JP2021534462A - 顕微鏡装置 - Google Patents

Abstract

顕微鏡対物レンズ（１２）と、第１のスペクトル範囲内の光による試料（１６）の透過光照明のための第１の光源（１８）、および第１のスペクトル範囲とは異なる第２のスペクトル範囲内の光による試料の透過光照明のための第２の光源（２０）と、顕微鏡対物レンズによって収集される光からの試料画像を形成するためのチューブレンズ（２２）と、第１のスペクトル範囲内の光を検出するための第１のカメラ検出器（３２）と、第２のスペクトル範囲内の光を検出するための第２のカメラ検出器（３４）と、チューブレンズと検出器との間の画像ビームパス（２６）内の二色性ビームスプリッタ（２４）と、分析器ユニット（４４）とを備える、顕微鏡装置が提供される。ビームスプリッタは、第１のスペクトル範囲内の光を第１の検出器上に反射させ、第２のスペクトル範囲内の光を第２の検出器上に透過させ、分析器ユニットは、強化されたコントラストを有する試料全体画像を生成するように、第１のカメラによって記録される試料の第１の画像および第２のカメラによって記録される試料の第２の画像を結合するように構成される。【選択図】図１

Description

本発明は、二色検出能力を有する顕微鏡装置に関する。

典型的には、顕微鏡に使用されるカメラ検出器は単色である。

米国特許第８，４２７，６４６（Ｂ２）号は、二重放射能力を有する顕微鏡装置であって、画像収差および画像ゆがみの有害効果が、第１のスペクトル範囲の第１のビームを、その掌性を逆にするような様式で反射させ、第２のスペクトル範囲の第２のビームを、その掌性を維持するような様式で反射させ、それにより完全に対称の構成を獲得することによって低減され、その結果として、両方のスペクトルチャネル内の対応する像点がすべて、同じフィールド依存動作を経験する、顕微鏡装置に関する。これにより、互いに隣接する２つのスペクトル的に異なる画像を所与の検出カメラの同じチップ上に結像することが可能になる。

本発明の目的は、比較的高いコントラストを有する試料画像を作成することができる顕微鏡装置を提供することである。

本発明によると、この目的は、請求項１に規定されるような顕微鏡装置によって達成される。

試料は、エリア検出器を分離するように向けられる２つの異なるスペクトル範囲の透過光により照明される。２つの検出器上の合致画像（congruent images）は、２つのスペクトル範囲の光がチューブレンズと検出器との間の画像ビームパス内の二色性ビームスプリッタによって分離されると同時に、両方のスペクトル範囲のための共通チューブレンズを使用することによって達成される。合致画像は、強化されたコントラストを有する試料全体画像を生成するために結合され得る。両方のビームパスのための共通チューブレンズを使用することによって、すなわち、画像ビームパスを最後のレンズシステムの後に有限の光学空間内で２つのスペクトルアームに分離することによって、２つの画像ビームパスの合致を侵害する光学効果は、スペクトルアームごとに別個のチューブレンズを有する構成と比較して大いに減少される。別個のチューブレンズを有するこのような構成は、レンズが実際には正確に同一であることが決してないため、合致画像をもたらすことができない。それらの焦点距離、および故に倍率は、常に異なり、光学的な不完全さが、２つの画像の異なるゆがみを引き起こす。

両方のスペクトルアームのための共同チューブレンズを使用することは、光学非対称を低減するが、それを完全に回避することはできない。０°より大きい角度で通過される（２つのスペクトルアームのうちの一方によってなされる）平面光学素子（二色性ビームスプリッタ）は、そのビームに画像ゆがみを生じさせ、これは、角度の増加および基板厚さにより増加する。入射ビームおよび反射ビームを分離するために、入射ビームと反射ビームとの間の角度は、少なくとも３０°の有限値をとらなければならない（ビームスプリッタが入射ビームによって通過される角度は、入射ビームと反射ビームとの間の角度αの半分であり、すなわち、それはα／２である）。その一方で、基板厚さを低減することもまた、ある程度は作用するが、それは、反射コーティングが、所与の基板の平面性を損なう傾向があり、その効果が、基板厚さの減少に伴ってより顕著になるためである。したがって、基板厚さを減少することは、透過ビームに対する悪影響を減少させるが、それは、反射表面層を通じた基板の増加した曲げをもたらし、故に反射ビームを侵害し得る。１２〜１８°の入射（共通）画像ビームに対する二色性ビームスプリッタの角度α／２での１〜２ｍｍの基板厚さは、図２に示されるように、良好な折衷案である。

さらに好ましい実施形態は、従属請求項に規定される。

以後、本発明の例は、添付の図面を参照して例証される。

本発明による顕微鏡装置の例の概略図である。 ２つの検出器上での２つの異なるスペクトル範囲を含む画像ビームパスのスペクトル分離のための二色性ビームスプリッタの使用の例の概略図である。

図１および図２では、本発明による顕微鏡装置の例が概略的に示される。図１に示される装置１０は、顕微鏡対物レンズ１２と、試料１６を保持し、動かすための試料ホルダ（またはステージ）１４と、試料表面に対して第１の角度での、第１のスペクトル範囲内の光による試料１６の斜めの透過光照明のための第１の光源１８と、第２の角度での、第１のスペクトル範囲とは異なる第２のスペクトル範囲内の光による試料１６の斜めの透過光照明のための第２の光源２０とを備える。顕微鏡対物レンズ１２によって試料１６から収集される光は、チューブレンズ２２によって画像に変換される。二色性ビームスプリッタ２４は、２つのスペクトル範囲のうちの一方（例えば、第１のスペクトル範囲内）の光を反射させ、それにより、反射画像ビーム２８を作成すると同時に、２つのスペクトル範囲のうちの他方（例えば、第２のスペクトル範囲内）の光を透過させ、それにより透過画像ビーム３０を作成するように、収束画像ビームパス２６内に提供される。反射画像ビーム２８は、第１のスペクトル範囲内の光に基づいて試料の第１の画像を記録するための第１の検出器カメラ３２に到達するが（ビームスプリッタ２４が第１のスペクトル範囲内の光を反射させると仮定して）、透過画像ビームパス３０は、第２のスペクトル範囲内の光に基づいて試料１６の第２の画像を記録するための第２のカメラ検出器３４に到達する。図１の例では、第１のスペクトル範囲内の光のビームパスは、点線によって示される一方、第２のスペクトル範囲内の光のビームパスは、実線によって示される。

ビームスプリッタ２４は、ロングパスフィルタとして実装され得る（この場合、第１のスペクトル範囲は第２のスペクトル範囲よりも短い波長にある）か、またはそれは、ショートパスとして実装され得る（この場合、第１のスペクトル範囲は、第２のスペクトル範囲よりも長い波長にある）。

ブロッキングフィルタ３６（図２にのみ示される）は、第２のスペクトル範囲内の光（これはビームスプリッタ２４によってある程度反射され得るが、ビームスプリッタ２４は、第２のスペクトル範囲内の光を透過するように設計される）をブロックし、それにより、第２のスペクトル範囲内の反射光によって引き起こされる第１の検出器３２上のゴースト画像を防ぐように、ビームスプリッタ２４と第１の検出器３２との間の反射画像ビーム２８内に置かれ得る。

透過画像ビームパス３０と反射画像ビームパス２８との間の残りの光学非対称を最小限にするために、ビームスプリッタ２４は、２ｍｍ未満、および好ましくは少なくとも１ｍｍの比較的薄い厚さを有さなければならず、また、入射ビームおよび反射ビームの分離が許す限り平坦な角度で共通画像ビームパス２６に対して傾けられなければならない。後者の要件は、共通入射ビーム２６と反射画像ビーム２８との間の角度αが２４〜３６度の間にあるように、入射ビーム２６に対してビームスプリッタ２４の角度を選択することによって満足され得る。

ブロッキングフィルタ３６は、共通入射ビーム２６に対するビームスプリッタ２４と同じように、反射画像ビーム２８に対してほぼ同じ角度、例えば±３％以内に傾けられなければならず、さらに、ブロッキングフィルタ３６は、ビームスプリッタ２４と同じ厚さを有さなければならない。それにより、反射画像ビーム２８と透過画像ビーム３０との間の光学非対称は、さらに最小限にされるが、それは、この場合、反射画像ビーム２８が、透過画像ビーム３０が透過されるビームスプリッタ２４に非常に類似する透過光学素子（具体的には、ブロッキングフィルタ３６）を通過し、その結果として、反射画像ビーム２８は、透過画像ビーム３０がビームスプリッタ２４の透過によって影響を受ける様式と非常に類似した様式で、そのような透過によって影響を受けるためである。それにより、結果として生じる光学ゆがみは、透過画像ビーム３０および反射画像ビーム２８の両方で非常に類似しており、その結果として、第１の検出器３２および第２の検出器３４それぞれにおける結果として生じる画像は、非常に類似した点広がり関数（“ＰＳＦ”）を有し、その結果として、結果として生じる画像は合致している。言い換えると、一方でビームスプリッタ２４および他方でブロッキングフィルタ３６を通る収束ビームの透過から生じる光学ゆがみは、同じ様式で両方のスペクトルチャネルに影響を及ぼす。

図１の例では、第１および第２の光源１８、２０は、相対する横方向からの試料１６の斜めの透過光照明を実現するように配置され、試料表面に対して同じ傾斜角度βで、第１の光源１８が左側から斜めの照明を提供し、第２の光源２０が右側から斜めの照明を提供している。角度βは、できる限り多くの回折次数が対物レンズを通過することを可能にすることによって、所与の選択された対物レンズのために最適化され得る。より詳細には、第１の光源１８からの照明光および第２の光源２０からの照明光は、光束が、試料に垂直であり、かつ顕微鏡対物レンズ１２の光軸３８を含む平面に対して、互いに鏡面対称であるような様式で試料１６上に向けられる。コントラストは、傾斜角度βが増加するにつれて、すなわち、対物レンズによって収集される回折および屈折光が多いほど、増加する。

第１の光源１８からの光による試料１６の照明から生じる、第１のカメラ３２によって獲得される第１の画像、および第２の光源２０からの光による試料１６の照明によって獲得される、第２の検出器３４によって記録される第２の画像は、単一の斜めの透過照明（すなわち、第１の光源１８または第２の光源２０のいずれかのみによる試料１６の照明）の場合と比較してコントラストを増加させるような様式で、分析器ユニット４４によって結合される。第１および第２の画像を結合するための１つのやり方は、単純に第１および第２の画像を追加することである。しかしながら、より良好なコントラスト強化は、第１の画像と第２の画像との差を第１の画像および第２の画像の合計によって割ることによって獲得され得る。

上に例証される二色システムはまた、蛍光励起を達成するように顕微鏡対物レンズ１２を介して試料１６を照明するための落射照明光源４０を含む、落射照明蛍光顕微鏡に使用され得（例えば、ビームスプリッタ４２は、落射照明光を顕微鏡対物レンズ１２上に向けるために使用され得る）、試料１６からの蛍光発光は、顕微鏡対物レンズ１２によって収集され、二色性ビームスプリッタ２４を使用することによって第１の検出器３２および第２の検出器３４のうちの少なくとも一方に向けられるようにチューブレンズ２２によって集束される。

光源１８、２０、および４０は、単一の光源内に統合され得るか、または、多重バンド光源から獲得される異なるスペクトル範囲によって実装され得る、ということを理解されたい。

したがって、図１および図２に示されるような顕微鏡装置は、斜めの透過光照明によって高コントラスト画像を獲得することを可能にするだけでなく、ビームパス内の光学素子の挿入または除去を必要とすることなく、少なくとも２つの異なるスペクトル範囲内の蛍光画像を獲得することを可能にし、これにより、異なる光学モード間の簡便な切替えを可能にする。特に、強化されたコントラスト画像は、蛍光ビームパスに悪影響を及ぼすことなく高品質蛍光顕微鏡対物レンズを使用することによって獲得され得る。結果として、２つの別個の検出器を有する提案された斜めの透過光照明は、コントラスト透過画像を獲得する他の方法と比較して優れている。例えば、位相コントラスト顕微鏡または微分干渉コントラスト（ＤＩＣ）顕微鏡は、例えば、位相コントラスト顕微鏡が、蛍光測定に適していない特定の対物レンズを必要とし、ＤＩＣ顕微鏡が、透過照明ビームパス内だけでなく画像ビームパス内にも偏光子が挿入されることを必要とし、この偏光子は、蛍光測定の前に除去されなければならないため、高品質蛍光顕微鏡と一緒に使用するのには適していない。

２つの検出器を使用したスペクトル分離はまた、２つの蛍光体の同時結合のため、または、透過光画像内の２つの染料を分離するため、例えば、ヘマトキシリンおよびエオシンで同時に染められた標本のために使用され得るということに留意されたい。

Claims (13)

1. 顕微鏡対物レンズ（１２）と、
   第１のスペクトル範囲内の光による試料（１６）の透過光照明のための第１の光源（１８）、および前記第１のスペクトル範囲とは異なる第２のスペクトル範囲内の光による前記試料の透過光照明のための第２の光源（２０）と、
   前記顕微鏡対物レンズによって収集される光から試料画像を形成するためのチューブレンズ（２２）と、
   前記第１のスペクトル範囲内の光を検出するための第１のカメラ検出器（３２）と、
   前記第２のスペクトル範囲内の光を検出するための第２のカメラ検出器（３４）と、
   前記チューブレンズと前記検出器との間の画像ビームパス（２６）内の二色性ビームスプリッタ（２４）と、
   分析器ユニット（４４）と、を備え、
   前記ビームスプリッタが、前記第１のスペクトル範囲内の光を前記第１の検出器上に反射させ、前記第２のスペクトル範囲内の光を前記第２の検出器上へ透過させ、前記分析器ユニットが、強化されたコントラストを有する試料全体画像を生成するように、前記第１のカメラによって記録される前記試料の第１の画像および前記第２のカメラによって記録される前記試料の第２の画像を結合するように構成される、顕微鏡装置。
2. 蛍光励起のため前記顕微鏡対物レンズ（１２）を介して前記試料を照明するための落射照明光源（４０）をさらに備え、前記試料からの蛍光発光が、前記顕微鏡対物レンズによって収集され、前記チューブレンズ（２２）によって前記第１の検出器および前記第２の検出器（３２、３４）のうちの少なくとも一方の上に結像される、請求項１に記載の顕微鏡装置。
3. 前記入射ビーム（２６）に対する前記二色性ビームスプリッタ（２４）の角度（α／２）が、１２〜１８°の間にある、請求項１または２に記載の顕微鏡装置。
4. 前記二色性ビームスプリッタ（２４）が、１〜２ｍｍの厚さを有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の顕微鏡装置。
5. ブロッキングフィルタ（３６）が、前記第１の検出器上のゴースト画像を防ぐように、前記第２のスペクトル範囲内の光をブロックするため、前記二色性ビームスプリッタ（２４）と前記第１の検出器（３２）との間に提供される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の顕微鏡装置。
6. 前記ブロッキングフィルタ（３６）が、前記二色性ビームスプリッタ（２４）によって反射される前記ビーム（２８）に対して斜めに傾けられ、この角度は、前記チューブレンズ（２２）からの前記入射画像ビーム（２６）に対する前記二色性ビームスプリッタの角度に±３％以内で等しく、また前記ブロッキングフィルタ（３６）が、前記二色性ビームスプリッタと±３％以内で同じ厚さを有する、請求項５に記載の顕微鏡装置。
7. 前記分析器ユニット（４４）が、前記第１の画像および前記第２の画像を結合するように、前記第１の画像と前記第２の画像との差を前記第１の画像および前記第２の画像の合計で割るように構成される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の顕微鏡装置。
8. 前記二色性ビームスプリッタ（２４）がロングパスであるとともに、前記第１のスペクトル範囲が、前記第２のスペクトル範囲よりも短い波長にある、請求項１〜７のいずれか一項に記載の顕微鏡装置。
9. 前記二色性ビームスプリッタ（２４）がショートパスであるとともに、前記第１のスペクトル範囲が、前記第２のスペクトル範囲よりも長い波長にある、請求項１〜７のいずれか一項に記載の顕微鏡装置。
10. 前記第１および前記第２の光源（１８、２０）が、前記試料の透過光照明用である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の顕微鏡装置。
11. 前記第１の光源からの光が、前記試料表面に対して第１の角度で前記試料に衝突し、前記第２の光源からの光が、前記試料表面に対して第２の角度範囲で前記試料に衝突する、請求項１０に記載の顕微鏡装置。
12. 前記第１の角度および前記第２の角度が等しく、前記第１の光源（１８）からの光ビームおよび前記第２の光源（２０）からの光ビームが、前記試料に垂直であり、かつ前記顕微鏡対物レンズ（１２）の光軸（３８）を含む平面に対して互いに鏡面対称である、請求項１１に記載の顕微鏡装置。
13. 前記第１の角度が、４３°〜４７°である、請求項１２に記載の顕微鏡装置。
    

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