CN105602925B

CN105602925B - 一种非经典分泌蛋白及其在蛋白分泌表达中的应用

Info

Publication number: CN105602925B
Application number: CN201610056025.2A
Authority: CN
Inventors: 张大伟; 陈景奇; 赵留群; 孙际宾
Original assignee: Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Current assignee: Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Priority date: 2016-01-26
Filing date: 2016-01-26
Publication date: 2019-01-08
Anticipated expiration: 2036-01-26
Also published as: CN105602925A

Abstract

本发明涉及一种在枯草芽孢杆菌中以非经典分泌途径进行分泌的异源蛋白及其在蛋白分泌表达中的应用。来源于瘤胃菌Ruminococcus sp.5_1_39B_FAA的D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶RDPE本身不带有任何信号肽或分泌信号，却可以大量分泌到胞外；通过实验证明了RDPE并非通过Sec途径或Tat途径进行分泌，也不是因为细胞自溶和裂解而泄漏到胞外。因此，RDPE在枯草芽孢杆菌中是一种非经典分泌蛋白。将RDPE分别与18种目标蛋白进行融合，尝试以RDPE作为转运信号实现目标蛋白的分泌表达，16种融合蛋白均在胞内有明显的表达，9种融合蛋白被成功分泌到胞外，其中2种融合蛋白的分泌水平占相应融合蛋白总量的比例大于50%。所以，本实验发展了一种实现蛋白质在枯草芽孢杆菌中分泌表达的新策略。

Description

一种非经典分泌蛋白及其在蛋白分泌表达中的应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种在枯草芽孢杆菌中通过非经典分泌途径进行分泌的异源蛋白，以及利用该蛋白作为转运信号实现蛋白质在枯草芽孢杆菌中分泌表达的一种新型策略。

背景技术

枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）是工业生产中重要的蛋白质生产菌株。因为强大的蛋白质分泌能力、安全菌种的定位（GRAS, generally recognized as safe）、遗传易操作性、无密码子偏好性以及发酵成本低廉等特征，枯草芽孢杆菌吸引了众多科学研究者的目光。在枯草芽孢杆菌中，大多数蛋白质以未折叠状态通过Sec途径被转运到胞外，少数蛋白（如PhoD和YwbN）以折叠状态通过Tat途径分泌到培养基中，还有一些蛋白通过ABC转运子途径、Com途径和ESX途径等方式进行分泌。目前，在蛋白分泌相关研究中，绝大多数蛋白是在经典信号肽（Sec信号肽或Tat信号肽）的指导下分泌到胞外，但是大多蛋白质的分泌效果往往并不理想。在经典分泌途径（Sec途径和Tat途径等）中的每一过程均可能成为限制蛋白质分泌的因素。此外，一般情况下，细胞质蛋白即使在信号肽的指导下也很难被分泌到细胞外的培养基中。以上因素限制了枯草芽孢杆菌在蛋白质生产上的应用。

除了可通过上述已知分泌途径分泌的蛋白，细菌中还存在一些不带有任何信号肽及其它分泌信号的分泌型蛋白，这些蛋白的分泌机制尚不清楚，因此被称为非经典分泌蛋白。通过计算机软件计算，枯草芽孢杆菌可以分泌大约300种蛋白质。到目前为止，在枯草芽孢杆菌中，通过2D-电泳和质谱技术已鉴定出113种分泌蛋白，其中84种含有经典的信号肽（Sec信号肽和Tat信号肽）并在信号肽的指导下分泌到胞外；而其它分泌蛋白却均不含有任何经典的信号肽或分泌信号序列。Antelman等通过蛋白质组学鉴定出了17种可分泌到胞外的典型细胞质蛋白（Antelman et al. Microbial Proteomics: Functional Biology ofWhole Organisms 2006, John Wiley & Sons, Inc., Hoboken, NJ, USA）；Tjalsma等列举了24种不带有信号肽且可分泌到胞外的蛋白质，并认为在细菌中不依赖信号肽的蛋白分泌现象可能比之前认为的更为普遍（Tjalsma et al. Microbiol. Mol. Biol. Rev.2004, 68:207）。Vitikainen等在枯草芽孢杆菌中对折叠酶PrsA进行结构功能分析时发现了一些非经典分泌蛋白，比如糖类代谢相关的蛋白Eno、PdhB、PdhD和CitH，目前尚不知这些蛋白在胞外是否具有功能（Vitikainen et al. J Biol Chem 2004, 279:19302-19314）。Antelman等最初发现涉及氨基酸代谢的酶RocA和RocF是通过非经典途径分泌的（Antelmanet al. Genome Res 2001, 11:1484-502），但是后来Vitikaimen证明只有RocF是非经典分泌蛋白。Hirose等鉴定出具有运动性和趋药性的蛋白Hag是存在胞外的（Hirose et al.Microbiology 2000, 146:65-75），随后同类蛋白FlgK和FliD也被鉴定位于胞外（Antelmanet al. Genome Res 2001, 11:1484-502），这三种蛋白在胞外均具有已知功能。过氧化氢酶KatA缺少信号肽，因此开始被认为是一种胞内酶，但是其后来被证明同样可以分泌到胞外（占总蛋白的56%）（Naclerio et al. Appl Environ Microbiol 1995, 61:4471-4473）。此外，SodA、YceD、Ef-G和GroEL等蛋白也被不同研究人员在胞外检测到。当然，在胞外环境中检测到非经典分泌蛋白很容易被认为是细胞裂解而导致细胞质蛋白发生泄漏的缘故。然而，Yang等人已证实一种异源的蛋白Est55和几种不含有信号肽的自身细胞质蛋白不是因为细胞裂解而泄漏到胞外，而是通过一种或某种未知的分泌途径被转运到胞外环境中（Yang et al. Journal of Bacteriology 2011, 193:5607-5615）。事实上，众多来自不同研究组关于不同菌种的研究已表明非经典分泌蛋白在枯草芽孢杆菌中是真实存在的。

尽管非经典分泌的机制尚未清楚，但是研究人员已开始尝试将非经典分泌***应用到蛋白生产中。最近，Wang等人选择了4种枯草芽孢杆菌自身非经典分泌蛋白来尝试引导异源蛋白分泌，结果4种蛋白均可以引导Nsp（Nucleoskeletal like protein）分泌到胞外，其中2种可以指导碱性磷酸酶PhoA的分泌，一种可以将耐高温β-半乳糖苷酶BgaB转运到胞外（Wang et al. Microb Cell Fact 2015, 14:179）。尽管这些蛋白的分泌量大多很低，只能用Western-blotting的方法进行检测，但是证明了非经典分泌蛋白可以应用在蛋白质分泌表达中。因此，为了补充枯草芽孢杆菌的蛋白分泌途径，以及拓展枯草芽孢杆菌表达***的使用范围，更多的非经典分泌蛋白需要被发掘并应用到重组蛋白的生产中。本发明证明了来源于瘤胃菌Ruminococcus sp. 5_1_39B_FAA的D-阿洛酮糖 3-差向异构酶RDPE是一种在枯草芽孢杆菌中的非经典分泌蛋白，并以该非经典分泌蛋白为分泌信号引导多个不同来源的目标蛋白实现了在枯草芽孢杆菌中的分泌表达。

发明内容

本发明的目的之一是证明来源于瘤胃菌Ruminococcus sp. 5_1_39B_FAA的D-阿洛酮糖 3-差向异构酶RDPE是一种在枯草芽孢杆菌中可通过非经典分泌途径进行分泌的蛋白。

所述的非经典分泌途径不是枯草芽孢杆菌中Sec途径和Tat途径等已知经典分泌途径，也不是因为细胞自溶和裂解而导致的胞内蛋白泄漏的现象，而是一种未知的全新的蛋白分泌途径。

所述的异源蛋白RDPE的核酸序列如SEQ ID NO.1所示，且其不含有经典的信号肽和分泌信号序列。

所述的枯草芽孢杆菌可以是枯草芽孢杆菌168、WB600、WB700、WB800、1A751、DB104或以上菌株后代细胞中的一种。

本发明的目的之二是提供一种利用非经典分泌蛋白RDPE并通过非经典分泌途径实现蛋白分泌表达的方法，即非经典分泌蛋白RDPE在蛋白分泌表达中的应用，是将RDPE与候选目标蛋白进行融合并构建一系列重组表达质粒pMA5-RDPE-TP，分别转化到枯草芽孢杆菌菌株后进行筛选培养，多达50%的目标蛋白可成功分泌到胞外。

所述的重组表达质粒pMA5-RDPE-TP包含非经典分泌蛋白RDPE的编码序列、21-bp的柔性Linker序列和目标蛋白的编码序列融合而获得的DNA序列。

所述的重组表达质粒pMA5-RDPE-TP中的21-bp的柔性Linker序列为5’-GGTAGCGGTGGAGGTGGCAGC-3’。

所述的重组表达质粒pMA5-RDPE-TP中的目标蛋白分别为来枯草芽孢杆菌来源的GroES、GroEL、DnaK、DnaJ、XylA、Pel、PhoA(BS)、LipA、PhoD、YwbN和PrsA，其它细菌来源的LacZ、PhoA(EC)、BgaB、AmyS和AmyL以及真核生物来源的GFP和RFP。

所述的重组表达质粒pMA5-RDPE-TP还包含组成型强启动子P_HpaII。

所述的重组表达质粒pMA5-RDPE-TP还包含氨苄青霉素和卡那霉素抗性选择标记基因。

本发明的目的之三是提供一种构建重组表达质粒pMA5-RDPE-TP的方法，是构建包含非经典分泌蛋白RDPE的编码序列、21-bp的柔性Linker序列和目标蛋白的编码序列融合而获得的DNA序列的质粒。

所述构建重组表达质粒pMA5-RDPE-TP的方法包括如下步骤：

1、以各相应来源菌种的基因组或质粒，利用对应引物扩增groES, groEL, dnaK,dnaJ, xylA, pel, phoA (BS), lipA, phoD, ywbN, prsA, lacZ, phoA(EC), bgaB,amyS, amyL, gfp and rfp基因，通过胶回收分别获得相应基因片段。

2、以pMA5-RDPEL为模板，使用相应引物进行PCR，通过胶回收获得线性化的载体pMA5-RDPEL。

3、将各基因片段分别与线性化的载体pMA5-RDPEL进行POE-PCR （Prolongedoverlap extension PCR）, 得到融合产物。

(1)将融合产物直接转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，分别得到对应的重组表达质粒pMA5-RDPE-GroES、pMA5-RDPE-GroEL、pMA5-RDPE-DnaK、pMA5-RDPE-DnaJ、pMA5-RDPE-XylA、pMA5-RDPE-Pel、pMA5-RDPE-PhoA(BS)、pMA5-RDPE-LipA、pMA5-RDPE-PhoD、pMA5-RDPE-YwbN、pMA5-RDPE-PrsA，pMA5-RDPE-lacZ、pMA5-RDPE-PhoA(EC)、pMA5-RDPE-BgaB、pMA5-RDPE-AmyS、pMA5-RDPE-AmyL、pMA5-RDPE-GFP和pMA5-RDPE-RFP。

本发明的目的之四是提供一种表达融合蛋白RDPE-TP的方法，是以重组表达了融合蛋白RDPE-TP的枯草芽孢杆菌为生产菌株，发酵生产融合蛋白RDPE-TP。

所述的方法是，构建表达融合蛋白RDPE-TP的重组枯草芽孢杆菌菌株；发酵培养基为2.0%~4.0%蛋白胨、3.0%~7.0%酵母提取物和0.3%~0.9%磷酸氢二钾，pH 7.2；活化所构建重组枯草芽孢杆菌菌株，于37℃、200 rpm条件下进行摇瓶发酵。

附图说明

图1 为重组质粒pMA5-RDPE的构建流程。

图2 为基因工程菌株B. subtilis 1A751-HR分泌表达D-阿洛酮糖 3-差向异构酶的SDS-PAGE图谱。1A751为负对照；1A751C为将pMA5空质粒转化1A751得到的菌株，也作为负对照；1A751-HR为将pMA5-RDPE转化1A751得到的菌株。Marker表示蛋白分子质量标准。箭头所指示的条带为D-阿洛酮糖 3-差向异构酶蛋白。

图3 为证明RDPE并非通过Sec 途径和Tat途径而分泌到胞外。A：RDPE在Sec信号肽的引导下的表达情况。1A751为负对照；1A751C为带有空质粒pMA5的1A751菌株，也作为负对照；WT，为不带有信号肽的RDPE。B：RDPE在Tat途径缺失菌株中的表达情况。1A751为负对照；1A751C为带有空质粒pMA5的1A751菌株，也作为负对照。

图4 为证明RDPE不是因细胞裂解而泄漏到胞外。1A751为负对照。

图5 为重组表达质粒pMA5-RDPE-TP的构建流程。

图6 为各融合蛋白在枯草芽孢杆菌中的表达情况。A：来源于枯草芽孢杆菌的蛋白与RDPE融合后的表达情况。B：来源于其它细菌的蛋白与RDPE融合后的表达情况。C：来源于真核生物的蛋白与RDPE融合后的表达情况。

具体实施方式

在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。

下面结合具体的制备实施例和应用实施例，并参照数据进一步详细地阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不是限制本发明的范围。

在以下的实施例中，未详尽描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。

表1 本发明中所用引物

Prmier	Sequence(5’-3’)
		pMA5-RDPE-F1	AAATATGGTATTTATTACGCTTATTG
pMA5-RDPE-R1	TAAATCGCTCCTTTTTAGGTGGCAC
		SacB-F	GTGCCACCTAAAAAGGAGCGATTTACAT ATGAACATCAAAAAGTTTGCAAAAC
SacB-R	CCAATAAGCGTAATAAATACCATATTTCGCAAACGCTTGAGTTGCGCCTCCTG
		AprE-F	GTGCCACCTAAAAAGGAGCGATTTACAT ATGAGAAGCAAAAAATTGTGGATCAG
AprE-R	CCAATAAGCGTAATAAATACCATATTTAGCCTGCACAGACATGTTGCTGAACG
		AmyL-F	GTGCCACCTAAAAAGGAGCGATTTACAT ATGAAACAACAAAAACGGCTTTATGC
AmyL-R	CAATAAGCGTAATAAATACCATATTTCGCCGCTGCTGCAGAATGAGGCAGC
		AmyE-F	GTGCCACCTAAAAAGGAGCGATTTACATATGTTTGCAAAACGATTCAAAACCTC
AmyE-R	CAATAAGCGTAATAAATACCATATTTAGCACTCGCAGCCGCCGGTCCTGCCAG
		UP1-F	CGGCATTCCCTTGGGTTGTAACTTGG
UP1-R	GAAGTCACCGGGTGGTACGCTGCACTAAATTTCCACTCCTTAATTCGTGATT
		DN1-F	AATCACGAATTAAGGAGTGGAAATTTAGTGCAGCGTACCACCCGGTGACTTC
DN1-R	GAACTAATGGGTGCTTTAGTTGAAGAACGATGCTACAGAAACCAGTGCATCAG
		CR1-F	CTGATGCACTGGTTTCTGTAGCATCGTTCTTCAACTAAAGCACCCATTAGTTC
CR1-R	CAAGCCCGGTATTCCAATGTTTGAAAACATTTATTCATTCAGTTTTCGTGCGGAC
		G1-F	GTCCGCACGAAAACTGAATGAATAAATGTTTTCAAACATTGGAATACCGGGCTTG
G2-R	AGCGGCCGCCGCTGTTTCTTCCCTC
		UP2-F	GGCAGGCATTATGGCCGCAAAGCAAAC
UP2-R	CTCGCATGAGAAATGGATTTTTTATTAATTTGGGCTCCTCCTTTCCCTCTATTC
		DN2-F	GAATAGAGGGAAAGGAGGAGCCCAAATTAATAAAAAATCCATTTCTCATGCGAG
DN2-R	GAACTAATGGGTGCTTTAGTTGAAGATGAACGAAACCCACTTAACAAAGGAG
		CR2-F	CTCCTTTGTTAAGTGGGTTTCGTTCATCTTCAACTAAAGCACCCATTAGTTC
CR2-R	CAAGGCTTCCAGGACCGATCGGCATTTATTCATTCAGTTTTCGTGCGGAC
		G2-F	GTCCGCACGAAAACTGAATGAATAAATGCCGATCGGTCCTGGAAGCCTTG
G2-R	TTGCCCAGAAGACACGTCCCGATCG
		pMA5-RDPE-F2	ATGAAATATGGTATTTATTACGCTTATTG
pMA5-RDPE-R2	TGAGTATAACACACTATACTTTATATTCATAAAGTGTG
		Spac-F	CTTTATGAATATAAAGTATAGTGTGTTATACTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACC
Spac-R	CAATAAGCGTAATAAATACCATATTTCATATG TCACCTCCTTAAGCTTAATTGTTATCC
		pMA5-RDPE-F3	GGATCCTCTAGAGTCGAGCTCAAGC
pMA5-RDPE-R3	GCTGCCACCTCCACCGCTACCGACTTCAAATACATGTTTTACAAAG
		pMA5-RDPEL-F	GGATCCTCTAGAGTCGAGCTCAAGC
pMA5-RDPEL-R	GCTGCCACCTCCACCGCTACCGACTTC
		groES-F	ATTTGAAGTCGGTAGCGGTGGAGGTGGCAGCTTGTTAAAGCCATTAGGTGATCGCGTTG
groES-R	CAAGCTAGCTTGAGCTCGACTCTAGAGGATCCTTAGCCGATAACAGCTAAAATGTCGC
		groEL-F	TTTGAAGTCGGTAGCGGTGGAGGTGGCAGCATGGCAAAAGAAATTAAGTTTAGTGAAG
groEL-R	AGCTAGCTTGAGCTCGACTCTAGAGGATCCTTACATCATTCCACCCATACCGCCCATG
		dnaK-F	ATTTGAAGTCGGTAGCGGTGGAGGTGGCAGCGTGAGTAAAGTTATCGGAATCGACTTAG
dnaK-R	AAGCTAGCTTGAGCTCGACTCTAGAGGATCCTTATTTTTTGTTTTGGTCGTCGTTTAC
		dnaJ-F	TTTGAAGTCGGTAGCGGTGGAGGTGGCAGCATGAGTAAGCGTGATTACTATGAAGTGC
dnaJ-R	AAGCTAGCTTGAGCTCGACTCTAGAGGATCCTTAATCGCCTTTAAACGCGCGTTTTAC
		xylA-F	ATTTGAAGTCGGTAGCGGTGGAGGTGGCAGCATGGCTCAATCTCATTCCAGTTCAATC
xylA-R	TAGCTTGAGCTCGACTCTAGAGGATCCTTATACTTCTAAAATGTATTGGTTCAATATCG
		pel-F	GTATTTGAAGTCGGTAGCGGTGGAGGTGGCAGCGCTGATTTAGGCCACCAGACGTTGG
pel-R	CAAGCTAGCTTGAGCTCGACTCTAGAGGATCCTTAATTTAATTTACCCGCACCCGCTTG
		phoA(BS)-F	GTATTTGAAGTCGGTAGCGGTGGAGGTGGCAGCGAGCTTCAGCAAACAGAAAAGGCCAG
phoA(BS)-R	CTAGCTTGAGCTCGACTCTAGAGGATCCTTATTTTCCAGTTTTTAAAATCTTAAATATG
		lipA-F	GTATTTGAAGTCGGTAGCGGTGGAGGTGGCAGCGCTGAACACAATCCAGTCGTTATGG
lipA-R	AGCTAGCTTGAGCTCGACTCTAGAGGATCCTTAATTCGTATTCTGGCCCCCGCCGTTC
		phoD-F	GTATTTGAAGTCGGTAGCGGTGGAGGTGGCAGCGCGCCTAACTTCTCAAGCTATCC
phoD-R	CAAGCTAGCTTGAGCTCGACTCTAGAGGATCCTCATCGGATTGCTTCACCCCGCCTTG
		ywbN-F	TTTGAAGTCGGTAGCGGTGGAGGTGGCAGCGCTAAGCCATCGAAAAAGGATGAAAAAG
ywbN-R	CAAGCTAGCTTGAGCTCGACTCTAGAGGATCCTTATGATTCCAGCAAACGCTGGGCAA
		prsA-F	ATTTGAAGTCGGTAGCGGTGGAGGTGGCAGCATGAAGAAAATCGCAATAGCAGCTATC
prsA-R	CTAGCTTGAGCTCGACTCTAGAGGATCCTTATTTAGAATTGCTTGAAGATGAAGAAGTG
		lacZ-F	GTATTTGAAGTCGGTAGCGGTGGAGGTGGCAGCATGACCATGATTACGGATTCACTGG
lacZ-R	GCTAGCTTGAGCTCGACTCTAGAGGATCCTTATTTTTGACACCAGACCAACTGGTAATG
		phoA(EC)-F	GTATTTGAAGTCGGTAGCGGTGGAGGTGGCAGCCGGACACCAGAAATGCCTGTTCTG
phoA(EC)-R	CAAGCTAGCTTGAGCTCGACTCTAGAGGATCCTTATTTCAGCCCCAGAGCGGCTTTC
		bgaB-F	GTATTTGAAGTCGGTAGCGGTGGAGGTGGCAGCATGAATGTGTTATCCTCAATTTGTTACGGAG
bgaB-R	CAAGCTAGCTTGAGCTCGACTCTAGAGGATCCCTAAACCTTCCCGGCTTCATCATGC
		amyS-F	GTATTTGAAGTCGGTAGCGGTGGAGGTGGCAGCGCCGCACCCTTTAACGGCACC
amyS-R	AGCTAGCTTGAGCTCGACTCTAGAGGATCCTTAAGGCCATGCCACCAGTCTAG
		amyL-F	GTATTTGAAGTCGGTAGCGGTGGAGGTGGCAGCGCAAATCTTAATGGGACGCTGATGC
amyL-R	AGCTAGCTTGAGCTCGACTCTAGAGGATCCCTATCTTTGAACATAGATCGAAACCGAC
		gfp-F	GAAGTCGGTAGCGGTGGAGGTGGCAGCATGAGTAAAGGAGAAGAACTTTTCACTGG
gfp-R	GAGCTCGACTCTAGAGGATCCCTATTTGTATAGTTCATCCATGCCATGTG
		rfp-F	GTATTTGAAGTCGGTAGCGGTGGAGGTGGCAGCATGGCGAGTAGCGAAGACGTTATC
rfp-R	CTTGAGCTCGACTCTAGAGGATCCTTAAGCACCGGTGGAGTGACGACC

实施例1 RDPE在枯草芽孢杆菌的分泌表达

根据来源于瘤胃菌（Ruminococcus sp. 5_1_39B_FAA）的DPEase编码基因rdpe序列进行全基因合成，并在该基因核苷酸序列的5’和3’端分别引入NdeI和BamHI限制性酶切位点，以方便后续的表达载体构建。合成好的基因连接到pUC57载体上，命名为pUC57-RDPE。

将质粒pUC57-RDPE和pMA5分别进行NdeI和BamHI双酶切处理；双酶切反应条件为37℃水浴3 h。将双酶切产物分别进行胶回收，得到两端分别带有NdeI和BamHI酶切位点的rdpe片段和线性化的pMA5载体，将两者以T4连接酶在室温条件下连接30 min；连接产物转化大肠感受态细胞DH5α，以氨苄霉素（100 μg/mL）进行抗性筛选，通过菌落PCR筛选阳性克隆，并提取质粒进行测序验证。质粒构建结果见图1，所构建的含有该rdpe基因的重组表达质粒命名为pMA5-RDPE。

将重组表达质粒pMA5-RDPE通过Spizizen转化方法（Spizizen et al. Proc NatlAcad Sci 1958, 44:1072-1078）转入1A751感受态细胞，涂布于卡那霉素（50 μg/mL）平板过夜培养，以菌落PCR筛选阳性克隆，得到重组菌株1A751R。将重组菌株1A751R接种于含5mL SR培养基（1.5%蛋白胨，3.0% 酵母提取物和0.3% K₂HPO₄，pH 7.2）的试管中，并添加50 μg/mL 卡那霉素用于维持质粒稳定，在37℃、200 rpm条件下培养18 h。随后，取300 μL试管中菌液接种于装有30 mL 2×SR培养基（3.0%蛋白胨，6.0% 酵母提取物和0.6% K₂HPO₄, pH7.2）的摇瓶（250 mL）中，并添加50 μg/mL 卡那霉素，在37℃、200 rpm条件下培养72 h。随后取出发酵液，12000 rpm离心5 min得到发酵液上清，即为粗酶液；将离心后的菌体用PBS重悬，进行超声破碎，12000 rpm离心5 min得到破碎细胞上清。上述相关方法均采用常规操作步骤。

取粗酶液和破碎细胞上清分别进行酶活测定，结果显示胞外和胞内RDPE活性分别为17 U/mL和4 U/mL；SDS-PAGE分析显示胞内和胞外在相对分子质量约33 kDa处均有明显的条带，与RDPE分子质量理论值大小一致，且胞外目标蛋白量明显多于胞内（如图2所示）。综上可知，大部分表达的RDPE被分泌到胞外。

实施例2 SignalP预测RDPE的信号肽或信号序列

使用信号肽预测软件SignalP 4.1（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）对RDPE的氨基酸序列进行分析，发现RDPE的N端不存在典型的信号肽，在其它区域也不存在任何分泌信号序列。

实施例3 RDPE不能通过Sec和Tat分泌途径进行分泌

该部分重组质粒构建方法依据文献中方法（You et al. Appl EnvironMicrobiol 2012, 78:1593-5）。以枯草芽孢杆菌168或地衣芽孢杆菌CICC 10181基因组为模板，使用对应的引物分别扩增四个Sec信号肽（SP_sacB、SP_AprE、SP_AmyL和SP_AmyE，核酸序列分别如SEQ ID NO. 2、3、4和5所示），对克隆得到的PCR产物分别进行胶回收。以pMA5-RDPE为模板，使用引物扩增线性化的载体pMA5-RDPE，将所得PCR产物进行胶回收。将以上4个信号肽片段与线性化的载体pMA5-RDPE分别进行POE-PCR （Prolonged overlap extension PCR）,将得到的融合产物分别直接转化大肠感受态细胞DH5α，分别得到重组表达质粒pMA5-SP_sacB-RDPE、pMA5-SP_AprE-RDPE、pMA5-SP_AmyL-RDPE和pMA5-SP_AmyE-RDPE。构建的质粒经测序验证正确。将以上重组表达质粒分别转化枯草芽孢杆菌1A751，经菌落PCR验证获得重组菌株1A751R1、1A751R2、1A751R3和1A751R4并进行摇瓶发酵，具体的摇瓶发酵方法同于实施例1。SDS-PAGE分析显示，RDPE分别融合上四个Sec信号肽后，不但不能分泌到胞外，在胞内也不能表达（如图3A所示）。以上结果说明，RDPE并不能通过Sec途径分泌到胞外。

敲除了枯草芽孢杆菌中Tat途径相关基因tatAd-tatCd和tatAy-tatCy （敲除方法参考Liu et al. Microbiology (2008), 154, 2562-2570），构建了Tat途径缺失菌株，命名为1A751D。将重组表达质粒pMA5-RDPE转化1A751D，获得重组菌株1A751DR。同时，构建了包含PhoD和YwbN基因的重组表达质粒pMA5-PhoD和pMA5-YwbN，构建方法同于前面所述重组质粒的构建方法；将该两种质粒分别转化Tat途径缺失菌株1A751D，获得重组菌株1A751DP和1A751DY。将重组菌株1A751DR、1A751DP和1A751DY分别进行摇瓶培养，培养方法同于实施例1。发酵24 h取样进行SDS-PAGE分析，结果显示敲除Tat途径后，RDPE仍可以分泌到胞外；而依赖Tat途径分泌的PhoD和YwbN在敲除Tat途径后却不能分泌到胞外（如图3B所示）。以上结果说明RDPE是不依赖Tat途径而分泌到胞外的。

实施例4 胞外的RDPE不是因为细胞裂解而泄漏到胞外

虽然RDPE不含有自身的信号肽或分泌信号，且不依赖于Sec和Tat分泌途径，但是不能排除其是因细胞裂解而泄漏到胞外的可能。P_spac为IPTG诱导的启动子（核酸序列如SEQID NO. 6所示），其完整序列中包含LacI基因，编码一种仅在胞内表达的蛋白。因此将重组表达质粒pMA5-RDPE上的启动子P_HpaII替换为P_spac，具体步骤如下：

以质粒pHCMC05为模板，使用相应引物扩增启动子P_spac，将PCR产物进行胶回收；以pMA5-RDPE为模板，使用相应引物扩增线性化的载体pMA5-RDPE，PCR产物进行胶回收；将P_spac片段与线性化的载体pMA5-RDPE分别进行POE-PCR, 将得到的融合产物分别直接转化大肠感受态细胞DH5α，得到重组表达质粒pMA5-P_spac-RDPE，经测序验证正确。

将重组表达质粒pMA5-P_spac-RDPE转化枯草芽孢杆菌1A751，得到重组菌株1A751SR，进行摇瓶发酵，在发酵液OD₆₀₀达到0.8的时候添加100 mM IPTG进行诱导，其它发酵方法同于实施例1。SDS-PAGE分析（如图4所示）显示LacI在胞内可以组成型大量表达，而不能分泌到胞外；在IPTG诱导下，RDPE可以在胞内表达，同时有更多的RDPE被分泌到胞外。综上所述，可知RDPE并不是因为细胞裂解而泄漏到胞外，而是通过某种未知分泌途径而分泌到胞外的。

实施例5 重组表达质粒pMA5-RDPE-TP的构建

实施例1-4可证明RDPE在枯草芽孢杆菌中是一种非经典分泌蛋白，我们使用该蛋白作为分泌信号以实现不同来源目标蛋白在枯草芽孢杆菌中的分泌表达，因此选择了18种蛋白作为目标蛋白，具体如下表所示：

表2 目标蛋白列表

NO.

Gene

Localisation

Function

Source

Molecular mass (kDa)

Gene length (bp)

Secretion pathway

1

groES

Intracellular

Chaperone

B. subtilis

10

285

2

groEL

Intracellular

Chaperone

B. subtilis

60

1635

3

dnaK

Intracellular

Chaperone

B. subtilis

67

1836

4

dnaJ

Intracellular

Chaperone

B. subtilis

41

1119

5

xylA

Intracellular

Xylose isomerase

B. subtilis

49

1338

6

pel

Extracellular

Pectate lyase

B. subtilis

44

1200

Sec pathway

7

phoA

Extracellular

Alkaline phosphatase A

B. subtilis

47

1293

Sec pathway

8

lipA

Extracellular

Lipase

B. subtilis

20

546

Sec pathway

9

phoD

Extracellular

Phosphodiesterase

B. subtilis

55

1503

Tat pathway

10

ywbN

Extracellular

Unknown function

B. subtilis

41

1119

Tat pathway

11

prsA

Membrane

Chaperone

B. subtilis

32

879

12

lacZ

Intracellular

β-galactosidase

E. coli

113

3075

13

phoA

Extracellular

Alkaline phosphatase A

E. coli

50

1353

Sec pathway

14

bgaB

Intracellular

β-galactosidase

G. stearothermophilus

74

2019

15

amyS

Extracellular

α-amylase

G. stearothermophilus

57

1548

Sec pathway

16

amyl

Extracellular

α-amylase

B. licheniformis

53

1452

Sec pathway

17

gfp

Intracellular

Green fluorescent protein

Aequorea victoria

26

717

18

rfp

Intracellular

Red fluorescent protein

Discosoma coral

25

678

以质粒pMA5-RDPE为模板，设计引物pMA5-RDPE-F3/pMA5-RDPE-R3，上游引物5’端含有21 bp的Liker序列，扩增线性化的载体pMA5-RDPE3，将PCR产物进行胶回收。将线性化的载体pMA5-RDPE3以T4多聚核苷酸激酶进行处理，条件为37℃水浴30 min；然后加入T4连接酶以使载体自连，条件为室温30 min；将连接体系转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，获得重组质粒pMA5-RDPEL（如图5所示），经测序验证正确。

以枯草芽孢杆菌168基因组为模板，使用相应引物扩增基因groES, groEL, dnaK,dnaJ, xylA, pel, phoA (BS), lipA, phoD, ywbN和prsA；以大肠杆菌Escherichia coli MG1655基因组为模板，使用相应引物扩增基因lacZ和phoA(EC)；以嗜热脂肪芽孢杆菌Bacillus stearothermophilus ATCC 31195基因组为模板，使用相应引物扩增基因bgaB和amyS；以地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis CICC 10181为模板，使用相应引物扩增基因amyL；使用质粒pDG和pDR（实验室自有）为模板，使用相应引物扩增基因gfp 和 rfp；将以上PCR产物进行胶回收。以pMA5-RDPEL为模板，使用相应引物扩增线性化的载体pMA5-RDPEL，PCR产物进行胶回收。将以上基因片段和线性化载体pMA5-RDPEL分别进行POE-PCR，将得到的融合产物分别直接转化大肠感受态细胞DH5α，得到重组表达质粒pMA5-RDPE-GroES、pMA5-RDPE-GroEL、pMA5-RDPE-DnaK、pMA5-RDPE-DnaJ、pMA5-RDPE-XylA、pMA5-RDPE-Pel、pMA5-RDPE-PhoA(BS)、pMA5-RDPE-LipA、pMA5-RDPE-PhoD、pMA5-RDPE-YwbN、pMA5-RDPE-PrsA，pMA5-RDPE-lacZ、pMA5-RDPE-PhoA(EC)、pMA5-RDPE-BgaB、pMA5-RDPE-AmyS、pMA5-RDPE-AmyL、pMA5-RDPE-GFP和pMA5-RDPE-RFP（如图5所示），经测序验证以上质粒均正确。

实施例6 融合蛋白RDPE-TP的表达

将所构建18种重组表达质粒转化枯草芽孢杆菌1A751，涂布含卡那霉素（50 μg/mL）的LB平板，37℃过夜培养，以菌落PCR进行验证，获得18种重组菌株，分别命名为1A751RL1、1A751RL2、1A751RL3、1A751RL4、1A751RL5、1A751RL6、1A751RL7、1A751RL8、1A751RL9、1A751RL10、1A751RL11、1A751RL12、1A751RL13、1A751RL14、1A751RL15、1A751RL16、1A751RL17和1A751RL18。将以上重组菌株分别进行摇瓶培养，培养方法同于实施例1，发酵72 h取样进行SDS-PAGE分析。

如图6所示，融合蛋白RDPE-DnaJ和RDPE-LacZ在胞内和胞外均没有被检测到；融合蛋白RDPE-GroES、RDPE-GroEL、RDPE-DnaK、RDPE-XylA、RDPE-Pel、RDPE-PhoA(BS)、RDPE-LipA、RDPE-PhoD、RDPE-YwbN、RDPE-PrsA、RDPE-PhoA(EC)、RDPE-BgaB、RDPE-AmyS和RDPE-AmyL、RDPE-GFP和RDPE-RFP均成功在胞内表达，且大多表达水平较高；融合蛋白RDPE-GroES、RDPE-DnaK、RDPE-Pel、RDPE-PhoA(BS)、RDPE-YwbN、 RDPE-PhoA(EC)、RDPE-AmyL、RDPE-GFP和RDPE-RFP均成功分泌到胞外，其中分泌的RDPE-DnaK和RDPE-RFP分别占总融合蛋白的比例均大于50%。以上结果说明非经典蛋白RDPE作为分泌信号成功地将大约50%的目标蛋白分泌到胞外。

实施例7 生物活性检测

将实施例6中所取样品在10000 rpm、4℃条件下离心15 min，保留发酵液上清，收集菌体，然后用PBS洗涤三次，并重悬于等体积的PBS中。然后加入20 mg/mL的溶菌酶，37℃水浴保温 30 min，使用超声波破碎菌体（5 min，300 W，JY 92-11N），10000 rpm、4℃条件下离心15 min，保留破碎细胞上清液。对融合蛋白的RDPE酶活以及相应目标蛋白的酶活进行测定

RDPE酶活测定方法：取200 μL粗酶液与800 μL 2%的D-果糖溶液（50 mM Tris-HCl，pH 8.0）于55℃反应10 min，然后煮沸5 min终止反应。用0.45 μm的微孔滤膜过滤后进行高效液相色谱分析。高效液相色谱条件如下：安捷伦高效液相色谱仪1200；分析柱：Sugar-PaKTM分析柱（6.5 mm×300 mm；Waters）；流动相：超纯水；流速: 0.4 mL/min；柱温：80℃；检测器：示差折光检测器。以Sigma公司生产的D-果糖和D-阿洛酮糖为标准品，将上述样品进行分析，上样量为20μL。

可进行酶活测定的蛋白质XylA、Pel、PhoA、LipA、LacZ、BgaB和AmyS（AmyL）的酶活测定方法分别依据文献中的方法（Me et al. Enzyme Microb Technol 2014, 64-65:1-5,Diao et al. Appl Environ Microbiol 2012, 78:651-659, Liu et al. Biotechnol Lett 2012, 34:109-115, Lu et al. J Ind Microbiol Biotechnol 2010, 37:919-925,Dwyer et al. J Bacteriol 2014, 196:3343-3350, Phan et al. Microb Cell Fact 2015, 14:72, Chen et al. Microb Cell Fact 2015, 14:92）。

荧光强度测定方法：将发酵液在10000 rpm、4℃条件下离心10 min，保留发酵液上清；同时菌体用等体积的PBS缓冲液重悬。吸取200 μL待测样品用NUNC 96孔黑色酶标板进行荧光检测，检测时每个样品做4个平行，所用仪器为SpectraMax M5多功能酶标仪，操作软件为Gen 5。荧光强度参数设置为，绿色荧光，激发：488 nm，发射：520 nm；红色荧光，激发：550 nm，发射：550 nm；顶端发光，氚气灯，增益为自动调整增益。

酶活测定结果如下表所示：

表3 融合蛋白的酶活测定结果

名称	胞内RDPE酶活 U/mL	胞外RDPE酶活 U/mL	胞内目标蛋白酶活 U/mL	胞外目标蛋白酶活 U/mL
					RDPE-GroES	√	√	-	-
RDPE-GroEL	√	-	-	-
					RDPE-DnaK	√	√	-	-
RDPE-DnaJ	-	-	-	-
					RDPE-XylA	√	-	1830	-
RDPE-Pel	√	√	-	180
					RDPE-PhoA(BS)	√	√	-	145
RDPE-LipA	√	-	-	-
					RDPE-PhoD	√	-	-	-
RDPE-YwbN	√	√	-	-
					RDPE-PrsA	√	-	-	-
RDPE-LacZ	-	-	-	-
					RDPE-PhoA(EC)	√	√	-	870
RDPE-BgaB	√	-	18	0.08
					RDPE-AmyS	√	-	-	-
RDPE-AmyL	√	√	-	63
					RDPE-GFP	√	√	-	-
RDPE-RFP	√	√	-	-

√表示具有RDPE活性

-表示没有检测到酶的活性或不可检测酶活

表4 融合蛋白的荧光活性检测 (RFU)

名称	RDPE	RDPE-GFP	RDPE-RFP
				胞内	0	2210	3430
胞外	0	640	7600

<110> 中科院天津工业生物技术研究所

<120> 一种非经典分泌蛋白及其在蛋白分泌表达中的应用

<130> 2016

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 876

<212> DNA

<213> Ruminococcus sp.

<400> 1

atgaaatatg gtatttatta cgcttattgg gaaaaggaat ggaatggaga ttacaaatat 60

tatatagata aaatttcaaa attaggtttt gatattctgg aaatttcttg cggcgctttt 120

tctgactatt acacgaaaga tcaggagtta attgatattg gaaaatatgc gaaagaaaaa 180

ggcgtaacat tgacagcagg gtatggacct cattttaatg aaagcctgtc atcttcagaa 240

cccaatacgc agaaacaagc aatcagtttt tggaaagaga cgctccggaa attgaagtta 300

atggatattc atattgttgg aggcgcactc tatggttatt ggcctgtaga ttattccaaa 360

ccttttgata agaaaaggga tttagagaat tccattaaaa acatgaaaat tattagtcag 420

tatgctgaag aatatgacat aatgatgggg atggaagttc ttaaccgttt tgaaggctat 480

atgttgaata catgcgatga agcgttggca tacgttgaag aggttggctc ttctaatgtt 540

ggtgttatgt tagatacttt tcacatgaat atagaggaag ataatatagc agcagccatt 600

cgtaaagcag gagataggct ttatcacttc catataggag aaggaaatcg taaagtacca 660

ggaaaaggta tgcttccttg gaatgagata ggacaggcat tgcgagatat aaactaccaa 720

catgcagcag ttatggagcc atttgtaatg cagggaggaa cagtagggca tgacattaaa 780

atatggagag atatcattgg aaactgttct gaagttacat tagatatgga cgctcaaagt 840

gcgttgcact ttgtaaaaca tgtatttgaa gtctaa 876

<210> 2

<211> 87

<212> DNA

<213> Bacillus subtilis

<400> 2

atgaacatca aaaagtttgc aaaacaagca acagtattaa cctttactac cgcactgctg 60

gcaggaggcg caactcaagc gtttgcg 87

<210> 3

<211> 87

<212> DNA

<213> Bacillus subtilis

<400> 3

atgagaagca aaaaattgtg gatcagcttg ttgtttgcgt taacgttaat ctttacgatg 60

gcgttcagca acatgtctgt gcaggct 87

<210> 4

<211> 87

<212> DNA

<213> Bacillus licheniformis

<400> 4

atgaaacaac aaaaacggct ttatgcccga ttgctgacgc tgttatttgc gctcatcttc 60

ttgctgcctc attctgcagc agcggcg 87

<210> 5

<211> 99

<212> DNA

<213> Bacillus subtilis

<400> 5

atgtttgcaa aacgattcaa aacctcttta ctgccgttat tcgctggatt tttattgctg 60

tttcatttgg ttctggcagg accggcggct gcgagtgct 99

<210> 6

<211> 1636

<212> DNA

<213> 未知

<400> 6

tcactgcccg ctttccagtc gggaaacctg tcgtgccagc tgcattaatg aatcggccaa 60

cgcgcgggga gaggcggttt gcgtattggg cgccagggtg gtttttcttt tcaccagtga 120

gacgggcaac agctgattgc ccttcaccgc ctggccctga gagagttgca gcaagcggtc 180

cacgctggtt tgccccagca ggcgaaaatc ctgtttgatg gtggttgacg gcgggatata 240

acatgagctg tcttcggtat cgtcgtatcc cactaccgag atatccgcac caacgcgcag 300

cccggactcg gtaatggcgc gcattgcgcc cagcgccatc tgatcgttgg caaccagcat 360

cgcagtggga acgatgccct cattcagcat ttgcatggtt tgttgaaaac cggacatggc 420

actccagtcg ccttcccgtt ccgctatcgg ctgaatttga ttgcgagtga gatatttatg 480

ccagccagcc agacgcagac gcgccgagac agaacttaat gggcccgcta acagcgcgat 540

ttgctggtga cccaatgcga ccagatgctc cacgcccagt cgcgtaccgt cttcatggga 600

gaaaataata ctgttgatgg gtgtctggtc agagacatca agaaataacg ccggaacatt 660

agtgcaggca gcttccacag caatggcatc ctggtcatcc agcggatagt taatgatcag 720

cccactgacg cgttgcgcga gaagattgtg caccgccgct ttacaggctt cgacgccgct 780

tcgttctacc atcgacacca ccacgctggc acccagttga tcggcgcgag atttaatcgc 840

cgcgacaatt tgcgacggcg cgtgcagggc cagactggag gtggcaacgc caatcagcaa 900

cgactgtttg cccgccagtt gttgtgccac gcggttggga atgtaattca gctccgccat 960

cgccgcttcc actttttccc gcgttttcgc agaaacgtgg ctggcctggt tcaccacgcg 1020

ggaaacggtc tgataagaga caccggcata ctctgcgaca tcgtataacg ttactggttt 1080

catcaaaatc gtctccctcc gtttgaatat ttgattgatc gtaaccagat gaagcactct 1140

ttccactatc cctacagtgt tatggcttga acaatcacga aacaataatt ggtacgtacg 1200

atctttcagc cgactcaaac atcaaatctt acaaatgtag tctttgaaag tattacatat 1260

gtaagattta aatgcaaccg ttttttcgga aggaaatgat gacctcgttt ccaccggaat 1320

tagcttggta ccaggcctta cacagcccag tccagactat tcggcactga aattatgggt 1380

gaagtggtca agacctcact aggcacctta aaaatagcgc accctgaaga agatttattt 1440

gaggtagccc ttgcctacct agcttccaag aaagatatcc taacagcaca agagcggaaa 1500

gatgttttgt tctacatcca gaacaacctc tgctaaaatt cctgaaaaat tttgcaaaaa 1560

gttgttgact ttatctacaa ggtgtggcat aatgtgtgga attgtgagcg gataacaatt 1620

aagcttaagg aggtga 1636

Claims

1.一种利用非经典分泌蛋白实现目标蛋白分泌表达的方法，其特征在于：所述非经典分泌蛋白为RDPE，其是来源于瘤胃菌(Ruminococcus sp.)5_1_39B_FAA的D-阿洛酮糖3-差向异构酶，其核酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述RDPE不含有任何经典的信号肽和分泌信号序列，该方法包括以下步骤：

(1)根据Ruminococcus sp.5_1_39B_FAA的DPEase编码基因rdpe序列进行全基因合成，并在该基因核苷酸序列的5’和3’端分别引入NdeI和BamHI限制性酶切位点，合成好的基因连接到pUC57载体上，获得pUC57-RDPE；

(2)将质粒pUC57-RDPE和pMA5分别进行NdeI和BamHI双酶切处理，胶回收后得到两端分别带有NdeI和BamHI酶切位点的rdpe片段和线性化的pMA5载体，将两者以T4连接酶进行连接，然后转化大肠杆菌DH5α获得pMA5-RDPE；

(3)以步骤(2)获得的质粒pMA5-RDPE为模板，用引物对pMA5-RDPE-F3/pMA5-RDPE-R3扩增线性化的载体pMA5-RDPE3，将PCR产物进行胶回收后以T4多聚核苷酸激酶进行处理，然后加入T4连接酶以使载体自连；将连接体系转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，获得重组质粒pMA5-RDPEL，其中pMA5-RDPE-F3序列为GGATCCTCTAGAGTCGAGCTCAAGC，pMA5-RDPE-R3序列为GCTGCCACCTCCACCGCTACCGACTTCAAATACATGTTTTACAAAG；

(4)扩增目标蛋白基因，通过胶回收获得相应的基因片段，所述目标蛋白为枯草芽孢杆菌来源的GroES、DnaK、Pel、PhoA或YwbN，或大肠杆菌来源的PhoA或地衣芽孢杆菌来源的AmyL或真核生物来源的GFP或RFP中的一种；

(5)以步骤(3)获得的质粒pMA5-RDPEL为模板，使用引物对pMA5-RDPEL-F/R进行PCR，通过胶回收获得线性化的载体pMA5-RDPEL，其中pMA5-RDPEL-F序列为GGATCCTCTAGAGTCGAGCTCAAGC，pMA5-RDPEL-R序列为GCTGCCACCTCCACCGCTACCGACTTC；

(6)将步骤(4)获得的目标蛋白基因片段与步骤(5)获得的线性化的载体pMA5-RDPEL进行POE-PCR，得到融合产物；

(7)将步骤(6)获得的融合产物直接转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，得到对应的重组表达质粒pMA5-RDPE-TP，其中TP代表目标蛋白，该质粒包含组成型强启动子P_HpaII，氨苄青霉素和卡那霉素抗性选择标记基因，及由RDPE的编码序列、21bp的柔性Linker序列和目标蛋白的编码序列融合而获得的DNA序列，其中21bp的柔性Linker序列为5’-GGTAGCGGTGGAGGTGGCAGC-3’；

(8)将步骤(7)获得的重组表达质粒转化入枯草芽孢杆菌中对目标蛋白进行发酵，实现目标蛋白的分泌表达，发酵培养基为2.0％～4.0％蛋白胨、3.0％～7.0％酵母提取物和0.3％～0.9％磷酸氢二钾，pH 7.2；活化所构建重组枯草芽孢杆菌菌株，于37℃、200rpm条件下进行摇瓶发酵。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述RDPE是通过非经典分泌途径分泌到胞外，其并非枯草芽孢杆菌中Sec分泌途径和Tat分泌途径等已知经典途径，也不是因为细胞自溶和裂解而导致的胞内蛋白泄漏现象，而是一种未知的全新的蛋白分泌途径。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述RDPE作为分泌信号引导目标蛋白实现了在枯草芽孢杆菌中的分泌表达。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(8)中所述枯草芽孢杆菌是枯草芽孢杆菌168、WB600、WB700、WB800、1A751、DB104中的一种。