JP5289311B2 - グルテンフリーの焼き製品の調製のための乳酸菌の混合物 - Google Patents
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Description
において市販の製品に対して実施されたいくつかの研究(Storsrudら、2003年、オートムギ製品及び天然にグルテンを含まない製品におけるグルテン混入(Gluten contamination in oat products and products naturally free from gluten)Eur Food Res Technol 217:281〜485頁)によって、注目すべきパーセンテージ(約30%)のグルテンフリーの製品が、微量のグルテン(100〜300ppm)によって汚染されている可能性があり、これはこの不耐性を受けている個体にとって危険の可能性となり得るということが実証された。
ラクトバチルス・サンフランシスセンシス(Lactobacillus sanfranciscensis)LS40=DSM18426
L.サンフランシスセンシス(L.sanfranciscensis) LS41=DSM18427
ラクトバチルス・ロシエ(Lactobacillus rossiae)LR15=DSM18428
ラクトバチルス・ロシエ(Lactobacillus rossiae)Ci35=DSM18429
ラクトバチルス・プランタラム(Lactobacillus plantarum)CF1=DSM18430
ラクトバチルス・カルバツス(Lactobacillus curvatus)1Hd=DSM18431
ラクトバチルス・ファルシミニス(Lactobacillus farciminis)2XA3=DSM18432
(TACGGGAGGCAGCAGTAG/CATGGTGTGACGGGCGGT、それぞれ、配列番号1及び配列番号2)。
a)前記で定義される乳酸菌株混合物を培養増殖させるステップと、
b)50〜65%濃度の前記で定義される粉組成物を、約108ufc/gの細胞密度を有するステップa)において定義される菌株混合物を含有する35〜50%の水と混合するステップと、
c)20〜30℃で8〜24時間発酵させるステップ。
a)40〜60%、好ましくは44%のパーセンテージの前記で定義される粉組成物と、醸造用酵母1〜3%を含有する水10〜30%、好ましくは26%と、塩0.1〜1.2%と、5〜30%、好ましくは30%の量の前記の方法に従って得ることができる新鮮なスターター種菌(パーセンテージが30%より低い場合は、粉及び水の量を比例的に増大させる)、又は乾燥された、酵母添加活性を有さない同様の成分、又は酵母添加活性を有する凍結された成分とを捏ねるステップであって、前記パーセンテージが、捏ね物の総重量に関して重量パーセンテージであるステップと、
b)30℃で約1〜3時間発酵させるステップと、
c)220℃で50分間調理するステップ。
本発明の株の選択及び分析
「天然酵母」からこれまでに単離された、Collezione di Colture del Dipartimento di Protezione delle Piante e Microbiologia Applicata dell’Universita degli Studi di Bariに属する55種の乳酸菌の株を、通常成分に加えて、5%マルトース及び10%のイースト水を含有する改変MRS(mMRS)−最終pH5.6において30℃で24時間増殖させた。表1には、「天然酵母」から単離され、本発明において使用されている乳酸菌種の一覧。
表1
タンパク質分解活性に基づいた選択を、24時間培養し、遠心分離(10,000g×10分、4℃)によって回収し、リン酸バッファー50mM、pH7.0で2回洗浄し、同バッファーで、108ufc/mlの細胞密度に対応する、2.5光学密度(A620nm)に再懸濁した細胞を用いて実施した。プロテイナーゼ活性は、小麦粉から抽出されたアルブミン及びグロブリンに対して試験した(Weissら、1993年、パン屋喘息に関与する種々の栽培品種に由来するコムギ粒アレルゲンの電気泳動による特徴付け(Electrophoretic characterisation of wheat grain allergens from different cultivars involved in baker’s asthma)、Electrophoresis 14:805〜816頁)。0.9mlのアルブミン−グロブリン画分(約4mg/1mlのタンパク質)と、0.1mlの細胞懸濁液を含有する反応混合物を、撹拌下(150rpm)、30℃で48時間インキュベートした。SDS−PAGE一次元電気泳動を、Laemmliシステムに従って実施した(Laemmli、1970年、バクテリオファージT4の頭部の組み立ての間の構造タンパク質の切断(Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4)、Nature 227:680〜685頁)。N型アミノペプチダーゼ(PepN)及びプロリンイミノペプチダーゼ(PepI)活性を、合成基質、それぞれ、Leu−p−NA及びFor−p−NAを用いて調べた。反応混合物は、合成基質が溶解している(最終濃度2mM)、0.9mlのK−リン酸バッファー50mM、pH7.0と、100μλの細胞懸濁液とを含んでいた。1μmol/分のp−ニトロアニリドを放出するのに必要な酵素量に対応する、活性単位(U)として表される酵素活性(Gobbettiら、1996年、ラクトバチルス・サンフランシスセンシス(Lactobacillus sanfranciscensis)CB1のタンパク質分解系:プロテイナーゼ、ジペプチダーゼ及びアミノペプチダーゼの精製及び特徴付け(The proteolytic system of Lactobacillus sanfranciscensis CB1:purification and characterisation of a proteinase、dipeptidase,and aminopeptidazse.)Appl.Environ.Microbiol.62:3220〜3226頁)。プロリダーゼ(PepQ)及びプロリナーゼ(PepR)は、Di Cagno及び共同研究者(Di Cagnoら、2004年、コムギ及び非毒性粉及び選択された乳酸菌を含むスターターから製造されたサワー種パンは、セリアック病患者において耐容性を示す(Sourdough bread made from wheat and nontoxic flours and starter with selected lactobacilli is tolerated in celiac sprue patients)、Appl.Environ.Microbiol.70:1088〜1096頁)によって記載されるように、それぞれVal−Pro及びFor−Glyに対して調べた。ジペプチダーゼ(PepV)及びトリペプチダーゼ(PepT)は、それぞれ、Leu−Leu及びLeu−Leu−Leuを用い、Cd−ニニドリン(Cd−ninidrine)法(Gobbettiら、1999年、二次応答曲面法によるチーズ関連乳酸菌のタンパク質分解及び脂肪分解活性に対する温度、pH、NaCl及びawの作用についての研究(Study of the effects of temperature,pH,NaCl,and aw on the proteolytic and lipolytic activities of cheese−related lactic acid bacteria by quadratic response surface methodology、Enzyme Microbial Technol 25:795〜809頁)に従って調べた。活性単位(U)は、1μmolのアミノ酸/分を放出するのに必要な酵素量として定義した。
酸性化力に基づく選択は、15、15、65及び5重量%のネイティブコーン、ホワイトコーン、米粉及びサラセンホウィート(saracen wheat)粉のような62.51gの粉混合物と、最終細胞密度108ufc/gの捏ね物の単一の乳酸菌の細胞懸濁液を含有する37.5mlの水とを用いる100gの捏ね物(捏ね物収量160)で実施した。捏ね物の酸性化動態は、オンラインでpHを測定して検出した(pHメーター507、Crison、Italy)。データは、Zwieteringと共同研究者によって改変されたGompertz方程式を用いてモデル化した(Zwieteringら、1990年、細菌増殖曲線のモデル化(Modelling of bacterial growth curve.)Appl Environ Microbiol 56:1875〜1881頁)。
グルテン解毒試験は、15、15、65及び5%のネイティブコーン、ホワイトコーン、米粉及びサラセンホウィート(saracen wheat)粉のような62.51gの粉混合物と、最終細胞密度108ufc/gの捏ね物の、より高いタンパク質分解活性のために選択された乳酸菌(ラクトバチルス・サンフランシスセンシス(Lactobacillus sanfranciscensis)(DSM18426)、(DSM18427)、ラクトバチルス・ロシエ(Lactobacillus rossiae)(DSM18429)、(DSM18428)、ペディオコッカス・ペントサセウス(Pediococcus pentosaceus)(DSM18432)及びラクトバチルス・ブレビス(Lactobacillus brevis)(DSM18431))の細胞懸濁液を含有する37.5mlの水とを用いる100gの捏ね物(捏ね物収量160)で実施した。捏ね物に500又は1000ppmというグルテン量を加えた。それぞれ、500及び1000ppmのグルテンと、0.15gのNaN3(p/p)を含有する2種の対照捏ね物を、細菌種菌を用いずに製造し、pH3.6に化学的に酸性化した。捏ね物は、30℃で5、24及び48時間インキュベートした。発酵の最後に、グルテン定量のためにELISA試験を用いた(Transia Plate、Diffchamb)。
選択された乳酸菌を、ネイティブコーン、ホワイトコーン、米粉及びサラセンホウィート(saracen wheat)粉からなる粉混合物をベースとする捏ね物の製造に用いられる5種の異なる配合に用いた(表2)。
表2
選択した「天然酵母」の種々の配合を、種々の技術的な解決策を考慮する、グルテンフリーのパンの製造に用いた。24時間発酵させた後、(i)前記で報告された成分からなる5〜30%ベース捏ね物で播種することによる新鮮な天然スターター又は予備乾燥の場合には、同様の(ii)成分(15%)として用いた。この捏ね物に醸造用酵母(1%)及びNaCl(0.3%)を加え、30℃で2時間インキュベートし、その後、実験室オーブンで焼成した(220℃で50分)。対照パン対照は、醸造用酵母(2%)を用いて30℃で2時間発酵させた捏ね物を用いて製造した。以下の測定は、製造されたパンで実施した:(i)水抽出と、原子吸光分光分析法によるその後の測定による生物学的に利用可能な無機養素含量の分析;(ii)6人の訓練を受けていない試験者によって(Haglundら、1998年、生態学的に栽培された、及び伝統的な方法で栽培されたコムギから得た全粒パンの官能評価(Sensory evaluation of wholemeal bread from ecologically and conventionally grown wheat.)J.Cereal Sci.27:199〜207頁)、各特性について、0〜100の値範囲の漸増する強度の連続的尺度を用いて実施されたパネル試験による官能分析;(iii)AACC10−10及びAACC74−09公定法に従う比容積及び硬度の分析(Approved Association Cereal Chemistry、X版、AACC、St.Paul、Minnesota−U.S.A.編);及び(iv)工業規模でのパン製造、改変雰囲気(40%N2及び60%CO2)における包装及び保存性化合物の不在下での6カ月間の継続保存による保存期間試験。
(1)プロテイナーゼ活性
不均一加水分解プロフィールが証明される、基質としてアルブミン及びグロブリンを用いて測定されるプロテイナーゼ活性。図2では、より顕著なプロテイナーゼ活性を代表するL.サンフランシスセンシス(L.sanfranciscensis)(DSM18426)、L.ブレビス(L.brevis)(DSM18431)及びL.ロシエ(L.rossiae)(DSM18428)及び(DSM18429)のプロフィールが報告されている。グルテンフリーの食品の製造に用いられる内因性粉酵素のものに対して補完的であり得るこのような酵素活性は、タンパク質分解過程の初期段階を構成する。ペプチダーゼ活性は、比較的特異的な合成基質でアッセイした。図3では、L.サンフランシスセンシス(L.sanfranciscensis)種に属する株に関する結果が報告されている。トリペプチダーゼ型活性を除く、すべての考慮される酵素活性について、株(DSM18426)及び(DSM18427)が、その他の株よりも著しく高い活性を有することを観察することができる。同じ基準に従って、その他の種に属する株の選択を実施した。スクリーニングのためにCulture Collectionを利用できること及び多数のアッセイされる酵素活性が、通常は得られない選択された株を得るための前提をなす。プロテイナーゼ及びペプチダーゼ活性に基づいて、L.サンフランシスセンシス(L.sanfranciscensis)(DSM18426)及び(DSM18427)、L.ロシエ(L.rossiae)(DSM18429)及び(DSM18428)、L.ブレビス(L.brevis)(DSM18431)及びP.ペントサセウス(P.pentosaceus)(DSM18432)が選択された。特に、選択された種及び株のペプチダーゼ型活性の、初期スクリーニングに用いた2種のラクトバチル・ファーメンタム(Lactobacillu fermentum)株との比較は、すべての試験した基質についてより高いペプチダーゼ活性(平均で40〜80%)を常に指し示した。それに基づいて選択が実施された酵素活性は、(i)アミノ酸のより多い放出に有利に働き、したがって、栄養上の利用率を高め;(ii)焼成プロセスの間に生じたより多量の揮発性化合物前駆体を放出し、典型的なパンの芳香の原因となり;(iii)グルテンフリー製品の混入のような、あり得るグルテンの痕跡の解毒に寄与する多様な価値を有し得る。
乳酸菌単離物の酸性化力は、単一の微生物を用いて30℃で7時間発酵させた酸性捏ね物で直接調べた。図4には、L.サンフランシスセンシス(L.sanfranciscensis)種に属する株に関する結果が報告されている。(DSM18426)株、特に、(DSM18427)はまた、ΔpH及びμmaxを用いて表される、良好な酸性化力も特徴とするということを観察することができる。同一の基準に従って、その他の種に属する株の選択を実施した。2.3より高いΔpH値を特徴とする酸性化力に基づいて、特に、L.プランタラム(L.plantarum)(DSM18430)が選択された。すべての選択された種又は株が、スクリーニングにおいて考慮された2種のL.ファーメンタム(L.fermentum)株について求められたものより高い酸性化力及び速度を示した。
最初に、タンパク質分解活性に基づいて選択されたプール乳酸菌 (L.サンフランシスセンシス(L.sanfranciscensis)(18426)及び(DSM18427)、L.ロシエ(L.rossiae)(DSM18429)及び(DSM18428)、L.ブレビス(L.brevis)(DSM18431)及びP.ペントサセウス(P.pentosaceus)(DSM18432))を、混入をシミュレートするためにグルテンフリーの捏ね物に意図的に加えた500又は1000ppmのグルテンの解毒に用いた。捏ね物を48時間インキュベートした後、両グルテン濃度の存在において約40%の減少が観察された。より短いインキュベーション時間、すなわち、24時間も、同様の解毒パーセンテージを示したが、5時間のインキュベーションはグルテン濃度の実質的な減少を可能にしなかった。組み合わせた、L.サンフランシスセンシス(L.sanfranciscensis)(DSM18426)及び(DSM18427)及びL.プランタラム(L.plantarum)(DSM18430)は、より多数の単離物からなるプールと同様のグルテンの加水分解活性を示した。同じ組合せの乳酸菌が、グルテンフリー出発材料の妥当な混入値である約300ppmの初期グルテン濃度を、20ppmという閾値で低下させるのに適していた。グルテンに対する同様の活性によって、発酵プロセスの間のグルテン生物学的混入除去を含むグルテンフリー成分のより高い安全使用が可能となり得る。
表2には、選択された乳酸菌に基づく「天然酵母」の配合が報告されている。各配合を、捏ね物の30℃で12時間の発酵に用いた。醸造用酵母のみを用いて30℃で2時間発酵させた捏ね物を、対照として用いた。すべての製造された捏ね物は、12時間発酵させた後に、常に、2.4より高いΔpH値(捏ね物の最終pH約3.4)に達し(図4)、このことは、すべての配合について、顕著な酸性化を引き起こす能力を示す。特に、n.5の組合せ(L.サンフランシスセンシス(L.sanfranciscensis)(DSM18426)及び(DSM18427)、及びL.ロシエ(L.rossiae)(DSM18429))を用いて得られた捏ね物は、約2.6に匹敵する最大のΔpH値を示したのに対し、n.3の組合せ(P.ペントサセウス(P.pentosaceus)(DSM18432)、L.プランタラム(L.plantarum)(DSM18430)及びL.ロシエ(L.rossiae)(DSM18428))は、約2.45に匹敵する最低のΔpH値を示した。最大酸性化速度(μmax)の点では、n.3、4(L.ブレビス(L.brevis)(DSM18431)、L.プランタラム(L.plantarum)(DSM18430)及びL.ロシエ(L.rossiae)(DSM18429))並びに5の組合せを用いて得られた捏ね物は、約1.3時間−1に匹敵する最高のΔpH値を示した。必ずしも最大の酸性化力が常に良好なパン構造及び/又は芳香とともにあるわけではないが、特に、グルテンフリーの粉を用いる場合には、酸性化力は、酵母添加された製品の感覚受容性特性を改善するために考慮されるパラメータの1つに相当する。対照捏ね物を除く、すべての捏ね物において、有機酸の存在が検出され、特に、変動は以下のとおりであった:21〜82mMのL−乳酸、51〜75mMのD−乳酸及び10〜30mMの酢酸(表3は、選択された乳酸菌の配合を用いて30℃で12時間発酵させた捏ね物の、L−及びD−乳酸、酢酸の濃度及び発酵指数を示す)。
表3
a 醸造用酵母を用いて30℃で2時間発酵させた捏ね物
b nd、測定せず
c 発酵指数、乳酸と酢酸間のモル比
表4
a対照1:1%の醸造用酵母を用いて30℃で2時間酵母添加された細菌種菌を含まない捏ね物
b対照2:0.5%の醸造用酵母を用いて30℃で2時間酵母添加された細菌種菌を含まない捏ね物
c対照3:0.25%の醸造用酵母を用いて30℃で2時間酵母添加された細菌種菌を含まない捏ね物
選択された乳酸菌に基づく「天然酵母」の種々の配合を、図8に報告されるバイオテクノロジープロトコールに従って、グルテンフリーのパンの製造に用いた。2種の提案される代替物は、異なる技術的な解決策に対応するものである。さらなる発酵プロセス(30℃で2時間)のためのスターターとしての新鮮な「天然酵母」の使用は、従来技術を表すが、高価ではなく、毎日の「天然酵母の補給」を必要とする。「天然酵母」の使用自体の変法として、より長期の保存及び再活性化後の連続使用を可能にするためのその凍結があり得る。「天然酵母」の乾燥及び成分としてのその直接使用は、最終発酵期間(30℃で2時間)において活性ではないものの、容易な保存を可能にする。酵母添加剤としての醸造用酵母の使用に関しては、30%の新鮮な「天然酵母」の使用によって、発酵プロセスの間に約10〜30倍高いフィターゼ活性が得られることが可能となり、生物学的に利用可能なCa2+及びZn2+の含量の、それぞれ約21及び48%の増大をもたらし、遊離アミノ酸の含量が約10倍増大する。所望の特性によって変わる「天然酵母」の使用パーセンテージに基づいて、前記のすべての官能的なもの、前記で報告された増大は、変動を起こしやすい。また、再活性化後の凍結「天然酵母」の使用は、新鮮なものの同様の性能を示す。選択された乳酸菌に基づく「天然酵母」の種々の配合を用いて得られたすべてのパンは、醸造用酵母のみを用いて製造された対照パンと比較して、比容積及び硬度の同様の又はわずかに良好な値を特徴とする。製造されたパンを官能分析に付した。評価した官能パラメータは、弾性、色、芳香酸、酸味、甘味、乾燥度及び芳香とした。どのパラメータも、0〜100の範囲の値で漸増強度評価に従って評価した。各パンの官能プロフィールの定性的評価のために、得られたデータを、主成分(PCA)の統計分析によって処理した。図9に報告される2種の主成分は、サンプル全分散の73%を説明した。水平軸(因子1)は、全官能評価の関数としてのパンの類型の分布を示し、縦軸(因子2)は、各々考慮される官能パラメータの関数としてのパンの分布を表す。2種の主成分から規定される図でのパン分布から明らかなように(図9a)、新鮮な「天然酵母」を用いて製造されたパンの類型は、全く同様の官能結果を示したということが推定される。図9bからは、芳香、風味及び色の官能上特有の、高く評価される特性は、「天然酵母」を用いて製造されたパンが存在する図の部分において分布しているということが明確に明らかであり、このことから、芳香及び風味の点での「天然酵母」の役割及び寄与が確認される。最終的に、工業規模で製造され、改変雰囲気(40%N2及び60%CO2)において包装され、6カ月間の保存に付された、2の配合を用いて製造されたパン。全保存期間の間、保存性化合物(例えば、プロピオン酸Ca)の添加のない、微生物汚染現象(白カビの生えた、「粘り気のある」パン)は観察されなかった。
DSM18427
DSM18428
DSM18429
DSM18430
DSM18431
DSM18432
<223>増幅プライマーLpigF
配列番号2
<223>増幅プライマーLiPR
Claims (14)
- グルテンフリーの粉の酵母添加のための乳酸菌株の混合組成物であって、ラクトバチルス・サンフランシスセンシス(Lactobacillus sanfranciscensis)(DSM18426)、ラクトバチルス・ロシエ(Lactobacillus rossiae)(DSM18429)、ラクトバチルス・プランタラム(Lactobacillus plantarum)(DSM18430)、ラクトバチルス・サンフランシスセンシス(Lactobacillus sanfranciscensis)(DSM18427)、ペディオコッカス・ペントサセウス(Pediococcus pentosaceus)(DSM18432)、ラクトバチルス・ロシエ(Lactobacillus rossiae)(DSM18428)及びラクトバチルス・ブレビス(Lactobacillus brevis)(DSM18431)からなる群から選択される少なくとも2種の乳酸菌株を含む、又はからなる、上記混合組成物。
- ラクトバチルス・サンフランシスセンシス(Lactobacillus sanfranciscensis)(DSM18426)、ラクトバチルス・ロシエ(Lactobacillus rossiae)(DSM18429)及びラクトバチルス・プランタラム(Lactobacillus plantarum)(DSM18430)を含む、又はからなる、請求項1に記載の混合組成物。
- ラクトバチルス・サンフランシスセンシス(Lactobacillus sanfranciscensis)(DSM18426)、ラクトバチルス・サンフランシスセンシス(Lactobacillus sanfranciscensis)(DSM18427)及びラクトバチルス・プランタラム(Lactobacillus plantarum)(DSM18430)を含む、請求項1に記載の混合組成物。
- ペディオコッカス・ペントサセウス(Pediococcus pentosaceus)(DSM18432)、ラクトバチルス・ロシエ(Lactobacillus rossiae)(DSM18428)及びラクトバチルス・プランタラム(Lactobacillus plantarum)(DSM18430)を含む、又はからなる、請求項1に記載の混合組成物。
- ラクトバチルス・ブレビス(Lactobacillus brevis)(DSM18431)、ラクトバチルス・ロシエ(Lactobacillus rossiae)(DSM18429)及びラクトバチルス・プランタラム(Lactobacillus plantarum)(DSM18430)を含む、又はからなる、請求項1に記載の混合組成物。
- ラクトバチルス・サンフランシスセンシス(Lactobacillus sanfranciscensis)(DSM18426)、ラクトバチルス・サンフランシスセンシス(Lactobacillus sanfranciscensis)(DSM18427)及びラクトバチルス・ロシエ(Lactobacillus rossiae)(DSM18429)を含む、又はからなる、請求項1に記載の混合組成物。
- 発酵の開始時に108cfu/gの細胞密度で株が等比にある、請求項1から6までのいずれか一項に記載の混合組成物。
- グルテンフリーの粉が、トウモロコシ、米、サラセンホウィート(ソバ)、タピオカデンプン、ヒマワリ、リネン、テフ、サトウモロコシ、キノア、ジャガイモ、キャッサバ、アマランサス、雑穀粉からなる群から選択される、請求項1から7までのいずれか一項に記載の混合組成物。
- 請求項1から8までのいずれか一項に記載の株混合組成物及び粉組成物を含む、グルテンフリーの焼き製品のスターター又は同様のグルテンフリーの焼き製品を調製するためのグルテンフリーの粉の混合組成物であって、前記粉組成物が、トウモロコシデンプン10〜30%、タピオカデンプン2〜10%、米粉20〜60%、サラセンホウィート粉(ソバ粉)1〜10%を含み、又はからなり、前記パーセンテージが、全粉組成物重量の重量%として表される、上記グルテンフリーの粉の混合組成物。
- グルテンフリーの焼き製品のためのスターターの調製方法であって、
a)請求項1から8までの各項に記載の乳酸菌株混合組成物を培養増殖させるステップと、
b)50〜64%濃度の請求項9に記載の粉組成物を、種及び株間で等比で108 cfu/gの細胞密度を有するステップa)の菌株培養物を含有する35〜50%水と混合するステップであって、前記パーセンテージが総捏ね物重量の重量パーセンテージである該ステップと、
c)20〜30℃で8〜24時間発酵させるステップと
を含む、上記方法。 - ステップc)において得られたスターターを乾燥又は凍結させるステップd)をさらに含む、請求項10に記載の方法。
- グルテンフリーの焼き製品の調製方法であって、
a)40〜60%のパーセンテージの請求項9に記載の粉組成物と、醸造用酵母1〜3%を含有する水10〜30%と、塩0.1〜1.2%と、5〜30%の量の請求項10から11までの各項に記載の方法を用いて得ることができる新鮮なスターター種菌、又は乾燥された、酵母添加活性を有さない同様の成分、又は酵母添加活性を有する凍結された成分とを捏ねるステップであって、前記パーセンテージが、捏ね物の総重量に関して重量パーセンテージである該ステップと、
b)30℃で約1〜3時間発酵させるステップと、
c)220℃で50分間調理するステップと
を含む、上記方法。 - 請求項10又は11に記載の方法を用いて得ることができるスターター組成物。
- 請求項12に記載の方法を用いて得ることができる焼き製品。
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