CN110452899B

CN110452899B - 一种葡萄糖异构酶、突变体及其在制备d-果糖中的应用

Info

Publication number: CN110452899B
Application number: CN201910594155.5A
Authority: CN
Inventors: 柳志强; 贾东旭; 徐海鹏; 李军良; 金利群; 郑裕国; 陈德水; 廖承军; 程新平; 李勉
Original assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Current assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Priority date: 2019-07-03
Filing date: 2019-07-03
Publication date: 2021-04-30
Anticipated expiration: 2039-07-03
Also published as: CN110452899A

Abstract

本发明涉及一种耐高温葡萄糖异构酶、突变体及其在制备D‑果糖中的应用。所述葡萄糖异构酶氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述突变体由序列如SEQ ID NO：3所示的氨基酸经定点突变而来。本发明提供了一种未被鉴定的全新耐高温葡萄糖异构酶及其突变体，该突变体具有超级最适反应温度120℃，比原始酶GtAI提高了60℃，属于文献报道的最高水平，解决了现有酶无法在高温生产高果糖浆的技术难题。使用本突变酶生产高果糖浆转化率最高可达75.7％，高于原始酶和其他突变酶的转化效果，同时也是文献报道的最高水平，具有较好应用前景。

Description

一种葡萄糖异构酶、突变体及其在制备D-果糖中的应用

(一)技术领域

本发明涉及一种未被鉴定的耐高温葡葡萄糖异构酶及其突变体，以及该突变体在制备D-果糖中的应用。

(二)背景技术

葡萄糖异构酶(glucose isomerase，简称GI，EC 5.3.1.5)，在体外主要用于催化D-葡萄糖异构化生成D-果糖，是工业上利用生物转化法制备高果糖浆的关键酶。高果糖浆(high fructose corn syrup，简称HFCS)是D-葡萄糖和D-果糖组成的混合物，是一种重要的甜味剂。根据其果糖含量的不同，高果糖浆主要有3种产品：HFCS-42、HFCS-55和HFCS-90。其中，HFCS-55的甜度优于蔗糖，是市场上的主流产品。

目前工业化主要采用嗜中温GI制备HFCS-42，GI催化剂主要来源于Bacilluscoagulans、Streptomyces murinus和Streptomyces rubiginosis等野生菌(Deng H.etal.，Bioprocess BiosystemEngineering，37：1211-1219，2014)。上述GI只能在60-65℃的异构化温度进行催化反应，果糖转化率仅42-45％，故需要将其浓缩至HFCS-90，再与HFCS-42勾兑制得HFCS-55，该过程能耗巨大(Jia D.X.et al，Journal of Bioscience andBioengineering，126：176-182，2018)。

GI介入的D-葡萄糖异构化过程是一个热力学平衡反应，随着异构化温度的升高，会促进异构化反应向果糖方向进行。如果能在高温下催化直接生成55％的D-果糖浓度的HFCS，可简化后续富集和勾兑步骤，大幅降低生产成本，对推进高果糖浆的生产技术升级具有重要意义。尽管有关于耐热GI的报道，例如Thermotoga maritime GI和Thermusthermophiles GI等，其最适温度分别达到105℃和95℃，但是，这些酶并没有制成酶制剂成功投放于市场，主要原因是该耐高温酶在高温的热稳定性没有达到工业化生产的要求(Dicosimo R.et al，Chemical Society Reviews，42：6437-6474，2013)。

(三)发明内容

本发明提供一种未被鉴定的全新耐高温葡萄糖异构酶及其突变体，以及该突变体在制备D-果糖中的应用。

本发明采用的技术方案是：

一种耐高温葡萄糖异构酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。其编码基因序列如SEQ ID NO.4所示。

本发明还涉及一种葡萄糖异构酶突变体，由序列如SEQ ID NO：3所示的氨基酸经定点突变而来，所述突变的位点为下列中的一个或多个：(1)第17位、(2)第401位、(3)第192位、(4)第213位。

具体的，所述突变体可由SEQ ID NO：3所示的氨基酸将第17位、第401位、第192位和第213位中的一位、两位、三位或者四位氨基酸突变为丝氨酸、色氨酸或半胱氨酸而得(多点突变时，各位点各自独立突变为三者之一)。

优选的，所述突变体为下列之一：(1)将SEQ ID NO.3所示氨基酸序列的第17位谷氨酰胺(Q)突变为丝氨酸(S)；(2)将SEQ ID NO.3所示氨基酸序列第17位谷氨酰胺(Q)突变为丝氨酸(S)、第401位苯丙氨酸(F)突变为色氨酸(W)；(3)将SEQ ID NO.3所示氨基酸序列第17位谷氨酰胺(Q)突变为丝氨酸(S)、第401位苯丙氨酸(F)突变为色氨酸(W)，第192位苏氨酸(T)突变为丝氨酸(S)；(4)将SEQ ID NO.3所示氨基酸序列第17位谷氨酰胺(Q)突变为丝氨酸(S)、第401位苯丙氨酸(F)突变为色氨酸(W)，第192位苏氨酸(T)突变为丝氨酸(S)，同时第213位甘氨酸(G)突变为半胱氨酸(C)。

更为优选的，所述突变体氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。

本发明运用基因挖掘技术，从National Center for BiotechnologyInformation(NCBI)数据库中获得未被研究的新型GI，通过基因工程技术表达该重组酶，运用蛋白质工程技术进行分子改造，将在高温下活性提高的GI突变体用于高温下生产HFCS-55型高果糖浆，对于填补缺乏耐高温酶的市场空白具有重大意义。

所述突变体可由如下方法获得：根据GtAI基因，设计定点突变的突变引物，以携带重组酶的克隆载体为模板进行定点突变构建突变体，以质粒pET28b或能表达该酶的载体为表达载体，将重组质粒转化Escherichia coli BL21(DE3)细胞或能表达该酶的宿主细胞，挑选验证后的阳性单克隆进行发酵培养。

本发明还涉及所述的葡萄糖异构酶突变体在微生物催化D-葡萄糖异构化制备D-果糖中的应用。

由所述耐高温葡萄糖异构酶突变体编码基因构建重组载体，由所述重组载体转化即可获得的重组基因工程菌。

具体的，所述应用为：以含耐高温葡萄糖异构酶突变体基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体为酶源，以D-葡萄糖为底物，以锰盐为助剂，以Na₂HPO₄/NaH₂PO₄缓冲液为反应介质，在50～130℃(优选100～120℃，最优选120℃)，100～300r/min条件下反应，制得D-果糖。

优选的，所述反应体系中，底物初始浓度为50～700g/L(优选600g/L)，湿菌体的用量为10～50g/L(优选25g/L)，所述镁盐终浓度为5～25mM(优选10mM)。

所述湿菌体可按如下方法制备：构建含有所述耐高温葡萄糖异构酶突变体基因的重组载体，将所述重组载体转化至E.coli中，获得的重组基因工程菌进行诱导表达，取培养液分离得到湿菌体细胞。具体为：将含耐高温葡萄糖异构酶突变体基因的工程菌接种至含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基，在37℃、150r/min培养10h，获得种子液；将种子液以2％(v/v)接种量接种至新鲜的含有终浓度50μg/mL卡那霉素的LB培养基中，于37℃、150r/min培养OD₆₀₀至0.6～0.8，再向培养液中加入终浓度为1mM的IPTG，于28℃诱导10h，8000r/min离心10min，弃去上清液，收集湿菌体；所述LB培养基组成：胰蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L，溶剂为水，pH值自然。

本发明有益效果主要体现在：本发明提供了一种未被鉴定的全新耐高温葡萄糖异构酶及其突变体，该突变体具有超级最适反应温度120℃，比原始酶GtAI提高了60℃，属于文献报道的最高水平，解决了现有酶无法在高温生产高果糖浆的技术难题。使用本突变体生产高果糖浆，GtAI突变体酶所生产的高果糖浆的转化率最高可达75.7％，高于原始酶和其他突变酶的转化效果，同时也是文献报道的最高水平。

(四)附图说明

图1为GtAI突变体的最适温度示意图；

图2为GtAI突变体的最适金属离子筛选示意图；

图3为GtAI及其突变体的重组菌异构化生产高果糖浆的应用示意图。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：新型GI的筛选

1、酶的来源与基因合成

从NCBI数据库中获得糖异构酶，分别来源于Kitasatospora setae(GenBank编号WP_014140463.1)、Geobacillus thermodenitrificans(GenBank编号AAQ72737.2)、Isoptericola variabilis(GenBank编号WP_013837964.1)，命名为KsAI、GtAI和IvAI。依据大肠杆菌密码子偏好性进行密码子优化，通过基因工程的常规操作以全合成的方法合成了三条选择的核苷酸序列，分别如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.6所示；编码酶的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.5所示。在核酸序列末端加入6×his-tag标签，两端加入酶切位点Xba I和Xho I，将该基因克隆至pET28b(+)对应的Xba I和Xho I位点，获得重组表达质粒pET28b/TxAI、pET28b/GtAI和pET28b/IvAI。

2、重组工程菌的诱导表达

LB液体培养基组成：胰蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L，溶剂为水，pH值自然；LB固体培养基在LB液体培养基中添加20g/L琼脂；121℃高压灭菌20min；使用前添加终浓度50μg/mL卡那霉素。

将基因工程菌接种至含终浓度50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基，在37℃、150r/min培养至OD₆₀₀约0.6～0.8，获得种子液；将种子液以体积浓度2％接种量接种至新鲜的含有终浓度50μg/mL卡那霉素的LB培养基中，于37℃、150r/min培养OD₆₀₀至0.6～0.8，再向培养液中加入终浓度为1mM的IPTG，于28℃下诱导表达10h后，4℃、8000r/min离心10min，弃去上清液，用0.85％的生理盐水清洗两遍湿菌体，并收集湿菌体，备用。

3、重组酶的底物特异性研究

采用超声破碎方法对湿菌体进行超声破碎，取1g制备的湿菌体，用10mL Tris-HCl(pH 8.0)缓冲液悬浮，在39W条件下超声破碎5min，制备获得无细胞抽提液(即超声破碎后的混悬液)，离心，收集上清液，取1mL上清液用于反应。反应体系：Tris-HCl(pH 7.0)缓冲液、1mM Co²⁺和10mM Mg²⁺、200mM各种单糖(见表1)及200μL酶液，共5mL体系。反应条件：于85℃条件下反应10min，冰浴10min终止反应，8000r/min离心10min，取上清液。

对于各个底物的活力测定采用半胱氨酸-咔唑法。取一定浓度的糖溶液，依次加入0.1mL的1.5％(w/v)半胱氨酸盐酸盐溶液、3mL 75％(w/w)浓硫酸溶液、0.1mL的0.12％(w/v)咔唑乙醇溶液，85℃冰浴10min，冰浴10min，于波长560nm下测定吸光度值，并作空白对照。每min将糖底物异构化生成1μmol糖产物所需酶量定义为一个酶活单位(U)。以TxAI对D-半乳糖为底物反应测定的酶活为100％。由表1结果可知，GtAI对D-葡萄糖具有最高酶活，该酶可催化D-葡萄糖至D-果糖的异构化反应。

表1：各酶的底物特异性研究

4、GtAI重组工程菌GI酶活的精确测定

采用超声破碎方法对湿菌体进行超声破碎，取1g制备的湿菌体，用10mL Tris-HCl(pH 8.0)缓冲液悬浮，在39W条件下超声破碎5min，制备获得无细胞抽提液(即超声破碎后的混悬液)，离心，收集上清液，取1mL上清液用于反应。反应体系：Tris-HCl(pH 7.0)缓冲液、1mM Co²⁺和10mM Mg²⁺、200mM的D-葡萄糖及200μL酶液，共5mL体系。反应条件：于85℃条件下反应10min，冰浴10min终止反应，8000r/min离心10min，取上清液；采用HPLC检测D-果糖的浓度。分析柱为Hypersil NH2柱(250×4.6mm，5μm)(依利特分析仪器有限公司，大连，中国)。Waters 2414示差折光检测器，Waters 1525泵，Waters 717进样器。酶活定义：85℃和pH 7.0下，每分钟将D-葡萄糖异构化生成1μmol D-果糖所需酶量定义为一个酶活单位(U)。

表2：重组GtAI的酶活测定

实施例2：GtAI单位点突变体的构建与筛选

1、突变体构建

根据GtAI亲本(亲本GtAI来源于Geobacillus thermodenitrificans，GenBank编号为AAQ72737.2)序列(氨基酸序列为SEQ ID NO.3所示，核苷酸序列为SEQ ID NO.4所示)设计定点突变的突变引物，利用快速PCR技术，以重组载体pET28b/GtAI为模板，对第17位引入单突变，引物为：

正向引物GGAAGCCAGNNKTTATACGGGGAA(下划线为突变碱基)

反向引物CCCGTATAAMNNCTGGCTTCCTGT(下划线为突变碱基)

PCR反应体系：2×Phanta Max Buffer(含Mg²⁺)25μL，dNTPs 10mM，正向引物2μL，反向引物2μL，模板DNA1μL，Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 50U，加入ddH₂O至50μL。

PCR扩增条件为95℃3min；(95℃15s，55℃20s，72℃7min)30循环；72℃10min。

取5μL的PCR产物，加入100μL冰浴的感受态细胞悬液中，冰上静置30min，将转化产物于42℃热击90s，迅速置于冰上冷却2min，向管中加入600μL的LB液体培养基，37℃，150r/min培养60min，取100μL上述菌液涂板，待菌液完全被培养基吸收后，37℃倒置培养12h。

2、高通量筛选阳性转化子

配制反应混合液终浓度组成为：50mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.0)、1mM Co²⁺、10mMMg²⁺、200mM葡萄糖。反应混合液85℃保温3min，快速吸取1mL加入含有菌体的1.5mL离心管中，振荡器振荡混匀后在85℃、500r/min反应10min，冰浴3min停止反应。以半胱氨酸-咔唑显色法筛选突变体，在1.5mL离心管中进行，反应体包括反应液167μL的1.5％(w/v)半胱氨酸盐酸盐，1000μL的70％(w/w)浓硫酸、33μL的0.12％(w/v)咔唑乙醇。85℃下保温10min后观察颜色变化，以野生型葡萄糖异构酶产生菌株E.coli BL21(DE3)/pET28b/GtAI(SEQ IDNO.4所示基因转入E.coli BL21(DE3)制成)作为对照，颜色比野生型深的突变株进行酶活测定。

3、阳性转化子发酵产酶

同实施例1的“重组工程菌的诱导表达”。

4、酶活测定

同实施例1的“GtAI重组工程菌GI酶活的精确测定”。

该实施例的结果为：运用高通量筛选，对604株重组转化菌初筛，筛选出2株酶活提高的突变株，再对其进行酶活测定，具体结果见表3。经分析确定，其余602重组菌酶活保持不变或下降的原因是第17位谷氨酰胺(Q)突变为S和W外的其他氨基酸。

表3：单点突变重组菌的酶活测定

将酶活提高最显著的突变体GtAI-Q17S记为GtAI1，获得重组菌E.coli BL21(DE3)/pET28b/GtAI1。

实施例3：GtAI二位点突变体的构建与筛选

根据实施例2构建的单突变体GtAI1氨基酸序列对应的核苷酸序列设计定点突变的突变引物，利用快速PCR技术，以重组载体pET28b/GtAI1为模板，对第401位引入单突变，引物为：

正向引物GGGCACCGTNNKCGTCTCATTGTC(下划线为突变碱基)

反向引物AATGAGACGMNNACGGTGCCCTAA(下划线为突变碱基)

PCR反应体系：2×Phanta Max Buffer(含Mg²⁺)25μL，dNTPs 10mM，正向引物2μL，反向引物2μL，模板DNA 1μL，Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 50U，加入ddH₂O至50μL。

PCR产物转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞，挑单克隆于含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养过夜。利用半胱氨酸-咔唑法显色法对突变体进行初筛(同实施例2的“高通量筛选阳性转化子”)。

采用超声破碎方法对湿菌体进行超声破碎，对初筛的阳性突变株进行酶活测定(同实施例1的“GtAI重组工程菌GI酶活的精确测定”)。

该实施例的结果为：运用高通量筛选方法，对577重组转化菌初筛，筛选出9株酶活提高的突变株，再对其进行酶活测定，具体结果见表4。经分析确定，其余568组菌酶活保持不变或下降的原因是第401位苯丙氨酸(F)突变为K、D、L、M、W、N、S、P和H外的其他氨基酸。

表4：双点突变重组菌的酶活测定

将酶活提高最多的突变体GtAI-F401W记为GtAI2，获得重组菌E.coli BL21(DE3)/pET28b/GtAI2。

实施例4：GtAI三位点突变体的构建与筛选

根据实施例3构建的突变体GtAI2氨基酸序列对应的核苷酸序列设计定点突变的突变引物，利用快速PCR技术，以重组载体pET28b/GtAI2为模板，对第192位引入单突变，引物为：

正向引物GTGGCGGTANNKGAAGGGGACAAA(下划线为突变碱基)

反向引物GTCCCCTTCMNNTACCGCCACTTC(下划线为突变碱基)

该实施例的结果为：对497株重组转化菌初筛，筛选出3株酶活提高的突变株，再对其进行酶活测定，具体结果见表5。经分析确定，其余494重组菌酶活保持不变或下降的原因是第192位苏氨酸(T)突变为P、S和C外的其他氨基酸。

表5：三点突变重组菌的酶活测定

将酶活提高最多的突变体GtAI2-T192S记为GtAI3，获得重组菌E.coli BL21(DE3)/pET28b/GtAI3。

实施例5：GtAI四位点突变体的构建与筛选

根据实施例4构建的突变体GtAI3氨基酸序列对应的核苷酸序列设计定点突变的突变引物，利用快速PCR技术，以重组载体pET28b/GtAI3为模板，对第213位引入单突变，引物为：

正向引物TATGGCATTNNKGATTTGGTGCAA(下划线为突变碱基)

反向引物CACCAAATCMNNAATGCCATAACC(下划线为突变碱基)

该实施例的结果为：对614株重组转化菌初筛，筛选出4株酶活提高的突变株，再对其进行酶活测定，具体结果见表6。经分析确定，其余610重组菌酶活保持不变或下降的原因是第213位甘氨酸(G)突变为Q、T、C和Y外的其他氨基酸。

表6：四点突变重组菌的酶活测定

将酶活提高最多的突变体GtAI3-G213C记为GtAI4，获得重组菌E.coli BL21(DE3)/pET28b/GtAI4。

实施例6：重组大肠杆菌发酵产酶

分别将实施例1、2、3、4和5的重组菌E.coli BL21(DE3)/pET28b/GtAI、E.coliBL21(DE3)/pET28b/GtAI1、E.coli BL21(DE3)/pET28b/GtAI2、E.coli BL21(DE3)/pET28b/GtAI3和E.coli BL21(DE3)/pET28b/GtAI4接种至含终浓度50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基，在37℃、150r/min培养OD₆₀₀约0.6～0.8，获得种子液；将种子液以2％(v/v)接种量接种至新鲜的含有终浓度50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，于37℃、150r/min培养OD₆₀₀至0.6～0.8，再向培养液中加入终浓度为0.1mM的IPTG，于28℃下诱导表达10h后，4℃、8000r/min离心10min，弃去上清液，用0.85％的生理盐水清洗两遍湿菌体，并收集湿菌体，备用。

实施例7：确定催化酶的最适温度

收集实施例6制备的各重组菌的湿菌体在39W条件下超声破碎20min后，将破碎混合液离心，取上清液，在75℃热处理15min，然后在4℃、8000r/min离心10min，弃去沉淀，收集上清液使用nickel-NTA琼脂糖凝胶柱进行纯化，用平衡缓冲液(20mM磷酸盐缓冲液，300mM NaCl，20mM咪唑，pH 8.0)平衡层析柱，再使用洗脱液(50mM磷酸盐缓冲液，300mMNaCl，500mM咪唑，pH 8.0)进行洗脱，根据紫外检测器的信号响应，收集相应的洗脱液，即为各自纯酶液。

将上述纯酶液作为转化用酶，测定酶的最适反应温度。具体操作如下：50mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.0)中，加入200mM D-葡萄糖、1mM Co²⁺、10mM Mg²⁺和1mL纯酶液，体系共5mL。分别于不同转化温度：50～130℃测定葡萄糖异构酶的活力(方法同实施例1的“GtAI重组工程菌GI酶活的精确测定”，高于100℃的测定条件需要使用油浴)，原始酶和各突变体将自身的最高酶活定义为100％，结果见图1。由图1可知，GtAI4的最适反应温度是120℃，比原始酶提高了60℃，是文献报道的最高值。

实施例8：金属离子对重组酶酶活的影响

将实施例7中的纯酶液作为转化用酶，测定金属离子对重组酶酶活的影响，具体配方和方法同“GtAI重组工程菌GI酶活的精确测定”，所选用金属离子包括10mM单金属例子Co²⁺、Mg²⁺、Mn²⁺、Cu²⁺、Zn²⁺、Ba²⁺、Fe²⁺、Ni²⁺和Ca²⁺；以及组合金属例子，分别为10mM Mg²⁺和5mMCo²⁺，10mM Mg²⁺和5mM Mn²⁺，10mM Mn²⁺和5mM Co²⁺，结果见图2。由图2可知，Mg²⁺对GI酶活有最大的促进作用。

实施例9：原始酶和突变重组菌全细胞制备高果糖浆

按实施例6的方法，获得重组菌E.coli BL21(DE3)/pET28b/GtAI、E.coli BL21(DE3)/pET28b/GtAI1、E.coli BL21(DE3)/pET28b/GtAI2、E.coli BL21(DE3)/pET28b/GtAI3和E.coli BL21(DE3)/pET28b/GtAI4湿菌体作为生物催化剂，以D-葡萄糖为底物，生物转化制备高果糖浆。1L催化体系包括：以50mM Na₂HPO₄/NaH₂PO₄缓冲液(pH 8.0)为反应介质，终浓度600g/LD-葡萄糖、终浓度10mM Mg²⁺、终浓度25g/L湿菌体。于90℃、150r/min，反应9h。每隔1h取1mL反应液，离心，0.22μm膜过滤后用HPLC检测D-果糖的浓度，结果见图3。由图3可知，E.coli BL21(DE3)/pET28b/GtAI4在2h底物转化率达75.7％，高于原始酶和其他突变酶的果糖得率，同时也为文献报道的最高水平。

序列表

<110> 浙江工业大学

<120> 一种葡萄糖异构酶、突变体及其在制备D-果糖中的应用

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 507

<212> PRT

<213> 未知(Unknown)

<400> 1

Met Thr Glu Val Phe Thr Gly Arg Glu Ile Trp Phe Leu Thr Gly Ser

1 5 10 15

Gln Gly Leu Tyr Gly Ala Asp Thr Leu Gln Gln Val Ala Asp Gln Ser

20 25 30

Arg Gln Val Ile Asn Gln Leu Ala Arg Thr Gly Leu Pro Val Arg Leu

35 40 45

Ile Trp Lys Pro Val Leu Thr Gly Ala Asp Ala Ile Arg Arg Val Cys

50 55 60

Leu Glu Ala Asn Ala Asp Asp Ala Cys Val Gly Leu Ile Ala Trp Met

65 70 75 80

His Thr Phe Ser Pro Ala Lys Met Trp Ile Ala Gly Leu Asp Ala Leu

85 90 95

Arg Lys Pro Leu Leu His Leu His Thr Gln Ala Asn Arg Asp Leu Pro

100 105 110

Trp Ala Thr Ile Asp Met Asp Phe Met Asn Leu Asn Gln Ala Ala His

115 120 125

Gly Asp Arg Glu Phe Gly Tyr Ile Gln Ser Arg Leu Gly Val Ala Arg

130 135 140

Lys Thr Val Ala Gly His Val Ser Asp Pro Ala Val Ala His Arg Ile

145 150 155 160

Ala Ala Trp Ser Arg Ala Ala Ala Gly Arg Ala Asp Leu Ala Ala Leu

165 170 175

Lys Leu Ala Arg Phe Gly Asp Asn Met Arg Asp Val Ala Val Thr Glu

180 185 190

Gly Asp Lys Val Glu Ala Gln Leu Arg Phe Gly Val Ser Val Asn Thr

195 200 205

Tyr Gly Val Asn Asp Leu Val Thr Ala Val Asp Thr Thr Ala Asp Ala

210 215 220

Asp Val Thr Ala Leu Val Lys Glu Tyr Asp Glu Thr Tyr Arg Leu Ala

225 230 235 240

Pro Glu Leu Arg Pro Gly Gly Asp Arg His Asp Ser Leu Arg Tyr Ala

245 250 255

Ala Arg Ile Glu Leu Gly Leu Arg Gly Phe Leu Thr Ala Gly Gly Phe

260 265 270

Gly Ala Phe Thr Thr Asn Phe Glu Asp Leu Gly Gly Leu Arg Gln Leu

275 280 285

Pro Gly Leu Ala Val Gln Arg Leu Met Ala Asp Gly Tyr Gly Phe Gly

290 295 300

Gly Glu Gly Asp Trp Lys Thr Ser Val Leu Leu Arg Thr Leu Lys Thr

305 310 315 320

Thr Ala Thr Gly Leu Gly Gly Gly Thr Ser Phe Met Glu Asp Tyr Thr

325 330 335

Tyr His Leu Glu Pro Gly Arg Glu Leu Ile Leu Gly Ala His Met Leu

340 345 350

Glu Val Cys Pro Ser Ile Ala Ala Ala Thr Pro Ser Cys Glu Ile His

355 360 365

Pro Leu Gly Ile Gly Gly Arg Glu Asp Pro Val Arg Leu Val Phe Asp

370 375 380

Ala Ala Pro Gly Pro Ala Thr Val Val Gly Leu Ala Asp Leu Gly Asp

385 390 395 400

Arg Phe Arg Leu Val Ala Asn Glu Ile Asp Val Val Asp Pro Val Glu

405 410 415

Pro Leu Pro Asn Leu Pro Val Ala Arg Ala Val Trp Gln Pro Arg Pro

420 425 430

Asn Leu Arg Thr Ser Thr Glu Ala Trp Leu Thr Ala Gly Ala Pro His

435 440 445

His Thr Val Leu Thr Ser Ala Leu Gly Thr Glu His Leu Asp Asp Leu

450 455 460

Ala Glu Met Leu Ala Thr Glu Leu Val Val Ile Asp Ala Asp Thr Thr

465 470 475 480

Ile Arg Ser Phe Thr Arg Glu Leu Arg Trp Asn Gln Ala Tyr His Arg

485 490 495

Leu Ala Gln Arg Leu His His His His His His

500 505

<210> 2

<211> 1521

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 2

atgaccgagg tattcaccgg acgcgagatc tggttcctca ccgggagcca gggcctctac 60

ggcgccgaca ccctccagca ggtcgccgac cagtcccggc aggtcatcaa ccagctcgcc 120

cgcaccggcc tgcccgtgcg cctgatctgg aagcccgtcc tcaccggcgc cgacgcgatc 180

cgccgggtct gcctggaggc caacgccgac gacgcctgcg tcggcctgat cgcctggatg 240

cacaccttct ccccggccaa gatgtggatc gccggcctcg acgcgctccg caaaccactg 300

ctccacctgc acacccaggc caaccgcgac ctgccctggg ccaccatcga catggacttc 360

atgaacctga accaggccgc ccacggcgac cgcgagttcg gctacatcca gtcccgcctc 420

ggcgtcgccc gcaagaccgt cgccggccac gtcagcgacc ccgccgtcgc ccaccggatc 480

gccgcctggt cccgcgccgc cgccggccgc gccgacctcg ccgccctcaa gctcgcccgc 540

ttcggcgaca acatgcgcga cgtcgccgtc accgagggcg acaaggtcga ggcccaactg 600

cgcttcggcg tctccgtcaa cacctacggc gtcaacgacc tggtcaccgc cgtcgacacc 660

accgccgacg ccgacgtcac cgccctggtc aaggagtacg acgagaccta ccgcctggcc 720

cccgaactgc gccccggcgg cgaccgccac gactcgctgc gctacgccgc ccggatcgaa 780

ctcggcctgc gcggcttcct caccgccggc ggcttcggcg ccttcaccac caacttcgag 840

gacctcggcg gcctgcgcca gctccccggc ctcgccgtcc agcgcctgat ggccgacggc 900

tacggcttcg gcggcgaggg cgactggaag acctccgtcc tgctgcgcac cctcaagacc 960

accgccaccg gcctgggcgg cggcacctcc ttcatggagg actacaccta ccacctggag 1020

cccggaaggg agttgatcct cggcgcgcac atgctggagg tctgcccgag catcgccgcc 1080

gccaccccgt cctgcgagat ccacccgctc ggcatcggcg gccgcgagga ccccgtccgc 1140

ctcgtcttcg acgccgcgcc cggccccgcc accgtcgtcg gactcgccga cctcggcgac 1200

cgcttccgcc tggtcgccaa cgagatcgac gtcgtcgacc ccgtcgaacc gctccccaac 1260

ctgcccgtcg cccgcgccgt ctggcagccc cggcccaacc tgcgcacctc caccgaagcc 1320

tggctcaccg ccggcgcccc gcaccacacc gtcctcacca gcgccctcgg caccgagcac 1380

ctcgacgacc tcgccgagat gctggccacc gaactcgtcg tcatcgacgc cgacaccacc 1440

atccgctcct tcacccgcga actgcgctgg aaccaggcct accaccgcct ggcccagcgc 1500

ctgcaccacc accaccacca c 1521

<210> 3

<211> 503

<212> PRT

<213> 未知(Unknown)

<400> 3

Met Met Leu Ser Leu Arg Pro Tyr Glu Leu Trp Phe Val Thr Gly Ser

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Gln His Leu Tyr Gly Glu Glu Ala Leu Lys Gln Val Glu Glu His Ser

20 25 30

Arg Thr Ile Val Asn Glu Leu Asn Arg Asp Ser Val Phe Pro Phe Pro

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Leu Val Phe Lys Pro Ile Val Thr Thr Pro Glu Glu Ile Arg Asn Ile

50 55 60

Cys Leu Glu Ala Asn Ala Ser Glu Gln Cys Ala Gly Val Val Thr Trp

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Met His Thr Phe Ser Pro Ala Lys Met Trp Ile Gly Gly Leu Leu Glu

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Leu Arg Lys Pro Leu Leu His Leu His Thr Gln Phe Asn Arg Asp Ile

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Pro Trp Asp Ser Ile Asp Met Asp Phe Met Asn Leu Asn Gln Ser Ala

115 120 125

His Gly Asp Arg Glu Tyr Gly Phe Ile Gly Ala Arg Met Gly Val Ala

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Arg Lys Val Val Val Gly His Trp Glu Asp Pro Glu Val Arg Glu Arg

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Leu Ala Lys Trp Met Arg Thr Ala Val Ala Phe Ala Glu Ser Arg His

165 170 175

Leu Lys Val Ala Arg Phe Gly Asp Asn Met Arg Glu Val Ala Val Thr

180 185 190

Glu Gly Asp Lys Val Gly Ala Gln Ile Gln Phe Gly Trp Ser Ile Asn

195 200 205

Gly Tyr Gly Ile Gly Asp Leu Val Gln Ser Ile Arg Asp Val Ser Glu

210 215 220

Gln Ser Val Asn Glu Leu Leu Asp Glu Tyr Ala Glu Leu Tyr Asp Ile

225 230 235 240

Val Pro Ala Gly Arg Gln Asp Gly Pro Val Arg Glu Ser Ile Arg Glu

245 250 255

Gln Ala Arg Ile Glu Leu Gly Leu Lys Ala Phe Leu Gln Asp Gly Asn

260 265 270

Phe Thr Ala Phe Thr Thr Thr Phe Glu Asp Leu His Gly Met Lys Gln

275 280 285

Leu Pro Gly Leu Ala Val Gln Arg Leu Met Ala Glu Gly Tyr Gly Phe

290 295 300

Gly Gly Glu Gly Asp Trp Lys Thr Ala Ala Leu Val Arg Leu Met Lys

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Val Met Ala Asp Gly Lys Gly Thr Ser Phe Met Glu Asp Tyr Thr Tyr

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His Phe Glu Pro Gly Asn Glu Met Ile Leu Gly Ala His Met Leu Glu

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Val Cys Pro Thr Ile Ala Ala Thr Arg Pro Arg Ile Glu Val His Pro

355 360 365

Leu Ser Ile Gly Gly Lys Glu Asp Pro Ala Arg Leu Val Phe Asp Gly

370 375 380

Gly Glu Gly Ala Ala Val Asn Ala Ser Leu Ile Asp Leu Gly His Arg

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Phe Arg Leu Ile Val Asn Glu Val Asp Ala Val Lys Pro Glu Tyr Asp

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Met Pro Lys Leu Pro Val Ala Arg Ile Leu Trp Lys Pro Arg Pro Ser

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Leu Arg Asp Ser Ala Glu Ala Trp Ile Leu Ala Gly Gly Ala His His

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Thr Cys Phe Ser Phe Ala Val Thr Ala Glu Gln Leu Glu Asp Phe Ala

450 455 460

Glu Met Thr Gly Ile Glu Cys Val Val Ile Asn Glu His Thr Ser Val

465 470 475 480

Ser Ser Phe Lys Asn Glu Leu Arg Trp Asn Glu Val Phe Trp Arg Gly

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Arg His His His His His His

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<211> 1509

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 4

atgatgctgt cattacgtcc ttatgaactt tggtttgtga caggaagcca gcacttatac 60

ggggaagaag cgttaaaaca agttgaagaa cattcaagaa cgatcgtcaa tgagttgaac 120

cgtgattcgg tgtttccgtt cccactcgtt ttcaaaccga tcgtcacaac cccagaagaa 180

attcgcaaca tctgtcttga ggcgaatgcg agcgaacaat gtgccggcgt tgtcacatgg 240

atgcatacgt tctcgccagc gaagatgtgg attggcggcc ttttggagtt gcgaaaaccg 300

ttattgcatc ttcacactca gtttaaccgt gatattccgt gggacagcat cgatatggac 360

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gtacctgctg gccgtcaaga tggacccgtt cgtgagtcga tccgtgagca ggcgcggatt 780

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ggatatggat ttggcggcga aggcgactgg aaaacggctg ctctcgttcg gttgatgaaa 960

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<211> 509

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<213> 未知(Unknown)

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Gln Glu Val Ala Arg Ala Leu Asp Ala Ser Ser Asp Val Pro Val Asn

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Val Val Trp Lys Pro Val Leu Lys Asp Ser Asp Ala Ile Arg Arg Ala

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Met Leu Asp Ala Asn Ser Asn Asp Asp Val Leu Gly Val Ile Thr Trp

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Met His Thr Phe Ser Pro Ala Lys Met Trp Ile Ala Gly Met Asp Ala

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Leu Arg Lys Pro Leu Leu His Leu His Thr Gln Ala Asn Val Glu Leu

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Pro Trp Ala Asp Ile Asp Phe Asp Phe Met Asn Leu Asn Gln Ala Ala

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His Gly Asp Arg Glu Tyr Gly Tyr Val Leu Ser Arg Leu Gly Val Ala

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Arg Thr Thr Val Val Gly His Val Ser Asn Pro Ala Val Thr Arg Arg

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Val Gly Thr Trp Val Arg Gly Ala Ala Gly Trp Ala Ala Thr His Glu

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Leu Lys Leu Ala Arg Phe Gly Asp Asn Met Arg Asn Val Ala Val Thr

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Glu Gly Asp Lys Thr Glu Ala Glu Leu Arg Phe Gly Val Ser Val Asn

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Thr Trp Gly Val Asn Glu Leu Val Ala Ala Val Glu Ala Val Ala Asp

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Ala Ala Glu Leu Arg Ala Gly Gly Glu Arg His Asp Ser Leu Arg Tyr

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Ala Lys Ala Phe Thr Thr Asn Phe Glu Asp Leu Gly Ala Leu Arg Gln

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Leu Pro Gly Ile Ala Val Gln Arg Leu Met Gly Lys Gly Tyr Gly Phe

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Gly Ala Glu Gly Asp Trp Lys Thr Ala Val Leu Val Arg Ala Ala Lys

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Thr Tyr Asp Leu Thr Pro Gly Ala Glu Leu Ile Leu Gly Ala His Met

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Leu Glu Ile Cys Pro Thr Leu Thr Thr Ser Lys Pro Arg Val Glu Ile

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His Pro Leu Gly Ile Gly Gly Lys Glu Asp Pro Val Arg Met Val Phe

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Asp Ala Asp Ala Thr Glu Gly Ala Val Val Val Ser Leu Ala Asp Met

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Arg Asp Arg Phe Arg Leu Thr Ala Asn Val Val Asp Val Val Thr Pro

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Pro His Asp Leu Pro Asn Leu Pro Val Ala Arg Ala Val Trp Arg Pro

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Arg Pro Asp Phe Thr Thr Ser Ala Glu Ala Trp Leu Thr Ala Gly Gly

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Ala His His Thr Val Leu Ser Thr Ala Val Gly Val Glu Ala Phe Glu

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Val Phe Ala Gln Ile Ala Arg Thr Glu Leu Leu Val Ile Asp Glu Ser

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Thr Thr Arg Arg Gly Phe Ala Asp Gln Val Arg Trp Asn Gln Val Tyr

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Tyr Arg Leu Ala Gln Gly Leu His His His His His His

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Ser His Leu Tyr Gly Glu Glu Ala Leu Lys Gln Val Glu Glu His Ser

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Leu Val Phe Lys Pro Ile Val Thr Thr Pro Glu Glu Ile Arg Asn Ile

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Cys Leu Glu Ala Asn Ala Ser Glu Gln Cys Ala Gly Val Val Thr Trp

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Met His Thr Phe Ser Pro Ala Lys Met Trp Ile Gly Gly Leu Leu Glu

85 90 95

Leu Arg Lys Pro Leu Leu His Leu His Thr Gln Phe Asn Arg Asp Ile

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Pro Trp Asp Ser Ile Asp Met Asp Phe Met Asn Leu Asn Gln Ser Ala

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His Gly Asp Arg Glu Tyr Gly Phe Ile Gly Ala Arg Met Gly Val Ala

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Arg Lys Val Val Val Gly His Trp Glu Asp Pro Glu Val Arg Glu Arg

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Leu Ala Lys Trp Met Arg Thr Ala Val Ala Phe Ala Glu Ser Arg His

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Leu Lys Val Ala Arg Phe Gly Asp Asn Met Arg Glu Val Ala Val Ser

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Glu Gly Asp Lys Val Gly Ala Gln Ile Gln Phe Gly Trp Ser Ile Asn

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Gly Tyr Gly Ile Cys Asp Leu Val Gln Ser Ile Arg Asp Val Ser Glu

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Gln Ser Val Asn Glu Leu Leu Asp Glu Tyr Ala Glu Leu Tyr Asp Ile

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Val Pro Ala Gly Arg Gln Asp Gly Pro Val Arg Glu Ser Ile Arg Glu

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Gln Ala Arg Ile Glu Leu Gly Leu Lys Ala Phe Leu Gln Asp Gly Asn

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Phe Thr Ala Phe Thr Thr Thr Phe Glu Asp Leu His Gly Met Lys Gln

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Leu Pro Gly Leu Ala Val Gln Arg Leu Met Ala Glu Gly Tyr Gly Phe

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Val Met Ala Asp Gly Lys Gly Thr Ser Phe Met Glu Asp Tyr Thr Tyr

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His Phe Glu Pro Gly Asn Glu Met Ile Leu Gly Ala His Met Leu Glu

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Val Cys Pro Thr Ile Ala Ala Thr Arg Pro Arg Ile Glu Val His Pro

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Leu Ser Ile Gly Gly Lys Glu Asp Pro Ala Arg Leu Val Phe Asp Gly

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Gly Glu Gly Ala Ala Val Asn Ala Ser Leu Ile Asp Leu Gly His Arg

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Thr Cys Phe Ser Phe Ala Val Thr Ala Glu Gln Leu Glu Asp Phe Ala

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Glu Met Thr Gly Ile Glu Cys Val Val Ile Asn Glu His Thr Ser Val

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Ser Ser Phe Lys Asn Glu Leu Arg Trp Asn Glu Val Phe Trp Arg Gly

485 490 495

Arg His His His His His His

500

Claims

1.一种耐高温葡萄糖异构酶突变体，其特征在于所述突变体为下列之一：（1）SEQ IDNO.3所示氨基酸序列的第17位谷氨酰胺突变为丝氨酸；（2）SEQ ID NO.3所示氨基酸序列第17位谷氨酰胺突变为丝氨酸、第401位苯丙氨酸突变为色氨酸；（3）SEQ ID NO.3所示氨基酸序列第17位谷氨酰胺突变为丝氨酸、第401位苯丙氨酸突变为色氨酸，第192位苏氨酸突变为丝氨酸；（4）SEQ ID NO.3所示氨基酸序列第17位谷氨酰胺突变为丝氨酸、第401位苯丙氨酸突变为色氨酸，第192位苏氨酸突变为丝氨酸，同时第213位甘氨酸突变为半胱氨酸。

2.如权利要求1所述的葡萄糖异构酶突变体，其特征在于所述突变体氨基酸序列如SEQID NO.7所示。

3.权利要求1或2所述的葡萄糖异构酶突变体在微生物催化D-葡萄糖异构化制备D-果糖中的应用。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述应用为：以含耐高温葡萄糖异构酶突变体基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体为酶源，以D-葡萄糖为底物，以镁盐为助剂，以Na₂HPO₄/NaH₂PO₄缓冲液为反应介质，在50~130℃，100~300 r/min条件下反应，制得D-果糖。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于：底物初始浓度为50~700 g/L，湿菌体的用量为10~50 g/L，所述镁盐终浓度为5~25 mM。