CN111057698B

CN111057698B - L-***糖异构酶、突变体及其应用

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Publication number: CN111057698B
Application number: CN201911384083.8A
Authority: CN
Inventors: 柳志强; 贾东旭; 郑裕国; 孙晨奕; 金利群; 彭晨; 陈德水; 廖承军; 程新平; 李勉; 毛宝兴
Original assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Current assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Priority date: 2019-12-28
Filing date: 2019-12-28
Publication date: 2021-10-15
Anticipated expiration: 2039-12-28
Also published as: CN111057698A

Abstract

本发明涉及一种新型L‑***糖异构酶(LAI)及其突变体，及其在连续催化D‑半乳糖异构化制备D塔格糖(D‑tagatose)的应用。所述异构酶突变体，由SEQ ID NO.1所示所示氨基酸经定点突变而得，所述点突变位点为下列中的一个或多个：(1)第107位、(2)第199位、(3)第59位。本发明有益效果主要体现在：本发明提供了一种全新的LAI及其突变体，85℃，700g/L D‑半乳糖反应体系下，产物得率最高达89.2％。将重组酶进行固定化并连续催化200批次，转化率均仍大于89％。本发明解决了现有酶催化制备D‑tagatose效率低下的难题，获得的优于文献报道的连续转化效果对提升D‑tagatose工业化水平具有重要意义。

Description

L-***糖异构酶、突变体及其应用

(一)技术领域

本发明涉及一种L-***糖异构酶及其突变体，及其在微生物催化D-半乳糖异构化制备D-塔格糖中的应用。

(二)背景技术

D-塔格糖(D-tagatose)是自然界中发现的稀有己酮糖，是D-半乳糖的异构体。它最早被发现存在于一种热带长青植物的树胶中，后来在酸奶、奶酪中也有发现。D-tagatose具有甜度高、热量低、吸收率低、有效降低血糖及抗龋齿、改善肠道菌群等性质与功效。美国食品及药物管理局已通过对D-tagatose的安全认证，准许其用于食品中。D-tagatose的生产方法主要有化学法和生物法。化学法存在成本高、酸碱用量高、污染严重、产物成分复杂、分离纯化难等问题。相比之下，生物法制备D-tagatose更具有优势，近年来逐渐成为研究热点。

生物法制备D-tagatose的工艺是以D-半乳糖为原料，利用L-***糖异构酶(L-arabinose isomerase，简称LAI)进行催化反应，一步法生成D-tagatose。其中，原料D-半乳糖廉价易得、整体反应过程温和易控、反应过程符合环保要求，是一种替代化学法的最优制糖方法。研究报道指出，高温和弱酸性的反应条件更有利于D-tagatose的生物转化。当前，生物法催化D-半乳糖制备D-tagatose时底物浓度偏低，均处于100g/L以下，不利于应用到工业化生产中。除此之外，可开发的酶源较少，该弊端制约着D-tagatose的生产水平。

由于异构酶本身作用环境和对象的多样化，通常具备底物谱广泛的优势，可以由一种异构酶催化制备多种糖产品，这为研制转化特定糖的异构酶提供了新的途径。以核酸、蛋白质等生物大分子数据库为主要对象，辅助计算机对生物信息进行比较分析，获取基因编码、蛋白质结构功能及其相互关系等理性信息，筛选新型异构酶制剂，探索异构酶的底物谱，开发异构酶的新功能，将分子改造获得的高效生物催化剂用于制备高浓度D-tagatose，对于满足人民群众日益增长的摄糖需求具有重要意义。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种最适反应温度高且收率高的L-***糖异构酶及其异构体突变体，以及其在微生物催化D-半乳糖异构化制备D-塔格糖中的应用。

本发明采用的技术方案是：

一种L-***糖异构酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还涉及一种L-***糖异构酶突变体，由序列如SEQ ID NO.1所示氨基酸经定点突变而来，所述突变的位点为下列中的一个或多个：(1)第107位、(2)第199位、(3)第59位。

优选的，所述突变体由序列如SEQ ID NO.1所示氨基酸经下列之一或多个位点突变而得：(1)第107位异亮氨酸I突变为丝氨酸S、精氨酸R、丙氨酸A或谷氨酰胺Q；(2)第199位天冬氨酸D突变为色氨酸W、组氨酸H、苯丙氨酸F、天冬氨酸D或半胱氨酸C；(3)第59位A突变为赖氨酸K、缬氨酸V、苏氨酸T、半胱氨酸C或谷氨酸E。

进一步，所述L-***糖异构酶突变体由序列如SEQ ID NO.1所示氨基酸经下列之一或多个位点突变而得：(1)第107位异亮氨酸I突变为谷氨酰胺Q、(2)第199位天冬氨酸D突变为色氨酸W、(3)第59位丙氨酸A突变为谷氨酸E。

更为优选的，所述L-***糖差向异构酶突变体序列如SEQ ID NO.7所示。

本发明还涉及所述L-***糖异构酶及其突变体在催化D-半乳糖异构化制备D-塔格糖中的应用。

具体的，所述应用为：以含所述L-***糖异构酶或其突变体编码基因的重组基因工程菌经发酵培养获得的湿菌体或湿菌体经超声破碎后获得的上清液或或菌体细胞经固定化获得的固定化酶制剂作为催化剂，以D-半乳糖为底物，在Mn²⁺存在下，在6.0～7.5的MOPS缓冲液中，60～90℃温度下反应，反应结束后，反应液分离纯化，获得D-塔格糖。

所述固定化酶制剂可按如下方法制备：称取含酶菌体细胞，用Na₂HPO₄/NaH₂PO₄缓冲液(pH 7.0)悬浮，加入Celite 545，适当搅拌。加入聚乙烯亚胺水溶液在25℃、100r/min条件下絮凝，再加三羟甲基磷(THP)水溶液，在25℃、100r/min条件下交联反应2h。然后抽滤，滤饼用蒸馏水洗涤后用轴向挤压机挤压成长条状，室温风干后，粉碎成粒(优选粒径为0.5-2mm)，获得酶的固定化颗粒。

优选的，所述L-***糖异构酶编码基因序列如SEQ ID NO.2(编码SEQ ID NO.1所示氨基酸)所示。

优选的，所述L-***糖异构酶突变体编码基因序列如SEQ ID NO.8所示(编码SEQ ID NO.7所示氨基酸)。

本发明的有益效果主要体现在：本发明提供了一种全新的LAI及其突变体，具有超高酶活和底物转化率，在700g/L底物浓度下，产物得率最高达86.8％。将重组酶进行固定化并连续催化200批次，转化率均大于86％。本发明解决了现有酶催化制备D-tagatose效率低下的难题，获得的优于文献报道的连续转化效果对提升D-tagatose工业化水平具有重要意义。

(四)附图说明

图1为重组酶的最适温度结果示意图；

图2为金属离子对重组酶活力的影响示意图；

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：新型酶的筛选

1、酶的来源与重组菌的构建

解析异构酶的关键催化区域，从NCBI数据库中获得三株未被研究的糖异构酶，分别来源于分别来源于Pocillopora damicornis(GenBank编号XP_027045535.1)、Vignaunguiculata(GenBank编号XP_027927277.1)、Candidatus Paracaedibacteracanthamoebae(GenBank编号WP_075261590.1)，并命名为EPoda、EViun和ECapa。根据氨基酸序列，依据大肠杆菌密码子偏好性进行密码子优化，通过基因工程的常规操作以全合成的方法合成了三条选择的核苷酸序列，分别如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.6所示；编码酶的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.5所示。在核酸序列末端加入6×His-tag标签，两端加入酶切位点XbaI和Xho I，将该基因克隆至pET28b(+)对应的XbaI和Xho I位点，获得重组表达质粒pET28b/EPoda、pET28b/EViun和pET28b/ECapa。

2、重组菌的筛选与诱导

将获得的重组表达质粒pET28b/EPoda、pET28b/EViun和pET28b/ECapa转化至Escherichia coli BL21(DE3)受体菌中，涂布于终浓度为100μg/mL卡那霉素的琼脂平板上，37℃下培养过夜，第2天于平板上长出的菌落中随机挑取克隆并抽提质粒进行琼脂糖凝胶电泳鉴定，获得含阳性克隆基因的基因工程菌。

LB液体培养基组成：胰蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L，溶剂为水，pH值自然；LB固体培养基在LB液体培养基中添加15g/L琼脂；121℃高压灭菌20min；使用前添加终浓度100μg/mL卡那霉素。

将基因工程菌接种至终浓度100μg/mL卡那霉素的LB液体培养基，在37℃、150r/min培养至OD₆₀₀约0.6～0.8，获得种子液；将种子液以体积浓度2％(v/v)接种量接种至新鲜的含有终浓度100μg/mL卡那霉素的LB培养基中，于37℃、150r/min培养OD₆₀₀至0.4～0.6，再向培养液中加入终浓度为0.7mM的IPTG，于28℃下诱导表达9h后，4℃、6000r/min离心10min，弃去上清液，用0.85％的生理盐水清洗两遍湿菌体，并收集湿菌体，备用。

3、底物特异性地研究

各取1g上述重组菌湿菌体，用50mL的20mM MOPS缓冲液(pH 7.0)悬浮，在39W条件下超声破碎，有效时间15min，制备获得超声破碎后的混悬液，离心，收集上清液，取1mL上清液用于反应。1mL反应体系为：20mM MOPS缓冲液(pH 7.0)、0.5mM CoCl₂.6H₂O、0.5mM MnCl₂、0.5mM CaCl₂、0.5mM MgCl₂和50g/L的各种底物(见表1)、50μL上述上清液。反应条件：于40℃条件下反应10min，沸水煮沸10min终止反应。12000r/min离心10min，取上清液。

对于各个底物的活力测定采用半胱氨酸-咔唑法。取一定浓度的糖溶液，依次加入0.1mL的1.5％(w/v)半胱氨酸盐酸盐溶液、3mL 75％(w/w)浓硫酸溶液、0.1mL的0.12％(w/v)咔唑乙醇溶液，85℃冰浴10min，于波长560nm下测定吸光度值，并作空白对照。每min内糖底物异构化生成1μmol糖产物所需酶量定义为一个酶活单位(U)。将ECapa对L-核酮糖测定的酶活设定为100％。由表1结果可知，EPoda对D-半乳糖具有较高酶活，说明该酶可能具备催化D-半乳糖至D-tagatose的异构化反应能力。

表1：各酶的底物特异性研究

4、重组菌酶活的精准测定

采用超声破碎方法对湿菌体进行超声破碎，取1g制备的湿菌体，用50mL的20mMMOPS缓冲液(pH 7.0)悬浮，在39W条件下超声破碎15min，制备获得超声破碎后的混悬液，离心，收集上清液，取1mL上清液用于反应。反应体系：20mM MOPS缓冲液(pH 7.0)、0.5mMMnCl₂和50g/L的D-半乳糖及50μL上述上清液，共1mL体系。反应条件：于40℃条件下反应10min，沸水煮沸10min终止反应，稀释10倍后，使用0.22μm滤膜过膜；采用HPLC检测D-tagatose浓度。分析柱为AminexHPX-87H柱(300×7.8mm，9μm，伯乐生命医学产品有限公司)。Waters 2414示差折光检测器，Waters 1525泵，Waters 717进样器。酶活定义：40℃和pH 7.0下，每分钟将D-半乳糖异构化生成1μmol D-塔格糖所需酶量定义为一个酶活单位(U)。

表2：重组酶的酶活测定

实施例2：EPoda单位点突变体的构建与筛选

1、突变体构建

根据EPoda亲本序列(氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示，核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示)设计定点突变的突变引物，利用快速PCR技术，以重组载体pET28b/EPoda为模板，对第107位引入单突变，引物为：

正向引物107I：AACTGGATGTGGCGNNNGATGGCGCGGATGATGTG(下划线为突变碱基)

反向引物107I：CACATCATCCGCGCCATCNNNCGCCACATCCAGTT(下划线为突变碱基)

PCR反应体系：2×Phanta Max Buffer(含Mg²⁺)25μL，dNTPs 10mM，正向引物107I 2μL(5pmol/μL，下同)，反向引物107I 2μL(5pmol/μL，下同)，模板DNA 1μL(20ng/μL，下同)，Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 50U，加入ddH₂O至50μL。

PCR扩增条件为95℃3min；(95℃15s，65℃15s，72℃6.5min)30循环；72℃5min。

2、突变体转化表达

取5μL的PCR产物，加入100μL冰浴的E.coli BL21(DE3)感受态细胞悬液中，冰上静置30min，将转化产物于42℃热击90s，迅速置于冰上冷却5min，向管中加入600μL的LB液体培养基，37℃、150r/min培养60min，取100μL上述菌液涂板，待菌液完全被培养基吸收后，37℃倒置培养12h。

3、高通量筛选阳性转化子

反应混合液组成：20mM MOPS缓冲液(pH 7.0)、1mM MnCl₂和5g/L的D-半乳糖。在96孔聚苯乙烯微孔培养板中每孔加入100μL含有终浓度100μg/mL卡那霉素的LB培养液，接种不同的转化菌落，于37℃、150r/min培养OD₆₀₀至0.4～0.6，再向培养液中加入终浓度为0.7mM的IPTG，于28℃下诱导表达9h后，4℃、6000r/min离心10min，弃去上清液。取50μL上述反应混合液加入含有菌体的96孔板中，振荡器振荡混匀后在40℃、600r/min反应10min，冰浴10min停止反应。取2.5μL反应液以半胱氨酸-咔唑显色法筛选突变体，反应体包括反应液5μL的1.5％(w/v)半胱氨酸盐酸盐，150μL的70％(w/w)浓硫酸、5μL的0.12％(w/v)咔唑乙醇，60℃下保温10min后观察颜色变化。以重组菌E.coli BL21(DE3)/pET28b/EPoda的反应为对照，取颜色比E.coli BL21(DE3)/pET28b/EPoda的反应深的突变株进行酶活精准测定。

4、阳性转化子酶活的精准测定

操作同实施例1的“重组菌酶活的精准测定”。

该实施例的结果为：对660株重组转化菌初筛，筛选出4株酶活提高的突变株，再对其进行酶活精准测定，具体结果见表3。经分析确定，其余656株重组菌酶活保持不变或下降的原因是第107位异亮氨酸(I)突变为S、R、A和Q外的其他氨基酸。

表3：单点突变重组菌的酶活测定

将酶活提高最多的EPoda突变体-I107Q记为EPoda-1，获得重组菌E.coli BL21(DE3)/pET28b/EPoda-1。

实施例3：EPoda双位点突变体的构建与筛选

根据实施例2构建的单突变体EPoda-1序列设计定点突变的突变引物，利用快速PCR技术，以重组载体pET28b/EPoda-1为模板，对第199位引入单突变，引物为：

正向引物199D：GGCCCGGTGGTGACCNNNAACAGCAACTTTATTA(下划线为突变碱基)

反向引物199D：TAATAAAGTTGCTGTTNNNGGTCACCACCGGGCC(下划线为突变碱基)

PCR反应体系：2×Phanta Max Buffer(含Mg²⁺)25μL，dNTPs 10mM，正向引物199D 2μL，反向引物199D 2μL，模板DNA 1μL，Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 50U，加入ddH₂O至50μL。

PCR扩增条件为95℃3min；(95℃15s，63℃15s，72℃6.5min)30循环；72℃5min。

PCR产物转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞，挑单克隆于含100μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养过夜。利用半胱氨酸咔唑法显色法对突变体进行初筛(操作同实施例2的“高通量筛选阳性转化子”)。

采用超声破碎方法对湿菌体进行超声破碎，并进行酶活精准测定(操作同实施例2的“阳性转化子酶活测定”)。

该实施例的结果为：对701株重组转化菌初筛，筛选出5株酶活提高的突变株，再对其进行酶活精准测定，具体结果见表4。经分析确定，其余696株重组菌酶活保持不变或下降的原因是第199位天冬氨酸(D)突变为W、H、F、D和C外的其他氨基酸。

表4：双点突变重组菌的酶活测定

将酶活提高最多的EPoda突变体-I107Q-D199W记为EPoda-2，获得重组菌E.coliBL21(DE3)/pET28b/EPoda-2。

实施例4：EPoda三位点突变体的构建与筛选

根据实施例3构建的突变体EPoda-2序列设计定点突变的突变引物，利用快速PCR技术，以重组载体pET28b/EPoda-2为模板，对第59位引入单突变，引物为：

正向引物59A：GCACCATTGTGTATNNNGTGGAACGTATTGC(下划线为突变碱基)

反向引物59A：GCAATACGTTCCACNNNATACACAATGGTGC(下划线为突变碱基)

PCR反应体系：2×Phanta Max Buffer(含Mg²⁺)25μL，dNTPs 10mM，正向引物59A 2μL，反向引物59A 2μL，模板DNA 1μL，Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 50U，加入ddH₂O至50μL。

PCR扩增条件为95℃3min；(95℃15s，61℃15s，72℃6.5min)30循环；72℃5min。

该实施例的结果为：对692株重组转化菌初筛，筛选出5株酶活提高的突变株，再对其进行酶活测定，具体结果见表5。经分析确定，其余687株重组菌酶活保持不变或下降的原因是第59位丙氨酸(A)突变为K、V、T、C和E外的其他氨基酸。

表5：三点突变重组菌的酶活测定

将酶活提高最多的EPoda突变体-I107Q-D199W-A59E记为EPoda-3，获得重组菌E.coli BL21(DE3)/pET28b/EPoda-3。

实施例5：重组大肠杆菌发酵产酶与纯化

分别将重组菌E.coli BL21(DE3)/pET28b/EPoda、E.coli BL21(DE3)/pET28b/EPoda-1、E.coli BL21(DE3)/pET28b/EPoda-2、E.coli BL21(DE3)/pET28b/EPoda-3接种至含终浓度100μg/mL卡那霉素的LB液体培养基，在37℃、150r/min培养OD₆₀₀约0.6～0.8，获得种子液；将种子液以2％(v/v)接种量接种至新鲜的含有终浓度100μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，于37℃、150r/min培养OD₆₀₀至0.4～0.6，再向培养液中加入终浓度为0.7mM的IPTG，于28℃下诱导表达9h后，4℃、6000r/min离心10min，弃去上清液，用0.85％的生理盐水清洗两遍湿菌体，并收集湿菌体。

采用超声破碎方法对湿菌体进行超声破碎，收集上清液。使用nickel-NTA琼脂糖凝胶柱进行纯化，用平衡缓冲液(20mM磷酸盐缓冲液，300mM NaCl，20mM咪唑，pH 8.0)平衡层析柱，再使用洗脱液(50mM磷酸盐缓冲液，300mM NaCl，500mM咪唑，pH 8.0)进行洗脱，根据紫外检测器的信号响应，收集相应的洗脱液，即为各自纯酶液。

实施例6：纯化EPoda及其突变体的最适反应温度

将实施例5中的纯酶液作为转化用酶，测定酶的最适反应温度。反应体系为：50g/L的D-半乳糖、1mM MnCl₂、50μL上述实施例获得的纯酶液，再加入20mM MOPS缓冲液(pH 7.0)至总体系1mL。分别于不同转化温度：65、70、75、80、85、90、95、100℃测定重组EPoda催化D-半乳糖异构化为D-tagatose的活力(操作方法同实施例1的“重组菌酶活的精准测定”)。由图1中可知，EPoda-3的最适反应温度为85℃，比原始酶EPoda提高15℃。

实施例7：金属离子对EPoda最优突变体酶活的影响

将实施例5中的纯酶液作为转化用酶，测定金属离子对重组酶酶活的影响。1mL反应体系包括：20mM MOPS缓冲液(pH 7.5)、50g/LD-半乳糖、50μL纯酶液和1mM不同金属离子(阴离子为Cl^-)。其中，单金属离子的选择如下：Co²⁺、Mg²⁺、Mn²⁺、Cu²⁺、Ni²⁺、Ba²⁺、Fe²⁺、Ca²⁺，组合金属离子的选择如下：1mM Mn²⁺+0.5mM Mg²⁺、1mM Mn²⁺+0.5mM Ca²⁺和1mM Mn²⁺+0.5mM Co² ⁺。于40℃进行酶活测定。以不加金属离子作为对照。由图2可知，本发明的酶以添加Co²⁺作用最佳。

实施例8：原始酶与突变酶突变重组菌全细胞制备D-tagatose

按实施例5的发酵方法，获得重组菌E.coli BL21(DE3)/pET28b/EPoda、E.coliBL21(DE3)/pET28b/EPoda-1、E.coli BL21(DE3)/pET28b/EPoda-2、E.coli BL21(DE3)/pET28b/EPoda-3。分别以上述湿菌体作为生物催化剂，以D-半乳糖为底物，生物转化制备D-tagatose。催化体系包括：不同浓度的D-半乳糖、10g/L湿菌体，2mM CoCl₂再加入适量20mMMOPS缓冲液(pH 7.0)至总体系100mL。反应体系于65℃、150r/min条件下反应，样品用0.22μm膜过滤后进行HPLC检测D-tagatose浓度。由表6可知，E.coli BL21(DE3)/pET28b/EPoda-3的产物得率最终达到86.8％，高于原始酶E.coli BL21(DE3)/pET28b/EPoda和其他突变酶的得率。

表6：各重组菌得率的比较

实施例9：突变酶重组菌高温下全细胞制备D-tagatose

按实施例5的发酵方法，对重组菌E.coli BL21(DE3)/pET28b/EPoda-2、E.coliBL21(DE3)/pET28b/EPoda-3。分别以上述湿菌体作为生物催化剂，以D-半乳糖为底物，生物转化制备D-tagatose。催化体系包括：不同浓度的D-半乳糖、10g/L湿菌体，2mM CoCl₂，再加入适量20mM MOPS缓冲液(pH 7.0)至总体系100mL。反应体系于85℃、150r/min条件下反应，样品用0.22μm膜过滤后进行HPLC检测D-tagatose浓度。由表7得，E.coli BL21(DE3)/pET28b/EPoda-3的产物得率最终达到89.2％，优于E.coli BL21(DE3)/pET28b/EPoda-2。

表7：各重组菌得率的比较

实施例10：重组枯草芽孢杆菌的构建与规模化发酵

将EPoda-3突变酶和穿梭质粒pDG148同时进行双酶切，再将酶切后的目的片段***穿梭质粒pDG148，构建重组穿梭质粒pDG148/EPoda-3。将构建的重组质粒转化至表达宿主Bacillus subtilis PRO1中，涂布含100μg/mL氨苄青霉素抗性的LB固体培养基，37℃培养箱过夜培养。第二天于平板上长出的菌落中随机挑取克隆并抽提质粒进行酶切鉴定，最终获得食品级表达重组菌B.subtilis PRO1/pDG148/EPoda-3。

将B.subtilis PRO1/pDG148/EPoda-3接种至含终浓度100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基，在37℃培养获得种子液；将种子液以2％(v/v)接种量接种至新鲜的含有终浓度100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，于35℃下发酵10h，4℃、6000r/min离心10min，弃去上清液，用0.85％的生理盐水清洗两遍湿菌体，并收集湿菌体。经酶活检测发现，B.subtilis PRO1/pDG148/EPoda-3重组菌的酶活高于E.coli BL21(DE3)/pET28b/EPoda-3的酶活。

实施例11：B.subtilis PRO1/pDG148/EPoda-3的固定化与连续转化

制备30％(v/v)THP水溶液：取15g的四羟甲基氯化磷(浓度80％)溶于90mL去离子水，3.4g的氢氧化钾溶于10mL去离子水，室温25℃、100r/min条件下将两者缓慢混合，制得30％(v/v)THP水溶液，现用现配，四羟甲基氯化磷和氢氧化钾按摩尔比1:0.995。

称取6g重组B.subtilis PRO1/pDG148/EPoda-3细胞，分别用50mL的50mM Na₂HPO₄/NaH₂PO₄缓冲液(pH 7.0)悬浮，加入0.3g Celite 545，适当搅拌。加入2mL 5％(v/v)聚乙烯亚胺水溶液在25℃、100r/min条件下絮凝，再加入0.25mL体积浓度30％THP水溶液，在25℃、100r/min条件下交联反应2h。然后抽滤，滤饼用蒸馏水洗涤后用轴向挤压机挤压成长条状，室温风干后，粉碎成粒(优选粒径为0.5～2mm)，获得EPoda-3突变体的固定化颗粒。

以上述固定化颗粒为生物催化剂，以D-半乳糖为底物，生物转化制备D-tagatose。100mL催化体系包括：20mM MOPS缓冲液(pH 7.0)缓冲液、700g/L D-半乳糖、2mM CoCl₂、7g/L固定化颗粒。反应于85℃、200r/min异构化2h。反应液于4℃离心，少量上清液经0.22μm膜过滤后用HPLC检测D-tagatose浓度；收集固定化颗粒，经缓冲液洗涤进行下一批转化。实验结果表明，连续催化200批次，产物得率均大于89％，反应批次和转化率均为文献报道的最高水平。

序列表

<110> 浙江工业大学

<120> L-***糖异构酶、突变体及其应用

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 259

<212> PRT

<213> Pocillopora damicornis

<400> 1

Met Val Leu Ser Tyr Phe Arg Leu Arg Gly Ser Ile Leu His Leu Cys

1 5 10 15

Arg Arg Val Ser Thr Gly Glu Val Val Met Glu Ala Gly Lys Arg Ala

20 25 30

Ala Ala Arg Tyr Ala Val Asp Thr Tyr Val Lys Gly Asn Gln Ala Leu

35 40 45

Gly Ile Gly Ser Gly Ser Thr Ile Val Tyr Ala Val Glu Arg Ile Ala

50 55 60

Glu Arg Val Lys Asp Glu Lys Leu His Leu Leu Cys Val Pro Ser Ser

65 70 75 80

Phe Gln Ala Gln Gln Leu Ile Thr Gln His Asn Leu Thr Leu Ser Asp

85 90 95

Leu Asp Arg Thr Pro Glu Leu Asp Val Ala Ile Asp Gly Ala Asp Asp

100 105 110

Val Asp Ser Asn Leu Ser Ala Ile Lys Gly Gly Gly Gly Cys Leu Thr

115 120 125

Gln Glu Lys Ile Val Ala Ser Cys Ala Lys Gln Phe Ile Ile Ile Ala

130 135 140

Asp Asp Arg Lys Asp Ser Lys Gln Leu Gly Glu Ala Phe Lys Lys Gly

145 150 155 160

Ile Pro Val Glu Val Ile Pro Met Ala Tyr Val Pro Val Met Lys Lys

165 170 175

Ile Glu Lys Leu Gly Leu Lys Pro Ile Leu Arg Met Ala Arg Ala Lys

180 185 190

Ala Gly Pro Val Val Thr Asp Asn Ser Asn Phe Ile Ile Asp Cys Gln

195 200 205

Phe Asp Lys Val Tyr Asp Trp Lys Glu Leu Asn Thr Gln Leu Asn Leu

210 215 220

Ile Pro Gly Val Val Glu Thr Gly Leu Phe Val Gly Met Ala Glu Cys

225 230 235 240

Ala Ile Phe Gly Lys Pro Asp Gly Thr Ile Thr Lys Arg His His His

245 250 255

His His His

<210> 2

<211> 777

<212> DNA

<213> Pocillopora damicornis

<400> 2

atggtgctga gctattttcg tctgcgtggc agcattctgc atctgtgccg tcgtgtgagc 60

accggcgaag tggtgatgga agcgggcaaa cgtgcggcgg cgcgttatgc ggtggatacc 120

tatgtgaaag gcaaccaggc gctgggcatt ggcagcggca gcaccattgt gtatgcggtg 180

gaacgtattg cggaacgtgt gaaagatgaa aaactgcatc tgctgtgcgt gccgagcagc 240

tttcaggcgc agcagctgat tacccagcat aacctgaccc tgagcgatct ggatcgtacc 300

ccggaactgg atgtggcgat tgatggcgcg gatgatgtgg atagcaacct gagcgcgatt 360

aaaggcggcg gcggctgcct gacccaggaa aaaattgtgg cgagctgcgc gaaacagttt 420

attattattg cggatgatcg taaagatagc aaacagctgg gcgaagcgtt taaaaaaggc 480

attccggtgg aagtgattcc gatggcgtat gtgccggtga tgaaaaaaat tgaaaaactg 540

ggcctgaaac cgattctgcg tatggcgcgt gcgaaagcgg gcccggtggt gaccgataac 600

agcaacttta ttattgattg ccagtttgat aaagtgtatg attggaaaga actgaacacc 660

cagctgaacc tgattccggg cgtggtggaa accggcctgt ttgtgggcat ggcggaatgc 720

gcgatttttg gcaaaccgga tggcaccatt accaaacgtc atcatcatca tcatcat 777

<210> 3

<211> 258

<212> PRT

<213> Vigna unguiculata

<400> 3

Met Gly Arg Lys Phe Phe Val Gly Gly Asn Trp Lys Cys Asn Gly Thr

1 5 10 15

Thr Glu Glu Val Lys Lys Ile Val Thr Thr Leu Asn Glu Ala Lys Val

20 25 30

Pro Gly Glu Asp Val Val Glu Val Val Val Ser Pro Pro Phe Val Phe

35 40 45

Leu Pro Leu Val Lys Ser Leu Leu Arg Pro Asp Phe His Val Ala Ala

50 55 60

Gln Asn Cys Trp Val Arg Lys Gly Gly Ala Phe Thr Gly Glu Ile Ser

65 70 75 80

Ala Glu Met Leu Val Asn Leu Glu Ile Pro Trp Val Ile Ile Gly His

85 90 95

Ser Glu Arg Arg Gln Leu Leu Gln Glu Ser Asn Glu Phe Val Gly Asp

100 105 110

Lys Val Ala Tyr Ala Leu Ala Gln Gly Leu Lys Val Ile Ala Cys Ile

115 120 125

Gly Glu Thr Leu Glu Gln Arg Glu Ala Gly Thr Thr Thr Ala Val Val

130 135 140

Ser Glu Gln Thr Lys Ala Ile Ala Ala Lys Ile Ser Asn Trp Asp Asn

145 150 155 160

Val Val Leu Ala Tyr Glu Pro Val Trp Ala Ile Gly Thr Gly Lys Val

165 170 175

Ala Thr Pro Ala Gln Ala Gln Glu Val His Ala Ala Leu Arg Lys Trp

180 185 190

Phe Gln Asp Asn Val Ser Ala Glu Val Ala Ala Ser Val Arg Ile Ile

195 200 205

Tyr Gly Gly Ser Val Asn Gly Gly Asn Ser Lys Glu Leu Ala Gly Gln

210 215 220

Ala Asp Val Asp Gly Phe Leu Val Gly Gly Ala Ser Leu Lys Pro Glu

225 230 235 240

Phe Val Asp Ile Ile Asn Ala Ala Thr Val Lys Asn His His His His

245 250 255

His His

<210> 4

<211> 774

<212> DNA

<213> Vigna unguiculata

<400> 4

atgggccgta aattttttgt gggcggcaac tggaaatgca acggcaccac cgaagaagtg 60

aaaaaaattg tgaccaccct gaacgaagcg aaagtgccgg gcgaagatgt ggtggaagtg 120

gtggtgagcc cgccgtttgt gtttctgccg ctggtgaaaa gcctgctgcg tccggatttt 180

catgtggcgg cgcagaactg ctgggtgcgt aaaggcggcg cgtttaccgg cgaaattagc 240

gcggaaatgc tggtgaacct ggaaattccg tgggtgatta ttggccatag cgaacgtcgt 300

cagctgctgc aggaaagcaa cgaatttgtg ggcgataaag tggcgtatgc gctggcgcag 360

ggcctgaaag tgattgcgtg cattggcgaa accctggaac agcgtgaagc gggcaccacc 420

accgcggtgg tgagcgaaca gaccaaagcg attgcggcga aaattagcaa ctgggataac 480

gtggtgctgg cgtatgaacc ggtgtgggcg attggcaccg gcaaagtggc gaccccggcg 540

caggcgcagg aagtgcatgc ggcgctgcgt aaatggtttc aggataacgt gagcgcggaa 600

gtggcggcga gcgtgcgtat tatttatggc ggcagcgtga acggcggcaa cagcaaagaa 660

ctggcgggcc aggcggatgt ggatggcttt ctggtgggcg gcgcgagcct gaaaccggaa 720

tttgtggata ttattaacgc ggcgaccgtg aaaaaccatc atcatcatca tcat 774

<210> 5

<211> 230

<212> PRT

<213> Candidatus Paracaedibacter acanthamoebae

<400> 5

Met Gly Met Met Ser Ser Ile Lys Ile Ser Pro Ser Ile Leu Ser Ala

1 5 10 15

Asp Ile Leu Asn Leu Gly Asp Glu Val Thr Ser Val Ala Gln Ser Gly

20 25 30

Ala Asp Gly Leu His Val Asp Val Met Asp Gly Arg Tyr Val Pro Asn

35 40 45

Ile Thr Tyr Gly Pro Asn Leu Val Ala Ala Leu Arg Arg Val Thr Asp

50 55 60

Leu Pro Leu Asp Val His Leu Met Ile Thr Pro Ala Gln Pro His Leu

65 70 75 80

Lys Ala Phe Ala Gln Ala Gly Ala Ser Ile Ile Thr Ile His Pro Asp

85 90 95

Ala Asp Val His Thr His Arg Leu Leu Gly Glu Ile Arg Ser Tyr Gly

100 105 110

Val Lys Ala Gly Val Ala Leu Asn Pro Gly Val Pro Ala Ser Ser Ile

115 120 125

Glu Pro Leu Leu Pro Phe Ile Asp Leu Ile Leu Ile Met Thr Val Asn

130 135 140

Pro Gly Phe Gly Gly Gln Ser Tyr Ile Ser Glu Met Thr Asp Lys Ile

145 150 155 160

Arg Gln Val Arg Arg Leu Ile Asp His Ser Gly Arg Asp Ile Glu Leu

165 170 175

Glu Val Asp Gly Gly Ile Asn Ala Glu Thr Ala Lys Gln Ala Ile Glu

180 185 190

Ala Gly Ala Thr Ala Leu Val Ala Gly Ala Ala Ile Phe Ala Thr Lys

195 200 205

Asp Asn Asp Tyr Ala Ala Thr Ile Ala Gln Leu Arg Gly Asp Arg Pro

210 215 220

His His His His His His

225 230

<210> 6

<211> 690

<212> DNA

<213> Candidatus Paracaedibacter acanthamoebae

<400> 6

atgggcatga tgagcagcat taaaattagc ccgagcattc tgagcgcgga tattctgaac 60

ctgggcgatg aagtgaccag cgtggcgcag agcggcgcgg atggcctgca tgtggatgtg 120

atggatggcc gttatgtgcc gaacattacc tatggcccga acctggtggc ggcgctgcgt 180

cgtgtgaccg atctgccgct ggatgtgcat ctgatgatta ccccggcgca gccgcatctg 240

aaagcgtttg cgcaggcggg cgcgagcatt attaccattc atccggatgc ggatgtgcat 300

acccatcgtc tgctgggcga aattcgtagc tatggcgtga aagcgggcgt ggcgctgaac 360

ccgggcgtgc cggcgagcag cattgaaccg ctgctgccgt ttattgatct gattctgatt 420

atgaccgtga acccgggctt tggcggccag agctatatta gcgaaatgac cgataaaatt 480

cgtcaggtgc gtcgtctgat tgatcatagc ggccgtgata ttgaactgga agtggatggc 540

ggcattaacg cggaaaccgc gaaacaggcg attgaagcgg gcgcgaccgc gctggtggcg 600

ggcgcggcga tttttgcgac caaagataac gattatgcgg cgaccattgc gcagctgcgt 660

ggcgatcgtc cgcatcatca tcatcatcat 690

<210> 7

<211> 259

<212> PRT

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 7

Met Val Leu Ser Tyr Phe Arg Leu Arg Gly Ser Ile Leu His Leu Cys

1 5 10 15

Arg Arg Val Ser Thr Gly Glu Val Val Met Glu Ala Gly Lys Arg Ala

20 25 30

Ala Ala Arg Tyr Ala Val Asp Thr Tyr Val Lys Gly Asn Gln Ala Leu

35 40 45

Gly Ile Gly Ser Gly Ser Thr Ile Val Tyr Glu Val Glu Arg Ile Ala

50 55 60

Glu Arg Val Lys Asp Glu Lys Leu His Leu Leu Cys Val Pro Ser Ser

65 70 75 80

Phe Gln Ala Gln Gln Leu Ile Thr Gln His Asn Leu Thr Leu Ser Asp

85 90 95

Leu Asp Arg Thr Pro Glu Leu Asp Val Ala Gln Asp Gly Ala Asp Asp

100 105 110

Val Asp Ser Asn Leu Ser Ala Ile Lys Gly Gly Gly Gly Cys Leu Thr

115 120 125

Gln Glu Lys Ile Val Ala Ser Cys Ala Lys Gln Phe Ile Ile Ile Ala

130 135 140

Asp Asp Arg Lys Asp Ser Lys Gln Leu Gly Glu Ala Phe Lys Lys Gly

145 150 155 160

Ile Pro Val Glu Val Ile Pro Met Ala Tyr Val Pro Val Met Lys Lys

165 170 175

Ile Glu Lys Leu Gly Leu Lys Pro Ile Leu Arg Met Ala Arg Ala Lys

180 185 190

Ala Gly Pro Val Val Thr Trp Asn Ser Asn Phe Ile Ile Asp Cys Gln

195 200 205

Phe Asp Lys Val Tyr Asp Trp Lys Glu Leu Asn Thr Gln Leu Asn Leu

210 215 220

Ile Pro Gly Val Val Glu Thr Gly Leu Phe Val Gly Met Ala Glu Cys

225 230 235 240

Ala Ile Phe Gly Lys Pro Asp Gly Thr Ile Thr Lys Arg His His His

245 250 255

His His His

<210> 8

<211> 777

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 8

atggtgctga gctattttcg tctgcgtggc agcattctgc atctgtgccg tcgtgtgagc 60

accggcgaag tggtgatgga agcgggcaaa cgtgcggcgg cgcgttatgc ggtggatacc 120

tatgtgaaag gcaaccaggc gctgggcatt ggcagcggca gcaccattgt gtatgaagtg 180

gaacgtattg cggaacgtgt gaaagatgaa aaactgcatc tgctgtgcgt gccgagcagc 240

tttcaggcgc agcagctgat tacccagcat aacctgaccc tgagcgatct ggatcgtacc 300

ccggaactgg atgtggcgca ggatggcgcg gatgatgtgg atagcaacct gagcgcgatt 360

aaaggcggcg gcggctgcct gacccaggaa aaaattgtgg cgagctgcgc gaaacagttt 420

attattattg cggatgatcg taaagatagc aaacagctgg gcgaagcgtt taaaaaaggc 480

attccggtgg aagtgattcc gatggcgtat gtgccggtga tgaaaaaaat tgaaaaactg 540

ggcctgaaac cgattctgcg tatggcgcgt gcgaaagcgg gcccggtggt gacctggaac 600

agcaacttta ttattgattg ccagtttgat aaagtgtatg attggaaaga actgaacacc 660

cagctgaacc tgattccggg cgtggtggaa accggcctgt ttgtgggcat ggcggaatgc 720

gcgatttttg gcaaaccgga tggcaccatt accaaacgtc atcatcatca tcatcat 777

Claims

1.一种L-***糖异构酶突变体，所述突变体为下列之一：

（1）SEQ ID NO. 1所示氨基酸第107位异亮氨酸I突变为丝氨酸S、精氨酸R、丙氨酸A或谷氨酰胺Q；

（2）SEQ ID NO. 1所示氨基酸第107位异亮氨酸I突变谷氨酰胺Q，第199位天冬氨酸D突变为色氨酸W、组氨酸H、苯丙氨酸F或半胱氨酸C；

（3）SEQ ID NO. 1所示氨基酸第107位异亮氨酸I突变谷氨酰胺Q，第199位天冬氨酸D突变为色氨酸W，第59位A突变为赖氨酸K、缬氨酸V、苏氨酸T、半胱氨酸C或谷氨酸E。

2.如权利要求1所述的L-***糖异构酶突变体，其特征在于所述L-***糖差向异构酶突变体序列如SEQ ID NO. 7所示。

3.权利要求1所述L-***糖异构酶突变体在催化D-半乳糖异构化制备D-塔格糖中的应用。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述应用为：以含所述L-***糖异构酶突变体编码基因的重组基因工程菌经发酵培养获得的湿菌体或湿菌体经超声破碎后获得的上清液或菌体细胞经固定化获得的固定化酶制剂作为催化剂，以D-半乳糖为底物，在Co²⁺存在下，在7.0~7.5 的MOPS缓冲液中，65~90℃温度下反应，反应结束后，反应液分离纯化，获得D-塔格糖。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述L-***糖异构酶突变体编码基因序列如SEQ ID NO. 8所示。