体培地組成に相違があり、菌株別にプロテアーゼを生成する程度が異なることがあるためである。実際の製パン時には、乳酸菌発酵液中のプロテアーゼ濃度が最終製品に影響を与えることから、実験例4の結果を優先的に参考し、LRCC 5241、LRCC 5318、LBS 51-3の3種を選定した。
(1)実験例4で選ばれた3種の菌株の食パンにおける効果を確認するために、菌株不添加食パン(比較例3)、レビラクトバチルスブレビスLRCC 5241添加食パン(実施例12)、ラクチプランチバチルスプランタラムLRCC 5318添加食パン(実施例13)、ラクチカゼイバチルスパラカゼイLBS 51-3添加食パン(実施例14)の4種を製造して比較した。
乳酸菌発酵食パン中種の組成は、下記の表8の通りである。
4種の食パン(比較例3、実施例12~14)の物理的消化率(%)は、人体の口腔、胃、小腸の消化過程をまねて作ったin vitro胃腸モデルを用いて測定した。人工唾液は、Pickering Laboratories社の人工唾液(cat.no.1700-0304)を購買して使用し、人工胃液は、NaCl 2.0gとペプシン3.2gにHCl 7mlを添加して溶解させ、pH 1.2に調整した後、D.W.(Distilled water)で1Lまで合わせて製造し、人工腸液は、KH2PO4 6.8gにD.W.250mlを入れて溶かし、0.2N NaOH 77ml、D.W.500ml、パンクレアチン10gを添加した後、pH6.8に調整し、D.W.で1Lまで合わせて製造した。製造した人工消化液は、実験前には37℃の水槽に保管する。その後、4種の食パンを粉砕し、各10gを取って、人工唾液で10分、人工胃液で2時間、人工腸液で4時間放置した後、4種の消化完了液を濾紙(Whatman,No.541)で濾過した固形分を80℃オープンで乾燥させた。その乾燥重量を測定し、下記の式1によって物理的消化率を計算した。
4種の食パン(比較例3、実施例12~14)の化学的消化率(%)は、実験例5で濾紙で濾過した後の残存液中の遊離アミノ酸含有量を用いて測定した。詳細には、4種の初期食パン試料10g中のタンパク質含有量をそれぞれ測定し、消化後残存液中の遊離アミノ酸含有量を測定して、下記式2によって化学的消化率を計算した。
4種の食パン(比較例3、実施例12~14)の物理化学的消化率が実際に食パン中のグルテン含有量の減少と関連があるかどうか確認するために、グルテンアッセイキット(AgraQuant(登録商標) Gluten G12(登録商標)、製造社:Romer Lab(登録商標))を用いてグルテン含有量を測定した。
受託番号:KCCM 12988P
受託日時:20210513
Claims (6)
- パンの消化率を増加させる効果を有する寄託番号KCCM 12988Pのラクチプランチバチルスプランタラム(Lactiplantibacillus plantarum)LRCC 5318菌株。
- 前記消化率の増加は、菌株培養液及び乳酸菌発酵液の高いプロテアーゼ濃度と製パン発酵時のグルテン低減によって発生する、請求項1に記載の菌株。
- 前記菌株は、配列番号1の塩基配列を含む16S rDNAを有する、請求項1に記載の菌株。
- 請求項1~3のいずれか一項による菌株;その破砕物;その培養物;その発酵物;及び前記菌株、破砕物、培養液又は発酵物の抽出物;のいずれか一つ以上を含む乳酸菌発酵液。
- 請求項4による乳酸菌発酵液を用いる段階を含むパンの製造方法。
- 請求項1~3のいずれか一項による菌株;その破砕物;その培養物;その発酵物;及び前記菌株、破砕物、培養液又は発酵物の抽出物;のいずれか一つ以上を含むパン。
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