JP2016528925A - D−プシコース 3−エピメラーゼの改良された変異体およびその使用 - Google Patents
D−プシコース 3−エピメラーゼの改良された変異体およびその使用 Download PDFInfo
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Abstract
Description
59,7785−7792、中国特許第102373230号明細書)、ルミノコッカス属(Ruminococcus sp.)5_1_39BFAA(DPEase)(Z
hu et al.2012,Biotechnology letters 34,1901−1906)、クロストリジウム・ボルテアエ(Clostridium bolteae)ATCC BAA−613(Jia et al.2013,Applied
Microbiology and Biotechnology DOI 10.1007/s00253−013−4924−8)、クロストリジウム・シンデンス(Clostridium scindens)ATCC 35704(Zhang et al.2013,PLoS ONE 8,e62987)、およびクロストリジウム属(Clostridium sp.)BNL1100(Mu et al.2013,Biotechnology Letter DOI 10.1007/s10529−013−1230−6)に由来する、別の6種のDTEase酵素ファミリーの特性が明らかにされた。さらに、Marutaらが、リゾビウム属(Rhizobium)に属するDTEaseの生成源を開示した(米国特許出願公開第2011/0275138号明細書)。
a.親D−プシコース3−エピメラーゼと比較してより低い、好ましくは6〜7の範囲の最適pH、および/または
b.親D−プシコース3−エピメラーゼと比較して、基質D−フルクトースに対しより高い、好ましくは少なくとも2倍の触媒効率、および/または
c.親D−プシコース3−エピメラーゼと比較して、60℃でのより長い半減期。
− G211S置換を有する配列番号5のアミノ酸配列、あるいは配列番号5と90%もしくは95%、またはそれ以上の同一性を有し、かつ211位にSer残基を有するアミノ酸配列;または
− G210S置換を有する配列番号6のアミノ酸配列、あるいは配列番号6と90%もしくは95%、またはそれ以上の同一性を有し、かつ210位にSer残基を有するアミノ酸配列;または
− G211S置換を有する配列番号7のアミノ酸配列、あるいは配列番号7と90%もしくは95%、またはそれ以上の同一性を有し、かつ211位にSer残基を有するアミノ酸配列;または
− G213S置換を有する配列番号8のアミノ酸配列、あるいは配列番号8と90%もしくは95%、またはそれ以上の同一性を有し、かつ213位にSer残基を有するアミノ酸配列;または
− G223S置換を有する配列番号9のアミノ酸配列、あるいは配列番号7と90%もしくは95%、またはそれ以上の同一性を有し、かつ223位にSer残基を有するアミノ酸配列;または
− G213S置換を有する配列番号10のアミノ酸配列、あるいは配列番号10と90%もしくは95%、またはそれ以上の同一性を有し、かつ213位にSer残基を有するアミノ酸配列。
の染色体に組み込まれていることが好ましい。特定の実施形態では、宿主細胞はGRAS(一般に安全と認められる)菌株、好ましくはバチルス・サブチリス(Bacillus
subtilis)である。いくつかの実施形態では、組換え宿主細胞は、バチロペプチダーゼFをコードする遺伝子が不活性化されているバチルス・サブチリス菌株である。
本明細書において、「DPEase」および「DTEase」という用語は、それぞれ「D−プシコース3−エピメラーゼ」および「D−タガトース3−エピメラーゼ」の代わりとして使用し得る。そして、「DPEase」および「DTEase」は、それぞれ最適基質をD−プシコースおよびD−タガトースとするケトース3−エピメラーゼを意味する。
al and food chemistry 59,7785−7792;「Enzyme Assay」セクション、7787ページ)に開示されているようにして測定することができる。
本発明は、親D−プシコース3−エピメラーゼ変異体であって、親D−プシコース3−エピメラーゼと比較して配列番号2の211位に対応する位置のグリシン残基のセリン残基による置換を含み、かつD−プシコース3−エピメラーゼ活性を有する変異体に関する。
− より低い最適pH、すなわち野生型DPEaseの8.0の代わりに6.5、
− 60℃でのより長い半減期、すなわち6.8の代わりに7.2時間、および
− D−フルクトースに対するより高いkcat/Km、すなわち62.7の代わりに150.6。
a.親D−プシコース3−エピメラーゼと比較して、より低い最適pH、好ましくは6〜7の範囲、および/または
b.親D−プシコース3−エピメラーゼと比較して、基質D−フルクトースに対しより高い触媒効率、好ましくは少なくとも50、75、100、120%高い、より好ましくは少なくとも2倍、および/または
c.60℃でのより長い半減期、好ましくは少なくとも5、10、15もしくは20分、またはそれ以上長い。
11位に対応する位置のグリシン残基のセリン残基による置換を含み、D−プシコース3−エピメラーゼ活性を有し、かつ配列番号2および5〜10からなる群から選択される配列と少なくとも60、70、75、80、85、90もしくは95、またはそれ以上の同一性を有する。さらに、変異体は上で開示したように、項目a)およびb)、項目a)およびc)、項目b)およびc)、または項目a)、b)およびc)の要件を満たすことができる。
er残基を有するアミノ酸配列を有するかまたは含む、DPEase変異体に関する。
本発明は、本発明のDPEase変異体をコードする核酸、または本発明のDPEase変異体をコードする配列を含む核酸に関する。本発明はまた、本発明の核酸の発現カセットに関する。本発明はさらに、本発明の核酸または発現カセットを含むベクターに関する。ベクターは発現ベクターが好ましい。ベクターはプラスミドベクターが好ましい。さらに、本発明は、本発明の核酸、本発明の核酸の発現カセット、または本発明の核酸もしくは発現カセットを含むベクターを含む宿主細胞に関する。本発明のDPEase変異体をコードする核酸は、エピソーム配列として宿主細胞中に存在することができ、あるいは染色体中に組み込むことができる。本発明のDPEase変異体をコードする核酸は、宿主細胞中に1つまたは数個のコピーで存在することができる。
Z4、pC194、ρ11、Φ1およびΦ105を使用できることが好ましい。プラスミド、pHV14、TRp7、YEp7およびpBS7は、2種以上の宿主中で組換え核酸を複製する場合に有用である。これらのベクターにコード核酸配列を挿入するには、この技術分野の従来法を使用することができる。
− 遺伝子の発現レベルが低下するような、またはコードするタンパク質の生物学的活性が変わるような、1つもしくは数個の変異(例えば挿入、削除、またはランダムもしくは定方向変異、例えばフレームシフト変異、点変異、もしくは停止コドンの挿入など)の遺伝子への導入。例えば、本発明との関連では、変異は、DPEaseに対する加水分解活性が非常に低いプロテアーゼの産生をもたらし得る。
− タンパク質の低生産生のものから得られた低強度プロモーターによる、遺伝子の天然
プロモーターの置換、
− 対応するメッセンジャーRNAまたはタンパク質を不安定化する要素の使用、
− 遺伝子またはその一部の削除、特にノックアウト
により得ることができる。
本発明は、D−プシコースを製造するための、本発明のDPEase変異体の使用、および本発明のDPEase変異体を使用することによってD−プシコースを製造する方法に関する。
− 温度:50〜60℃、好ましくは約55℃;および/または
− pH:5.5〜7.5、好ましくは6〜7、より好ましくは約6.5;および/または
− 好ましくはCo2+、Mn2+、Fe2+、Ni2+およびMg2+からなる群から、より好ましくはCo2+、Mn2+、Fe2+およびNi2+からなる群から、さらに好ましくはCo2+およびMn2+からなる群から、最も好ましくはCo2+から選択される2価の金属イオンの存在下で;および/または
− 固定化TDEaseを使用するときには、例えば40〜80mM、好ましくは約60mMのホウ酸塩の存在下で。
発明者らは、部位特異的変異誘発により、211位(配列番号1)でGlyをコードするコドンGGCを、それぞれG211S置換、G211A置換、G211D置換、G21
1T置換、G211W置換およびG211L置換をコードするコドンAGC、GCC、GAC、CGC、TGGおよびCTCで置き換えることによって、クロストリジウム・セルロリティカムのDPEase変異体を調製した。
薬品および試薬
Taq DNAポリメラーゼ、デオキシヌクレオシドトリホスフェート(dNTP)、PCR用薬品、T4 DNAリガーゼおよびプラスミドのミニプレップキットは、Takara(Dalian、China)から入手した。タンパク質精製用の樹脂、Chelating Sepharose Fast FlowはGE(Uppsala、Sweden)から入手した。電気泳動試薬はBio−Radから購入した。酵素アッセイおよびキャラクタリゼーションに使用した、イソプロピルβ−D−1−チオガラクトピラノシド(IPTG)および全ての薬品は、少なくとも分析グレードであり、Sigma(St
Louis、MO、USA)およびSinopharm Chemical Reagent(Shanghai、China)から入手した。オリゴヌクレオチドは、Sangon Biological Engineering Technology and Services(Shanghai、China)により合成された。
プラスミドpET−22(+)は、Novagen(Darmstadt、Germany)から入手した。エシェリキア・コリ(E.coli)DH5αおよびエシェリキア・コリBL21(DE3)は、Tiangen Biotechnology(Beijing、China)から入手した。バチルス・サブチリスWB600およびプラスミドpMA5はInvitrogen(Carlsbad、CA、USA)から入手した。細菌の菌株は、回転振盪機(200rpm)中において、37℃でLuria−Bertani培地により培養した。
(1)タンパク質改変のためのプライマー設計は以下のようにした。
フォワード変異原性プライマー:
テンプレート:pET−Cc−dpe
DNAポリメラーゼ:Pfu
PCRプログラム:Pfu DNAポリメラーゼにより、94℃で30秒、60℃で30秒および72℃で5分、その後72℃で10分の伸長工程からなる20サイクルのPCR増幅を行った。
(3)PCRの後、1ulのDpnI制限酵素(10U/μl)を200μlのPCR生成物に加え、37℃で4時間のインキュベートし、テンプレートのDNAを消化し除去する。
(4)DNAをGel Extraction Kitにより精製した。
(5)16℃で12時間、変異フラグメントの5’−リン酸化反応および連結反応を一緒に行った。反応系は以下の通りである。
(7)プラスミドを抽出し、ヌクレオチド配列決定法により同定した。
(8)再構築したプラスミドをエシェリキア・コリBL21に形質転換した。
(1)PCR
異なる変異体遺伝子をバチルス・サブチリス発現プラスミドにサブクローニングすることに関しては、NdeIおよびBamHI制限部位を導入するために、フォワード
(2)Gel Extraction Kitを用い、PCR生成物を個別に精製する。(3)精製PCR生成物およびバチルス・サブチリスの発現プラスミド、pMA5を制限酵素NdeIおよびBamHIにより消化した。
(4)T4 DNAリガーゼによりDNAフラグメントとpMA5を結合させ、その後、その混合物をエシェリキア・コリ大腸菌DH5αに形質転換した。
(5)形質転換体を、100μg/mLのアンピシリンを含有するLB寒天プレート上、37℃で選択した。
(6)再構築されたプラスミドを抽出し、制限酵素による消化およびヌクレオチド配列決定法により同定した。
(7)野生型または変異体DPEase遺伝子を有する、再構築したpMA5プラスミドを、電気穿孔法により個別にバチルス・サブチリスWB600に形質転換した。形質転換体を、100μg/mLのカナマイシンを含有するLB寒天プレート上、37℃で選択した。
組換えDPEase変異体を精製するために、遠心分離した細胞ペレットを溶解用緩衝液(50mM Tris−HCl、100mM NaCl、pH7.5)に懸濁させ、Vibra−Cell 72405超音波発生装置を用い、4℃で6分間の超音波処理(3秒の脈動、、増幅度90)により崩壊させ、遠心分離(20000g、20分、4℃)により細胞の破片を除去した。予めNi2+でキレート化し、結合緩衝液(50mM Tris−HCl、500mM NaCl、pH7.5)で平衡化した、Chelating
Sepharose Fast Flow樹脂カラム(1.0cm×10.0cm)に、細胞を含まない抽出物を適用した。結合していないタンパク質は、洗浄緩衝液(50mM Tris−HCl、500mM NaCl、50mM イミダゾール、pH7.5)によってカラムから溶出した。その後、溶出緩衝液(50mM Tris−HCl、500mM NaCl、500mM イミダゾール、pH7.5)によって、DPEase変異体をカラムから溶出した。活性画分をプールし、10mMのエチレンジアミンテトラ酢酸(EDTA)を含む50mMのTris−HCl緩衝液(pH7.5)を用い、4℃、48時間の終夜透析を行った。続いて、50mMのEDTA不含Tris−HCl緩衝液(pH7.5)を用い、酵素を透析した。
D−フルクトースから生成したD−プシコースの量を定量し、活性を測定した。1mLの反応混合物は、D−フルクトース(50g/L)、Tris−HCl緩衝液(50mM、pH8.0)、0.1mM Co2+および0.5μMの酵素を含んだ。反応混合物を55℃で2分間インキュベートし、10分後、煮沸により反応を停止させた。HPLC法により生成したD−プシコースを定量した。酵素活性の1単位を、pH8.0、55℃で、1μmolD−プシコース/minの生成を触媒した酵素の量と定義した。
35〜70℃の範囲で2分間、酵素試料を試験して酵素活性の最適温度を測定した。酵素活性の最適pHを測定するために、2つの緩衝液系、すなわちリン酸ナトリウム(50
mM、pH6.0〜7.0)およびTris−HCl緩衝液(50mM、pH7.5〜9.0)を使用した。Tris−HCl緩衝液(50mM、pH8.0)中の酵素を各種温度でインキュベートすることにより、酵素の熱安定性を調べた。所定の時間間隔で試料を取り出し、標準試験条件で残留活性を測定した。pH安定性を調べるために、pH6.0〜9.0、4℃で最長2時間、酵素をインキュベートし、標準試験条件で、時間間隔を置いて残留酵素活性を測定した。
0.1mMのCo2+および5〜200mMの基質を含有する、50mM Tris−HCl緩衝液(pH8.0)中で、55℃での反応に対するDPEase変異体の動力学的パラメータを決定した。10分後、煮沸により酵素反応を停止させ、HPLC分析によりD−プシコースの量を決定した。ラインウィーバー・バークの式および酵素濃度の定量化により、ミカエリス・メンテン定数(Km)および基質に対するターンオーバー数(kcat)の値などの動力学的パラメータを得た。
D−フルクトースおよびD−プシコースの濃度を、示差屈折率検出器およびCa2+−炭水化物用カラム(Waters Sugar−Pak 1、Waters Corp.、Milford、MA)を具備したHPLCにより、カラムを85℃、0.4mL/minの水で溶出して分析した。タンパク質濃度は、ウシ血清アルブミンを標準物質に用い、ブラッドフォード法により決定した。Laemmli法によりSDS−PAGEを実施した。ゲル(12重量/体積%のポリアクリルアミド)を、クマシーブリリアントブルーにより染色し、10%(体積/体積)メタノール/10%(体積/体積)酢酸の水性混合物で脱色した。
本発明者らは、D−プシコースエピメラーゼを染色体に組込んだ5種の菌株を構築した。抗生物質の添加および菌株中の抗生物質耐性遺伝子(ARG)を避けるために、ARGを挿入しない染色体組込みを行う2つの方法、すなわち、Cre/LoxおよびmazFをベースとした系により菌種を構築した。Cre/Lox系は、ARGを染色体に組込んだ菌株を構築し、Creリコンビナーゼによりそれをノックアウトする(方法1)。他の方法は、mazF遺伝子を染色体に組込んだ菌株を構築し、p43−DPE遺伝子によりそれをノックアウトする(方法2)。バチルス・サブチリスの3種の菌株、すなわち、1A751、WB600およびWB800を宿主株として使用した。
1.1序論
Cre/Lox組換え系は、今日、強力なDNA組換えツールとして認められている簡素な2成分系である。Cre/Lox系の一般的原理は、2つのloxP部位(これらの34bpの各標的DNA配列は、中央の方向性のある8bpからなるコアの両側に位置する2つの13bpからなる逆方向の繰り返し配列からなる)の間のDNAを認識し、結合し、組換えるCreリコンビナーゼの能力に拠る。Cre/Lox組換え系を使用することによって、抗生物質耐性遺伝子(ARG)をノックアウトした。
ARGのない染色体組込みがなされた菌株の構築は、Cre/Lox組換え系に基づき、次のような複数の工程を含む(図4も参照):
a.オーバーラップエクステンションPCR法によるプロモーターp43を有するDPEaseコード遺伝子の切断
プロモーターp43とDPEaseコード遺伝子をオーバーラップエクステンションPCR法により切断した。その後、PCR生成p43−DPEカセットをpMD19−Tにクローニングして、pP43DPEを作った。
プラスミドpDGI−7S6−DPEを次のように構築した。両側にSalIおよびXmaIを有するフラグメントを含むlox71−spc−lox66カセットをp7S6からpDGIEFの対応する部位に転移させてpDGI−7S6を得、その後、NheI/SalI消化pP43DPEをpDGI−7S6の対応する部位にクローニングしてpDGI−7S6−DPEを得た(図4)。
pDGI−7S6−DPEプラスミドをXho Iにより線形化し、化学変換によりバチルス・サブチリス(B.subtilis)菌株(1A751、WB600、WB800)に形質転換した[Keith et al.,Appl Microbiol Biotechnol,2013,97:6803−6811(宿主 1A751);Zhang et al.,Bioresource Technology,2013,146:543−548(宿主 WB600);Nguyen et al.Microbial Cell Factories 2013,12:79(宿主 WB800)]。バチルス・サブチリス(B.subtilis)アミラーゼ遺伝子相同アームを、組込みベクターおよび染色体DNA間の相同組換えに使用した。染色体組込みにより、p43−DPEカセットおよびlox71−spc−lox66カセットを染色体DNAに挿入した。
スペクチノマイシン100μg/mLを含むLBプレート上で、組換え株をスクリーニングした。
Creリコンビナーゼ遺伝子を有するpTSCプラスミドをバチルス・サブチリス(pDGI−7S6−DPE)コンピテント細胞に形質転換した。バチルス・サブチリス(7S6−DPE、pTSC)菌株をエリスロマイシン200μg/mLを含むLBプレートでスクリーニングした。
スペクチノマイシン耐性遺伝子がノックアウトされれば、菌株はエリスロマイシン200μg/mLおよびスペクチノマイシン100μg/mLを含むLBプレート上で増殖できないが、エリスロマイシン200μg/mLを含むLBプレート上では増殖できる。これに基づき、バチルス・サブチリス(lox−DPE、pTSC)菌株をスクリーニングし、選択した。
pTSCは、プレートが42℃でインキュベートされた場合に複製できない温度感受性プラスミドであった。pTSCプラスミドがバチルス・サブチリス菌株中に欠失すると、菌株はエリスロマイシン200μg/mLを含むLBプレート上で増殖できない。42℃で2日間インキュベート後、バチルス・サブチリス(lox−DPE)菌株をLBプレートおよびエリスロマイシン200μg/mLを含むLBプレート上でスクリーニングし、選択した。
抗生物質耐性遺伝子のノックアウトを確認するために2つの方法、PCRおよび抗生物質プレート上でのスクリーニングを用いた。PCR増幅は、バチルス・サブチリスアミラーゼ相同アーム遺伝子を用いて行った。DNAフラグメントの配列を決定し、抗生物質耐性遺伝子配列とアライメントして、抗生物質耐性遺伝子がノックアウトされたことを確認した。それと同時に、抗生物質耐性遺伝子のプライマーも使用した。PCR増幅ができないなら、構築した菌種に抗生物質耐性遺伝子は存在しない。他の試験方法は、抗生物質プレートによるスクリーニングであった。菌株が抗生物質プレート上で増殖できなかったなら、抗生物質耐性遺伝子はノックアウトされた。
2.1序論
mazFは、バチルス・サブチリスのマーカーなしの染色体操作のための新規なカウンターセレクション可能なマーカーとして使用することができるエシェリキア・コリ毒素遺伝子である。mazFをキシロース誘導発現系の制御下に置いた。mazFカセットを有するバチルス・サブチリス菌株は、キシロース含有培地で増殖することはできない。mazFカセットをp43−DPEカセットで置き換えれば、キシロース含有培地で増殖することができる。
バチルス・サブチリスのマーカーなしの染色体組込みは、これに基づき、次のような複数の工程を含む(図7も参照):
a.再構築プラスミドpDGI−DPEを作るための、p43−DPE遺伝子(p43−DPE)のシャトルプラスミドベクターpDGIEFへの挿入。
プラスミドpDGI−DPEを次のように構築した。両側にXma IおよびSal Iを有するフラグメントを含むp43−DPEカセットをp43DPEからpDGIEFの対応する部位に移入して、pDGI−DPEを得る。(図6)
pDGREFプラスミドをCla Iにより線形化し、化学変換によりバチルス・サブチリス菌株(1A751、WB600、WB800)に形質転換した。バチルス・サブチ
リスアミラーゼ遺伝子相同アームを、組込みベクターおよび染色体DNA間の相同組換えに使用した。染色体組込みにより、mazFカセットを染色体DNAに挿入した。
スペクチノマイシン100μg/mLを含むLBプレート上で、組換え株をスクリーニングした。その後、陽性クローンを、スペクチノマイシン(100μg/mL)−キシロース(2%)含有LBプレートおよびスペクチノマイシン(100μg/mL)含有LBプレートにそれぞれ画線した。キシロース含有LBプレートで増殖できなかった陽性クローンを次工程で使用した。
p43−DPE遺伝子を有するpDGI−DPEプラスミドをXho Iによって線形化し、バチルス・サブチリスコンピテント細胞に形質転換した。バチルス・サブチリス(DPE)菌株を2%のキシロースを含有するLBプレートでスクリーニングした。
5種の菌株をこれらの2つの方法により選択した。バチルス・サブチリス菌株を選択後、実験室培地で培養した。酵素活性を実施例1で記載のようにして決定し、DPEaseコード遺伝子が染色体DNAに挿入されたことを確認した。酵素活性を選択した全ての菌株で決定した。最も高い酵素活性は1A751株で検出された。その酵素活性は、プラスミド依存バチルス・サブチリスで検出された初期の活性に近い03.45U/mLに達した。
Claims (25)
- 親D−プシコース3−エピメラーゼの変異体であって、親D−プシコース3−エピメラーゼと比較して、配列番号2の211位に対応する位置のグリシン残基のセリン残基による置換を含み、かつD−プシコース3−エピメラーゼ活性を有し、前記親D−プシコース3−エピメラーゼが配列番号2および5〜10からなる群から選択される配列と60%またはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する変異体。
- 請求項1に記載の変異体であって、以下:
a.親D−プシコース3−エピメラーゼと比較してより低い、好ましくは6〜7の範囲の最適pH、および/または
b.親D−プシコース3−エピメラーゼと比較して、基質D−フルクトースに対しより高い、好ましくは少なくとも2倍の触媒効率、および/または
c.親D−プシコース3−エピメラーゼと比較して、60℃でのより長い半減期、
の1つもしくは複数の特徴を有する、変異体。 - 配列番号2および5〜10からなる群から選択される配列と60%またはそれ以上、好ましくは少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、またはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する請求項1または2に記載の変異体。
- 前記親D−プシコース3−エピメラーゼは、シュードモナス・シコリイ(Pseudomonas cichorii)由来のD−タガトース3−エピメラーゼ、アグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)由来のD−プシコース3−エピメラーゼ、クロストリジウム属(Clostridium sp.)由来のD−プシコース3−エピメラーゼ、クロストリジウム・シンデンス(Clostridium scindens)由来のD−プシコース3−エピメラーゼ、クロストリジウム・ボルテアエ(Clostridium bolteae)からのD−プシコース3−エピメラーゼ、ルミノコッカス属(Ruminococcus sp.)由来のD−プシコース3−エピメラーゼ、およびクロストリジウム・セルロリティカム(Clostridium cellulolyticum)由来のD−プシコース3−エピメラーゼから選択される請求項1〜3のいずれか一項に記載の変異体。
- 前記親D−プシコース3−エピメラーゼは、クロストリジウム・セルロリティカム由来のD−プシコース3−エピメラーゼである請求項1〜4のいずれか一項に記載の変異体。
- 配列番号4のアミノ酸配列、あるいは配列番号4と90%もしくは95%、またはそれ以上の同一性を有し、211位にSer残基を有するアミノ酸配列を、含むかまたはそれからなる請求項5に記載の変異体。
- G211S置換を有する配列番号5のアミノ酸配列、あるいは配列番号5と90%もしくは95%、またはそれ以上の同一性を有し、かつ211位にSer残基を有するアミノ酸配列を、含むかまたはそれからなる請求項4に記載の変異体。
- G210S置換を有する配列番号6のアミノ酸配列、あるいは配列番号6と90%もしくは95%、またはそれ以上の同一性を有し、かつ210位にSer残基を有するアミノ酸配列を、含むかまたはそれからなる請求項4に記載の変異体。
- G211S置換を有する配列番号7のアミノ酸配列、あるいは配列番号7と90%もしくは95%、またはそれ以上の同一性を有し、かつ211位にSer残基を有するアミノ酸配列を、含むかまたはそれからなる請求項4に記載の変異体。
- G213S置換を有する配列番号8のアミノ酸配列、あるいは配列番号8と90%もしくは95%、またはそれ以上の同一性を有し、かつ213位にSer残基を有するアミノ酸配列を、含むかまたはそれからなる請求項4に記載の変異体。
- G223S置換を有する配列番号9のアミノ酸配列、あるいは配列番号7と90%もしくは95%、またはそれ以上の同一性を有し、かつ223位にSer残基を有するアミノ酸配列を、含むかまたはそれからなる請求項4に記載の変異体。
- G213S置換を有する配列番号10のアミノ酸配列、あるいは配列番号10と90%もしくは95%、またはそれ以上の同一性を有し、かつ213位にSer残基を有するアミノ酸配列、含むかまたはそれからなる請求項4に記載の変異体。
- 請求項1〜12のいずれか一項に記載の変異体をコードする単離された核酸。
- 請求項13に記載の核酸を含む組換え発現ベクター。
- 請求項13に記載の核酸、または請求項14に記載の組換え発現ベクターを含む組換え宿主細胞。
- 前記変異体をコードする核酸が染色体に組み込まれている請求項15に記載の組換え宿主細胞。
- GRAS(一般に安全と認められる)菌株、好ましくはバチルス・サブチリス(Bacillus subtilis)である請求項15または16に記載の組換え宿主細胞。
- バチロペプチダーゼFをコードする遺伝子が不活性化されているバチルス・サブチリス菌株である請求項17に記載の組換え宿主細胞。
- 請求項15〜18のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞を培養する工程、および、任意選択により、得られた培養物から生成したD−プシコース3−エピメラーゼ変異体を回収する工程を含む、D−プシコース3−エピメラーゼ変異体の製造方法。
- D−プシコース3−エピメラーゼ活性に適した条件下で、請求項1〜12のいずれか一項に記載の変異体をD−フルクトースと接触させる工程、および、任意選択により、生成したD−プシコースを回収する工程を含む、D−プシコースの製造方法。
- 前記D−フルクトースが、グルコースイソメラーゼによりD−グルコースから予めまたは同時に製造される、請求項20に記載の方法。
- 請求項1〜12のいずれか一項に記載のD−プシコース3−エピメラーゼ変異体と、追加の酵素、特にグルコースイソメラーゼとを含む、酵素組成物。
- 請求項1〜12のいずれか一項に記載のD−プシコース3−エピメラーゼ変異体、または請求項15〜18のいずれか一項に記載の宿主細胞の、D−プシコースを製造するための使用。
- 請求項17または18に記載の宿主細胞の、食品を調製するための使用。
- 請求項17または18に記載の宿主細胞を含む食品。
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