CN112567282B - 显微镜设备 - Google Patents
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Abstract
提供了一种显微镜设备，包括：显微镜物镜（12）；用于用第一光谱范围内的光对样本（16）进行透射光照射的第一光源（18）和用于用不同于第一光谱范围的第二光谱范围内的光对样本进行透射光照射的第二光源（20）；用于从显微镜物镜收集的光形成样本图像的管透镜（22）；用于检测第一光谱范围内的光的第一相机检测器（32）；用于检测第二光谱范围内的光的第二相机检测器（34）；在管透镜和检测器之间的图像光束路径（26）中的二向色分束器（24）；以及分析器单元（44），分束器将第一光谱范围内的光反射到第一检测器上，并将第二光谱范围内的光透射到第二检测器上，并且其中分析器单元被配置成组合由第一相机记录的样本的第一图像和由第二相机记录的样本的第二图像，以便生成具有增强对比度的总样本图像。
Description
本发明涉及一种具有双色检测能力的显微镜设备。
通常，显微术中使用的相机检测器是单色的。
US 8，427，646 B2涉及一种具有双发射能力的显微镜设备，其中通过以使得反转其旋向性（handedness）的方式反射第一光谱范围的第一光束并以使得保持其旋向性的方式反射第二光谱范围的第二光束来减小图像像差和图像失真的不利影响，从而获得完全对称的配置，使得两个光谱通道中的对应图像点都经历相同的场相关操作。这允许将彼此相邻的两个光谱不同的图像成像到给定检测器相机的相同芯片上。
本发明的目的是要提供一种能够产生具有相对高对比度的样本图像的显微镜设备。
根据本发明，该目的通过如权利要求1中限定的显微镜设备来实现。
用两个不同光谱范围的透射光照射样本，所述透射光被引导到单独的区域检测器。两个检测器上的全等图像通过对两个光谱范围使用共同的管透镜来实现，其中两个光谱范围的光由管透镜和检测器之间的图像光束路径中的二向色分束器分离。全等图像可以被组合以生成具有增强对比度的总样本图像。通过对两个光束路径使用共同的管透镜，即，通过在最后一个透镜***之后在有限的光学空间中将图像光束路径分离成两个光谱臂，与每个光谱臂具有单独的管透镜的配置相比，损害两个图像光束路径全等性的光学效应大大缩减。具有单独管透镜的这样的配置不能结果产生全等的图像，因为实际上透镜从来不是确切等同的。它们的焦距——以及因此放大倍数——将总是不同的，并且光学缺陷导致两个图像的不同失真。
对两个光谱臂使用联合管透镜减小光学不对称性，但不能完全避免它。以大于0°的角度穿过的平面光学元件（二向色分束器）（如两个光谱臂中的一个所做的那样）引起对该光束的图像失真，该图像失真随着增加的角度以及随着基底厚度而增加。为了分离传入光束和反射光束，传入光束和反射光束之间的角度应该假设至少30°的有限值（传入光束穿过分束器的角度是传入光束和反射光束之间的角度/>的一半，即，它是/>）。另一方面，减小基底厚度也仅在一定程度上起作用，因为反射涂层倾向于破坏给定基底的平面性，并且随着减少的基底厚度，该影响变得更明显。因此，虽然减小基底厚度将减小对透射光束的不利影响，但它可能导致基底通过反射表面层的增加弯曲，并且因此损害反射光束。如图2中图示，相对于12至18°的入射（共同）图像光束，二向色分束器的角度/>处的1-2 mm的基底厚度是好的折衷。
从属权利要求中限定了另外的优选实施例。
在下文中，将参照附图说明本发明的示例，其中：
图1是根据本发明的显微镜设备的示例的示意性图示；以及
图2是使用二向色分束器对包括两个检测器上的两个不同光谱范围的图像光束路径进行光谱分离的示例的示意性图示。
在图1和图2中示意性地示出了根据本发明的显微镜设备的示例。图1中所示的布置10包括显微镜物镜12、用于保持和移动样本16的样本保持器（或载物台）14、用于以相对于样本表面的第一角度用第一光谱范围内的光对样本16进行倾斜透射光照射的第一光源18、以及用于以第二角度用不同于第一光谱范围的第二光谱范围内的光对样本16进行倾斜透射光照射的第二光源20。显微镜物镜12从样本16收集的光被管透镜22转换成图像。二向色分束器24提供在会聚图像光束路径26中，以便反射两个光谱范围之一内（例如，在第一光谱范围内）的光，从而创建反射图像光束28，同时在两个光谱范围中的另一个光谱范围中（例如，在第二光谱范围内）透射光，从而创建透射图像光束30。反射图像光束28到达用于基于第一光谱范围内的光记录样本的第一图像（假设分束器24反射第一光谱范围内的光）的第一检测器相机32，而透射图像光束路径30到达用于基于第二光谱范围内的光记录样本16的第二图像的第二相机检测器34。在图1的示例中，第一光谱范围内的光的光束路径由虚线指示，而第二光谱范围内的光的光束路径由实线指示。
分束器24可以实现为长通滤光器（在这种情况下，第一光谱范围将比第二光谱范围处于更短的波长），或者其可以实现为短通（在这种情况下，第一光谱范围将比第二光谱范围处于更长的波长）。
阻挡滤光器36（仅图2中所示）可以被放置到分束器24和第一检测器32之间的反射图像光束28中，以便阻挡第二光谱范围内的光（尽管分束器24被设计成透射第二光谱范围内的光，但是分束器24可以在一定程度上反射第二光谱范围内的光），从而防止第二光谱范围内的反射光在第一检测器32上引起重影图像。
为了最小化透射图像光束路径30和反射图像光束路径28之间的剩余光学不对称性，分束器24应该具有小于2 mm、并且优选地至少1 mm的相对低的厚度，并且应该相对于共同图像光束路径26以传入和反射光束的分离所准许的那么平坦的角度倾向。后一要求可以通过选择分束器24相对于入射光束26的角度来满足，使得共同入射光束26和反射图像光束28之间的角度位于24度和36度之间。
阻挡滤光器36应该相对于反射图像光束28以与分束器24相对于共同入射光束26大约相同的角度（例如，在以内）倾向；此外，阻挡滤光器36应该具有与分束器24相同的厚度。因此，反射图像光束28和透射图像光束30之间的光学不对称性被进一步最小化，因为在这种情况下，反射图像光束28穿过透射光学元件（即阻挡滤光器36），该透射光学元件（即阻挡滤光器36）非常类似于透射图像光束30通过其被透射的分束器24，使得反射图像光束28以非常类似于透射图像光束30受通过分束器24的透射影响的方式受到这样的透射影响。因此，对于透射图像光束30和反射图像光束28二者，结果所得的光学失真非常类似，使得第一检测器32和第二检测器34上的结果所得图像分别具有非常类似的点扩展函数（“PSF”），使得结果所得图像将是全等的。换句话说，由会聚光束一方面通过分束器24并且另一方面通过阻挡滤光器36的透射所致的光学失真将以相同的方式影响两个光谱通道。
在图1的示例中，第一和第二光源18、20被布置用于实现从相反的横向方向对样本16的倾斜透射光照射，其中第一光源18提供从左侧的倾斜照射，并且第二光源20提供从右侧的倾斜照射，其相对于样本表面具有相同的倾向角度。通过允许尽可能多的衍射级穿过物镜，可以针对给定的所选物镜优化角度/>。更精确地，来自第一光源18的照射光和来自第二光源20的照射光以这样的方式被引导到样本16上，使得光射束相对于平面彼此镜像对称，该平面垂直于样本并且包括显微镜物镜12的光轴38。对比度随着增加的倾向角度/>而增加，即，物镜收集的衍射和折射光越多。
由第一相机32获得的由来自第一光源18的光照射样本16所得的第一图像，和由第二检测器34记录的通过利用来自第二光源20的光照射样本16获得的第二图像，由分析器单元44以与单次倾斜透射照射的情况相比增加对比度的方式组合（即，仅用第一光源18或第二光源20照射样本16）。一种组合第一和第二图像的方式将是简单地添加第一和第二图像。然而，通过将第一图像和第二图像之间的差除以第一图像和第二图像的和，可以获得更好的对比度增强。
以上说明的双色***也可以用在面照射荧光显微镜中，该面照射荧光显微镜包括面照射光源40，用于经由显微镜物镜12照射样本16，以便实现荧光激发（例如，分束器42可以用于将面照射光引导到显微镜物镜12上），其中来自样本16的荧光发射光被显微镜物镜12收集，并被管透镜22聚焦，以便通过使用二向色分束器24被引导到第一检测器32和第二检测器34中的至少一个。
将理解，光源18、20和40可以集成在单个光源内，或者可以通过从多波段光源获得的不同光谱范围来实现。
因此，如图1和图2中所示的显微镜设备不仅允许通过倾斜透射光照射获得高对比度图像，而且还允许在至少两个不同光谱范围内获得荧光图像，而不需要在光束路径中***或移除光学元件，从而允许在不同光学模式之间方便地切换。特别地，可以通过使用高质量荧光显微镜物镜获得增强的对比度图像，而不对荧光光束路径有负面影响。因此，与获得对比透射图像的其他方法相比，所提出的具有两个单独检测器的倾斜透射光照射更优越。例如，相位对比显微术或差分干涉对比（DIC）显微术不太适合与高质量荧光显微术一起使用，因为例如，相位对比显微术需要特定的物镜，其不太适合荧光测量，并且DIC显微术需要偏振器不仅***到透射照射光束路径中，而且还***到图像光束路径中，然后所述偏振器将不得不在荧光测量之前被移除。
注意，使用两个检测器的光谱划分也可以用于两个荧光团的同时成像，或者用于在透射光图像中分离两种染料，例如用于利用苏木精和曙红同时染色的试样。
Claims (11)
1.一种显微镜设备，包括：
显微镜物镜(12)，
用于用第一光谱范围内的光对样本(16)进行透射光照射的第一光源(18)、和用于用不同于第一光谱范围的第二光谱范围内的光对样本进行透射光照射的第二光源(20)，
用于从显微镜物镜收集的光形成样本图像的管透镜(22)，
用于检测第一光谱范围内的光的第一相机检测器(32)，
用于检测第二光谱范围内的光的第二相机检测器(34)，
在管透镜和检测器之间的图像光束路径(26)中的二向色分束器(24)，以及分析器单元(44)，
其中分束器将第一光谱范围内的光反射到第一相机检测器上，并将第二光谱范围内的光透射到第二相机检测器上，并且其中分析器单元被配置成组合由第一相机检测器记录的样本的第一图像和由第二相机检测器记录的样本的第二图像，以便生成具有增强对比度的总样本图像，
其中在二向色分束器(24)和第一相机检测器(32)之间提供阻挡滤光器(36)，用于阻挡第二光谱范围内的光，以便防止第一相机检测器上的重影图像，并且其中阻挡滤光器(36)相对于由二向色分束器(24)反射的光束(28)以一个角度倾向，所述角度在±3％的近似范围内等于二向色分束器相对于来自管透镜(22)的入射图像光束(26)的角度，并且具有与二向色分束器在±3％的近似范围内相同的厚度。
2.根据权利要求1所述的显微镜设备，进一步包括用于经由用于荧光激发的显微镜物镜(12)照射样本的面照射光源(40)，其中来自样本的荧光发射光由显微镜物镜收集并由管透镜(22)成像到第一和第二相机检测器(32，34)中的至少一个上。
3.根据权利要求1或2所述的显微镜设备，其中二向色分束器(24)的法线相对于入射光束(26)的角度位于12和18°之间。
4.根据权利要求1或2所述的显微镜设备，其中二向色分束器(24)具有1与2mm之间的厚度。
5.根据权利要求1或2所述的显微镜设备，其中，分析器单元(44)被配置为将第一图像和第二图像之间的差除以第一图像和第二图像的和，以便组合第一图像和第二图像。
6.根据权利要求1或2所述的显微镜设备，其中第一光谱范围处于比第二光谱范围更短的波长，其中二向色分束器(24)是长通的。
7.根据权利要求1或2所述的显微镜设备，其中，第一光谱范围处于比第二光谱范围更长的波长，其中二向色分束器(24)是短通的。
8.根据权利要求1或2所述的显微镜设备，其中第一和第二光源(18，20)用于对样本进行透射光照射。
9.根据权利要求8所述的显微镜设备，其中来自第一光源的光以相对于样本表面的第一角度撞击在样本上，并且其中来自第二光源的光以相对于样本表面的第二角度范围撞击在样本上。
10.根据权利要求9所述的显微镜设备，其中第一角度和第二角度的绝对值相等，并且其中来自第一光源(18)的光束和来自第二光源(20)的光束相对于垂直于样本并且包括显微镜物镜(12)的光轴(38)的平面彼此镜像对称。
11.根据权利要求10所述的显微镜设备，其中第一角度从43°至47°。
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