CN117545772A - 结合CD123和γ-δT细胞受体的抗体 - Google Patents

Abstract

本发明涉及能够结合人CD123并且能够结合人Vγ9Vδ2T细胞受体的Vδ2链的抗体。本发明还涉及包含本发明的抗体的药物组合物和本发明的抗体用于医学治疗的用途。

Description

结合CD123和γ-δT细胞受体的抗体

技术领域

本发明涉及能够结合人CD123并且能够结合人Vγ9Vδ2T细胞受体的Vδ2链的新型多特异性抗体。本发明还涉及包含本发明的抗体的药物组合物和本发明的抗体用于医学治疗的用途。

背景技术

CD123或白介素-3(IL3)受体α链是一种膜蛋白，其通过IL3(一种参与血细胞产生的细胞因子)传递信号。CD123与共同的β链CD131形成异二聚体。CD123在一些类型的血细胞(诸如浆细胞样树突状细胞或单核细胞)上正常表达并且由正常髓系祖细胞的亚群表达。然而，CD123在急性髓系白血病患者的白血病干细胞上强烈地过表达。因此，CD123是包括急性髓系白血病在内的几种血液***恶性肿瘤中的潜在治疗靶标。

几种双特异性CD123-CD3 T细胞衔接抗体已有描述(Kuo等人(2012)Protein EngDes Set 10:561；Al-Hussaini等人(2016)Blood127:122)。双特异性T细胞衔接抗体具有肿瘤靶标结合特异性和T细胞结合特异性，并且因此通过将T细胞的细胞毒性重定向至恶性细胞来加强功效，参见例如Huehls等人(2015)Immunol Cell Biol 93:290；Ellerman(2019)Methods,154:102；de Bruin等人(2017)Oncoimmunology 7(1):e1375641和WO2015156673。然而，结果差异很大。例如，在一项将CD3结合部分与针对8种不同的B细胞靶标(CD20、CD22、CD24、CD37、CD70、CD79b、CD138和HLA-DR)的结合部分组合的研究中，发现靶向不同肿瘤靶标的双特异性抗体在其诱导靶细胞的细胞毒性的能力上表现出很大差异，并且细胞毒性与抗原表达水平不相关。例如，尽管HLA-DR和CD138的表达水平中等至较高，但靶向HLA-DR或CD138的基于CD3的双特异性抗体无法诱导细胞毒性(Engelberts等人(2020)Ebiomedicine52:102625)。很少T细胞重定向疗法已达到临床开发后期，这可能是由于显著的毒性、制造问题、免疫原性、狭窄的治疗窗口和低反应。具体地，当T细胞衔接器(T-cell engager)包括CD3结合臂时，可能发生毒性，并导致不受控制的、过度的免疫活化和细胞因子释放。

因此，虽然已经取得了重大进展，但仍然需要治疗有效且具有可接受的毒性以及稳定性和可制造性的新型CD123靶向抗体。

发明内容

本发明提供了用于基于CD123的疗法的新型抗体。构建了双特异性抗体，其中将单结构域CD123结合区与能够结合人Vγ9Vδ2T细胞受体的Vδ2链并且从而衔接γδT细胞的结合区组合。令人惊讶的是，双特异性抗体在介导Vγ9Vδ2T细胞的活化以及在Vγ9Vδ2T细胞的存在下诱导表达CD123的细胞系以及患者来源的肿瘤细胞的杀伤方面异常有效。

因此，在第一方面，本发明提供了一种多特异性抗体，其包含能够结合人CD123的第一抗原结合区和能够结合人Vγ9Vδ2T细胞受体的Vδ2链的第二抗原结合区。

在另一个主要方面，本发明提供了一种抗体，其包含能够结合人CD123的第一抗原结合区，其中第一抗原结合区是单结构域抗体，其包含：

(i)SEQ ID NO:2所示的VH CDR1序列、SEQ ID NO:3所示的VH CDR2序列和SEQ IDNO:4所示的VH CDR3序列，其中优选地第一抗原结合区包含或由以下组成：选自SEQ ID NO:1、25至34所示的序列组的序列，或与选自SEQ ID NO:1、25至34所示的序列组的序列具有至少90％，诸如至少92％，例如至少94％，诸如至少96％，例如至少98％序列同一性的序列，或

(ii)SEQ ID NO:10所示的VH CDR1序列、SEQ ID NO:11所示的VH CDR2序列和SEQID NO:12所示的VH CDR3序列，其中优选地第一抗原结合区包含或由以下组成：SEQ ID NO:9所示的序列，或与SEQ ID NO:9所示的序列具有至少90％，诸如至少92％，例如至少94％，诸如至少96％，例如至少98％序列同一性的序列。

下面描述本发明的另外方面和实施方案。

附图说明

图1：示出所有不同的双特异性VHH与CD123、Vγ9Vδ2(GDT)TCR和BSA(作为阴性对照)的结合的ELISA。描绘了OD值；值是重复测量的平均值；误差线表示平均值的标准误差。单价抗Vδ2VHH用作TCR染色的对照(“TCR对照”)，并且可商购获得的抗CD123抗体(“抗CD123”)用作CD123抗原包被的对照。“无AB”表示不具有一抗的阴性对照。

图2：使用流式细胞术测定的双特异性VHH的结合特异性。将荧光信号的几何平均值绘制为所用的抗体和细胞类型的函数。包括由293F细胞内源性表达的识别EGFR的VHH作为阳性对照。单价抗Vδ2VHH用作阴性对照VHH。

图3：使用流式细胞术确定1D2-5C8var1与CD123的结合的表观亲和力。测试纯化的1D2-5C8var1的系列稀释液与瞬时表达CD123或CD131或CD123和CD131两者的293F细胞的结合。将荧光强度的几何平均值绘制为所用抗体浓度的函数。EC50值通过曲线拟合确定。

图4：1D2-5C8var1与CD123的结合的代表性BLI分析。将代表所结合的蛋白质质量的光反射偏移(以nm为单位测量)绘制为时间的函数。0-300秒：缔合阶段；300-900秒：解离阶段。

图5：C1R-neo靶细胞依赖性的、1D2-5C8var1介导的Vγ9Vδ2T细胞活化。将显示出CD107A表达(脱粒)的CD3+-Vγ9+T细胞的百分比绘制为所用抗体浓度的函数。描绘了使用两个不同供体的实验。

图6：1D2-5C8var1诱导的、Vγ9Vδ2T细胞介导的C1R-neo靶细胞的细胞毒性。将活C1R-neo靶细胞的百分比绘制为所用的双特异性VHH的浓度的函数。描绘了使用Vγ9Vδ2T细胞的两个不同供体获得的数据。

图7：双特异性VHH诱导的、Vγ9Vδ2T细胞介导的THP-1靶细胞的细胞毒性。将活THP-1靶细胞的百分比绘制为所用的双特异性VHH的浓度的函数。

图8：双特异性VHH介导的Vγ9Vδ2T细胞活化和双特异性VHH介导的T细胞诱导的患者来源的原代AML样品的裂解。上图：通过CD107A表达测量的T细胞活化。下图：T细胞连同双特异性VHH一起对AML母细胞的裂解。

图9：纯化的抗CD123 x Vγ9Vδ2TCR双特异性抗体1D2-5C8var1(Y105F)-Fc的HP-SEC图谱。

图10：1D2-5C8var1(Y105F)-Fc诱导Vγ9Vδ2T细胞活化。示出典型实验。CD107a-(溶酶体相关蛋白-1，或LAMP-1)阳性Vγ9Vδ2细胞的百分比被描绘为所用化合物浓度的函数。EC50值(以pM为单位，通过曲线拟合确定)描绘于下图中。数据点是三次重复测量的平均值；误差线代表标准偏差。

图11：1D2-5C8var1(Y105F)-Fc诱导T细胞介导的靶细胞裂解。示出典型实验。该图示出在共培养24小时后被杀伤的靶细胞的百分比作为所用化合物浓度的函数。EC50值(以pM为单位，通过曲线拟合确定)描绘于下图中。数据点是三次重复测量的平均值；误差线代表标准偏差。

图12：浆细胞样树突状细胞(上图)和THP-1细胞系(下图)上的CD123表达水平。示出典型染色。描绘了示出未染色细胞、同种型对照染色(左侧重叠直方图)和针对CD123的染色(右侧峰)的直方图。事件数(Y轴)示出为荧光强度(X轴)的函数。

图13：与pDC相比，1D2-5C8var1(Y105F)-Fc诱导THP-1细胞的优先杀伤。示出代表性结果。杀伤的靶细胞的百分比被描绘为每个靶细胞群(即THP-1或pDC)的所用化合物浓度的函数。EC50值(以pM为单位，通过曲线拟合确定)描绘于下图中。数据点是三次重复测量的平均值；误差线代表标准偏差。

图14：全长人CD123的一级氨基酸序列(GenBank登录号NM_002183.4)(SEQ ID NO:23)。被发现与1D2抗体交联的残基用粗体表示并且加有下划线。以斜体表示的残基(侧接有所发现的反应性残基)也可以是所识别表位的一部分。

图15：CD123的C-α迹线模型(IL-3受体α链：Broughton等人,2018 2018NatCommun.9:386)；指示了被发现与抗体交联的残基。跨膜螺旋将位于图的左侧。

图16：通过利用(A)通过紫外吸收(SEC-UV)检测的尺寸排阻色谱和(B)在变性(SDS)条件(CE-SDS)下并且在还原之后进行的毛细管凝胶电泳测量聚集体和片段确定的应激诱导的变化。

图17：(A)4小时后通过利用流式细胞术测量CD107a(溶酶体相关蛋白-1，或LAMP-1)阳性细胞的百分比来分析脱粒。(B)通过测量CD25阳性细胞的百分比来分析T细胞活化。(C)通过利用流式细胞术确定24小时后活靶细胞的百分比来分析细胞毒性。

具体实施方式

定义

当在本文使用时，术语“人CD123”是指人CD123蛋白，也称为白介素-3受体α链(GenBank登录号NM_002183.4，NCBI参考序列：NP_002174.1)。人CD123的序列如SEQ ID NO:23所示。IL3受体是CD123与共同的β链CD131的异二聚体(NCBI参考序列：NP_000386.1)。CD131如SEQ ID NO:24所示。

当在本文中使用时，术语“人Vδ2”是指Vγ9Vδ2-T细胞受体(TCR)的重排δ2链(SEQID NO:48)。UniProtKB-A0JD36(A0JD36_HUMAN)给出可变TRDV2序列的实例。

当在本文中使用时，术语“人Vγ9”是指Vγ9Vδ2-T细胞受体(TCR)的重排y9链。UniProtKB–Q99603_HUMAN给出可变TRGV9序列的实例。

术语“抗体”旨在指免疫球蛋白分子、免疫球蛋白分子的片段，或其中任一者的衍生物，其具有在典型的生理条件下特异性结合抗原的能力，并且半衰期为很长的时间段，诸如至少约30分钟、至少约1小时、至少约2小时、至少约8小时、至少约12小时、约24小时或更长、约48小时或更长、约3、4、5、6、7天或更多天等，或任何其他相关的功能性定义的时间段(诸如足以诱导、促进、增强和/或调节与抗体结合抗原相关的生理反应的时间和/或足够抗体募集效应物活性的时间)。与抗原相互作用的抗原结合区可包含免疫球蛋白分子的重链和轻链的可变区，或可包含单结构域抗原结合区或由其组成，例如仅重链可变区。抗体的恒定区(如果存在)可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，所述宿主组织或因子包括免疫***的各种细胞(诸如效应细胞和T细胞)和补体***的组分，诸如C1q，其为补体活化的经典途径的第一组分。然而，在一些实施方案中，抗体的Fc区已被修饰而变得有惰性，“惰性”意指Fc区至少不能结合任何Fcγ受体、诱导Fc介导的FcR交联，或通过单个抗体的两个Fc区诱导FcR介导的靶抗原交联。在另一个实施方案中，惰性Fc区除此之外还不能结合C1q。在一个实施方案中，抗体包含位置234和235处的突变(Canfield和Morrison(1991)J ExpMed 173:1483)，例如位置234处的Leu至Phe突变和位置235处的Leu至Glu突变(根据EU编号，参见下文)。在另一个实施方案中，抗体包含位置234处的Leu至Ala突变、位置235处的Leu至Ala突变以及位置329处的Pro至Gly突变。在另一个实施方案中，抗体包含位置234处的Leu至Phe突变、位置235处的Leu至Glu突变以及位置265处的Asp至Ala。

免疫球蛋白的Fc区定义为在用木瓜蛋白酶消化抗体后通常将产生的抗体片段，其包括免疫球蛋白的两个CH2-CH3区和连接区，例如铰链区。抗体重链的恒定结构域限定抗体同种型，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgM、IgD或IgE。Fc区利用称为Fc受体的细胞表面受体和补体***的蛋白质介导抗体的效应功能。

如本文所用的术语“铰链区”旨在指免疫球蛋白重链的铰链区。因此，例如，根据EU编号，人IgG1抗体的铰链区对应于氨基酸216-230。

如本文所用的术语“CH2区”或“CH2结构域”旨在指免疫球蛋白重链的CH2区。因此，例如，根据EU编号，人IgG1抗体的CH2区对应于氨基酸231-340。然而，CH2区也可以是如本文所述的任何其他亚型。

如本文所用的术语“CH3区”或“CH3结构域”旨在指免疫球蛋白重链的CH3区。因此，例如，根据EU编号，人IgG1抗体的CH3区对应于氨基酸341-447。然而，CH3区也可以是如本文所述的任何其他亚型。

本发明中对Fc区/Fc结构域中的氨基酸位置的引用是根据EU编号(Edelman等人,Proc Natl Acad Sci U S A.1969年5月；63(1):78-85；Kabat等人,Sequences ofproteins of immunological interest.第5版-1991NIH出版号91-3242)。

如上文所指出，除非另行指出或与上下文明显矛盾，否则如本文所用的术语抗体包括保留特异性结合抗原的能力的抗体片段。已经表明，抗体的抗原结合功能可由全长抗体的片段来执行。术语“抗体”内涵盖的结合片段的实例包括(i)Fab’或Fab片段，即由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段，或如WO2007059782中所述的单价抗体；(ii)F(ab')2片段，即包含在铰链区通过二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)基本上由VH和CH1结构域组成的Fd片段；以及(iv)基本上由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段。此外，虽然Fv片段的两个结构域VL和VH由单独的基因编码，但它们可使用重组方法通过合成接头接合，这使得它们能够被制备为单条蛋白链，其中VL和VH区配对形成单价分子(称为单链抗体或单链Fv(scFv)，参见例如Bird等人,Science 242,423-426(1988)和Huston等人,PNASUSA 85,5879-5883(1988))。除非上下文另外指明，否则此类单链抗体涵盖在术语抗体内。除非另外指明，否则术语抗体还包括多克隆抗体、单克隆抗体(mAb)、嵌合抗体和人源化抗体，以及通过任何已知技术(诸如酶促切割、肽合成和重组技术)提供的抗体片段。

在本发明的抗体的一些实施方案中，第一抗原结合区或第二抗原结合区或两者是单结构域抗体。单结构域抗体(sdAb，也称为或VHH)是技术人员众所周知的，参见例如Hamers-Casterman等人(1993)Nature 363:446、Roovers等人(2007)Curr OpinMol Ther 9:327和Krah等人(2016)Immunopharmacol Immunotoxicol 38:21。单结构域抗体包含单个CDR1、单个CDR2和单个CDR3。单结构域抗体的实例是仅重链抗体的可变片段、天然不包含轻链的抗体、衍生自常规抗体的单结构域抗体以及工程化抗体。单结构域抗体可衍生自任何物种，包括小鼠、人、骆驼、美洲驼、鲨鱼、山羊、兔和牛。例如，天然存在的VHH分子可以衍生自在骆驼科物种，例如骆驼、单峰骆驼、美洲驼、羊驼和原驼中产生的抗体。与完整抗体一样，单结构域抗体能够选择性地结合特定抗原。单结构域抗体可以仅包含免疫球蛋白链的可变结构域，即CDR1、CDR2和CDR3以及框架区。

如本文所用的术语“免疫球蛋白”旨在指一类结构相关的糖蛋白，其通常由两对多肽链、一对轻(L)链和一对重(H)链组成，这四条链全部可能通过二硫键相互连接，尽管一些哺乳动物物种不产生轻链而仅产生重链抗体。如本文所用的术语“免疫球蛋白重链”、“免疫球蛋白的重链”或“重链”旨在指免疫球蛋白的链之一。重链通常由重链可变区(本文缩写为VH)和重链恒定区(本文缩写为CH)构成，其限定了免疫球蛋白的同种型。重链恒定区通常由三个结构域CH1、CH2和CH3构成。重链恒定区还包含铰链区。在免疫球蛋白(例如IgG)的结构内，两条重链通过铰链区中的二硫键相互连接。与重链一样，每条轻链通常由若干区域构成；即轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)。此外，VH和VL区可细分为高变区(或序列可高变和/或形成结构限定环的高变区)，也称为互补决定区(CDR)，其中穿插有更保守的区域，称为框架区(FR)。每个VH和VL通常由三个CDR和四个FR构成，以下列顺序从氨基端至羧基端排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。CDR序列可通过使用各种方法来确定，例如以下参考文献中提供的方法：Choitia和Lesk(1987)J.Mol.Biol.196:901或Kabat等人(1991)Sequence of protein of immunological interest,第五版.NIH出版。用于CDR确定和氨基酸编号的各种方法可以在www.abysis.org(UCL)上进行比较。

如本文所用的术语“同种型”是指免疫球蛋白(亚)类(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgD、IgA、IgE或IgM)或其任何同种异型，诸如由重链恒定区基因编码的IgG1m(za)和IgG1m(f)。每个重链同种型都可以与kappa(κ)或lambda(λ)轻链组合。本发明的抗体可以具有任何同种型。

术语“亲本抗体”应理解为与根据本发明的抗体相同的抗体，但其中亲本抗体不具有一种或多种指定突变。本发明的“变体”或“抗体变体”或“亲本抗体的变体”是与“亲本抗体”相比包含一个或多个突变的抗体分子。氨基酸取代可将天然氨基酸交换为另一种天然存在的氨基酸，或非天然存在的氨基酸衍生物。氨基酸取代可以是保守或非保守的。在本发明的上下文中，保守取代可通过以下三个表中的一个或多个中所反映的氨基酸类别内的取代来限定：

用于保守取代的氨基酸残基类别

酸性残基	Asp(D)和Glu(E)
		碱性残基	Lys(K)、Arg(R)和His(H)
亲水性不带电残基	Ser(S)、Thr(T)、Asn(N)和Gln(Q)
		脂族不带电残基	Gly(G)、Ala(A)、Val(V)、Leu(L)和Ile(I)
非极性不带电残基	Cys(C)、Met(M)和Pro(P)
		芳族残基	Phe(F)、Tyr(Y)和Trp(W)

替代性保守氨基酸残基取代类别

1	A	S	T
				2	D	E
3	N	Q
				4	R	K
5	I	L	M
				6	F	Y	W

氨基酸残基的替代性物理和功能分类

在本发明的上下文中，变体中的取代表示为：

原始氨基酸-位置-取代氨基酸；

使用三字母代码或单字母代码，包括代码Xaa和X来指示氨基酸残基。因此，记法“T366W”是指变体在与亲本抗体的位置366中的氨基酸相对应的变体氨基酸位置中包含色氨酸对苏氨酸的取代。

此外，术语“取代”包括取代为其他十九种天然氨基酸中的任一种，或取代为其他氨基酸，诸如非天然氨基酸。例如，位置366中的氨基酸T的取代包括以下取代中的每一个：366A、366C、366D、366G、366H、366F、366I、366K、366L、366M、366N、366P、366Q、366R、366S、366E、366V、366W和366Y。

当在本文中使用时，术语“全长抗体”是指包含与通常在所述同种型的野生型抗体中发现的那些相对应的所有重链和轻链恒定和可变结构域的抗体。

术语“嵌合抗体”是指其中可变区衍生自非人物种(例如衍生自啮齿动物)并且恒定区衍生自不同物种诸如人的抗体。嵌合抗体可通过基因工程产生。开发用于治疗应用的嵌合单克隆抗体以降低抗体免疫原性。

术语“人源化抗体”是指基因工程化的非人抗体，其包含人抗体恒定结构域和被修饰为与人可变结构域包含高水平的序列同源性的非人可变结构域。这可以通过将一起形成抗原结合位点的六个非人抗体互补决定区(CDR)移植到同源的人受体框架区(FR)上来实现。为了完全重构亲本抗体的结合亲和力和特异性，可能需要将来自亲本抗体(即非人抗体)的框架残基替换为人框架区(回复突变)。结构同源性建模可有助于鉴定框架区中对抗体的结合特性来说重要的氨基酸残基。因此，人源化抗体可包含非人CDR序列，主要是人框架区，其任选地包含非人氨基酸序列的一个或多个氨基酸回复突变；以及任选地，完全人恒定区。任选地，可引入另外的氨基酸修饰(不一定是回复突变)以获得具有优选特征(诸如亲和力和生化特性)的人源化抗体。进行非人治疗性抗体的人源化以最小化其在人类中的免疫原性，而此类人源化抗体同时保持非人来源的抗体的特异性和结合亲和力。

术语“多特异性抗体”是指由于存在两个或更多个抗原结合区而对至少两个不同的，诸如至少三个，通常不重叠的表位具有特异性的抗体。此类表位可位于相同或不同的靶抗原上。如果表位位于不同的靶标上，则此类靶标可位于相同的细胞或不同的细胞或细胞类型上。

术语“双特异性抗体”是指由于存在两个抗原结合区而对两个不同的通常不重叠的表位具有特异性的抗体。此类表位可位于相同或不同的靶标上。如果表位位于不同的靶标上，则此类靶标可位于相同的细胞或不同的细胞或细胞类型上。

不同类别的双特异性抗体的实例包括但不限于(i)具有互补的CH3结构域以强制发生异二聚化的IgG样分子；(ii)重组IgG样双重靶向分子，其中分子两侧各包含至少两种不同抗体的Fab片段或Fab片段的一部分；(iii)IgG融合分子，其中全长IgG抗体与额外的Fab片段或Fab片段的一部分融合；(iv)Fc融合分子，其中单链Fv分子或稳定的双抗体与重链恒定结构域、Fc区或其部分融合；(v)Fab融合分子，其中不同的Fab片段融合在一起，融合于重链恒定结构域、Fc区或其部分；以及(vi)基于scFv和双抗体的重链抗体(例如，结构域抗体、)，其中不同的单链Fv分子或不同的双抗体或不同的重链抗体(例如，结构域抗体，/>)彼此融合或融合于与重链恒定结构域、Fc区或其部分融合的另一蛋白质或载体分子。

具有互补的CH3结构域分子的IgG样分子的实例包括但不限于(TrionPharma/Fresenius Biotech)、旋钮-孔(Knobs-into-Hol es)(Genentech)、CrossMAbs(Roche)和静电匹配(electrostatically-mat ched)(Amgen,Chugai,Oncomed)、LUZ-Y(Genentech,Wranik等人J.Biol.Chem.2012,287(52):43331-9,doi:10.1074/jbc.M112.397869.Epub 2012年11月1日)、DIG-body和PIG-body(Pharmabcine,WO2010134666、WO2014081202)、链交换工程化结构域体(Strand Exchange EngineeredDomain body，SEEDbody)(EMD Serono)、Bicl onics(Merus,WO2013157953)、FcΔAdp(Regeneron)、双特异性IgG1和IgG2(Pfizer/Rinat)、Azymetric支架(Zymeworks/Merck)、mAb-Fv(Xencor)、二价双特异性抗体(Roche,WO2009080254)以及/> 分子(Genmab)。

重组IgG样双重靶向分子的实例包括但不限于双重靶向(DT)-Ig(GSK/Domantis,WO2009058383)、二合一抗体(Genentech,Bostrom等人2009.Science 323,1610–1614)、交联单克隆抗体(Karmanos Cancer Center)、mAb2(F-Star)、Zybodies^TM(Zyngenia,LaFleur等人MAbs.2013年3月-4月；5(2):208-18)、采用共同轻链的方法κλBodies(NovImmune,WO2012023053)以及(CovX/Pfizer,Doppalapudi,V.R.等人2007.Bioorg.Med.Chem.Lett.17,501–506)。

IgG融合分子的实例包括但不限于双可变结构域(DVD)-Ig(Abbott)、双结构域双头抗体(Unilever；Sanofi Aventis)、IgG样双特异性抗体(IgG-like Bispecific)(ImClone/Eli Lilly,Lewis等人Nat Biotechnol.2014年2月；32(2):191-8)、Ts2Ab(MedImmune/AZ,Dimasi等人J Mol Biol.2009年10月30日；393(3):672-92)以及BsAb(Zymogenics,WO2010111625)、HERCULES(Biogen Idec)、scFv融合体(Novartis)、scFv融合体(Changzhou Adam Biotech Inc)以及TvAb(Roche)。

Fc融合分子的实例包括但不限于scFv/Fc融合体(Academic Insti tution,Pearce等人Biochem Mol Biol Int.1997年9月；42(6):1179)、SCORPION(EmergentBioSolutions/Trubion,Blankenship JW等人AACR第100届年会2009(摘要#5465)；Zymogenetics/BMS,WO2010111625)、双重亲和力重靶向技术(Fc-DARTTM)(MacroGenics)以及双(ScFv)2-Fab(国家抗体医学研究中心-中国(National Research Cent er forAntibody Medicine–China))。

Fab融合双特异性抗体的实例包括但不限于F(ab)2(Medarex/AMGEN)、Dual-Action或Bis-Fab(Genentech)、(DN L)(ImmunoMedics)、BivalentBispecific(Biotecnol)和Fab-Fv(UCB-Celltech)。

基于scFv的、基于双抗体的结构域抗体的实例包括但不限于双特异性T细胞衔接器(Bispecific T Cell Engager，)(Micromet)、串联双抗体(Tandem Diabody，Tandab)(Affimed)、双重亲和力重靶向技术(DARTTM)(MacroGenics)、单链双抗体(Academic,Lawrence FEBS Lett.1998年4月3日；425(3):479-84)、TCR样抗体(AIT，ReceptorLogics)、人血清白蛋白ScFv融合体(Merrimack,WO2010059315)以及COMBODY分子(Epigen Biotech,Zhu等人Immunol Cell Biol.2010年8月；88(6):667-75)、(Ablynx,Hmila等人,FASEB J.2010)、双重靶向仅重链结构域抗体。在一些实施方案中，本发明的多特异性抗体为VHH-Fc格式，即抗体包含两个或更多个通过人Fc区二聚体彼此连接的单结构域抗原结合区。在此格式中，每个单结构域抗原结合区与Fc区多肽融合，并且两个融合多肽通过铰链区中的二硫桥形成二聚体双特异性抗体。此类构建体通常不包含完整或任何CH1或轻链序列。WO06064136的图12B提供了该实施方案的实例的说明。

在抗体与抗原结合的上下文中，术语“结合”或“特异性结合”是指抗体与预先确定的抗原或靶标(例如人CD123或Vδ2)的结合，与其的结合通常具有与约10^-6M或更低，例如10^-7M或更低，诸如约10^-8M或更低，诸如约10^-9M或更低、约10^-10M或更低或约10^-11M或甚至更低的K_D相对应的亲和力，例如当使用如本文实施例中所述的流式细胞术确定时。可替代地，可以使用抗原作为配体并且使用结合部分或结合分子作为分析物，在BIAcore T200中使用例如表面等离子共振(SPR)技术或在Octet RED96仪器中使用生物层干涉测量法(BLI)来确定K_D值。特异性结合意指抗体与预先确定的抗原的结合亲和力对应于比其与除预先确定的抗原或密切相关的抗原之外的非特异性抗原(例如，BSA、酪蛋白)的结合亲和力低至少十倍，诸如低至少100倍，例如低至少1,000倍，诸如低至少10,000倍，例如低至少100,000倍的K_D。亲和力降低的程度取决于结合部分或结合分子的K_D，因此当结合部分或结合分子的K_D非常低(即，结合部分或结合分子具有高度特异性)时，则对抗原的亲和力比对非特异性抗原的亲和力低的程度可以为至少10,000倍。如本文所用，术语“K_D”(M)是指抗原与结合部分或结合分子之间的特定相互作用的解离平衡常数。

在本发明的上下文中，“竞争(competition)”或“能够竞争”或“竞争(competes)”是指特定结合分子(例如CD123抗体)在与结合配偶体结合的另一分子(例如不同的CD123抗体)的存在下结合特定结合配偶体(例如CD123)的倾向的任何可检测的显著降低。通常，竞争是指由另一分子(诸如抗体)的存在导致的结合减少至少约25％，诸如至少约50％，例如至少约75％，诸如减少至少90％，如使用足够量的两种或更多种竞争分子(例如抗体)通过例如ELISA分析或流式细胞术所确定的。用于通过竞争性抑制确定结合特异性的另外的方法可在例如Harlow等人,Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1988)、Colligan等人编辑,CurrentProtocols in Immunology,Greene Publishing Assoc,and Wiley InterScience N.Y.,(1992,1993)以及Muller,Meth.Enzymol.92,589-601(1983))中找到。在一个实施方案中，本发明的抗体与抗体1D2或1A3结合CD123上的相同表位和/或与抗体5C8、6H4、6C1、5D3(WO2015156673)或5C8var1(WO2020060405)结合Vδ2上的相同表位。已确定5C8的表位包括残基S33、S43和K45(SEQ ID NO:48)。已确定6H4的表位包括残基R139、K152、S189和S191(SEQ ID NO:48)。存在若干本领域已知的可用于对靶抗原上的抗体表位作图的方法，包括但不限于：交联偶联质谱法，其允许鉴定作为表位一部分的肽，以及X射线晶体分析法，其鉴定抗原上形成表位的各个残基。表位残基可以确定为来自抗体的至少一个原子小于或等于的所有氨基酸残基。选择/>作为表位截止距离，以考虑到范德华半径内的原子加上可能的水介导的氢键。接下来，可以将表位残基确定为至少一个原子小于或等于/>的所有氨基酸残基。选择小于或等于/>作为表位截止距离，以考虑到延长的精氨酸氨基酸的长度。交联偶联质谱法首先利用质量标记的化学交联剂使抗体和抗原结合。接下来使用高质量MALDI检测确认复合物的存在。由于交联化学后，Ab/Ag复合物极其稳定，因此可以对复合物施加许多不同的酶和消化条件，以提供许多不同的重叠肽。使用高分辨率质谱和MS/MS技术对这些肽进行鉴定。使用与交联试剂连接的质量标签来确定交联肽的鉴定。在MS/MS片段化和数据分析后，交联并且衍生自抗原的肽是表位的一部分，而衍生自抗体的肽是互补位的一部分。所发现的各个交联肽的最N端和C端交联残基之间的所有残基都被认为是表位或互补位的一部分。

当在本文中使用时，术语“第一”和“第二”抗原结合区不是指它们在抗体中的方向/位置，即它们关于N端或C端没有意义。术语“第一”和“第二”仅用于正确且一致地指权利要求和说明书中的两个不同的抗原结合区。

“能够结合人CD123”是指抗体可以作为单独的分子和/或作为CD123/CD131复合物的一部分结合人CD123。然而，抗体将不作为单独的分子与CD131结合。

“能够结合Vγ9Vδ2-TCR的Vδ2链”是指抗体可以作为单独的分子和/或作为Vγ9Vδ2-TCR的一部分结合Vδ2链。然而，抗体将不作为单独的分子与Vγ9链结合。

当在本文中使用时，“％序列同一性”是指不同序列共享的相同核苷酸或氨基酸位置的数量(即，同一性％＝相同位置的数量/位置总数x 100)，考虑到需要引入以实现最佳比对的空位的数量和每个空位的长度。两个核苷酸或氨基酸序列之间的同一性百分比可以例如使用已结合到ALIGN程序(2.0版)中的E.Meyers和W.Miller,Comput.Appl.Biosci 4,11-17(1988)的算法，使用PAM120权重残基表、空位长度罚分12和空位罚分4来确定。

本发明的另外方面和实施方案

如上所述，在第一主要方面，本发明涉及一种多特异性抗体，其包含能够结合人CD123的第一抗原结合区和能够结合人Vγ9Vδ2T细胞受体的Vδ2链的第二抗原结合区。

在一个实施方案中，多特异性抗体是双特异性抗体。在另一个实施方案中，多特异性抗体是三特异性抗体。在另一个实施方案中，第一抗原结合区是单结构域抗体，例如由重链可变区组成的单结构域抗体。在另一个实施方案中，第二抗原结合区是单结构域抗体，例如由重链可变区组成的单结构域抗体。在另一个实施方案中，第一抗原-抗原结合区和第二抗原结合区均为单结构域抗体，例如各自由重链可变区组成的单结构域抗体。

在另一个实施方案中，多特异性抗体是双特异性抗体，其中第一抗原结合区是单结构域抗体并且第二抗原结合区是单结构域抗体。所述双特异性抗体可任选地包含另外的序列，诸如接头和/或免疫球蛋白Fc区。

在一个实施方案中，多特异性抗体与具有SEQ ID NO:1所示序列的抗体竞争(即能够竞争)结合人CD123，优选地其中多特异性抗体与具有SEQ ID NO:1所示序列的抗体结合人CD123上的相同表位。在一个实施方案中，多特异性抗体结合包含S203至R273区域中的一个或多个残基的表位，诸如完全包含在S203至R273区域内的表位，如本文实施例11中所述的那样确定。

在另一个实施方案中，多特异性抗体结合人CD123上的表位，其包含S203至T214区域中的一个或多个残基和H221至K227区域中的一个或多个残基以及Y238至K244区域中的一个或多个残基和Y268至R273区域中的一个或多个残基(图14)。

在另一个实施方案中，多特异性抗体结合人CD123上的表位，其包含残基S203、T209、T214、H221、H225、K227、Y238、K244、Y268、T269和R273中的一个、多个或全部(图14)。

在一个实施方案中，第一抗原结合区包含SEQ ID NO:2所示的VH CDR1序列、SEQID NO:3所示的VH CDR2序列以及SEQ ID NO:4所示的VH CDR3序列。

在一个实施方案中，在SEQ ID NO:2中，X₁是G。在另一个实施方案中，X₁是S。

在一个实施方案中，在SEQ ID NO:3中，X₂是A。在另一个实施方案中，X₂是T。

在一个实施方案中，在SEQ ID NO:4中，X₃是Y。在另一个实施方案中，X₃是F。

在一个实施方案中，X₁是G，X₂是A并且X₃是Y。

在另一个实施方案中，X₁是G，X₂是A并且X₃是F。

在另一个实施方案中，X₁是G，X₂是T并且X₃是Y。

在另一个实施方案中，X₁是G，X₂是T并且X₃是F。

在一个实施方案中，X₁是S，X₂是A并且X₃是Y。

在另一个实施方案中，X₁是S，X₂是A并且X₃是F。

在另一个实施方案中，X₁是S，X₂是T并且X₃是Y。

在另一个实施方案中，X₁是S，X₂是T并且X₃是F。

在一个实施方案中，第一抗原结合区包含或由以下组成：SEQ ID NO:1所示的序列，或与SEQ ID NO:1所示的序列具有至少90％，诸如至少92％，例如至少94％，诸如至少96％，例如至少98％序列同一性的序列。

在另一个实施方案中，第一抗原结合区包含或由以下组成：选自SEQ ID NO:25至34所示的序列组的序列，或与选自SEQ ID NO:25至34所示的序列组的序列具有至少90％，诸如至少92％，例如至少94％，诸如至少96％，例如至少98％序列同一性的序列。

在另一个实施方案中，多特异性抗体与具有SEQ ID NO:9所示序列的抗体竞争结合人CD123，优选地其中多特异性抗体与具有SEQ ID NO:9所示序列的抗体结合人CD123上的相同表位。

在一个实施方案中，多特异性抗体结合包含H225至T267区域中的一个或多个残基的表位，诸如完全包含在H225至T267区域内的表位，如本文实施例11中所述的那样确定。

在另一个实施方案中，多特异性抗体结合人CD123上的表位，其包含H225和R234区域中的一个或多个残基和T251至T267区域中的一个或多个残基。

在另一个实施方案中，多特异性抗体结合人CD123上的表位，其包含残基H225、H231、R234、T251、R255和T267中的一个、多个或全部。

在一个实施方案中，第一抗原结合区包含SEQ ID NO:10所示的VH CDR1序列、SEQID NO:11所示的VH CDR2序列以及SEQ ID NO:12所示的VH CDR3序列。

在一个实施方案中，第一抗原结合区包含或由以下组成：SEQ IDNO:9所示的序列，或与SEQ ID NO:9所示的序列具有至少90％，诸如至少92％，例如至少94％，诸如至少96％，例如至少98％序列同一性的序列。

如上所述，本发明的多特异性抗体包含能够结合人Vγ9Vδ2-T细胞受体的Vδ2链的第二抗原结合区。Vδ2是Vγ9Vδ2-TCR的δ链的一部分。能够结合人Vδ2的抗体可结合完全位于Vδ2区域内的表位或结合作为Vδ2区域中的残基和δ链的恒定区中的残基的组合的表位。在一个实施方案中，多特异性抗体能够活化人Vγ9Vδ2T细胞。Vγ9Vδ2T细胞的活化可通过基因表达和/或(表面)标志物表达(例如，活化标志物，诸如CD25、CD69或CD107a)和/或分泌蛋白(例如，细胞因子或趋化因子)谱来测量。在一个优选实施方案中，多特异性抗体能够诱导活化(例如，CD69和/或CD25表达的上调)，导致脱粒，其标志是Vγ9Vδ2T细胞的CD107a表达(参见本文的实施例)和/或细胞因子产生(例如TNFα、IFNγ)的增加。优选地，当如本文实施例中所描述的那样进行测试时，本发明的多特异性抗体能够将CD107a阳性细胞的数量增加至少2倍，诸如至少5倍。在另一个优选实施方案中，当使用Vγ9Vδ2T细胞和C1r-neo靶细胞进行测试时，如本文实施例中所述，本发明的多特异性抗体具有50pM或更少，诸如25pM或更少，例如20pM或更少，诸如15pM或更少，例如10pM或更少的增加CD107a阳性细胞百分比的EC50值。

结合Vδ2的几种抗体已在WO2015156673中有所描述，并且其抗原结合区或至少其CDR序列可以结合在本发明的多特异性抗体中。

在一个实施方案中，多特异性抗体与具有SEQ ID NO:17所示序列的抗体竞争结合人Vδ2，其中X₄是Y。

在另一个实施方案中，多特异性抗体与具有SEQ ID NO:17所示序列的抗体结合人Vδ2上的相同表位。

在一个实施方案中，多特异性抗体与具有SEQ ID NO:36所示序列的抗体竞争结合人Vδ2，优选地多特异性抗体与具有SEQ ID NO:36所示序列的抗体结合人Vδ2上的相同表位。

在一个实施方案中，多特异性抗体与具有SEQ ID NO:37所示序列的抗体竞争结合人Vδ2，优选地多特异性抗体与具有SEQ ID NO:37所示序列的抗体结合人Vδ2上的相同表位。

在一个实施方案中，多特异性抗体与具有SEQ ID NO:38所示序列的抗体竞争结合人Vδ2，优选地多特异性抗体与具有SEQ ID NO:38所示序列的抗体结合人Vδ2上的相同表位。

在本发明的多特异性抗体的一个实施方案中，第二抗原结合区包含SEQ ID NO:18所示的VH CDR1序列、SEQ ID NO:19所示的VH CDR2序列以及SEQ ID NO:20所示的VH CDR3序列。在一个实施方案中，在SEQ ID NO:20中，X₄是Y。在另一个实施方案中，在SEQ ID NO:20中，X₄是F。在另一个实施方案中，在SEQ ID NO:20中，X₄是S。

在本发明的多特异性抗体的一个实施方案中，第二抗原结合区包含SEQ ID NO:40所示的VH CDR1序列和SEQ ID NO:41所示的VH CDR3序列，优选地第二抗原结合区包含或由以下组成：SEQ ID NO:36所示的序列，或与SEQ ID NO:36所示的序列具有至少90％，诸如至少92％，例如至少94％，诸如至少96％，例如至少98％序列同一性的序列。

在本发明的多特异性抗体的一个实施方案中，第二抗原结合区包含SEQ ID NO:42所示的VH CDR1序列、SEQ ID NO:43所示的VH CDR2序列和SEQ ID NO:44所示的VH CDR3序列，优选地第二抗原结合区包含或由以下组成：SEQ ID NO:37所示的序列，或与SEQ ID NO:37所示的序列具有至少90％，诸如至少92％，例如至少94％，诸如至少96％，例如至少98％序列同一性的序列。

在本发明的多特异性抗体的一个实施方案中，第二抗原结合区包含SEQ ID NO:45所示的VH CDR1序列、SEQ ID NO:46所示的VH CDR2序列和SEQ ID NO:47所示的VH CDR3序列，优选地第二抗原结合区包含或由以下组成：SEQ ID NO:38所示的序列，或与SEQ ID NO:38所示的序列具有至少90％，诸如至少92％，例如至少94％，诸如至少96％，例如至少98％序列同一性的序列。

在本发明的多特异性抗体的一个实施方案中，第二抗原结合区是人源化的。

在另一个实施方案中，第二抗原结合区包含或由以下组成：SEQ ID NO:17所示的序列，或与SEQ ID NO:17所示的序列具有至少90％，诸如至少92％，例如至少94％，诸如至少96％，例如至少98％序列同一性的序列。在一个实施方案中，在SEQ ID NO:17中，X₄是Y。在另一个实施方案中，在SEQ ID NO:17中，X₄是F。在另一个实施方案中，在SEQ ID NO:17中，X₄是S。

在本发明的多特异性抗体的一个优选实施方案中，

(i)第一抗原结合区包含SEQ ID NO:2所示的VH CDR1序列、SEQ ID NO:3所示的VHCDR2序列和SEQ ID NO:4所示的VH CDR3序列，并且第二抗原结合区包含SEQ ID NO:18所示的VH CDR1序列、SEQ ID NO:19所示的VH CDR2序列和SEQ ID NO:20所示的VH CDR3序列，或

(ii)第一抗原结合区包含SEQ ID NO:10所示的VH CDR1序列、SEQ ID NO:11所示的VH CDR2序列和SEQ ID NO:12所示的VH CDR3序列，并且第二抗原结合区包含SEQ ID NO:18所示的VH CDR1序列、SEQ ID NO:19所示的VH CDR2序列和SEQ ID NO:20所示的VH CDR3序列。

在本发明的多特异性抗体的另一个优选实施方案中，

(i)第一抗原结合区包含SEQ ID NO:1所示的序列或由其组成，并且第二抗原结合区包含SEQ ID NO:17所示的序列或由其组成，其中任选地X₄是Y，或

(ii)第一抗原结合区包含SEQ ID NO:9所示的序列或由其组成，并且第二抗原结合区包含SEQ ID NO:17所示的序列或由其组成，其中任选地X₄是Y，或

(iii)第一抗原结合区包含SEQ ID NO:25所示的序列或由其组成，并且第二抗原结合区包含SEQ ID NO:17所示的序列或由其组成，其中任选地X₄是Y，或

(iv)第一抗原结合区包含SEQ ID NO:26所示的序列或由其组成，并且第二抗原结合区包含SEQ ID NO:17所示的序列或由其组成，其中任选地X₄是Y，或

(v)第一抗原结合区包含SEQ ID NO:27所示的序列或由其组成，并且第二抗原结合区包含SEQ ID NO:17所示的序列或由其组成，其中任选地X₄是Y，或

(vi)第一抗原结合区包含SEQ ID NO:28所示的序列或由其组成，并且第二抗原结合区包含SEQ ID NO:17所示的序列或由其组成，其中任选地X₄是Y，或

(vii)第一抗原结合区包含SEQ ID NO:29所示的序列或由其组成，并且第二抗原结合区包含SEQ ID NO:17所示的序列或由其组成，其中任选地X₄是Y，或

(viii)第一抗原结合区包含SEQ ID NO:30所示的序列或由其组成，并且第二抗原结合区包含SEQ ID NO:17所示的序列或由其组成，其中任选地X₄是Y，或

(ix)第一抗原结合区包含SEQ ID NO:31所示的序列或由其组成，并且第二抗原结合区包含SEQ ID NO:17所示的序列或由其组成，其中任选地X₄是Y，或

(x)第一抗原结合区包含SEQ ID NO:32所示的序列或由其组成，并且第二抗原结合区包含SEQ ID NO:17所示的序列或由其组成，其中任选地X₄是Y，或

(xi)第一抗原结合区包含SEQ ID NO:33所示的序列或由其组成，并且第二抗原结合区包含SEQ ID NO:17所示的序列或由其组成，其中任选地X₄是Y，或

(xii)第一抗原结合区包含SEQ ID NO:34所示的序列或由其组成，并且第二抗原结合区包含SEQ ID NO:17所示的序列或由其组成，其中任选地X₄是Y。

在本发明的多特异性抗体的另一个优选实施方案中，

(i)第一抗原结合区包含SEQ ID NO:1所示的序列或由其组成，并且第二抗原结合区包含SEQ ID NO:36所示的序列或由其组成，或

(ii)第一抗原结合区包含SEQ ID NO:9所示的序列或由其组成，并且第二抗原结合区包含SEQ ID NO:36所示的序列或由其组成，或

(iii)第一抗原结合区包含SEQ ID NO:25所示的序列或由其组成，并且第二抗原结合区包含SEQ ID NO:36所示的序列或由其组成，或

(iv)第一抗原结合区包含SEQ ID NO:26所示的序列或由其组成，并且第二抗原结合区包含SEQ ID NO:36所示的序列或由其组成，或

(v)第一抗原结合区包含SEQ ID NO:27所示的序列或由其组成，并且第二抗原结合区包含SEQ ID NO:36所示的序列或由其组成，或

(vi)第一抗原结合区包含SEQ ID NO:28所示的序列或由其组成，并且第二抗原结合区包含SEQ ID NO:36所示的序列或由其组成，或

(vii)第一抗原结合区包含SEQ ID NO:29所示的序列或由其组成，并且第二抗原结合区包含SEQ ID NO:36所示的序列或由其组成，或

(viii)第一抗原结合区包含SEQ ID NO:30所示的序列或由其组成，并且第二抗原结合区包含SEQ ID NO:36所示的序列或由其组成，或

(ix)第一抗原结合区包含SEQ ID NO:31所示的序列或由其组成，并且第二抗原结合区包含SEQ ID NO:36所示的序列或由其组成，或

(x)第一抗原结合区包含SEQ ID NO:32所示的序列或由其组成，并且第二抗原结合区包含SEQ ID NO:36所示的序列或由其组成，或(xi)第一抗原结合区包含SEQ ID NO:33所示的序列或由其组成，并且第二抗原结合区包含SEQ ID NO:36所示的序列或由其组成，或

(xii)第一抗原结合区包含SEQ ID NO:34所示的序列或由其组成，并且第二抗原结合区包含SEQ ID NO:36所示的序列或由其组成。

在本发明的多特异性抗体的另一个优选实施方案中，

(i)第一抗原结合区包含SEQ ID NO:1所示的序列或由其组成，并且第二抗原结合区包含SEQ ID NO:37所示的序列或由其组成，或

(ii)第一抗原结合区包含SEQ ID NO:9所示的序列或由其组成，并且第二抗原结合区包含SEQ ID NO:37所示的序列或由其组成，或

(iii)第一抗原结合区包含SEQ ID NO:25所示的序列或由其组成，并且第二抗原结合区包含SEQ ID NO:37所示的序列或由其组成，或

(iv)第一抗原结合区包含SEQ ID NO:26所示的序列或由其组成，并且第二抗原结合区包含SEQ ID NO:37所示的序列或由其组成，或

(v)第一抗原结合区包含SEQ ID NO:27所示的序列或由其组成，并且第二抗原结合区包含SEQ ID NO:37所示的序列或由其组成，或

(vi)第一抗原结合区包含SEQ ID NO:28所示的序列或由其组成，并且第二抗原结合区包含SEQ ID NO:37所示的序列或由其组成，或

(vii)第一抗原结合区包含SEQ ID NO:29所示的序列或由其组成，并且第二抗原结合区包含SEQ ID NO:37所示的序列或由其组成，或

(viii)第一抗原结合区包含SEQ ID NO:30所示的序列或由其组成，并且第二抗原结合区包含SEQ ID NO:37所示的序列或由其组成，或

(ix)第一抗原结合区包含SEQ ID NO:31所示的序列或由其组成，并且第二抗原结合区包含SEQ ID NO:37所示的序列或由其组成，或

(x)第一抗原结合区包含SEQ ID NO:32所示的序列或由其组成，并且第二抗原结合区包含SEQ ID NO:37所示的序列或由其组成，或

(xi)第一抗原结合区包含SEQ ID NO:33所示的序列或由其组成，并且第二抗原结合区包含SEQ ID NO:37所示的序列或由其组成，或

(xii)第一抗原结合区包含SEQ ID NO:34所示的序列或由其组成，并且第二抗原结合区包含SEQ ID NO:37所示的序列或由其组成。

在本发明的多特异性抗体的另一个优选实施方案中，

(i)第一抗原结合区包含SEQ ID NO:1所示的序列或由其组成，并且第二抗原结合区包含SEQ ID NO:38所示的序列或由其组成，或

(ii)第一抗原结合区包含SEQ ID NO:9所示的序列或由其组成，并且第二抗原结合区包含SEQ ID NO:38所示的序列或由其组成，或

(iii)第一抗原结合区包含SEQ ID NO:25所示的序列或由其组成，并且第二抗原结合区包含SEQ ID NO:38所示的序列或由其组成，或

(iv)第一抗原结合区包含SEQ ID NO:26所示的序列或由其组成，并且第二抗原结合区包含SEQ ID NO:38所示的序列或由其组成，或

(v)第一抗原结合区包含SEQ ID NO:27所示的序列或由其组成，并且第二抗原结合区包含SEQ ID NO:38所示的序列或由其组成，或

(vi)第一抗原结合区包含SEQ ID NO:28所示的序列或由其组成，并且第二抗原结合区包含SEQ ID NO:38所示的序列或由其组成，或

(vii)第一抗原结合区包含SEQ ID NO:29所示的序列或由其组成，并且第二抗原结合区包含SEQ ID NO:38所示的序列或由其组成，或

(viii)第一抗原结合区包含SEQ ID NO:30所示的序列或由其组成，并且第二抗原结合区包含SEQ ID NO:38所示的序列或由其组成，或

(ix)第一抗原结合区包含SEQ ID NO:31所示的序列或由其组成，并且第二抗原结合区包含SEQ ID NO:38所示的序列或由其组成，或

(x)第一抗原结合区包含SEQ ID NO:32所示的序列或由其组成，并且第二抗原结合区包含SEQ ID NO:38所示的序列或由其组成，或

(xi)第一抗原结合区包含SEQ ID NO:33所示的序列或由其组成，并且第二抗原结合区包含SEQ ID NO:38所示的序列或由其组成，或

(xii)第一抗原结合区包含SEQ ID NO:34所示的序列或由其组成，并且第二抗原结合区包含SEQ ID NO:38所示的序列或由其组成。

多特异性抗体中的第一和第二抗原结合区可以各种方式排列。在一个实施方案中，抗原结合区通过接头诸如共价接头彼此连接。在一个实施方案中，第一抗原结合区和第二抗原结合区通过肽接头彼此共价连接，例如长度为1至20个氨基酸、例如1至10个氨基酸，诸如2、3、4、5、6、7、8或10个氨基酸的接头。在一个实施方案中，肽接头包含4个甘氨酸后跟丝氨酸的序列或由其组成。

在一些实施方案中，能够结合人CD123的第一抗原结合区位于能够结合人Vδ2链的第二抗原结合区的N端。在另一个实施方案中，能够结合人CD123的第一抗原结合区位于能够结合人Vδ2链的第二抗原结合区的C端。

本发明的多特异性抗体，诸如双特异性抗体，可包含除第一和第二抗原结合区之外的另外的分子、结构域或多肽序列。在一个实施方案中，多特异性抗体还包含半衰期延长结构域，即延长分子在人患者的循环中的半衰期的结构域。在一个实施方案中，当施用于人受试者时，多特异性抗体具有长于约168小时的终末半衰期。最优选地，终末半衰期为336小时或更长。当在本文中使用时，抗体的“终末半衰期”是指在最终消除阶段中多肽的血清浓度在体内降低50％所花费的时间。

在一个实施方案中，多特异性抗体包含Fc区，优选人Fc区。在一个实施方案中，多特异性抗体为VHH-Fc格式，即抗体包含两个或更多个通过人Fc区二聚体彼此连接的单结构域抗原结合区，其中每个单结构域抗原结合区与Fc区多肽(无CH1或轻链序列)融合，并且两个融合多肽通过铰链区中的二硫桥形成二聚体双特异性抗体。

本领域已经描述了用于制备双特异性抗体的各种方法，例如由Brinkmann和Kontermann(2017)MAbs 9:182和Labrijn等人(2019)Nature Reviews Drug Discovery18:585所综述的。在本发明的一个实施方案中，Fc区是包含两个Fc多肽的异二聚体，其中第一抗原结合区与第一Fc多肽融合并且第二抗原结合区与第二Fc多肽融合，并且其中第一和第二Fc多肽包含不对称氨基酸突变，相对于同二聚体的形成，其有利于异二聚体的形成(参见例如Ridgway等人(1996)'Knobs-into-holes'engineering of antibody CH3 domainsfor heavy chain heterodimerization.Protein Eng 9:617)。在本文件中的另一个实施方案中，Fc多肽的CH3区包含所述不对称氨基酸突变，优选地第一Fc多肽包含T366W取代并且第二Fc多肽包含T366S、L368A和Y407V取代，或反之亦然，其中根据EU编号***，氨基酸位置对应于人IgG1。在另一个实施方案中，第一和第二Fc多肽中的位置220处的半胱氨酸残基已缺失或被取代，其中根据EU编号***，氨基酸位置对应于人IgG1。在另一个实施方案中，所述区域包含SEQ ID NO:35所示的序列。

在一些实施方案中，第一和/或第二Fc多肽包含使Fc区变得有惰性(即不能介导效应功能)的突变。在一个实施方案中，第一和第二Fc多肽包含位置234和/或235处的突变，优选地第一和第二Fc多肽包含L234F和L235E取代，其中根据EU编号***，氨基酸位置对应于人IgG1。

在一个优选实施方案中，

-第一抗原结合区包含SEQ ID NO:2所示的VH CDR1序列、SEQ ID NO:3所示的VHCDR2序列和SEQ ID NO:4所示的VH CDR3序列，并且第二抗原结合区包含SEQ ID NO:18所示的VH CDR1序列、SEQ ID NO:19所示的VH CDR2序列和SEQ ID NO:20所示的VH CDR3序列，并且

-第一Fc多肽包含SEQ ID NO:21所示的序列并且第二Fc多肽包含SEQ ID NO:22所示的序列，或反之亦然。

在另一个优选实施方案中，

-第一抗原结合区包含SEQ ID NO:10所示的VH CDR1序列、SEQ ID NO:11所示的VHCDR2序列和SEQ ID NO:12所示的VH CDR3序列，并且第二抗原结合区包含SEQ ID NO:18所示的VH CDR1序列、SEQ ID NO:19所示的VH CDR2序列和SEQ ID NO:20所示的VH CDR3序列，并且

-第一Fc多肽包含SEQ ID NO:21所示的序列并且第二Fc多肽包含SEQ ID NO:22所示的序列，或反之亦然。

在另一个优选实施方案中，本发明的抗体由以下组成：

(i)第一多肽链，其由以下组成：第一抗原结合区，其由选自由以下组成的组的序列组成：SEQ ID NO:1、9和25至34所示的序列、SEQ ID NO:35所示的序列以及SEQ ID NO:21所示的序列，以及

(i)第二多肽链，其由以下组成：第二抗原结合区，其由以下组成：SEQ ID NO:17所示的序列、SEQ ID NO:35所示的序列以及SEQ ID NO:22所示的序列，其中X₄是Y。

在另一个优选实施方案中，本发明的抗体由以下组成：

(i)第一多肽链，其由以下组成：第一抗原结合区，其由选自由以下组成的组的序列组成：SEQ ID NO:1、9和25至34所示的序列、SEQ ID NO:35所示的序列以及SEQ ID NO:22所示的序列，以及

(i)第二多肽链，其由以下组成：第二抗原结合区，其由以下组成：SEQ ID NO:17所示的序列、SEQ ID NO:35所示的序列以及SEQ ID NO:21所示的序列，其中X₄是Y。

在一个实施方案中，本发明的多特异性抗体能够介导Vγ9Vδ2T细胞对表达CD123的细胞，诸如C1R-neo细胞或THP-1细胞的杀伤。

优选地，所述抗体能够通过Vγ9Vδ2T细胞的活化诱导杀伤C1R-neo细胞，其中当如本文实施例5中所述进行测试时，EC50值为50pM或更低，诸如25pM或更低，例如20pM或更低，诸如15pM或更低，例如10pM或更低，或甚至5pM或更低，诸如2pM或更低。

在另一个实施方案中，所述抗体能够通过Vγ9Vδ2T细胞的活化诱导杀伤THP-1细胞，其中当如本文实施例5中所述进行测试时，EC50值为100pM或更低，诸如50pM或更低，诸如25pM或更低，例如20pM或更低，诸如15pM或更低，例如10pM或更低，或甚至5pM或更低，诸如2pM或更低。

在另一个实施方案中，多特异性抗体能够介导人患者来源的表达CD123的骨髓源性AML肿瘤细胞的杀伤。这种杀伤可例如如本文实施例6中所述进行确定。在一个实施方案中，本发明的多特异性抗体能够在100fM的浓度下介导超过25％，诸如超过50％的特异性细胞死亡，如在本文实施例6中描述的测定中所确定的。

在另一个实施方案中，多特异性抗体不能介导CD123阴性细胞，诸如CD123阴性人细胞的杀伤。

在另一个实施方案中，本发明的多特异性抗体能够结合瞬时表达CD123的293F细胞，其中当如本文实施例3中所述进行测试时，EC50为50nM或更低，诸如20nM或更低，例如10nM或更低，诸如5nM或更低。

在另一个实施方案中，本发明的多特异性抗体能够结合重组CD123-Fc融合蛋白，其中当如本文实施例4中所述进行测试时，EC50为50nM或更低，诸如20nM或更低，例如10nM或更低，诸如5nM或更低。

在另一个主要方面，本发明涉及一种抗体，其包含能够结合人CD123的第一抗原结合区，其中第一抗原结合区是单结构域抗体，其包含：

(i)SEQ ID NO:2所示的VH CDR1序列、SEQ ID NO:3所示的VH CDR2序列和SEQ IDNO:4所示的VH CDR3序列，其中优选地第一抗原结合区包含或由以下组成：选自SEQ ID NO:1、25至34所示的序列组的序列，或与选自SEQ ID NO:1、25至34所示的序列组的序列具有至少90％，诸如至少92％，例如至少94％，诸如至少96％，例如至少98％序列同一性的序列，或

(ii)SEQ ID NO:10所示的VH CDR1序列、SEQ ID NO:11所示的VH CDR2序列和SEQID NO:12所示的VH CDR3序列，其中优选地第一抗原结合区包含或由以下组成：SEQ ID NO:9所示的序列，或与SEQ ID NO:9所示的序列具有至少90％，诸如至少92％，例如至少94％，诸如至少96％，例如至少98％序列同一性的序列。

在一个实施方案中，在SEQ ID NO:2中，X₁是G。在另一个实施方案中，X₁是S。

在一个实施方案中，在SEQ ID NO:3中，X₂是A。在另一个实施方案中，X₂是T。

在一个实施方案中，在SEQ ID NO:4中，X₃是Y。在另一个实施方案中，X₃是F。

在一个实施方案中，X₁是G，X₂是A并且X₃是Y。

在另一个实施方案中，X₁是G，X₂是A并且X₃是F。

在另一个实施方案中，X₁是G，X₂是T并且X₃是Y。

在另一个实施方案中，X₁是G，X₂是T并且X₃是F。

在一个实施方案中，X₁是S，X₂是A并且X₃是Y。

在另一个实施方案中，X₁是S，X₂是A并且X₃是F。

在另一个实施方案中，X₁是S，X₂是T并且X₃是Y。

在另一个实施方案中，X₁是S，X₂是T并且X₃是F。

在另一个主要方面，本发明涉及一种药物组合物，其包含如本文所述的根据本发明的抗体(诸如多特异性抗体)和药学上可接受的赋形剂。

可根据常规技术，诸如(Rowe等人,Handbook of Pharmaceutical Excipients,2012年6月,ISBN 9780857110275)中公开的那些，用药学上可接受的赋形剂配制抗体。药学上可接受的赋形剂以及任何其他载剂、稀释剂或佐剂应适合于抗体和所选择的施用方式。药物组合物的赋形剂和其他组分的适宜性是基于对本发明的所选抗体或药物组合物的期望生物特性没有显著的负面影响(例如，在抗原结合时小于实质性影响(10％或更少的相对抑制、5％或更少的相对抑制等)来确定的)。

药物组合物可包含稀释剂、填充剂、盐、缓冲剂、去污剂(例如，非离子去污剂，诸如Tween-20或Tween-80)、稳定剂(例如，糖或不含蛋白质的氨基酸)、防腐剂、组织固定剂、增溶剂和/或适合包含在药物组合物中的其他材料。另外的药学上可接受的赋形剂包括与本发明的抗体生理上相容的任何和所有合适的溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂、抗氧化剂和吸收延迟剂等。

在另一个主要方面，本发明涉及用作药物的如本文所述的根据本发明的多特异性抗体。

根据本发明的多特异性抗体能够产生有利于Vγ9Vδ2T细胞杀伤肿瘤细胞，特别是CD123阳性肿瘤细胞的微环境。

因此，在另一个主要方面，本发明涉及用于治疗癌症的如本文所述的根据本发明的多特异性抗体。在另一个主要方面，本发明涉及用于治疗急性髓系白血病、B细胞急性淋巴母细胞性白血病、毛细胞白血病、霍奇金淋巴瘤、母细胞性浆细胞样树突状细胞肿瘤、慢性粒细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、B细胞慢性淋巴细胞增殖性病症或骨髓增生异常综合征的如本文所述的根据本发明的多特异性抗体。

类似地，本发明涉及一种治疗疾病的方法，其包括将如本文所述的根据本发明的多特异性抗体施用于有需要的人受试者。在一个实施方案中，疾病是癌症，诸如急性髓系白血病。

在一些实施方案中，抗体作为单一疗法施用。然而，本发明的抗体还可在组合疗法中施用，即与和待治疗的疾病或病状相关的其他治疗剂组合。

“治疗(Treatment)”或“治疗(treating)”是指施用有效量的根据本发明的抗体，其目的是缓解、改善、阻止、根除(治愈)或预防症状或疾病状态。“有效量”是指在必要的剂量和时间段内有效实现期望治疗结果的量。多肽诸如抗体的有效量可根据诸如个体的疾病阶段、年龄、性别和体重以及抗体在个体中引起期望反应的能力等因素而变化。有效量还是其中抗体的任何毒性或有害效果都超过治疗有益效果的量。本发明抗体的有效量的示例性非限制性范围为约0.1μg/kg至100mg/kg，诸如约1μg/kg至50mg/kg，例如约0.01至20mg/kg，诸如约0.1至10mg/kg，例如约0.5、约0.3、约1、约3、约5或约8mg/kg。施用可通过任何合适的途径进行，但通常将是肠胃外的，诸如静脉内、肌内或皮下。

本发明的多特异性抗体通常重组产生，即通过在合适的宿主细胞中表达编码抗体的核酸构建体，然后从细胞培养物中纯化所产生的重组抗体。核酸构建体可以通过本领域众所周知的标准分子生物学技术产生。通常使用表达载体将构建体引入宿主细胞中。合适的核酸构建体和表达载体是本领域已知的。适合抗体重组表达的宿主细胞是本领域众所周知的，并且包括CHO、HEK-293、Expi293F、PER-C6、NS/0和Sp2/0细胞。

因此，在另一方面，本发明涉及一种编码本发明的抗体，诸如根据本发明的多特异性抗体的核酸构建体。在一个实施方案中，构建体是DNA构建体。在另一个实施方案中，构建体是RNA构建体。

在另一方面，本发明涉及一种表达载体，其包含编码根据本发明的多特异性抗体的核酸构建体。

在另一方面，本发明涉及一种宿主细胞，其包含编码根据本发明的多特异性抗体的一个或多个核酸构建体或包含编码根据本发明的多特异性抗体的核酸构建体的表达载体。

表1：序列表。

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本文引用的所有参考文献、文章、出版物、专利、专利公布和专利申请出于所有目的通过引用整体并入。然而，本文的任何参考文献、文章、出版物、专利、专利公布和专利申请的提及不是并且不应被视为承认或任何形式暗示它们构成有效的现有技术或形成世界上任何国家的公知常识的一部分。

实施例

实施例1：从由用C1R-CD1d细胞免疫的动物制备的噬菌体展示文库中选择和鉴定抗CD123 VHH

用表达CD123的C1R-CD1d细胞对大羊驼(Llama Glama)(2只动物)进行免疫，然后如所描述的那样制备‘免疫’VHH噬菌体抗体文库(Lameris等人,2016Immunology 149:111)。这些文库用于对所捕获的重组人CD123或直接包被的CD123抗原(细胞外结构域，SinoBiological)进行噬菌体选择。进行单轮或连续两轮选择。经过一轮和两轮噬菌体选择后，针对在ELISA中与重组捕获抗原的结合对单噬菌体克隆进行筛选。对结合评分为阳性的那些克隆进行测序，然后在流式细胞术中测试具有不同序列的所有克隆与用于免疫的细胞系的结合。然后选择在FACS中显示出结合的VHH克隆进行进一步表征。鉴定出八个不同的克隆并命名为：1E2、1B4、1A3、2D11、1D2、1E4、1H1和1F1。

实施例2：双特异性VHH的合成基因合成、产生和纯化

然后将CD123特异性VHH结构域抗体的序列重新格式化为具有Vδ2特异性VHH(5C8var1；SEQ ID NO:17，其中X₄是Y)的双特异性VHH，方向为：N端-抗CD123 VHH-接头-抗Vδ2VHH-C标签。所使用的Vδ2特异性VHH在SEQ ID NO:17中示出(其中X₄是Y)。两个VHH结构域之间的接头是具有序列G4S的甘氨酸(G)-丝氨酸(S)链段。编码这些蛋白质的cDNA通过合成基因合成在Genscript制备，然后通过定向克隆而克隆到真核表达载体pCDNA3.1+(Thermofisher Scientific)中。通过瞬时转染在Hek293E细胞中表达蛋白质，然后(表达5天后)根据供应商的方案使用Capture Select C标签亲和基质(Thermo FisherScientific)从条件细胞培养物上清液中纯化。如使用考马斯染色通过SDS-PAGE分析所确定的，纯化的双特异性VHH的纯度始终>95％，并且内毒素水平非常低(<0.5EU/mg)。

实施例3：在ELISA中测定双特异性抗CD123 x Vδ2VHH的结合特异性

将重组的纯化CD123抗原(细胞外结构域；Sino Biological)或CD123抗原的Fc融合体(Bio-Techne/R&D Systems)以2μg/ml的浓度包被到ELISA板(Greiner)的孔中的PBS中。作为阴性对照，用1％(w/v)BSA包被孔。与人Fc融合的人Vγ9和Vδ2TCR链的细胞外结构域的内部设计、产生和纯化的重组形式也作为抗原以2μg/ml进行包被。在包被并用2％(w/v)BSA封闭孔后，测试双特异性VHH蛋白在50nM饱和浓度下的结合，并使用HRP标记的抗VHH抗体(Genscript)和使用3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)/H2O2进行的染色来检测所结合的VHH。

图1显示，在ELISA中，仅1A3-5C8var1和1D2-5C8var1显示出与CD123和γδ-TCR(γ-δT细胞受体)的强烈且特异性的结合。其他双特异性抗体弱结合或不结合CD123。

实施例4：使用流式细胞术测定双特异性抗CD123 x Vδ2VHH的结合特异性

人CD123和受体的共同β链(CD131)的表达构建体购自Invivogen。将质粒转化为化学感受态DH5α细菌，并使用在选择性培养基上生长的单菌落接种50ml培养基来扩增两种构建体。然后使用聚乙烯亚胺(PEI)将纯化的DNA转染至freestyle 293F细胞。单独的质粒或两种质粒的混合物用于转染。作为阴性对照，未转染细胞也用于流式细胞术。转染后一天，使用细胞在FACS中利用染色来测试双特异性VHH的结合。简单来说，用AF647标记的抗VHH(Genscript)抗体检测饱和浓度的100nM双特异性VHH与转染细胞的结合，并使用FACSCelesta(Becton and Dickinson)使染色可视化。

图2显示，当抗原单独表达，或连同CD131一起表达时，1A3-5C8var1和1D2-5C8var1均强烈且特异性地识别CD123。1D2-5C8var1在流式细胞术中给出最强信号。

为了使用流式细胞术确定1D2-5C8var1对CD123的表观亲和力，测试了一定浓度范围的该双特异性VHH与表达CD123、CD131或CD123和CD131两者的瞬时转染的293F细胞的结合。前一种细胞(表达CD131)用作阴性对照。

图3再次显示，1D2-5C8var1对CD123具有极高特异性，因为仅识别(瞬时)表达CD123而不是CD131的细胞。此外，数据显示，使用流式细胞术确定的1D2-5C8var1与CD123的结合的表观亲和力为大约3nM。该值和与单独CD123的结合或与共表达的CD123和CD131的结合相当。

实施例5：使用生物层干涉测量法(BLI)确定1D2-5C8var1与CD123的结合亲和力

为了确定1D2-5C8var1与CD123的结合动力学，将重组的纯化CD123-Fc融合蛋白(Bio-Techne/R&D Systems)以1nm的密度加载到Octet Red96e(Sartorius)仪器的抗人IgGFc捕获传感器上(使用5μg/ml的浓度)。然后将不同的传感器浸入不同浓度的1D2-5C8var1中；稀释液在供应商提供的10x动力学缓冲液(10xKB)中制备。由获得的传感图，通过曲线拟合确定动力学缔合和解离速率常数。

图4示出用于曲线拟合的实际传感图。后者在图中被描绘为直线。这用于确定动力学缔合和解离速率常数，并且从而确定抗CD123VHH 1D2的亲和力。测量进行两次，并且1D2-5C8var1对CD123的亲和力被测量为介于3与5nM之间。

实施例6：CD123依赖性的、1D2-5C8var1介导的Vγ9Vδ2T细胞活化和T细胞介导的靶细胞的细胞毒性

血沉棕黄层(Buffy coat)获自Sanquin(Amsterdam,the Netherlands)。使用所描述的程序通过Ficoll密度梯度离心从这些血沉棕黄层中分离PBMC。使用Vδ2特异性抗体通过MACS获得高纯度的Vγ9Vδ2T细胞，并使用已公布的方法对这些细胞进行扩增(de Bruin等人,2016Clin Immunol.169:128)。CD123阳性B淋巴母细胞、EBV转化的C1R neo细胞系(CRL-2369)和CD123阳性AML衍生的THP-1细胞系(TIB-202)获自美国典型培养物保藏中心(American type culture collection)并根据供应商的说明书进行培养。靶细胞用细胞微量紫(CTV)在37℃下标记20分钟。为了测量T细胞活化，对细胞进行活化标志物CD107a(或LAMP-1，溶酶体相关膜蛋白-1)染色，一旦细胞脱粒，所述标志物就变得暴露于细胞表面。在PE标记的抗CD107A抗体的存在下，将一定浓度范围的双特异性抗体与靶细胞和扩增的Vγ9Vδ2T细胞(各50,000个细胞)的1:1混合物一起孵育4小时，最终体积为100μl。孵育后，将细胞洗涤并用荧光标记的抗CD3和抗Vγ9抗体的混合物染色，以鉴定T细胞和活/死染色剂(7-AAD)。使用FACS Celesta(Beckton and Dickinson)分析样品。为了评估T细胞介导的靶细胞的细胞毒性，使用基本上相同的设置，只是不添加抗CD107A抗体，并将CTV标记的靶细胞和Vγ9Vδ2T细胞在双特异性VHH的存在下孵育24小时。测定结束时再次对细胞进行CD3和Vγ9染色，并在活/死染色剂(7-AAD)的存在下使用流式细胞术进行分析。

图5显示，1D2-5C8var1引起有效的T细胞活化，其中EC50在pM范围内。在不存在靶细胞的情况下，高浓度的1D2-5C8var1仅引起背景活化(数据未示出)。1D2-5C8var1诱导T细胞活化的效力略依赖于所使用的T细胞供体；EC50值的范围介于3与13pM之间。

为了确定观察到的T细胞活化是否还将导致靶细胞裂解，使用1:1的效应物与靶标(E:T)比率和24小时时间点进行细胞毒性测定。图6显示，在存在扩增的Vγ9Vδ2T细胞的情况下，1D2-5C8var1有效诱导C1R-neo靶细胞裂解。通过曲线拟合确定细胞毒性的EC50介于1与2pM之间，取决于所使用的T细胞供体(描绘了两个供体的数据)。

使用CD123阳性AML细胞系：THP-1，重复进行相同的细胞毒性测定。1D2-5C8var1诱导THP-1靶细胞裂解的效力非常相当：EC50测量为1pM。相比之下：1A3-5C8var1诱导靶细胞裂解的效力测量为约50pM：图7。

实施例7：双特异性VHH介导的Vγ9Vδ2T细胞活化和T细胞诱导的原代AML细胞裂解

将25,000个来自AML患者的骨髓源性单核细胞与源自健康供体的扩增的Vγ9Vδ2T细胞以1:1的比率共培养过夜。细胞在PE标记的CD107a抗体的存在下和1D2-5C8var1的浓度范围内(在10fM至100nM的范围内)进行培养。收获细胞，洗涤并在4℃下用含有荧光标记的抗CD45、CD117、CD34、CD33和CD2抗体的抗体混合物标记30”。洗涤后，将细胞重悬于活/死染色剂(7AAD)和123计数珠的混合物中，随后使用LSRFortessa流式细胞仪进行分析。

图8显示，两种双特异性VHH化合物均能够诱导依赖于CD123阳性原代AML母细胞的有效T细胞活化。此外，所述化合物引起高水平的肿瘤细胞裂解，并且在这种细胞毒性方面均显示出显著的效力。EC50值无法从获得的曲线中明确确定，但处于fM范围内(低于1pM)。

实施例8：使用CDR移植进行抗CD123 VHH 1D2的人源化

使用CDR移植技术将1D2 VHH抗体片段人源化(参见例如美国专利号5,225,539和Williams,D.G.等人,2010,Antibody Engineering,第1卷,第21章)。首先，使用IgBLAST鉴定人种系序列(Ye J.等人,2013,Nucleic Acids Res.41:W34-40)。鉴定出V基因IGVH3-23*04作为最接近的人种系序列(78.4％同一性)。使用该种系序列直接移植美洲驼CDR(与人种系IGVH3-23*04具有91.8％同一性)，得到以下cDNA构建体：SEQ ID NO:31。接下来，使用BLASTP(2.10.0+版)查询NCBI NR数据库(2020年9月27日下载)，以鉴定与1D2序列表现出最高同一性的人模板序列。鉴定出两个VH序列，其表现出70％或更高的相似性得分，并且表现出相似的CDR长度，优选地分别与1D2 CDR1、CDR2、CDR3中的那些相同。选择由GenBank(Benson,D.A.等人,2013,Nucleic Acids Res.41(D1):D36-42)登录号CAD60357.1和AKU38567.1编码的框架作为用于移植1D2 CDR的模板，得到以下cDNA构建体：分别为SEQ IDNO:28和32。框架和CDR定义是如Kabat等人确定的那些("Sequences of Proteins ofImmunological Interest",Kabat,E.等人,USDepartment of Health and HumanServices,(1983))。为了了解人源化框架残基对VHH结构的影响，使用BioLuminate4.2.156内的'抗体预测'工具(默认参数)制作了1D2 VHH的同源模型。同源模型是在PDB ID 6GKU的基础上构建的。将CDR进行计算机移植，以研究人类残基对CDR环构象、表面疏水性和结构完整性(例如增加的刚性)等特征的影响。检查所得构建体的这些特征，从而设计另外的构建体：SEQ ID NO:25、26、27、29、30、33和34。然后将这些人源化1D2-VHH的序列重新格式化为具有Vδ2特异性VHH(5C8var1；SEQ ID NO:17，其中X₄是Y)的双特异性VHH，方向为：N端-人源化的抗1D2 VHH-接头-抗Vδ2VHH-C标签。然后合成编码这些分子的cDNA并克隆到表达载体中以在HEK293E细胞中表达。通过细胞的瞬时转染制备蛋白质，并使用C标签亲和色谱并且接着使用制备型尺寸排阻色谱从培养物上清液中纯化。

实施例9：使用生物层干涉测量法(BLI)确定人源化1D2-5C8var1(Y105F)变体与CD123的结合亲和力

为了确定人源化1D2-5C8var1变体与CD123的结合动力学，将重组的纯化CD123-Fc融合蛋白(Bio-Techne/R&D Systems)以1nm的密度加载到Octet Red96e(Sartorius)仪器的抗人IgG Fc捕获传感器上(使用5μg/ml的浓度)。然后将不同的传感器浸入不同浓度的人源化1D2-5C8var1变体中，以50nM及其两倍稀释液开始；稀释液在供应商提供的10x动力学缓冲液(10xKB)中制备。由获得的传感图，通过曲线拟合确定动力学缔合和解离速率常数。当可以拟合时，使用结合和解离速率常数计算人源化1D2-5C8var1变体与CD123的结合亲和力。进行两次测量，并且不同的人源化1D2-5C8var1变体对CD123的亲和力的范围为2.6nM(与亲本1D2相比是相似的)至非结合变体，如表2所示。作为参考，将非人源化(亲本)1D2包括在这些实验中。

表2：1D2的人源化变体与重组CD123的亲和力

*低结合(>20nM)，仅一个测量结果，n.b.：未观察到结合

实施例10：半衰期延长的(含有Fc的)双特异性构建体

1D2-5C8var1双特异性VHH被重新格式化为包含人Fc结构域的治疗性抗体格式。两个VHH结构域均与具有以下特征的人IgG1Fc(即CH2和CH3)结构域偶联：VHH与经修饰的铰链(AAA，后跟SDKTHTCPPCP)以及人CH2和CH3结构域偶联。CH2结构域被LFLE突变对(L234F、L235E)Fc沉默，并且CH3结构域突变为具有“旋钮-孔”突变(旋钮：T366W，并且孔：T366S、L368A和Y407V)，其在同一细胞中共表达两条链时强制发生异二聚化。该突变对已在科学文献中有所描述(Ridgway等人(1996)Protein Eng 9:617)。抗Vγ9Vδ2重链的C端配备有用于纯化目的的C端标签(AAAEPEA(SEQ ID NO:53))。构建体的序列在SEQ ID NO:49和SEQ IDNO:50中示出。所得的抗体构建体称为1D2-5C8var1(Y105F)-Fc。

通过在HEK293E细胞中共转染编码两种表达载体并通过C标签亲和色谱，接着进行制备型尺寸排阻色谱从培养物上清液中纯化来制备蛋白质。这产生了1D2-5C8var1(Y105F)-Fc的高单体蛋白制剂：图9。

实施例11：1D2-5C8var1(Y105F)-Fc诱导靶标依赖性T细胞活化并引起T细胞介导的靶细胞的细胞毒性，其效力与双特异性VHH相等

然后测试1D2-5C8var1(Y105F)-Fc在Vγ9Vδ2T细胞和THP-1肿瘤细胞(比率为1:1)的共培养物中诱导靶标依赖性Vγ9Vδ2T细胞活化的能力。使用本领域已知的程序从健康供体的血液中扩增Vγ9Vδ2T细胞。THP-1细胞系(ATCC目录号TIB-202)按照供应商的建议进行培养。在两种细胞类型的4小时共培养物中，通过CD107a染色并通过流式细胞术测量CD107a阳性细胞的百分比来测量Vγ9Vδ2T细胞的活化。图10显示1D2-5C8var1(Y105F)-Fc诱导靶标依赖性T细胞活化(在不存在化合物的情况下，在Vγ9Vδ2T细胞和肿瘤细胞的共培养物中未观察到活化；数据未示出)。EC50通常在pM范围内，范围为4至16pM(取决于所使用的供体)。

值得注意的是，含有Fc的分子诱导Vγ9Vδ2T细胞活化的效力与双特异性VHH没有可测量差异。这是在三个不同的独立T细胞供体中观察到的。为了确定这种T细胞活化是否也导致靶细胞裂解，在抗体存在下与Vγ9Vδ2T细胞共培养(1:1比率)24小时后测量THP-1靶细胞的活力。从健康供体的血液中分离Vγ9Vδ2T细胞，并使用标准化方案进行扩增。测定前一天，将THP-1靶细胞系用细胞微量紫(CTV)标记，以便能够在流式细胞术中将其与效应细胞群区分开来。在化合物浓度不断增加的情况下共培养24小时后，确定活靶细胞的百分比：图11。

图11显示，双特异性VHH和含有Fc的对应物均诱导强烈的T细胞介导的靶细胞的细胞毒性，并且两种分子引起靶细胞裂解的效力没有可测量的差异。EC50值的范围介于1与3pM之间，取决于所使用的供体。在不存在化合物的情况下，在共培养物中未观察到靶细胞裂解(数据未示出)。24小时后，测定中的所有靶细胞均被杀伤。

实施例12：1D2-5C8var1(Y105F)-Fc导致相对于靶标阳性正常细胞优先杀伤肿瘤细胞

为了确定抗体诱导CD123阳性正常细胞杀伤的程度，使用MACS分选(MiltenyiBiotech，目录号130-097-415)从由来自两名健康供体的血液中分离的外周血单核细胞(PBMC)级分中富集已知表达CD123(Collin等人,2013Immunology 140,1:22-30)的浆细胞样树突状细胞(pDC)。THP-1细胞系用作表达CD123的肿瘤细胞系。使用针对CD123的染色和通过流式细胞术进行的分析，已表明，pDC上的CD123表达水平比THP-1细胞系上高大约十倍：图12。

然后，在THP-1细胞系、pDC和Vγ9Vδ2T细胞的比率为1:1:2的共培养物中确定CD123靶向化合物与Vγ9Vδ2T细胞的组合对靶细胞混合物的细胞毒性作用。从健康供体的血液中分离Vγ9Vδ2T细胞，并使用标准化方案进行扩增。测定前一天，将THP-1靶细胞系用细胞微量紫(CTV)标记，以便能够在流式细胞术中将其与效应细胞群和其他靶细胞区分开来。在浓度不断增加的化合物的存在下共培养24小时后，通过针对Vγ9(T细胞)、CD303(pDC)、CTV(THP-1)和CD123(THP-1和pDC)进行染色并通过流式细胞术进行分析来确定活靶细胞的百分比。

图13显示，双特异性抗体诱导预期的THP-1靶细胞裂解(图11)，其效力(EC50)为约1pM。然而，值得注意的是，尽管CD123靶分子在pDC上的表达水平高出十倍(图12)，但这些细胞受到的影响要小得多。观察到的最大裂解较低，并且在测定中发现的EC50几乎比针对THP-1细胞裂解所发现的EC50高10倍。2号供体的结果是相似的(THP-1和pDC的EC50值分别为1和11pM；数据未示出)。这些数据显示，相对于靶标阳性正常细胞，化合物和Vγ9Vδ2T细胞优先诱导肿瘤细胞的裂解。

实施例13：表位作图揭示1D2 VHH与膜近端表位(membrane-proximal epitope)的结合

为了确定CD123上的什么表位被抗CD123 VHH 1D2识别，使用基于质谱的方法对该表位作图(Pimenova等人,2008J Mass Spectrom.43(2):185-95)。发现CD123分子中的许多残基与抗体交联：图14。

图14将1D2的表位鉴定为存在于人CD123的氨基酸203-273的区域中。当将这些残基在分子的晶体结构中突出显示时(PDB ID 5UV8:Broughton等人,2018Nat Commun.9:386)，这映射至最接近膜的第二结构域，并覆盖的表面积。

图15显示，由先导抗CD123抗体识别的表位位于靠近膜的位置。跨越的距离为约这对于表位来说并不罕见。发现1D2VHH的所有CDR区域均与抗原交联，其中CDR3的信号特别强。

进行了类似的实验来确定CD123上的哪个表位被抗CD123 VHH 1A3识别。发现CD123的残基H225、H231、R234、T251、R255和T267与1A3抗体交联。

实施例14：1D2x5C8var1(Y105F)-Fc显示出有利的稳定性概况

通过纳米差示扫描荧光测定法(nano-DSF)分析1D2x5C8var1(Y105F)-Fc的热稳定性。该蛋白表现出高热稳定性，展开温度>60℃(表3)。此外，还对1D2x5C8var1(Y105F)-Fc进行了加速应激测试。将样品在高温(40℃)以及酸性(50mM醋酸盐缓冲液，pH5.0)和碱性(100mM磷酸盐缓冲液，pH 8.5)条件下孵育1周，并在氧化条件(磷酸盐缓冲液，pH 7.4和0.05％ H₂O₂)下孵育6和24小时。通过利用(A)通过紫外吸收(SEC-UV)检测的尺寸排阻色谱和(B)在变性(SDS)条件下(CE-SDS)并且在还原之后进行的毛细管凝胶电泳测量聚集体和片段来分析任何应激诱导的变化(图16)。与非应激参考样品相比，不可观察到应激蛋白质样品的可检测降解；发现该蛋白质非常稳定。

表3：

实施例15：Vδ2-CD123双特异性抗体1D2x5C8var1(Y105F)在诱导T细胞活化和T细胞介导的肿瘤细胞的细胞毒性方面比基于7A5的Vγ9-CD123双特异性抗体更有效

将Vδ2-CD123双特异性抗体1D2x5C8var1(Y105F)-Fc的效力与基于结合Vγ9的Fab抗体7A5的Vγ9-CD123-Fc双特异性抗体进行比较。7A5的序列由Kabelitz教授友情提供。抗体已在Oberg等人(2014)Cancer Res 74(5):1349中有所表征。Ganesan等人(2021)Leukemia 35(8):2274-2284和WO2020/227457中已描述了抗体7A5的变体。将Fab 7A5的序列与包括CH3中的旋钮-孔突变以及Fc沉默突变L234F和L235E的人CH2和CH3序列融合。然后将该结合Vγ9的‘半-IgG’(SEQ ID NO:51和52)与CD123特异性VHH-Fc融合体在HEK293E细胞中共表达以形成双特异性Vγ9xCD123双特异性抗体。通过存在于Vγ9结合臂中的CH3 C端的C端标签纯化蛋白质，并且接着通过制备型尺寸排阻进一步纯化。这产生了纯化且基本上不含内毒素的蛋白质。1D2xFab 7A5-Fc具有与1D2x5C8var1(Y105F)-Fc相同的CD123结合VHH臂。对于该测定，将50,000个扩增的Vγ9Vδ2T细胞与50,000个Kasumi-3或THP1靶细胞以及这两种化合物的系列稀释液共培养。结果在图17中示出。(A)4小时后通过利用流式细胞术测量CD107a(溶酶体相关蛋白-1，或LAMP-1)阳性细胞的百分比来分析脱粒。(B)通过测量CD25阳性细胞的百分比来分析Vγ9Vδ2T细胞活化，并且(C)通过在24小时后利用流式细胞术分析活靶细胞的百分比来分析细胞毒性。通过与使用Vγ9靶向化合物时观察到的那些相比更高的CD107a阳性细胞以及CD25阳性细胞百分比和更低的EC50值可以看出，1D2x5C8var1(Y105F)-Fc诱导Vγ9Vδ2T细胞的更有效的活化和脱粒。与1D2xFab 7A5-Fc相比，使用1D2x5C8var1(Y105F)-Fc观察到更高的细胞毒性效力，EC50值的显著降低证明了这一点。

序列表

<110> 熔岩疗法公司

<120> 结合CD123和γ-δ T细胞受体的抗体

<130> P009 WO

<160> 53

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 131

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 抗体序列

<400> 1

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Ala Ser Ser Tyr

20 25 30

Val Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val

35 40 45

Ala Val Ile Asn Trp Asn Gly Asp Ser Thr Tyr Tyr Thr Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Ala Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ala Asp Thr Arg Arg Glu Trp Tyr Arg Asp Gly Tyr Trp Gly Pro

100 105 110

Pro Ala Arg Tyr Glu Tyr Asp Tyr Arg Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr

115 120 125

Val Ser Ser

130

<210> 2

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 抗体序列

<220>

<221> 变体

<222> (10)..(10)

<223> X是G或S

<400> 2

Gly Arg Thr Ala Ser Ser Tyr Val Met Xaa

1 5 10

<210> 3

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 抗体序列

<220>

<221> 变体

<222> (12)..(12)

<223> X是A或T

<400> 3

Val Ile Asn Trp Asn Gly Asp Ser Thr Tyr Tyr Xaa Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 4

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 抗体序列

<220>

<221> 变体

<222> (11)..(11)

<223> X是Y或F

<400> 4

Asp Thr Arg Arg Glu Trp Tyr Arg Asp Gly Xaa Trp Gly Pro Pro Ala

1 5 10 15

Arg Tyr Glu Tyr Asp Tyr

20

<210> 5

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 抗体序列

<400> 5

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser

20 25

<210> 6

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 抗体序列

<400> 6

Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala

1 5 10

<210> 7

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 抗体序列

<400> 7

Arg Phe Ala Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln

1 5 10 15

Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala

20 25 30

<210> 8

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 抗体序列

<400> 8

Arg Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

1 5 10

<210> 9

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 抗体序列

<400> 9

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Ala Ile Asn Thr Tyr

20 25 30

Ala Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Asp Phe Val

35 40 45

Ala Thr Ile Ser Tyr Ser Gly Gly Thr Thr Asp Tyr Ala Gly Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Glu Asn Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ala Arg Asp Arg Tyr Asn Pro Leu Ala Arg Asn Tyr Asn Tyr Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 10

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 抗体序列

<400> 10

Gly Arg Ala Ile Asn Thr Tyr Ala Met Ala

1 5 10

<210> 11

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 抗体序列

<400> 11

Thr Ile Ser Tyr Ser Gly Gly Thr Thr Asp Tyr Ala Gly Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 12

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 抗体序列

<400> 12

Arg Asp Arg Tyr Asn Pro Leu Ala Arg Asn Tyr Asn Tyr

1 5 10

<210> 13

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 抗体序列

<400> 13

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser

20 25

<210> 14

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 抗体序列

<400> 14

Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Asp Phe Val Ala

1 5 10

<210> 15

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 抗体序列

<400> 15

Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Glu Asn Thr Val Tyr Leu Gln

1 5 10 15

Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala

20 25 30

<210> 16

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 抗体序列

<400> 16

Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

1 5 10

<210> 17

<211> 130

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 抗体序列

<220>

<221> 变体

<222> (105)..(105)

<223> X是Y、F或S

<400> 17

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Pro Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val

35 40 45

Ser Ala Ile Ser Trp Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ala Gln Phe Ser Gly Ala Asp Xaa Gly Phe Gly Arg Leu Gly Ile

100 105 110

Arg Gly Tyr Glu Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val

115 120 125

Ser Ser

130

<210> 18

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 抗体序列

<400> 18

Asn Tyr Ala Met Ser

1 5

<210> 19

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 抗体序列

<400> 19

Ala Ile Ser Trp Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 20

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 抗体序列

<220>

<221> 变体

<222> (7)..(7)

<223> X是Y、F或S

<400> 20

Gln Phe Ser Gly Ala Asp Xaa Gly Phe Gly Arg Leu Gly Ile Arg Gly

1 5 10 15

Tyr Glu Tyr Asp Tyr

20

<210> 21

<211> 217

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 抗体序列

<400> 21

Ala Pro Glu Phe Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys

1 5 10 15

Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val

20 25 30

Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr

35 40 45

Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu

50 55 60

Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His

65 70 75 80

Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys

85 90 95

Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln

100 105 110

Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu

115 120 125

Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro

130 135 140

Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn

145 150 155 160

Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu

165 170 175

Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val

180 185 190

Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln

195 200 205

Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

210 215

<210> 22

<211> 217

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 抗体序列

<400> 22

Ala Pro Glu Phe Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys

1 5 10 15

Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val

20 25 30

Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr

35 40 45

Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu

50 55 60

Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His

65 70 75 80

Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys

85 90 95

Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln

100 105 110

Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu

115 120 125

Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro

130 135 140

Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn

145 150 155 160

Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu

165 170 175

Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val

180 185 190

Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln

195 200 205

Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

210 215

<210> 23

<211> 378

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 23

Met Val Leu Leu Trp Leu Thr Leu Leu Leu Ile Ala Leu Pro Cys Leu

1 5 10 15

Leu Gln Thr Lys Glu Asp Pro Asn Pro Pro Ile Thr Asn Leu Arg Met

20 25 30

Lys Ala Lys Ala Gln Gln Leu Thr Trp Asp Leu Asn Arg Asn Val Thr

35 40 45

Asp Ile Glu Cys Val Lys Asp Ala Asp Tyr Ser Met Pro Ala Val Asn

50 55 60

Asn Ser Tyr Cys Gln Phe Gly Ala Ile Ser Leu Cys Glu Val Thr Asn

65 70 75 80

Tyr Thr Val Arg Val Ala Asn Pro Pro Phe Ser Thr Trp Ile Leu Phe

85 90 95

Pro Glu Asn Ser Gly Lys Pro Trp Ala Gly Ala Glu Asn Leu Thr Cys

100 105 110

Trp Ile His Asp Val Asp Phe Leu Ser Cys Ser Trp Ala Val Gly Pro

115 120 125

Gly Ala Pro Ala Asp Val Gln Tyr Asp Leu Tyr Leu Asn Val Ala Asn

130 135 140

Arg Arg Gln Gln Tyr Glu Cys Leu His Tyr Lys Thr Asp Ala Gln Gly

145 150 155 160

Thr Arg Ile Gly Cys Arg Phe Asp Asp Ile Ser Arg Leu Ser Ser Gly

165 170 175

Ser Gln Ser Ser His Ile Leu Val Arg Gly Arg Ser Ala Ala Phe Gly

180 185 190

Ile Pro Cys Thr Asp Lys Phe Val Val Phe Ser Gln Ile Glu Ile Leu

195 200 205

Thr Pro Pro Asn Met Thr Ala Lys Cys Asn Lys Thr His Ser Phe Met

210 215 220

His Trp Lys Met Arg Ser His Phe Asn Arg Lys Phe Arg Tyr Glu Leu

225 230 235 240

Gln Ile Gln Lys Arg Met Gln Pro Val Ile Thr Glu Gln Val Arg Asp

245 250 255

Arg Thr Ser Phe Gln Leu Leu Asn Pro Gly Thr Tyr Thr Val Gln Ile

260 265 270

Arg Ala Arg Glu Arg Val Tyr Glu Phe Leu Ser Ala Trp Ser Thr Pro

275 280 285

Gln Arg Phe Glu Cys Asp Gln Glu Glu Gly Ala Asn Thr Arg Ala Trp

290 295 300

Arg Thr Ser Leu Leu Ile Ala Leu Gly Thr Leu Leu Ala Leu Val Cys

305 310 315 320

Val Phe Val Ile Cys Arg Arg Tyr Leu Val Met Gln Arg Leu Phe Pro

325 330 335

Arg Ile Pro His Met Lys Asp Pro Ile Gly Asp Ser Phe Gln Asn Asp

340 345 350

Lys Leu Val Val Trp Glu Ala Gly Lys Ala Gly Leu Glu Glu Cys Leu

355 360 365

Val Thr Glu Val Gln Val Val Gln Lys Thr

370 375

<210> 24

<211> 897

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 24

Met Val Leu Ala Gln Gly Leu Leu Ser Met Ala Leu Leu Ala Leu Cys

1 5 10 15

Trp Glu Arg Ser Leu Ala Gly Ala Glu Glu Thr Ile Pro Leu Gln Thr

20 25 30

Leu Arg Cys Tyr Asn Asp Tyr Thr Ser His Ile Thr Cys Arg Trp Ala

35 40 45

Asp Thr Gln Asp Ala Gln Arg Leu Val Asn Val Thr Leu Ile Arg Arg

50 55 60

Val Asn Glu Asp Leu Leu Glu Pro Val Ser Cys Asp Leu Ser Asp Asp

65 70 75 80

Met Pro Trp Ser Ala Cys Pro His Pro Arg Cys Val Pro Arg Arg Cys

85 90 95

Val Ile Pro Cys Gln Ser Phe Val Val Thr Asp Val Asp Tyr Phe Ser

100 105 110

Phe Gln Pro Asp Arg Pro Leu Gly Thr Arg Leu Thr Val Thr Leu Thr

115 120 125

Gln His Val Gln Pro Pro Glu Pro Arg Asp Leu Gln Ile Ser Thr Asp

130 135 140

Gln Asp His Phe Leu Leu Thr Trp Ser Val Ala Leu Gly Ser Pro Gln

145 150 155 160

Ser His Trp Leu Ser Pro Gly Asp Leu Glu Phe Glu Val Val Tyr Lys

165 170 175

Arg Leu Gln Asp Ser Trp Glu Asp Ala Ala Ile Leu Leu Ser Asn Thr

180 185 190

Ser Gln Ala Thr Leu Gly Pro Glu His Leu Met Pro Ser Ser Thr Tyr

195 200 205

Val Ala Arg Val Arg Thr Arg Leu Ala Pro Gly Ser Arg Leu Ser Gly

210 215 220

Arg Pro Ser Lys Trp Ser Pro Glu Val Cys Trp Asp Ser Gln Pro Gly

225 230 235 240

Asp Glu Ala Gln Pro Gln Asn Leu Glu Cys Phe Phe Asp Gly Ala Ala

245 250 255

Val Leu Ser Cys Ser Trp Glu Val Arg Lys Glu Val Ala Ser Ser Val

260 265 270

Ser Phe Gly Leu Phe Tyr Lys Pro Ser Pro Asp Ala Gly Glu Glu Glu

275 280 285

Cys Ser Pro Val Leu Arg Glu Gly Leu Gly Ser Leu His Thr Arg His

290 295 300

His Cys Gln Ile Pro Val Pro Asp Pro Ala Thr His Gly Gln Tyr Ile

305 310 315 320

Val Ser Val Gln Pro Arg Arg Ala Glu Lys His Ile Lys Ser Ser Val

325 330 335

Asn Ile Gln Met Ala Pro Pro Ser Leu Asn Val Thr Lys Asp Gly Asp

340 345 350

Ser Tyr Ser Leu Arg Trp Glu Thr Met Lys Met Arg Tyr Glu His Ile

355 360 365

Asp His Thr Phe Glu Ile Gln Tyr Arg Lys Asp Thr Ala Thr Trp Lys

370 375 380

Asp Ser Lys Thr Glu Thr Leu Gln Asn Ala His Ser Met Ala Leu Pro

385 390 395 400

Ala Leu Glu Pro Ser Thr Arg Tyr Trp Ala Arg Val Arg Val Arg Thr

405 410 415

Ser Arg Thr Gly Tyr Asn Gly Ile Trp Ser Glu Trp Ser Glu Ala Arg

420 425 430

Ser Trp Asp Thr Glu Ser Val Leu Pro Met Trp Val Leu Ala Leu Ile

435 440 445

Val Ile Phe Leu Thr Ile Ala Val Leu Leu Ala Leu Arg Phe Cys Gly

450 455 460

Ile Tyr Gly Tyr Arg Leu Arg Arg Lys Trp Glu Glu Lys Ile Pro Asn

465 470 475 480

Pro Ser Lys Ser His Leu Phe Gln Asn Gly Ser Ala Glu Leu Trp Pro

485 490 495

Pro Gly Ser Met Ser Ala Phe Thr Ser Gly Ser Pro Pro His Gln Gly

500 505 510

Pro Trp Gly Ser Arg Phe Pro Glu Leu Glu Gly Val Phe Pro Val Gly

515 520 525

Phe Gly Asp Ser Glu Val Ser Pro Leu Thr Ile Glu Asp Pro Lys His

530 535 540

Val Cys Asp Pro Pro Ser Gly Pro Asp Thr Thr Pro Ala Ala Ser Asp

545 550 555 560

Leu Pro Thr Glu Gln Pro Pro Ser Pro Gln Pro Gly Pro Pro Ala Ala

565 570 575

Ser His Thr Pro Glu Lys Gln Ala Ser Ser Phe Asp Phe Asn Gly Pro

580 585 590

Tyr Leu Gly Pro Pro His Ser Arg Ser Leu Pro Asp Ile Leu Gly Gln

595 600 605

Pro Glu Pro Pro Gln Glu Gly Gly Ser Gln Lys Ser Pro Pro Pro Gly

610 615 620

Ser Leu Glu Tyr Leu Cys Leu Pro Ala Gly Gly Gln Val Gln Leu Val

625 630 635 640

Pro Leu Ala Gln Ala Met Gly Pro Gly Gln Ala Val Glu Val Glu Arg

645 650 655

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660 665 670

Gly Pro Ala Pro Pro Ala Leu Gly Pro Arg Val Gly Gly Gln Asp Gln

675 680 685

Lys Asp Ser Pro Val Ala Ile Pro Met Ser Ser Gly Asp Thr Glu Asp

690 695 700

Pro Gly Val Ala Ser Gly Tyr Val Ser Ser Ala Asp Leu Val Phe Thr

705 710 715 720

Pro Asn Ser Gly Ala Ser Ser Val Ser Leu Val Pro Ser Leu Gly Leu

725 730 735

Pro Ser Asp Gln Thr Pro Ser Leu Cys Pro Gly Leu Ala Ser Gly Pro

740 745 750

Pro Gly Ala Pro Gly Pro Val Lys Ser Gly Phe Glu Gly Tyr Val Glu

755 760 765

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770 775 780

Val Pro Pro Glu Ala Lys Ser Pro Val Leu Asn Pro Gly Glu Arg Pro

785 790 795 800

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805 810 815

Gln Gln Val Gly Asp Tyr Cys Phe Leu Pro Gly Leu Gly Pro Gly Pro

820 825 830

Leu Ser Leu Arg Ser Lys Pro Ser Ser Pro Gly Pro Gly Pro Glu Ile

835 840 845

Lys Asn Leu Asp Gln Ala Phe Gln Val Lys Lys Pro Pro Gly Gln Ala

850 855 860

Val Pro Gln Val Pro Val Ile Gln Leu Phe Lys Ala Leu Lys Gln Gln

865 870 875 880

Asp Tyr Leu Ser Leu Pro Pro Trp Glu Val Asn Lys Pro Gly Glu Val

885 890 895

Cys

<210> 25

<211> 131

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 抗体序列

<400> 25

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Ala Ser Ser Tyr

20 25 30

Val Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val

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Ser Val Ile Asn Trp Asn Gly Asp Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

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65 70 75 80

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Val Ser Ser

130

<210> 26

<211> 131

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 抗体序列

<400> 26

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Ala Ser Ser Tyr

20 25 30

Val Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Trp Val

35 40 45

Ser Val Ile Asn Trp Asn Gly Asp Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

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100 105 110

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115 120 125

Val Ser Ser

130

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<211> 131

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 抗体序列

<400> 27

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Ala Ser Ser Tyr

20 25 30

Val Met Ser Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Trp Val

35 40 45

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50 55 60

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65 70 75 80

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Pro Ala Arg Tyr Glu Tyr Asp Tyr Arg Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

115 120 125

Val Ser Ser

130

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<211> 131

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 抗体序列

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Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Ala Ser Ser Tyr

20 25 30

Val Met Ser Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Trp Val

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50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

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100 105 110

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115 120 125

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130

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<211> 131

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 抗体序列

<400> 29

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Ala Ser Ser Tyr

20 25 30

Val Met Ser Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val

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50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

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100 105 110

Pro Ala Arg Tyr Glu Tyr Asp Tyr Arg Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

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Val Ser Ser

130

<210> 30

<211> 131

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 抗体序列

<400> 30

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Ala Ser Ser Tyr

20 25 30

Val Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Val Ile Asn Trp Asn Gly Asp Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

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100 105 110

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115 120 125

Val Ser Ser

130

<210> 31

<211> 131

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 抗体序列

<400> 31

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Ala Ser Ser Tyr

20 25 30

Val Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Val Ile Asn Trp Asn Gly Asp Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

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100 105 110

Pro Ala Arg Tyr Glu Tyr Asp Tyr Arg Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

115 120 125

Val Ser Ser

130

<210> 32

<211> 131

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 抗体序列

<400> 32

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Ala Ser Ser Tyr

20 25 30

Val Met Ser Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Asn Trp Asn Gly Asp Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

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100 105 110

Pro Ala Arg Tyr Glu Tyr Asp Tyr Arg Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

115 120 125

Val Ser Ser

130

<210> 33

<211> 131

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 抗体序列

<400> 33

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Ala Ser Ser Tyr

20 25 30

Val Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Trp Val

35 40 45

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50 55 60

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65 70 75 80

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100 105 110

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115 120 125

Val Ser Ser

130

<210> 34

<211> 131

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 抗体序列

<400> 34

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Ala Ser Ser Tyr

20 25 30

Val Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val

35 40 45

Ser Val Ile Asn Trp Asn Gly Asp Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

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100 105 110

Pro Ala Arg Tyr Glu Tyr Asp Tyr Arg Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr

115 120 125

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130

<210> 35

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 抗体序列

<400> 35

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1 5 10

<210> 36

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 抗体序列

<400> 36

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Pro Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

Gly Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Lys Arg Glu Phe Val

35 40 45

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100 105 110

Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 37

<211> 126

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 抗体序列

<400> 37

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Pro Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

Gly Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Lys Arg Glu Ser Val

35 40 45

Ala Gly Ile Ser Trp Ser Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ala Val Phe Ser Gly Ala Glu Thr Ala Tyr Tyr Pro Ser Asp Asp

100 105 110

Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

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<211> 127

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 抗体序列

<400> 38

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Pro Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val

35 40 45

Thr Val Ile Ser Trp Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ala Gln Phe Ser Gly Ala Ser Thr Val Val Ala Gly Thr Ala Leu

100 105 110

Asp Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Arg Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 39

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 抗体序列

<400> 39

Gly Arg Pro Phe Ser Asn Tyr Gly Met Gly

1 5 10

<210> 40

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 抗体序列

<400> 40

Gly Ile Ser Trp Ser Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 41

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 抗体序列

<400> 41

Val Phe Ser Gly Ala Glu Thr Ala Tyr Tyr Pro Ser Asp Asp Tyr Asp

1 5 10 15

Tyr

<210> 42

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 抗体序列

<400> 42

Gly Arg Pro Phe Ser Asn Tyr Gly Met Gly

1 5 10

<210> 43

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 抗体序列

<400> 43

Gly Ile Ser Trp Ser Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 44

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 抗体序列

<400> 44

Val Phe Ser Gly Ala Glu Thr Ala Tyr Tyr Pro Ser Asp Asp Tyr Asp

1 5 10 15

Tyr

<210> 45

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 抗体序列

<400> 45

Gly Arg Pro Phe Ser Asn Tyr Ala Met Gly

1 5 10

<210> 46

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 抗体序列

<400> 46

Val Ile Ser Trp Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 47

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 抗体序列

<400> 47

Gln Phe Ser Gly Ala Ser Thr Val Val Ala Gly Thr Ala Leu Asp Tyr

1 5 10 15

Asp Tyr

<210> 48

<211> 267

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 48

Met Gln Arg Ile Ser Ser Leu Ile His Leu Ser Leu Phe Trp Ala Gly

1 5 10 15

Val Met Ser Ala Ile Glu Leu Val Pro Glu His Gln Thr Val Pro Val

20 25 30

Ser Ile Gly Val Pro Ala Thr Leu Arg Cys Ser Met Lys Gly Glu Ala

35 40 45

Ile Gly Asn Tyr Tyr Ile Asn Trp Tyr Arg Lys Thr Gln Gly Asn Thr

50 55 60

Met Thr Phe Ile Tyr Arg Glu Lys Asp Ile Tyr Gly Pro Gly Phe Lys

65 70 75 80

Asp Asn Phe Gln Gly Asp Ile Asp Ile Ala Lys Asn Leu Ala Val Leu

85 90 95

Lys Ile Leu Ala Pro Ser Glu Arg Asp Glu Gly Ser Tyr Tyr Cys Ala

100 105 110

Cys Asp Thr Leu Gly Met Gly Gly Glu Tyr Thr Asp Lys Leu Ile Phe

115 120 125

Gly Lys Gly Thr Arg Val Thr Val Glu Pro Arg Ser Gln Pro His Thr

130 135 140

Lys Pro Ser Val Phe Val Met Lys Asn Gly Thr Asn Val Ala Cys Leu

145 150 155 160

Val Lys Glu Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Arg Ile Asn Leu Val Ser Ser

165 170 175

Lys Lys Ile Thr Glu Phe Asp Pro Ala Ile Val Ile Ser Pro Ser Gly

180 185 190

Lys Tyr Asn Ala Val Lys Leu Gly Lys Tyr Glu Asp Ser Asn Ser Val

195 200 205

Thr Cys Ser Val Gln His Asp Asn Lys Thr Val His Ser Thr Asp Phe

210 215 220

Glu Val Lys Thr Asp Ser Thr Asp His Val Lys Pro Lys Glu Thr Glu

225 230 235 240

Asn Thr Lys Gln Pro Ser Lys Ser Cys His Lys Pro Lys Ala Ile Val

245 250 255

His Thr Glu Lys Val Asn Met Met Ser Leu Thr

260 265

<210> 49

<211> 361

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 抗体序列

<400> 49

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Pro Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val

35 40 45

Ser Ala Ile Ser Trp Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ala Gln Phe Ser Gly Ala Asp Phe Gly Phe Gly Arg Leu Gly Ile

100 105 110

Arg Gly Tyr Glu Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val

115 120 125

Ser Ser Ala Ala Ala Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro

130 135 140

Ala Pro Glu Phe Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys

145 150 155 160

Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val

165 170 175

Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr

180 185 190

Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu

195 200 205

Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His

210 215 220

Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys

225 230 235 240

Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln

245 250 255

Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu

260 265 270

Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro

275 280 285

Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn

290 295 300

Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu

305 310 315 320

Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val

325 330 335

Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln

340 345 350

Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

355 360

<210> 50

<211> 362

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 抗体序列

<400> 50

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Ala Ser Ser Tyr

20 25 30

Val Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val

35 40 45

Ala Val Ile Asn Trp Asn Gly Asp Ser Thr Tyr Tyr Thr Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Ala Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ala Asp Thr Arg Arg Glu Trp Tyr Arg Asp Gly Tyr Trp Gly Pro

100 105 110

Pro Ala Arg Tyr Glu Tyr Asp Tyr Arg Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr

115 120 125

Val Ser Ser Ala Ala Ala Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

130 135 140

Pro Ala Pro Glu Phe Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

145 150 155 160

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

165 170 175

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

180 185 190

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

195 200 205

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

210 215 220

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

225 230 235 240

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

245 250 255

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu

260 265 270

Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr

275 280 285

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

290 295 300

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

305 310 315 320

Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

325 330 335

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

340 345 350

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

355 360

<210> 51

<211> 455

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 抗体序列

<400> 51

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp His

20 25 30

Tyr Ile Asn Trp Val Lys Gln Arg Thr Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Gln Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asn Thr Tyr Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Pro Asn Tyr Gly Asp Tyr Thr Leu Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro

115 120 125

Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly

130 135 140

Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn

145 150 155 160

Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln

165 170 175

Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser

180 185 190

Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser

195 200 205

Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr

210 215 220

His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Glu Gly Gly Pro Ser

225 230 235 240

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg

245 250 255

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro

260 265 270

Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala

275 280 285

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val

290 295 300

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

305 310 315 320

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr

325 330 335

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu

340 345 350

Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys

355 360 365

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

370 375 380

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp

385 390 395 400

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser

405 410 415

Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala

420 425 430

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440 445

Ala Ala Ala Glu Pro Glu Ala

450 455

<210> 52

<211> 219

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 抗体序列

<400> 52

Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Val Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser

20 25 30

Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Val Lys Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln

85 90 95

Tyr Tyr Arg Tyr His Thr Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

115 120 125

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

130 135 140

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

145 150 155 160

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

165 170 175

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

180 185 190

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

195 200 205

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 53

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 标签序列

<400> 53

Ala Ala Ala Glu Pro Glu Ala

1 5

Claims (22)

1.一种多特异性抗体，其包含能够结合人CD123的第一抗原结合区和能够结合人Vγ9Vδ2T细胞受体的Vδ2链的第二抗原结合区。

2.根据权利要求1所述的多特异性抗体，其中所述多特异性抗体是双特异性抗体。

3.根据前述权利要求中任一项所述的多特异性抗体，其中所述第一抗原结合区是单结构域抗体和/或所述第二抗原结合区是单结构域抗体。

4.根据前述权利要求中任一项所述的多特异性抗体，其中所述多特异性抗体与具有SEQ ID NO:1所示序列的抗体竞争结合人CD123，优选地其中所述多特异性抗体与具有SEQID NO:1所示序列的抗体结合人CD123上的相同表位。

5.根据前述权利要求中任一项所述的多特异性抗体，其中所述第一抗原结合区包含SEQ ID NO:2所示的VH CDR1序列、SEQ ID NO:3所示的VH CDR2序列和SEQ ID NO:4所示的VH CDR3序列，其中优选地所述第一抗原结合区包含或由以下组成：选自SEQ ID NO:1、25至34所示的序列组的序列，或与选自SEQ ID NO:1、25至34所示的序列组的序列具有至少90％，诸如至少92％，例如至少94％，诸如至少96％，例如至少98％序列同一性的序列。

6.根据权利要求1至3中任一项所述的多特异性抗体，其中所述多特异性抗体与具有SEQ ID NO:9所示序列的抗体竞争结合人CD123，优选地其中所述多特异性抗体与具有SEQID NO:9所示序列的抗体结合人CD123上的相同表位。

7.根据权利要求6所述的多特异性抗体，其中所述第一抗原结合区包含SEQ ID NO:10所示的VH CDR1序列、SEQ ID NO:11所示的VH CDR2序列和SEQ ID NO:12所示的VH CDR3序列，其中优选地所述第一抗原结合区包含或由以下组成：SEQ ID NO:9所示的序列，或与SEQID NO:9所示的序列具有至少90％，诸如至少92％，例如至少94％，诸如至少96％，例如至少98％序列同一性的序列。

8.根据前述权利要求中任一项所述的多特异性抗体，其中所述多特异性抗体能够活化人Vγ9Vδ2T细胞。

9.根据前述权利要求中任一项所述的多特异性抗体，其中所述多特异性抗体与具有SEQ ID NO:17所示序列的抗体竞争结合人Vδ2，其中X₄是Y，优选地其中所述多特异性抗体与具有SEQ ID NO:17所示序列的抗体结合人Vδ2上的相同表位，其中X₄是Y，

或

其中所述多特异性抗体与具有SEQ ID NO:36所示序列的抗体竞争结合人Vδ2，优选地其中所述多特异性抗体与具有SEQ ID NO:36所示序列的抗体结合人Vδ2上的相同表位，

或

其中所述多特异性抗体与具有SEQ ID NO:37所示序列的抗体竞争结合人Vδ2，优选地其中所述多特异性抗体与具有SEQ ID NO:37所示序列的抗体结合人Vδ2上的相同表位，

或

其中所述多特异性抗体与具有SEQ ID NO:38所示序列的抗体竞争结合人Vδ2，优选地其中所述多特异性抗体与具有SEQ ID NO:38所示序列的抗体结合人Vδ2上的相同表位。

10.根据前述权利要求中任一项所述的多特异性抗体，其中所述第二抗原结合区包含SEQ ID NO:18所示的VH CDR1序列、SEQ ID NO:19所示的VH CDR2序列和SEQ ID NO:20所示的VH CDR3序列，其中优选地所述第二抗原结合区包含或由以下组成：SEQ ID NO:17所示的序列，或与SEQ ID NO:17所示的序列具有至少90％，诸如至少92％，例如至少94％，诸如至少96％，例如至少98％序列同一性的序列，

或

其中所述第二抗原结合区包含SEQ ID NO:39所示的VH CDR1序列、SEQ ID NO:40所示的VH CDR2序列和SEQ ID NO:41所示的VH CDR3序列，其中优选地所述第二抗原结合区包含或由以下组成：SEQ ID NO:36所示的序列，或与SEQ ID NO:36所示的序列具有至少90％，诸如至少92％，例如至少94％，诸如至少96％，例如至少98％序列同一性的序列，

或

其中所述第二抗原结合区包含SEQ ID NO:42所示的VH CDR1序列、SEQ ID NO:43所示的VH CDR2序列和SEQ ID NO:44所示的VH CDR3序列，其中优选地所述第二抗原结合区包含或由以下组成：SEQ ID NO:37所示的序列，或与SEQ ID NO:37所示的序列具有至少90％，诸如至少92％，例如至少94％，诸如至少96％，例如至少98％序列同一性的序列，

或

其中所述第二抗原结合区包含SEQ ID NO:45所示的VH CDR1序列、SEQ ID NO:46所示的VH CDR2序列和SEQ ID NO:47所示的VH CDR3序列，其中优选地所述第二抗原结合区包含或由以下组成：SEQ ID NO:38所示的序列，或与SEQ ID NO:38所示的序列具有至少90％，诸如至少92％，例如至少94％，诸如至少96％，例如至少98％序列同一性的序列。

11.根据前述权利要求中任一项所述的多特异性抗体，其中

(i)所述第一抗原结合区包含SEQ ID NO:2所示的VH CDR1序列、SEQ ID NO:3所示的VHCDR2序列和SEQ ID NO:4所示的VH CDR3序列，并且所述第二抗原结合区包含SEQ ID NO:18所示的VH CDR1序列、SEQ ID NO:19所示的VH CDR2序列和SEQ ID NO:20所示的VH CDR3序列，或

(ii)所述第一抗原结合区包含SEQ ID NO:10所示的VH CDR1序列、SEQ ID NO:11所示的VH CDR2序列和SEQ ID NO:12所示的VH CDR3序列，并且所述第二抗原结合区包含SEQ IDNO:18所示的VH CDR1序列、SEQ ID NO:19所示的VH CDR2序列和SEQ ID NO:20所示的VHCDR3序列。

12.根据前述权利要求中任一项所述的多特异性抗体，其中能够结合人CD123的所述第一抗原结合区位于能够结合所述人Vδ2链的所述第二抗原结合区的N端。

13.根据前述权利要求中任一项所述的多特异性抗体，其中所述多特异性抗体还包含半衰期延长结构域，诸如Fc区，优选地人Fc区。

14.根据权利要求13所述的多特异性抗体，其中所述Fc区是包含两个Fc多肽的异二聚体，其中所述第一抗原结合区与所述第一Fc多肽融合并且所述第二抗原结合区与所述第二Fc多肽融合，并且其中所述第一和第二Fc多肽包含相对于同二聚体的形成有利于异二聚体形成的不对称氨基酸突变，其中优选地所述第一Fc多肽包含T366W取代并且所述第二Fc多肽包含T366S、L368A和Y407V取代，或反之亦然，其中根据EU编号***，所述氨基酸位置对应于人IgG1。

15.根据权利要求13或14中任一项所述的多特异性抗体，其中所述第一和第二Fc多肽中的位置220处的半胱氨酸残基已缺失或被取代，其中根据EU编号***，所述氨基酸位置对应于人IgG1。

16.根据权利要求13至15中任一项所述的多特异性抗体，其中所述第一和第二Fc多肽还包含位置234和/或235处的突变，优选地其中所述第一和第二Fc多肽包含L234F和L235E取代，其中根据EU编号***，所述氨基酸位置对应于人IgG1。

17.根据权利要求13至16中任一项所述的多特异性抗体，其中所述第一Fc多肽包含SEQID NO:21所示的序列并且所述第二Fc多肽包含SEQ ID NO:22所示的序列，或反之亦然。

18.根据前述权利要求中任一项所述的多特异性抗体，其中所述多特异性抗体能够介导Vγ9Vδ2T细胞对表达CD123的细胞诸如C1r-neo细胞或THP-1细胞的杀伤。

19.一种抗体，其包含能够结合人CD123的第一抗原结合区，其中所述第一抗原结合区是单结构域抗体，其包含：

(i)SEQ ID NO:2所示的VH CDR1序列、SEQ ID NO:3所示的VH CDR2序列和SEQ ID NO:4所示的VH CDR3序列，其中优选地所述第一抗原结合区包含或由以下组成：选自SEQ ID NO:1、25至34所示的序列组的序列，或与选自SEQ ID NO:1、25至34所示的序列组的序列具有至少90％，诸如至少92％，例如至少94％，诸如至少96％，例如至少98％序列同一性的序列，或

(ii)SEQ ID NO:10所示的VH CDR1序列、SEQ ID NO:11所示的VH CDR2序列和SEQ IDNO:12所示的VH CDR3序列，其中优选地所述第一抗原结合区包含或由以下组成：SEQ IDNO:9所示的序列，或与SEQ ID NO:9所示的序列具有至少90％，诸如至少92％，例如至少94％，诸如至少96％，例如至少98％序列同一性的序列。

20.一种药物组合物，其包含根据前述权利要求中任一项所述的多特异性抗体或根据权利要求19所述的抗体以及药学上可接受的赋形剂。

21.根据权利要求1至18中任一项所述的多特异性抗体或根据权利要求19所述的抗体，其用作药物，优选地用于治疗癌症，更优选地用于治疗急性髓系白血病、B细胞急性淋巴母细胞性白血病、毛细胞白血病、霍奇金淋巴瘤、母细胞性浆细胞样树突状细胞肿瘤、慢性粒细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、B细胞慢性淋巴细胞增殖性病症或骨髓增生异常综合征。

22.一种包含编码根据权利要求1至19中任一项所述的抗体的核苷酸序列的核酸构建体，或一种包含编码根据权利要求1至19中任一项所述的抗体的一个或多个核酸构建体的宿主细胞。