KR101970148B1 - 프로바이오틱 활성을 갖는 신규 락토바실러스 사케이 kr18 균주 및 이를 함유하는 조성물 - Google Patents
프로바이오틱 활성을 갖는 신규 락토바실러스 사케이 kr18 균주 및 이를 함유하는 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 우유단백질 분해능 및 항균활성이 우수하여 프로바이오틱 활성을 갖는 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) KR18 (KCCM 12350P) 및 이를 함유하는 조성물에 관한 것으로, 본 발명에서 선별한 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) KR18 (KCCM 12350P)는 내산성 및 내담즙성이 우수하여 유산균의 장내 생존성을 높여주어 프로바이오틱스 기능성을 향상시킬 수 있고, 우유단백질 및 대두단백질의 커드 형성을 통해 우유 및 두유를 이용한 발효유 제조를 위한 스타터로 사용할 수 있다.
또한, 본 발명의 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) KR18 (KCCM 12350P)는 병원성균에 대하여 우수한 항균특성을 나타내어 생균제로 이용시 유해균의 증식을 억제하여 장내균총을 개선시키는 효과를 발휘할 수 있다.
또한, 본 발명의 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) KR18 (KCCM 12350P)는 우유단백질 분해능이 뛰어나며, 장부착능이 우수한 유산균 프로바이오틱스로서 활용할 수 있다.
또한, 본 발명의 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) KR18 (KCCM 12350P)는 병원성균에 대하여 우수한 항균특성을 나타내어 생균제로 이용시 유해균의 증식을 억제하여 장내균총을 개선시키는 효과를 발휘할 수 있다.
또한, 본 발명의 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) KR18 (KCCM 12350P)는 우유단백질 분해능이 뛰어나며, 장부착능이 우수한 유산균 프로바이오틱스로서 활용할 수 있다.
Description
본 발명은 신규한 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) KR18 (KCCM 12350P)에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 살모넬라(Salmonella)속, 포도상구균(Staphylococcus aureus) 및 대장균(E-coli) 등 병원성 세균에 대한 항균활성과, 우유단백질 분해능이 우수한 프로바이오틱 활성을 갖는 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) KR18 (KCCM 12350P) 및 이를 함유하는 조성물에 관한 것이다.
프로바이오틱스(Probiotics)는 체내에 들어가서 건강에 좋은 효과를 주는 살아있는 균을 말하는 것으로, 정상 장내 세균총의 균형을 유지하고 병원성 세균의 증식을 억제하는데 중요한 역할을 한다. 현재까지 알려진 프로바이오틱스의 대부분은 유산균들이며, 유산균을 비롯한 세균들이 프로바이오틱스로 인정받기 위해서는 위산과 담즙산에서 살아남아 소장까지 도달하여 장에서 증식하고 정착하여야하며 장관내에서 유용한 효과를 나타내어야 하고, 독성이 없으며 비병원성이어야한다는 필요성이 있다.
프로바이오틱스는 유당불내증을 개선하고 콜레스테롤 및 혈압을 낮춰주며, 면역기능 개선, 감염예방 등 다양한 효능을 지니고 있어 소비자들의 관심이 높으며 이에 대한 다양한 연구가 진행되고 있다. 프로바이오틱스 제품들이 유산균을 이용하여 만들어진 발효유 제품으로 섭취되어 왔으며, 최근에는 과립, 분말 등의 형태로도 개발하고 있다. 이에 따라 뛰어난 기능성을 가지고 있으면서, 활용성이 좋은 프로바이오틱스를 개발하는 것이 필요한 실정이다.
본 발명은 병원성균에 대한 항균활성과 우유단백질 분해능이 우수한 균주를 선별하고, 이를 함유하여 프로바이오틱스 활성을 갖는 식품 조성물 및 약학 조성물을 개발하여 제공하고자 한다.
본 발명은 16S rRNA로 서열번호 1에 기재된 염기서열을 포함하는 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei)로서, D-갈락토오스(D-galactose) 및 락토오스(Lactose)에 양성반응을 나타내는 것을 특징으로 하는 유산균을 제공한다.
본 발명의 유산균에 있어서, 상기 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei)는, 바람직하게 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) KR18 (KCCM 12350P)인 것일 수 있다.
본 발명의 유산균에 있어서, 상기 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei)는, 바람직하게 내산성, 내담즙성, 항균활성, 우유단백질 분해능, 장내 부착능 중 선택되는 하나 이상의 성질을 갖는 것일 수 있다.
한편, 본 발명은 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) KR18 (KCCM 12350P)을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 식품 조성물에 있어서, 상기 식품 조성물은, 바람직하게 유산균 발효유, 두유, 분유, 음료 또는 건강보조식품 중 선택되는 어느 하나인 것일 수 있다.
본 발명에서 선별한 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) KR18 (KCCM 12350P)는 내산성 및 내담즙성이 우수하여 유산균의 장내 생존성을 높여주어 프로바이오틱스 기능성을 향상시킬 수 있고, 우유단백질 및 대두단백질의 커드 형성을 통해 우유 및 두유를 이용한 발효유 제조를 위한 스타터로 사용할 수 있다.
또한, 본 발명의 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) KR18 (KCCM 12350P)는 병원성균에 대하여 우수한 항균특성을 나타내어 생균제로 이용시 유해균의 증식을 억제하여 장내균총을 개선시키는 효과를 발휘할 수 있다.
또한, 본 발명의 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) KR18 (KCCM 12350P)는 우유단백질 분해능이 뛰어나며, 장부착능이 우수한 유산균 프로바이오틱스로서 활용할 수 있다.
도 1은 본 발명의 락토바실러스 사케이 KR18(Lactobacillus sakei KR18(KCCM 12350P))의 현미경 관찰 사진 및 락토바실러스 사케이 KR18(Lactobacillus sakei KR18(KCCM 12350P))와 비교 균주 CSLA((Lactobacillus acidophilus CSLA)의 우유단백질 분해능을 나타내는 투명환 생성여부 실험 결과 사진이다.
도 2는 본 발명의 락토바실러스 사케이 KR18(Lactobacillus sakei KR18(KCCM 12350P))의 유전학적 계통수(Phylogenetic tree)를 나타낸 그림이다.
도 3은 본 발명의 락토바실러스 사케이 KR18(Lactobacillus sakei KR18(KCCM 12350P))의 최적생장온도를 확인하기 위해 BCP agar에 35℃와 45℃에서 배양한 결과사진이다.
도 4는 본 발명의 락토바실러스 사케이 KR18(Lactobacillus sakei KR18(KCCM 12350P)) 및 비교 균주 CSLA의 생장률, 생장곡선 및 pH변화를 나타낸 결과표와 결과그래프이다.
도 5는 본 발명의 락토바실러스 사케이 KR18(Lactobacillus sakei KR18(KCCM 12350P))에 대해 API kit를 이용한 당분해 특성을 나타낸 실험 결과 표 및 사진이다.
도 6은 본 발명의 락토바실러스 사케이 KR18(Lactobacillus sakei KR18(KCCM 12350P))와 비교 균주 CSLA의 우유단백질 및 대두단백질의 커드 형성 특성에 대한 실험 결과사진이다.
도 7은 본 발명의 락토바실러스 사케이 KR18(Lactobacillus sakei KR18(KCCM 12350P))와 비교 균주 CSLA의 5개의 병원성 균주에 대한 항균활성 실험 결과 사진이다.
도 8은 본 발명의 락토바실러스 사케이 KR18(Lactobacillus sakei KR18(KCCM 12350P))의 우유단백질 분해력을 측정한 결과표 및 그래프이다. 우유단백질 분해력은 유리되는 티로신(tyrosine) 함량으로 나타내었다.
도 9는 락토바실러스 사케이 KR18(Lactobacillus sakei KR18(KCCM 12350P)) 및 비교균주 L. rhamnosus GG(LGG)의 장내 부착능을 확인한 실험 결과표 및 그래프이다.
도 2는 본 발명의 락토바실러스 사케이 KR18(Lactobacillus sakei KR18(KCCM 12350P))의 유전학적 계통수(Phylogenetic tree)를 나타낸 그림이다.
도 3은 본 발명의 락토바실러스 사케이 KR18(Lactobacillus sakei KR18(KCCM 12350P))의 최적생장온도를 확인하기 위해 BCP agar에 35℃와 45℃에서 배양한 결과사진이다.
도 4는 본 발명의 락토바실러스 사케이 KR18(Lactobacillus sakei KR18(KCCM 12350P)) 및 비교 균주 CSLA의 생장률, 생장곡선 및 pH변화를 나타낸 결과표와 결과그래프이다.
도 5는 본 발명의 락토바실러스 사케이 KR18(Lactobacillus sakei KR18(KCCM 12350P))에 대해 API kit를 이용한 당분해 특성을 나타낸 실험 결과 표 및 사진이다.
도 6은 본 발명의 락토바실러스 사케이 KR18(Lactobacillus sakei KR18(KCCM 12350P))와 비교 균주 CSLA의 우유단백질 및 대두단백질의 커드 형성 특성에 대한 실험 결과사진이다.
도 7은 본 발명의 락토바실러스 사케이 KR18(Lactobacillus sakei KR18(KCCM 12350P))와 비교 균주 CSLA의 5개의 병원성 균주에 대한 항균활성 실험 결과 사진이다.
도 8은 본 발명의 락토바실러스 사케이 KR18(Lactobacillus sakei KR18(KCCM 12350P))의 우유단백질 분해력을 측정한 결과표 및 그래프이다. 우유단백질 분해력은 유리되는 티로신(tyrosine) 함량으로 나타내었다.
도 9는 락토바실러스 사케이 KR18(Lactobacillus sakei KR18(KCCM 12350P)) 및 비교균주 L. rhamnosus GG(LGG)의 장내 부착능을 확인한 실험 결과표 및 그래프이다.
본 발명은 16S rRNA로 서열번호 1에 기재된 염기서열을 포함하는 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei)로서, D-갈락토오스(D-galactose) 및 락토오스(Lactose)에 양성반응을 나타내는 것을 특징으로 하는 유산균을 제공한다.
본 발명에서는 전통방법으로 제조된 발효김치로부터 우수한 유산균을 스크리닝하였으며, 그 중에서 선별된 일부 콜로니에 대하여 페이퍼 디스크 방법(paper disc assay)을 통해 투명환을 생성하는 것을 우유단백질 분해능이 있는 것으로 판단하였고, 생리적, 생화학적 실험 및 항균성 실험을 실시한 결과가 가장 우수한 균주를 선별, 분리하여 본 발명을 완성하였다.
유산균은 글루코오스 등 당류를 분해하여 젖산을 생성하는 세균으로, 젖산균이라고도 하며, 당류를 발효하여 에너지를 획득한다. 대표적인 유산균으로는 락토바실러스속과 스트렙토코쿠스 속 등 여러 종류가 알려져 있으며 유제품(요구르트, 치즈 등), 김치류, 양조식품(청주, 된장, 간장 등)의 식품제조에 이용된다.
본 발명의 유산균에 있어서, 상기 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei)는 바람직하게 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) KR18 (KCCM 12350P)일 수 있다.
본 발명의 유산균에 있어서, 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei)는 바람직하게 내산성, 내담즙성, 항균활성, 우유단백질 분해능, 장내 부착능 중 선택되는 하나 이상의 성질을 갖는 것일 수 있다.
본 발명의 유산균은 하기 실험에 의할 경우, 우유단백질 및 대두단백질의 커드 형성을 관찰함으로써 우유 및 두유를 이용한 발효유 제조를 위한 스타터로 사용 가능성을 확인할 수 있었고, 살모넬라속(Salmonella sp.), 스타필로코쿠스속(Staphylococcus sp.), 바실러스속(Bacillus sp.), 대장균(Escherichia coli) 등의 병원성균에 대하여 우수한 항균특성을 나타내어 생균제로 이용시 유해균의 증식을 억제하여 장내균총을 개선시키는 효과를 발휘할 수 있음을 확인하였다. 또한, 상기 탈지유 함유 배지에서 투명환의 생성을 통해 우유단백질의 분해능을 확인한 바 있으며, 발효공정 중 유리되는 티로신의 함량 측정을 통해 우유단백질 분해능이 뛰어난 것을 확인하였고, 이를 통해 뛰어난 기능성을 가지는 유산균 프로바이오틱스로서 활용할 수 있음을 알 수 있었다.
한편, 본 발명은 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) KR18 (KCCM 12350P)을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 식품 조성물에 있어서, 일 예로, 유산균 발효유, 두유, 분유, 음료 또는 건강보조식품 중 선택되는 어느 하나인 것일 수 있으나, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다.
이하, 본 발명의 내용을 하기 실시예를 통해 더욱 상세히 설명하고자 한다. 다만, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예에만 한정되는 것은 아니고, 그와 등가의 기술적 사상의 변형까지를 포함한다.
[실시예 1: 우유단백질 분해능이 우수한 락토바실러스 사케이 KR18 선발 및 분리동정]
본 실시예에서는 전통 발효 김치로부터 우유단백질 분해능이 우수한 균주를 선발 및 분리동정하고자 하였다.
1) 우유단백질 분해능이 우수한 락토바실러스 사케이 KR18 선발 및 형태적, 생화학적 특성 분석
국내 강원지역에서 전통방법으로 제조된 발효김치로부터 유산균을 분리하였으며, 시료 10g씩을 멸균수에 희석한 후 MRS(Difco Laboratories, Detroit, MI, USA) 고체배지에 백금이로 획선 접종하여 37℃에서 24시간 동안 배양하고, 유백색의 콜로니를 크게 형성하는 균락을 1차적으로 50 colony를 선별하였다. 선별한 콜로니를 다시 BCP Agar에 획선 접종하여 젖산 생성으로 노란색을 형성하는 균락을 유산균으로 판단하고, 이들 중 산생성이 우수한 32 colony를 순수 분리하였다. 추가로 2% 환원탈지유를 혼합한 MRS 평판배지를 만든 후 6mm paper disc를 올려놓은 다음, 상기 분리유산균 액체 배양액을 10㎕씩 적하하고 37℃에서 48시간동안 배양시켜 투명환의 생성여부를 확인하였다. 이때, 투명환을 생성하는 분리균을 우유단백질 분해능이 있는 것으로 잠정 판단하였으며, 비교를 위하여 상업 균주인 CSLA(Lactobacillus acidophilus CSLA)를 실험에 사용하였다. 비교 균주인 CSLA(Lactobacillus acidophilus CSLA)와 투명환 생성여부를 확인한 결과, 도 1과 같이 KR18 균주가 CSLA의 약 8mm보다 큰 약 10mm의 투명환을 형성시키며 우수한 우유단백질 분해 특성을 나타내어 우수균주로 선발하고, 생리적, 생화학적 실험 및 현미경 관찰을 실시하였다.
상기 분리한 균주(KR18)의 형태적, 생화학적 특성을 분석한 결과, 하기 표 1및 도 1과 같았고, 분리한 균주(KR18)는 현미경 관찰을 통해 장간균(rod) 형태를 가지는 것을 확인하였고 그람염색을 통해 그람 양성균임을 확인하였다. 또한, 카탈라아제(Catalase) 시험 결과, 카탈라아제 음성 반응을 나타냈고, 산소유무와 관계없이 잘 증식함을 확인하였다. 따라서, 분리 균주(KR18)는 전형적인 유산균의 특성을 가지고 있음을 알 수 있었다.
| 특성 | 결과 |
| Morphology | rod |
| Gram staining (+/-) | + |
| Catalase test (+/-) | - |
| Aerobic / Anaerobic | +/+ |
2) 우유단백질 분해능이 우수한 락토바실러스 사케이 KR18의 유전학적 동정
상기 분리 균주(KR18)의 정확한 동정을 위하여 16S rRNA gene분석을 통한 유전학적 동정을 실시하였다.
분리 균주(KR18)의 콜로니 샘플의 16S rRNA 증폭을 위해 유산균용 프라이머인 forward primer 27F(5'-aga gtt tga tcc ctc ag-3')와, reverse primer 1492R(5'-ggt tac ctt gtt acg act t-3')을 사용하여 처음 사이클은 95℃에서 15분, 30사이클은 95℃에서 20초, 50℃에서 40초, 72℃에서 1분 30초, 마지막 사이클은 72℃에서 5분, 4℃에서 10분의 조건으로 PCR(Polymerase chain reaction)을 수행한 다음 전기영동으로 증폭된 PCR product의 gene 크기를 확인한 후, NCBI genebank를 통한 시퀀싱 분석 결과를 토대로 유전학적 동정을 실시하였다. 일반 분류학상으로 97% 이상의 염기서열 상동성을 나타내는 균주들의 경우 하나의 종으로 정의할 수 있는데, 분석 결과 하기 표 2와 같이 99%이상의 상동성으로 Lactobacillus sakei로 동정되었다. 동정된 균주(KR18)의 유전학적 계통수(phylogenetic tree)는 도 2와 같이 나타낼 수 있고, 사용한 16S rRNA 염기서열은 하기 표 3과 같이 나타냈다.
| Strain No. | Identification | 16S rRNA | |
| 27F | 1492R | ||
| KR18 | Lactobacillus sakei | 99% | 100% |
| 명칭 | 16S rRNA 염기서열 |
| 동정균주(KR18) | 서열번호 1 |
본 발명의 발명자들은 한국미생물보존센터에 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) KR18 (KCCM 12350P)를 기탁하였다.
[실험예 1 : 신규 락토바실러스 사케이 KR18의 최적 생장온도 및 생장특성 확인 실험]
본 실험예에서는 선별된 분리 균주 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) KR18 (KCCM 12350P)의 최적 생장온도 및 생장특성을 확인하기 위한 실험을 진행하였다.
분리 균주(KR18)의 최적 생장온도를 확인하기 위하여 BCP agar에 스트리킹(streaking)한 후 45℃ 및 35℃에서 24시간동안 배양한 결과 도 3과 같이 45℃에서는 거의 생장이 이루어지지 못하고 35℃에서는 잘 생장하는 것으로 보아 중온균임을 알 수 있었다.
한편, 분리 균주(KR18)의 생장특성을 확인하기 위해 균주의 증식정도를 생균수와 pH 변화로 측정하였다. 비교 균주로 상업균주인 CSLA (L. acidophilus)을 사용하였다. MRS broth에 각 균주를 접종한 후 37℃에서 12시간 동안 배양하면서 2시간 간격으로 시료를 취하고, Spectrophotometer (X-ma 1200, Human corporation)로 660 nm에서의 흡광도를 측정하여 생육곡선을 작성하였으며, pH의 변화는 pH meter(Orion 3 Star, Thermo Scientific)를 이용하여 측정하였다.
실험결과, 도 4와 같이 균주의 생육은 배양 6시간에서 10시간 사이에 대수증식기를 보였으며, 10시간 이후에는 완만한 증가세로 정체기에 접어들고 있음을 확인할 수 있었다. 분리 균주(KR18)와 대조균(CSLA)의 생장 형태는 유사한 경향을 보여 분리 균주(KR18)가 대조군인 상업균주 CSLA와 같이 우수한 생장능력이 있음을 알 수 있었다. 또한, pH의 변화는 분리균과 대조균이 생균수의 증식곡선에 비례하여 6시간에서 10시간 사이에 급격한 저하를 보였고, 이때 pH4.5수준으로 발효유 제조에 적용할 수 있음을 확인할 수 있었다.
[실험예 2 : 신규 락토바실러스 사케이 KR18의 내산성 및 내담즙성 확인 실험]
본 실험예에서는 선별된 분리 균주 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) KR18 (KCCM 12350P)의 내산성 및 내담즙성을 확인하기 위하여 배양실험을 진행하였다.
먼저 내산성 확인을 위해 분리 균주(KR18)를 MRS broth에 접종하여 37℃에서 24시간 배양한 배양액을 1N-HCl로 보정하여 만든 pH3.0 MRS broth에 각각 2%씩 접종하여 37℃에서 3시간 배양방법으로 테스트하였다. 배양된 샘플을 멸균수에 십진 희석하고 1ml 채취하여 MRS agar에 접종한 다음, 37℃에서 24시간 배양하여 생성된 콜로니를 계수하고, 초기 균수와 배양 후의 균수를 비교하여 산성 pH에 대한 내성을 확인하였다. 그 결과, 하기 표 4와 같이 초기균수 대비 60.1%의 생존률을 보였으며, 이는 일반적으로 pH 2.5-3.5에서 90%이상의 내산성으로 보이는 것으로 알려진 L. acidophilus 균종보다는 낮은 수준이었지만 50%이상으로 양호한 내산성을 보이는 것을 확인하였다. 일반적인 발효유는 pH4.0 이상인 것을 고려할 때 분리 균주(KR18)는 발효유 스타터로 사용이 적합한 것으로 판단되었다.
다음으로, 내담즙성 확인을 위해 분리 균주(KR18)를 MRS broth에 접종하여 37℃에서 24시간 배양한 배양액을 0.3% oxgall bile salt를 첨가한 MRS broth에 각각 2%씩 접종하여 37℃에서 6시간 배양방법으로 테스트 하였다. 배양된 샘플을 멸균수에 십진 희석하고 1ml 채취하여 MRS agar에 접종한 다음, 37℃에서 24시간 배양하여 생성된 콜로니를 계수하고, 초기 균수와 배양 후의 균수를 비교하여 산성 pH에 대한 내성을 확인하였다. 그 결과, 하기 표 4와 같이 Bile extract 0.3% 첨가구에서 6시간 동안 배양시 초기균수 대비 226.9%의 생균수를 나타냈다. 이는 Bile extract 0.3% 농도에서는 분리 균주(KR18)의 생장이 억제되지 않고 일정비율로 증식이 가능하였음을 보여주는 것으로 매우 우수한 내담즙성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다. 이를 통해 분리 균주(KR18)는 발효유 제조용으로 사용시 유산균의 장내 생존성을 높여주어 프로바이오틱스 기능성을 향상시켜줄 수 있을 것으로 판단되었다.
| 시료 | 내산성(pH3.0/3hr) | 내담즙성(bile salt 0.3%/6hr) |
| L. sakei KR18 | 60.1% | 226.9% |
[실험예 3 : 신규 락토바실러스 사케이 KR18의 당분해 특성 확인 실험]
본 실험예에서는 선별된 분리 균주 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) KR18 (KCCM 12350P)의 당분해 특성을 확인하기 위해 API kit을 이용하여 49개의 당이용성 패턴 분석 및 동정을 실시하였다.
생화학적 패턴을 알아보기 위해 각 분리 균주(KR18)를 MRS agar에 접종하여 37℃에서 24시간 동안 배양한 다음 형성된 콜로니를 무균적으로 취하여 API 50 CHL medium(Bio Meriex Co., Lyon, France)에 현탁하고, 이 현탁액을 API 50 CH strip에 분주하여 37℃에서 48시간 동안 배양한 후 각각의 당이용 패턴을 확인하였다. 스트립의 판독은 각 튜브의 색변화로 negative(-), positive(+)등으로 판정하였으며, API 50 CHL database를 이용하여 동정하였다. 그 결과, 도 5와 같이, 분리 균주(KR18)는 D-갈락토오스(D-galactose) 및 락토오스(Lactose)에서 양성 반응을 나타내는 것을 확인할 수 있었다.
[실험예 4 : 신규 락토바실러스 사케이 KR18의 발효유 우유단백질 및 대두단백질의 커드형성 특성 확인 실험]
본 실험예에서는 선별된 분리 균주 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) KR18 (KCCM 12350P)의 발효유 우유단백질 및 대두단백질의 커드형성 특성을 확인하기 위한 실험을 진행하였다.
분리 균주(KR18)는 MRS broth에서 37℃로 24시간 동안 배양한 다음 85℃로 10분간 살균한 유고형분 함량 10%(w/w) 탈지유 및 고형분 8%(w/w)의 대두유에 1%씩 접종하였다. 대조구로서 상업균주인 CSLA (L. acidophilus)를 MRS broth에 12시간 동안 배양한 후 유사한 방법으로 1%를 접종하였다. 이것을 37℃에서 12시간 동안 배양하여 커드의 형성정도를 관찰하고 발효유 제조용 starter로서의 사용 가능성을 판단하였다.
배양결과는 하기 표 5 및 도 6과 같았고, 대두단백질은 배양 후 5시간부터 커드형성이 시작되었으며, 우유단백질은 8시간 이후부터 커드형성이 관찰되었다. CSLA(상업균주)보다 분리 균주(KR18)가 다소 느린 산생성을 보였으나, 배양 12시간에는 전체적으로 유사한 수준의 커드 형성을 보였으며, 이를 통해 우유 및 두유를 이용한 발효유 제조를 위한 스타터로 사용 가능성을 확인하였다.
| 구분 | 10% 탈지유 | 대두유(TS 8%) | ||
| CSLA | KR18 | CSLA | KR18 | |
| 커드형성 | O | O | O | O |
| pH | 3.92 | 4.32 | 3.68 | 3.67 |
| 산도(%) | 0.94 | 0.74 | 0.50 | 0.55 |
[실험예 5 : 신규 락토바실러스 사케이 KR18의 항균활성 확인 실험]
본 실험예에서는 선별된 분리 균주 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) KR18 (KCCM 12350P)의 항균 활성을 확인하기 위한 실험을 진행하였다.
분리 균주(KR18)의 항균활성 테스트는 Paper disk agar diffusion method을 이용하여 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella typhimurium), 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes), 황색포도상구균(Staphylococcus aureus), 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 대장균(Escherichia coli) 등의 병원성 미생물을 각각 tryptic soy broth(Oxoid, UK)에 접종한 뒤 37℃에서 24시간 배양하여 피검균주로 사용하였다. 분리 유산균 배양액은 MRS broth에 분리균주를 접종하여 37℃에서 12시간동안 전배양한 다음 샘플로 사용하였으며, 비교 유산균으로 상업균주 CSLA(Lactobacillus acidophilus CSLA)를 동일한 방법으로 전배양하여 사용해 비교하였다. 각 피검 균주를 tryptic soy soft agar에 접종하여 미리 만들어 둔 tryptic soy agar plate에 부어 30분간 굳힌 다음, 멸균한 paper disk를 올려 각 유산균 배양액 샘플 50㎕를 적가하고, 37℃에서 24시간 동안 배양한 후 저해환(clear zone)의 형성 여부를 확인하였다. 저해환의 형성은 5개 병원성 세균에 대하여 모두 저해환을 형성하였으며, +는 10mm이상으로 저해환이 크게 있는 것이며, w는 저해환이 10mm미만으로 비교적 작은 경우를 의미한다.
실험 결과, 도 7과 같이 분리 균주(KR18)는 시험한 5개 모두의 병원성 균주에 대해 항균력을 나타내었고, 리스테리아를 제외한 다른 4종의 병원성균에 대하여 CSLA보다 우수한 항균특성을 보였다. 일반적으로 유산균은 젖산을 생성하여 산도를 낮춤으로써 병원성 세균의 생육을 억제하며, 박테리오신(bacteriocin) 등의 항균물질을 생성하여 항균작용을 나타내는 것으로 알려져 있다. 따라서 항균 활성이 우수한 분리 균주(KR18)는 생균제로 이용시 유해균의 증식을 억제하여 장내균총을 개선시키는 효과를 기대할 수 있을 것으로 판단된다.
[실험예 6 : 신규 락토바실러스 사케이 KR18의 우유단백질 분해력(유리 티로신 함량) 확인 실험]
본 실험예에서는 선별된 분리 균주 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) KR18 (KCCM 12350P)의 우유단백질 분해력을 발효중 생성되는 유리 티로신 함량을 통해 확인하기 위한 실험을 진행하였다.
분리 균주(KR18)의 우유단백질 분해력 측정은 10% 환원탈지유를 배지로 사용하였으며, 유리되는 티로신(tyrosine) 함량으로 나타내었다. 살균된 환원탈지유 배지에 계대배양된 분리균주 1%를 접종한 후 37℃에서 24시간 동안 배양하면서 4시간 단위로 시료를 취하하여 분석하였다. 시료를 whatman(No. 2) 여과지로 여과한 후 여과액 5 mL에 0.44 M trichlroacetic acid(TCA) 동량을 가해 침전시켜 상등액을 사용하였다. 30분간 방치 후 whatman(No. 42) 여과지로 여과하여 여과액 1 mL와 0.44 M의 탄산나트륨(Na2CO3) 2.5 mL를 혼합한 후 1 N folin시약 200 μL를 가하여 5분 동안 잘 흔들어 청색을 발색시켰다. 발색시킨 시료를 Spectrophotometer (X-ma 1200)로 540 nm에서의 흡광도를 측정하였으며, 측정값을 준비해 둔 tyrosine standard의 값으로 환산하여 유리된 tyrosine양을 ㎍/㎖로 표시하였다.
10% 환원탈지유 배지를 이용하여 분리 균주(KR18)를 37℃에서 24시간동안 배양하면서 유리된 티로신 함량을 측정한 결과 도 8과 같이 배양 8시간에서 16시간 사이에 가장 높은 분해활성을 보였으며, 상기 paper disc assay에서의 결과와 같은 우수한 우유단백질의 분해능을 나타내는 것을 확인할 수 있었다.
[실험예 7 : 신규 락토바실러스 장세포 부착능 확인 실험]
본 실험예에서는 선별된 분리 균주 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) KR18 (KCCM 12350P)의 장세포 부착능을 확인하기 위한 실험을 진행하였다.
장세포 부착능은 프로바이오틱스로써 숙주의 장내 환경에 대한 적합성을 판단하는 대표적인 실험으로 간주된다. 실험을 위해 인체의 소장 상피세포와 유사한 형태로 증식되는 Caco-2 cell line을 사용하였고, 일반적으로 L. rhamnosus GG (LGG; Valio Ltd, Finland)와 같은 상업균주와 비교하여 유산균주의 장내적합성을 판단·선별해오고 있으므로, 본 실험에서도 LGG 균주를 대조군으로 하여 상대적 부착능을 확인하였다,
먼저 Caco-2 cell line 배양액을 37℃ 5% CO2 환경에서 배양하였다. 부착도 측정을 위해 39번째와 41번째 분열기 사이의 Caco-2 cell line이 사용되었다. caco-2 cell 들은 5 X 102 ml 농도로 12개의 세포배양 플레이트 웰에 로딩후 72시간 동안 배양하여 80%가 채워진 단일세포층을 형성하였다. 부착도 측정 전에 Caco-2cell을 항생제가 없는 MEM 배지에서 2시간 동안 배양하고, 이 배양액을 0.5ml의 측정 대상 유산균이 담긴 동일 부피 PBS 용액와 혼합하여 최종 세균 농도가 2 X 108CFU/ml이 되도록 하였다. 다음으로 용액을 각 조직배양 플레이트 웰에 첨가하고 37℃ 5% CO2 환경에서 2시간 동안 배양하였다. 그 이후 단일세포층을 멸균한 PBS(pH7.2) 용액으로 2번 세척하고, 10% 포르말린 용액으로 고정시킨 다음 크리스탈 바이올렛으로 염색하고 현미경하에서 관찰하였으며, 장부착률(%) = (viable cell count ÷ initial cell count) x 100로 확인하였다.
실험 결과, 도 9와 같이 LGG의 장세포 부착능을 1.0으로 보았을 때 분리균주(KR18)는 0.7798을 보여 비교적 낮은 수준을 보였지만 상업균주 대비 77%이상 수준의 우수한 장부착능을 확인할 수 있었다.
상기와 같은 결과를 종합해볼 때, 신규한 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) KR18 (KCCM 12350P)는 내산성 및 내담즙성이 우수하여 유산균의 장내 생존성을 높여주어 프로바이오틱스 기능성을 향상시키는 효과를 발휘할 수 있고, D-galactose 및 Lactose에 당분해 특성이 있으며, 우유단백질 및 대두단백질의 커드 형성을 관찰함으로써 우유 및 두유를 이용한 발효유 제조를 위한 스타터로 사용 가능성을 확인할 수 있었다.
한편, 본 발명의 균주는 병원성균에 대하여 우수한 항균특성을 나타내어 생균제로 이용시 유해균의 증식을 억제하여 장내균총을 개선시키는 효과를 발휘할 수 있음을 확인하였다. 또한, 유리되는 티로신의 함량이 높은 것을 통해 우유단백질 분해능이 뛰어나며, 장부착능이 우수한 유산균 프로바이오틱스로서 활용할 수 있음을 알 수 있다.
본 발명의 발명자들은 한국미생물보존센터에 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) KR18 (KCCM 12350P)를 기탁하였다.
기탁기관명 : 한국미생물보존센터(국외)
수탁번호 : KCCM12350P
수탁일자 : 20181029
<110> seoulfnb
<120> Novel Lactobacillus sakei KR18 with probiotic activities
<130> YP-18-238
<160> 1
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 1433
<212> RNA
<213> Lactobacillus sake
<400> 1
actctcgttt agattgaagg agcttgctcc tgattgataa acatttgagt gagtggcgga 60
cgggtgagta acacgtgggt aacctgccct aaagtggggg ataacatttg gaaacagatg 120
ctaataccgc ataaaaccta acaccgcatg gtgtagggtt gaaagatggt ttcggctatc 180
actttaggat ggacccgcgg tgcattagtt agttggtgag gtaaaggctc accaagaccg 240
tgatgcatag ccgacctgag agggtaatcg gccacactgg gactgagaca cggcccagac 300
tcctacggga ggcagcagta gggaatcttc cacaatggac gaaagtctga tggagcaacg 360
ccgcgtgagt gaagaaggtt ttcggatcgt aaaactctgt tgttggagaa gaatgtatct 420
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agcagccgcg gtaatacgta ggtggcaagc gttgtccgga tttattgggc gtaaagcgag 540
cgcaggcggt ttcttaagtc tgatgtgaaa gccttcggct caaccgaaga agtgcatcgg 600
aaactgggaa acttgagtgc agaagaggac agtggaactc catgtgtagc ggtgaaatgc 660
gtagatatat ggaagaacac cagtggcgaa ggcggctgtc tggtctgtaa ctgacgctga 720
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ccgcctgggg agtacgaccg caaggttgaa actcaaagga attgacgggg gcccgcacaa 900
gcggtggagc atgtggttta attcgaagca acgcgaagaa ccttaccagg tcttgacatc 960
ctttgaccac tctagagata gagctttccc ttcggggaca aagtgacagg tggtgcatgg 1020
ttgtcgtcag ctcgtgtcgt gagatgttgg gttaagtccc gcaacgagcg caacccttat 1080
tactagttgc cagcatttag ttgggcactc tagtgagact gccggtgaca aaccggagga 1140
aggtggggac gacgtcaaat catcatgccc cttatgacct gggctacaca cgtgctacaa 1200
tggatggtac aacgagttgc gagaccgcga ggtttagcta atctcttaaa accattctca 1260
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ttgtaacacc caaagccggt gaggtaaccc ttcggggagc cagccgtcta agg 1433
Claims (5)
16S rRNA로 서열번호 1에 기재된 염기서열을 포함하는 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei)로서, D-갈락토오스(D-galactose) 및 락토오스(Lactose)에 양성반응을 나타내는 것을 특징으로 하는 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) KR18 (KCCM 12350P).
삭제
제1항에 있어서,
상기 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei)는,
내산성, 내담즙성, 항균활성, 우유단백질 분해능, 장내 부착능 중 선택되는 하나 이상의 성질을 갖는 것을 특징으로 하는 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) KR18 (KCCM 12350P).
상기 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei)는,
내산성, 내담즙성, 항균활성, 우유단백질 분해능, 장내 부착능 중 선택되는 하나 이상의 성질을 갖는 것을 특징으로 하는 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) KR18 (KCCM 12350P).
락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) KR18 (KCCM 12350P)을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 식품 조성물.
제4항에 있어서,
상기 식품 조성물은,
유산균 발효유, 두유, 분유 또는 건강보조식품 중 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 식품 조성물.
상기 식품 조성물은,
유산균 발효유, 두유, 분유 또는 건강보조식품 중 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 식품 조성물.
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| KR1020180148617A KR101970148B1 (ko) | 2018-11-27 | 2018-11-27 | 프로바이오틱 활성을 갖는 신규 락토바실러스 사케이 kr18 균주 및 이를 함유하는 조성물 |
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|---|---|---|---|---|
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2018
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| WO2021075928A1 (ko) | 2019-10-18 | 2021-04-22 | 주식회사 지놈앤컴퍼니 | 비피도박테리움 비피덤을 포함하는 면역력 증강 또는 개선용 조성물 |
| KR20210046498A (ko) | 2019-10-18 | 2021-04-28 | 주식회사 지놈앤컴퍼니 | 비피도박테리움 비피덤을 포함하는 면역력 증강 또는 개선용 조성물 |
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