JP2024502383A

JP2024502383A - 顕微鏡装置

Info

Publication number: JP2024502383A
Application number: JP2023541904A
Authority: JP
Inventors: ウール，レイナー
Original assignee: ミルテニイビオテックベー．ファー．ウントコー．カーゲー
Priority date: 2021-01-12
Filing date: 2022-01-12
Publication date: 2024-01-18
Also published as: US20240068026A1; CN116830008A; EP4278227A1; WO2022152720A1

Abstract

本発明は、顕微鏡対物レンズ（１）と、１つまたは複数の光源と、少なくとも３つのダイクロイックビームスプリッタ（５０、５１、５６）と、少なくとも２つのカメラ（１０９、１１７）と、を備える顕微鏡装置において、光源によって生成された光が試料（３）と相互作用し、それにより試料光線（６）を発生させ、－試料光線（６）が、第１のダイクロイックビームスプリッタ（５０）により、光線（Ｋ）と光線（Ｌ）とに分割され、光線（Ｋ）と光線（Ｌ）とが、異なる光のスペクトル範囲を有し、－光線（Ｋ）が、第２のダイクロイックビームスプリッタ（５１）により、第１の光のスペクトル範囲を有する第１の光線（Ａ）と、第２の光のスペクトル範囲を有する第２の光線（Ｂ）とに分割され、第１の光線（Ａ）は、反射要素（５４）を介して第１のカメラ（１０９）の検出器に導かれ、第２の光線（Ｂ）は、反射要素（５２）および（５３）を介して第１のカメラ（１０９）の検出器に導かれ、－光線（Ｌ）が、第３のダイクロイックビームスプリッタ（５６）により、第３の光のスペクトル範囲を有する第３の光線（Ｃ）と、第４の光のスペクトル範囲を有する第４の光線（Ｄ）とに分割され、第３の光線（Ｃ）は、反射要素（５８）および（５９）を介して第２のカメラ（１１７）の検出器に導かれ、第４の光線（Ｄ）は、反射要素（５７）を介して第２のカメラ（１１７）の検出器に導かれることを特徴とする、顕微鏡装置を対象とする。シーケンシング情報を得るための同顕微鏡の使用。

Description

本発明は、４色の識別能力を利用して最大限にコントラストの豊かな蛍光あるいは透過光像を提供する、カメラを使用した顕微鏡に関する。

通例、顕微鏡法で使用されるカメラ検出器はモノクロである。多色顕微鏡がＷＯ２０２０／０３８７５２に開示されており、それは二重発光検出能力を持つ顕微鏡装置に関する。それは２つのカメラを用い、顕微鏡と２つのカメラとの間の有限の光学空間にダイクロイックビームスプリッタを配置し、カメラが、２つの望まれるスペクトル領域を記録する。透過されるスペクトル像を歪ませないために、ダイクロイックは可能な限り薄く、反射角度は可能な限り小さく、保たれる。しかし、薄い基板は、平坦性を損なう傾向があり、したがって反射像の品質を損なう傾向があるため、最適な厚みは常に透過像の品質と反射像の品質との間の妥協を反映している。

同様の技術が米国特許出願公開第２０１８／００６７３２７号に開示されており、そこでは、像光線がダイクロイックビームスプリッタによって２つの望まれるスペクトル領域に分割され、それらが次いで１つのカメラに導かれる。

本発明の目的は、２つのカメラだけで４つのスペクトル領域を分離することが可能な顕微鏡装置を提供することである。

本発明の目的は、したがって、顕微鏡対物レンズ（１）と、１つまたは複数の光源と、少なくとも３つのダイクロイックビームスプリッタ（５０、５１、５６）と、少なくとも２つのカメラ（１０９、１１７）と、を備える顕微鏡装置において、光源によって生成された光が試料（３）と相互作用し、それにより試料光線（６）を発生させ、
－試料光線（６）が、第１のダイクロイックビームスプリッタ（５０）により、光線（Ｋ）と光線（Ｌ）とに分割され、光線（Ｋ）と光線（Ｌ）とが、異なる光のスペクトル範囲を有し、
－光線（Ｋ）が、第２のダイクロイックビームスプリッタ（５１）により、第１の光のスペクトル範囲を有する第１の光線（Ａ）と、第２の光のスペクトル範囲を有する第２の光線（Ｂ）とに分割され、第１の光線（Ａ）は、反射要素（５４）を介して第１のカメラ（１０９）の検出器に導かれ、第２の光線（Ｂ）は、反射要素（５２）および（５３）を介して第１のカメラ（１０９）の検出器に導かれ、
－光線（Ｌ）が、第３のダイクロイックビームスプリッタ（５６）により、第３の光のスペクトル範囲を有する第３の光線（Ｃ）と、第４の光のスペクトル範囲を有する第４の光線（Ｄ）とに分割され、第３の光線（Ｃ）は、反射要素（５８）および（５９）を介して第２のカメラ（１１７）の検出器に導かれ、第４の光線（Ｄ）は、反射要素（５７）を介して第２のカメラ（１１７）の検出器に導かれることを特徴とする、顕微鏡装置である。

そのような顕微鏡装置は、ＤＮＡ／ＲＮＡ分子のシーケンシングで該当することの多い、試料によって発される複数のスペクトル範囲を検出するために特に有用である。試料の損傷を回避するために、光と試料との間の相互作用は、可能な限り短く保たれるべきである。本発明の装置は少なくとも４つの異なるスペクトル範囲を同時に検出することができるため、ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ－ｂｙ－ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ法における本明細書に開示される顕微鏡装置の使用が、本発明のさらなる目的である。

本発明の顕微鏡の光の経路の２つの実施形態を示す図である。試料光線（６）の上流の装置の一部を示す図である。

図１または図２に示される本発明の装置では、試料から発した光（透過されたまたは発光されたかのどちらか）が、３つのダイクロイックビームスプリッタによって４つのスペクトル領域に分離され、その結果生じる像光線Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＤが、２つのカメラ（１０９、１１７）に誘導され、それにより、２つのカメラの各々が、各自のセンサチップ上で並んで２つのスペクトル領域を記録する。これは、最大で１７×１７ｍｍの正方形の視野をカバーする、現在の顕微鏡の像野よりもはるかに大きい像野（例えば３６×２４ｍｍ）向けに、ハイエンドのカメラチップが利用可能であることによって容易にされる。代替として、ＴＤＩカメラが使用される。

本発明による顕微鏡は、電荷結合素子（ＣＣＤ）型、電子倍増電荷結合素子（ＥＭ－ＣＣＤ）型、相補型金属酸化膜半導体（ＣＭＯＳ）型、科学相補型金属酸化膜半導体（ＣＭＯＳ）型、時間遅延積分（ＴＤＩ）型、またはそれらの組み合わせである、少なくとも１つのカメラ（１０９、１１７）を備えてよい。

好ましくは、顕微鏡は、４つのスペクトル範囲、例えば、４０５、４８８、５６１および６３８ｎｍ、または３７５ｎｍ、４７３ｎｍ、５３２ｎｍおよび６６０ｎｍ、を検出するように装備される。そのために、好ましくは、カットオン波長は、発光を励起波長間の４つのスペクトル領域に分離するように、４８８、５６１、および６３８ｎｍと選定される。好ましくは、第１、第２、第３、および第４の光線（語Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄと交換可能）の光のそれぞれのスペクトル範囲は、４７３ｎｍ～５３２ｎｍ；５３２ｎｍ～５９４ｎｍ、５９４ｎｍ～６６０ｎｍ；６３３ｎｍ～６６０ｎｍである。これらの光のスペクトル範囲は、例として与えられるものであり、ビームスプリッタの機能に依存すること、すなわち、必ずしもこの順（sequence）に制限されないことに留意すべきである。

好ましい実施形態では、ダイクロイックビームスプリッタ（５０、５１、５６）の少なくとも１つは、カメラによって検出される光の色誤差を最小にするまたは回避するように、光の経路内に配置（傾斜）される。色誤差は光のスペクトル範囲／波長に依存するので、ダイクロイックビームスプリッタ（５０、５１、５６）の角度位置は、同じであることも異なることもあり得る。

したがって、各々の残像に対する第１、第２、および第３のダイクロイックビームスプリッタ（５０、５１、５６）の傾斜角は、それぞれ独立して＋４５°～－４５°の間、好ましくはそれぞれ独立して＋３０°～－３０°の間、またはそれぞれ独立して＋２５°～－２５°の間、またはそれぞれ独立して＋１５°～－１５°の間、であってよい。いずれの場合も、各自の残光線に対する第１のダイクロイックビームスプリッタと第３のダイクロイックビームスプリッタ（５０、５６）の傾斜角は、互いと反対方向であってよい。

光源は好ましくは、白色光、レーザ光、またはＬＥＤ光のような、３００～１７５０ｎｍ、好ましくは３００～８００ｎｍ、の波長のスペクトル範囲を有する光を提供する。試料は、「そのまま」光に当てられても、または関心領域を識別するための蛍光もしくは燐光剤が与えられてもよい。試料を損傷するのを回避するために、５２５ｎｍや６３５ｎｍなどの長い波長の光を発生する好ましい光源が使用される。

したがって、試料光線は、試料（３）から発する蛍光もしくは燐光放射、または試料（３）によって透過もしくは反射された放射であるかまたはそれを含み得る。

さらに、顕微鏡装置は、第１のビームスプリッタの上流の試料光線の光線経路内に少なくとも１つの合焦要素（２）を備えてよい（図１に示される）。代替例では、図２に示すように、第１のビームスプリッタの下流の試料光線内に、２つ以上の合焦要素（２）が設けられてよい。

合焦要素は、少なくとも１つのレンズ、または１つの対物レンズ、またはそれらの組み合わせから構成されるかまたはそれを含んでよい。

別の実施形態で、本発明による顕微鏡装置は、第１、第２、第３のおよび／または第４の像光線Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄの光線経路内に１つまたは複数の光学要素（２１、２２、２３、２４）を備えていてよい。そのような光学要素は、焦点面または像面シフトが可能であり、任意で、適切な装置を用いて光線経路に挿入および除去が可能であり得る。好適な光学要素は、周囲の媒体よりも高い屈折率を有しており、被覆されたまたは被覆されていないガラスまたはポリマーから成ってよい。さらに、それら光学要素は、二色性のビームスプリッタによって引き起こされる光学的歪みを色補正するためのフィルタを備えることができる。

図１および図２は、本発明の装置を示し、これは、２つのカメラチップ（１０９）および（１１７）のそれぞれに、２つの同一の光学的構成（４８）および（４９）を使用する。チューブレンズ（２）と、カメラチップ（９）および（１８）それぞれとの間の有限の光学空間に置かれたビームスプリッタ（５０）は、像光線（６）を２つの光線（Ｋ＝Ａ＋Ｂ）および（Ｌ＝Ｃ＋Ｄ）に分ける。光学的構成（４８）では、ビームスプリッタ（５１）がＫを光線ＡおよびＢに分けるのに対し、光学的構成（４９）では、ビームスプリッタ（５６）がＬを光線ＣおよびＤに分ける。反射光線（Ｂ）は、ミラー（５２）および（５３）でもう２回の反射を必要とするのに対し、透過光線（Ａ）は、検出器（１０９）に到達する前に表面（５４）で１回のみの反射を必要とする。ダイクロイックビームスプリッタ（５０）によって透過された光線である（Ｌ）は、ダイクロイックビームスプリッタ（５６）で反射されることにより（Ｃ）と、ダイクロイックビームスプリッタ（５６）で透過される（Ｄ）とに分けられる。（４８）と同じように、透過分（Ｄ）は、反射要素（５７）で１回の反射を必要とするのに対し、反射分（Ｃ）は、反射面（５８）および（５９）でもう２回の反射を必要とする。

本発明の前の変形例に関して説明したように、ダイクロイックビームスプリッタによって反射されたすべての光線は、ゴースト像情報を運んでいる可能性がある。図１および図２において、これはスペクトル領域（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）に当てはまり、これらは、検出器の前に適切なバンドパスフィルタを必要とするか、または空間的制約を克服するために、反射面（５４）、（５２）、および（５３）、ならびに（５８）および（５９）に関して適切なフィルタ特性を必要とする。

（主として、球面、非点、またはコマ）収差を最小に抑えるために、２つのダイクロイック要素（５０）および（５１）の傾斜角は、色収差を補償するように、約２５°の角度およびその反対の角度に保たれる。

ダイクロイックビームスプリッタの厚みは、透過における厚みに関係する収差を最小にするために可能な限り小さく保たれる（通常１～３ｍｍ）が、光線の反射分の像品質にとって極めて重大である反射面の平坦性を維持するのに十分に厚い（図１）。代替として、（主として、球面、非点、またはコマ）収差を最小に抑えるために、１つのダイクロイック要素が、対物レンズ（１）と合焦要素（２）との間に配置されて、このダイクロイック位置においてより大きい傾斜角（好ましくは４５°）を可能にすると共に、より大きい厚み（通常は３ｍｍ、場合により１ｍｍ～５ｍｍ）を可能にする。

ダイクロイック要素で反射を経た３つのスペクトル領域（Ａ）、（Ｂ）、および（Ｃ）はすべて、それぞれのダイクロイックビームスプリッタ（５０、５１、および５６）の後ろ（出射）側での反射から生じたゴースト像を運んでいる可能性がある。これらのゴースト像が含むのは、通常、伝えられる像情報の１％未満であるが、反射信号が弱く、透過信号の合計が大きい場合、これは依然として著しい像劣化につながり得る。これの解決法は、適切なバンドパスフィルタまたは光学要素（２１、２２、２３、および２４）を光線経路に入れるものである。

さらに、反射要素（５２）および／または（５３）は、第１のダイクロイックビームスプリッタ（５０）および／または第２のダイクロイックビームスプリッタ（５１）と同じ光学特性を有するフィルタ層を備えてよい。反射要素（５４）は、第１のダイクロイックビームスプリッタ（５０）と同じ光学特性を有するフィルタ層を備えてよい。反射要素（５８）および／または（５９）は、第３のダイクロイックビームスプリッタ（５６）と同じ光学特性を有するフィルタ層を備えてよい。

さらに、反射要素（５２）および／または反射要素（５３）は、第２のダイクロイックビームスプリッタ（５１）と同じ光学特性を有するフィルタ層を備えてよい。

また、本発明の顕微鏡装置は、像（６）を作り出すために、試料光線の光線経路内に少なくとも１つの合焦要素（２）を備えてよい。代替例（図２に示される）では、少なくとも１つの合焦要素（２）が、像Ｌおよび／またはＫの光線経路中に設けられてよい。合焦要素（２）は、少なくとも１つのレンズ、または少なくとも１つの対物レンズ、またはそれらの組み合わせから構成されるかまたはそれを含んでよい。

それぞれのダイクロイックビームスプリッタがロングパスフィルタである場合は、ショートパスフィルタがバンドパスフィルタの替わりとなることができ、ダイクロイックビームスプリッタがショートパスであれば、ロングパスフィルタが必要となる。

本発明による顕微鏡装置は、蛍光発光と透過光吸収の両方において、最大４つのスペクトル領域に関して、色標識のされた物体の像を差別化することを可能にする。好ましくは、光学経路長がすべてのスペクトル範囲（色チャネル）について同一であり、すべての像がそれぞれの検出器チップ（カメラ）の面内に存在する。

これは、最適に補正された光学系の場合に成立する。現実世界では、この光学レイアウトは、光学経路長を適宜調節することにより、長手方向の色の不完全性を補正するために使用され得る。

しかし、非着色試料では、または透過光もしくは反射光像には、経路長の意図的なずらし（ｄｅｔｕｎｉｎｇ）を使用して、２つ以上の焦点深度を同時に観察し、異なる焦点位置で撮影された像からコントラスト強化像を再構築することができる。例えば、４０５ｎｍレーザおよび４８８ｎｍレーザによって励起された発光を分離するために設計されたダイクロイックアンサンブルは、白色発光ダイオードの光を、４８８ｎｍより下と上の２つのスペクトル領域に分割する。

光学要素（２２）を光線経路（１１）に挿入し、光学要素（２２）を光線から除去するための手段を設けることによって、＞４８８ｎｍの長波長チャネルにおけるゴースト像を抑制することにより、光学要素（２２）の厚みが、光線ＡとＢの経路長差を決定するようになる。同じ構成が、光学要素（２１）、（２３）および／または（２４）を備えることができる。

４０×の対物レンズを用い、厚み２ｍｍのフィルタ基板を除去すると、カメラチップ（１０９）によって記録される２つの像の４１６ｎｍの焦点変位が得られる。明らかに、２つ以上の色チャネル間に好適な経路長差を設けるための他の手段も、本発明に従って可能である。

装置の使用
本発明の顕微鏡装置は、ＤＮＡ／ＲＮＡ分子のシーケンシング中に発される複数のスペクトル範囲を検出するための方法に、特に生物試料のＤＮＡまたはＲＮＡ配列情報を得るためのｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ－ｂｙ－ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ法のために、特に有用である。

好ましくは、ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ－ｂｙ－ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ法は、それぞれ異なる色素が与えられたヌクレオチドの、生物試料のＤＮＡまたはＲＮＡとのハイブリッド形成によって行われ、色素は、スペクトル範囲Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＤまたはそれらの組み合わせにある１つまたは複数の光源によって励起されたときに光を発する。そのようなｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ－ｂｙ－ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ法および必要な色素は、当業者に知られている。

図１および図２は、本発明の装置を示し、これは、２つのカメラチップ（１０９）および（１１７）のそれぞれに、２つの同一の光学的構成（４８）および（４９）を使用する。チューブレンズ（２）と、カメラチップ（１０９）および（１１７）それぞれとの間の有限の光学空間に置かれたビームスプリッタ（５０）は、像光線（６）を２つの光線（Ｋ＝Ａ＋Ｂ）および（Ｌ＝Ｃ＋Ｄ）に分ける。光学的構成（４８）では、ビームスプリッタ（５１）がＫを光線ＡおよびＢに分けるのに対し、光学的構成（４９）では、ビームスプリッタ（５６）がＬを光線ＣおよびＤに分ける。反射光線（Ｂ）は、ミラー（５２）および（５３）でもう２回の反射を必要とするのに対し、透過光線（Ａ）は、カメラチップ（１０９）の検出器に到達する前に表面（５４）で１回のみの反射を必要とする。ダイクロイックビームスプリッタ（５０）によって透過された光線である（Ｌ）は、ダイクロイックビームスプリッタ（５６）で反射されることにより（Ｃ）と、ダイクロイックビームスプリッタ（５６）で透過される（Ｄ）とに分けられる。（４８）と同じように、透過分（Ｄ）は、反射要素（５７）で１回の反射を必要とするのに対し、反射分（Ｃ）は、反射面（５８）および（５９）でもう２回の反射を必要とする。

Claims

顕微鏡対物レンズ（１）と、１つまたは複数の光源と、少なくとも３つのダイクロイックビームスプリッタ（５０、５１、５６）と、少なくとも２つのカメラ（１０９、１１７）と、を備える顕微鏡装置において、前記光源によって生成された光が試料（３）と相互作用し、それにより試料光線（６）を発生させ、
－試料光線（６）が、第１のダイクロイックビームスプリッタ（５０）により、光線（Ｋ）と光線（Ｌ）とに分割され、光線（Ｋ）と光線（Ｌ）とが、異なる光のスペクトル範囲を有し、
－光線（Ｋ）が、第２のダイクロイックビームスプリッタ（５１）により、第１の光のスペクトル範囲を有する第１の光線（Ａ）と、第２の光のスペクトル範囲を有する第２の光線（Ｂ）とに分割され、第１の光線（Ａ）は、反射要素（５４）を介して第１のカメラ（１０９）の検出器に導かれ、第２の光線（Ｂ）は、反射要素（５２）および（５３）を介して前記第１のカメラ（１０９）の前記検出器に導かれ、
－光線（Ｌ）が、第３のダイクロイックビームスプリッタ（５６）により、第３の光のスペクトル範囲を有する第３の光線（Ｃ）と、第４の光のスペクトル範囲を有する第４の光線（Ｄ）とに分割され、第３の光線（Ｃ）は、反射要素（５８）および（５９）を介して第２のカメラ（１１７）の検出器に導かれ、前記第４の光線（Ｄ）は、反射要素（５７）を介して前記第２のカメラ（１１７）の前記検出器に導かれることを特徴とする、顕微鏡装置。
各々の光線に対する第１、第２、および第３のダイクロイックビームスプリッタ（５０、５１、５６）の傾斜角が、それぞれ独立して＋４５°～－４５°の間であることを特徴とする、請求項１に記載の顕微鏡装置。
反射要素（５４）が、第１のダイクロイックビームスプリッタ（５０）と同じ光学特性を有するフィルタ層を備えていることを特徴とする、請求項１または２に記載の顕微鏡装置。
反射要素（５８）および／または（５９）が、第３のダイクロイックビームスプリッタ（５６）と同じ光学特性を有するフィルタ層を備えていることを特徴とする、請求項１から３のいずれかに記載の顕微鏡装置。
反射要素（５２）および／または反射要素（５３）が、第１のダイクロイックビームスプリッタ（５０）と同じ光学特性を有するフィルタ層を備えていることを特徴とする、請求項１から４のいずれかに記載の顕微鏡装置。
反射要素（５２）および／または反射要素（５３）が、第２のダイクロイックビームスプリッタ（５１）と同じ光学特性を有するフィルタ層を備えていることを特徴とする、請求項１から５のいずれかに記載の顕微鏡装置。
前記光源が、３００～１７５０ｎｍのスペクトル範囲を有する光を提供することを特徴とする、請求項１から６のいずれかに記載の顕微鏡装置。
少なくとも１つの合焦要素（２）を前記試料光線（６）の光線経路内に設けることを特徴とする、請求項１から７のいずれかに記載の顕微鏡装置。
前記合焦要素（２）が、少なくとも１つのレンズ、または少なくとも１つの対物レンズ、またはそれらの組み合わせからなることを特徴とする、請求項８に記載の顕微鏡装置。
１つまたは複数の光学要素（２１、２２、２３、２４）を第１、第２、第３、および／または第４の光線Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄの光線経路内に設けることを特徴とする、請求項１から９のいずれかに記載の顕微鏡装置。
前記光学要素が、前記光線経路に挿入および除去されることが可能であることを特徴とする、請求項１０に記載の顕微鏡装置。
前記試料光線（６）が、前記試料（３）から発された蛍光もしくは燐光放射または透過光もしくは反射光を含むことを特徴とする、請求項１から１１のいずれかに記載の顕微鏡装置。
前記第１の光線と前記第２の光線、および／または前記第３の光線と前記第４の光線が、前記試料（３）上の異なる位置から発され、前記異なる位置の前記光線同士は、前記試料（３）を前記カメラに対して移動させることによって位置合わせされることを特徴とする、請求項１から１２のいずれかに記載の顕微鏡装置。
ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ－ｂｙ－ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ法における、請求項１から１３のいずれかに記載の顕微鏡装置の使用。
生物試料のＤＮＡまたはＲＮＡ配列情報を得るためのｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ－ｂｙ－ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ法における、請求項１４に記載の顕微鏡装置の使用。
前記ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ－ｂｙ－ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ法が、それぞれ異なる色素が与えられたヌクレオチドの、前記生物試料のＤＮＡまたはＲＮＡとのハイブリッド形成によって行われ、前記色素は、スペクトル範囲Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＤまたはそれらの組み合わせにある前記１つまたは複数の光源によって励起されたときに光を発することを特徴とする、請求項１４または１５に記載の使用。