CN111394410A - 一种高催化活性神经氨酸合酶及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种高催化活性神经氨酸合酶及应用，属于遗传工程领域。本发明通过筛选不同来源的N‑乙酰神经氨酸合酶，并以5个不同强度启动子优化N‑乙酰神经氨酸合酶在基因组上的表达水平，将最佳表达强度的NeuB整合到可以合成NeuAc前体物质ManNAc的菌株中，提高了枯草芽孢杆菌的N‑乙酰神经氨酸产量使N‑乙酰神经氨酸在摇瓶中产量达到7.6g/L。

Description

一种高催化活性神经氨酸合酶及应用

技术领域

本发明涉及一种高催化活性神经氨酸合酶及应用，属于遗传工程领域。

背景技术

N-乙酰神经氨酸是一种功能性单糖，广泛存在于微生物以及哺乳动物体内。在人体中，N-乙酰神经氨酸参与细胞识别、信号转导等多个生理过程。因此，N-乙酰神经氨酸被广泛应用于增强婴儿免疫力，促进婴儿大脑发育。目前，N-乙酰神经氨酸主要采取天然产物提取法(鸡蛋、燕窝等)，存在其他产物难以分离，且成本较高；另外可以通过全细胞转化的方法获得，但是需要成本较高的底物乙酰氨基葡萄糖和丙酮酸为底物，由于底物转化率较低，导致神经氨酸生产成本较高。

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是一种被广泛用作食品酶制剂及重要营养化学品的生产宿主，其产品被FDA认证为“generally regarded as safe”(GRAS)安全级别。因此以枯草芽孢杆菌为宿主，通过代谢工程改造，以葡萄糖等廉价碳源为底物，高效从头合成神经氨酸是一种有效的策略。

目前在枯草中构建的N-乙酰神经氨酸代谢途径主要通过N-乙酰氨基葡萄糖为前体的NeuB关键酶合成途径，由于现有NeuB酶催化性能较弱，限制了神经氨酸的合成效率。这个问题的存在严重限制了神经氨酸产量的提高，进一步限制了其市场应用。

发明内容

为解决上述问题，本发明通过筛选不同来源的N-乙酰神经氨酸合酶(NeuB)，并优化其表达强度，提高了枯草芽孢杆菌的N-乙酰神经氨酸产量。

本发明的第一个目的是提供脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis)来源于的N-乙酰神经氨酸合酶在提高枯草芽孢杆菌N-乙酰神经氨酸产量方面的应用。

在一种实施方式中，所述应用是在枯草芽孢杆菌中表达来源于脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis)的N-乙酰神经氨酸合酶。

在一种实施方式中，所述N-乙酰神经氨酸合酶为(a)或(b)：

(a)氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的蛋白质；

(b)在(a)的氨基酸序列基础上经过取代、缺失或者添加一个或几个氨基酸且具有N-乙酰神经氨酸合酶活性的酶。

在一种实施方式中，所述N-乙酰神经氨酸合酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在一种实施方式中，所述N-乙酰神经氨酸合酶通过低强度的启动子调控表达。

在一种实施方式中，所述启动子含有SEQ ID NO.3～7任一所示的核苷酸序列。

本发明的第二个目的是提供一种基因工程菌，具有N-乙酰-D-甘露糖胺(NeuAc)的合成能力，并表达SEQ ID NO.1所示的N-乙酰神经氨酸合酶。

在一种实施方式中，所述N-乙酰神经氨酸合酶整合到可以合成N-乙酰-D-甘露糖胺(ManNAc)的枯草芽孢杆菌中。

在一种实施方式中，所述基因工程菌以枯草芽孢杆菌BSGN6-comK为宿主。

在一种实施方式中，所述基因工程菌还强化氨基葡萄糖-6-磷酸-N-乙酰基转移酶和N-乙酰氨基葡萄糖异构酶的表达。

在一种实施方式中，所述氨基葡萄糖-6-磷酸-N-乙酰基转移酶(Gna1)的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示。

在一种实施方式中，所述N-乙酰氨基葡萄糖异构酶(Age)的氨基酸序列如SEQ IDNO.11所示。

在一种实施方式中，所述氨基葡萄糖-6-磷酸-N-乙酰基转移酶通过SEQ ID NO.3所示的启动子调控表达。

在一种实施方式中，所述N-乙酰氨基葡萄糖-异构酶通过SEQ ID NO.8所示的启动子调控表达。

本发明的第三个目是提供所述枯草芽孢杆菌工程菌在生产N-乙酰神经氨酸或其衍生产品方面的用途。

在一种实施方式中，所述重组枯草芽孢杆菌接种在LB培养基中，培养12～18h获得种子液，再以按体积计1～10％的接种量转接至发酵培养基中进行发酵。

在一种实施方式中，所述枯草芽孢杆菌工程菌在30～37℃发酵16～72h。

在一种实施方式中，所述衍生产品包括但不限于抗病毒药物扎那米韦或奥司他韦。

有益效果：

(1)本发明通过筛选不同来源NeuB酶，发现在同样的低表达水平时，来源于脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis)的NeuB相比于大肠杆菌等来源有较高的催化活性，NeuAc产量能够由0.1g/L提高至7.6g/L。

(2)本发明通过以5个不同强度启动子(P1～P5)优化N-乙酰神经氨酸合酶(NeuB)在基因组上的表达水平，并将最佳表达强度的NeuB整合到可以合成N-乙酰神经氨酸(NeuAc)前体物质N-乙酰基-D-氨基甘露糖(ManNAc)的菌株中，提高了神经氨酸产量，使摇瓶水平发酵72h的神经氨酸产量由3.7g/L提高至7.6g/L。

具体实施方式

Neisseria meningitidis来源的N-乙酰神经氨酸合酶(NeuB)酶氨基酸列如SEQID NO.1所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

P1启动子核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；P2启动子核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；P3启动子核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；P4启动子核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；P5启动子核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，P10启动子核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；

氨基葡萄糖-6-磷酸-N-乙酰基转移酶(Gna1)氨基酸列如SEQ ID NO.9所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；

N-乙酰氨基葡萄糖-异构酶(Age)氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示；

大肠杆菌来源NeuB酶氨基酸列如SEQ ID NO.13所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示；

Moritella viscosa来源NeuB酶氨基酸列如SEQ ID NO.15所示，核苷酸序列如SEQID NO.16所示。

种子培养基(g/L)：胰蛋白胨10，酵母提取物5，NaCl 10。

发酵培养基(g/L)：葡萄糖60，胰蛋白胨6，酵母粉12，硫酸铵6，磷酸氢二钾12.5，磷酸二氢钾2.5，硫酸镁3。

神经氨酸检测方法：Agilent液相色谱：色谱柱为Aminex HPX-87H column(300×7.8mm)，紫外210nm检测吸收峰，流动相为10mM硫酸，流速为0.5mL/min。神经氨酸出峰时间为9.8分钟。

实施例1构建基因组重组整合Gna1片段

以枯草芽孢杆菌168基因组为模版，设计引物Gna1-L-F:5’-CGTGATATCGTCATTCAGTCTCTTGAACGCCA-3’和Gna1-L-R:5’-CGCAATAACGCAGGCGTTCTGTGACATTAACTTATTTCATGTTCTTTTTAGTTAGACGATTTTAATACAAGCCTCGCCA-3’，扩增重组整合Gna1左臂基因片段；

合成如SEQ ID NO.3所示的启动子P1片段；合成如SEQ ID NO.10所示的编码Gna1的基因片段；

以枯草芽孢杆菌168基因组为模板，以引物Gna1-R-L：5’-ATAACTTGTCAGACTGCCGGGAAATCCCGGCAGTCTTTTTTCCATTAAAACACGGCCCAGTCATAAAATAGTTTTCCTAATAAGACCTGG-3’和Gna1-R-R：5’-CCTACTTAAGCTGCTACCACTTGTGA-3’，扩增重组整合Gna1右臂基因片段。

将Gna1左臂基因片段、P1启动子片段、Gna1的基因片段和Gna1右臂基因片段通过融合PCR技术，构建成重组整合Gna1基因片段，将其命名为Gna1-1。

实施例2构建基因组重组整合Age片段

以枯草芽孢杆菌168基因组为模版，设计引物Age-L-F:5’-CGTGATATCGTCATTCAGTCTCTTGAACGCCA-3’和Age-L-R:5’-CGCAATAACGCAGGCGTTCTGTGACATTAACTTATTTCATGTTCTTTTTAGTTAGACGATTTTAATACAAGCCTCGCCA-3’，扩增重组整合Age左臂基因片段；

合成如SEQ ID NO.8所示的启动子P10启动子片段；

合成如SEQ ID NO.12所示的编码Age的基因片段；

以枯草基因组为模板，以引物Age-R-L：5’-ATAACTTGTCAGACTGCCGGGAAATCCCGGCAGTCTTTTTTCCATTAAAACACGGCCCAGTCATAAAATAGTTTTCCTAATAAGACCTGG-3’和Age-R-R：5’-ATAACCAACGCAGCAAGTGGCAACCT-3’，扩增重组整合Age右臂基因片段。

将Age左臂基因片段、P10启动子片段(SEQ ID NO.8所示)、Age基因片段和Age右臂基因片段通过融合PCR技术，构建成重组整合Age基因片段，将其命名为Age-10。

实施例3构建基因组重组整合NemNeuB片段

以枯草芽孢杆菌168基因组为模版，设计引物NemNeuB-L-F:5’-CGGTGTCTGTATATCACAAAAATAGTGAGCAGGGTAACGA-3’和NemNeuB-L-R:5’-CGCAATAACGCAGGCGTTCTGTGACATTAACTTATTTCCACCTATTTTGTTACAGCGTGTGCCACTTTTATGCA-3’，扩增重组整合NemNeuB左臂基因片段；

分别合成如SEQ ID NO.3～7所示的启动子P1～P5的片段；

合成如SEQ ID NO.2所示的编码N-乙酰神经氨酸合酶基因NeuB的基因片段；

以枯草芽孢杆菌168基因组为模板，以引物NemNeuB-R-L：5’-TAACTTGTCAGACTGCCGGGAAATCCCGGCAGTCTTTTTTCCATTAAAACACGGCGCTTGAACAGCTTTTTTTGAATACCTTGTCCAGCT-3’和NemNeuB-R-R：5’-GCGTCATCGCAGTTTTTGCACCTGACT-3’，扩增重组整合NemNeuB右臂基因片段。

将NemNeuB左臂基因片段、启动子片段(分别如SEQ ID NO.3～7所示)、NemNeuB基因片段和NemNeuB右臂基因片段通过融合PCR技术构建成重组整合NemNeuB基因片段，根据不同启动子不同将其命名为NemNeuB-1～NemNeuB-5。

实施例4重组整合Gna1基因的枯草芽孢杆菌的构建

将重组整合Gna1-1的基因片段转化至枯草芽孢杆菌BSGN6-comK(菌株的构建方法公开于论文《Modular pathway engineering of key carbon-precursor supply-pathways for improved N-acetylneuraminic acid production in Bacillussubtilis》)基因组上，获得的重组枯草芽孢杆菌命名为BS-Gna1。

实施例5重组整合Age基因的枯草芽孢杆菌的构建

将重组整合Age-10的基因片段转化至实施例4构建的重组枯草芽孢杆菌BS-Gna1基因组上，获得的重组枯草芽孢杆菌命名为BSG-Age-10。

实施例6重组整合NemNeuB基因的枯草芽孢杆菌的构建

分别将重组整合NemNeuB-1～NemNeuB-5的基因片段转化至实施例5构建的枯草芽孢杆菌BSG-Age-10基因组上，获得的重组枯草芽孢杆菌命名为BSGA-NemNeuB-1～BSGA-NemNeuB-5。

将重组枯草芽孢杆菌BSGA-NemNeuB-1～BSGA-NemNeuB-5分别接种在LB培养基中，培养12～18h获得OD约为8的种子液，以按体积计1％的接种量将种子液转接于发酵培养基中，于37℃、200rpm培养72h，测定发酵液中NeuAc的产量分别为：7.6g/L、3.4g/L、3.1g/L、2.8g/L、3.7g/L。

对比例1：不同来源N-乙酰神经氨酸合酶的表达效果

将实施例3的N-乙酰神经氨酸合酶NemNeuB替换为大肠杆菌来源的NeuB酶(核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示)，并按照同样的方法将NemNeuB左臂基因片段、P1启动子片段(SEQ ID NO.3所示)、NeuB基因片段和NemNeuB右臂基因片段按顺序进行融合，再按照实施例6的方法构建重组枯草芽孢杆菌，结果显示，在实施例6相同的培养条件下，构建的重组枯草芽孢杆菌NeuAc产量仅0.1g/L。

对比例2：不同来源N-乙酰神经氨酸合酶对表达效果的影响

以实施例6相同的策略，分别将E.coli K1和Moritella viscosa来源的NeuB基因在枯草芽孢杆菌BSG-Age-10中表达，在实施例6相同的培养条件下，发酵16～72h后的神经氨酸产量如表1所示。

表1 表达不同来源NeuB的重组枯草芽孢杆菌神经氨酸产量

对比例3：不同启动子调控不同酶对表达效果的影响

按照实施例2相同的策略，将P10启动子分别替换为P1～P5，构建重组整合Age基因片段，分别命名为Age-1、Age-2、Age-3、Age-4、Age-5，并分别整合至枯草芽孢杆菌BS-Gna1基因组上，获得的重组枯草芽孢杆菌分别命名为BSG-Age-1～BSG-Age-5。

按照实施例6相同的策略，将重组整合NemNeuB-1基因片段分别转化至重组枯草芽孢杆菌BSG-Age-1～BSG-Age-5中，并在与实施例6相同的条件下发酵，结果显示，重组枯草芽孢杆菌BSG-Age-1～BSG-Age-5发酵72h的NeuAc产量分别为1.5g/L、2.2g/L、2.5g/L、3.5g/L和3.2g/L。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种高催化活性神经氨酸合酶及应用

<160> 16

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 349

<212> PRT

<213> Neisseria meningitidis

<400> 1

Met Gln Asn Asn Asn Glu Phe Lys Ile Gly Asn Arg Ser Val Gly Tyr

1 5 10 15

Asn His Glu Pro Leu Ile Ile Cys Glu Ile Gly Ile Asn His Glu Gly

20 25 30

Ser Leu Lys Thr Ala Phe Glu Met Val Asp Ala Ala Tyr Asn Ala Gly

35 40 45

Ala Glu Val Val Lys His Gln Thr His Ile Val Glu Asp Glu Met Ser

50 55 60

Asp Glu Ala Lys Gln Val Ile Pro Gly Asn Ala Asp Val Ser Ile Tyr

65 70 75 80

Glu Ile Met Glu Arg Cys Ala Leu Asn Glu Glu Asp Glu Ile Lys Leu

85 90 95

Lys Glu Tyr Val Glu Ser Lys Gly Met Ile Phe Ile Ser Thr Pro Phe

100 105 110

Ser Arg Ala Ala Ala Leu Arg Leu Gln Arg Met Asp Ile Pro Ala Tyr

115 120 125

Lys Ile Gly Ser Gly Glu Cys Asn Asn Tyr Pro Leu Ile Lys Leu Val

130 135 140

Ala Ser Phe Gly Lys Pro Ile Ile Leu Ser Thr Gly Met Asn Ser Ile

145 150 155 160

Glu Ser Ile Lys Lys Ser Val Glu Ile Ile Arg Glu Ala Gly Val Pro

165 170 175

Tyr Ala Leu Leu His Cys Thr Asn Ile Tyr Pro Thr Pro Tyr Glu Asp

180 185 190

Val Arg Leu Gly Gly Met Asn Asp Leu Ser Glu Ala Phe Pro Asp Ala

195 200 205

Ile Ile Gly Leu Ser Asp His Thr Leu Asp Asn Tyr Ala Cys Leu Gly

210 215 220

Ala Val Ala Leu Gly Gly Ser Ile Leu Glu Arg His Phe Thr Asp Arg

225 230 235 240

Met Asp Arg Pro Gly Pro Asp Ile Val Cys Ser Met Asn Pro Asp Thr

245 250 255

Phe Lys Glu Leu Lys Gln Gly Ala His Ala Leu Lys Leu Ala Arg Gly

260 265 270

Gly Lys Lys Asp Thr Ile Ile Ala Gly Glu Lys Pro Thr Lys Asp Phe

275 280 285

Ala Phe Ala Ser Val Val Ala Asp Lys Asp Ile Lys Lys Gly Glu Leu

290 295 300

Leu Ser Gly Asp Asn Leu Trp Val Lys Arg Pro Gly Asn Gly Asp Phe

305 310 315 320

Ser Val Asn Glu Tyr Glu Thr Leu Phe Gly Lys Val Ala Ala Cys Asn

325 330 335

Ile Arg Lys Gly Ala Gln Ile Lys Lys Thr Asp Ile Glu

340 345

<210> 2

<211> 1050

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atgcaaaaca acaacgaatt taaaatcggc aacagatcag tcggatataa tcatgaaccg 60

cttattatct gcgaaattgg catcaaccat gaaggaagct taaaaacagc ctttgaaatg 120

gtcgatgcag cgtataatgc cggagcagaa gttgtgaaac atcaaacaca tatcgttgaa 180

gatgaaatgt ctgatgaagc caaacaggtg atcccgggca acgcagatgt ctcaatctac 240

gaaatcatgg aaagatgtgc gctgaacgaa gaagatgaaa tcaaactgaa agaatacgtt 300

gaaagcaaag gaatgatctt tatctctaca ccgttttcac gcgctgccgc acttagatta 360

cagcgcatgg atattccggc ctataaaatc ggctctggag aatgcaacaa ctacccgctg 420

atcaaactgg tggcaagctt tggcaaaccg atcatcctgt ctacaggaat gaactcaatc 480

gaaagcatca aaaaatcagt tgaaatcatc agagaagcgg gcgtgccgta tgctctgctt 540

cattgtacaa acatttatcc gacaccgtat gaagatgttc gcctgggcgg aatgaatgat 600

ctttcagaag cctttccgga tgcaattatc ggccttagcg atcatacatt agataactat 660

gcatgcctgg gagcggtggc tcttggcgga tctatcctgg aaagacattt tacagataga 720

atggatcgcc cgggcccgga tatcgtctgt tcaatgaatc cggatacatt taaagaactg 780

aaacaaggag cccatgcact gaaacttgcg agaggcggca agaaagatac aattatcgct 840

ggcgaaaaac cgacaaaaga ttttgcgttt gctagcgtcg ttgcggataa agatattaag 900

aaaggcgaac tgctgtctgg agataacctg tgggtcaaaa gaccgggcaa cggagatttt 960

agcgttaacg aatacgaaac actttttggc aaagtggcgg cttgcaatat ccgcaaagga 1020

gctcagatta agaaaacaga tatcgaataa 1050

<210> 3

<211> 116

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tcatagacct gaaaaggtct ttttttgtac tcttaataat aaaaagaaga tgaaacttgt 60

ttaaggattg aacgtagtag ataataatat taaaactgag aaaggaggtg ataaaa 116

<210> 4

<211> 116

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

attattctta acttttacga aactttgata taataacaaa cgtatatatt agtaatttac 60

ggcttatttt ccttgtgagc gtaaaaataa atgtgactat aaaggaggtg ataaaa 116

<210> 5

<211> 121

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

aaacaatgaa actttttttt ataaaaaacg actattttag gatttcattc ttgtattaaa 60

tagagttgta tttattggaa atttaactca taatgaaagt aatttaaagg aggtgataaa 120

a 121

<210> 6

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ttttcttgac gcccttttga gggaggagta aaatgaaatt gtcaataaat cttaataaag 60

tgcttacaat tgaaagaagt gggggaagag attaaaggag gtgataaaa 109

<210> 7

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

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taataactga caaacatcac cctcttgcta aagcggccaa ggacgccgcc gccggggctg 120

tttgcgttct tgccgtgatt tcgtgtacca ttggtttact tatttttttg ccaaggctgt 180

aatggctgaa aattcttaca tttattttac atttttagaa atgggcgtga aaaaaagcgc 240

gcgattatgt aaaatataaa gtgatagcgg taccattata ggtaagagag gaatgtacac 300

<210> 8

<211> 76

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

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aaaggaggtg ataaaa 76

<210> 9

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<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 9

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Ser Lys Gly Tyr Val Asp Leu Leu Ser Gln Leu Thr Ser Val Gly Asn

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Leu Asp Gln Glu Ala Phe Glu Lys Arg Phe Glu Ala Met Arg Thr Ser

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Val Pro Asn Tyr His Ile Val Val Ile Glu Asp Ser Asn Ser Gln Lys

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Val Val Ala Ser Ala Ser Leu Val Val Glu Met Lys Phe Ile His Gly

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Ala Gly Ser Arg Gly Arg Val Glu Asp Val Val Val Asp Thr Glu Met

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Arg Arg Gln Lys Leu Gly Ala Val Leu Leu Lys Thr Leu Val Ser Leu

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<212> DNA

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atgagaacaa gcgtaccgaa ttatcacatc gtagtaattg aggattccaa cagccagaaa 240

gtggtggcgt ctgctagttt ggttgttgaa atgaaattca ttcatggggc cggatcaagg 300

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<212> PRT

<213> 人工序列

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Leu Asn Asp Val Leu Pro Phe Trp Glu Asn His Ser Leu Asp Ser Glu

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acacttgaaa tggaatggtt actgccgcaa gaaacactgg aaaatgtgct tgctgccaca 600

gtccaggaag ttatgggcga ttttcttgat caagaacagg gattaatgta tgaaaacgtc 660

gctccggatg gctcacatat cgattgcttt gaaggacgcc tgattaatcc gggccatgga 720

atcgaagcga tgtggtttat tatggatatc gctagacgca aaaacgatag caaaacaatc 780

aaccaggcgg ttgatgttgt gttaaatatc ctgaactttg cttgggataa cgaatacggc 840

ggactttact actttatgga tgcagcgggc catccgccgc aacagctgga atgggatcaa 900

aaactttggt gggtgcatct tgaaagctta gtcgcactgg cgatgggcta tagattaaca 960

ggacgcgatg catgttgggc gtggtatcaa aaaatgcatg attattcttg gcagcatttt 1020

gcagatccgg aatatggcga atggtttgga tatcttaaca gacgcggcga agtgcttctg 1080

aacctgaaag gcggaaaatg gaaaggatgc tttcatgtcc cgagagccat gtatctgtgt 1140

tggcaacagt ttgaagcact ttcataa 1167

<210> 13

<211> 346

<212> PRT

<213> Escherichia coli

<400> 13

Met Ser Asn Ile Tyr Ile Val Ala Glu Ile Gly Cys Asn His Asn Gly

1 5 10 15

Ser Val Asp Ile Ala Arg Glu Met Ile Leu Lys Ala Lys Glu Ala Gly

20 25 30

Val Asn Ala Val Lys Phe Gln Thr Phe Lys Ala Asp Lys Leu Ile Ser

35 40 45

Ala Ile Ala Pro Lys Ala Glu Tyr Gln Ile Lys Asn Thr Gly Glu Leu

50 55 60

Glu Ser Gln Leu Glu Met Thr Lys Lys Leu Glu Met Lys Tyr Asp Asp

65 70 75 80

Tyr Leu His Leu Met Glu Tyr Ala Val Ser Leu Asn Leu Asp Val Phe

85 90 95

Ser Thr Pro Phe Asp Glu Asp Ser Ile Asp Phe Leu Ala Ser Leu Lys

100 105 110

Gln Lys Ile Trp Lys Ile Pro Ser Gly Glu Leu Leu Asn Leu Pro Tyr

115 120 125

Leu Glu Lys Ile Ala Lys Leu Pro Ile Pro Asp Lys Lys Ile Ile Ile

130 135 140

Ser Thr Gly Met Ala Thr Ile Asp Glu Ile Lys Gln Ser Val Ser Ile

145 150 155 160

Phe Ile Asn Asn Lys Val Pro Val Gly Asn Ile Thr Ile Leu His Cys

165 170 175

Asn Thr Glu Tyr Pro Thr Pro Phe Glu Asp Val Asn Leu Asn Ala Ile

180 185 190

Asn Asp Leu Lys Lys His Phe Pro Lys Asn Asn Ile Gly Phe Ser Asp

195 200 205

His Ser Ser Gly Phe Tyr Ala Ala Ile Ala Ala Val Pro Tyr Gly Ile

210 215 220

Thr Phe Ile Glu Lys His Phe Thr Leu Asp Lys Ser Met Ser Gly Pro

225 230 235 240

Asp His Leu Ala Ser Ile Glu Pro Asp Glu Leu Lys His Leu Cys Ile

245 250 255

Gly Val Arg Cys Val Glu Lys Ser Leu Gly Ser Asn Ser Lys Val Val

260 265 270

Thr Ala Ser Glu Arg Lys Asn Lys Ile Val Ala Arg Lys Ser Ile Ile

275 280 285

Ala Lys Thr Glu Ile Lys Lys Gly Glu Val Phe Ser Glu Lys Asn Ile

290 295 300

Thr Thr Lys Arg Pro Gly Asn Gly Ile Ser Pro Met Glu Trp Tyr Asn

305 310 315 320

Leu Leu Gly Lys Ile Ala Glu Gln Asp Phe Ile Pro Asp Glu Leu Ile

325 330 335

Ile His Ser Glu Phe Lys Asn Gln Gly Glu

340 345

<210> 14

<211> 1041

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

atgtctaaca tctacatcgt ggcagaaatc ggctgcaatc ataacggatc agtcgatatc 60

gcgagagaaa tgattttaaa agctaaagaa gccggcgtga acgctgtcaa atttcaaaca 120

tttaaagccg ataaactgat cagcgcaatt gcgccgaaag cagaatacca aatcaaaaac 180

acaggagaat tagaatctca gctggaaatg acgaaaaaac tggaaatgaa atacgatgat 240

taccttcatc tgatggaata cgcagtcagc ctgaatcttg atgtttttag cacaccgttt 300

gatgaagatt ctattgattt tctggcgtca ctgaaacaaa aaatctggaa aattccgtca 360

ggcgaactgc ttaaccttcc gtacctggaa aaaatcgcta aacttccgat cccggataag 420

aaaattatca ttagcacagg catggccaca atcgatgaaa tcaaacagtc tgtctcaatc 480

tttatcaata acaaagtccc ggttggaaac atcacaatcc tgcattgtaa cacagaatat 540

ccgacaccgt ttgaagatgt taaccttaac gctatcaacg atctgaaaaa acattttccg 600

aaaaacaaca tcggcttttc tgatcattca agcggatttt atgcagcgat tgctgccgtt 660

ccgtatggca tcacatttat cgaaaaacat tttacactgg ataaaagcat gtctggaccg 720

gatcatcttg cttcaatcga accggatgaa ctgaaacatc tttgcattgg cgttagatgt 780

gtggaaaaat cactgggatc aaatagcaaa gttgtgacag ccagcgaaag aaaaaacaaa 840

atcgttgcac gcaaatctat catcgcgaaa acagaaatca aaaaaggaga agtgttttca 900

gagaaaaata tcacaacaaa aagaccgggc aacggaatta gcccgatgga atggtataat 960

ttactgggca aaatcgcgga acaagatttt atcccggatg aacttatcat ccatagcgaa 1020

tttaaaaacc agggagaata a 1041

<210> 15

<211> 347

<212> PRT

<213> Moritella viscosa

<400> 15

Met Thr Asn Pro Val Phe Glu Ile Ser Gly Arg Lys Val Gly Leu Asp

1 5 10 15

Tyr Ala Pro Leu Val Ile Ala Glu Ile Gly Ile Asn His Glu Gly Ser

20 25 30

Leu Lys Thr Ala Phe Glu Met Val Asp Ala Ala Ile Glu Gly Gly Ala

35 40 45

Glu Ile Ile Lys His Gln Thr His Val Ile Glu Asp Glu Met Ser Ser

50 55 60

Glu Ala Lys Lys Val Ile Pro Gly Asn Ala Asp Val Ser Ile Tyr Glu

65 70 75 80

Ile Met Asp Arg Cys Ser Leu Asn Glu Glu Asp Glu Ile Lys Leu Lys

85 90 95

Lys Tyr Ile Glu Ser Lys Gly Ala Ile Phe Ile Ser Thr Pro Phe Ser

100 105 110

Arg Ala Ala Ala Leu Arg Leu Glu Arg Met Gly Val Ser Ala Tyr Lys

115 120 125

Ile Gly Ser Gly Glu Cys Asn Asn Tyr Pro Leu Leu Asp Leu Ile Ala

130 135 140

Ser Tyr Gly Lys Pro Val Ile Leu Ser Thr Gly Met Asn Asp Ile Pro

145 150 155 160

Ser Ile Arg Lys Ser Val Glu Ile Phe Arg Lys Tyr Lys Thr Pro Leu

165 170 175

Cys Leu Leu His Thr Thr Asn Leu Tyr Pro Thr Pro Asp His Leu Ile

180 185 190

Arg Ile Gly Ala Met Glu Glu Met Gln Arg Glu Phe Ser Asp Val Val

195 200 205

Val Gly Leu Ser Asp His Ser Ile Asp Asn Leu Ala Cys Leu Gly Ala

210 215 220

Val Ala Ala Gly Ala Ser Val Leu Glu Arg His Phe Thr Asp Asn Lys

225 230 235 240

Ala Arg Ser Gly Pro Asp Ile Cys Cys Ser Met Asp Gly Ala Glu Cys

245 250 255

Ala Glu Leu Ile Ser Gln Ser Lys Arg Met Ala Gln Met Arg Gly Gly

260 265 270

Ser Lys Gly Ala Val Lys Glu Glu Gln Val Thr Ile Asp Phe Ala Tyr

275 280 285

Ala Ser Val Val Thr Ile Lys Glu Ile Lys Ala Gly Glu Ala Phe Thr

290 295 300

Lys Asp Asn Leu Trp Val Lys Arg Pro Gly Thr Gly Asp Phe Leu Ala

305 310 315 320

Asp Asp Tyr Glu Met Leu Leu Gly Lys Lys Ala Ser Gln Asn Ile Asp

325 330 335

Phe Asp Val Gln Leu Lys Lys Glu Phe Ile Lys

340 345

<210> 16

<211> 1044

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

atgacaaatc cggtctttga aatttctggc agaaaagttg gacttgatta tgccccgtta 60

gtgatcgcag aaattggcat caaccatgaa ggatcactga aaacagcctt tgaaatggtg 120

gatgcagcga ttgaaggcgg agcagaaatc atcaaacatc aaacacatgt cattgaagat 180

gaaatgtcaa gcgaagcaaa gaaagttatc ccgggcaatg ctgatgtgag catctacgaa 240

atcatggata gatgctctct gaacgaagaa gatgaaatca aactgaaaaa atacatcgaa 300

tcaaaaggcg ctatctttat ctcaacaccg tttagccgcg ctgccgcact gagacttgaa 360

cgcatgggag ttagcgccta taaaattggc tctggagaat gcaataacta tccgctgctt 420

gatcttattg cgtcttatgg caaaccggtc atcttatcaa caggaatgaa tgatattccg 480

tctatcagaa aatcagttga aatctttcgc aaatacaaaa caccgctttg tttactgcat 540

acaacaaacc tgtatccgac accggatcat cttattagaa tcggcgcaat ggaagaaatg 600

caacgcgaat ttagcgatgt tgtggtcgga ctgagcgatc attctatcga taacctggct 660

tgtctgggag ctgtggctgc tggagcttct gtcctggaaa gacattttac agataacaaa 720

gctcgctcag gcccggatat ttgctgtagc atggatggag cggaatgtgc tgaacttatc 780

tctcaatcaa aaagaatggc ccagatgcgc ggcggatcaa aaggcgcagt caaagaagaa 840

caggttacaa ttgattttgc ctatgcaagc gttgtgacaa ttaaagaaat caaagccgga 900

gaagcattta caaaagataa tctgtgggtt aaacgcccgg gcacaggaga ttttcttgcg 960

gatgattatg aaatgctttt aggcaagaaa gcaagccaaa acattgattt tgatgtgcag 1020

ctgaagaaag aatttatcaa ataa 1044

Claims (10)

1.脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis)来源于的N-乙酰神经氨酸合酶在提高枯草芽孢杆菌N-乙酰神经氨酸产量方面的应用，其特征在于，所述N-乙酰神经氨酸合酶为(a)或(b)：

(a)氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的蛋白质；

(b)在(a)的氨基酸序列基础上经过取代、缺失或者添加一个或几个氨基酸且具有N-乙酰神经氨酸合酶活性的酶。

2.一种枯草芽孢杆菌，其特征在于，具有N-乙酰-D-甘露糖胺的合成能力，并表达脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis)来源于的N-乙酰神经氨酸合酶；所述N-乙酰神经氨酸合酶具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。

3.根据权利要求2所述的枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述N-乙酰神经氨酸合酶通过低强度的启动子调控表达。

4.根据权利要求3所述的枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述启动子含有SEQ ID NO.3～7任一所示的核苷酸序列。

5.根据权利要求2～4任一所述的枯草芽孢杆菌，其特征在于，编码所述N-乙酰神经氨酸合酶的基因整合到可以合成N-乙酰-D-甘露糖胺的枯草芽孢杆菌基因组上。

6.根据权利要求2～4任一所述的枯草芽孢杆菌，其特征在于，还强化氨基葡萄糖-6-磷酸-N-乙酰基转移酶和N-乙酰氨基葡萄糖异构酶的表达。

7.根据权利要求6所述的枯草芽孢杆菌，其特征在于，通过SEQ ID NO.3所示的启动子调控氨基葡萄糖-6-磷酸-N-乙酰基转移酶表达，或通过SEQ ID NO.8所示的启动子调控N-乙酰氨基葡萄糖异构酶表达。

8.权利要求2～7任一所述的枯草芽孢杆菌在生产N-乙酰神经氨酸或其衍生产品方面的应用。

9.一种生产神经氨酸的方法，其特征在于，应用权利要求2～7任一所述枯草芽孢杆菌发酵。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述发酵在30～37℃下进行。