JP2022544085A - プシコース3-エピメラーゼミュータント、それを発現するための遺伝子工学菌、その固定化酵素及び固定化方法 - Google Patents
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Abstract
Description
(1)変異体ライブラリーを確立し、菌株の構築、培養、分離を実施する工程と、
(2)フルクトースを入れ、反応を実施する工程と、
(3)リビトールデヒドロゲナーゼ(KRDH)及びコエンザイムNADHを入れ、2回目反応を実施して、反応液を得る工程と、
(4)340 nmで反応液の吸光度変化を測定して、高触媒活性のミュータントを選択する工程と、を含む。
(1)マクロポーラス樹脂をpH 7.5-8.0のリン酸カリウム緩衝液に置いて活性化させる樹脂活性化工程と、
(2)プシコース3-エピメラーゼ、及び/又はそのミュータント、及び/又は修飾酵素を異種発現するための遺伝子工学菌の発酵により酵素液を製造し、好ましくは、前記遺伝子工学菌が大腸菌又は枯草菌、或いは上記第3様態に係る遺伝子工学菌であってもよい、酵素製造工程と、
(3)活性化された樹脂をプシコース3-エピメラーゼ、及び/又はそのミュータント、及び/又は修飾酵素の酵素液に入れて固定化させ、好ましくは、固定化温度が20-40 ℃であり、固定化時間が12-24 hである、固定化工程と、
(4)0.2-0.5 %濃度のグルタルアルデヒド溶液を用いて固定化酵素を架橋し、洗浄及び水切りしてから、プシコース3-エピメラーゼ固定化酵素を得る架橋工程と、を含む。
(1)マクロポーラス樹脂を緩衝液に置いて活性化させる樹脂活性化工程と、
(2)上記プシコース3-エピメラーゼミュータントを発現するための遺伝子工学菌の発酵により酵素液を製造する酵素製造工程と、
(3)活性化された樹脂をプシコース3-エピメラーゼミュータントの酵素液に入れて固定化させる固定化工程と、
(4)架橋剤を用いて固定化酵素を架橋し、プシコース3-エピメラーゼ固定化酵素を得る架橋工程と、を含む。
まず、大腸菌発現RDPEは細胞内酵素であるため、菌細胞を破砕した。破砕上澄みを粗酵素液として、基質を入れて反応させた。効率を向上させるために、全細胞反応の方法により触媒反応を実施した。また、本発明の発明者は、RDPE遺伝子がE. coli BL21宿主細胞においてある程度のバックグラウンド発現を示し、IPTGを加えず、タンパク質発現量が酵素活性の測定条件に満たしたため、IPTG添加による誘導工程が省略できることを発見した。
ルミノコッカス由来のプシコースエピメラーゼ(RDPE)、並びにGenbankデータベースにより報告されたプシコースエピメラーゼ及びタガトースエピメラーゼのアミノ酸配列に対して相同性対照分析を実施した。また、RDPEの構造を予測した。Swiss-Model、Phyre2、Discovery Studioなどのソフトを用いて当該酵素野生型タンパク質に対してホモロジーモデリングを実施すると共に、フルクトース分子を基質として分子ドッキングを実施することで、野生型酵素の触媒部位及び基質結合部位を予測し、これらの部位の近傍にあるアミノ酸残基の働きを分析して、RDPEミュータントのアミノ酸配列を設計した。上記分析により、配列番号1に対応するS36、G38、Y44、L110、D117、F122、F157、C165、D194、I196、L207、G215、V244、Q251、I265を突然変異部位として選定して飽和突然変異を実施し、単一部位飽和突然変異ライブラリーを確立した。
〔実施例3 部位特異的飽和突然変異及び組合せ突然変異によるRDPE安定性の向上〕
RDPEシングルミュータント、ダブルミュータント及びトリプルミュータントから相対酵素活性150 %以上のミュータント(I196F、F157Y/C165A、F157Y/I265L、F157Y/C165A/I196F、F157Y/C165A/Q251T)を選択して、熱的安定性を測定した。具体的な測定方法は下記の通りである。60 ℃においてRDPEミュータントを30、60、120、240 min熱処理してから、フルクトースを基質として酵素活性を測定した。熱処理していない各ミュータント酵素活性を100 %と定義して、熱処理後の残留酵素活性を算出した。結果は表4に示される。選定された5つのミュータントは野生型より熱的安定性がある程度に向上し、トリプルミュータントF157Y/C165A/I196Fは熱的安定性が最も顕著に向上した。
上記実施例に係るRDPEミュータントの発現が全て大腸菌E. coli BL21において行われた。初期実験でRDPE野生型の大腸菌における発現により封入体が形成されるため、発現誘導は低温低回転数(20 ℃、100 rpm)で行われた。実験によれば、異なる部位における突然変異が当該タンパク質の封入体の生成量に明らかに影響を与えた。S36N、F157Y、Y44A/F157Y、F157Y/C165A、F157Y/I265L、F157Y/C165A/I196F、F157Y/C165A/Q251Tミュータントは野生型より封入体の生成量が低下したが、その他のミュータントは野生型より生成量が向上した。封入体の生成量を定量するために、超音波破砕後の懸濁液を水で適切に希釈させてから、600 nmにおいて吸光度を測定した。RDPE野生型の600 nmにおける吸光度を1とし、各ミュータントの吸光度相対値を算出して、濁度を、封入体の生成量を評価するための定量指標とする。図3は封入体の生成量が減少した各ミュータントの吸光度相対値を示す。トリプルミュータントF157Y/C165A/I196Fが大腸菌において発現する場合、封入体の生成量が顕著に低下したため、可溶性タンパク質のレベルが向上した。更に当該ミュータントの発現誘導温度を25 ℃に上昇させてみたが、封入体の生成量が依然として少ない。封入体が減少することで、活性を有する可溶様態であるタンパク質発現がより多くなり、大腸菌の発酵によるRDPE酵素の製造効率及び産出量が向上されることから、良好な適用見通しを有する。
RDPEが枯草菌において分泌発現することができるため、更にミュータントF157Y/C165A、F157Y/I265L、F157Y/C165A/I196F、F157Y/C165A/Q251Tの枯草菌における分泌発現レベルを分析した。pMA5をベクターとし、B. subtilis 168を宿主菌とし、RDPE野生型及びミュータントの発現遺伝子工学菌株B-0、B-1、B-2、B-3、B-4を構築し、SR培地で48 h培養して、発酵液に分泌されたRDPEの酵素活性を測定した。結果は表5に示される。選択されたRDPEミュータントは野生型より枯草菌における分泌発現量が顕著に向上した。
RDPE野生型及びミュータントF157Y/C165A/I196Fの異なる温度(30、40、50、60、70、80 ℃)における酵素活性を測定し、最高酵素活性を100 %とし、相対酵素活性を算出して、温度の酵素活性に対する影響を検討した。図4に示される。ミュータントF157Y/C165A/I196Fは最適温度が60 ℃から70 ℃に上昇し、かつ80 ℃においても65 %以上の相対酵素活性を有するが、野生型は80 ℃において相対酵素活性が僅か約30 %程度である。
RDPEミュータントF157Y/C165A/I196Fの枯草菌における分泌発現量を更に向上させるために、構成的発現プロモーターP43を含有する枯草菌発現ベクターpNWP43Nを用いて、枯草菌168を宿主菌とし、RDPEミュータントF157Y/C165A/I196Fの発現遺伝子工学菌株B-3-1を構築した。具体的な方法は下記の通りである。PCRによりRDPEミュータントF157Y/C165A/I196Fの遺伝子フラグメントを増幅させて、ダイジェストによりベクターに連結される。連結生成物をB. subtilis 168コンピテンスに入れて十分に混ぜ、37 ℃、200 rpmで1.5 h回復させ、混合液をすべて取り、クロラムフェニコール(25 μg/mL)を含有するLBプレートに塗布し、コロニーPCRにより検証して、枯草菌分泌遺伝子工学菌株B-3-1を得た。
遺伝子工学菌株B-3-1を5L規模の発酵シリンダーにより発酵させ、発酵条件を最適化し、SR培地を用いて、37 ℃、300 rpm条件で48 h培養し、発酵液におけるRDPE活性を測定し、結果が1436 U/mLとなった。当該結果によれば、本発明に係るミュータントプラスミドの安定性が大幅に向上されることで、異種タンパク質RDPEの分泌発現量が向上された。また、SDS-PAGEにより培地に分泌されたRDPEミュータントを測定した結果(図5)、標的タンパク質が発酵培地に大量に分泌発現され、かつ宿主タンパク質異物が少ない。
200 g樹脂(ES-1、ES-103、ES-108、ESR-1、ESR-2又はESQ-1)を量って、2 L PBS緩衝液(リン酸水素二カリウム22.8 g、リン酸二水素カリウム2.75 g、1000 mLに定容し、約pH 7.5)に入れて活性化させ、適切に約2 h攪拌した後に、濾過により活性化樹脂を得た。
プシコース3-エピメラーゼの固定化効率を更に向上させ、酵素と樹脂ベクターとの結合力を強化させるために、プシコース3-エピメラーゼのカルボキシ基末端にAKAKAKAKAKラベルを加えた(即ち、修飾酵素)。ラベルにおけるアルカリ性アミノ酸(リシン)側鎖にあるアミノ基により酵素と樹脂におけるエポキシ基との結合部位が増加されることで、固定化効率が向上された。実験結果によれば、ラベルを加えていないプシコース3-エピメラーゼとES-108樹脂との固定化効率は74.7 %であるが、AKAKAKAKAKラベルを加えたプシコース3-エピメラーゼとES-108樹脂との固定化効率は100 %である。実験結果によれば、ラベルを加えたプシコース3-エピメラーゼの酵素比活性が明らかな変化を示していない。
バッチ反応により固定化酵素の繰返し使用回数を測定し、50 %(w/v)フルクトース溶液を基質とし、実施例10に係るカルボキシ基末端にAKAKAKAKAKラベルを加えた修飾酵素固定化酵素を入れて、酵素添加量10 %(w/w)、反応温度55 ℃で2 h反応させた後に、サンプリングして変換率を測定した。その後、濾過により固定化酵素を得て、新しく調製した50 %(w/v)フルクトース溶液に入れて、2回目反応を実施し、2 h反応させた後、サンプリングして変換率を測定した。50回以上反応させるように、上記工程を繰り返す。結果は図7に示される。現在の酵素添加量ではプシコース3-エピメラーゼ固定化酵素による触媒作用により2 h以内に当該エピメリ化反応を平衡になるようにすることができ、変換率が約30 %である。また、反応系にMn2+を入れることで、プシコース3-エピメラーゼ固定化酵素の安定性が大幅に向上される。50回繰り返して反応させた後、フルクトースからプシコースへの変換率が28-29 %になる。
当該実施例は、反応変換率が更に向上され、反応時間が短縮されるように、実施例11を基に調整した。
当該実施例は、酵素添加量が削減され、固定化酵素繰返し使用率が向上されることで、コストが削減されるように、実施例11を基に調整した。
当該実施例は、反応温度が低下されることで、固定化酵素繰返し使用率が更に向上され、反応エネルギー消耗量が削減されるように、実施例13を基に調整した。
実施例10に係るカルボキシ基末端にAKAKAKAKAKラベルを加えた修飾酵素固定化酵素が保温ジャケット付きのカラム(φ26×200)に充填されることで、固定化酵素反応器とする。反応条件及びパラメータを最適化した結果、保温ジャケットの温度が50 ℃に制御され、70 %(w/v)フルクトース溶液(1 mM Mn2+含有)が2.5 ml/minの流速で当該固定化反応器を通過する場合、反応器流出液におけるプシコースとフルクトースの比率が基本的に平衡になる。平衡変換率が28-29 %であり、当該固定化反応器の半減期が100日以上である。
適切な固定化樹脂を選定し、実施例7で構築された枯草菌分泌遺伝子工学菌株B-3-1の発酵により製造されたRDPEミュータント粗酵素液をそのまま固定化させた。
Claims (14)
- ミュータントがD-フルクトースのエピ異性体であるD-プシコースに対する触媒活性を有し、そのアミノ酸配列が、配列番号1(SEQ ID NO.1)に対応するS36、Y44、D117、F157、C165、I196、Q251、I265の少なくとも1つの部位におけるアミノ酸残基の突然変異に含まれ、
好ましくは、前記ミュータントは配列番号1に示されるアミノ酸配列と、70 %以上の相同性(ホモロジー)を有し、例えば80 %以上の相同性を有し、更に例えば90 %以上、95 %以上、98 %以上の相同性を有し、
好ましくは、前記ミュータントのアミノ酸配列がS36、Y44、D117、F157、C165、I196、Q251、I265の何れか2つの部位におけるアミノ酸残基の突然変異を含み、
好ましくは、前記ミュータントの少なくとも1つの突然変異部位がF157、C165、Q251、I265の何れか1つであり、
好ましくは、前記ミュータントのアミノ酸配列の1つの突然変異部位がF157部位であり、もう1つの突然変異部位がC165、Q251、I265の何れか1つであり、
好ましくは、前記ミュータントがY44/F157、Y44/I196、D117/I196、F157/C165A、F157/Q251、F157/I265、又はI196/Q251の何れか2つの部位における突然変異を含み、
好ましくは、そのアミノ酸配列がS36、Y44、D117、F157、C165、I196、Q251、I265の何れか3つ部位におけるアミノ酸残基の突然変異を含み、
好ましくは、前記ミュータントがF157/C165部位における突然変異、及びS36、Y44、D117、I196、Q251、I265の何れか1つ部位における突然変異を含み、
好ましくは、前記ミュータントがF157/C165/I196部位における突然変異を含み、又は 前記ミュータントがF157/C165/Q251部位における突然変異を含み、
更に好ましくは、前記S36、Y44、D117、F157、C165、I196、Q251、I265の少なくとも1つの部位におけるアミノ酸残基の突然変異が、S36N、Y44A、D117H、F157Y、C165A、I196F、Q251T、I265Lの少なくとも1つの部位における残基の置換から選ばれ、
更に好ましくは、前記ミュータントのアミノ酸配列がY44A/F157Y、Y44A/I196F、D117H/I196F、F157Y/C165A、F157Y/Q251T、F157Y/I265L、I196F/Q251Tの何れか1種の突然変異部位の組合せを含み、
更に好ましくは、前記ミュータントのアミノ酸配列がF157Y/C165A/S36N、F157Y/C165A/Y44A、F157Y/C165A/D117H、F157Y/C165A/I196F、F157Y/C165A/Q251T、F157Y/C165A/I265Lの何れか1種の突然変異部位の組合せを含むことを特徴とする、プシコース3-エピメラーゼミュータント。 - 請求項1に記載のプシコース3-エピメラーゼミュータントをコードする核酸。
- 請求項1に記載のプシコース3-エピメラーゼミュータントをコードする核酸を含み、
好ましくは、前記遺伝子工学菌が、前記核酸をベクターに連結して組換えベクターを得た後、更に宿主菌に導入して得た組換え菌株であり、
好ましくは、前記宿主菌が、大腸菌、枯草菌、コリネバクテリウムグルタミクム、乳酸菌又は酵母の何れか1種であり、例えば、B. subtilis 168、WB600、WB800、WB800N、1A751、FZB24、又はSCK6枯草菌の何れか1種から選ばれ、或いは、E. coli BL21(DE3)、BL21(DE3)pLysS、Rosetta(DE3)、EndoToxin-Free BL21(DE3)、BL21 trxB(DE3)、JM109大腸菌の何れか1種から選ばれ、
好ましくは、前記ベクターがrepB枯草菌レプリコンを持つベクター、例えば、pHP13-43、pHT43、pHT304、pMK3、pMK4、pHCMC04、pHCMC05、pMA5、pHY300PLK、pYH-P43の何れか1種から選ばれ、
好ましくは、前記ベクターが、構成的発現プロモーターP43が含まれる枯草菌発現ベクターpNWP43Nから選ばれ、
好ましくは、前記遺伝子工学菌がプシコース3-エピメラーゼミュータントを発現することを特徴とする、プシコース3-エピメラーゼミュータントを発現するための遺伝子工学菌。 - 前記核酸をベクターに連結して組換えベクターを得た後、更に宿主菌に導入して組換え菌株を得る工程、を含むことを特徴とする、請求項3に記載の遺伝子工学菌の構築方法。
- 請求項3に記載の遺伝子工学菌のプシコース3-エピメラーゼミュータント製造における適用。
- 請求項3に記載の遺伝子工学菌を培養して、前記プシコース3-エピメラーゼミュータントをコードする核酸を発現させる工程、を含み、
好ましくは、前記培養の温度が35-40 ℃であり、培養時間が24-72 hであり、
好ましくは、前記培養が攪拌又は振動の下で行われ、例えば、攪拌回転数が100-1000 rpmであり、
好ましくは、前記製造方法が、培養物からプシコース3-エピメラーゼミュータントを分離する工程、を更に含むことを特徴とする、プシコース3-エピメラーゼミュータントの製造方法。 - 請求項1に記載のプシコース3-エピメラーゼミュータントをフルクトースに接触させて触媒反応を実施する工程、を含み、
好ましくは、前記触媒反応の温度が40-80 ℃であり、
好ましくは、前記反応系において、フルクトースの質量体積濃度が20-80 %であり、
好ましくは、前記D-プシコースの製造方法が、培地にフルクトースを入れ、前記プシコース3-エピメラーゼミュータントを発現するための遺伝子工学菌を培養し、培養物からD-プシコースを分離する工程、を含み、
好ましくは、前記D-プシコースの製造方法が、遺伝子工学菌を培養し、前記プシコース3-エピメラーゼミュータントをコードする核酸を発現させる工程と、培養物からプシコース3-エピメラーゼミュータントを分離する工程と、フルクトースに分離により得られたプシコース3-エピメラーゼミュータントを入れ、触媒反応を実施して、D-プシコースを得る工程と、を含むことを特徴とする、D-プシコースの製造方法。 - (1)変異体ライブラリーを確立し、菌株の構築、培養、分離を実施する工程と、
(2)フルクトースを入れ、反応を実施する工程と、
(3)リビトールデヒドロゲナーゼ(KRDH)及びコエンザイムNADHを入れ、2回目反応を実施して、反応液を得る工程と、
(4)340 nmで反応液の吸光度変化を測定して、高触媒活性のミュータントを選択する工程と、を含み、
好ましくは、高速液体クロマトグラフィーにより反応液におけるD-プシコースの含有量を測定して、セカンダリスクリーニングを実施する工程、を更に含むことを特徴とする、プシコース3-エピメラーゼ高活性ミュータントのスクリーニング方法。 - 配列番号1に示されるタンパク質のカルボキシ基末端にリシンを大量に含有するラベルを加え、好ましくは、当該ラベルがAKAKAKAKAKであることを特徴とする、プシコース3-エピメラーゼ。
- ルミノコッカス由来のプシコース3-エピメラーゼ、及び/又はミュータント、及び/又はその分子修飾のチモプロテインが固定化樹脂と結合することで形成される固定化酵素であって、
好ましくは、当該固定化酵素により固定されるプシコース3-エピメラーゼが、配列番号2と少なくとも60 %、少なくとも70 %、少なくとも80 %、少なくとも85 %、少なくとも90 %、少なくとも95 %又は100 %の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、
好ましくは、当該固定化酵素により固定される酵素が、請求項1に記載のプシコース3-エピメラーゼミュータント、又は請求項3に記載の遺伝子工学菌により発現されるプシコース3-エピメラーゼミュータントであり、
好ましくは、当該固定化酵素により固定されるプシコース3-エピメラーゼが、請求項9に記載の酵素であり、
好ましくは、当該固定化酵素のベクターがマクロポーラス樹脂であり、
好ましくは、当該固定化酵素のベクターがマクロポーラスエポキシ樹脂又はマクロポーラスアミノ樹脂であることを特徴とする、プシコース3-エピメラーゼ固定化酵素。 - (1)マクロポーラス樹脂をpH 7.5-8.0のリン酸カリウム緩衝液に置いて活性化させる樹脂活性化工程と、
(2)プシコース3-エピメラーゼを異種発現するための遺伝子工学菌の発酵により酵素液を製造し、遺伝子工学菌が大腸菌又は枯草菌である、酵素製造工程と、
(3)活性化された樹脂をプシコース3-エピメラーゼの酵素液に入れて固定化させ、固定化温度が20-40 ℃であり、固定化時間が12-24 hである、固定化工程と、
(4)0.2-0.5 %濃度のグルタルアルデヒド溶液を用いて固定化酵素を架橋し、洗浄及び水切りしてから、プシコース3-エピメラーゼ固定化酵素を得る架橋工程と、を含むことを特徴とする、請求項10に記載のプシコース3-エピメラーゼ固定化酵素の製造方法。 - (1)マクロポーラス樹脂を緩衝液に置いて活性化させる樹脂活性化工程と、
(2)請求項3に記載のプシコース3-エピメラーゼミュータントを発現するための遺伝子工学菌の発酵により酵素液を製造する酵素製造工程と、
(3)活性化された樹脂をプシコース3-エピメラーゼミュータントの酵素液に入れて固定化させる固定化工程と、
(4)架橋剤を用いて固定化酵素を架橋し、プシコース3-エピメラーゼ固定化酵素を得る架橋工程と、を含み、
好ましくは、工程(1)における樹脂が、マクロポーラス樹脂、例えば、マクロポーラスエポキシ樹脂又はマクロポーラスアミノ樹脂であり、
好ましくは、工程(1)における緩衝液が、リン酸カリウム緩衝液、例えば、pH 7.5-8.0のリン酸カリウム緩衝液であり、
好ましくは、工程(3)における固定化温度が20-40 ℃であり、固定化時間が12-24 hであり、
好ましくは、工程(4)における架橋剤が、グルタルアルデヒド、グリオキサールなどの架橋剤を含むが、これらに限定されないことを特徴とする、プシコース3-エピメラーゼミュータント固定化酵素の製造方法。 - 請求項10に記載のプシコース3-エピメラーゼ固定化酵素のプシコース製造における適用。
- 請求項10に記載のプシコース3-エピメラーゼ固定化酵素をフルクトース又はフルクトース含有の原料に接触させて触媒反応を実施する工程、を含み、
好ましくは、前記フルクトース含有の原料におけるフルクトース濃度が20-75 %であり、原料が、純フルクトース溶液、又はフルクトース含有のミックスシロップ(例えば、異性化糖)、又はフルクトース含有の植物抽出物(例えば、フルーツジュース)であり、
好ましくは、前記触媒反応の温度が40-70 ℃であり、
好ましくは、前記D-プシコースの製造方法が、反応系にMn2+又はCo2+イオンを入れるが、イオン濃度が0.2-2.0 mMである工程、を含み、
好ましくは、前記D-プシコースの製造方法が、バッチ反応及び連続反応のどちらかであることを特徴とする、D-プシコースの製造方法。
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