JP2018514210A - ハイスループットｂｈ３プロファイリング：少量の細胞でのｂｈ３プロファイルのための迅速かつ拡大縮小可能な技術 - Google Patents

Abstract

本発明は、試験作用因子に対する細胞の感受性を予測する方法を提供する。一部の実施形態では、細胞は、血清を有する培養培地中で培養される。一局面において、試験作用因子に対する細胞の感受性を予測する方法が提供され、この方法は、ａ）血清を有する培養培地中、試験作用因子の存在下および非存在下で、接着性固体表面上にて細胞を培養するステップ；ｂ）培養された上記細胞を、ＢＨ３プロファイリング緩衝液およびアポトーシス促進性ＢＨ３ドメインペプチドと接触させるステップ；ｃ）上記細胞におけるＢＨ３ドメインペプチド誘導型ミトコンドリア外膜透過化（ＭＯＭＰ）の量を測定するステップ；およびｄ）上記試験作用因子の存在下で培養された上記細胞におけるＢＨ３ドメインペプチド誘導型ＭＯＭＰの量を、上記試験作用因子の非存在下で培養された上記細胞におけるＢＨ３ドメインペプチド誘導型ＭＯＭＰの量と比較するステップを含む。

Description

関連出願
この出願は、米国特許法§１１９（ｅ）の下、２０１５年４月２７日に出願された米国仮出願第６２／１５３，４７５号（この内容は、その全体が参考として本明細書に援用される）の利益を主張する。

ダイナミックＢＨ３プロファイリング（ＤＢＰ）は、薬物が細胞のアポトーシス感受性をどのように変化させるかを決定する。ダイナミックＢＨ３プロファイリングの方法は、ウェル中で培養培地の存在下、細胞を化学化合物で約４〜７２時間処理することを含んでいた。次に、細胞がウェルから取り上げられ、遠心分離機を使用して培養培地から分離された。分離された細胞がＢＨ３プロファイリング緩衝液中に入れられ、ＢＨ３プロファイリングペプチドと接触し、ミトコンドリア膜電位（ＭＯＭＰ）の消失が測定された。ＢＨ３ペプチドに対するミトコンドリア感受性の増加は、細胞が化学化合物に対して感受性であることを示した。しかし、これは、相当量のヒト作業者による取り扱いを伴う骨の折れる工程であり、それにより誤り率が増加する。加えて、この工程は、限りのある材料（例えば、腫瘍細胞）を大量に要する。これらの制限は、克服すべき障壁の代表である。したがって、自動化された効率的で費用対効果の高いＢＨ３プロファイリング方法が必要である。

様々な態様では、本開示は、薬物が細胞のアポトーシス感受性をどのように変化させるかを決定するための改良法を提供する。

したがって、一部の態様では、本開示は、試験作用因子に対する細胞の感受性を予測する方法であって、血清を有する培養培地中、試験作用因子の存在下および非存在下で、接着性固体表面上にて細胞を培養するステップ；培養された細胞を、ＢＨ３プロファイリング緩衝液およびアポトーシス促進性ＢＨ３ドメインペプチドと（例えば、接着性固体表面上で）接触させるステップ；細胞におけるＢＨ３ドメインペプチド誘導型ミトコンドリア外膜透過化（ＭＯＭＰ）の量を測定するステップ；および試験作用因子の存在下で培養された細胞におけるＢＨ３ドメインペプチド誘導型ＭＯＭＰの量を、試験作用因子の非存在下で培養された細胞におけるＢＨ３ドメインペプチド誘導型ＭＯＭＰの量と比較するステップを含み、試験作用因子の非存在下で培養された細胞におけるＢＨ３ドメインペプチド誘導型ＭＯＭＰの量と比較した、試験作用因子の存在下で培養された細胞におけるＭＯＭＰの増加は、細胞が試験作用因子に感受性であることを示す、方法を提供する。

一部の実施形態では、方法は、細胞をＢＨ３プロファイリング緩衝液およびアポトーシス促進性ＢＨ３ドメインペプチドと接触させる前に、細胞から培養培地を洗浄するステップをさらに含む。

一部の実施形態では、ＢＨ３プロファイリング緩衝液は、２×、３×または４×の濃度で添加される。一部の実施形態では、ＢＨ３プロファイリング緩衝液は、２×の濃度で添加され、ＢＨ３ドメインペプチド誘導型ＭＯＭＰの量は顕微鏡法によって測定される。一部の実施形態では、ＢＨ３プロファイリング緩衝液は、３×または４×の濃度で添加され、ＢＨ３ドメインペプチド誘導型ＭＯＭＰの量は、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）によって測定される。

一部の実施形態では、接着性固体表面は、１種または複数の接着促進化合物でコーティングされている。一部の実施形態では、１種または複数の接着促進化合物は細胞外マトリックス（ＥＣＭ）タンパク質である。一部の実施形態では、ＥＣＭタンパク質は、コラーゲン１、ラミニン、コラーゲン４およびフィブロネクチンからなる群より選択される。一部の実施形態では、ＥＣＭタンパク質混合物は動物組織に由来し、未知の組成である。一部の実施形態では、１種または複数の接着促進化合物は抗体である。一部の実施形態では、１種または複数の接着促進化合物はストレプトアビジンまたはニュートラアビジンである。

一部の実施形態では、ＢＨ３プロファイリング緩衝液は、トレハロース由来実験緩衝液（Ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ Ｔｒｅｈａｌｏｓｅ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｂｕｆｆｅｒ）（ＤＴＥＢ）またはマンニトール実験緩衝液（ＭＥＢ）である。一部の実施形態では、細胞は、ＢＨ３ドメインペプチドとの接触の後、その前、またはそれと同時に透過化される。一部の実施形態では、ＢＨ３プロファイリング緩衝液に透過化剤が補充される。一部の実施形態では、透過化剤はジギトニンまたはサポニンである。

方法の一部の実施形態では、ＢＨ３ドメインペプチド誘導型ＭＯＭＰの量は、ｉ）電位差測定用色素と接触した細胞における前記電位差測定用色素の発光、またはｉｉ）ミトコンドリア膜間腔からの分子の放出を決定することによって測定される。一部の実施形態では、ＢＨ３ドメインペプチド誘導型ＭＯＭＰの量は、ＦＡＣＳ、プレート蛍光定量法、蛍光イメージングまたは自動画像解析によって測定される。

一部の実施形態では、方法は、ＭＯＭＰを測定する前に細胞を固定するステップをさらに含む。一部の実施形態では、固定された細胞は、電位差測定用色素と接触する。一部の実施形態では、電位差測定用色素は、５，５’，６，６’−テトラクロロ−１，１’，３，３’−テトラエチルベンゾイミダゾリルカルボシアニンヨージド（ＪＣ−１）、ジヒドロローダミン１２３、テトラメチルローダミンメチルエステル（ＴＭＲＭ）またはテトラメチルローダミンエチルエステル（ＴＭＲＥ）である。

一部の実施形態では、固定された細胞は、ＭＯＭＰを測定するためにチトクロームＣ、ＳＭＡＣ／Ｄｉａｂｌｏ、Ｏｍｉ、アデニル酸キナーゼ−２またはアポトーシス誘導因子に対する抗体と接触する。一部の実施形態では、固定された細胞は、例えば、ＭＯＭＰ後のミトコンドリア位置の対比測定として、ＭＯＭＰによって放出されないＴｏｍ２０またはＶＤＡＣなどのミトコンドリア抗原に対する抗体と接触する。

一部の実施形態では、ＢＨ３ドメインペプチドは、ＢＩＤ、ＢＩＭ、ＢＡＤ、ＮＯＸＡ、ＰＵＭＡ、ＢＭＦ、またはＨＲＫポリペプチドのＢＨ３ドメインに由来する。

一部の実施形態では、ＢＨ３ドメインペプチドは、配列番号１〜１５からなる群より選択される。一部の実施形態では、試験作用因子は治療剤である。一部の実施形態では、試験治療剤は化学療法剤である。

一部の実施形態では、細胞は初代ヒト腫瘍細胞である。一部の実施形態では、細胞は患者由来異種移植片（ＰＤＸ）から得られる。一部の実施形態では、細胞は培養ヒト細胞である。一部の実施形態では、細胞は初代動物腫瘍細胞である。一部の実施形態では、細胞は、ヒトまたは動物組織に由来する健康な細胞である。一部の実施形態では、方法は、複数の試験作用因子を用いて繰り返される。

一部の態様では、本開示は、試験治療剤およびＢＨ３ドメインペプチドを含むマルチウェルプレートであって、各ウェルが、接着性作用因子でコーティングされている、マルチウェルプレートを提供する。

一部の実施形態では、ＢＨ３ドメインペプチドは、ＢＩＤ、ＢＩＭ、ＢＡＤ、ＮＯＸＡ、ＰＵＭＡ、ＢＭＦ、またはＨＲＫポリペプチドのＢＨ３ドメインに由来する。一部の実施形態では、ＢＨ３ドメインペプチドは、配列番号１〜１５からなる群より選択される。一部の実施形態では、試験治療剤は化学療法剤である。一部の実施形態では、接着性作用因子は細胞外マトリックス（ＥＣＭ）タンパク質である。一部の実施形態では、ＥＣＭタンパク質は、コラーゲン１、ラミニン、コラーゲン４およびフィブロネクチンからなる群より選択される。一部の実施形態では、接着性作用因子は抗体である。

一部の態様では、本開示は、本開示によって記載されるマルチウェルプレートを含むキットであって、ＢＨ３プロファイリング緩衝液を収容するバイアルおよび治療剤に対する細胞の感受性を予測するためにキットを使用するための指示をさらに含むキットを提供する。

図１は、ハイスループットダイナミックＢＨ３プロファイリングのための方法の一実施形態を示す。患者からの腫瘍を解離させて単一細胞懸濁物にし、３８４ウェルプレートに分配する。細胞を薬物で４〜７２時間処理し、次にＢＨ３プロファイルに供する。チトクロームｃの相対的消失（デルタプライミング（ｄｅｌｔａ ｐｒｉｍｉｎｇ））は、この薬物が細胞をアポトーシスへと感作し、個別化化学療法または臨床状況でのさらなる評価のための化合物を提示し得ることを示す。

図２は、３８４ウェルプレート中において生存細胞から培地を低残留体積（５μＬ未満）で吸引および洗浄する効果を示す。いくつかの結腸がん細胞を組織培養処理済みプレート上に蒔き、１日後に細胞はハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）ＢＨ３プロファイリングを受けた。洗浄後に維持される細胞もあれば、消失する細胞もあることに留意されたい。これは、低残留体積でプレート洗浄装置を使用する周知の問題である。細胞をチトクロームｃ抗体で染色する。

図３は、膵臓がん細胞株におけるチトクロームｃ消失の用量応答曲線を示す。ＳＵ８６．８６膵臓がん細胞株を、用量を増加させた合成Ｂｉｍペプチドで処理した。細胞をＤＮＡ色素（Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２）および抗チトクロームｃ抗体で染色した。より高い濃度のペプチドでチトクロームｃの漸進性の消失が起こった。個々の細胞からのチトクロームｃの消失を定量した結果、３つ組のウェルの標準偏差を表すエラーバー付きの用量応答曲線が得られた。本実験に２×濃縮ＭＥＢ緩衝液を使用した。

図４は、いくつかの膵臓がん細胞株についてのＨＴＳ ＢＨ３プロファイルの結果およびＦＡＣＳ ＢＨ３プロファイルの結果の比較を示す。ハイスループット顕微鏡法アッセイのＥＣ−５０は減少したが、相関しており、アッセイの適合性を示している。

図５Ａ〜５Ｂは、結腸ＰＤＸ腫瘍から新鮮単離された細胞のＨＴＳ ＢＨ３プロファイルを示す。図５Ａは、ダイナミックＢＨ３プロファイリング後の結腸腫瘍の４×画像を示す。薬物処理およびＢＨ３プロファイルの後、ミトコンドリアを表示するために細胞を抗チトクロームｃおよびＥｐＣａｍで染色した。図５Ｂは、結腸ＰＤＸ腫瘍の用量応答像および曲線を示す。図５Ｂ（上）では、細胞を抗チトクロームｃ（図示）で染色し、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２（図示せず）およびＴｏｍ２０ミトコンドリア対比染色（図示せず）でも染色する。図５Ｂ（下）では、チトクロームｃおよびＴｏｍ２０の蛍光強度を相関させることによってチトクロームｃ消失の用量応答曲線を計算する。

図６は、一次ヒトＣＬＬ腫瘍のＨＴＳ ＢＨ３プロファイルを示す。チトクロームｃのペプチド誘導型消失を、チトクロームｃのシグナルの消失によって示す。下は、チトクロームｃの消失の用量応答曲線である。

図７は、ＤＭＳＯで２４時間模擬処理され、次にＢＨ３プロファイルを受けたマウスＭＭＴＶ腫瘍から新鮮単離された細胞のＢＨ３プロファイル後のチトクロームｃの消失のウェル全体像を示す。

図８Ａ〜８Ｄは、他の目的の非腫瘍細胞からの目的のヒト腫瘍細胞の分染を示す。図８Ａは、ハイスループットダイナミックＢＨ３プロファイリング（ＨＴ−ＤＢＰ）後の腫瘍細胞（８９０２細胞）および他の非腫瘍マウス細胞（Ｂａｘ／Ｂａｋ ＤＫＯ ＭＥＦ）を示す。８９０２腫瘍細胞はＭＯＭＰを受け、一方でＢａｘ／Ｂａｋ ＤＫＯ細胞はチトクロームｃを失わなかった。ヒトＥｐＣａｍの染色に基づき８９０２腫瘍細胞を特定した。図８Ｂは、図８Ａの定量である。図８Ｃは、ＨＴ−ＤＢＰ後に膵臓患者由来異種移植片から新鮮単離された細胞を示す。膵臓腫瘍細胞は腫瘍マーカーＥｐＣａｍでマークされ、一方で他の細胞はＥｐＣａｍでマークされない。図８Ｄは、ＨＴ−ＤＢＰを使用した膵臓患者由来異種移植片（ＰＣＡ１９）およびウェル内の細胞の全て（全細胞）のＢＨ３ペプチドの用量応答を示す。膵臓腫瘍細胞だけを分析するとき、用量応答曲線がシフトしたことに留意されたい。 図８Ａ〜８Ｄは、他の目的の非腫瘍細胞からの目的のヒト腫瘍細胞の分染を示す。図８Ａは、ハイスループットダイナミックＢＨ３プロファイリング（ＨＴ−ＤＢＰ）後の腫瘍細胞（８９０２細胞）および他の非腫瘍マウス細胞（Ｂａｘ／Ｂａｋ ＤＫＯ ＭＥＦ）を示す。８９０２腫瘍細胞はＭＯＭＰを受け、一方でＢａｘ／Ｂａｋ ＤＫＯ細胞はチトクロームｃを失わなかった。ヒトＥｐＣａｍの染色に基づき８９０２腫瘍細胞を特定した。図８Ｂは、図８Ａの定量である。図８Ｃは、ＨＴ−ＤＢＰ後に膵臓患者由来異種移植片から新鮮単離された細胞を示す。膵臓腫瘍細胞は腫瘍マーカーＥｐＣａｍでマークされ、一方で他の細胞はＥｐＣａｍでマークされない。図８Ｄは、ＨＴ−ＤＢＰを使用した膵臓患者由来異種移植片（ＰＣＡ１９）およびウェル内の細胞の全て（全細胞）のＢＨ３ペプチドの用量応答を示す。膵臓腫瘍細胞だけを分析するとき、用量応答曲線がシフトしたことに留意されたい。

図９は、ＨＴＳダイナミックＢＨ３プロファイルによって得られたデータセットを示す。膵臓がん細胞株（ＳＵ８６．８６）を異なる薬物で２４および７２時間処理して、２４時間目にプライミングを増加させる薬物を見出し、どのようにこれを７２時間での細胞死と比較するかを見出した。２４時間処理した細胞にＢＨ３プロファイリングを施して、アポトーシスについて細胞をプライミングした分子を特定した。残留した生存細胞の数を反映させるために、７２時間処理した細胞を計数した。１回の実験でデータを生成した。

図１０Ａおよび１０Ｂは、化学化合物ライブラリーを使用したマウスＭＭＴＶ−ＰｙＭＴ腫瘍由来がん細胞株に対するＨＴＳ ＢＨ３プロファイリングアッセイの再現性を示す。図１０Ａおよび図１０Ｂのそれぞれに、同じ腫瘍に関する技術的反復を示す。各点は、単一の化学化合物による処理を表す。 図１０Ａおよび１０Ｂは、化学化合物ライブラリーを使用したマウスＭＭＴＶ−ＰｙＭＴ腫瘍由来がん細胞株に対するＨＴＳ ＢＨ３プロファイリングアッセイの再現性を示す。図１０Ａおよび図１０Ｂのそれぞれに、同じ腫瘍に関する技術的反復を示す。各点は、単一の化学化合物による処理を表す。

図１１Ａ〜１１Ｃは、いくつかの膵臓がん細胞株にわたる２×緩衝液濃度を用いたＢｉｍペプチドに対する応答の例を示す。細胞を抗チトクロームｃ抗体およびＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２色素で染色した。図１１Ａは、２×緩衝液中の０μＭ Ｂｉｍペプチド（上）および２×緩衝液中の１００μＭ Ｂｉｍペプチド（下）に対する、ＲＰＭＩ中で培養されたＹＡＰＣ、Ｐａｎｃ０２．０３およびＳＵ８６．８６細胞の応答を示す。図１１Ｂは、２×緩衝液中の０μＭ Ｂｉｍペプチド（上）および２×緩衝液中の１００μＭ Ｂｉｍペプチド（下）に対するＨＰＡＣ、Ｐａｔｕ８９８８ＴおよびＰａｔｕ８９０２膵臓がん細胞の応答を示す。ＨＰＡＣおよびＰａｔｕ８９８８Ｔ細胞をＲＰＭＩ中で培養し、Ｐａｔｕ８９０２細胞をＤＭＥＭ中で培養した。図１１Ｃは、２×緩衝液中の０μＭ Ｂｉｍペプチド（上）および２×緩衝液中の１００μＭ Ｂｉｍペプチド（下）に対するＢｘＰｃ３、Ｐａｎｃ０４．０３およびＡＳＰＣ−１膵臓がん細胞の応答を示す。ＢｘＰｃ３細胞をＤＭＥＭ中で培養し、Ｐａｎｃ０４．０３およびＡＳＰＣ−１細胞をＲＰＭＩ中で培養した。２×緩衝液中の１００μＭ Ｂｉｍペプチドを用いた全ての膵臓がん細胞株の処理を図１１Ａ〜１１Ｃに示すが、この処理の結果、蛍光顕微鏡法によって測定されるように、チトクロームｃの消失が生じた。 図１１Ａ〜１１Ｃは、いくつかの膵臓がん細胞株にわたる２×緩衝液濃度を用いたＢｉｍペプチドに対する応答の例を示す。細胞を抗チトクロームｃ抗体およびＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２色素で染色した。図１１Ａは、２×緩衝液中の０μＭ Ｂｉｍペプチド（上）および２×緩衝液中の１００μＭ Ｂｉｍペプチド（下）に対する、ＲＰＭＩ中で培養されたＹＡＰＣ、Ｐａｎｃ０２．０３およびＳＵ８６．８６細胞の応答を示す。図１１Ｂは、２×緩衝液中の０μＭ Ｂｉｍペプチド（上）および２×緩衝液中の１００μＭ Ｂｉｍペプチド（下）に対するＨＰＡＣ、Ｐａｔｕ８９８８ＴおよびＰａｔｕ８９０２膵臓がん細胞の応答を示す。ＨＰＡＣおよびＰａｔｕ８９８８Ｔ細胞をＲＰＭＩ中で培養し、Ｐａｔｕ８９０２細胞をＤＭＥＭ中で培養した。図１１Ｃは、２×緩衝液中の０μＭ Ｂｉｍペプチド（上）および２×緩衝液中の１００μＭ Ｂｉｍペプチド（下）に対するＢｘＰｃ３、Ｐａｎｃ０４．０３およびＡＳＰＣ−１膵臓がん細胞の応答を示す。ＢｘＰｃ３細胞をＤＭＥＭ中で培養し、Ｐａｎｃ０４．０３およびＡＳＰＣ−１細胞をＲＰＭＩ中で培養した。２×緩衝液中の１００μＭ Ｂｉｍペプチドを用いた全ての膵臓がん細胞株の処理を図１１Ａ〜１１Ｃに示すが、この処理の結果、蛍光顕微鏡法によって測定されるように、チトクロームｃの消失が生じた。 図１１Ａ〜１１Ｃは、いくつかの膵臓がん細胞株にわたる２×緩衝液濃度を用いたＢｉｍペプチドに対する応答の例を示す。細胞を抗チトクロームｃ抗体およびＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２色素で染色した。図１１Ａは、２×緩衝液中の０μＭ Ｂｉｍペプチド（上）および２×緩衝液中の１００μＭ Ｂｉｍペプチド（下）に対する、ＲＰＭＩ中で培養されたＹＡＰＣ、Ｐａｎｃ０２．０３およびＳＵ８６．８６細胞の応答を示す。図１１Ｂは、２×緩衝液中の０μＭ Ｂｉｍペプチド（上）および２×緩衝液中の１００μＭ Ｂｉｍペプチド（下）に対するＨＰＡＣ、Ｐａｔｕ８９８８ＴおよびＰａｔｕ８９０２膵臓がん細胞の応答を示す。ＨＰＡＣおよびＰａｔｕ８９８８Ｔ細胞をＲＰＭＩ中で培養し、Ｐａｔｕ８９０２細胞をＤＭＥＭ中で培養した。図１１Ｃは、２×緩衝液中の０μＭ Ｂｉｍペプチド（上）および２×緩衝液中の１００μＭ Ｂｉｍペプチド（下）に対するＢｘＰｃ３、Ｐａｎｃ０４．０３およびＡＳＰＣ−１膵臓がん細胞の応答を示す。ＢｘＰｃ３細胞をＤＭＥＭ中で培養し、Ｐａｎｃ０４．０３およびＡＳＰＣ−１細胞をＲＰＭＩ中で培養した。２×緩衝液中の１００μＭ Ｂｉｍペプチドを用いた全ての膵臓がん細胞株の処理を図１１Ａ〜１１Ｃに示すが、この処理の結果、蛍光顕微鏡法によって測定されるように、チトクロームｃの消失が生じた。

図１２Ａ〜１２Ｂは、いくつかの緩衝液濃度で０μＭ Ｂｉｍペプチドまたは１００μＭ Ｂｉｍペプチドのいずれかを用いた膵臓がん細胞株の処理を示す。図１２Ａは、８９０２細胞を示す。図１２Ｂは、８９８８Ｔ細胞を示す。細胞を抗チトクロームｃ抗体およびＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２色素で染色した。２×、３×、４×または５×緩衝液濃度を用いた処理からのデータを示す。３×、４×、および５×で０μＭ Ｂｉｍペプチドを用いた細胞の処理の結果、蛍光顕微鏡法により測定されるように、チトクロームｃの非特異的消失が生じたが、これは、これらの緩衝液濃度で不十分なアッセイ品質であることを示す。チトクロームｃのペプチド誘導型消失は、２×緩衝液の濃度で生じた。 図１２Ａ〜１２Ｂは、いくつかの緩衝液濃度で０μＭ Ｂｉｍペプチドまたは１００μＭ Ｂｉｍペプチドのいずれかを用いた膵臓がん細胞株の処理を示す。図１２Ａは、８９０２細胞を示す。図１２Ｂは、８９８８Ｔ細胞を示す。細胞を抗チトクロームｃ抗体およびＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２色素で染色した。２×、３×、４×または５×緩衝液濃度を用いた処理からのデータを示す。３×、４×、および５×で０μＭ Ｂｉｍペプチドを用いた細胞の処理の結果、蛍光顕微鏡法により測定されるように、チトクロームｃの非特異的消失が生じたが、これは、これらの緩衝液濃度で不十分なアッセイ品質であることを示す。チトクロームｃのペプチド誘導型消失は、２×緩衝液の濃度で生じた。

図１３Ａ〜１３Ｂは、いくつかの緩衝液濃度で０μＭ Ｂｉｍペプチドまたは１００μＭ Ｂｉｍペプチドのいずれかを用いた膵臓がん細胞株の処理を示す。図１３Ａは、ＦＡＣＳデータを示す。図１３Ｂは、ＦＡＣＳデータのヒストグラムを示す。細胞を抗チトクロームｃ抗体で染色した。２×、３×、４×または５×緩衝液濃度を用いた処理からのデータを示す。２×および３×濃度の緩衝液の１００μＭ Ｂｉｍペプチドを用いた細胞の処理の結果、チトクロームｃ陽性細胞集団のペプチド誘導型の減少が生じた。

図１４は、不良な細胞付着のハイスループット顕微鏡法のＢＨ３像に対する効果を示す。結腸がんＰＤＸから単離した細胞を、組織培養処理済みの細胞表面に置いたが、接着しなかった。ウェル中で洗浄したために細胞はウェルの側方に移った。

図１５は、結腸がんおよび膵臓がん患者由来異種移植片からの腫瘍細胞が、異なる細胞外マトリックスでコーティング済みの表面に貼り付いたことを示す。Ｃ１はコラーゲン１であり；Ｃ４はコラーゲン４であり；Ｌはラミニンであり；Ｆはフィブロネクチンであり；マトリゲルは組成不明のＥＣＭタンパク質の混合物である。

図１６は、ＢＨ３プロファイルの間に一次卵巣腹水がＥｐＣａｍコーティング済みプレートに貼り付いたが、ニュートラアビジンコーティング済みプレート、アミンプレート、組織培養処理済みプレート、またはポリ−ｌ−リシンプレートに貼り付かなかったことを示す。細胞をＤＮＡ色素Ｈｏｅｃｈｅｓｔ ３３３４２で染色する。

図１７は、一次ＣＬＬ腫瘍がＣＤ１９コーティング済みプレート、アミンプレート、組織培養処理済みプレート、またはポリ−ｌ−リシンプレートに貼り付いたことを示す。細胞をＤＮＡ色素Ｈｏｅｃｈｅｓｔ ３３３４２で染色する。

図１８Ａ〜１８Ｃは、細胞わずか１００個を用いて様々な程度のノイズでＨＴ−ＤＢＰを行うことができることを示す。ここで、ウェル１個あたり異なる細胞数で膵臓細胞株を蒔き、ハイスループットＢＨ３プロファイルに供した。図１８Ａは、異なる細胞数でＢｉｍペプチドの用量応答を示す。図１８Ｂは、図１８ＡからのＢｉｍペプチドの用量応答の最大プラトーを示す。図１８Ｃは、アッセイのノイズの尺度としての、Ｂｉｍの用量応答の最大プラトーの標準偏差を示す。図１８Ｃからのノイズ測定に基づき全ての細胞数で用量応答を観測することが可能であるものの、ＨＴ−ＤＢＰは細胞５００個またはそれ超で最適であることに留意されたい。

図１９Ａおよび１９Ｂは、予備ＢＨ３プロファイルがＭＭＴＶ−ＰｙＭＴマウス乳腺腫瘍から単離された腫瘍細胞を使用するＨＴ−ＤＢＰのために使用された単一で正しいペプチド濃度を特定したことを示す。多くの腫瘍について、アポトーシス性プライミングは予備決定されない。これには、凍結させることができない腫瘍が含まれる。これらの場合、ＨＴ−ＤＢＰに必要な最小細胞数を減少させるためのＨＴ−ＤＢＰを行うために理想的なペプチド濃度を特定することが重要である。ＨＴ−ＤＢＰ予備プロファイルおよび４時間隔てて行われたＢＨ３プロファイルにより、同様のレベルのアポトーシス性プライミングがもたらされたことが見出された。

図２０Ａ〜２０Ｃは、化学化合物ライブラリーを使用したＭＭＴＶ−ＰｙＭＴマウス腫瘍のＨＴ−ＤＢＰを示す。図２０Ａは、技術的反復を示す。図２０Ｂは、アポトーシス性プライミング（ｘ軸）を増加させた化合物を示す。ｙ軸に細胞計数も示す。図２０Ｃは、アポトーシス性プライミングを増加させたまたは増加させなかった化合物のいくつかの画像を示す。 図２０Ａ〜２０Ｃは、化学化合物ライブラリーを使用したＭＭＴＶ−ＰｙＭＴマウス腫瘍のＨＴ−ＤＢＰを示す。図２０Ａは、技術的反復を示す。図２０Ｂは、アポトーシス性プライミング（ｘ軸）を増加させた化合物を示す。ｙ軸に細胞計数も示す。図２０Ｃは、アポトーシス性プライミングを増加させたまたは増加させなかった化合物のいくつかの画像を示す。

図２１は、一次卵巣腹水腫瘍に対する選ばれた数の薬物に関するハイスループットダイナミックＢＨ３プロファイルの例を示す。より大きなデルタプライミングを引き起こした薬物は、化学感受性を増加させる見込みがある薬物である。棒線３および７（左から）は、類似の作用機作を有する薬物を示す。棒線３４、４０、および４２（左から）は、類似の作用機作を有する薬物を示す。

図２２は、ＣＬＬ腫瘍に対する選ばれた数の薬物に関するハイスループットダイナミックＢＨ３プロファイルの例を示す。より大きなデルタプライミングを引き起こした薬物は、化学感受性を増加させる見込みがある薬物である。エラーバーは、標準偏差を表す。

ダイナミックＢＨ３プロファイリングは、試験化合物または治療法に対する細胞の感受性を測定するために使用される技法である。この技法は、以前にＷＯ２０１４／０４７，３４２に記載されており、その内容は、参照により本明細書に組み込まれる。ダイナミックＢＨ３プロファイリングは、標的細胞をプログラム細胞死により近づける新薬の特定を可能にする。この技法は、患者のためになる見込みが最も高い治療薬の特定を可能にするので、個別化医療にも使用することができる。

以前に記載されたダイナミックＢＨ３プロファイリングの方法では、細胞は、典型的に血清を含有する培養培地の存在下で薬物で処理された。細胞は、薬物で処理された後、次に培養培地から分離され、細胞をＢＨ３プロファイリング緩衝液およびアポトーシス促進性ＢＨ３ドメインペプチドと接触させる前に洗浄された。血清を含む細胞培養培地の存在は、ＢＨ３ペプチドがミトコンドリア外膜透過化を誘導する能力を妨害すると予想されたので、この分離ステップが必要であった。加えて、細胞を表面（例えばアッセイプレート）に付着させることのＢＨ３プロファイルに対する効果は未知であり、細胞に対するペプチドの効果を減少させると仮定された。したがって、以前に記載された技法は、細胞をアポトーシス促進性ＢＨ３ドメインペプチドに曝露する前に細胞を分離および洗浄することを含んでいた。これらの追加的な分離ステップおよび洗浄ステップは、工程を骨の折れるものにし、ヒト作業者の取り扱いを相当量伴っており、それにより、アッセイにおける誤りのリスクを増加させた。加えて、工程は、分離ステップおよび洗浄ステップの間の材料損失のために多数の細胞を要した。これらの制限は、いくつかの物流上の障壁を課し、個別化医療にまたは薬物スクリーニングツールとして使用することができる自動化またはハイスループット法に工程の規模を調整する（ｓｃａｌｅ）ことを困難にした。

本発明は、部分的に、細胞培養培地、塩類溶液（例えばＰＢＳ）、および血清の存在が、ＢＨ３ペプチドがミトコンドリア外膜透過化を誘導する能力を妨害しないので、ダイナミックＢＨ３プロファイリングを行うために細胞を培養プレートから取り出す必要がないという驚くべき発見に基づく。その上、付着細胞を除去してしまうことが多い精力的な洗浄ステップ（例えば、細胞の上部にほとんど残留体積がない場合）は、不必要である。その代わりに、プレートのウェル中で薬物およびＢＨ３ドメインペプチドを用いて細胞を逐次的に処理することができる。これは、以前に記載されたダイナミックＢＨ３プロファイリングのプロトコールに比べて決定的な進歩に相当する。技法は、今や全自動化することができ、作業者の偏りおよび高度に矛盾するデータを招くおそれがあるヒトの取り扱いをほとんど伴わない。自動化は、以前は不可能であった大規模薬物スクリーニングのための技法を使用できるようにする。また、アッセイは、必要な細胞数がより少ない。以前に記載されたダイナミックＢＨ３プロファイリングの技法は、１つの条件あたり細胞１０００万から３０００万個の間を必要とする一方で、本発明の方法は、ウェル１個あたりわずか細胞１００個、例えばウェル１個あたりわずか細胞２５０個を使用してシグナルを測定することができる。この細胞数の少なくとも１０分の１、例えば少なくとも１００分の１の減少は、全自動化と一緒になって、一次ヒト腫瘍、患者由来異種移植片または遺伝的に操作された動物腫瘍モデルを薬物のスクリーニングに使用することを容易にする。

ダイナミックＢＨ３プロファイリングは、多様なＢＨ３プロファイリング緩衝液濃度で実施することができることも発見された。驚くことに、細胞は、より高い濃度（例えば、２×〜４×）のＢＨ３プロファイリングに耐容性を示し得ることが見出された。これは、方法をハイスループット薬物スクリーニングに適切なマイクロウェル環境で実施可能にする。

一部の態様では、本開示は、試験作用因子に対する細胞の感受性を予測する方法であって、血清を有する培養培地中、試験作用因子の存在下および非存在下で、接着性固体表面上にて細胞を培養するステップ；細胞をＢＨ３プロファイリング緩衝液およびアポトーシス促進性ＢＨ３ドメインペプチドと接触させるステップ；細胞におけるＢＨ３ドメインペプチド誘導型ミトコンドリア外膜透過化（ＭＯＭＰ）の量を測定するステップ；および試験作用因子の存在下で培養された細胞におけるＢＨ３ドメインペプチド誘導型ＭＯＭＰの量を、試験作用因子の非存在下で培養された細胞におけるＢＨ３ドメインペプチド誘導型ＭＯＭＰの量と比較するステップを含み、試験作用因子の非存在下で培養された細胞におけるＢＨ３ドメインペプチド誘導型ＭＯＭＰの量と比較した、試験作用因子の存在下で培養された細胞におけるＭＯＭＰの増加は、細胞が試験作用因子に対して感受性であることを示す、方法を提供する。

「血清を有する培養培地中、試験作用因子の存在下および非存在下で細胞を培養すること」は、試験作用因子の存在下および非存在下で細胞を適切な条件で培養して成長させることを意味する。「培養培地」（本明細書において「細胞培養培地」または「培地」とも呼ばれる）は、細胞の生存度を維持して増殖を支援する栄養素を含有する、細胞を培養するための培地である。本開示は、細胞を培養するための様々なパラメーターおよび条件を企図する。本発明は、細胞培養培地および血清の存在がダイナミックＢＨ３プロファイリングの感度に影響しないという驚くべき発見に部分的に基づく。したがって、一部の実施形態では、細胞は、血清を有する培養培地中で培養される。細胞培養培地は、以下の栄養素：塩、緩衝剤、アミノ酸、グルコースまたは他の糖、抗生物質、血清または血清代替物、およびペプチド増殖因子などの他の要素のいずれかを適切な量および組合せで含有し得る。細胞培養培地は、当技術分野において公知であり、天然培地または人工培地として分類され得る。細胞培養培地の例には、非限定的に、最小必須培地（ＭＥＭ）、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）およびロズウェルパーク記念研究所培地（ＲＰＭＩ）が含まれる。細胞を培養するために適切な培地の選択は、当業者の能力の範囲内である。

一部の細胞株（Ｃｏｌｏ２０５、ＨＣＴ１１６、ＨＴ５５）は、洗浄の間に接着しており、また一部は洗浄の間にかなりの消失を示す。この細胞消失は、低残留体積で細胞を洗浄することの公知の特徴であり、より高い残留体積で減弱する。以前は、培地または洗浄緩衝液の残留体積がある状態で、ＢＨ３プロファイリングを行うことができることも、細胞によって耐容され得るＢＨ３プロファイリング緩衝液の濃度も分かっていなかった。したがって、一部の実施形態では、細胞は、接着性固体表面上で培養される。この付着は、ＢＨ３プロファイル後の定量分析を容易にする。付着の非存在下で、細胞は消失する、またはしばしばウェルの縁に移動して定量分析を制限する。一部の実施形態では、固体表面はマルチウェルプレートである。マルチウェルプレートは、プラスチック（例えばポリスチレン）またはガラス製の可能性がある。一般的に、マルチウェルプレートは、９６、３８４または１５３６ウェルのアレイを含む。一部の実施形態では、固体表面は、表面への細胞の接着に好都合なように処理される。一部の実施形態では、表面は、コロナ放電によって処理される。あるいは、表面は、接着促進化合物で処理される場合がある。接着促進化合物には、非限定的に、ポリ−Ｄ−リシン、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、コムギ胚芽凝集素（ＷＧＡ）および細胞外マトリックスタンパク質（例えば、コラーゲン１、ラミニン、コラーゲン４およびフィブロネクチン）が含まれる。それ自体、細胞外マトリックスタンパク質を分泌する他の非がん細胞も、がん細胞と並べて表面上で培養することができる。一部の実施形態では、接着促進化合物は、細胞表面タンパク質に対する抗体である。例えば、がん細胞表面タンパク質（ＥｐＣａｍ、ＣＤ１９、ＣＤ４５など）に特異的な抗体が表面にコーティングされ、がん細胞が添加されるとがん細胞を表面に接着させる場合がある。一部の実施形態では、接着促進化合物はストレプトアビジンであり、細胞はビオチン化される。

細胞は、培養培地中において、試験作用因子が細胞をプログラム細胞死により近づけるのを可能にするために十分な、適切な条件および時間で培養される。一部の実施形態では、細胞は、オルガノイドの形態で培養される。ＢＨ３プロファイルを生成するために適切な任意の数の細胞を使用することができる。細胞数は、培養プレートのウェル１個あたりの細胞数として表現することができる。一部の実施形態では、細胞数は、ウェル１個あたり約１００個からウェル１個あたり約１００００個の間の範囲である。一部の実施形態では、細胞数は、ウェル１個あたり約１００個からウェル１個あたり約５００個の間の範囲である。一部の実施形態では、細胞数は、ウェル１個あたり約２００個からウェル１個あたり約１００００個の間の範囲である。一部の実施形態では、細胞数は、ウェル１個あたり約２５０個からウェル１個あたり約５００個の範囲である。一部の実施形態では、細胞数は、ウェル１個あたり約３００個からウェル１個あたり約７５０個の範囲である。一部の実施形態では、細胞数は、ウェル１個あたり約４００個からウェル１個あたり約６００個の範囲である。一部の実施形態では、細胞数は、ウェル１個あたり約１００、約１５０、約２００、約２５０、約３００、約３５０、約４００、約４５０、または約５００個である。適切な条件は、細胞を細胞培養インキュベーターで標準的な細胞培養条件下（例えば、相対湿度＞８０％の空気および５〜１０％ＣＯ_２という加湿雰囲気中で３７℃）で成長させることを含む。一部の実施形態では、細胞は、試験作用因子の存在下または非存在下で少なくとも３０分間、４５分間、１時間、２時間、４時間、８時間、１２時間、１６時間、２０時間、１日間、少なくとも２日間、少なくとも３日間、または少なくとも４日間培養される。

試験作用因子に対する細胞感受性は、細胞または細胞要素（例えば、ミトコンドリア）をＢＨ３プロファイリング緩衝液およびアポトーシス促進性ＢＣＬ−２ファミリーからのＢＨ３ドメインペプチドまたは直接ミトコンドリア活性を有する小型分子と接触させることによって決定される。これには、非限定的にＡＢＴ−１９９、ＡＢＴ−２６３、ＡＢＴ−７３７、ＷＥＨＩ−５３９、Ａ−１２１０４７７、およびＡＢＴ−１９９が含まれる。ＢＨ３ペプチドがミトコンドリア外膜透過化（ＭＯＭＰ）を誘導する能力は、試験作用因子に曝露された細胞（または細胞要素、例えばミトコンドリア）および試験作用因子に曝露されなかった対照細胞（または細胞要素、例えばミトコンドリア）において測定される。試験作用因子の非存在下で培養された細胞におけるＢＨ３ドメインペプチド誘導型ＭＯＭＰの量と比較して、試験作用因子の存在下で培養された細胞におけるＢＨ３ペプチド誘導型ＭＯＭＰが増加することは、細胞が試験作用因子に対して応答性である（例えば、細胞死が誘導される）ことを示す。試験作用因子の非存在下で培養された細胞におけるＢＨ３ドメインペプチド誘導型ＭＯＭＰの量と比較して、試験作用因子の存在下で培養された細胞においてＭＯＭＰが変化しないことは、薬物が細胞死の誘導に効果を有さないことを示す。試験作用因子の非存在下で培養された細胞におけるＢＨ３ドメインペプチド誘導型ＭＯＭＰの量と比較して、試験作用因子の存在下で培養された細胞においてＭＯＭＰが減少することは、試験作用因子が細胞に脱感作効果または保護効果を有することを示す。ＢＨ３ドメインペプチド誘導型細胞死に関して脱感作効果または保護効果を有する試験作用因子は、他の非がん疾患（例えば神経変性疾患）を処置するために、または化学療法誘導型毒性から異なる細胞型を保護するための併用療法として、潜在的に有用な作用因子である。

試験作用因子に曝露されていない細胞のＢＨ３ペプチド誘導型ＭＯＭＰのレベルと比較した、試験作用因子に曝露された細胞のＢＨ３ペプチド誘導型ＭＯＭＰのレベルにおける差は、統計的に有意である。統計的に有意であるということは、変化が、単なる偶然で起こると予想され得るものよりも大きいことを意味する。有意差は、適切な統計検定を使用することによって特定され得る。統計的有意性の検定は、当技術分野において周知であり、Ｐｅｔｒｕｃｃｅｌｌｉ， ＣｈｅｎおよびＮａｎｄｒａｍによるＡｐｐｌｉｅｄ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ ｆｏｒ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｓ ａｎｄ Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔｓ、１９９９年、再版に例示されている。

本明細書に使用される用語「ＢＨ３プロファイリング緩衝液」は、糖、ｐＨ緩衝剤、塩、キレート剤およびＭＯＭＰの測定を行うために有用な電子伝達鎖のための炭素源を含む水溶液を指す。一部の実施形態では、ＢＨ３プロファイリング緩衝液は、トレハロース由来実験緩衝液（ＤＴＥＢ）である。一部の実施形態では、ＢＨ３プロファイリング緩衝液はマンニトール実験緩衝液（ＭＥＢ）である。ＤＴＥＢは、１３５ｍＭトレハロース、１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、５０ｍＭ ＫＣｌ、２０μＭ ＥＧＴＡ、２０μＭ ＥＤＴＡ、０．１％ ＢＳＡおよび５ｍＭスクシネートから構成される。ＭＥＢは、１５０ｍＭマンニトール、１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、５０ｍＭ ＫＣｌ、２０μＭ ＥＧＴＡ、２０μＭ ＥＤＴＡ、０．１％ＢＳＡおよび５ｍＭスクシネートから構成される。マンニトールの代わりにスクロースおよび他の糖が使用される場合がある。ＫＣｌのいくらかの増加は耐容されるが、ＢＨ３プロファイリングに有害な可能性がある。濃縮緩衝液（２×〜５×）は、下の表１に記載されるように、上記試薬の濃度を比例的に増加させることを必要とする。

任意の特定の理論に縛られることを望むわけではないが、増加した緩衝液濃度（例えば２×〜５×緩衝液）は、血清を有する培地の存在下でＢＨ３プロファイリングを実施できるようにする。一部の実施形態では、緩衝液の濃度は、約１×から約５×の範囲である。一部の実施形態では、緩衝液の濃度は、約１×から４×の範囲である。一部の実施形態では、緩衝液の濃度は、約２×から約３×の範囲である。一部の実施形態では、緩衝液の濃度は、約１×、約２× 約３×、約４×、または約５×である。一部の実施形態では、緩衝液の濃度は、１×、２×、３×、４×、または５×である。

アポトーシス促進性ＢＣＬ−２ ＢＨ３タンパク質およびペプチドには、Ｂｃｌ−２相互作用性細胞死媒介因子（ＢＩＭ）；その変異体（ＢＩＭ ＡＶ）；ＢＨ３相互作用性ドメインデスアゴニスト（ＢＩＤ）；Ｂｃｌ−２関連死プロモーター（ＢＡＤ）；ＮＯＸＡ；アポトーシスのｐ５３アップレギュレーション型モジュレーター（ＰＵＭＡ）；Ｂｃｌ−２改変因子（ＢＭＦ）およびハラキリ（ｈａｒａｋｉｒｉ）（ＨＲＫ）が含まれる（表２参照）。

一部の実施形態では、方法は、ＢＨ３ドメインペプチドとの接触の後、その前、またはそれと同時に細胞を透過化するステップを含む。一般的に、透過化は、ミトコンドリア外膜を透過化することなしに細胞膜が透過性になるように、細胞を試薬で処理する工程を指す。透過化のために使用される試薬には、有機溶媒（例えば、アセトンおよびメタノール）およびに洗剤（例えば、ジギトニン、サポニン、トリトンＸ−１００およびＴｗｅｅｎ−２０）が含まれる。任意の特定の理論に縛られることを望むわけではないが、細胞は、ミトコンドリアへのＢＨ３ペプチドの接近を可能にするように透過化される。細胞は、当技術分野において公知の方法によって透過化される。例えば、細胞は、細胞をジギトニン、サポニン、メタノール、トリトンＸ−１００または当技術分野において認識されている他の細胞透過化剤と接触させることによって透過化される。一部の実施形態では、ＢＨ３プロファイリング緩衝液は、ジギトニンまたはサポニンなどの透過化試薬を含む。

当業者は、培養細胞に試験作用因子、ＢＨ３プロファイリング緩衝液および／またはＢＨ３ドメインペプチドを添加するためのいくつかの方法を認識している。例えば、ハイスループット薬物スクリーニングのために、一般的に自動液体取り扱いシステムが利用される。自動液体取り扱いシステムは、アッセイプレートのウェルに一定体積の液体を分配するために、ロボットアームによって制御される液体分注容器のアレイを利用する。一般的に、アレイは、９６，３８４または１５３６個の液体分注チップを含む。自動液体取り扱いシステムの非限定的な例には、デジタル分注器（例えば、ＨＰ Ｄ３００デジタル分注器）およびピンニングマシン（ｐｉｎｎｉｎｇ ｍａｃｈｉｎｅ）（例えば、ＭＵＬＴＩ−ＢＬＯＴ（商標）Ｒｅｐｌｉｃａｔｏｒ Ｓｙｓｔｅｍ、ＣｙＢｉｏ、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｊａｎｕｓ）が含まれる。本開示により非自動化方法も企図されており、それには、非限定的に、手動デジタル式繰り返しマルチチャンネルピペットが含まれる。

細胞をＢＨ３ドメインペプチドで処理した後、ミトコンドリア外膜透過化（ＭＯＭＰ）が測定される。外膜の透過化はいくつかの方式で測定することができる。例えば、外膜の透過化は、ミトコンドリア膜電位の消失を決定することによって測定することができる。ミトコンドリア膜電位の消失は、例えば電位差測定用色素または放射測定用色素（ｒａｄｉｏｍｅｔｒｉｃ ｄｙｅ）で細胞を処理することによって測定される。電位差測定用色素の例には、非限定的に、蛍光ＪＣ−１プローブ（５，５’，６，６’−テトラクロロ−１，１’，３，３’−テトラエチルベンゾイミダゾリルカルボシアニンヨージド）もしくはジヒドロローダミン１２３、またはテトラメチルローダミンメチルエステル（ＴＭＲＭ）もしくはテトラメチルローダミンエチルエステル（ＴＭＲＥ）が含まれる。これらおよび他の電位差測定用色素は、当技術分野において周知である。

あるいは、外膜の透過化は、ミトコンドリア膜間腔からの分子の放出を測定することによって決定される。ミトコンドリア膜間腔から放出される分子の例には、チトクロームｃ、ＳＭＡＣ／Ｄｉａｂｌｏ、Ｏｍｉ、アデニル酸キナーゼ−２、またはアポトーシス誘導因子（ＡＩＦ）が含まれる。ミトコンドリア膜間腔からの分子の放出は、当技術分野において周知の方法によって測定することができる。例えば、分子の放出は、分子に対する抗体、すなわち、チトクロームｃ、ＳＭＡＣ／Ｄｉａｂｌｏ、Ｏｍｉ、アデニル酸キナーゼ−２またはアポトーシス誘導因子（ＡＩＦ）に対する抗体を使用することによって測定することができる。検出は、例えば、ＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳ、免疫ブロット、免疫蛍光法、免疫組織化学法、プレート蛍光定量法、蛍光イメージングまたは自動画像解析による可能性がある。細胞の分析は、顕微鏡法を使用して手動で成し遂げることができ、または例えば核の位置を特定するためにＣｅｌｌＰｒｏｆｉｌｅｒもしくはＭｅｔａｍｏｒｐｈ画像解析ソフトウェアなどのソフトウェアを使用することによって自動化することもできる。

外膜の透過化を測定する前に、任意選択で、細胞は固定される。細胞は、アルデヒド（例えばホルムアルデヒド）またはメタノールを使用することによってなどの、当技術分野において公知の方法によって固定される。

ミトコンドリア外膜の透過化は、単一細胞レベルまたは多細胞レベルで測定することができる。追加的に、本明細書に開示の方法の一部は、細胞の亜集団をアッセイすることを可能にする。例えば、腫瘍特異的マーカーまたは腫瘍関連マーカー（例えばＥｐＣａｍ）を使用して腫瘍細胞を特定することができる。これは、正常細胞と腫瘍細胞とを識別できるようにする。次に、腫瘍細胞においてＭＯＭＰが本明細書に記載のように測定される。

一部の実施形態では、本明細書に記載の方法に使用される細胞は、がん細胞、またはがん性であることが疑われる細胞である。一部の実施形態では、細胞は、不死化がん細胞株を含む。一部の実施形態では、細胞は、不死化マウスまたはヒトがん細胞株である。一部の実施形態では、細胞は、非悪性のヒトまたはマウス初代細胞である。樹立されたがん細胞株は当技術分野において周知であり、それらには、例えば膵臓がん細胞株（例えば、ＹＡＰＣ、Ｐａｎｃ０２．０３およびＳＵ８６．８６など）、乳がん細胞株（例えば、ＡＵ５６５、ＢＴ−２０、ＣＡＬ−１２０、ＨＭＥＬおよびＫＰＬ−１など）、腎臓がん株（例えば、７６９−Ｐ、ＡＣＮＨ、ＨＥＫ ＴＥ、ＳＬＲ２０およびＵＭＲＣ２など）、骨がん細胞株（例えば、ＣＡＬ−７８、ＨＯＳ、ＭＧ−６３およびＳＫ−ＥＳ−１など）およびリンパ系がん細胞株（例えば、ＡＭＬ−１９３、ＢＤＣＭ、ＣＭＬ−Ｔ１およびＪＭ１など）が含まれる。当業者は、他のがん細胞株、例えばＢａｒｒｅｔｉｎａら（Ｔｈｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｅｎａｂｌｅｓ ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ ｍｏｄｅｌｌｉｎｇ ｏｆ ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ ｄｒｕｇ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ．Ｎａｔｕｒｅ．２０１２年３月２８日；４８３巻（７３９１号）：６０３〜７頁。ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１１００３）に開示されているものを認識している。一部の実施形態では、細胞は被験体に由来する。例えば、がん細胞は、外科的技法（例えば、生検）によって被験体から単離される場合がある。したがって、一部の実施形態では、細胞は初代腫瘍細胞、例えば初代ヒト腫瘍細胞である。一部の実施形態では、細胞は、培養ヒト細胞である。一部の実施形態では、細胞は初代動物腫瘍細胞である。一部の実施形態では、細胞は、患者由来異種移植片（ＰＤＸ）を含む。本明細書に使用される用語「患者由来異種移植片」（ＰＤＸ）は、免疫不全マウスへのがん性一次腫瘍の移植によって生成した組織を指す。

接着性固体表面上で細胞を培養することを含む方法に、非がん性細胞を使用することもできる。一部の実施形態では、非がん性細胞は、健常細胞（例えば、いかなる明白なまたは潜伏した病的状態も有さない細胞）である。一部の実施形態では、非がん性細胞は、感染作用因子、例えばウイルスまたは細胞内細菌に感染している。一部の実施形態では、非がん性細胞は、その他の点では正常に機能していない器官からのものである。一部の実施形態では、非がん性細胞は、ストレス、例えばとりわけ低酸素、卒中、心筋梗塞などの血管ストレスを受けやすい。一部の実施形態では、細胞は、ヒトまたは動物組織に由来する健康な細胞である。例えば、本明細書に提供されるＢＨ３プロファイリングアッセイに、例えば、ＢＨ３ドメインペプチド誘導型細胞死に対して保護効果を示す作用因子を特定するために、血清を有する培養培地中、接着性固体表面にて細胞を培養することを伴うアッセイに、非がん性細胞を使用することができ、そのような作用因子は、神経変性疾患の間に細胞死のプライミングを低下させるために有用であり得る。別の実施形態では、マウスが特定の作用因子で処置され、次に屠殺される場合がある。作用因子が毒性効果を有するかどうかを特定するために、例えば、接着性固体表面上で細胞を培養することを伴う、本開示によるハイスループットＢＨ３プロファイリングがマウスの組織に行われる場合がある。あるいは、正常な一次組織に対して薬物の毒性スクリーニングを行うために、例えば、接着性固体表面上で細胞を培養することを伴う、本開示によるハイスループットＢＨ３プロファイリングが正常細胞のパネルに対して実施される場合がある。例えば、接着性固体表面上で細胞を培養することを伴う、本開示による正常細胞のＢＨ３プロファイリングは、環境中の毒性作用因子（例えば、放射線、ガス、生物学的作用因子など）の存在について試験するためにも有用であり得る。

本明細書に使用される「被験体」は、好ましくは哺乳動物である。哺乳動物は、例えば、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ、またはウシである。一部の実施形態では、被験体は、遺伝的に改変された動物である。例えば、特定のがんを発生するようにマウスを遺伝的に操作することができる。一部の実施形態では、被験体は、以前にがんを有すると診断されており、すでにがんの処置を受けている可能性がある。あるいは、一部の実施形態では、被験体は、以前にがんを有すると診断されていない。

本開示による例示的な試験作用因子には、非限定的に、小型有機分子、小型無機分子、ペプチド、タンパク質、タンパク質類似体、酵素、核酸、核酸類似体、抗体、抗原、ホルモン、脂質、多糖、増殖因子、ウイルス、細胞、生物活性剤、薬学的薬剤、ならびにそれらの組合せおよびプロドラッグが含まれる。一部の実施形態では、試験作用因子は、化学療法剤などの抗がん剤である。さらなる例示的な試験作用因子には、非限定的に、ガス、微粒子、放射線、電磁放射線、およびエアロゾルが含まれる。

小型分子化学療法剤の例には、アルキル化剤（シクロホスファミド、クロルメチン、テモゾロミド）、アントラサイクリン（ダウノルビシン、ドキソルビシン、ミトキサントロン）、タキサン（パクリタキセル、ドセタキセル）、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤（ボリノスタット、ロミデプシン）、トポイソメラーゼＩ／ＩＩ阻害剤（イリノテカン、トポテカン、エトポシド）、キナーゼ阻害剤（ゲフィチニブ、イマチニブ、ボルテゾミブ）、ヌクレオチド類似体および前駆体類似体（アザシチジン、フルオロウラシル、メトトレキセート）、白金系薬剤（シスプラチン、カルボプラチン）、レチノイド（アリトレチノイン、ベキサロテン）ならびにビンカアルカロイド（ビンブラスチン、ビンデシン、ビノレルビン）が含まれる。ペプチドおよびタンパク質の例には、ブレオマイシン、ダクチノマイシン、抗腫瘍抗体（抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ、アレムツズマブ、トラスツズマブ、ブレンツキシマブ）が含まれる。当業者は、がんに関係する遺伝子の発現を標的化するＲＮＡｉ分子としての化学療法ＲＮＡｉ分子を認識している。例えば、ＨｏｘＡ１に対するＲＮＡｉ分子は、Ｂｒｏｃｋら、Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ ６巻２１７ｒａ２頁（２０１４年）によって開示されたように、乳腺腫瘍細胞の形成を阻害することができる。一部の実施形態では、化学療法剤には、非限定的に、キナーゼ阻害剤、アポトーシス誘導因子、血管新生阻害剤、およびモノクローナル抗体が含まれる。

一部の態様では、本開示は、個別化医療に関する。一部の実施形態では、本明細書に記載の方法は、化学療法レジメンのカスタマイズに有用である。例えば、公知の化学療法剤のパネルに対するがんの感受性を決定するために、がんを有する被験体から単離されたがん細胞に対してハイスループットＢＨ３プロファイリングを行うことができる。化学療法剤には、非限定的に、キナーゼ阻害剤、アポトーシス誘導因子、血管新生阻害剤、およびモノクローナル抗体が含まれる。

一部の態様では、本開示は創薬に関する。一部の実施形態では、本開示によって記載される方法は、細胞をプログラム細胞死により近づける新薬を特定するために試験作用因子の大型ライブラリーをスクリーニングするために有用である。

アポトーシス促進性ＢＣＬ−２ ＢＨ３ドメインペプチド
アポトーシス促進性ＢＣＬ−２ ＢＨ３ドメインペプチドは、以前にＷＯ２０１４／０４７，３４２に記載されており、その内容は、参照により本明細書に組み込まれる。特に、アポトーシス促進性ＢＣＬ−２ ＢＨ３ドメインペプチドは１９５アミノ酸長未満であり、例えば、１５０、１００、７５、５０、３５、２５または１５アミノ酸長未満またはそれと等しい。アポトーシス促進性ＢＣＬ−２ ＢＨ３ペプチドの非限定的な例には、Ｂｃｌ−２相互作用性細胞死媒介因子（ＢＩＭ）；その変異体（ＢＩＭ ＡＶ）；ＢＨ３相互作用性ドメインデスアゴニスト（ＢＩＤ）；Ｂｃｌ−２関連死プロモーター（ＢＡＤ）；ＮＯＸＡ；アポトーシスのｐ５３アップレギュレーション型モジュレーター（ＰＵＭＡ）；Ｂｃｌ−２改変因子（ＢＭＦ）およびハラキリ（ＨＲＫ）が含まれる。

一部の実施形態では、アポトーシス促進性ＢＣＬ−２ ＢＨ３ドメインペプチドは、表２に示される配列番号１〜１５の配列を含む。ＰＵＭＡ２Ａ（配列番号１６）は、陰性対照ペプチドである。

一部の実施形態では、ＢＨ３ドメインペプチドは、配列ＮＨ_２−ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＬＸＸＸＸＤＸＸＸＸ−ＣＯＯＨ（配列番号１７）を（全体的または部分的に）含むペプチドを含む。本明細書に使用されるＸは、任意のアミノ酸であり得る。あるいは、ＢＨ３ドメインペプチドは、配列番号１７の少なくとも５、６、７、８、９、１５個またはそれを超えるアミノ酸を含む。

ＢＨ３ドメインペプチドは、標準的な改変を使用して改変することができる。改変は、アミノ（Ｎ−）末端、カルボキシ（Ｃ−）末端、内部、または前述のいずれかの組合せで起こり得る。本明細書に記載の一態様では、ポリペプチドに１種類を超える改変があり得る。改変には、非限定的に、アセチル化、アミド化、ビオチン化、シンナモイル化、ファルネシル化、ホルミル化、ミリストイル化、パルミトイル化、リン酸化（Ｓｅｒ、ＴｙｒまたはＴｈｒ）、ステアロイル化、スクシニル化、スルフリル化および環化（ジスルフィド架橋またはアミド環化を介する）、ならびにＣｙｓ３またはＣｙｓ５による改変が含まれる。改変されたＢＨ３ドメインペプチドは、ＢＨ３ドメインペプチドの生物学的活性を保持する。生物学的活性を保持することにより、必ずしも天然に存在するＢＨ３ドメインポリペプチドと同じレベルの効力ではないにしろ、ＢＨ３ポリペプチドによって細胞死が誘導されることを意味する。誘導されるおよび刺激されるという用語は、本明細書全体にわたり互換的に使用される。

任意選択で、ＢＨ３ドメインペプチドは、形質導入ドメインに付着される。形質導入ドメインは、それが存在するペプチドを所望の細胞の目的地に方向付ける。したがって、形質導入ドメインは、ペプチドが形質膜を横切るように、例えば細胞外から形質膜を通過して細胞質に入るように方向付けることができる。代替的または追加的に、形質導入ドメインは、ペプチドを細胞内の所望の位置、例えば核、リボソーム、ＥＲ、ミトコンドリア、リソソーム、またはペルオキシソームに方向付けることができる。一部の実施形態では、形質導入ドメインは、公知の膜トランスロケーション配列に由来する。あるいは、形質導入ドメインは、ポリエチレングリコール、コレステロール部分、オクタン酸およびデカン酸などの、膜取込みを促進することが公知の化合物である。形質導入ドメインは、ＢＨ３ドメインペプチドのＮ末端またはＣ末端のいずれかに連結される場合がある。

ＢＨ３ドメインペプチドおよび／または形質導入ドメインペプチドは、Ｌ−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸、または両方の組合せのポリマーであり得る。あるいは、ＢＨ３ドメインペプチドおよび／または形質導入ドメインペプチドは、環状ペプチドである。環状ペプチドは、当技術分野において公知の方法によって調製される。例えば大環状化は、多くの場合にペプチドＮ末端とＣ末端との間、側鎖とＮ末端もしくはＣ末端との間［例えば、ｐＨ８．５でＫ３Ｆｅ（ＣＮ）６を用いる］（Ｓａｍｓｏｎら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、１３７巻：５１８２〜５１８５頁（１９９６年））、または２つのアミノ酸側鎖の間にアミド結合を形成することによって成し遂げられる。例えば、ＤｅＧｒａｄｏ、Ａｄｖ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｈｅｍ、３９巻：５１〜１２４頁（１９８８年）を参照されたい。

ＢＨ３ドメインペプチドおよび／または形質導入ドメインペプチドは、現代のクローニング技法を使用して調製される、または固体法もしくは部位特異的変異誘発によって合成され得る。一部の実施形態では、ネイティブなＢＨ３ドメインペプチドおよび／または形質導入ドメインペプチドは、標準的なタンパク質精製技法を使用した適切な精製スキームによって細胞または組織供給源から単離することができる。別の実施形態では、ＢＨ３ドメインポリペプチドおよび／または形質導入ドメインペプチドは、組換えＤＮＡ技法によって産生される。組換え発現の代わりに、ＢＨ３ドメインペプチドおよび／または形質導入ドメインペプチドは、標準的なペプチド合成技法を使用して化学合成することができる。

様々な実施形態では、ＢＨ３ペプチドは、その二次構造、例えばα−ヘリックス構造を維持する。ヘリックスの安定化方法は、当技術分野において公知である。

「単離された」または「精製された」ＢＨ３ドメインペプチドは、ＢＨ３ドメインペプチドが由来する細胞もしくは組織供給源からの細胞物質もしくは他の混入タンパク質を実質的に含まない、または化学合成された場合、化学前駆体もしくは他の化学物質を実質的に含まない。

マルチウェルプレート
一部の態様では、本開示は、試験治療剤およびＢＨ３ドメインペプチドを含むマルチウェル細胞培養プレートであって、各ウェルが接着性作用因子でコーティングされている、マルチウェル細胞培養プレートを提供する。一部の実施形態では、マルチウェルプレートは、プラスチックまたはガラスである。一部の実施形態では、マルチウェルプレートは、６、２４、９６、３８４または１５３６ウェルのアレイを含む。しかし、当業者は、マルチウェルプレートが、６、２４、９６、３８４または１５３６の倍数であるウェルの数を有するマルチウェルプレートのように、他の許容され得る多様な構成に構築され得ることを認識している。例えば、一部の実施形態では、マルチウェルプレートは、（１５３６の倍数である）３０７２ウェルのアレイを含む。

一部の実施形態では、プレートの各ウェルは、接着性作用因子でコーティングされている。一部の実施形態では、接着性作用因子は、ポリ−Ｄ−リシン、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、またはコムギ胚芽凝集素（ＷＧＡ）である。一部の実施形態では、接着性作用因子は、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）タンパク質である。一部の実施形態では、ＥＣＭタンパク質は、コラーゲン１、ラミニン、コラーゲン４およびフィブロネクチンからなる群より選択される。一部の実施形態では、接着性作用因子は、ＥＣＭタンパク質の組合せ（例えば、マトリゲル、またはフィーダー細胞によって分泌される１種もしくは複数のＥＣＭタンパク質）である。一部の実施形態では、接着性作用因子は抗体である。例えば、細胞表面タンパク質に対する抗体が、マルチウェルプレートの各ウェルにコーティングされる場合がある。一部の実施形態では、接着性作用因子はストレプトアビジンである。

本明細書に使用される用語「試験治療剤」は、特定の疾患に関するその治療的価値を決定するために評価されている分子、ペプチド、タンパク質、もしくは化合物またはそれらの組合せを指す。例えば、新しいモノクローナル抗体の能力が腫瘍細胞におけるアポトーシスを誘導する能力について試験される場合がある。一部の実施形態では、プレートは、試験治療剤を含む。一部の実施形態では、試験治療剤は化学療法剤である。一部の実施形態では、プレートは、１種を超える試験治療剤を含む。例えば、各薬剤を単独または別の薬剤と組合せて化学療法剤のパネルを試験するために、プレートが使用される場合がある。一部の実施形態では、プレートの各ウェルは、単一の試験治療剤を含む。一部の実施形態では、プレートの各ウェルは、少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも４種、少なくとも５種、少なくとも６種、少なくとも７種、少なくとも８種、少なくとも９種または少なくとも１０種の治療剤を含む。一部の実施形態では、プレートの各ウェルは、１０種を超える治療剤を含む。

化学療法剤の非限定的な例には、小型分子、ペプチドまたはタンパク質（例えば、ペプチド抗生物質および抗体）およびＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）分子が含まれる。小型分子化学療法剤の例には、アルキル化剤（シクロホスファミド、クロルメチン、テモゾロミド）、アントラサイクリン（ダウノルビシン、ドキソルビシン、ミトキサントロン）、タキサン（パクリタキセル、ドセタキセル）、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤（ボリノスタット、ロミデプシン）、トポイソメラーゼＩ／ＩＩ阻害剤（イリノテカン、トポテカン、エトポシド）、キナーゼ阻害剤（ゲフィチニブ、イマチニブ、ボルテゾミブ）、ヌクレオチド類似体および前駆体類似体（アザシチジン、フルオロウラシル、メトトレキセート）、白金系薬剤（シスプラチン、カルボプラチン）、レチノイド（アリトレチノイン、ベキサロテン）ならびにビンカアルカロイド（ビンブラスチン、ビンデシン、ビノレルビン）が含まれる。ペプチドおよびタンパク質の例には、ブレオマイシン、ダクチノマイシン、抗腫瘍抗体（抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ、アレムツズマブ、トラスツズマブ、ブレンツキシマブ）が含まれる。当業者は、がんに関係する遺伝子の発現を標的化するＲＮＡｉ分子としての化学療法ＲＮＡｉ分子を認識している。例えば、ＨｏｘＡ１に対するＲＮＡｉ分子は、Ｂｒｏｃｋら、Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ ６巻２１７ｒａ２頁（２０１４年）によって開示されたように、乳腺腫瘍細胞の形成を阻害することができる。

一部の実施形態では、マルチウェルプレートは、ＢＨ３ドメインペプチドを含む。一部の実施形態では、ＢＨ３ドメインペプチドは、ＢＩＤ、ＢＩＭ、ＢＡＤ、ＮＯＸＡ、ＰＵＭＡ、ＢＭＦ、またはＨＲＫポリペプチドのＢＨ３ドメインに由来する。一部の実施形態では、ＢＨ３ドメインペプチドは、配列番号１〜１５からなる群より選択される。一部の実施形態では、プレートは、１つ超のＢＨ３ドメインペプチドを含む。例えば、一部の実施形態では、プレートは、少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも４種、少なくとも５種、少なくとも６種、少なくとも７種、少なくとも８種、少なくとも９種または少なくとも１０種のＢＨ３ドメインペプチドを含む。

キット
本発明の一部の態様は、ＢＨ３プロファイリングを行うためのキットを含む。一部の実施形態では、キットは、試験治療剤およびＢＨ３ドメインペプチドを有するマルチウェルプレートを含む。一部の実施形態では、マルチウェルプレートの各ウェルは、接着性作用因子でコーティングされている。一部の実施形態では、接着性作用因子はＥＣＭタンパク質である。一部の実施形態では、ＥＣＭタンパク質は、コラーゲン１、ラミニン、コラーゲン４およびフィブロネクチンからなる群より選択される。一部の実施形態では、接着性作用因子は抗体である。例えば、細胞表面タンパク質に対する抗体は、マルチウェルプレートの各ウェルにコーティングされる場合がある。一部の実施形態では、接着性作用因子はストレプトアビジンである。

一部の実施形態では、キットは、試験治療剤を有するマルチウェルプレートを含む。一部の実施形態では、試験治療剤は化学療法剤である。一部の実施形態では、キットは、少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも４種、少なくとも５種、少なくとも６種、少なくとも７種、少なくとも８種、少なくとも９種または少なくとも１０種の治療剤を有するマルチウェルプレートを含む。一部の実施形態では、キットは、各ウェルが１０種を超える治療剤を含むマルチウェルプレートを含む。一部の実施形態では、キットは、ＢＨ３ドメインペプチドを有するマルチウェルプレートを含む。一部の実施形態では、ＢＨ３ドメインペプチドは、ＢＩＤ、ＢＩＭ、ＢＡＤ、ＮＯＸＡ、ＰＵＭＡ、ＢＭＦ、またはＨＲＫポリペプチドのＢＨ３ドメインに由来する。一部の実施形態では、ＢＨ３ドメインペプチドは、配列番号１〜１５からなる群より選択される。

一部の態様では、キットは、ＢＨ３プロファイリング緩衝液を収容するバイアルをさらに含む。一部の実施形態では、バイアルは、ガラスまたはプラスチック製バイアルである。一部の実施形態では、バイアルは、その表面に体積測定目盛を備える。一部の実施形態では、ＢＨ３プロファイリング緩衝液は、１×、２×、３×、４×、５×、６×、７×、８×、９×、または１０×の濃度である。一部の実施形態では、ＢＨ３プロファイリング緩衝液は、１０×を超える濃度である。一部の実施形態では、ＢＨ３プロファイリング緩衝液は、トレハロース由来実験緩衝液（ＤＴＥＢ）またはマンニトール実験緩衝液（ＭＥＢ）である。一部の実施形態では、ＢＨ３プロファイリング緩衝液に、透過化剤が補充される。一部の実施形態では、透過化剤はジギトニンまたはサポニンである。

一部の実施形態では、キットは、電位差測定用色素をさらに含む。一部の実施形態では、電位差測定用色素は、５，５’，６，６’−テトラクロロ−１，１’，３，３’−テトラエチルベンゾイミダゾリルカルボシアニンヨージド（ＪＣ−１）、ジヒドロローダミン１２３、テトラメチルローダミンメチルエステル（ＴＭＲＭ）またはテトラメチルローダミンエチルエステル（ＴＭＲＥ）である。あるいは、一部の実施形態では、キットは、チトクロームｃ、ＳＭＡＣ／Ｄｉａｂｌｏ、Ｏｍｉ、アデニル酸キナーゼ−２またはアポトーシス誘導因子に対する抗体をさらに含む。

一部の態様では、キットは、治療剤に対する細胞の感受性を予測するためにキットを使用するための指示をさらに含む。指示は、一般的に印刷されたパンフレットまたは紙シートとして提供されるが、指示がキットに付随すべきものであることを使用者が明確に認識するように提供された任意の口述または電子的な指示、例えば、オーディオビジュアル（例えば、ビデオテープ、ＤＶＤなど）、インターネット、および／またはウェブベースの通信なども含み得る。

以下の非限定的な実施例で本発明をさらに例証する。

（実施例１：ハイスループットダイナミックＢＨ３プロファイリング）
ダイナミックＢＨ３プロファイリング（ＤＢＰ）は、薬物が一次ヒト腫瘍（または患者由来異種移植片）のアポトーシス感受性をどのように変化させるかを決定する。現在使用されているダイナミックＢＨ３プロファイリングの方法は、ウェル内において細胞を化学化合物で１６〜２４時間処理すること、細胞をウェルから取り上げること、遠心分離機を使用して細胞を培地から分離し、細胞をＢＨ３プロファイリング緩衝液（ＤＴＥＢ）およびＢＨ３プロファイリングペプチド中に入れることを伴う。内因性チトクロームｃの消失を測定するが、有意な消失がある場合は、薬物が細胞をアポトーシスに向けて感作することを示す。これは、ヒト作業者のかなりの取り扱いおよび多数の腫瘍細胞を伴う骨の折れる工程であり、これらの両方が、克服すべき障壁となる。

本実施例は、細胞が培養物から取り出されず、かつ薬物、ＢＨ３プロファイル緩衝液およびペプチドは、細胞にｉｎ ｓｉｔｕで添加されるハイスループットＢＨ３プロファイリングのプロトコールの実施形態を記載する。本明細書に記載のプロトコールと現在使用されているダイナミックＢＨ３プロファイリングのプロトコールとの間には、２つの重大な差がある。第１に、このプロトコールは全自動化されており、腫瘍が単一細胞に加工された後、ほとんどヒトの取り扱いを伴わない。自動化は、大型の化学物質スクリーニングに着手することを可能にする。さらに、ヒトの取り扱いは、作業者の偏りを招き、その結果高度に矛盾するデータとなるおそれがある。第２に、アッセイは、現在使用されている方法と比較してダイナミックＢＨ３プロファイルを行うために必要な細胞数がより少数である。他の方法が、１つの条件あたり細胞１０００万から３０００万個の間を必要とする一方で、本プロトコールは、ウェル１個あたり細胞わずか２５０個またはそれ未満を使用してシグナルの測定が可能である。この細胞数の少なくとも１０分の１の減少は、全自動化と一緒になって、一次ヒト腫瘍または患者由来異種移植片（ＰＤＸ）を化学物質スクリーニングに使用することを容易にする。要するに、この技法の２つの価値ある産物は、（１）一次ヒト腫瘍または患者由来異種移植片（ＰＤＸ）に対するアポトーシス感作物質のハイスループット化学物質発見および（２）複数の薬物および薬物の組合せを使用した化学療法の個別化を可能にすることである。プロトコールの実施形態を下および図１に記載する。

プロトコール：
１． 腫瘍を単一細胞懸濁物にする（機械的溶解および酵素消化による）。

２． 接着促進化合物でコーティングされたマルチウェルプレートに細胞を蒔く（例えば、コラーゲンまたは腫瘍細胞の細胞表面マーカーを標的化する抗体）。ピンニングマシンを使用して化学物質をプレートにピニングする（ｐｉｎ）。細胞を化合物と共に４〜７２時間インキュベートする。

３． 任意選択で、予備ＢＨ３プロファイルを行って残りのアッセイを行うための単一のペプチド濃度を特定する。この予備ＢＨ３プロファイルは、化合物を有さないウェルに対して行い、化合物で処理された細胞に対するＢＨ３プロファイルの少なくとも４時間前に行う。

４． 任意選択で、自動プレート洗浄機を使用して培養培地を洗い流し、ＤＴＥＢまたは別のＢＨ３プロファイリング緩衝液（例えば、マンニトール実験緩衝液）を洗い入れる。あるいは、ＰＢＳなどの塩類溶液をウェル内に洗い入れ、塩類溶液を除去せずに２×緩衝液を細胞に添加する。培地を除去せずに２×緩衝液を細胞に添加する場合もある。

５． ＢＨ３ペプチドをウェル内にプリントまたはピニングする。あるいは、細胞を塩類溶液で洗浄し、ペプチドをウェル内にプリントし、続いて２×緩衝液を添加する。あるいは、２×緩衝液をＢＨ３ペプチドと共に添加する。

６． 細胞を固定するためにマルチウェル分注器を使用してホルムアルデヒド緩衝液を添加する。

７． ホルムアルデヒドの活性を止めるために中和緩衝液を添加する。

８． チトクロームｃを染色するために染色溶液を添加する。

９． 任意選択で、染色溶液を洗い流してバックグラウンドのシグナルを減少させる。

１０． 蛍光顕微鏡法またはＦＡＣＳおよび画像解析ソフトウェア（例えばＭｅｔａｍｏｒｐｈ Ｉｍａｇｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ）を使用してチトクロームｃの消失を定量する。

結果
この方法は、細胞が単一細胞懸濁物の状態になった後、ほとんどヒトの取り扱いを必要としない、ほぼ全自動化された手順である（図１）。この方法を、いくつかのがん細胞株（図３、４、１１）、いくつかのＰＤＸモデル（図５）、一次腫瘍（図６）、および遺伝的に操作されたマウスモデル（図７）に適用した。

図３に、膵臓細胞における用量応答実験からのデータを示す。簡潔には、ＳＵ８６．８６膵臓がん細胞を、用量を増加させた合成Ｂｉｍペプチドで処理し、上記プロトコールに供した。結果は、より高濃度のペプチドでチトクロームｃの漸進的な消失が起こることを示している。チトクロームｃの消失は、Ｂｉｍペプチドによる細胞におけるミトコンドリア外膜透過化（ＭＯＭＰ）の誘導を指し示している。

ハイスループットＢＨ３プロファイリングは、以前に使用されたｉＢＨ３プロファイリングアッセイよりも減少した感受性であるが、類似した選択性を提供する。図４は、ＨＴＳ ＢＨ３プロファイルの結果とＦＡＣＳ ＢＨ３プロファイルの結果との比較を示す。絶対ＥＣ−５０値は、自動化顕微鏡的ＢＨ３プロファイルの方が系統的に高い。これは、ミトコンドリアへのペプチドの接近が困難であることに起因し得る。任意の特定の理論に縛られることを望むわけではないが、異なる分析方法のＥＣ−５０は、それにもかかわらず類似しているので、アッセイに後方互換性があることを示している。

ハイスループットＢＨ３プロファイリングは、初代ヒト腫瘍細胞、ＰＤＸからの細胞、および遺伝的に操作されたマウスモデルからの細胞にも適用可能である（図５〜７）。ＥｐＣａｍなどの腫瘍特異的マーカーを使用して目的の細胞または腫瘍細胞を確実に特定することができる。図８に、８９０２細胞はＥｐＣａｍで染色されるが、マウスＢａｘ／Ｂａｋダブルノックアウト細胞はＥｐＣａｍで染色されない例を提供する。追加的に、図８に、膵臓の患者由来異種移植片から見出される正常細胞から膵臓腫瘍細胞が区別される例を提供する。両方の例では、目的の細胞と非目的細胞との間の差を識別し、異なる集団におけるチトクロームｃの放出を決定することができる。

このプロトコールは、ヒト初代腫瘍細胞、ＰＤＸ、遺伝的に操作されたマウスモデルまたは樹立されたがん細胞株のいずれかに対して多数の化合物をスクリーニングするために創薬の状況でも使用することができる（図９）。特に、図９に示されるデータが単一の実験からまとめられたものであるのに対して、旧バージョンのＢＨ３プロファイルは、匹敵するデータ量を獲得するために数週間を要した。その上、このデータは、同じ細胞株に対する異なる生物学的実験から再現性よく生成される（図１０Ａ〜１０Ｂ）。

ハイスループットＢＨ３プロファイリングのプロトコールは、現在使用されているＢＨ３プロファイリング方法が直面する多くの難題を克服するものである。第１に、洗浄および染色ステップのために培養プレートから細胞を取り出す必要性が排除された。新しい方法は、細胞を培養ウェル内に保ち、しかもＢＨ３プロファイリング緩衝液（ＤＴＥＢまたはＭＥＢ、ホルムアルデヒド、中和緩衝液、染色溶液）を添加している間に最適なイメージングのために細胞を接着させ続ける。これは、２つの進歩を使用することによって達成された。第１に、細胞外マトリックスコーティング済みプレートまたは抗体コーティング済みプレートは、ＢＨ３プロファイルの間に細胞を付着させ続ける。細胞外マトリックスコーティング済みプレートは、薬物インキュベーションの間により良好な細胞生存度を生み出すという追加的な利点を有する。さらに、接着性表面の使用は、イメージング平面内に細胞を保つことによって高品質の顕微鏡法を容易にし、抗体染色後の洗浄を容易にして、蛍光バックグラウンドを減少させる。

第２に、培地がほとんどまたは全く残らず、かなりの細胞消失を招く可能性がある洗浄ステップを行う代わりに（図２）、濃縮緩衝液を用いてＢＨ３プロファイリングを行うことができるという発見によって、ウェルに多大な残留体積がある状態でアッセイにおける洗浄ステップを行うことが可能になる。濃縮緩衝液の使用によって容易になった比較的多大な残留体積は、そうでなければ低残留体積で経験される、細胞に適用される剪断力または圧力を減少させることによって、残留細胞数の増加をもたらした可能性がある。

ハイスループットＢＨ３プロファイリングのプロトコールによって克服された別の相当な困難は、ＢＨ３プロファイリング緩衝液を有するウェル中にペプチドを添加することである。ペプチドが添加されてから１時間以内にミトコンドリア外膜透過化が起こるので、これは、時間に対して感受性のステップである。さらに、薬物スクリーニングの状況で、各薬物の２〜４つの間のペプチド濃度が試験されるが、これは、異なるペプチド濃度を各ウェルに加える必要があることを意味している。マルチチャンネルピペットの使用は、拡大縮小可能なアプローチを提供しない。本明細書に記載のハイスループット方法は、培養プレートにペプチドを迅速に添加するために３８４ウェルピンニングマシンおよびデジタル薬物プリンター（ＨＰ Ｄ３００）を利用することによってその問題を解決する。

ハイスループットＢＨ３プロトコールは、多様ながん細胞株にわたりいくつかの緩衝液濃度を使用することも許容する。血清またはＰＢＳを含有する培養培地の存在下で全ての実験を行った。図３は、２×濃縮緩衝液中のいくつかの濃度のＢｉｍペプチドを使用して生成した、膵臓がん細胞株（ＳＵ８６．８６）についての用量応答曲線のデータを示す。図１１Ａ〜１１Ｃは、２×緩衝液中の１００μＭ Ｂｉｍペプチドに対するいくつかのがん細胞株の応答を示す。２×緩衝液中のＢｉｍを用いた全ての細胞株の処理は、蛍光顕微鏡法によって測定されるようにチトクロームｃの消失をもたらした。

図１２は、２×、３×、４×および５×緩衝液中の１００μＭ Ｂｉｍペプチドで処理され、次に蛍光顕微鏡法によって測定された接着性膵臓がん細胞株を示す。非特異的なチトクロームｃの消失は、約３×およびそれ超の濃度で起こり、一方でペプチド誘導型チトクロームｃの消失は、２×緩衝液の場合のみで起こった。

図１３は、２×から３×の間の緩衝液濃度は、全ての試験懸濁細胞株について許容され得る毒性プロファイルを有し、最大５×の緩衝液濃度は、一部の細胞株（例えば、ＭＯＬＭ−１３、ＡＭＬ２、ＴＨＰ１）に無毒であることを実証している。

この形式で懸濁物中の細胞に関してＢＨ３プロファイルを実行することができるものの、細胞が付着していないことは、顕微鏡法ベースの分析を使用した十分なデータ定量を阻止する。例えば図１４は、薬物処理またはＢＨ３プロファイリングの前に付着していなかった結腸がんＰＤＸ細胞の例である。細胞はウェルの隅に凝集する。これがＦＡＣＳ分析の最終的な問題ではないものの、これらの細胞クラスターは、顕微鏡法ベースの分析が容易ではない。対照的に、図５における結腸がんＰＤＸの画像は、コラーゲンＩコーティング済みプレート上に蒔かれたものであり、ウェル全体に均等に分布し、顕微鏡法ベースの分析が容易である。コラーゲンＩコーティング済み表面に加えて、いくつかの細胞外マトリックスコーティング済み表面は、腫瘍細胞の接着を容易にする（図１５）。公知の懸濁腫瘍について、抗体コーティング済みプレートは、ＢＨ３プロファイル後の細胞表面への付着およびそれゆえに、より良好な定量を容易にする。増強した付着の例は、卵巣腹水腫瘍およびＣＬＬ腫瘍を使用して提供される（それぞれ図１６および図１７）。

ダイナミックＢＨ３プロファイリングの以前の反復と比較して、ＨＴ−ＤＢＰは、より少ない細胞数で有効に機能する。わずか細胞１００個を用いたＨＴ−ＤＢＰの例を図１８に提供する。図１９に概説した予備ＢＨ３プロファイルを使用して、必要細胞数のさらなる減少を行って、化学化合物のスクリーニングを行うために単一のＢＨ３ペプチド濃度を特定する。この予備プロファイルを、多くの場合、化学化合物スクリーニングのために使用されるＢＨ３プロファイルの４時間前に行う。図１９Ｂにおいて、予備ＢＨ３プロファイルが４時間後のＢＨ３プロファイルと完全に重なることに留意されたい。

ハイスループットダイナミックＢＨ３プロファイルの例および一次ＭＭＴＶ−ＰｙＭＴマウス腫瘍に対してこの方法を使用して、一次腫瘍に対してハイスループットスクリーニングを直接行う可能性を図２０に示す。追加的に、一次卵巣腹水腫瘍に行われたハイスループットスクリーニングを図２１に示し、一次ＣＬＬ腫瘍に行われたものを図２２に示す。ここで、おそらく化学感受性に最大の増加を引き起こす薬物は、デルタプライミングにも最大の増加を産生する。

Claims (40)

1. 試験作用因子に対する細胞の感受性を予測する方法であって、
   ａ）血清を有する培養培地中、試験作用因子の存在下および非存在下で、接着性固体表面上にて細胞を培養するステップ；
   ｂ）培養された前記細胞を、ＢＨ３プロファイリング緩衝液およびアポトーシス促進性ＢＨ３ドメインペプチドと接触させるステップ；
   ｃ）前記細胞におけるＢＨ３ドメインペプチド誘導型ミトコンドリア外膜透過化（ＭＯＭＰ）の量を測定するステップ；および
   ｄ）前記試験作用因子の存在下で培養された前記細胞におけるＢＨ３ドメインペプチド誘導型ＭＯＭＰの量を、前記試験作用因子の非存在下で培養された前記細胞におけるＢＨ３ドメインペプチド誘導型ＭＯＭＰの量と比較するステップ
   を含み、
   前記試験作用因子の非存在下で培養された前記細胞におけるＢＨ３ドメインペプチド誘導型ＭＯＭＰの量と比較した、前記試験作用因子の存在下で培養された前記細胞におけるＭＯＭＰの増加が、前記細胞が前記試験作用因子に対して感受性であることを示す、方法。
2. 前記細胞を前記ＢＨ３プロファイリング緩衝液および前記アポトーシス促進性ＢＨ３ドメインペプチドと接触させる前に、前記細胞から前記培養培地を洗浄するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
3. 前記ＢＨ３プロファイリング緩衝液が、２×、３×または４×の濃度で添加される、請求項１に記載の方法。
4. 前記ＢＨ３プロファイリング緩衝液が、２×の濃度で添加され、ＢＨ３ドメインペプチド誘導型ＭＯＭＰの量が、顕微鏡法によって測定される、請求項１に記載の方法。
5. 前記ＢＨ３プロファイリング緩衝液が、３×または４×の濃度で添加され、ＢＨ３ドメインペプチド誘導型ＭＯＭＰの量が、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）によって測定される、請求項１に記載の方法。
6. 前記接着性固体表面が、１種または複数の接着促進化合物でコーティングされている、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
7. 前記１種または複数の接着促進化合物が、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）タンパク質である、請求項６に記載の方法。
8. 前記ＥＣＭタンパク質が、コラーゲン１、ラミニン、コラーゲン４およびフィブロネクチンからなる群より選択される、請求項７に記載の方法。
9. 前記ＥＣＭタンパク質が、動物組織に由来するＥＣＭタンパク質混合物である、請求項７に記載の方法。
10. 前記１種または複数の接着促進化合物が抗体である、請求項６に記載の方法。
11. 前記１種または複数の接着促進化合物が、ストレプトアビジンまたはニュートラアビジンである、請求項６に記載の方法。
12. 前記ＢＨ３プロファイリング緩衝液が、トレハロース由来実験緩衝液（ＤＴＥＢ）またはマンニトール実験緩衝液（ＭＥＢ）である、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
13. 前記ＢＨ３ドメインペプチドとの接触の後、その前、またはそれと同時に前記細胞が透過化される、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
14. 前記ＢＨ３プロファイリング緩衝液に透過化剤が補充される、請求項１３に記載の方法。
15. 前記透過化剤が、ジギトニンまたはサポニンである、請求項１４に記載の方法。
16. ＢＨ３ドメインペプチド誘導型ＭＯＭＰの量が、ｉ）電位差測定用色素と接触した細胞における前記電位差測定用色素の発光、またはｉｉ）ミトコンドリア膜間腔からの分子の放出を決定することによって測定される、請求項１から１５のいずれか一項に記載の方法。
17. ＢＨ３ドメインペプチド誘導型ＭＯＭＰの量が、ＦＡＣＳ、プレート蛍光定量法、蛍光イメージングまたは自動画像解析によって測定される、請求項１から１５のいずれか一項に記載の方法。
18. ＭＯＭＰを測定する前に前記細胞を固定するステップをさらに含む、請求項１から１７のいずれか一項に記載の方法。
19. 固定された前記細胞が、電位差測定用色素と接触する、請求項１８に記載の方法。
20. 前記電位差測定用色素が、５，５’，６，６’−テトラクロロ−１，１’，３，３’−テトラエチルベンゾイミダゾリルカルボシアニンヨージド（ＪＣ−１）、ジヒドロローダミン１２３、テトラメチルローダミンメチルエステル（ＴＭＲＭ）またはテトラメチルローダミンエチルエステル（ＴＭＲＥ）である、請求項１９に記載の方法。
21. 固定された前記細胞が、チトクロームＣ、ＳＭＡＣ／Ｄｉａｂｌｏ、Ｏｍｉ、アデニル酸キナーゼ−２またはアポトーシス誘導因子に対する抗体と接触する、請求項１８に記載の方法。
22. 固定された前記細胞が、Ｔｏｍ２０またはＶＤＡＣに対する抗体と接触する、請求項１８に記載の方法。
23. 前記ＢＨ３ドメインペプチドが、ＢＩＤ、ＢＩＭ、ＢＡＤ、ＮＯＸＡ、ＰＵＭＡ、ＢＭＦ、またはＨＲＫポリペプチドのＢＨ３ドメインに由来する、請求項１から２２のいずれか一項に記載の方法。
24. 前記ＢＨ３ドメインペプチドが、配列番号１〜１５からなる群より選択される、請求項１から２３のいずれか一項に記載の方法。
25. 前記試験作用因子が治療剤である、請求項１から２４のいずれか一項に記載の方法。
26. 試験治療剤が化学療法剤である、請求項２５に記載の方法。
27. 前記細胞が初代ヒト腫瘍細胞である、請求項１から２６のいずれか一項に記載の方法。
28. 前記細胞が、患者由来異種移植片（ＰＤＸ）から得られる、請求項１から２６のいずれか一項に記載の方法。
29. 前記細胞が培養ヒト細胞である、請求項１から２６のいずれか一項に記載の方法。
30. 前記細胞が、初代動物腫瘍細胞である、請求項１から２６のいずれか一項に記載の方法。
31. 前記細胞が、ヒトまたは動物組織に由来する健康な細胞である、請求項１から２６のいずれか一項に記載の方法。
32. 複数の試験作用因子を用いて繰り返される、請求項１から３１のいずれか一項に記載の方法。
33. 各ウェルが接着性作用因子でコーティングされている、試験治療剤およびＢＨ３ドメインペプチドを含むマルチウェルプレート。
34. 前記ＢＨ３ドメインペプチドが、ＢＩＤ、ＢＩＭ、ＢＡＤ、ＮＯＸＡ、ＰＵＭＡ、ＢＭＦ、またはＨＲＫポリペプチドのＢＨ３ドメインに由来する、請求項３３に記載のマルチウェルプレート。
35. 前記ＢＨ３ドメインペプチドが、配列番号１〜１５からなる群より選択される、請求項３３に記載のマルチウェルプレート。
36. 前記試験治療剤が化学療法剤である、請求項３３から３５のいずれか一項に記載のマルチウェルプレート。
37. 前記接着性作用因子が細胞外マトリックス（ＥＣＭ）タンパク質である、請求項３３から３６のいずれか一項に記載のマルチウェルプレート。
38. 前記ＥＣＭタンパク質が、コラーゲン１、ラミニン、コラーゲン４およびフィブロネクチンからなる群より選択される、請求項３７に記載のマルチウェルプレート。
39. 前記接着性作用因子が抗体である、請求項３３から３６のいずれか一項に記載のマルチウェルプレート。
40. 請求項３３から３９のいずれか一項に記載のマルチウェルプレートを含むキットであって、ＢＨ３プロファイリング緩衝液を収容するバイアルおよび治療剤に対する細胞の感受性を予測するために前記キットを使用するための指示をさらに含む、キット。